高通量鑑定甜瓜雜交種純度的方法與流程
2023-10-27 02:53:42 1
本發明屬於蔬菜育種與應用技術領域，涉及一種高通量鑑定甜瓜雜交種純度的方法。
背景技術：
甜瓜是傳統的特色水果和瓜農就業增收的主要經濟作物。甜瓜雜交種的種子純度是種子質量的核心指標，隨著甜瓜產業的發展和生產的需求，越來越多的優質、抗病新品種湧入市場，但由於雜交種子中混入了母本種子導致純度不達標，引起的種子糾紛時有發生，給瓜農造成很大的經濟損失，因此為了保護育種者、種子經營者及瓜農的利益，研究並建立快速、準確有效的種子純度鑑定方法是非常重要的。
在眾多分子標記技術中，ssr技術因其多態性高、操作簡便、結果穩定可靠等優點，在甜瓜、黃瓜、西瓜等瓜類作物的雜交種純度鑑定方面得到了廣泛應用。甜瓜核基因組ssr標記呈現共顯性遺傳方式，電泳檢測時，f1帶型為雙親互補帶型，只能通過單株檢測才能顯示f1種子中混入的母本種子，工作量較大。而在甜瓜雜交種子純度鑑定工作中，母本株通常較少，如果能夠通過混合樣品檢測就可顯示母本的有無，從而迅速判定混合樣品的整體純度，將大幅度減少工作量，顯著提高工作效率，因此，急需尋找能夠進行混合樣品分析的分子標記技術。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種高通量鑑定甜瓜雜交種純度的方法。
本發明提供了一種高通量鑑定甜瓜品種a的雜交種中是否混有其母本自交種的方法，其原理在於：甜瓜的線粒體基因組呈現獨特的父系遺傳特性。電泳檢測時，純合的f1帶型和父本帶型一樣；如果f1帶型是雙親帶型，將表示f1種子中混入了母本種子。該方法具體可包括如下步驟：
(a1)從待測甜瓜種子中隨機選取若干數目的種子，提取基因組dna，混合後形成混合樣本dna；
(a2)以步驟(a1)所得混合樣本dna作為模板，採用根據甜瓜線粒體基因組開發的ssr引物對進行pcr擴增，得到擴增產物；
(a3)將步驟(a2)所得擴增產物進行凝膠電泳，根據電泳譜圖按照如下確定所述待測甜瓜種子是否均為甜瓜品種a的雜交種：若所述電泳圖譜上具有所述甜瓜品種a的父本的特徵譜帶且不具有所述甜瓜品種a的母本的特徵譜帶，則所述待測甜瓜種子均為所述甜瓜品種a的雜交種，不含其母本自交種；若所述電泳圖譜上同時具有所述甜瓜品種a的父本的特徵譜帶和所述甜瓜品種a的母本的特徵譜帶，則所述待測甜瓜種子中除了所述甜瓜品種a的雜交種外混有其母本自交種。
所述待測甜瓜種子為所述甜瓜品種a的雜交種，或者所述甜瓜品種a的雜交種與其母本自交種的混合。
在所述方法的步驟(a1)中，所述若干數目可為大於等於2且小於50的整數(如20-40)。
進一步，在本發明的一個實施例中，所述若干數目具體為20，即步驟(a1)中，每20個種子一混合。
在所述方法中，所述凝膠電泳具體為聚丙烯醯胺凝膠電泳；如非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳；更加具體如8％非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。
在本發明中，所述8％非變性聚丙烯醯胺溶液具體由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％(質量百分比)acr-bis、40μltemed、400μl10％(質量百分比)ap配製而成。
在所述方法中，將所述擴增產物經8％非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，220v穩壓電泳直至溴酚藍指示劑遷移至可以使擴增dna片段能夠被清楚識別的距離時，停止電泳；銀染法染色，拍照記錄特徵譜帶。
在所述方法中，從種子中提取基因組dna具體為從種子所發幼芽中提取基因組dna。更加具體的，為：將待測樣品種子35℃發芽3-4天，取1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩衝液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存備用。
在所述方法中，進行pcr擴增採用的反應體系如下：基因組dna20ng、含mg2+的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l-11μl，上下遊引物0.25mmol·l-1各1μl，taq酶5u·μl-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。
在所述方法中，進行pcr擴增採用的退火溫度為55℃。更加具體的，進行pcr擴增採用的擴增程序如下：94℃下預變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環反應；72℃延伸5min；16℃永久保存。
在本發明的一個實施例中，所述甜瓜品種a為甜瓜品種「糖妃極品」。步驟(a2)中，所述根據甜瓜線粒體基因組開發的ssr引物對為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna組成的引物對。相應的，所述「糖妃極品」的父本的特徵譜帶是大小為255bp的目的條帶；所述「糖妃極品」的母本的特徵譜帶是大小為243bp的目的條帶。
本發明還請求保護用於鑑定甜瓜「糖妃極品」雜交種純度的引物對。
所述引物對具體由序列表中序列1和序列2所示兩條單鏈dna組成。
所述引物對在如下(b1)或(b2)中的應用也屬於本發明的保護範圍：
(b1)鑑定甜瓜「糖妃極品」雜交種純度；
(b2)製備用於鑑定甜瓜「糖妃極品」雜交種純度的試劑盒。
其中，所述鑑定甜瓜「糖妃極品」雜交種純度可為高通量鑑定甜瓜「糖妃極品」雜交種純度。
本發明的有益效果是：通過合理混合樣品dna，避免了單株分析，具有簡單、高效等優勢。可以將至少20株樣品dna進行混合，1次pcr檢測即可顯示混合樣品中是否存在母本，大幅度減少了鑑定工作量，將鑑定效率提高20倍左右，具有較高的商業應用價值。
附圖說明
圖1為利用引物mtssr073擴增「糖妃極品」f1及其父本、母本和不同比例dna混合樣品的pcr電泳結果。♀表示母本，♂表示父本，f1表示「糖妃極品」，1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50表示混合樣品dna中的母本與f1體積比。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、用於高通量檢測甜瓜「糖妃極品」雜交種混合樣品純度的方法
一、篩選用於鑑定甜瓜「糖妃極品」純度的mtssr引物
從genbank下載甜瓜線粒體基因組序列，使用mreps2.5ssr序列鑑定程序，鑑定甜瓜線粒體基因組中含ssr的序列區段，同時設計出跨越ssr位點的pcr引物；
以「糖妃極品」母本、父本、f1為dna模板進行引物篩選，獲得條帶清晰、差異大、重複性好的引物mtssr073，其序列為；
mtssr073f：5』-tgtcgagttcactctttcattag-3』(序列1)；
mtssr073r：5』-ttcattctttgctctcgttatac-3』(序列2)。
二、利用特異性引物mtssr073對甜瓜「糖妃極品」雜交種子混合樣品進行純度鑑定
1、樣品dna的快速提取：將供試甜瓜「糖妃極品」以及其父本和母本的種子，35℃發芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩衝液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存備用；
2、樣品dna混合：按照母本與f1(即「糖妃極品」)的體積比為1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的體積比進行樣品dna混合；
3、pcr擴增
①反應體系
12.5μl反應體系如下：基因組dna20ng、含mg2+的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l-11μl，上下遊引物0.25mmol·l-1各1μl，taq酶5u·μl-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。
②反應條件
94℃下預變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環；72℃延伸5min；16℃永久保存；
4、聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳
擴增產物在8％聚丙烯醯胺非變性凝膠(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配製而成。％均表示質量百分比)電泳分離，120v穩壓1.5小時，電泳結束後，0.1％agno3銀染6min；然後用2％naoh、0.4％甲醛顯色，直至條帶清晰即可。
5、拍照記錄樣品dna的特徵譜帶。
6、擴增結果分析：
mtssr073引物在「糖妃極品」父本、母本均可以擴增出特異標記，母本表現為243bp的特徵譜帶，父本表現為相異於母本的255bp特徵譜帶，f1表現和父本一樣的255bp特徵譜帶。
混合樣品中，當混合比例為1:1、1:5、1:10、1:20時，混合樣品中均顯示出清晰的243bp母本條帶，說明當混樣株數達到20株時，樣品中即使只有1株母本株，也可以被檢測出來。但是，當混合樣品比例降低到1:30甚至1:40時，243bp的母本條帶變弱；混合樣品比例降低到1:50時弱帶消失。說明當混樣株數達到50株時，如果樣品中有1株母本株，將很難被檢測，影響純度鑑定結果的準確性。具體結果如圖1所示。
實施例2、採用混合樣品法高通量檢測「糖妃極品」雜交種樣品純度
一、樣品dna的快速提取
將待測試的「糖妃極品」f1種子100粒，35℃發芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩衝液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存備用；
二、樣品dna混合
將「糖妃極品」f1種子dna，按照每20株一混，形成5個混合樣品。混合的20株樣品，單株體積相同。
三、pcr擴增
1、反應體系
12.5μl反應體系如下：基因組dna20ng、含mg2+的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l-11μl，上下遊引物0.25mmol·l-1各1μl，taq酶5u·μl-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。
其中，基因組dna分為兩組：一組為單株dna；另一組為混樣dna。即實驗中採用單株檢測和混樣高通量檢測兩種方法平行進行，以驗證高通量檢測方法的準確性。
2、反應條件
94℃下預變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環；72℃延伸5min；16℃永久保存；
四、聚丙烯醯胺凝膠凝膠電泳
擴增產物在8％聚丙烯醯胺非變性凝膠(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配製而成。％均表示質量百分比)電泳分離，120v穩壓1.5小時，電泳結束後，0.1％agno3銀染6min；然後用2％naoh、0.4％甲醛顯色，直至條帶清晰即可。拍照記錄樣品dna的特徵譜帶。
五、擴增結果分析
採用單株dna進行pcr分析時，100株f1單株中有1株表現為母本帶型，說明100株單株中混入了一株母本株；
採用混合樣品dna進行pcr分析時中，只有混樣1表現為雜合帶型，說明20株f1單株中混入了母本，其餘4個混樣均表現為父本帶型，表明這80株均為純合的f1單株。將混樣1進行單株檢測，發現確實有1株母本，與單株檢測結果一致。
北京市農林科學院
高通量鑑定甜瓜雜交種純度的方法
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