Pcr擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法

2023-10-06 15:55:24 2

Pcr擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物【技術領域】的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，包括如下步驟：以重組目的基因的表達質粒為模板，設計PCR引物；其中，正向PCR引物位於質粒啟動子（目的基因對應啟動子）上遊，反向PCR引物位於質粒轉錄終止子（目的基因對應終止子）下遊；以重組目的基因的表達質粒為PCR模板，通過所設計的PCR引物進行PCR擴增；回收PCR產物；選取PCR產物，按照Lonza公司核轉試劑盒標準操作程序進行細胞轉染。與核轉質粒相比，核轉PaGene能夠顯著降低懸浮動物細胞的死亡率；PaGene在保證核轉懸浮動物細胞較低死亡率的情況下，轉染效率亦沒有顯著降低或降低很少。
【專利說明】PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法。
【背景技術】
[0002]核酸轉染細胞(非編碼小RNA、信使RNA、或者質粒)被廣泛應用於功能基因組學研究、疫苗研究、轉錄調控研究、幹細胞研究、炎症性疾病治療研究等方面；用於細胞系或者原代細胞轉染的方法可以分為兩類:一類是基於病毒的轉染方法；另一類是不基於病毒的轉染方法。對於不基於病毒的轉染方法，電轉(Electrophoration)是其中最重要的方法之一(特別是對於懸浮細胞)，電轉的基本原理是通過電擊造成細胞質膜短暫的通透，以便於核酸能夠進入細胞。作為電轉的升級版，核轉(Nucleofection)綜合了電擊以及細胞特異的溶液，能夠保證細胞較理想的轉染效率以及細胞活力，特別是對於那些很難轉染的細胞。
[0003]Kasum1-1細胞系是來自於一位患M2型急性髓系白血病(Acute myeloid leukemiaM2)的日本男孩的外周血，該細胞系在白血病發病機理的研究中被廣泛使用。然而，研究人員在Kasum1-1細胞的常規核轉實踐中發現，用質粒核轉總是會誘導更加嚴重的細胞死亡以及更低的轉染效率，質粒核轉所導致的高死亡率有可能影響所轉染目的基因生物作用的客觀準確解讀，現有技術中亟需一種可靠的核轉Kasum1-1細胞的方法，以便進行涉及Kasum1-1核轉的相關功能實驗。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法。本發明的方法保證了目的基因核轉懸浮動物細胞後，能夠較客觀的觀察感興趣基因本身對懸浮動物細胞所造成的生物影響，排除了核轉質粒後所造成的非特異細胞死亡對基因真實生物作用的掩蓋。
[0005]本發明涉及一種PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，包括如下步驟:
[0006]步驟一，以重組目的基因的表達質粒為模板，設計PCR引物；其中，正向PCR引物位於質粒啟動子上遊,反向PCR引物位於質粒轉錄終止子下遊；
[0007]步驟二，以重組目的基因的表達質粒為PCR模板，通過所設計的PCR引物進行PCR擴增；PCR擴增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶；
[0008]步驟三，回收PCR產物，即PaGene，並定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度；
[0009]步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉試劑盒標準操作程序進行細胞轉染，所用PaGene用與對應質粒相同摩爾數的劑量進行核轉，進而完成PaGene核轉懸浮動物細胞。
[0010]優選地，所 述目的基因可為任何編碼蛋白的基因。
[0011]優選地，所述重組目的基因的表達質粒可為非誘導型表達蛋白的質粒。
[0012]優選地，所述方法包括如下步驟:[0013]懸浮動物細胞在含有適當比例胎牛血清的懸浮動物細胞培養基中培養，培養環境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(E.coli)工具菌株被用於質粒的保存和擴增；用相應試劑盒抽提質粒；所抽提質粒被用於目的蛋白編碼基因的擴增；所擴增基因被命名為PaGene ；
[0014]所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其對應PCR引物進行擴增；正向引物位於基因啟動子上遊，反向引物位於基因轉錄終止子下遊；正反向引物的位置保證目的蛋白編碼基因在細胞內能夠成功轉錄和翻譯；PaGene用相應試劑盒純化,進而用於核轉懸浮動物細胞；
[0015]DNA濃度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相應分光光度計測定，以反應對應核酸的完整性和純度；PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進行質控；
[0016]取懸浮動物細胞被用於核轉；
[0017]核轉所用溶液及程序採用Lonza公司就對應細胞系的說明書進行或者採用常規核轉條件；核轉後，細胞被轉移至37°C預熱的懸浮動物細胞完全培養基中繼續培養；
[0018]進而完成PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞；與核轉質粒相比，核轉PaGene能夠顯著降低懸浮動物細胞的死亡率；PaGene在保證核轉懸浮動物細胞較低死亡率的情況下，轉染效率沒有顯著降低或降低很少。
[0019]優選地，所述懸浮動物細胞為Kasum1-1細胞、NB4細胞或THP-1細胞。
[0020]優選地，所述PCR擴增基因核轉Kasum1-1細胞的方法包括如下步驟:
[0021]步驟一，以重組目的基因的表達質粒為模板，設計PCR引物；其中，正向PCR引物位於質粒啟動 子上遊,反向PCR引物位於質粒轉錄終止子下遊；
[0022]步驟二，以重組目的基因的表達質粒為PCR模板，通過所設計的PCR引物進行PCR擴增；PCR擴增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶；
[0023]步驟三，回收PCR產物，即PaGene，並定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度；
[0024]步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉試劑盒標準操作程序進行細胞轉染，核轉程序為P-19,核轉所用溶液為solution V,即kit V,所用PaGene用與對應質粒相同摩爾數的劑量進行核轉，進而完成PaGene核轉Kasum1-1細胞。
[0025]優選地，步驟一中，所述目的基因為EGFP基因或螢火蟲螢光素酶基因。
[0026]優選地，步驟一中，所述重組目的基因的表達質粒為BD Biosciences的質粒pEGFP-N2 或 Promega 的質粒 pGL3_Control。
[0027]優選地,步驟二中，所述DNA聚合酶為Toyobo公司的KOD Plus ；
[0028]所述引物具體為=PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQID N0.4 所示。
[0029]優選地，其特徵在於，步驟四中，所用PaGene劑量以2 μ g對應質粒所對應等摩爾數的劑量進行核轉。
[0030]優選地，所述方法包括如下步驟:
[0031]Kasum1-1細胞在含有15%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，培養環境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(Ε.coli)菌株TOPlO被用於質粒的保存和擴增；用NucleoBond Xtra Midi試劑盒抽提質粒 pEGFP_N2 和 pGL3_Control ;用 AxyPrep? Plasmid Miniprep 試劑盒準備空E.coli TOPlO的洗脫液；所抽提質粒被用於EGFP和Iuciferase的擴增；所擴增基因分別被命名為PaEGFP和PaLuc ；
[0032]所述兩個基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus和其對應PCR引物進行擴增；正向引物位於基因啟動子上遊，EGFP在pEGFP-N2的啟動子為Paw IE ；luciferase在pGL3-Control的啟動子為SV40啟動子；反向引物位於轉錄終止子下遊，EGFP在pEGFP_N2的終止子為早期poly (A)信號；luciferase在pGL3_Control的終止子為SV40晚期poly (A)信號；正反向引物的位置保證PaEGFP和PaLuc能夠在細胞內成功轉錄和翻譯；所述引物具體為:PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示；
[0033]PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up試劑盒純化,進而用於核轉Kasum1-Ι細胞；
[0034]DNA 濃度以及 A260/A280 和 A260/A230，比值皆≥ 1.8，用 Nano Drop NDlOOO 分光光度計測定，以反應對應核酸的完整性和純度；質粒和PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進行質控；
[0035]Kasum1-1細胞與10 μ M等體積的eFluor670混合，並在37°C避光孵育IOmin ;之後加入4-5倍體積預冷的RPMI1640完全培養基，所述RPMI1640完全培養基為RPMI1640+15%胎牛血清，並且冰浴5min以終止標記，之後用RPMI1640完全培養基洗滌3遍，所標記細胞被用於後續核轉；
[0036]2X IO6Kasum1-1細胞被用於核轉，所述細胞預先標記或沒有標記細胞增殖染料eFluor670 ；
[0037]核轉所用溶液為solution V，即kit V，程序為P-19 ;核轉後，細胞被轉移至37°C預熱的RPMI1640完全培養基中繼續培養；
[0038]對於PaEGFP和pEGFP_N2，每次核轉的劑量分別為680ng PaEGFP和2000ngPEGFP-N2，具有相同摩爾數；SE.coli洗脫液亦被用於核轉，以便檢測樣品中殘留的內毒素是否對細胞有潛在的致死效果；對於PaLuc和pGL3-Control，核轉劑量分別為830ngPaLuc和2000ng pGL3_Control,相同摩爾數；與PaGene相同質量的對應質粒亦被用於核轉，具體為 PEGFP-N2 680ng, pGL3_Control830ng ；
[0039]進而完成PCR擴增基因核轉Kasum1-1細胞；與核轉質粒相比,核轉PaGene能夠顯著降低Kasum1-1細胞的死亡率,核轉PaGene的Kasum1-1細胞能夠較好增殖,PaGene在保證核轉Kasum1-1細胞較低死亡率的情況下，轉染效率沒有顯著降低或降低很少。
[0040]本發明具有如下的有益效果:(I)與核轉質粒相比，核轉PaGene能夠顯著降低懸浮動物細胞的死亡率；(2) PaGene在保證核轉懸浮動物細胞較低死亡率的情況下，轉染效率亦沒有顯著降低或降低很少；本發明的方法保證了目的基因核轉懸浮動物細胞後，能夠較客觀的觀察感興趣基因本身對懸浮動物細胞所造成的生物影響，排除了核轉質粒後所造成的非特異細胞死亡對基因真實生物作用的掩蓋。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯:
[0042]圖1為以質粒為模板進行基因PCR擴增以及實驗設計示意圖；[0043]圖2為PaGene及其對應表達質粒的瓊脂糖凝膠電泳結果；
[0044]圖3為核轉Kasum1-1細胞的細胞活力和GFP+比例結果；
[0045]圖4為核轉Kasum1-1細胞的顯微鏡觀察結果；
[0046]圖5為通過其它方法對核轉Kasum1-1細胞增殖能力的檢測結果；
[0047]圖6為核轉後Kasum1-1細胞表達外源蛋白的定量結果；
[0048]圖7為核轉後NB4和THP-1細胞的細胞活力和GFP+比例結果。
【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件，例如薩姆布魯克等分子克隆:實驗手冊第三版(科學出版社，2002)中所述的條件，或者按照各製造商所建議的條件。
[0050]實施例1、PCR擴增基因(PaGene)核轉Kasum1-1細胞
[0051] 申請人:發現表達質粒核轉Kasum1-1細胞後，導致Kasum1-1細胞大量死亡； 申請人:經過大量的實驗，意外地發現，採用如下方法處理後能夠顯著減少核轉Kasum1-1細胞的死亡率、以及保持較理 想的細胞轉染效率和較高的細胞增殖，以便為後續涉及Kasum1-1細胞核轉的相關功能實驗提供可行的核轉方法；所述方法以表達質粒為模板，通過PCR擴增目的基因(PaGene);所擴增PaGene包含基因啟動子、蛋白編碼區、以及轉錄終止子；保證PaGene能夠在細胞內成功的轉錄和翻譯,之後用PaGene核轉Kasum1-1細胞。
[0052]本實施例涉及一種PaGene核轉Kasum1-1細胞的方法,主要以增強型綠色突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)為工具報告基因，在 Kasum1-1 細胞中進行的核轉實驗，具體內容如下，以下實施例中涉及到的相關試劑及材料均可以通過公開的市售渠道獲得。
[0053]細胞系和大腸桿菌菌株
[0054]Kasum1-1細胞(能夠通過市售的公開渠道獲得)在含有15%胎牛血清(Gibco)的RPMI1640培養基中培養(Gibco)，培養環境為37°C、5%C02。大腸桿菌(Escherochia coli,
E.coli)菌株 T0P10 (Invitrogen-Life Technologies)被用於質粒的保存和擴增。
[0055]質粒和PCR 擴增基因(PCR amplified gene, PaGene)的準備
[0056]用NucleoBond Xtra Midi 試劑盒(Macherey-Nagel)抽提質粒 pEGFP_N2 (BDBiosciences)和 pGL3_Control (Promega)0
[0057]用AxyPrep? Plasmid Miniprep 試劑盒(Axygen)準備空 Ε.coli T0P10 的洗脫液(按照標準質粒抽提步驟。該空E.coli洗脫液中可能含有內毒素，用以鑑定殘存的內毒素是否在Kasum1-1細胞核轉過程中對細胞有致死作用)。所抽提質粒被用於EGFP和螢火蟲螢光素酶基因(Firefly luciferase)的擴增。所擴增基因分別被命名為PaEGFP (PCR ampIiedEGFP)和 PaLuc (PCR amplified luciferase)。
[0058]具體來講，這兩個基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus(Toyobo)和其對應PCR引物(表1，引物合成於英濰捷基(上海)貿易有限公司)進行擴增。正向引物位於基因啟動子上遊(EGFP在pEGFP-N2的啟動子為Pcmv ie ;luciferase在pGL3_Control的啟動子為SV40啟動子)；反向引物位於轉錄終止子下遊(EGFP在pEGFP-N2的終止子為早期poly (A)信號；luciferase在pGL3_Control的終止子為SV40晚期poly (A)信號)(圖1)。
[0059]圖1，以質粒為模板進行基因PCR擴增以及實驗設計示意圖。IH向引物位於基因啟動子上遊；反向引物位於基因終止子下遊。用具有校IH功能的DNA聚合酶擴增目的基因。PaGene進一步被純化，並被用於Kasum1-1細胞核轉(同時亦包括其對應表達質粒的核轉比較)。表達質粒的核轉劑暈為兩個:一個劑暈與PaGene等質暈；另一個劑暈與PaGene等摩爾數。
[0060]正反向引物的位置保證PaEGFP和PaLuc能夠在細胞內成功轉錄和翻譯。PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up試劑盒(Axygen)純化,進而用於核轉Kasum1-Ι細胞。
[0061]DNA 濃度以及 A260/A280 和 A260/A230 (比值皆大於 1.8)用 Nano Drop NDlOOO 分光光度計(Thermo Scientific)測定，以反應對應核酸的完整性和純度。
[0062]質粒和PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進行質控(圖2)。圖2, PaGenes及其對應表汰質粒的掠脂糖凝膠電泳。(A),dEGFP-N2和PaEGFP的凝膠電泳。(B),DGL3_Control和PaLuc的凝膠電泳。DNA分子量參照DL2000和DL15, 000購自於Takara,對應備帶分子量大小(鹼基對，basepair,簡稱bp)標記於電$永圖左偵!I。
[0063]表1 PaEGFP和PaLuc PCR擴增所用的引物序列
[0064]
【權利要求】
1.一種PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 步驟一，以重組目的基因的表達質粒為模板，設計PCR引物；其中，正向PCR引物位於質粒啟動子上遊，反向PCR引物位於質粒轉錄終止子下遊； 步驟二，以重組目的基因的表達質粒為PCR模板，通過所設計的PCR引物進行PCR擴增；PCR擴增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶； 步驟三，回收PCR產物，即PaGene，並定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度； 步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉試劑盒標準操作程序進行懸浮動物細胞轉染，所用PaGene用與對應質粒相同摩爾數的劑量進行核轉，進而完成PaGene核轉懸浮動物細胞。
2.如權利要求1所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，所述目的基因可為任何編碼蛋白的基因。
3.如權利要求1所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，所述重組目的基因的表達質粒可為非誘導型表達蛋白的質粒。
4.如權利要求1所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: 懸浮動物細胞在含有適當比例胎牛血清的懸浮動物細胞培養基中培養，培養環境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(E.coli)工具菌株被用於質粒的保存和擴增；用相應試劑盒抽提質粒；所抽提質粒被用於目的 蛋白編碼基因的擴增；所擴增基因被命名為PaGene ； 所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其對應PCR引物進行擴增；正向引物位於基因啟動子上遊，反向引物位於基因轉錄終止子下遊；正反向引物的位置保證目的蛋白編碼基因在細胞內能夠成功轉錄和翻譯；PaGene用相應試劑盒純化,進而用於核轉懸浮動物細胞； DNA濃度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相應分光光度計測定，以反應對應核酸的完整性和純度；PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進行質控； 取懸浮動物細胞被用於核轉； 核轉所用溶液及程序採用Lonza公司就對應細胞系的說明書進行或者採用常規核轉條件；核轉後，細胞被轉移至37°C預熱的懸浮動物細胞完全培養基中繼續培養； 進而完成PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞；與核轉質粒相比，核轉PaGene能夠顯著降低懸浮動物細胞的死亡率；PaGene在保證核轉懸浮動物細胞較低死亡率的情況下，轉染效率沒有顯著降低或降低很少。
5.如權利要求1所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，所述懸浮動物細胞為Kasum1-1細胞、NB4細胞或THP-1細胞。
6.如權利要求5所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，所述PCR擴增基因核轉Kasum1-1細胞的方法包括如下步驟: 步驟一，以重組目的基因的表達質粒為模板，設計PCR引物；其中，正向PCR引物位於質粒啟動子上遊，反向PCR引物位於質粒轉錄終止子下遊； 步驟二，以重組目的基因的表達質粒為PCR模板，通過所設計的PCR引物進行PCR擴增；PCR擴增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶；步驟三，回收PCR產物，即PaGene，並定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度； 步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉試劑盒標準操作程序進行細胞轉染，核轉程序為P-19，核轉所用溶液為solution V，即kit V，所用PaGene用與對應質粒相同摩爾數的劑量進行核轉，進而完成PaGene核轉Kasum1-1細胞。
7.如權利要求6所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，步驟一中，所述目的基因為EGFP基因或螢火蟲螢光素酶基因。
8.如權利要求6所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，步驟一中，所述重組目的基因的表達質粒為BD Biosciences的質粒pEGFP_N2或Promega的質粒pGL3-Control。
9.如權利要求6所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，步驟二中，所述DNA聚合酶為Toyobo公司的KOD Plus ； 所述引物具體為=PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQID N0.2所示;PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示。
10.如權利要求6所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，步驟四中，所用PaGene劑量以2 μ g對應質粒所對應等摩爾數的劑量進行核轉。
11.如權利要求6所述的PCR擴增基因核轉懸浮動物細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: Kasum1-1細胞在含有15%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，培養環境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(Ε.coli)菌株TOPlO被用於質粒的保存和擴增；用NucleoBond Xtra Midi試劑盒抽提質粒 pEGFP_N2 和 pGL3_Control ;用 AxyPrep? Plasmid Miniprep 試劑盒準備空E.coli TOPlO的洗脫液；所抽提質粒被用於EGFP和Iuciferase的擴增；所擴增基因分別被命名為PaEGFP和PaLuc ； 所述兩個基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus和其對應PCR引物進行擴增；正向引物位於基因啟動子上遊，EGFP在pEGFP-N2的啟動子為Paw IE ;Iuciferase在pGL3-Control的啟動子為SV40啟動子；反向引物位於轉錄終止子下遊，EGFP在pEGFP_N2的終止子為早期poly (A)信號；luciferase在pGL3_Control的終止子為SV40晚期poly (A)信號；正反向引物的位置保證PaEGFP和PaLuc能夠在細胞內成功轉錄和翻譯；所述引物具體為:PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示； PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up試劑盒純化,進而用於核轉Kasum1-Ι細胞； DNA濃度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用Nano Drop NDlOOO分光光度計測定，以反應對應核酸的完整性和純度；質粒和PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進行質控； Kasum1-1細胞與10 μ M等體積的eFluor670混合，並在37°C避光孵育IOmin ;之後加入4-5倍體積預冷的RPMI1640完全培養基，所述RPMI1640完全培養基為RPMI1640+15%胎牛血清，並且冰浴5min以終止標記，之後用RPMI1640完全培養基洗滌3遍，所標記細胞被用於後續核轉； 2X 1O 6Ka sum 1-1細胞被用於核轉，所述細胞預先標記或沒有標記細胞增殖染料eFluor670 ； 核轉所用溶液為solution V，即kit V，程序為P-19 ;核轉後，細胞被轉移至37°C預熱的RPMI1640完全培養基中繼續培養；
對於PaEGFP和pEGFP-N2，每次核轉的劑量分別為680ng PaEGFP和2000ng pEGFP_N2，具有相同摩爾數；空E.coli洗脫液亦被用於核轉，以便檢測樣品中殘留的內毒素是否對細胞有潛在的致死效果；對於PaLuc和pGL3-Control，核轉劑量分別為830ng PaLuc和2000ng pGL3-Control,相同摩爾數；與PaGene相同質量的對應質粒亦被用於核轉,具體為pEGFP_N2 680ng, pGL3-Control830ng ； 進而完成PCR擴增基因核轉Kasum1-1細胞；與核轉質粒相比,核轉PaGene能夠顯著降低Kasum1-1細胞的死亡率,核轉PaGene的Kasum1-1細胞能夠較好增殖,PaGene在保證核轉Kasum1-1細胞較低死亡率的情況下，轉染效率沒有顯著降低或降低很少。
【文檔編號】C12N15/87GK103740760SQ201410010269
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月7日
【發明者】吳康, 範小勇, 黃家穎, 趙旭傑 申請人:上海市公共衛生臨床中心