一種腫瘤幹細胞的分離方法

2023-10-26 21:45:22 2

一種腫瘤幹細胞的分離方法
【專利摘要】本發明公開了一種腫瘤幹細胞的分離方法，該方法為將腫瘤細胞消化為單個細胞後，再加入消化酶液孵育數小時；將孵育後的細胞加入含血清的細胞培養液進行貼壁生長；細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養；當細胞長滿後，重複多次前述操作後，將獲得的細胞進行微球培養，最終獲得的微球即為腫瘤幹細胞。本發明首次使用多種消化酶或者結合其他物理應激條件刺激多種腫瘤細胞，可以穩定地獲得不同類型的TSC；本發明分離的MuseTSC擁有極強的腫瘤乾性，均質性好，穩定，因此該方法的建立使獲得不同類型的TSC得以標準化，並且更加簡單經濟，適合大規模構建TSC庫所用，以滿足常規腫瘤生物醫學基礎研究、臨床研究以及藥物開發等工作需求。
【專利說明】一種腫瘤幹細胞的分離方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於腫瘤幹細胞【技術領域】，涉及一種腫瘤幹細胞的分離方法。

【背景技術】
[0002] 近年來大量報導發現腫瘤中有極少數的一群細胞，其惡性程度極高，當病人放化 療後大的腫瘤塊隨即消失，然而這些極少量的細胞仍然能夠存活，PET-CT也不能夠檢測其 存在，而正是這些惡性細胞復發以後，便更加兇猛，大量轉移吞噬生命，這些細胞就是腫瘤 幹細胞(腫瘤幹細胞，tumor stem cell, TSC ;或叫癌幹細胞，cancer stem cell, CSC;腫瘤 起始細胞，tumor initiating cell，TIC ;癌起始細胞，cancer initiating cell，CIC)，當今 許多主流的觀點認為放化療富集的腫瘤幹細胞是導致傳統治療方法失敗的主要原因。2006 年美國癌症研究協會給出TSC的定義是：腫瘤中具有自我更新能力並能分化產生異質性腫 瘤細胞的細胞，它的自我更新能力以及分化能力完全滿足幹細胞特有的兩個主要特徵，而 這兩個特徵正是造成腫瘤復發和腫瘤轉移的必要原因。普通的腫瘤細胞在非肥胖糖尿病/ 重症聯合免疫缺陷（N0D/SCID)老鼠體內需要十萬到百萬級別的數量才能夠成瘤，而TSC僅 需要數十個到數百個細胞便能成瘤，甚至1-10個TSC便能成瘤，可見其極高的致瘤性和惡 性，因此解決TSC的問題是未來癌症研究和治療最重要的方向之一。
[0003] 1997年Bonnet等通過對急性粒細胞白血病幹細胞的研究，證明了大多數白血病 細胞不能持續增殖，只有少數表型為CD34+CD381 勺細胞可以在N0D/SCID小鼠體內成瘤，第 一次證實了 TSC的存在。2003年，AlHajj等從乳腺癌組織中分離出表型為⑶44+CD24-/lQW Lineage的乳腺癌細胞，這是首次分離出實體瘤幹細胞。迄今為止，已經在白血病、腦腫瘤、 肺癌、前列腺癌、結腸癌、肝癌、鼻咽癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤中 分離出TSC。
[0004] 雖然目前有越來越多的證據支持TSC理論，但TSC的研究仍然存在許多問題：首 先，並不是所有腫瘤中都分離到了 TSC ;其次，TSC分離和鑑定的技術仍不完善；第三，還沒 有確定的TSC特異性表面標誌；第四，TSC的起源、發生、分子細胞機制的研究還不夠深入， 仍有許多重大問題以待解決。而要解決這些問題，就需要大量的TSC作為基礎，而國際上還 未有專門提供各種TSC的機構，由此可見TSC的來源非常匱乏，通常基礎研究或臨床研究所 需的TSC大多是自己構建或者與報導文獻的作者聯絡索取，其時間耗費長，成本高，且品種 不全，限制頗多。由於TSC分離和鑑定技術尚不完善及難度較大，更加阻滯了 TSC相關研究 的步伐，建立一個通用性高，操作簡便適合大規模建庫的TSC製備方法已經迫在眉睫。
[0005] 構建TSC細胞庫所要面對的首要問題就是從腫瘤細胞或者腫瘤組織中分離出 TSC，由於TSC在腫瘤組織中所佔的比例很小，迄今仍有很多類型腫瘤的TSC沒有被分離出 來。目前TSC的分離方法主要有以下三種 ： I. TSC特異性表面標記法：根據TSC的表面標記與普通腫瘤細胞的差異，通過流式細胞 儀分選法（fluorescence activated cell sorting，FACS)或者免疫磁珠分選法（magnetic activated cell sorting，MACS)分選得到TSC。Dalerba等米用CD44和上皮細胞黏附分 子EpCAM做標記，利用FACS成功分選出了表型為EpCAMhighCD44+的結腸癌幹細胞。Yuan等 利用MACS成功從人腦膠質瘤中分離出了 CD133+的膠質瘤幹細胞。但是這兩種分離技術均 有賴於TSC表面特異的標記，而目前仍缺乏足夠有效的TSC表面標記，導致有許多並無可靠 表面標記的各類型腫瘤無法利用該方法分選到TSC，此外該方法所用的儀器和試劑都是極 其昂貴，而且對實驗人員要求頗高，並不適宜大規模分選各種類型腫瘤的TSC。
[0006] 2. SP細胞分離法：SP細胞是一群不能被DNA染料Hoechst33342著色的幹細胞，這 類細胞高表達諸如ABC轉運蛋白之類的細胞表面轉運蛋白，能將Hoechst 33342排出細胞 外而不著色。這類細胞能夠將化療藥物排出細胞外，具有耐藥性以及TSC生物學特性，比非 SP細胞具有更強的侵襲性和成瘤能力，同樣利用流式細胞儀可以分離出SP-TSC。目前已經 從膠質瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中分離出了 SP-TSC。然而SP-TSC並不是一群均一 化的細胞，異質性仍然很強，有的SP細胞不具備完整的幹細胞特徵，並且不是所有類型的 腫瘤組織細胞中都能分離出來具有乾性的SP-TSC，並且該方法仍需流式分選操作，也需要 具備昂貴的分選級別流式細胞儀，同樣不適宜大規模分選TSC。
[0007] 3. Spheroids懸浮培養法：此方法是利用TSC在無血清培養基中能夠以單細胞的 形式懸浮生長形成微球（Spheroids)的特性來分離獲得TSC的方法。Singh等用該方法得到 了 CD133+的神經膠質瘤幹細胞，Ponti等也獲得了 CD44+CD24-Cx43-的乳腺癌幹細胞球。但 是並不是所有類型的腫瘤細胞在單細胞狀態時都能懸浮形成Spheroids，只有具備自我更 新能力的幹細胞才能形成Spheroid,並且沒有經過其他手段處理分選所得到的Spheroids 其致瘤性並不總是太高，且相應標記物也不統一，因此單獨的Spheroids懸浮培養法較難 滿足要求，然而Spheroids形成能夠直觀地反映細胞的自我更新能力，也廣泛應用於腫瘤 幹細胞的鑑定、富集和純化。
[0008] TSC的存在是惡性腫瘤復發最根本的原因之一，目前尚無有效針對TSC靶向治療 的藥物，因此對TSC的深入研究將有利於我們掌握新的技術，尋找更有效的腫瘤診治手段。 針對TSC的研究必須具備獲取TSC的手段，而目前獲取TSC的方法參差不齊，因此建立新的 簡便高質量的TSC獲取方法具有十分重要的意義。
[0009] 2010年日本科學家Mari Dezawa發現間質來源的細胞群體中（如間充質幹細胞、 成纖維細胞）存在一類抗外源應激能力的細胞子集，這些細胞能夠耐受消化酶(報導所指的 是0. 25%的胰蛋白酶)、低氧、無血清、無營養成分等的應激壓力刺激而不死亡，並且這些細 胞具有比原本普通的間質細胞更強的分化能力，能夠向三個胚層分化，而非該子集的間質 細胞不能進行相應分化，並且不像其他多能幹細胞(如胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞）一樣 形成畸胎瘤，這是其他已發現的成體幹細胞所不具備的能力，這類細胞叫做持續應激多系 分化細胞（multilineage differentiating stress enduring cells, Muse Cells) (Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 11; 107 (19) :8639-43.)。後續發現間質細胞中分選 SSEA3(多能幹細胞表面標記)和⑶105(間質細胞表面標記）雙陽性的細胞具有典型的Muse cells特性，能夠向三胚層分化而不形成畸胎瘤，通過分選的方法可以較好的獲得具有極大 再生醫學應用價值分化能力強的Muse cells (Nat Protoc. 2013;8(7):1391-415·)，這 些細胞也是獲得誘導多能幹細胞良好的細胞來源（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 14; 108(24) :9875-80.)。如此看來在間質群體中存在一群耐受外界物理壓力的一類細胞具 有更強的自我更新能力和分化能力，而TSC就是一類具有更強自我更新能力和分化能力的 腫瘤細胞，但各類不同的TSC並無統一的篩選表面標記，其來源遠不止間質類型細胞，包括 大量的上皮、神經、淋巴、血液等類型的腫瘤，採用單純統一分子標記進行分選的模式很難 有效分離各種類型的TSC。


【發明內容】

[0010] 為了解決上述存在的問題，本發明建立一種新型、可靠、便捷的腫瘤幹細胞（TSC) 的分離方法，可獲得各種類型腫瘤來源的TSC，為創建公共TSC細胞庫平臺，為填補TSC研究 資源的匱乏提供了夯實的技術基礎。
[0011] 本發明的目的在於提供一種腫瘤幹細胞的分離方法。
[0012] 本發明所採取的技術方案是： 一種腫瘤幹細胞的分離方法，包括以下步驟： 1) 將貼壁生長的腫瘤細胞經消化酶液1消化至單個細胞後，終止消化，離心，收集沉澱 的細胞； 2) 將收集的細胞中加入消化酶液2孵育0. 5?IOh ; 3) 將孵育後的細胞經洗滌，離心，收集沉澱的細胞，加入含血清的細胞培養液，混勻，將 細胞接種到細胞培養皿中進行貼壁生長； 4) 上述細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養； 5) 當細胞長滿後,重複2?6次步驟1)?4),所獲得的細胞稱為Muse-腫瘤細胞； 6) Spher〇ids培養：將上述獲得的Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中，採用TSC培養 基，使Muse-腫瘤細胞進行單細胞低密度貼壁生長，當多數細胞形成均一緻密的克隆，核質 比增大,具有典型的幹細胞特性時,去除少數異質化的非腫瘤幹細胞,將長滿後的Muse-腫 瘤細胞消化成單細胞，使用TSC培養基懸浮至瓊脂糖鋪墊的或低黏附的細胞培養皿中進行 懸浮培養，獲得的微球Spheroids即為腫瘤幹細胞，稱為Muse TSC。
[0013] 進一步的，一種腫瘤幹細胞的分離方法，包括以下步驟： 1) 將貼壁生長的腫瘤細胞經消化酶液1消化至單個細胞後，終止消化，離心，收集沉澱 的細胞； 2) 將收集的細胞中加入消化酶液2於1?37°C孵育0. 5?10h，模擬消化酶應激狀態； 3) 將上述孵育後的細胞移至1?18°C條件下繼續孵育10?72h，模擬低溫和消化酶應 激狀態； 4) 將孵育後的細胞經洗滌，離心，收集沉澱的細胞，加入不含血清或血清低於5%(v/v) 的細胞培養液，混勻，在密閉條件下，於1?37°C下孵育20?70h，模擬無血清和低氧應激 狀態； 5) 將上一步孵育後的細胞離心，收集沉澱的細胞，加入含1?20%(v/v) FBS的細胞培 養液，混勻，將細胞接種到細胞培養皿中進行貼壁生長； 6) 上述細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養； 7) 當細胞長滿後,重複2?6次步驟1)?6),所獲得的細胞稱為Muse-腫瘤細胞； 8) Spher〇ids培養：將上述獲得的Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中，採用TSC培養 基，使Muse-腫瘤細胞進行單細胞低密度貼壁生長，當多數細胞形成均一緻密的克隆，核質 比增大,具有典型的幹細胞特性時,去除少數異質化的非腫瘤幹細胞,將長滿後的Muse-腫 瘤細胞消化成單細胞，使用TSC培養基懸浮至瓊脂糖鋪墊的細胞培養皿中進行懸浮培養， 獲得的微球Spheroids即為腫瘤幹細胞，稱為Muse TSC。
[0014] 進一步的，上述消化酶液1中的消化酶選自胰蛋白酶、TrypLE、Accutase中的一 種。
[0015] 進一步的，上述步驟2)中每IX IO6?9X IO6個細胞中加入0. 2?15mL消化酶液2。
[0016] 進一步的，上述消化酶液2選自0. 02?0. 3%(w/v)的I型膠原酶液、0. 02?0. 3% (w/v)的IV型膠原酶液、0· 1?3U/ml的Dispase分散酶液、0· 01?0· 3% (w/v)胰蛋白酶 液、0· 01 ?1% (w/v)的 TrypLE 酶液、0· 01 ?1% (w/v)的 Accutase 酶液中的一種。
[0017] 進一步的，上述所有細胞培養液根據不同種類腫瘤細胞選擇不同的細胞基礎培養 基。
[0018] 進一步的，上述Spheroids培養中，Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中的數目 為六孔板的每孔含100?2000個細胞。
[0019] 進一步的，上述所獲得的Muse TSC再重複不少於1次消化成單細胞和懸浮培養， 獲得純度更高、更光滑穩定的微球Spheroids，即Muse TSC。
[0020] 本發明的有益效果是： 1)本發明首次使用多種消化酶(包括I型膠原酶、IV型膠原酶、dispase、胰蛋白酶、 TrypLE、Accutase)、或者結合其他物理應激條件刺激多種腫瘤細胞，可以穩定地獲得不同 類型的TSC，稱之為Muse TSC，通過鑑定，本發明分離的Muse TSC擁有極強的腫瘤乾性，均 質性較好，比較穩定，能夠反覆獲得單細胞來源的懸浮培養微球（Muse cells-Spheroids)， 因此該方法的建立使獲得不同類型的TSC得以標準化，並且更加簡單經濟，適合大規模構 建TSC庫所用，以滿足常規腫瘤生物醫學基礎研究、臨床研究以及藥物開發等工作需求。
[0021] 2)本發明具有獨創性，本發明改進了持續應激多系分化細胞的分離方法，並結合 傳統的Spheroids培養手段，將其應用於腫瘤幹細胞的分離；本發明首次使用新的獨特的 培養方法分離得到了多種類型的腫瘤幹細胞，這些腫瘤幹細胞無論質量、純度還是其乾性 都要強於傳統分離分選方法得到的腫瘤幹細胞，並且該方法簡單、經濟，不需要苛刻的實驗 條件，也不需要昂貴的實驗儀器，適合針對大量類型的腫瘤幹細胞庫建立。
[0022] 3)本發明建立了低成本、快速、方便地獲取各種類型腫瘤幹細胞的方法，獲得的腫 瘤幹細胞稱之為Muse TSC，經嚴格鑑定其腫瘤乾性及惡性程度遠高於傳統方法所獲取，本 發明方法具有同時大量構建多種類型腫瘤幹細胞的能力。
[0023] 4)本發明為建立標準化、兼容、通用、高質量、開放的各種類型腫瘤來源的腫瘤幹 細胞庫、填補高端腫瘤生物學資源庫的匱乏提供了夯實的技術基礎；本發明方法製備的腫 瘤幹細胞將覆蓋腫瘤生物醫學的各層次研究，為我國腫瘤臨床診治、基礎研究、新藥研發提 供可靠的技術資源。
[0024] 5)本發明將為廣大科研以及臨床工作者提供高質量的腫瘤幹細胞，這些豐富多樣 的腫瘤幹細胞將用於基礎科研的深入探索、早期惡性腫瘤診斷的研發與突破、靶向腫瘤幹 細胞特異性的小分子化合物篩選、靶向腫瘤幹細胞基因治療藥物研發、靶向腫瘤幹細胞人 源化抗體的生物飛彈研發、靶向腫瘤幹細胞的特異性免疫細胞治療技術開發、預防腫瘤復 發的新一代放化療技術研發等等。因此本發明方法將惠及於地區乃至全國的臨床以及基礎 癌症研究，將防治癌症推進新的階段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為100倍鏡下S^Muse-ifepG〗低密度單細胞貼壁培養圖；雙箭頭所指為形成 的大多數均一緻密的克隆，核質比增大，與原本的H印G2形態差異明顯，具有典型的幹細胞 特性；而單箭頭所指為極少數維持H印G2其原有細胞形態的克隆； 圖2為40倍鏡下的H印G2-Muse TSC微球圖，為將Slrd-Muse-H印G2消化成單細胞，懸 浮接種至瓊脂糖鋪墊的孔板中進行培養，再經3次純化後得到的Spheroids即!fepG2-MUse TSC ； 圖3為普通H印G2 (A)和！fepG2-Muse TSC (B)細胞中TSC表面標記CD133的FACS檢 測結果圖（綠色為CD133抗體峰圖，紅色為響應同型對照（Isotype Control)抗體峰圖）； 圖4為普通H印G2細胞和實施例1製備的HepG2-MuSe TSC細胞在的低濃度血清條件 單克隆的形成情況； 圖5左圖為1萬個H印G2-Muse TSC細胞於低濃度血清培養基中（2% FBS)第五天便形 成明顯的Spheroids,右圖為相同條件下的HepG2在第十天都未形成明顯的Spheroids (40 倍鏡觀察）； 圖6為將表1中的各組老鼠解剖一隻取出的腫瘤圖； 圖7為實施例2製備的!fep3B-MuSe TSC (肝癌腫瘤幹細胞）； 圖8為普通H印3B (A)和H印3B-Muse TSC (B)細胞中TSC表面標記CD133的FACS檢 測結果圖（綠色為CD133抗體峰圖，紅色為響應同型對照（Isotype Control)抗體峰圖）； 圖9為實施例3製備的U251-Muse TSC (神經膠質腫瘤幹細胞）； 圖10為普通U251 (A)和實施例3製備的U251-Muse TSC (B)的腫瘤乾性標記物CD133 的檢測結果（綠色為⑶133抗體峰圖，紅色為響應同型對照（Isotype Control)抗體峰 圖）； 圖11為分別將1000個U251、U251 spheroids-TSC以及U251-Muse TSC細胞種到包含 10%FBS、2%FBS以及0. 5%FBS的培養基中單細胞貼壁培養9天後，結晶紫染色細胞克隆； 圖12為實施例4製備的MCF7-Muse TSC (乳腺腫瘤幹細胞）； 圖13為MCF7 (A)與實施例4製備的MCF7-Muse TSC (B)的腫瘤乾性標記物⑶133的 檢測結果（綠色為⑶133抗體峰圖，紅色為響應同型對照（Isotype Control)抗體峰圖）。

【具體實施方式】
[0026] -種腫瘤幹細胞的分離方法： 1) 將貼壁生長的腫瘤細胞經消化酶液1消化至單個細胞後，終止消化，離心，收集沉澱 的細胞； 2) 將收集的細胞中加入消化酶液2孵育0. 5?IOh ; 3) 將孵育後的細胞經洗滌，離心，收集沉澱的細胞，加入含血清的細胞培養液，混勻，將 細胞接種到細胞培養皿中進行貼壁生長； 4) 上述細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養； 5) 當細胞長滿後,重複2?6次步驟1)?4),所獲得的細胞稱為Muse-腫瘤細胞； 6) Spher〇ids培養：將上述獲得的Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中，採用TSC培養 基，使Muse-腫瘤細胞進行單細胞低密度貼壁生長，當多數細胞形成均一緻密的克隆，核質 比增大,具有典型的幹細胞特性時,去除少數異質化的非腫瘤幹細胞,將長滿後的Muse-腫 瘤細胞消化成單細胞，使用TSC培養基懸浮至瓊脂糖鋪墊的或低黏附的細胞培養皿中進行 懸浮培養，獲得的微球Spheroids即為腫瘤幹細胞，稱為Muse TSC。
[0027] 優選的，上述腫瘤幹細胞的分離方法包括以下步驟： 1) 將貼壁生長的腫瘤細胞經消化酶液1消化至單個細胞後，終止消化，離心，收集沉澱 的細胞； 2) 將收集的細胞中加入消化酶液2孵育0. 5?10h，優選的孵育溫度為1?37°C，最優 選為37°C，模擬消化酶應激狀態； 3) 將上述孵育後的細胞移至1?18°C條件下繼續孵育10?72h，模擬低溫和消化酶應 激狀態；其中溫度優選為2?6°C，最優選為4°C，孵育時間優選為12?16h。
[0028] 4)將孵育後的細胞經洗滌，離心，收集沉澱的細胞，加入不含血清或血清低於 5%(v/v)，混勻，在密閉條件下孵育20?70 h，優選為在1?37°C下孵育40?60h，孵育溫 度最優選為37°C，模擬無血清和低氧應激狀態； 5) 將上一步孵育後的細胞離心，收集沉澱的細胞，加入含1?20% (v/v) FBS的細胞培 養液，FBS濃度最優選為2%，混勻，將細胞接種到細胞培養皿中進行貼壁生長； 6) 上述細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養； 7) 當細胞長滿後，重複2?6次(優選為重複3?4次)步驟1)?6)，所獲得的細胞稱 為3rt/4th-M USe-腫瘤細胞； 8) Spher〇ids培養：將上述獲得的Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中，採用TSC培養 基，使Muse-腫瘤細胞進行單細胞低密度貼壁生長，當多數細胞形成均一緻密的克隆，核質 比增大,具有典型的幹細胞特性時,去除少數異質化的非腫瘤幹細胞,將長滿後的Muse-腫 瘤細胞消化成單細胞，使用TSC培養基懸浮至瓊脂糖鋪墊的或低黏附的細胞培養皿中進行 懸浮培養(優選瓊脂糖鋪墊的細胞培養皿懸浮培養)，獲得的微球Spheroids即為腫瘤幹細 胞，稱為Muse TSC。
[0029] 優選的，上述消化酶液1所含消化酶的濃度為0. 25%(w/v)，消化時間為2?5min， 消化時間與不同類型的腫瘤細胞有關。
[0030] 優選的，上述消化酶液1中的消化酶選自胰蛋白酶、TrypLE、Accutase中的一種， 最優選為胰蛋白酶。
[0031] 優選的，上述步驟2)中每IX IO6?9X IO6個細胞中加入0.2?15mL消化酶液2， 最優選為ImL。
[0032] 優選的，上述步驟2)中消化酶液2孵育細胞的時間為4?8h，最優選為6h。
[0033] 優選的，上述消化酶液2選自（λ 02?(λ 3% (w/v)的I型膠原酶液、(λ 02?(λ 3% (w/v)的IV型膠原酶液、0· 1?3U/ml的Dispase分散酶液、0· 01?0· 3% (w/v)胰蛋白酶 液、0· 01?1% (w/v)的TrypLE酶液、0· 01?1% (w/v)的Accutase酶液中的一種，最優選 為0. 02?0. 3% (w/v)的I型膠原酶液。
[0034] 優選的，上述所有細胞培養液根據不同種類腫瘤細胞選擇不同的細胞基礎培養 基。
[0035] 優選的，上述所有TSC培養基根據不同種類腫瘤細胞選擇不同的TSC培養基。
[0036] 優選的，上述Spheroids培養中，Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中的數目為 六孔板的每孔含100?2000個細胞。
[0037] 優選的，上述所獲得的Muse TSC再重複不少於1次消化成單細胞和懸浮培養，獲 得純度更高、更光滑穩定的微球Spheroids，即Muse TSC。
[0038] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。
[0039] 下文中所用到的肝癌、乳腺癌、神經膠質瘤等細胞株均來自廣州市搏克腫瘤研究 所細胞生物學實驗庫。
[0040] 實施例I HepG2肝腫瘤幹細胞的分離方法 1) 將貼壁生長的肝癌細胞H印G2使用0. 25%胰蛋白酶液在37°C消化2飛分鐘至單個 細胞，使用含有血清的培養基進行終止，200g/min離心5min，收集沉澱的細胞；（此步驟可 以使用其他消化酶替代胰蛋白酶液，如TrypLE、Accutase等，消化時間、消化溫度、離心時 間隨不同類型的腫瘤細胞有關）； 2) 將上述收集的細胞中加入0. 1%的I型膠原酶液(用基礎培養基DMEM/F12稀釋而成)， 每I X IO6個細胞加入ImL酶液，37°C孵育6h，模擬消化酶應激狀態；（此步驟可以使用其他 消化酶替代〇. 1%的I型膠原酶液，如〇. 02?0. 3% (w/v)的IV型膠原酶液、0. 1?3U/ml 的Dispase分散酶液、0· 01?0· 3% (w/v)胰蛋白酶液、0· 01?1% (w/v)的TrypLE酶液、 0. 01?1% (w/v)的Accutase酶液等，使用其他消化酶也在本發明保護範圍內，最優選為 0. 1% (w/v)的I型膠原酶液；孵育時間可以為0. 5?IOh,優選為4?8h，最優選為6h ;) 3) 將上述孵育後的細胞移至4°C孵育12~16h，模擬低溫和消化酶應激狀態；（模擬低溫 應激狀態的溫度可以為1?18°C，優選為2?6°C，最優選為4°C ;孵育的時間可以為10? 72h，優選為12?16h ;) 4) 將孵育後的細胞經PBS緩衝液洗滌，混合均勻，200g/min離心5min，棄上清，洗去 酶液，將離心管中沉澱的細胞中加入DMEM/F12培養液，直至離心管滿，蓋好離心管蓋，用封 口膜封好瓶口，顛倒混勻，放入37°C培養箱中孵育48h，模擬無血清和低氧應激狀態；（步驟 3)?4)可以省去，直接將步驟2)中孵育後的細胞進行步驟5)的操作，但最優處理方法是 含有步驟3)?4)的處理；） 5) 將上一步孵育後的細胞離心，200g/min離心5min，收集沉澱的細胞，加入含2%(v/v) FBS的DMEM/F12培養液，混勻，將細胞接種到組織培養處理過的普通細胞培養皿中進行貼 壁生長； 6) 上述細胞貼壁後換肝癌TSC培養基進行培養，其中肝癌TSC培養基為含20ng/ml EGFjIO ng/ml bFGF,2°/〇 B27 supplement without vitamin A (Invitrogen)，1% N2 添加 劑的DMEM/F12培養基； 7) 當細胞長滿後，重複3次步驟1)?6)，所獲得的細胞稱為Slrd-Muse-HepGS ; 8) Spheroids培養：將上述獲得的3ri-Muse-!fepG2接種到組織培養處理過的細胞培養 皿中（六孔板每孔含100?2000個細胞)，使用肝癌TSC培養基以單細胞低密度貼壁生長， 數天後大多數細胞形成均一緻密的克隆，核質比增大，與原本的HepG2形態差異明顯，具有 典型的幹細胞特性，而極少數克隆維持H印G2其原有的細胞形態，將異質化的非TSC用刮針 刮掉(見圖1);將長滿後的3 rt-MUse-HepG2消化成單細胞，使用肝癌TSC培養基懸浮至瓊脂 糖鋪墊的細胞培養皿中進行懸浮培養，獲得的Spheroids (微球）即為肝腫瘤幹細胞，稱為 HepG2-MUSe TSC，再重複3次消化成單細胞和懸浮培養的純化處理，得到更為光滑穩定的 H印G2-Muse TSC (見圖 2); 下面對實施例1製備的能夠穩定單細胞成球傳代的未分化的ifepG2-MuSe TSC進行表 面標記鑑定（FACS鑑定)、TSC反覆單細胞成球以及極少量細胞成瘤實驗檢測證實其具有顯 著的腫瘤乾性。
[0041] (1)流式細胞儀（FACS)鑑定 使用FACS鑑定普通H印G2和實施例1製備的H印G2-Muse TSC細胞中腫瘤幹表面標記 CD133,結果顯示H印G2-Muse TSC有96%以上都有CD133標記，而普通的H印G2不足0. 1% 的細胞含有⑶133 (如圖3所示)。
[0042] (2)低血清濃度克隆形成實驗 在六孔板裡分別種上100個，1000個，3000個普通的!fepG2細胞和實施例1製備的 HepG2-MuSe TSC細胞，然後使用含2%FBS的低濃度血清培養基進行貼壁單克隆培養，在一 周后用結晶紫染色觀察克隆的形成情況。
[0043] 克隆形成實驗結果發現IfepG2-MuSe TSC在六孔板中僅100個細胞就能在低濃度 血清（2%血清濃度）培養基中出現明顯的克隆，而普通的H印G2需要將近3000個細胞才能 形成較明顯的克隆(見圖4)。
[0044] (3) Spheroids 培養實驗 分別取1萬個普通的H印G2細胞和實施例1製備的H印G2-Muse TSC細胞在含2%FBS 的低濃度血清培養基進行Spheroids培養，觀察其Spheroids (微球）的形成情況。
[0045] 本發明通過Spheroids培養實驗發現1萬個HepG2_Muse TSC細胞在低濃度血清 培養基中第五天便能形成明顯的Spheroids，而1萬個H印G2到第十天都沒有形成明顯的 Spheroids (見圖 5)。
[0046] (4)致瘤性檢測 分別將101、102、103、104、10 5、5父105、106、2父106個!1印62和實施例1製備的!1印62-]\11186 TSC細胞接種到NOD-SCID小鼠皮下，一個月後發現各接種10個!tepG2-Muse TSC細胞的5 只老鼠中就有2隻成瘤，接種100個以及以上的!fepG2-MuSe TSC的老鼠全部都成瘤，而普 通的HepG2在分別接種了 50萬個細胞的5隻老鼠中僅3隻成瘤，小於50萬的接種量都未 能成瘤(見圖6和表1)，由此可見本發明製備的HepG2-Mu Se TSC具有極強的自我更新能力 和致瘤性，具備較完整的TSC特徵。
[0047] 表1分別將101、102、103、104、10 5、5父105、106、2父106個!1印62和!1印62-]\11186丁5〇 細胞各接種到5隻NOD-SCID小鼠皮下，一個月後計數各組成瘤老鼠的個數。
[0048] 表1老鼠成瘤實驗結果表

【權利要求】
1. 一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：包括以下步驟： 1) 將貼壁生長的腫瘤細胞經消化酶液1消化至單個細胞後，終止消化，離心，收集沉澱 的細胞； 2) 將收集的細胞中加入消化酶液2孵育0. 5?IOh ; 3) 將孵育後的細胞經洗滌，離心，收集沉澱的細胞，加入含血清的細胞培養液，混勻，將 細胞接種到細胞培養皿中進行貼壁生長； 4) 上述細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養； 5) 當細胞長滿後,重複2?6次步驟1)?4),所獲得的細胞稱為Muse-腫瘤細胞； 6. Spher〇ids培養：將上述獲得的Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中，採用TSC培養 基，使Muse-腫瘤細胞進行單細胞低密度貼壁生長，當多數細胞形成均一緻密的克隆，核質 比增大,具有典型的幹細胞特性時,去除少數異質化的非腫瘤幹細胞,將長滿後的Muse-腫 瘤細胞消化成單細胞，使用TSC培養基懸浮至瓊脂糖鋪墊的或低黏附的細胞培養皿中進行 懸浮培養，獲得的微球Spheroids即為腫瘤幹細胞，稱為Muse TSC。
2. 根據權利要求1所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：包括以下步驟： 1) 將貼壁生長的腫瘤細胞經消化酶液1消化至單個細胞後，終止消化，離心，收集沉澱 的細胞； 2) 將收集的細胞中加入消化酶液2於1?37°C孵育0. 5?10h，模擬消化酶應激狀態； 3) 將上述孵育後的細胞移至1?18°C條件下繼續孵育10?72h，模擬低溫和消化酶應 激狀態； 4) 將孵育後的細胞經洗滌，離心，收集沉澱的細胞，加入不含血清或血清低於5%(v/v) 的細胞培養液，混勻，在密閉條件下，於1?37°C下孵育20?70h，模擬無血清和低氧應激 狀態； 5) 將上一步孵育後的細胞離心，收集沉澱的細胞，加入含1?20%(v/v) FBS的細胞培 養液，混勻，將細胞接種到細胞培養皿中進行貼壁生長； 6) 上述細胞貼壁後換腫瘤幹細胞TSC培養基進行培養； 7) 當細胞長滿後,重複2?6次步驟1)?6),所獲得的細胞稱為Muse-腫瘤細胞； 8. Spher〇ids培養：將上述獲得的Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中，採用TSC培養 基，使Muse-腫瘤細胞進行單細胞低密度貼壁生長，當多數細胞形成均一緻密的克隆，核質 比增大,具有典型的幹細胞特性時,去除少數異質化的非腫瘤幹細胞,將長滿後的Muse-腫 瘤細胞消化成單細胞，使用TSC培養基懸浮至瓊脂糖鋪墊的細胞培養皿中進行懸浮培養， 獲得的微球Spheroids即為腫瘤幹細胞，稱為Muse TSC。
3. 根據權利要求1或2所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：所述消化酶 液1中的消化酶選自胰蛋白酶、TrypLE、Accutase中的一種。
4. 根據權利要求1或2所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：步驟2)中每 I X IO6?9X IO6個細胞中加入0. 2?15mL消化酶液2。
5. 根據權利要求1、2或4所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：所述消化 酶液2選自0. 02?0. 3% (w/v)的I型膠原酶液、0. 02?0. 3% (w/v)的IV型膠原酶液、 0? 1?3U/ml的Dispase分散酶液、0? 01?0? 3% (w/v)膜蛋白酶液、0? 01?1% (w/v)的 TrypLE 酶液、0? 01 ?1% (w/v)的 Accutase 酶液中的一種。
6. 根據權利要求1或2所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：所述的所有 細胞培養液根據不同種類腫瘤細胞選擇不同的細胞基礎培養基。
7. 根據權利要求1或2所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：所述 Spheroids培養中，Muse-腫瘤細胞接種到細胞培養皿中的數目為六孔板的每孔含100? 2000個細胞。
8. 根據權利要求1或2所述的一種腫瘤幹細胞的分離方法，其特徵在於：所獲得的 Muse TSC再重複不少於1次消化成單細胞和懸浮培養，獲得純度更高、更光滑穩定的微球 Spheroids，即 Muse TSC。
【文檔編號】C12N5/095GK104312976SQ201410543007
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】王淋立, 陳月花, 宋立兵 申請人:廣州市搏克腫瘤研究所, 王淋立