用於抗過敏症狀的微生物株、其組合物和以此微生物株刺激細胞產生幹擾素-γ的方法

2023-10-12 00:03:54 1

專利名稱：：用於抗過敏症狀的微生物株、其組合物和以此微生物株刺激細胞產生幹擾素-γ的方法
技術領域：
：本發明關於一種經分離的類乾酪乳桿菌(丄actoZwc/〃wparacme/),且特別關於其可用於抗過敏症狀。
背景技術：
：過敏疾病是一種免疫疾病，其為人體內的免疫功能失調，出現不平衡的狀況。由於人體內有抗原(過敏原)進入，身體就會產生免疫保護作用，當人體再次接觸抗原時，就會誘發身體免疫系統產生反應，T細胞會釋放幹擾素(Interferon,IFN)-y、白細胞介素(Interleukin,IL)-2，使免疫反應趨向第一型T細胞反應，B細胞因此分泌更多的免疫球蛋白G(IgG)。然而，有過敏體質的人，當過敏原進入體內，則會誘發身體免疫系統朝第二型T細胞免疫反應，T細胞會釋放白細胞介素4、5、9、13，讓免疫B細胞製造免疫球蛋白E(IgE)增加，粘附在肥大細胞(Mastcells)上，再遇過敏原時，過敏原會粘附在免疫球蛋白E上，共同作用後，月巴大細胞會釋放發炎介質如組織胺(Histamine)、白三烯素(Leukotriene)、前列腺素(Prostaglandin)、和血小板活化因子等，這些發炎介質會進一步導致過敏症狀發生。由上述說明可知，影響過敏免疫反應之一為幹擾素y。免疫細胞活化到某程度後所產生的幹擾素—1],可以增加抗原呈獻細胞的功能，使巨噬細胞能有效的辨識併吞噬侵入的病原體，所以幹擾素-y也被稱為巨噬細胞的活化因子之一p]。全世界的過敏疾病罹病率和盛行率有逐年增加之勢，且病情轉趨嚴重，住院率和死亡率也隨之增加，全球約有20%到30%的人口有過敏疾病的經驗。如過敏的標的器官是在鼻子則稱之為過敏性鼻炎(rhinitis)，發生在皮膚則為異位性皮膚炎(dermatitis)或蕁麻滲(urticaria),發生在眼睛則為過敏性結膜炎(conjunctivitis),發生在氣管為氣喘(asthma)等。這些過敏症狀影響短則幾周長則數個月，對於過敏患者而言實在造成生活品質上的一大影響因素且現代社會為此付出了巨大成本。乳酸菌是非致病性的革蘭氏陽性桿菌，是腸道的益生菌，在腸道黏膜表面的正常菌叢中大多數是乳酸菌與比菲德氏菌，其臨床作用有調節腸道的通透性、改變腸道微生物的狀態與增加腸道IgA的反應性[3，4，5]。早期的研究發現乳酸菌可刺激老鼠的脾臟細胞抹分泌幹擾素-/'7-9]，同時在人類的研究上亦發現血液中的淋巴球細胞亦可被乳酸菌刺激而分泌幹擾素-/'5'|1-12]。經上述說明可知，幹擾素i可調節免疫反應產生與否。因此乳酸菌能刺激產生幹擾素-Y也代表其可調節免疫反應。
發明內容本發明提供一種經分離的微生物抹，命名為類乾酪乳桿菌(丄acto6ac/〃w/aracwe/)BRAP-01，其保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2218。本發明也提供一種用於抗過敏症狀的微生物抹，包括如上述的微生物抹。本發明另提供一種用於抗過敏症狀的組合物，包括有效量的上述微生物抹；以及賦形劑。本發明還提供一種刺激細胞產生幹擾素-Y的方法，包括提供哺乳動物共培養。為了讓本發明的上述和其它目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合附圖，作詳細說明如下圖1A與1B顯示分離抹BRAP-01進行API50CH糖化反應測試的結果。圖2A與2B圖顯示分離株BRAP-01、BR1204以及市售優酪乳(統一LP33機能優酪乳)中LP33菌三抹菌的API50CH糖化反應測試的結果差異。圖3顯示BRAP-Ol、BR1204以及市售優酪乳(統一LP33機能優酪乳)中LP33菌三抹菌的隨機擴增多型性DNA圖譜。圖4A顯示BRAP-01、BR1204以及市售優酪乳(統一LP33機能優酪乳)中LP33菌三林菌進行序列比對的結果。圖4B顯示BRAP-01、BR1204以及市售優酪乳(統一LP33機能優酪乳)5中LP33菌三4朱菌的演化關係。圖5顯示實驗樣本的不同過敏症狀的病患分布情況。圖6顯示人類幹擾素-Y濃度標準液的序列稀釋。圖7顯示試劑或各菌抹對刺激細胞產生幹擾素-Y能力的差異。圖8顯示分離林BRAP-01的革蘭氏染色鏡檢。圖9顯示將分離抹BRAP-01進行API50CH糖化反應測試的測試結果以API軟體進行分析。發明詳述菌種分離首先自嬰兒糞便一全體以ROGOSA平板培養基作為選擇性培養基進行菌種分離，以得到分離的單一菌落。菌種確認將經由上述方法取得的分離抹之一命名為BRAP-01並將其進行各項鑑定。分離林BRAP-01菌落外觀為乳白色凸起菌落，適用的液體培養基為MRSbroth，培養溫度為33-40°C,微厭氧環境下生長。革蘭氏染色結果呈藍紫色，分離抹BRAP-Ol為革蘭氏陽性桿菌。分離抹BRAP-Ol不具運動性、具觸酶、不具氧化酶。根據乳酸菌16S核糖體基因高保留性的特性設計一對分類引物(speciesprimer)-16SrDNA引物順向引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG畫3，；反向為引物5，-GTATTACCGCGGCTGCTG-3，。將分離抹BRAP-01以上述引物進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)鑑定，得到分離林BRAP-01的16S核糖體DNA基因部分序列516bp，如序列號1的序列所示。將序列號1的序列於美國全國生物技術信息中心(NCBI)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)基因庫進行序列比對，結果顯示分離抹BRAP-01與類乾酪乳桿菌相似度99%，結果如表1所示。表1、分離林BRAP-01與其它類乾酪乳桿菌亞種的16S核糖體DNA基因部分序列比對結果6tableseeoriginaldocumentpage7分離抹BRAP-01進行微生物50種糖類生化反應鑑定系統鑑定(API50CHL),結果如圖1A與1B所示，將此結果以API軟體進行分析，確認其為類幹酷豸L才幹菌類幹賂亞種(丄acto6ac/〃tw/ara;case/m//an3ca化/)的l岸"i只度為99%，因此鑑定為類乾酪乳桿菌的菌抹。綜合上述的各項鑑定結果顯示此分離抹BRAP-01為類乾酪乳桿菌的菌林。不同類乾酪乳桿菌的差異分析將分離抹BRAP-Ol、發明人先前已確認為類乾酪乳桿菌的另一菌抹BR1204以及市售優酪乳(統一LP33機能優酪乳)中LP33菌抹(也為類乾酪乳桿菌的一^M進^f亍以下的差異分析。1.API50CHL鑑定分析將上述三菌林進行API50CHL鑑定，結果顯示於圖2A與2B,由圖可知三抹類乾酪乳桿菌的生化反應不相同。其中BRAP-01對鼠李糖(Rhamnose)與蜜二糖(Melibiose)的生化反應與其它兩林菌完全不同。2.隨機擴增多態性DNA(RandomlyamplifiedpolymorphicDNAs，RAPD)分析利用較廣泛的應用於族群分布變異或亞種間差異的研究之隨機擴增多態性DNA來判定菌種間的差異。這個方法主要利用聚合酶鏈式反應的技術以較短的引物(約10個核苷酸)在DNA上任意的配對而進行放大。由於相同族群或相同亞種的個體間核酸序列變異較少，所以放大出的核酸片段大小差異較小，而不同族群或亞種的個體間的差異則較大，所以放大出的核酸片段大小差異亦較大。本分析所使用引物序列為(5'-AACGCGCAAC-3')，以此引物進行聚合酶鏈式反應以得知三抹菌抹隨機擴增多型性DNA的差異。聚合酶鏈鎖反應條件為95°C，IO分鐘將雙股DNA變性分離為單股(denature);95°C,30秒；36°C,30秒；72°C，30秒，進行30次循環，最終72。C，5分鐘來擴增DNA片段。反應完成後以1.5。/。瓊脂糖凝膠(agarOsegel)進行DNA電泳分析。圖3的隨機擴增多態性DNA圖譜中顯示BRAP-Ol主要擴增片段為350bp、450bp、650bp、800bp、900bp、1000bp、1300bp、1400bp、1500bp、2500bp(左起第l欄)；LP33主要擴增片段為450bp、950bp、1100bp、1300bp(左起第2欄)；BR1204主要擴增片段為450bp、950bp、1000bp、2500bp(左起第3欄)。因此三抹菌在圖譜上主要片段不同，故具有差異性。M為DNA分子量標準品，由小至大依序為300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp、2000bp與3000bp(右起第1欄)。3.16S核糖體基因序列比對'如前述，根據乳酸菌16S核糖體基因高保留性的特性設計一對分類引物(speciesprimer)-16SrDNA引物順向引物為5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3s;反向為引物5，-GTATTACCGCGGCTGCTG-3，。將分離林BRAP-Ol、BR1204與LP33以上述引物進行聚合酶鏈式反應鑑定，得到分離抹BRAP-Ol的16S核糖體DNA基因部分序列序列號l,以及BR1204與LP33的16S核糖體DNA基因部分序列，分別各皆約為500-600bp。利用CLCcombinedWorkbench3.0.2版免費試用軟體(CLCbioInc.HeadquarteredinAarhus，Denmark)將三株菌抹的16S核糖體DNA基因部分序列進行序列比對，比對結果如圖4A所示。將此比對結果產生演化樹以證實三抹菌抹的相關性，如圖4B所示。在序列比對上BRAP-01與其它兩4朱具有差異性，經由演化樹的結果證實BRAP-Ol、BR1204與LP33為不同的菌林。綜上所述可以得知BRAP-01、BR1204與LP33在生化反應、基因序列以及演化分類上皆不相同，三抹菌確實為不同的菌抹，因此可以證實分離林BRAP-01確實為新穎的菌才朱。將此新穎的分離林命名為類乾酪乳桿菌BRAP-01,並且將其保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2218。又本發明提供一種用於抗過敏症狀的微生物抹，包括上述的類乾酪乳桿菌BRAP-Ol。其使用形式可包括菌粉等，而菌粉的形成方法包括將培養的細菌經冷凍乾燥等方式而得。在一實施例中，將菌種活化培養後利用冷凍乾燥方式進行凍幹。凍幹菌粉粉末檢測菌數須大於9.0xl(TCFU/g，在一實施例中為大於1.0xl0"CFU/g。而上述的過敏症狀則包括氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、過敏性結膜炎、食物過敏、蕁麻滲及/或腸躁症等。上述菌抹具抗過敏症狀的功能為因其具有刺激細胞產生幹擾素-y的能力。在一實施例中，可將上述的菌粉取約0.5-3g溶於5-20ml無菌水中，充分均勻混合後，形成菌粉混合液，以系列稀釋方式，將菌粉混合液稀釋至約9.0xl07-3.0xl08CFU/ml,接著置於約80-100°C中加熱處理約2-8分鐘，優選為置於95。C水浴槽中加熱處理約5分鐘，之後置於4。C備用。然後將經上述處理的菌粉與哺乳動物細胞進行共培養後，再測定細胞所產生的幹擾素-y的量，證實細胞所產生的幹擾素i的量確實有增加的情形。上述的哺乳動物細月包可包括人類外周血單核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)。在一來的約6-12倍。本發明也可將有效量的上述用於抗過敏症狀的^f鼓生物抹與賦形劑等組合以形成用於抗過敏症狀的組合物。而賦形劑可為一般食品可添加或藥學上可接受的賦形劑，包括乳糖(lactose)、乾燥澱粉(starch)、澱粉糊(starchpaste)、糊精(dextrin)、環糊精(cyclodextrin)、預膠化澱粉(pregelatinizedstarch)、羧曱基;定4分4內(carboxymethylstarchsodium)、#5丙基;定鬥分(hydroxypropystarch)、孩l晶性纖維素(microcrystallinecellulose)、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)或麥芽糊精(maltodextrin),優選為千燥澱粉、糊精、羧甲基纖維素或麥芽糊精。在一實施例中所使用的賦形劑為麥芽糊精。在此組合物中，上述用於抗過敏症狀的微生物抹的型態可包括菌粉，而菌粉可由冷凍乾燥等方式而得。此組合物也具抗過^:症狀的功能，由於其具有刺激細胞產生幹擾素-y的能力。又其可抵抗的過敏症狀則包括氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、過敏性結膜炎、食物過敏、蕁麻瘮及/或腸躁症等。上述的細胞可包括人類外周血單核細胞。在一實施例中，上述用於抗過敏症狀的組合物促進細胞所產生的幹擾素-Y為原來的約6-12倍。實施例一、體外實一瞼實驗方向體外實驗主要分成二部分進行，第一部分為具過敏症狀的病患的血液樣本分離出外周血單核細胞並將其與試劑或各菌林共同培養來觀察病患的外周血單核細胞對試劑或各菌林所產生細胞激素的差異。第二部分為收集不同過敏症狀的病患，分別將其外周血單核細胞進一步與試劑或各菌抹共培養，以得知BRAP-01抗不同過每丈症狀的能力。菌抹製備BRAP-01為篩選自嬰兒糞便;險體的菌種，該菌種經鑑定為類乾酪乳桿菌，該菌種活化培養後，利用冷凍乾燥方式進行凍幹。凍幹菌粉;險測菌數須大於1.0xl0"CFU/g。進行細胞實驗時，取1g菌粉溶於10ml無菌水中，充分均勻混合後，以系列稀釋方式，將菌粉混合液稀釋至2.0xl08CFU/ml，置於95。C水浴槽中加熱處理5分鐘後，置於4。C備用。實驗中使用到的其它菌林的製備亦如上述。人類外周血單核細胞製備1.過每l病患血液樣本收集血液檢體來自臺灣高雄某診所，共計52名過敏病患，其過敏症狀由醫師診斷告知，過敏症狀包括氣喘(asthma)、過敏性鼻炎(allergicrhinitis)、異位性皮月夫炎(dermatitis)、過每文性結膜炎(conjunctivitis)、食物過每文(foodallergy)、蕁麻滲(urticaria)、腸躁症(IBS，IrritableBowelSyndrome)等，病患中有多數合併兩種以上症狀發生，不同過壽丈症^l大的病患分布如圖5所示。2.人類外周血單核細胞分離抽取病患血液約10ml，將病患血液沿管壁緩慢加入含有聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)(BDPharmacia,Cat.No.17-1400-02)的離心管中，以冷凍離10心機進行離心(3000rpm,10分鐘)來進行全血的血球分離，分界面處為外周血單核細胞，沉澱物為紅血球。將取出的外周血單核細胞置於新的15ml離心管，並加入10ml1x磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)至離心管中，以離心機進行離心(1500rpm,5分鐘)，除去上清液，留下血球細胞沉澱。取10mlRPMI-1640培養基(含1。/。青黴素-鏈黴素(Penicillin-Streptomycin)及10%小牛血清)至離心管中，來回吸衝^)次並避免氣泡產生，使血球細胞均勻分布。取血球細胞懸浮液與臺盼藍(trypanblue)染劑等體積混合，以血球計數盤進行細胞計數。並以RPMI-1640培養基調整血球細胞懸浮液濃度為4.0x106個細力包/ml。人類外周血單核細胞與乳酸菌共同培養進行共同培養時，取100pl血球細胞懸浮液及20pl菌林加於96孔盤細胞培養jEi，每一個孔(well)含有200|al的混合液，將已加熱處理的菌抹與人類外周血單核細胞置於培養條件為37°C、5。/。C02細胞培養箱中一起培養48小時後，收集細胞培養液，分別置於2ml離心管，以2000rpm離心5分鐘後，取上清液進行酶聯免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),測定幹擾素-Y的濃度。以酶聯免疫吸附測定測量細胞上清液中的幹護L素-y1.人類幹擾素-Y濃度標準曲線幹擾素-y標準儲存液製備方法如下將重組人類幹擾素-y(BDPharmingen:Cat.No.554616)粉末溶解於無菌水中，調整其濃度至56ng/ml,並以每管50pi形式分裝後儲存於-70。C保存。取出一管濃度56ng/ml的幹擾素-Y標號為1，參照圖6，將幹擾素-Y標準液進行序列稀釋，分別取500(11稀釋緩沖溶液(lx磷酸鹽緩衝液)，加入標示為2、3、4、5、6及7的1.8ml微量離心管中備用。先以微量分注器將1號管加入1080jil的稀釋緩衝溶液後，與重組人類幹擾素-Y混合均勻。並依箭頭指示依序進行幹擾素-Y標準液的製備，並以稀釋緩沖溶液作為幹擾素-y濃度為零的樣品。依據上述方式稀釋後使終濃度分別為1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml及31.3pg/ml。2.細胞所產生的幹擾素-y農度分析取適量經純化的抗-人類幹擾素-Y(BDPharmingen,Cat.No.551221)溶於緩衝液(coatingbuffer,0.1MNa2HPO4，pH9.0)使得終濃度為2pg/ml,力卩150^至每一格中；以膠膜封好，置於4。C中隔夜；次日用洗滌緩衝液(washingbuffer,0.05%Tween20溶於磷酸鹽緩沖液)沖洗每一格3次各3分鐘；然後每格加入200jil填充緩衝液(blockingbuffer,1%牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)溶於磷酸鹽緩衝液)，在37。C反應2小時，再用洗滌緩沖液衝洗每一格3次各3分鐘；取樣本100|il加入每一格中，於4。C放置隔夜；隔天用洗滌緩沖液沖洗每一格3次各3分鐘，再分別加入100fil生物素(biotin)小鼠抗-人類幹擾素-Y(BDPharmingen,CatNo.554550，0.5|ig/ml)(1000倍稀釋)至每格中，37。C2小時；然後用洗滌緩衝液衝洗每一格3次各3分鐘；加入100jil抗生物素蛋白鏈菌素"威性磷酸酶(Streptavidin-alkalinephosphatase)(1:2000)至每格中，37。Cl小時；洗滌緩沖液衝洗每一格3次各3分鐘，最後加入90|ilpNPP(BDPharmingen,石舞酸對硝基苯酉旨(p-Nitrophenylphosphate),二鈉(di-sodium))至每格中呈色，呈色結果以波長405nm進行讀取，讀取lt值與標準曲線進行濃度換算。不同菌抹刺激具過敏症狀病患的人類外周血單核細胞分泌幹擾素-Y的比絲將病患的人類外周血單核細胞分成五組進行共同培養來分析試劑或各菌林對刺激細胞產生幹擾素-Y能力的差異。第一組為空白組，第二組加入植物白細胞凝集素(Leucoagglutinin，PHA-L)(SigmaL2769)(10(ig/ml)為正控制組，第三組加入文獻中已證實具有抗敏功效的益生菌，鼠李糖乳桿菌(丄actoZ^"7/wsGG(LGG),ATCC53103)，第四組為加入分離抹BRAP-01,第五組為加入類乾酪乳桿菌33，(LP33)。結果如第7圖所示。利用人類外周血單核細胞與熱處理乳酸菌共同培養後進行幹擾素-Y分析，其結果為空白組578.8士56.47;PHA:1359.0±49,97;LGG:2386.0±31.9;BRAP-01:5495.0士279.1;類乾酪乳桿菌33:3315.0±149.9。由上述結果可得知BRAP-01確實能刺激大量幹擾素-Y分泌，且分泌量約為LGG的2.5倍，顯示類乾酪乳桿菌BRAP-01確實有減輕過^:症狀的潛力。不同菌抹刺激具不同過敏症狀病患的人類外周血單核細胞分泌幹擾素-Y的比較_培養來分析試劑或各菌抹對刺激細胞產生幹擾素-Y能力的差異。第一組為空白組，第二組加入植物白細胞凝集素(10(ig/ml)為正控制組，第三組加入文獻中已證實具有抗敏功效的益生菌，鼠李糖乳桿菌GG(LGG，ATCC53103),第四組為加入分離4朱BRAP-01，第五組為加入類乾酪乳桿菌33(LP33)，其結果依據分泌幹擾素-y進行比較(以酶聯免疫吸附測定單位(ELISAUnit)進行相對值比較，酶聯免疫吸附測定單位氣OD釓5-NaiVe)/PHAx100。/。)，並以酶聯免疫吸附測定單位進行等級區分，<50%:+;50100%:++;101%:+++，結果如表2所示。表2、不同菌株刺激病患人類外周血單核細胞分泌幹擾素-Y的相對值(酶聯免疫吸附測定單位)_tableseeoriginaldocumentpage13依據相對值分布結果，LGG及類乾酪乳桿菌33對於具有過敏症狀的病患均具有刺激作用，但以BRAP-01較強，顯示BRAP-01對於七大過敏症狀的病患均具有調控Thl/Th2的作用，刺激幹擾素-Y產生。二、臨實馬全利用類乾酪乳桿菌BRAP-01進行過敏性鼻炎非正式臨床試驗1.受試者受試者以居住在臺灣高雄市且能定期在門診追蹤治療者為優先，且需符合以下條件年齡5歲以上、患有過敏性鼻炎至少一年以上、對家塵過敏原皮膚測試呈陽性反應且患者願意接受臨床研究評估。若有下列情形，則不列入研究準備或正在懷孕中婦女病患、正使用全身性類固醇患者、近半年有抽菸習慣、患有精神障礙者、先天免疫不全的患者、對牛奶過敏者。而如有下列情形發生，受試者可提早退出實-險急性細菌性或病毒感染並發鼻竇炎、行政因素，如搬家、經濟因素、或不合作、有不良反應等。受試者共20位，實馬全時間為30天。2.BRAP-01菌粉膠嚢製備取類乾酪乳桿菌BRAP-01冷凍管進行活化放大後，添加冷凍保護劑進行冷凍乾燥後，以系列稀釋方法檢測其菌數，菌數須達1.0xlO"CFU/g。菌粉製備符合規格後，將菌粉添加麥芽糊精作為賦形劑後充填膠嚢，使每顆膠嚢菌數大於5xl09CFU/g。3.研究設計本試驗自2007年2月19日開始至2007年4月16日結束。在高雄某診所進行實驗。受試者篩選期為期兩周，用來收集病患基本資料包括姓名、住址、年齡、過敏性鼻炎病程及鼻炎評分表，總共篩選20名具有過^:鼻炎的病患進行試-瞼。在第二次門診時(基準期)首先再確認病患資料，並填寫第一次鼻炎評分表，之後每日食用三顆膠嚢，30天後請受試者再填寫第二次鼻炎評分表，並依據受試者所填寫鼻炎評分結果進行分析。4.鼻炎評分表此表修改自Juniper等的小兒鼻結膜炎生活品質評分表(PediatricRhinoconjunctivitisQualityofLifeQuestionnaire,PRQLQ)[13]。這份簡易鼻炎評分表內容含6個過敏性鼻炎主要症狀(包含鼻塞、打噴噢、易流鼻水、鼻子癢、鼻弟倒流、揉眼睛及鼻子、擤鼻弟)，每個問題以5分定等級。在頻率方面，0分為沒有、1分為不常、2分為有時候、3分為常常、4分為每天；在困擾程度方面，0分為沒有、1分為不常、2分為有時候、3分為常常、4分為每天，受試者共填寫兩份問巻，每份問巻約可在10分鐘內完成。5.統^十方法14資料收集後，以免費試用版統計軟體SPSS10.0版(SPSSInc.Headquarters,233S.WackerDrive,11thfloor,Chicago,Illinois60606)進4亍資料分析，以Wilcoxon-符號等級檢定法(WilcoxonSignedRankTest)統計，分析後P值0.05具統計上顯著差異意義，主要評估依據是所有病患對簡易鼻炎評分表上每個項目的分數的平均，所有數據以平均士標準差(Mean士SEM)來表示，結果如表3所示。表3、人體試驗分析結果(受試人數N=20)試驗前(分數)試驗後(分數)P值頻率鼻塞2.60±0.221.90±0.160.002*打噴噢2.55±0.222.00±0.190.005*易流鼻水2.80±0.191.90±0.190.000*鼻子癢2.70±0.191.75±0.200.001*鼻弟倒流2.10±0.271.70±0.210.073揉眼睛及鼻子2.60±0.291.80±0.210.006*擤鼻涕2.20±0.281.30±0.180.003*總分17.55±0.4712.35士0.200.000*困擾鼻塞2.70±0.231.55±0.150細*程度打噴嚏2.35±0.211.40±0.180細*易流鼻水2.35±0.231.35±0.180.002*鼻子癢2.30±0.231.25±0.180.001*鼻弟倒流2.00±0.271.15±0.170.003*揉眼睛及鼻子1.90±0.300.95±0.200.003*擤鼻涕1.80±0.330,80±0.160.003*總分15.40±0.628.45±0.050駕*承P值〈0.016.結果受試者食用含有BRAP-01菌粉的膠嚢30天後，比較食用前後過敏性鼻炎相關症狀是否具有差異情形。由表3可知，就症狀發生頻率，在鼻塞、打噴嚏、易流鼻水、揉眼睛及鼻子及擤鼻涕等均具有統計上顯著差異(P值<0.01)。而在症狀困擾程度上，受試者在所有症狀上均有顯著差異，顯示受試者在食用含有BRAP-01菌粉的膠嚢30天後，每一症狀發生頻率及困擾程度15上均有明顯的改善(P值<0.01),且所有症狀發生頻率及困擾程度明顯下降，表示食用BRAP-01確實能使過敏性鼻炎患者除了降低症狀發生頻率之外，還具有改善生活品質的能力。所有的受試者均完成30天的實驗，在實驗期間內沒有嚴重不良的反應產生。雖然本發明已以優選實施例批露如上，然其並非用以限定本發明，任何本領域的技術人員，在不脫離本發明之精神和範圍內，可作一些更動與潤飾，因此本發明的保護範圍應以所附的權利要求所界定者為準。參考文獻1.Vassalli,P.Thepathophysiologyoftumornecrosisfactor,iev./畫畫/.1992;10:411-452.2.Mario,D.andDoina，G.InhibitionofIFN-y-InducedJanusKinase-1-STAT1activationinmacrophagesbyVasoactiveIntestinalPeptideandPituitaryAdenylateCyclase-ActivatingPolypeptide./Tmmwwo/.2000;165:3051-3057.3.HallerD,BodeC，HammesWP，PfeiferAM，SchiffrinEJ,BlumS:Non-pathogenicbacteriaelicitadifferentcytokineresponsebyintestinalepithelialcell/leucocyteco-culture.Gwf2000;47:79-87.4.IsolauriE,MajamaaH，ArvolaT，RantalanI，VirtanenE，ArvilommiH:丄actoZac/〃wscose/strainGGreversesincreasedintestinalpermeabilityinducedbycowmilkinsuckingrats.Ga欲oe她ro/ogy1993;105:1643-50.5.KalliomakiM,SalminenS,ArvilommiH，KeroP,KoskinenP,IsolauriE.Probiotcsinprimarypreventionofatopicdisease:arandomizedplacebo-controlledtrial.丄acwcW2001;357:1076-79.6.BlumS，AlvarezS，HallerD，PerezP，SchiffrinEJ:Intensinalmicrofloraandtheinteractionwithimmunocompetentcells.Jwtow'eJ7"""丄ee歴ew/zoeA:1999;67:199-205.7.OhmanL,IsakssonS，LundgrenA,SimrenM，SjovallH.Acontrolledstudyofcolonicimmuneactivityandbeta7+bloodTlymphocytesinpatientswithirritablebowelsyndrome.ClinGastrogenterolHepatol2005;3:980-6.8.ContractorNV，BassiriH,RpyaT,ParkAY，BaumgartDC，WasikMA,EmersonSG，CardingSR:Lymphoidhyperplasia,autoimmunity.Andcompromisedintestinalintraepitheliallymphocytedevelopmentincolits-freegnotobioticIL-2-deficientmice,c/7w腿wo/1998;160:385-394.9.DelnesteY，Donnet-HughesA，SchiffrinEJ:Functionalfoods:Mechanismofactiononimmuncompetentcells.A^riev1998;56:593-98.10.ArunachalamK，GillHS，ChandraRK:Enhancementofnaturalimmunefunctionbydietaryconsumptionof5i/c/o6"c/e〃'ww/ac^y(HN019).五wr/C7/wTVz^2000;54:1-5.11.KishiA，UnoK，MatsubaraY,OkudaC，KishidaT:Effectoftheoraladministrationof丄acfo6ac〃/ws6rev/ssubsp.Coagulansoninterferon-aproducingcapacityinhumans,C。〃淑r1996;15:408-412.12.SutasY,SoppiE，KorhonenH，SyvaojaEL，SaxelinM,RokkaT，IsolauriE.SuppressionoflymphocyteproliferationinvitrobybovinecaseinshydrolyzedwithLactobacilluscaseiGG-derivedenzyme.爿〃er^C7/w7m附柳o/1996;98:21613.JuniperEF,HowlandWC,RobertsNB,ThompsonAK,KingDR.Measuringqualityoflifeinchildrenwithrhinoconjunctivitis.JAllergyClinImmunolFebruary1998;Vol.101,No.2:163-170.序列表光晟生物科技股份有限公司<120〉WT抗過敏症狀的微生物株、其組合物與以此微生物株刺激細胞產生幹擾素-Y的方法<歸1<210〉1<211〉516<212〉DNA<213〉類乾酪乳桿菌(Aa"o/a"'^s/7aracase力1gctggcggcgtgctatacatgC33gtcga^cgagttctcgttgatgatcggtgcttgcac60cg3g3ttcaBC3tgg^LCgagtggcggacgggtgagt,cctgccctta1208gtgggggataac3tttggaaacagatgctaccgcatggt180tcttggctga,atggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctag240ttggtg鄉taatggctcacatacgtagccg咖tg卿ggttgatcggc300cacattgggactgagacacggcccaaactcCt3Cggg3ggg犯tcttcca360CMtgg3CgC犯gtCtg3tggagc犯cgcc8g犯ggCtttcgggtcgt朋420aactctgttg3tggtCggC3g3gt犯Ctgttgtcggcgtgacggtatcca480cacggctaactacgtgccagcagccg51618權利要求1.一種經分離的微生物株，命名為類乾酪乳桿菌BRAP-01，其保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2218。2.權利要求1所述的經分離的微生物抹，其篩選自人類嬰兒糞便檢體。3.—種用於抗過敏症狀的微生物林，包括權利要求1所述的微生物抹。4.權利要求3所述的用於抗過敏症狀的微生物抹，其中該微生物抹的形式為菌粉。5.權利要求4所述的用於抗過敏症狀的微生物抹，其中該菌粉是通過冷凍乾燥而得。6.權利要求3所述的用於抗過敏症狀的微生物抹，其中該過敏症狀包括氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、過敏性結膜炎、食物過敏、蕁麻疹及/或腸躁症。7.權利要求3所述的用於抗過敏症狀的微生物抹，其具有刺激人類外周血單核細胞產生幹擾素-Y的能力。8.權利要求3所述的用於抗過敏症狀的微生物株，其促進人類外周血單核細胞產生的幹擾素-Y為原來的約6-12倍。9.一種用於抗過敏症狀的組合物，包括有效量的權利要求3所述的微生物抹；以及賦形劑。10.權利要求9所述的用於抗過敏症狀的組合物，其中該微生物抹的形式為菌粉。11.權利要求IO所述的用於抗過敏症狀的組合物，其中該菌粉是通過冷凍乾燥而得。12.權利要求9所述的用於抗過敏症狀的組合物，其中該過敏症狀包括氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、過敏性結膜炎、食物過敏、蕁麻疹及/或腸躁症。13.權利要求9所述的用於抗過敏症狀的組合物，其具有刺激人類外周血單核細胞產生幹擾素-y之能力。14.權利要求9所述的用於抗過敏症狀的組合物，其促進人類外周血單核細胞所產生的幹擾素-Y為原來的約6-12倍。15.權利要求9所述的用於抗過敏症狀的組合物，其中該賦形劑包括乳糖、乾燥澱粉、澱粉糊、糊精、環糊精、預膠化澱粉、羧曱基澱粉鈉、羧基澱粉丙酸酯、微晶性纖維素、羧曱基纖維素或麥芽糊精。16.—種刺激細胞產生幹擾素-Y的方法，包括提供哺乳動物細胞；將該哺乳動物細胞與經熱處理的權利要求3所述的用於抗過敏症狀的微生物抹進行共培養。17.權利要求16所述的刺激細胞產生幹擾素-y的方法，其中該哺乳動物細胞包括人類外周血單核細胞。18.權利要求17所述的刺激細胞產生幹擾素-Y的方法，該方法促進該人類外周血單核細胞所產生的幹擾素-Y為原來的約6-12倍。全文摘要本發明包括一種經分離的微生物株，命名為類乾酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)BRAP-01，其具有抗過敏症狀的功能。本發明也包括一種用於抗過敏症狀的組合物，其包括有效量的上述微生物株；以及賦形劑。本發明還提供一種刺激細胞產生幹擾素-γ的方法，包括提供哺乳動物細胞；將該哺乳動物細胞與經熱處理的上述用於抗過敏症狀的微生物株進行共培養。文檔編號A61K35/66GK101503662SQ20081000487公開日2009年8月12日申請日期2008年2月5日優先權日2008年2月5日發明者李欣樺,王櫻諭,薛如婷,許清祥,賴訂穎申請人:光晟生物科技股份有限公司