一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法
2023-10-06 15:54:09 1
專利名稱：一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及酶的固定化技術，尤其涉及一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的 製備方法。
背景技術：
纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一，利用纖維素酶對其進行糖化並進而發酵生成乙醇，純乙醇或與汽油混合可直接代替汽油、柴油等化石燃料， 能有效緩解人類化石能源日益短缺的困境。但是纖維素酶在水解纖維素的過程 中，其穩定性差、使用壽命短、催化效率較低，導致纖維素糖化過程中酶的生 產成本過高，影響其工業化推廣應用。所以如何降低纖維素酶的生產成本，增 加其穩定性和使用壽命，是打通由纖維質原料到燃料乙醇技術路線的關鍵，也 是世界範圍內所面臨的一項共性關鍵技術。纖維素酶的固定化能有效提高其穩定性和使用壽命，從而為降低纖維素酶 的生產成本提供了可能。對它的研究已經成為纖維素酶學領域研究的一個熱點， 大量的載體和固定化方法也已被人們陸續開發出來。而對固定化酶而言，其性能的優劣主要取決於所使用載體材料的性質和固定化方法。我國在20世紀90 年代開展纖維素酶的固定化研究，目前國內外已經有許多不溶性、可溶性載體和固定化方法被廣泛用於纖維素酶的固定化。把纖維素酶固定在不溶性載體上， 固然有利於酶的回收，但缺點是不利於纖維素酶接近於不溶性纖維素底物，增 加了傳質阻力；而採用可溶性聚合物作為纖維素酶固定化的載體，確實使酶促 反應容易進行，但是反應結束後，酶又不易回收，失去了固定化酶反覆使用的 優點。為克服這些缺點，人們開發出了可溶(Soluble)-不可溶(Insoluble) (S-IS)互變載體系統。這種載體會隨溶液pH值、溫度、離子強度、光照等的不 同，而呈現出可溶和不可溶性狀態，用其固定化纖維素酶就可避免單獨使用不 溶性載體系統酶-底物的傳質阻力問題，以及可溶性載體系統酶使用後不易回收 的缺陷。由於S-IS系統的種種優越性，對它的研究已成為近年來酶工程領域研 究的一個熱點。但是以可溶-不可溶腸溶衣材料Eudragit L-100作為纖維素酶 固定化的載體，國內還未見有專利文獻報導。發明內容本發明的目的在於提供一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法。 本發明通過交聯劑EDC的連接作用，把纖維素酶共價固定於pH值敏感型載 體腸溶衣材料Eudragit L-100上，通過溶液pH值的變化，可實現固定化纖維 素酶的快速回收，大大提高纖維素酶的穩定性和使用壽命，從而為降低纖維素 酶的使用成本提供了可能。 本發明的具體步驟如下1)將腸溶衣材料Eudragit L-100均勻地分散於pH值5. 5的醋酸-醋酸鈉緩衝液中；2) 先後加入溶解於pH 5. 5的醋酸-醋酸鈉緩衝液中的纖維素酶液和交聯 劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3 6小時；3) 用3M醋酸調節pH值為3. 8，在5000rpm下離心10min;4) 沉澱溶解於pH 5. 8的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，即得到所需的固定化纖 維素酶。所述的載體腸溶衣材料Eudragit L-IOO溶液濃度為質量體積比(W/V)濃 度2 5%。所述的交聯劑EDC用量為0.3g/g載體。所述的固定化纖維素酶中蛋白質載量為10 100mg蛋白/g載體。 本發明的優點在於可通過溶液pH的變化方便地實現固定化酶的均相酶解 和異相回收，也能夠確保固定化酶在均相狀態下對不溶性纖維素材料的高效酶 解，以及酶解後副產物木質素的快速分離，具有反覆使用多次，酶活保留率變 化不大的優點，製備過程簡單方便，可大大降低纖維素酶的使用成本，具有較 好的推廣應用價值。
具體實施方式
為更好地理解本發明，下面結合實施實例對本發明作進一步描述。本實施例採用德國羅姆公司生產的腸溶衣載體材料Eudragit L-100 (Eudragit L-IOO，德國羅姆公司(R5hm GmbH & Co. KG， Darmstadt, Germany) 生產，由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯(1: 1)共聚而成，產品標準符合USP/NF/Ph. Eur.，深圳市優普惠實業發展有限公司代售)。將lg腸溶衣Eudragit L-100均勻地分散於pH值5. 5的0. 1M醋酸-醋酸鈉緩衝液中，配置成2%的載體溶液;加入濃度為15mg/mL的纖維素酶液4mL和0. 3g的交聯劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3 6小時；用3M的醋酸調節pH值為3.8，5000rpm下離心10min;將沉澱溶解於pH 5. 8的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，即得到所需的固定化纖維素酶。以Whatman 1號定性濾紙為底物，在固定化酶溶解狀態下測定纖維素酶的活力，該固定化酶的使用8次後活性回收率為60%，蛋白保留率為48. 71%。
權利要求
1、一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法，其特徵在於包括如下步驟1)將腸溶衣材料Eudragit L-100均勻地分散於pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩衝液中；2)先後加入溶解於pH5.5的醋酸-醋酸鈉緩衝液中的纖維素酶液和交聯劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3～6小時；3)用3M醋酸調節pH值為3.8，在5000rpm下離心10min；4)沉澱溶解於pH5.8的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，即得到所需的固定化纖維素酶。
2、 如權利要求1所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法，其特徵在於所 述的載體腸溶衣材料Eudragit L-100溶液質量體積比濃度為2 5%。
3、 如權利要求1所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法，其特徵在於所 述的交聯劑EDC用量為0. 3g/g載體。
4、 如權利要求1所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法，其特徵在於所 述的固定化纖維素酶中蛋白質載量為10 100mg蛋白/g載體。
5、 如權利要求4所述的腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法，其特徵在於纖 維素酶液濃度為10 100mg/mL。
全文摘要
本發明提供了一種腸溶衣材料固定化纖維素酶的製備方法。其步驟包括1)將腸溶衣材料Eudragit L-100均勻地分散於pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩衝液中；2)先後加入溶解於pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩衝液中的纖維素酶液和交聯劑EDC，室溫下緩慢攪拌固定3～6小時；3)用3M醋酸調節pH值為3.8，在5000rpm下離心10min；4)沉澱溶解於pH 5.8的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，即得到固定化纖維素酶。本發明可通過溶液pH的變化方便地實現固定化酶的均相酶解和異相回收，也能夠確保固定化酶在均相狀態下對不溶性纖維素材料的高效酶解，以及酶解後副產物木質素的快速分離，具有反覆使用多次，酶活保留率變化不大的優點，製備過程簡單方便，可大大降低纖維素酶的使用成本，具有較好的推廣應用價值。
文檔編號C12N11/00GK101225380SQ200810026158
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月31日 優先權日2008年1月31日
發明者呂鵬梅, 莊新姝, 宇 張, 東 李, 袁振宏, 許敬亮 申請人:中國科學院廣州能源研究所