一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法與流程
2023-10-06 19:59:04 3
本發明涉及植物組培領域，特別涉及一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法。
背景技術：
舌柱唇柱苣苔(Chirita liguliformis W.T.Wang)是苦苣苔科(Gesneriaceae)唇柱苣苔屬多年生草本。舌柱唇柱苣苔具粗根狀莖，葉片基生，對生，長2-11釐米，寬4-9毫米，被短柔毛。葉片厚紙質，橢圓形。花序約2條，2-3回分枝，每花序約有7花；花序梗長20釐米，被開展短柔毛，花期7月；苞片狹三角形，長約3.5毫米，寬1.1毫米，被短柔毛；花梗長2.5-4釐米，被短柔毛。花萼5裂達基部，裂片披針狀線形，長3-3.5毫米，寬1毫米，外面被短柔毛，內面無毛。花冠淡紫色，長約2.2釐米，外面疏被短柔毛，內面在上唇之下被短柔毛；筒長約1.5釐米，口部直徑約6毫米。蒴果線形，長約3釐米，寬2毫米，被短柔毛；種子橢圓形，長約0.25毫米。產貴州西南部(安龍、冊享)。生於山谷林下陰溼處，海拔約800米。
舌柱唇柱苣苔的花色素雅，其葉片厚，十分耐陰，易於管理，將其開發為室內觀賞花卉和園林綠化耐陰花卉具有較高的市場價值，然而野生資源十分稀少，難以滿足市場上將其作為觀賞花卉和園林綠化的實際需要。植物組織培養是一種快速繁殖技術，可為園藝市場提供大量優質種苗，同時也避免了採挖野生舌柱唇柱苣苔對野生資源的破壞。
技術實現要素：
本發明提供一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法，以解決野生舌柱唇柱苣苔難以滿足市場上將其作為觀賞花卉和園林綠化的實際需要，有效、快速的提高種苗的繁殖速度和保證種苗的繁殖質量，為舌柱唇柱苣苔作為室內觀賞花卉和園林耐陰花卉提供了大量優質種苗。
本發明的技術方案如下：
一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法，包括以下步驟：
(1)外植體的製備
取舌柱唇柱苣苔的葉片，經清洗、消毒和漂洗，得到外植體；
(2)初代培養
所述的外植體接種到添加有0.1～0.5mg/L 6-BA和0.05～0.1mg/L NAA的MS培養基中培養，所述的外植體的邊緣出現大量不定芽，繼續培養至不定芽發育成幼株；
(3)繼代培養
所述的幼株在無菌條件下取出，將所述的幼株的葉片切成小塊，然後所述的小塊接種到添加有0.1～0.5mg/L 6-BA和0.01～0.05mg/L NAA的MS培養基中培養，所述的小塊出現不定芽，繼續培養至不定芽全部成幼苗；
(4)生根培養
所述的幼苗轉接到添加有0.1～0.3mg/L IBA和15～30g/L蔗糖的MS生根培養基中培養，得到生根苗；
(5)移栽馴化
所述的生根苗從培養裝置內移出，移栽於裝滿育苗基質的育苗容器培養，並控制相對溼度，得到定植苗。
進一步優選，所述的步驟(1)外植體的製備包括取舌柱唇柱苣苔的幼嫩葉片，用洗滌劑擦洗後，置於水下衝洗，然後將葉片置於超淨臺下，剪成邊長約1cm的小方塊，所述的小方塊依次的用70％酒精清洗，無菌水衝洗，並移入加有一滴吐溫20的0.1％升汞溶液中，取出後再用無菌水漂洗，得到所述的外植體。
進一步優選，所述的步驟(2)初代培養的MS培養基添加有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，且pH為5.8。
進一步優選，所述的步驟(2)初代培養的培養條件為在溫度為25±2℃，先黑暗下培養，然後再移置於光合有效輻射為40μmol m-2s-1，光照時間12h下培養。
進一步優選，所述的步驟(3)繼代培養還包括待不定芽全部成幼苗時，及時分株轉接到新的添加有0.1～0.5mg/L 6-BA和0.01～0.05mg/L NAA的MS培養基中繼續培養，然後再進行生根培養。
進一步優選，所述的步驟(3)繼代培養的MS培養基添加有0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，且pH為5.8。
進一步優選，所述的步驟(3)繼代培養和所述的步驟(4)生根培養的培養條件均是在溫度25±2℃，光合有效輻射為40μmol m-2s-1，光照時間12h下培養。
進一步優選，所述的步驟(4)生根培養的MS培養基添加有0.3mg/L IBA、30g/L蔗糖、5.5g/L瓊脂，且pH為5.8。
進一步優選，所述的步驟(5)移栽馴化的育苗基質為體積比3:1:1的草炭、蛭石和珍珠巖，且pH為6.5。
進一步優選，所述的步驟(5)移栽馴化包括將所述的生根苗從培養瓶內移出，洗去附著於根部的培養基溶液，然後移栽於裝滿有育苗基質的孔穴盤中，每穴一株，放置於苗床上，移栽後溫室遮陽，最大光合有效輻射不高於160μmol m-2s-1，並定期噴霧保溼，溫度控制在15～30℃下培養，馴化後再移栽。
與現有技術相比，本發明的有益效果如下：
一、本發明的一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法，有效、快速的提高了種苗的繁殖速度和保證了種苗的繁殖質量，為舌柱唇柱苣苔作為室內觀賞花卉和園林耐陰花卉提供了大量優質種苗，通過初代培養和繼代培養得到數目眾多的幼苗，繁殖係數高，且經生根培養後，生根苗的移栽成活率達到95％以上。
二、本發明的一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法，分別對初代培養、繼代培養和生根培養的MS培養基所加入的激素等物質和其含量進行了優化，得到了組培快繁各階段培養時的特定培養基，提高了繁殖係數和保證了繁殖質量。
當然，實施本發明的任一方法並不一定需要同時達到以上所述的所有優點。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應該理解，這些實施例僅用於說明本發明，而不用於限定本發明的保護範圍。在實際應用中本領域技術人員根據本發明做出的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。
本發明的一種舌柱唇柱苣苔的組培快繁方法，具體包括以下步驟：
(1)外植體的製備
天氣晴朗時，引種成活且生長健壯的舌柱唇柱苣苔母株，置於通風處，一周後取幼嫩的葉片，用洗潔精輕輕擦洗後，置於流動的自來水下衝洗1小時，然後將葉片放置於超淨臺下，剪成邊長約1cm的小方塊，先用70％酒精清洗10s，再用無菌水衝洗3次(每次15s左右)，再移入加有一滴吐溫20的0.1％升汞溶液中，振蕩5-8分鐘，最後用無菌水漂洗7-10次，得到所述的外植體；
(2)初代培養
所述的外植體接種到添加有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，且pH為5.8的MS培養基中培養，每瓶約接種5個，培養室溫度為25±2℃，先黑暗培養一周，然後再移置於光合有效輻射(PAR)為40μmol m-2s-1的組培架上，光照時間12h，培養19天，所述的外植體的邊緣出現大量不定芽，芽粗壯密集，繼續培養至第6周，不定芽發育為完整但未生根的幼株；
(3)繼代培養
所述的幼株在超淨工作檯無菌條件下取出，將幼株的葉片剝下並切成0.5cm×0.5cm的小塊，然後所述的小塊接種到添加有0.5mg/L 6-BA和0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，且pH為5.8的MS培養基中培養，每瓶接種5個，培養室溫度為25℃±2℃，光合有效輻射為40μmolm-2s-1，光照時間12h下培養，培養3周後，所述的小塊出現不定芽，繼續培養3周，不定芽全部成幼苗，再及時的分株，轉接到新的添加有0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS培養基中繼續培養3周，獲得健壯的植株；
(4)生根培養
所述的植株轉接到添加有0.3mg/L IBA、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂，且pH為5.8的MS生根培養基中培養25-30天，得到生根完整的生根苗，根長約1cm，植株長至3-4cm高；
(5)移栽馴化
將所述的生根苗從培養瓶內移出，洗去附著於根部的培養基溶液，然後移栽於裝滿有育苗基質的72孔穴盤中，每穴一株，放置於苗床上，苗床覆蓋小拱棚，小拱棚內配備噴霧裝置，定期噴霧保溼，所述的育苗基質為體積比3:1:1的草炭、蛭石和珍珠巖，且pH為6.5，裝滿穴盤後澆透水；移栽後溫室遮陽，小拱棚內的光合有效輻射不高於160μmol m-2s-1的，馴化第一周，小拱棚內的空氣相對溼度通過噴霧裝置和拱棚控制在95％以上，拱棚薄膜全封閉，一周後，新根長出後逐步揭開拱棚薄膜，並將空氣相對溼度保持在85％以上，維持一周，然後再加大通風面積，空氣溼度逐步降到75％，溫室內的溫度控制在15～30℃下培養，馴化栽培6周後，可將穴盤苗進一步移栽於花盆。
為了進一步考察在初代培養、繼代培養和生根培養，各培養基對舌柱唇柱苣苔的組培快繁的影響，本發明還設置了若干組實驗以優化在培養各階段的培養基。
一、考察初代培養時，培養基配方對不定芽誘導的影響
將所述的外植體分別接種到以下各組培養基中培養，第一組：0.5mg/L 6-BA、6g/L瓊脂、30g/L蔗糖，且pH為5.8的MS培養基；第二組：0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、6g/L瓊脂、30g/L蔗糖，且pH為5.8的MS培養基；第三組：0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L IBA、6g/L瓊脂、30g/L蔗糖，且pH為5.8的MS培養基；第四組：0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、6g/L瓊脂、30g/L蔗糖，且pH為5.8的MS培養基，每組各設置一個培養瓶，每個培養瓶均接種5個外植體，每個培養瓶的培養條件均為培養室溫度25±2℃，先黑暗培養一周，然後再移置於光合有效輻射(PAR)為40μmolm-2s-1的組培架上，光照時間12h下培養，統計結果如表一所示。
表一
註：表中第三列數據的不同字母(a、b)標註，表示新復極差法檢驗有顯著差異(P<0.05)
從表一的數據分析可以看出，第一組培養26天後，外植體增厚，但未見明顯的愈傷組織，邊緣出現不定芽且芽粗壯，但每個外植體只出現19個不定芽；第二組培養19天後即出現不定芽，每個外植體共產生31個不定芽，芽體比較均勻；第三組和第四組的每個外植體產生不定芽數分別為25個和23個，且產生不定芽的時間也相應的比第二組要長，因此，本發明在初代培養時，培養基宜選用添加有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、6g/L瓊脂、30g/L蔗糖，且pH為5.8的MS培養基。
二、考察不同激素水平組合對舌柱唇柱苣苔繼代培養增殖的影響
將所述的小塊分別接種到表二所示的組別為1～10的培養基上，第1組為對照組，不加任何激素的MS培養基，第2～10組為實驗組，在MS培養基中所加入的激素如表二第二列所示，其中每一組培養基中都還加入了6g/L瓊脂、30g/L蔗糖，且pH為5.8，每組各設置一個培養瓶，每個培養瓶均接種5個小塊，每個培養瓶的培養條件均為培養室溫度為25℃±2℃，光合有效輻射為40μmolm-2s-1，光照時間12h下培養，統計結果如表二所示。
表二
註：表中第三列數據的不同字母(a、b、c、d)標註，表示新復極差法檢驗有顯著差異(P<0.05)
從表二的數據分析可以看出，MS培養基中的6-BA的濃度對不定芽產生數量有顯著影響(P＝0.005)，而NAA的濃度對其沒有顯著影響(P＝0.247)，兩種激素的交互作用也對其有顯著影響。每個小塊產生的不定芽數量總體隨6-BA濃度的升高而增多，但6-BA濃度過高，芽密集且小，而且芽體玻璃化現象嚴重，因此，綜合增殖係數和苗體質量，本發明在繼代培養時，宜選用添加有0.5mg/L的6-BA，0.01mg/L NAA，6g/L瓊脂，30g/L蔗糖，且pH為5.8的MS培養基。
三、考察不同激素水平和蔗糖含量對舌柱唇柱苣苔生根培養的影響
將所述的幼苗分別接種到表三所示的組別為1～6的培養基上，具體考察了蔗糖濃度和IBA濃度對幼苗生根培養的影響，具體各濃度如表三第二、三列所示，其中每一組培養基中都還加入了5.5g/L瓊脂，且pH為5.8，每組各設置一個培養瓶，每個培養瓶均接種5個小塊，每個培養瓶的培養條件均為培養室溫度為25℃±2℃，光合有效輻射為40μmolm-2s-1，光照時間12h下培養，統計結果如表三所示。
表三
註：表中第三列數據的不同字母(a、b、c、d)標註，表示新復極差法檢驗有顯著差異(P<0.05)
從表三的數據分析可以看出，蔗糖的濃度對瓶苗株高和根數有顯著影響，IBA的濃度對瓶苗葉片數、根數、根長和株高都有顯著影響，其中在相同蔗糖的濃度下，在加入有0.5mg/L IBA的培養基培養時，根數為最多，根長也最長，植株也最高，但是瓶苗的根細長且不均勻，苗體也較弱，因此，在相同蔗糖的濃度下，宜選用0.3mg/L IBA的培養基；在相同IBA的濃度下，在加入30g/L蔗糖培養時，瓶苗較為健壯，根均勻且粗壯，根長約15mm,，植株長至1.5-2cm高，易於移栽。因此，本發明在生根培養時，宜選用0.3g/L IBA、5.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖且pH為5.8的MS培養基。
以上公開的本發明優選實施例只是用於幫助闡述本發明。優選實施例並沒有詳盡敘述所有的細節，也不限制該發明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取並具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地理解和利用本發明。本發明僅受權利要求書及其全部範圍和等效物的限制。