一種鮑氏層孔菌發酵培養基的製作方法

2023-10-26 14:03:07 6

專利名稱：一種鮑氏層孔菌發酵培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及鮑氏層孔菌的人工培養，具體地說是一種鮑氏層孔菌發酵培養基。
背景技術：
鮑氏層孔菌是已知高等真菌中抗癌效果最好的菌類，其市場開發前景非常樂觀。
鮑氏層孔菌的抗癌功能最早被日本學者Tetsuro Ikekawa等(Ikekawa T，Nakanishi M，Uehara N，Chihara，G and Fukuoka，F，1968，Antitumor action ofsome basidiomycetes，especially Phellinus linteus.Gann，59155～157)發現，研究表明鮑氏層孔菌野生子實體的提取物對小鼠肉瘤180的抑制率為96.7％；研究還表明具有抗癌作用的物質是鮑氏層孔菌子實體中的多糖。Naruse等(Naruse S，Takeda S，Ito H，Jujii K，Terada Y.Shimura K，Sugiura M andMiyazaki T，1974，Studies on antitumor activity of basidiomycetes2.Antitumoreffects of polysaccharides prepared from cultured basidiomycetes.Mie Med J，23207～230)和Chung等(Chung K S，Kim S S，Rhyu，C H and Man W H，1991，An investigation on the antitumor constituents of Phellinus linteus.Korean J Mycol，19361)用鮑氏層孔菌人工培養菌絲的提取物做抗癌試驗，並證實菌絲提取物對小鼠肉瘤180同樣具有明顯的抑制作用。Kong等(1999)還發現鮑氏層孔菌的多糖對腫瘤的生長和轉移均有抑制作用；進一步研究發現(Kong D H，Hong N D，Han S B，1996，Stimulation of humeraland cell mediated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus linteus.Intern J Immunopharmacol，18295)鮑氏層孔菌的多糖對體液細胞具有免疫調解功能。Chung等(1993)還證明鮑氏層孔菌的多糖片段能夠使小鼠產生對肉瘤的體液免疫反應(Chug K S，Kim S S，Kim H S，1993.Effect of Kpan antitumor protein-polysaccharide from mycelial culture of Phellinus linteuson the humoral immune response of tumor-bearing ICR mice to sheep red bloodcells.Arch Pharm Res，16336～338)。Song等(Song C H，Ra K s，Yang B K.1998.Immuno-stimulating activity of Phellinus linteus.Korean J Mycol，2686～90)進一步研究鮑氏層孔菌的多糖也發現其免疫調解功能。Oho等(Oho G T，Han S B，1993，Immunostimulationg activity of Phellinus linteusextracts to B-lymphocyte.Arch Phar Res，15379～381)指出鮑氏層孔菌多糖的免疫調解功能與其對β淋巴細胞的功能調解有關。之後Song等(Song KS，Cho S M，Lee J H.1995.B-lymphocyte stimulating polysaccharide frommushroom Phellinus linteus.Chem Pharm Bull，432105～2108)對調解β淋巴細胞的多糖進行了純化，並對其物理和化學特性進行了研究。Lee等(LeeJW，Baek S J，Bang K W.1999.Characteristics of polysaccharide isolated fromthe fruitbodies and cultured mycelia of Phellinus linteus IY001.Korean J Mycol，27424-429)從鮑氏層孔菌子實體和培養菌絲中分離出多糖，並對其特性進行了研究。Kim等(Kim Y S，Park K S，Park H K，Kim S W，1994，Compositional sugar analysis of antitumor polysaccharides by high performanceliquid chromatography and gas chromatograpby.Arch Phar Res，17337～342)在研究多種擔子菌抗癌多糖時發現，芸芝和靈芝的多糖主要是β-1，3和1，6-D-葡萄糖，而鮑氏層孔菌多糖除葡萄糖外，還有半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和墨角藻糖等，因此鮑氏層孔菌的抗癌多糖要比其他多糖擔子菌的抗癌多糖複雜。不同的學者還從鮑氏層孔菌中發現了多種不同的抗癌多糖，其中為β-1，3-葡聚糖在C-6有葡萄糖分支的抗癌效果最好。
鮑氏層孔菌的人工培養目前還處在起步階段，目前僅韓國報導已成功培養出該菌的子實體，Song et al.，(Song C H，Moon H H，Ryu C H，1997.Artificial cultivation of Phellinus linteus.Korean J Mycol130～132)，但沒有明確的培養基配方。國內目前還沒有成功的人工培養報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種應用效果好、成本低的鮑氏層孔菌發酵培養基。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種鮑氏層孔菌發酵培養基，其組成按重量比計包括1950～2050份的暴馬子丁香木屑、板慄木屑或梨木木屑，240～260份的玉米粉、高粱米糠和/或高粱米粉，23～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4；其中還含有分別19～21份的硫酸銨與蔗糖或葡萄糖，或分別19～21份的甘露醇與牛肉膏。
具體可分為四類1)1950～2050份的暴馬子丁香木屑，240～260份的高粱米糠，23～27份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸銨，19～21份的蔗糖或葡萄糖；2)1950～2050份的暴馬子丁香木屑，240～260份的玉米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的甘露醇，19～21份的牛肉膏；3)1950～2050份的板慄木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸銨，19～21份的蔗糖或葡萄糖；4)1950～2050份的梨木木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸銨，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
上述培養基配方用於栽培生產，要求溫度最好控制在22～28℃，培養室內溼度最好82～86％；發菌全過程需30～50天，60天後開始子實體原基分化，90天後逐漸出現孔狀子實體。
本發明培養基配方具有如下優點1)木屑與米糠或玉米粉的按比例混合，可以使培養基孔隙大小分布均勻.透氣性、持水性好，溼度上下一致，在正常溫度下培養，菌絲生長迅速、粗壯濃密、潔白有光澤，而且由於粗細木屑的連結和大小孔隙內菌絲組織發達，使得菌塊的結持力強而韌，菌種塊結持性好，取接種塊不會碎，接種成活率高。
2)培養基中添加石膏可以增加鈣質使所發菌絲生長健壯。
3)在碳源氮源的選擇方面，根據申請人對鮑氏層孔菌進行培養條件的研究，發現培養時添加的最佳碳源為甘露醇和葡萄糖；最佳氮源為蛋白腖和牛肉膏；硫酸銨在培養初期對菌絲氮源的供給、促進菌絲生長效果非常明顯，考慮到蛋白腖的成本高，因此分別採用葡萄糖與硫酸銨、甘露醇與牛肉膏的配比方案。
4)培養基中而添加KH2PO4則延續了菌絲體從母種擴繁開始微量元素的需要。
具體實施例方式
實施例11)取生長於暴馬丁香Syringa amurensis Rupr.的野生鮑氏層孔菌子實體進行菌種分離，並進一步進行純化。
2)母種的擴繁按常規方法對鮑氏層孔菌母種原種進行培養，採用的培養基為常規的PDA培養基或PSA培養基，PDA培養基重量組成為，水∶馬鈴薯∶瓊脂∶葡萄糖∶KH2PO4∶MgSO4∶VB1＝2000∶400∶40∶40∶6∶3∶0.02；pH值5.5；PSA培養基重量組成為，水∶馬鈴薯∶瓊脂∶蔗糖∶KH2PO4∶MgSO4∶VB1＝2000∶400∶40∶40∶6∶3∶0.02；pH值6.5；上述兩種配方可作菌種分離培養基，也可作母種擴繁培養基。
a.本實施例採用的PDA母種培養基配方馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，KH2PO43g，MgSO41.5g，VB110毫克，以稀鹽酸將其PH值調至5.5；配製方法將馬鈴薯去皮，洗淨，挖去芽眼，切成小薄片，稱取200g，放入鋁鍋內加水1000ml煮沸，八分熟後過濾取其汁液，再加水補至1000ml，小火加熱，放入瓊脂。待瓊脂全部溶化，再加入其它成份，充分溶解後分裝入三角錐瓶中等待滅菌，高度不得超過三角錐瓶的三分之二；b.滅菌採用全自動高壓滅菌鍋滅菌，時間為30-40分鐘，壓力1.2kg/cm2，滅菌溫度121℃；滅菌過程中一定要嚴格遵守操作規程，以防意外事故發生；c.分裝將滅菌後的培養基裝入已乾熱滅菌後的玻璃培養皿中，厚度為培養皿高度的1/4為宜；d.接種必須在無菌條件下操作；將待接種的培養基和工具放入接種箱或接種室的工作檯上，用福馬林和高錳酸鉀燻蒸接種箱和接種室，同時開啟紫外線燈，增強滅菌效果；觀察2天，見培養皿內確無雜菌感染即可接種。接種時母種所經過的空間，必須是無菌區。各種工具與菌種接觸前都應經火焰滅菌，冷卻後再取菌種，以免灼傷菌種；培養皿邊緣及培養皿蓋也須經火焰滅菌；接種後，5盤為一組用封口膜(封口膜也要預先消毒)封好；移入培養室內培養；e.培養培養室內要保持清潔、乾淨，經常噴來蘇水殺滅雜菌。培養室要封閉好，在黑暗條件下培養，避免直射光以及各種照明燈光。溫度在22--28℃，溼度不宜過大，保持溼潤即可，在這樣的環境下，5天後即可見新生的菌絲體，15-20天菌絲即已滿盤；滿盤後的菌種即成為原種。
3)鮑氏層孔菌發酵培養(原種培養及栽培種培養)鮑氏層孔菌原種培養基及栽培種培養基(木屑類培養基，其可直接用於袋料栽培生產)配方暴馬子丁香木屑(乾重)1950～2050Kg，高粱米糠240～260Kg，石膏23～27Kg，KH2PO45.5～6.5Kg，蔗糖或葡萄糖19～21Kg，硫酸銨19～21Kg；本實施例採用的配料如下a.配料時遵循先幹拌後溼拌的原則；先將乾料暴馬子丁香木屑4000g(指幹木屑重量)、高梁米粉500g，石膏粉50g混拌均勻，再將蔗糖(或葡萄糖)40g，KH2PO412g，硫酸銨40g分別用純淨水溶解後混合在一起，倒入混拌好的乾料中，再次攪拌均勻；培養料最後的溼度以用手握時，手指間有水溢出而不下滴為宜，這樣的含水量在60％左右；b.裝瓶採用罐頭瓶培養，裝入培養料的多少依培養瓶大小而定。一般來說，裝入培養料的高原為整瓶高度的2/3；裝瓶時要鬆緊適度，料面壓平；培養基中間用打孔器從上至下直達瓶底打一孔洞，以增加氧氣，利於菌絲向下蔓延生長；然後用耐高溫的塑料封口膜將瓶口封好，封口不宜使用膠皮皮套扎口，因為經過高溫後，皮套易斷；最好用純棉線繩扎口；c.滅菌高壓蒸汽滅菌，壓力1.5kg/cm2，時間1～1.5時間，溫度在121℃；高壓蒸汽滅菌鍋使用時要儘量將鍋內冷空氣排除，鍋內培養瓶的擺放不宜過擠，以利熱蒸汽流通；滅菌結束，要等到鍋內壓力緩慢下降後再打開鍋蓋，防止因壓力下降過快或溫度過高等造成人身安全事故；d.接種將滅過菌的培養基置於25℃下培養3-7天，如培養基表面無任何變化，則表明滅菌效果良好，可接種使用；在原種及栽培種的接種過程中，操作者也應嚴格遵守無菌操作規程進行；e.培養將接種後的培養瓶移入培養室，整齊擺放於培養架上，培養室內要密閉遮光，溫度控制在22～28℃之間，室內溼度不宜過大，溼度大易雜菌滋生；每隔2-3天於中午適當通風，時間30分鐘；除此之外，隨時觀察培養瓶內目的菌種的發菌情況，發現有感染的菌種瓶及時清除；
接種後第9天即可見新生的菌絲體；菌絲體的顏色因培養基種類的不同而有所差異；木屑類培養基上所發菌絲顏色由淺至深，剛開始呈白色，慢慢變為淡黃色至深黃色；發菌全過程需30-50天，60天後可見子實體原基分化開始；f.子實體分化與形成階段管理當培養瓶內的菌絲布滿接種面時，可見突起的顏色稍深的瘤狀子實體原基，此時在封口膜上扎眼，增加瓶內的氧氣量，同時瓶上覆以乾淨的報紙，經常向紙面上噴水，滿足子實體分化階段對溼度的要求。此時室內最適溫度為24-28℃，溼度控制在82-86％左右，同時也要注意通風換氣。從接種到子實體原基分化需60天左右時間，成熟的子實體(孔狀子實體)出現需90天以上時間；成熟的子實體顏色呈現深黃褐色，菌蓋上長有孔口，成熟的孢子即可由孔口彈射出來。
g.採收接種後100天，鮑氏層孔菌的子實體基本形成，成熟過程還需10-15天。成熟後即可採收加工利用。
實施例2與實施例1不同之處在於母種擴繁中採用PSA培養基，其組成為，水∶馬鈴薯∶瓊脂∶蔗糖∶KH2PO4∶MgSO4∶VB1＝2000∶400∶40∶40∶6∶3∶0.02；pH值6.5；培養基滅菌壓力1.2kg/cm2，滅菌時間30分鐘，滅菌溫度121℃；鮑氏層孔菌發酵培養(原種培養及栽培種培養)的培養基配方為暴馬子丁香木屑(乾重)975～1025Kg，玉米粉120～125Kg，石膏14～16Kg，KH2PO42.75～3.25Kg，甘露醇9.5～10.5Kg，牛肉膏9.5～10.5Kg。
實施例3與實施例1不同之處在於鮑氏層孔菌發酵培養(原種培養及栽培種培養)的培養基配方為板慄木屑(乾重)975～1025Kg，玉米粉或高粱米粉120～125Kg，石膏14～16Kg，KH2PO42.75～3.25Kg，蔗糖或葡萄糖9.5～10.5Kg，硫酸銨9.5～10.5Kg。
實施例4與實施例1不同之處在於鮑氏層孔菌發酵培養(原種培養及栽培種培養)的培養基配方為梨木木屑(乾重)975～1025Kg，玉米粉或高粱米粉120～125Kg，石膏14～16Kg，KH2PO42.75～3.25Kg，蔗糖或葡萄糖9.5～10.5Kg，硫酸銨9.5～10.5Kg。
因為菌種從暴馬子丁香樹分離而來，所以採用具有類似營養成分的丁香木屑，其效果最佳，而梨木屑和板慄木屑是目前人工栽培靈芝等藥用真菌比較成功的培養基物。
權利要求
1.一種鮑氏層孔菌發酵培養基，其特徵在於其組成按重量比計包括，1950～2050份的暴馬子丁香木屑、板慄木屑或梨木木屑，240～260份的玉米粉、高粱米糠和/或高粱米粉，23～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4；其中還含有分別19～21份的硫酸銨與蔗糖或葡萄糖，或分別19～21份的甘露醇與牛肉膏。
2.按照權利要求1所述的鮑氏層孔菌發酵培養基，其特徵在於其組成按重量比計為，1950～2050份的暴馬子丁香木屑，240～260份的高粱米糠，23～27份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸銨，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
3.按照權利要求1所述的鮑氏層孔菌發酵培養基，其特徵在於其組成按重量比計為，1950～2050份的暴馬子丁香木屑，240～260份的玉米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的甘露醇，19～21份的牛肉膏。
4.按照權利要求1所述的鮑氏層孔菌發酵培養基，其特徵在於其組成按重量比計為，1950～2050份的板慄木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸銨，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
5.按照權利要求1所述的鮑氏層孔菌發酵培養基，其特徵在於其組成按重量比計為，1950～2050份的梨木木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸銨，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
全文摘要
本發明涉及鮑氏層孔菌的人工培養，具體地說是一種鮑氏層孔菌發酵培養基，其組成按重量比計包括，1950～2050份的暴馬子丁香木屑、板慄木屑或梨木木屑，240～260份的玉米粉、高粱米糠和/或高粱米粉，23～32份的石膏，5.5～6.5份的KH
文檔編號A01G1/04GK1789407SQ200410082979
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月15日 優先權日2004年12月15日
發明者戴玉成, 劉春靜, 杜佳豔, 魏玉蓮 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所, 鐵嶺市林業科學研究院