寡核苷酸標記及其鑑定方法
2023-10-27 03:29:12 1
專利名稱：寡核苷酸標記及其鑑定方法
技術領域：
本發明涉及寡核苷酸標記及其鑑定方法。
背景技術：
寡核苷酸具有獨特的優勢，這是由於它們即使以很少的量存在也可通過聚合酶鏈式反應(PCR)大量擴增，並且其原始的核苷酸序列可通過核苷酸測序確定。因此，當將很少量的這種寡核苷酸添加至多種物質或產品(包括油、塗料(paint)、爆炸物和藝術品)時，可以精確地測定物質或產品的最初來源或運輸途徑，或者產品是否真實的。一般使用添加螢光劑、色素或特定化學物質的方法來標記油產品。但是問題在於:很難對很少量的樣品進行定量分析，很難對多種產品進行標記，操作者可造成汙染，並且可進行變造(manipulation)例如移除標記。用於寡核苷酸合成儀的標準合成法是亞磷酸三酯法。在亞磷酸三酯法中，形成DNA結構骨架的磷酸二酯鍵使用￠-氰乙基亞磷醯胺產生。在該方法中，從連接有核苷的固體支持物開始，通過重複由去保護(deblocking)、偶聯、加帽和氧化組成的合成過程來合成具有期望長度的寡核苷酸。作為合成過程的第一步的去保護步驟起始於使DMT從固體支持物上脫離，去保護步驟生成的5'-羥基與核苷亞磷醯胺單體發生偶聯反應，以合成具有期望核苷酸序列的寡核苷酸。去保護步驟在酸性條件下使用三氯乙酸或二氯乙酸進行。偶聯步驟後，未反應的5'-羥基可以參與下一偶聯步驟以生成具有不期望核苷酸序列的(n-1)mer，因此，使未反應的5'-羥基通過用乙酸酐和N-甲基咪唑乙醯化進行加帽。偶聯步驟得到的結構為亞磷酸酯，用碘將其氧化以將其轉化成磷酸酯形式，這是實際DNA結構的一部分。重複上述合成過程使得合成具有期望長度的寡核苷酸。合成完成後，用氨處理使合成的寡核苷酸從固體支持物上脫離，3 -氰乙氧基被從中去除，從而使得所合成的寡核苷酸恢復為形成DNA結構骨架的磷酸二酯鍵。由於在中性pH下磷酸二酯鍵帶負電，所以由多個磷酸二酯鍵組成的寡核苷酸顯示強親水性。因此，寡核苷酸易溶於水溶液，但一般不溶於有機溶劑。該特性導致寡核苷酸溶解於有機溶劑中時溶解度低的問題。對於使用這種DNA標記對象的方法，W087/06383公開了可作為標記使用的核苷酸，但未公開通過DNA擴增或測序鑑定對象的方法，並且未公開在有機溶劑中溶解親水性DNA的方法。W090/14441公開了·使用去汙劑將DNA溶於油中，從而將親水性DNA引入有機層的技術。然而，W090/14441僅公開了使用特定引物檢測DNA是否擴增來確定DNA存在與否。而且，其未提及使用DNA的核苷酸序列作為鑑定標記。此外，使用去汙劑時，DNA在有機層中以反向膠束的形式存在，以致其聚集而不是在分子水平上分散。另外，以反向膠束形式引入有機層的DNA可容易地被提取至水層，從而可能被去除。W091/17265公開了通過用特定引物(W090/14441中描述的)擴增基因來確定基因的核苷酸序列，還公開了 DNA可與固體支持物或物質共價連接。對於W091/17265的公開，當核苷酸直接與塗料或油成鍵時，在提取和收集寡核苷酸的過程中共價鍵會被破壞，從而改變核苷酸。因此，寡核苷酸不能擴增為準確序列，因此它們難以被商業化。W094/14918公開了基因擴增和測序的更為改進的方法，其使用兩種或更多種發光物質或顯色化合物作為標記。然而，該方法也未考慮到寡核苷酸的羥基或核苷酸的氨基的反應性。由於羥基或氨基部分的反應，在進行聚合酶鏈式反應(PCR)或核苷酸測序時無法得到具有原始序列的寡核苷酸。美國專利N0.5665538公開了監測水溶液中石油物質運動的方法，包括在石油物質中添加微軌跡添加劑(microtrace additive)。使用DNA以0.01-1000pg/DNA/ U I的終濃度將微軌跡添加劑加入至石油物質中。將DNA配製為可溶於石油物質，從而微軌跡添加劑的疏水性使其分配到石油物質中。該製劑確保DNA溶解於或分散於石油物質中，從而使得其基本上不被水性清洗除去。含微軌跡添加劑的石油物質在其移動後取樣，然後將微軌跡添加劑從石油物質中取出，最後通過擴增反應對DNA微軌跡添加劑進行檢測。美國專利公開2007/0065876公開了標記系統，其包含具有不同大小的寡核苷酸的組合。每個DNA包括三個片段，其中中間片段具有根據寡核苷酸的長度而不同的長度，從而使得這種不同的長度作為編碼，並且兩個末端片段為具有不同序列的引物。引物作為檢測元件來確定物質的存在與否。寡核苷酸DNA通過擴增進行檢測。美國專利N0.5451505公開了監測暴露於自然紫外照射的物質是否存在的方法，其包括使用至少20個且少於1，000個核苷酸的核酸使物質(如空氣汙染物、油或芳族化合物)標籤化，以使所述物質和核酸暴露於自然紫外照射的方式釋放經標籤化的物質，收集核酸，用聚合酶鏈式反應擴增所述核酸，並且監測物質的存在。EP1171633公開了包含相同探針序列和不同引物序列的核苷酸標籤，還公開了這樣的核苷酸標籤序列，其中正向引物和探針是固定的，而反向引物是變化的。其中，通過用引物和螢光標記之標籤進行的PCR對樣品中的核苷酸標籤進行定量檢測，從而允許定量測定物質中標記的量。
為了克服現有技術的上述局限性，以申請人名義申請的韓國專利申請N0.10-0851764公開了在親脂性溶劑中具有提高的溶解度的寡核苷酸，以及使用其鑑定物質的方法。同樣，以申請人名義申請的韓國專利申請N0.10-0851765公開了寡核苷酸標記以及使用其檢測交通工具的方法，所述寡核苷酸標記添加至交通工具塗層膜並且適於用作交通工具鑑定標記。根據所公開的方法，可通過以下用核苷酸序列信息跟蹤和監視物質:提取溶於塗料的痕量寡核苷酸，收集所述寡核苷酸，通過PCR擴增所收集的寡核苷酸，然後對所擴增的寡核苷酸進行測序。在該方法中，需要解碼核苷酸序列的過程，因為序列信息是編碼的。由於分析成本、精確性、時間消耗以及過程的複雜性，分析核苷酸序列的方法不易商業化，並且以簡單而迅速的方式確定物質的編碼信息(內部使用的鑑定編號，例如批號、生產商等)以及物質是否真實存在局限性。此外，由於市場上存在多種質量的油，油等級的變造以及非標準汽油的流通造成了問題。因此，為了控制製造商的品牌形象並且在這些的流通中建立秩序，需要能夠鑑定流通油的種類和質量的技術
發明內容
技術問題本發明的一個目的是提供更穩定的寡核苷酸，以及用寡核苷酸標記物質並且在短時間內從物質中回收和鑑定經標記的寡核苷酸標記的方法。問題的解決方法一方面，本發明 提供了連接有陽離子型相轉移劑(cationic phase transferagent)(為季銨鹽化合物或陽離子表面活性劑)的寡核苷酸，以及使用所述寡核苷酸標記物質並且在短時間內從物質中回收和鑑定經標記寡核苷酸標記的方法。下文將對本發明進行詳細說明。一方面，本發明提供了用於鑑定物質的寡核苷酸標記，所述寡核苷酸標記為連接有陽離子型相轉移劑(為季銨鹽化合物或陽離子表面活性劑)的寡核苷酸，所述寡核苷酸標記包含用於實時聚合酶鏈式反應(PCR)的探針序列和連接至探針序列兩端的引物序列。本發明中，所述陽離子型相轉移劑可為烷基季銨離子(quaternaryalkylammonium ion),如四丁基氫氧化銨或十六燒基三甲基溴化銨。本發明中，所述寡核苷酸的末端可被封閉劑封閉，其中所述封閉劑不含化學物質或末端基團，例如脂質或磷酸酯/鹽(phosphate)。本發明中，所述寡核苷酸包含與含1-50個碳原子的有機化合物連接的反應性氮和氧部分，其中所述含1-50個碳原子的有機化合物為選自以下的化合物中的任一種:與氮形成醯胺鍵並且與氧形成酯鍵的羰基化合物、形成O-Si鍵與N-Si的矽基(silanyl)化合物、形成O-S鍵與N-S的磺醯基化合物，以及形成O-C鍵與N-C的飽和烴、芳香烴、不飽和烴或含雜原子的飽和或不飽和烴化合物，其中N-C和O-C之間的鍵可通過用氨處理斷裂。本發明中，所述寡核苷酸的長度為20-1000個核苷酸。另一方面，本發明提供了用於鑑定物質的方法，所述方法包括將所述寡核苷酸標記添加至所述物質。所述物質可以是選自以下的物質中的一種:交通工具塗層(vehicle coating)、漆(lacquer)、交通線塗料(paints for traffic line)、石油、塗料稀釋劑(paint diluent)、衝淡劑(thinner)、爆炸物、天然油，建築塗料、有機溶劑、粘合劑、染料、肉和魚。另一方面，本發明提供了用於鑑定物質的方法，所述方法包括:I)從標記有寡核苷酸標記的物質中提取寡核苷酸標記，所述寡核苷酸標記為與陽離子型相轉移劑連接的寡核苷酸，所述陽離子型相轉移劑為季銨鹽化合物或陽離子表面活性劑，所述寡核苷酸標記包含用於實時聚合酶鏈式反應(PCR)的探針序列和連接至探針序列兩端的引物序列；2)使用引物和探針通過實時PCR擴增所提取的寡核苷酸；3)通過實時PCR產物鑑定標記有所述寡核苷酸標記的物質。本發明中，所述探針可為螢光標記探針。本發明中，I)中的提取可以通過向所述物質中添加陰離子表面活性劑來進行。本發明中，所述物質可以為脂溶性或水溶性物質。更特別地，所述物質可以為選自以下的物質中的一種:交通工具塗層、漆、交通線塗料、石油、塗料稀釋劑、衝淡劑、爆炸物、天然油，建築塗料、有機溶劑、粘合劑、染料、肉和魚。
本發明中，可以通過以下進行鑑定:通過包含在所述物質中的具有不同序列的寡核苷酸標記的組合來鑑定所述物質。另一方面，本發明提供了用於鑑定物質的組合物，所述組合物包含所述寡核苷酸本發明中，所述組合物還可包含與所述寡核苷酸標記相對應的弓I物和探針。發明的有利效果本發明的用於鑑定物質的寡核苷酸標記使得短時間內以高精確性分析痕量物質成為可能，其在油性溶劑中具有改進的溶解度，並且可以改進檢測方法從而使得可以在2小時內檢測寡核苷酸標記。與使用測序的常規標記方法或利用螢光染料進行標記的常規方法相比，本發明的用於鑑定物質的方法可提供靈敏幾百倍的標記，而且其可標記多種產品，從而使得在實際生產過程對產品進行控制成為可能。本發明的用於鑑定物質的寡核苷酸標記可標記多種產品，包括油產品和石油產品、藝術品和收藏品，並且還可用於進行犯罪調查。附圖簡述本發明的上述和其他目的、特徵以及其他優點將通過以下結合附圖的對一些優選實施方案的說明變得顯而易見，附圖中:
圖1顯示與相轉移劑連接的寡核苷酸，其中寡核苷酸5和3區的核苷酸部分或醇形成醯胺鍵和酯鍵(R =C1 C18)；圖2顯示作為使用陽離子型相轉移劑之函數的寡核苷酸在有機溶劑中的溶解度的分析結果((A):溶於柴油的寡核苷酸的量；(B):溶於汽油的寡核苷酸的量；(C):溶於柴油的含脂質的寡核苷酸的量；(D):溶於汽油的含脂質的寡核苷酸的量)；圖3顯示溶於有機溶劑汽油的本發明寡核苷酸的回收的分析結果((A):溶於柴油的寡核苷酸的回收率；(B):溶於汽油的寡核苷酸的回收率)；圖4圖3顯示溶於作為有機溶劑的柴油的本發明寡核苷酸的回收率的分析結果；圖5顯示為了檢測從有機溶劑汽油中回收的本發明寡核苷酸的分子結構修飾而進行的MALD1-T0F質量分析結果；圖6顯示為了檢測從有機溶劑柴油中回收的本發明寡核苷酸的分子結構修飾而進行的MALD1-T0F質量分析結果；圖7為顯示以下的一組圖:用本發明寡核苷酸進行的實時定量核酸擴增反應的螢光曲線圖(A);使用螢光曲線繪製的定量曲線線圖(B)；圖8為顯示以下的一組圖:作為拷貝數之函數的以系列稀釋標準寡核苷酸作為模板以及探針和引物進行的實時定量核酸擴增反應的螢光曲線圖(A);使用螢光曲線繪製的定量曲線線圖⑶；圖9為顯示以下的一組圖:作為拷貝數之函數的以從汽油中純化的寡核苷酸標記和標準寡核苷酸作為模板以及探針和引物進行的實時定量核酸擴增反應的螢光曲線圖(A);使用螢光曲線繪製的定量曲線線圖⑶；圖10是顯示本發明寡核苷酸標記的鑑定信息的示意圖；圖11為示意圖，其顯示用4種不同引物組和5種探針組標記的樣品是否產生實施例4中的多種鑑定編碼(引物組1:紅，引物組2:黃，引物組3:綠，引物組4:藍，探針1:紫，探針2:監，探針3:綠，探針4:橘紅，以及探針5:売綠);圖12為顯示本發明實施例4中使用qPCR反應進行的定量分析結果的圖，qPCR反應使用探針組SEQ ID NO:35和39，引物組SEQ ID NO:27和28，以及引物組SEQ ID NO:29和30作為對照。圖13為顯示對本發明實施例4的4種模板使用qPCR反應進行的定量分析結果的圖，qPCR反應使用探針組SEQ ID NO:35和39，引物組SEQ ID NO:27和28。圖13為顯示對本發明實施例4的4種模板使用qPCR反應進行的定量分析結果的圖，qPCR反應使用探針組SEQ ID NO:35和39，引物組為SEQ ID NO:29和30。
具體實施例方式下文將參照實施例對本發明進行進一步詳細闡述。然而，這些實施例僅用於說明目的，而不以任何方式將本發明的範圍限於這些實施例。除非另有定義，本文所用全部技術和科學術語與本領域普通技術人員通常理解的含義相同。在下面的描述和附圖中，省略了將使本發明主題不需要地含糊的已知功能和構造的描述。[實施例1]有機溶劑中寡核苷酸的溶解_2] I)寡核苷酸的製備為了檢測寡核苷酸通過相轉移劑(PTA)在有機溶液中溶解度，通過自動合成系統在受控孔度玻璃(controlled pore glass, CPG)上合成了具有期望核苷酸序列的寡核苷酸。寡核苷酸序列設計成使其可通過qPCR(定量聚合酶鏈式反應)分析，其為68mer長的模板DNA。SEQ ID NO:1(正常 _68mer):5' -ATTCGGTGAATAAGCACTCTCATAGTCCTCATCCAACTGCGCGTCTTGCATAGAGCTGCTGACCCTAC-3' (MW = 20777).
為了增強作為模板的寡核苷酸在有機溶劑中的溶解度和穩定油中的寡核苷酸，可以將寡核苷酸合成為在其兩端添加有脂質。在本實施例中，設計寡核苷酸以使其3'端還包含C12，在5'端還包含C18。SEQ ID NO:2(脂質 _68mer):5' -C18-ATTCGGTGAATAAGCACTCTCATAGTCCTCATCCAACTGCGCGTCTTGCATAGAGCTGCTGACCCTAC-CI2-3'用氨(濃度為28%或更高)從受控孔度玻璃(CPG)回收合成的寡核苷酸。為了實現該目的，合成後，將lml28%氨水添加至受控孔度玻璃(約10mg)，然後室溫下(約25°C)孵育約30分鐘，之後回收氨溶液，從而回收作為水溶液的寡核苷酸。回收上述條件下處理的寡核苷酸，使得DNA鹼基保護基團被部分保留。這些鹼基保護基團有利於寡核苷酸在有機溶劑中的溶解，並防止寡核苷酸被酶等降解。這些保護基團在回收後可用有機溶劑除去，使得寡核苷酸可通過qPCR分析。水溶液中的寡核苷酸用260nm處的UV吸光度進行定量。(2)樣品的製備
使用15ml錐形管(Corning)進行將寡核苷酸的水溶液溶於有機溶劑的實驗。將寡核苷酸溶於無菌水中以使OD達到每毫升約50 (但在其它實驗中其稀釋至多種濃度)。作為相轉移劑(PTA)，可以使用通過靜電吸引力與寡核苷酸的陰離子區域連接的陽離子型相轉移劑(+PTA)。在這樣的實施例中，使用十六烷基三甲基溴化銨(分子量=364.5)作為相轉移劑，將其以1.3nM的濃度(但在其它實驗中溶解為多種濃度)溶於無菌水。作為有機溶劑，可以使用甲苯和醚，也可以使用油，如汽油和柴油。在本實施例中，使用汽油(SK Energy C0.，Ltd.，Korea)和柴油(SK Energy C0.，Ltd.，Korea)作為運輸工具用油。(3)實駘步驟用15ml錐形管(Corning)進行將寡核苷酸水溶液溶於有機溶劑的實驗。將寡核苷酸加至錐形管以使OD達到每毫升約100，然後加入陽離子型相轉移劑(+PTA)使樣品體積達到2ml，之後加入等體積的有機溶劑。將包含樣品和有機溶劑的錐形管用蓋封閉，用渦旋器充分混合樣品I分鐘或更長時間。此時，寡核苷酸的極性部分與相轉移劑通過靜電連接而中和，以 使其溶於有機溶劑。將混合的樣品以3，000RPM離心10，得到水層和有機溶劑層，收集下方水層並測定UV吸光度，從而測定水層中寡核苷酸的量。當寡核苷酸留在水層中，從上方水層部分中回收有機溶劑，向其中加入陽離子型相轉移劑和有機溶劑，重複混合和分離過程。如圖2結果所示，由於使用了 2當量或更多(基於使用的寡核苷酸)的陽離子型相轉移劑，90%或更多寡核苷酸從水溶液中進入有機溶劑，兩末端添加有脂質的樣品顯示相似結果。本實施例中，可以看出寡核苷酸在有機溶劑中分配係數(Pk)為約20。此外可以看出，通過控制所用相轉移劑和有機溶劑的種類和比例，95 %或更多的水溶液中的寡核苷酸可溶於有機溶劑。[實施例2]溶於有機溶劑的寡核苷酸的回收由於利用陽離子型相轉移劑(+PTA)的親脂特性將寡核苷酸溶於有機溶劑中以及鹼基保護基團已穩定溶於有機溶劑，當使用與水混合或用氨水煮的方法時，其不會以任何顯著量溶於水層。因此，如果加入能夠為陽離子型相轉移劑(+PTA)提供反離子(counter ion)的陰離子型相轉移劑(-PTA)從而使得這些反離子與陽離子型相轉移劑(-PTA)結合以替代寡核苷酸，則寡核苷酸可用水萃取出來。本實施例中，將實施例1中得到的溶於有機溶劑的各寡核苷酸(脂質-68mer和正常-68mer)稀釋至OD值為每ml約30 (其他實驗中稀釋成多種濃度)。將寡核苷酸的回收率表示為相對於最初添加量的百分比。作為陰離子型相轉移劑(-PTA)，使用溶於無菌水的濃度為0.5M的SDS (十二烷基硫酸鈉，分子量:288.4)，但也可用任何試劑作為陰離子型相轉移劑，只要其可溶於有機溶劑並且可作為陽離子型相轉移劑(+PTA)的反離子通過靜電吸引與有機溶劑中的寡核苷酸連接。本實施例中，使用了與實施例所用相同的包含溶解於其中的寡核苷酸的有機溶劑和陰離子型相轉移劑(-PTA)，並且回收了其中溶有寡核苷酸的水層。表I溶於汽油的寡核苷酸的回收
權利要求
1.一種用於鑑定物質的寡核苷酸標記，所述寡核苷酸標記為連接有陽離子型相轉移劑的寡核苷酸，並且包含用於實時聚合酶鏈式反應(PCR)的探針序列和連接於所述探針序列兩端的引物序列。
2.根據權利要求1的寡核苷酸標記，其中所述寡核苷酸的末端被封閉劑封閉。
3.根據權利要求2的寡核苷酸標記，其中所述封閉劑不含化學物質或末端基團，其為脂質或磷酸酯/鹽。
4.根據權利要求1的寡核苷酸標記，其中所述寡核苷酸包含與含有I至50個碳原子的有機化合物連接的反應性氮和氧部分。
5.根據權利要求1的寡核苷酸標記，其中所述寡核苷酸的長度為20至1000個核苷酸。
6.一種用於鑑定物質的方法，所述方法包括向物質中添加權利要求1所述的寡核苷酸標記。
7.根據權利要求6的方法，其中所述物質選自交通工具塗層的塗料、漆、交通線塗料、石油、塗料稀釋劑、衝淡劑、爆炸物、天然油，建築塗料、有機溶劑、粘合劑、染料、肉和魚。
8.一種用於鑑定物質的方法，所述方法包括: 1)從標記有權利要求1所述寡核苷酸標記的物質中提取寡核苷酸； 2)用引物和探針通過實時PCR擴增提取的所述寡核苷酸；和 3)使用所述實時PCR的產物鑑定標記有所述寡核苷酸標記的所述物質。
9.根據權利要求8的方法，其中所述探針為螢光標記的探針。
10.根據權利要求8的方法，其中I)的所述提取使用陰離子型相轉移劑進行。
11.根據權利要求8的方法，其中所述物質為脂溶性或水溶性物質。
12.根據權利要求11的方法，其中所述物質選自交通工具塗層的塗料、漆、交通線塗料、石油、塗料稀釋劑、衝淡劑、爆炸物、天然油，建築塗料、有機溶劑、粘合劑、染料、肉和魚。
13.根據權利要求8至12中任一項的方法，其中所述鑑定這樣進行:通過包含於所述物質中的具有不同序列的所述寡核苷酸標記的組合來鑑定所述物質。
14.一種用於鑑定物質的組合物，所述組合物包含權利要求1所述的寡核苷酸標記。
15.根據權利要求14的組合物，其還包含對應於所述寡核苷酸標記的引物和探針。
全文摘要
本發明提供了寡核苷酸標記和使用其鑑定物質的方法。所述寡核苷酸標記使短時間內以高精確性分析痕量的物質成為可能，具有改進的在油性溶劑中的溶解度，並且可以改進檢測方法從而使得在2小時內可檢測到所述寡核苷酸標記。所述寡核苷酸標記可標記多種產品(包括油產品和石油產品，藝術品和收藏品)，並且可用於進行犯罪調查。
文檔編號C12Q1/68GK103154244SQ201180048384
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月2日 優先權日2010年9月3日
發明者樸翰浯, 李在敦, 宋邱永, 吳鍾億, 金鉉培, 卞相軫, 張鎮雄, 蔣沅錫, 崔鍾德 申請人:株式會社百奧尼