青錢柳生根培養基及其培養方法與流程
2023-10-06 19:56:59
本發明涉及植物的組織培養技術，具體涉及青錢柳生根培養基及其培養方法。
背景技術：
青錢柳[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja]屬胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬植物，別名搖錢樹、麻柳，青錢李、山麻柳、山化樹。青錢柳被譽為「植物大熊貓」、「醫學界的第三棵樹」，是冰川四紀倖存下來的珍稀樹種，僅存於中國，是國家重點保護的瀕危植物。青錢柳主要分布於江西、浙江、江蘇、安徽、福建、臺灣、湖北、四川、貴州、雲南等地，多零星分布於深山老林和一些自然保護區中。
青錢柳更具有獨特的保健和藥用價值。民間長期以來用青錢柳葉做茶，茶氣清香，味甜。《中國中藥資源志要》(1994)記載，青錢柳葉具清熱消渴解毒之效。《全國中草藥名鑑》(1996)記載，青錢柳樹皮、葉、根有殺蟲止癢，消炎止痛祛風之功效。現代藥理學研究證明，青錢柳有降血壓、降血脂和抗衰老等藥用功效。研究發現，青錢柳葉含有大量的鉀、鈣、鎂、磷等常量元素，還含有錳、鐵、銅、鉻、鋅、硒、釩、鍺等微量元素。其中，與糖代謝和胰島素作用密切相關的元素鉻、鎳、鋰、硒、釩的含量較高，能夠協助胰島素髮揮降血糖作用，並能改善糖耐量。青錢柳葉還含有豐富的多糖、黃酮、三萜、甾體類、皂苷、香豆精等有機化合物，這些化合物能有效降低甘油三酯和膽固醇，使青錢柳具有降血壓、降血糖、降血脂的功能，同時對增強人體免疫力、抗氧化、抗衰老等具有獨特作用。
目前，市場上的青錢柳苗木多為野生資源移栽或人工培育的種子實生苗。由於青錢柳種源有限，種子飽滿率低，還具有深休眠特性，採用常規播種育苗方法育種周期長，效率低，難以在短期內生產出大量種苗，不能滿足市場的需求。近幾年來，國內外研究人員以離體胚、葉片、嫩芽、莖段等為外植體相繼開展青錢柳的組織培養與快速繁殖的研究，如謝寅峰等(謝寅峰等.青錢柳組培快繁體系的初步研究.西北植物學報，2009，29(11)：2331-2338)利用離體胚初步建立了青錢柳的快繁體系，採用WPM+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖培養基進行誘導，生根率為16.67％，經過15d暗誘導處理，生根率可提高到23.33％。喬卿梅等(喬卿梅,程茂高,魏志華.不同外源激素對青錢柳莖段組織培養的影響.北方園藝2009(7)：125-127)研究發現，在青錢柳莖段組織培養中，不定根誘導的適宜培養基為改良MS+5.0mg/L IBA，誘導率為40.00％。魯萌等(魯萌等.青錢柳莖段腋芽的離體培養技術.南京林業大學學報(自然科學版)，2013，37(6)：6-10)以WPM為基本培養基，研究IBA、GGR-6、ABT-1對青錢柳生根的影響，結果表明，10％GGR+1.0mg/L IBA組合處理效果最好，生根率為25％。已有的研究結果表明，青錢柳無菌苗已能成功擴繁，但其生根率低、生根質量差，難以滿足工廠化育苗的要求。由此可見，青錢柳組培苗的壯苗生根技術已成為制約青錢柳種苗工廠化生產的關鍵環節，組培苗生根技術的突破，對建立青錢柳高效組培快繁體系、擴大種植規模具有重要意義。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種青錢柳生根培養基及其培養方法。採用本發明所述的生根培養基對常規青錢柳試管苗進行生根培養，可以獲得70％以上的生根率，且根系發育良好，植株生長健壯，移栽成活率高。
本發明所述的青錢柳生根培養基的配方為：
改良MS+IBA 0.5～2.0mg/L+NAA 0～1.0mg/L+胺鮮酯0.02～0.1mg/L+蔗糖15～20g/L，pH5.5～6.0；
其中，改良MS的配方為：
大量元素的組分及濃度為：硝酸鉀700mg/L、硝酸銨600mg/L、七水硫酸鎂185mg/L、磷酸二氫鉀60mg/L、二水氯化鈣165mg/L；
有機化合物的組分及濃度為：肌醇100mg/L、鹽酸1mg/L、鹽酸吡哆醇1mg/L、鹽酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2mg/L；
微量元素的組分及濃度同MS培養基。
上述技術方案中，所述青錢柳生根培養基的配方優選為：改良MS+IBA 0.8～1.5mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+胺鮮酯0.05～0.08mg/L+蔗糖18～20g/L，pH5.5～6.0；最優選為改良MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+胺鮮酯0.05mg/L+蔗糖20g/L，pH5.5～6.0。所述青錢柳生根培養基的pH值優選為5.8～6.0。
本發明還包括一種青錢柳的培養方法，該方法包括生根培養步驟，所述的生根培養步驟為：切取單株試管苗，接入生根培養基中培養至少25d；其中：
所述生根培養基的配方為：
改良MS+IBA 0.5～2.0mg/L+NAA 0～1.0mg/L+胺鮮酯0.02～0.1mg/L+蔗糖15～20g/L，pH5.5～6.0；
其中，改良MS的配方為：
大量元素的組分及濃度為：硝酸鉀700mg/L、硝酸銨600mg/L、七水硫酸鎂185mg/L、磷酸二氫鉀60mg/L、二水氯化鈣165mg/L；
有機化合物的組分及濃度為：肌醇100mg/L、鹽酸1mg/L、鹽酸吡哆醇1mg/L、鹽酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2mg/L；
微量元素的組分及濃度同MS培養基。
上述方法中，青錢柳試管苗的生根培養條件可以與現有技術中相同。優選如下：培養溫度為20～30℃，光照周期為10～14h/d，光照強度為2000～3000Lx；進一步優選的培養條件為：培養溫度為23～27℃，光照周期為10～12h/d，光照強度為2000～3000Lx。
上述方法中，青錢柳試管苗在生根培養基中在上述培養條件下培養25d時，試管苗的生根率即可達到70％以上，而且根系發育良好，植株生長健壯。本發明所述方法中，優選試管苗的生根培養時間為25～35d。
上述方法中，所述生根培養基的配方優選為：改良MS+IBA 0.8～1.5mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+胺鮮酯0.05～0.08mg/L+蔗糖18～20g/L，pH5.5～6.0；最優選為改良MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+胺鮮酯0.05mg/L+蔗糖20g/L，pH5.5～6.0。所述青錢柳生根培養基的pH值優選為5.8～6.0。
本發明所述方法中，用於進行生根培養的試管苗按現有常規方法離體培養得到，優選是以青錢柳當年生枝條，按常規方法離體培養所得。優選是選取高度≥2cm的單株試管苗進行生根培養，更優選是選取高度≥3cm且長有3～4個複葉的單株試管苗進行生根培養，以提高植株的移栽成活率。
與現有技術相比，本發明的特點在於：通過改良基本培養基及成分、結合使用特定濃度的胺鮮酯、IBA以及NAA植物生長調節劑，使所得生根培養基可有效促進青錢柳試管苗的生根。利用該生根培養基對青錢柳試管苗進行生根培養，可使生根率達到70％以上(優選實施例可達84％)，且根系發育良好，植株生長健壯，移栽成活率高，為實現青錢柳組培產業化和推廣應用提供了技術支撐。
附圖說明
圖1為實施例1中按常規方法獲得的青錢柳試管苗的圖片；
圖2為採用本發明實施例1中所述生根培養基培養15d時的生根苗的圖片；
圖3為採用本發明實施例1中所述的生根培養基繼續培養至30d時的生根苗的圖片；
圖4為將採用本發明實施例1中所述生根培養基培養得到的生根苗進行移栽，移栽成活後的圖片。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述，以更好地理解本發明的內容，但本發明並不限於以下實施例。
以下各實施例中，所涉及的改良MS包括大量元素、微量元素和有機化合物，具體的配方如下：
大量元素的組分及濃度為：硝酸鉀700mg/L、硝酸銨600mg/L、七水硫酸鎂185mg/L、磷酸二氫鉀60mg/L、二水氯化鈣165mg/L；
微量元素的組分及濃度為：碘化鉀0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸錳22.3mg/L、七水硫酸鋅8.6mg/L、二水鉬酸鈉0.25mg/L、五水硫酸銅0.025mg/L、六水氯化鈷0.025mg/L、七水硫酸亞鐵27.8mg/L。其中，七水硫酸亞鐵與乙二胺四乙酸二鈉螯合，乙二胺四乙酸二鈉濃度為37.3mg/L。
有機化合物的組分及濃度為：肌醇100mg/L、煙酸1mg/L、鹽酸吡哆醇1mg/L、鹽酸硫胺素0.2mg/L、甘氨酸2mg/L。
實施例1
1)取青錢柳當年生枝條，按常規方法離體培養獲得試管苗，如圖1所示；
2)生根培養：切取高於3.5cm且長有3～4個複葉的單株試管苗，接入生根培養基中培養30d(在培養15d時如圖2所示，在培養30d如圖3所示)；其中：
所述生根培養基的配方為：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+胺鮮酯0.05mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，採用濾紙橋為支撐物。
在生根培養基中的培養條件為：溫度為23～25℃，光照周期為12h/d，光照強度為2000Lx。
按生根株數/接種株數×100％來計算生根率(以下相同)，生根率為84％。
進一步將按本實施例方法培養得到的生根苗進行移栽，移栽成活後的圖片如圖4所示。
對比例1
重複實施例1的方法，只是將生根培養基配方修改為：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8。
經計算，生根率為32％。
對比例2
重複實施例1的方法，只是將生根培養基配方修改為：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+胺鮮酯0.01mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8。
經計算，生根率為36％。
對比例3
重複實施例1的方法，只是將生根培養基配方修改為：改良MS+IBA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+胺鮮酯0.15mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8。
經計算，生根率為2％。
實施例2
1)取青錢柳當年生枝條，按常規方法離體培養獲得試管苗；
2)生根培養：切取高於2.5cm且長有2～3個複葉的單株試管苗，接入生根培養基中培養25d；其中：
所述生根培養基的配方為：改良MS+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+胺鮮酯0.1mg/L+蔗糖20g/L，pH6.0，採用濾紙橋為支撐物。
在生根培養基中的培養條件為：溫度為25℃，光照周期為10h/d，光照強度為3000Lx。
經計算，生根率為70％。
實施例3
1)取青錢柳當年生枝條，按常規方法離體培養獲得試管苗；
2)生根培養：選取高度大於3cm且長有2～3個複葉的單株試管苗，切去基部的愈傷組織，然後接入生根培養基中培養28d；其中：
所述生根培養基的配方為：改良MS+IBA2.0mg/L+胺鮮酯0.08mg/L+蔗糖16g/L，pH6.0，採用濾紙橋為支撐物；
在生根培養基中的培養條件為：溫度為27℃，光照周期為10h/d，光照強度為2800Lx。
經計算，生根率為78％。
實施例4
1)取青錢柳當年生枝條，按常規方法離體培養獲得試管苗；
2)生根培養：選取高度大於2.5cm且長有2個複葉的單株試管苗，切去基部的愈傷組織，然後接入生根培養基中培養27d；其中：
所述生根培養基的配方為：改良MS+IBA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+胺鮮酯0.05mg/L+蔗糖18g/L，pH5.5，採用濾紙橋為支撐物。
在生根培養基中的培養條件為：溫度為20℃，光照周期為14h/d，光照強度為2500Lx。
經計算，生根率為82％。
實施例5
1)取青錢柳當年生枝條，按常規方法離體培養獲得試管苗；
2)生根培養：切取高於2.5cm且長有3～4個複葉的單株試管苗，切去基部的愈傷組織，然後接入生根培養基中培養28d；其中：
所述生根培養基的配方為：改良MS+IBA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+胺鮮酯0.03mg/L+蔗糖15g/L，pH5.9，採用濾紙橋為支撐物。
在生根培養基中的培養條件為：溫度為30℃，光照周期為12h/d，光照強度為2000～2200Lx。
經計算，生根率為80％。