一種多維離子色譜分析系統的製作方法

2023-10-11 23:27:04

專利名稱：一種多維離子色譜分析系統的製作方法
技術領域：
本發明屬於化學中的分析化學技術領域，可廣泛應用於生物能源研究、生命科學、食品科學、環境、石油化工等領域。
背景技術：
胺基酸和糖是生物生長的主要氮源和碳源，他們在細胞代謝中起著重要的生理作用。對這些代謝物同時準確高效的分離檢測對提高細胞體系能源組分的生產力工藝研究和代謝組學研究意義重大。在生命科學、食品科學、醫學、農學和其他研究領域中，有機酸、氨 基酸和糖、糖醇等相關組分的分析已經成為了一個熱點。傳統的高效液相色譜法(HPLC)檢測需衍生化，且試劑具有化學毒性，操作複雜；示差檢測器的靈敏度也有一定局限性。根據胺基酸和糖類化合物在強鹼性溶液中，都可電離出陰離子的特性，可以通過陰離子交換色譜分離。Clark首次報導了不需任何衍生反應，用積分脈衝安培法，陰離子交換色譜法分析胺基酸和糖的技術，這項技術相比於HPLC具有更高的選擇性和靈敏度。在糖的檢測中，電化學檢測器甚至能達到質譜檢測器的靈敏度。利用離子色譜安培法測定胺基酸，糖、乙二醇、糖醇的研究已經有很多報導JnPetr Jandik提出了用雙電位波形同時檢測胺基酸和糖；Valoran等研究了一個寬範圍的梯度洗脫程序用於胺基酸和糖的同時檢測等。然而由於濃度和組分性質等影響，利用一維的單柱離子色譜在極端的洗脫條件下，某些胺基酸和糖仍然存在共淋洗的問題，如蘇氨酸和葡萄糖、半乳糖；穀氨醯胺和木糖或果糖；纈氨酸和乳糖或異麥牙糖存在共淋洗，因此不可能準確同時對它們進行定量。由於一維的離子色譜的峰容量有限，特別是同時分離複雜的生物樣品中的水溶性代謝物如胺基酸、糖、醇、有機酸等存在很大困難。組分共淋洗的幹擾問題在高度複雜樣品的分析中普遍存在，因此同時準確測定這些水溶性代謝物是代謝物組學研究領域中的一大難題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題通過構建多維離子色譜分析系統，能夠解決複雜樣品的多種非極性物質如烴類，長鏈脂肪酸，蛋白，極性物質如有機酸、胺基酸、糖和醇等分子的分離度不足的難題。一種多維離子色譜分析系統，包括進樣器、進樣閥、定量環、泵、廢液瓶和由保護柱、分析柱、檢測器依次連接成的離子色譜分離分析系統，構成一維離子色譜分析系統，其中進樣閥上連接定量環、進樣器、泵、廢液瓶和保護柱，該系統還包括至少一個切換閥，連接在進樣閥和離子色譜分離分析系統之間，切換閥上連接色譜柱和/或定量環，色譜柱和定量環均連接一個泵，色譜柱和定量環均可通過切換閥切換而連接到相應的離子色譜分離分析系統或下一維連接有色譜柱和/或定量環的切換閥，構成多維離子色譜分析系統。所述色譜柱可以是陽離子交換色譜柱(陽離子捕集柱)、陰離子交換色譜柱(陰離子捕集柱)、離子排斥色譜柱、反相色譜柱等。所述離子色譜分離分析系統由保護柱、分析柱和檢測器依次連接而成。
所述的切換閥為色譜技術中常用的多通進樣切換閥，可以是六通閥、八通閥、十通閥等。所述的切換閥可以是一個，色譜柱和定量環分別連接在切換閥上，色譜柱和定量環均可通過切換閥切換而連接到相應的離子色譜分離分析系統。所述一個切換閥可以是十通閥，連接可以採取如圖2的方式，色譜柱連接在十通閥的位⑦和位④，定量環2連接在十通閥的位③和位⑩，十通閥的位⑧連接進樣閥，十通閥的位⑨連接廢液瓶，十通閥的位②和位⑤分別連接泵，位①和位⑥分別連接離子色譜分離分析系統。所述的切換閥可以是兩個，進樣閥與切換閥I連接，切換閥I與切換閥2連接，切換閥I上連接色譜柱和泵，切換閥2上連接定量環、泵和廢液瓶，切換閥I上的色譜柱和切換閥2上的定量環均可通過切換閥切換而分別連接到相應的離子色譜分離分析系統。
當切換閥為兩個時，可以採取如圖4的方式，為兩個六通閥，色譜柱連接在切換閥I的位④和位①，切換閥I的位⑤連接進樣閥，位⑥連接切換閥2，位③連接離子色譜分離分析系統，位②連接泵；定量環2連接在切換閥2的位④和位①，切換閥2的位⑤連接切換閥I，位⑥連接廢液瓶，位③連接離子色譜分離分析系統，位②連接泵。所述的切換閥可以是三個，進樣閥與切換閥I連接，切換閥I上連接色譜柱、定量環和泵，切換閥2與切換閥I連接，切換閥2上連接色譜柱和/或定量環和/或保護柱和泵，切換閥3與切換閥I或切換閥2連接，切換閥3上連接色譜柱和/或定量環和/或保護柱和泵，最末一級的色譜柱、定量環、保護柱均可通過切換閥切換而分別連接相應的離子色譜分離分析系統。所述最末一級的色譜柱、定量環、保護柱即後面未連接色譜柱、定量環、保護柱。所述保護柱具有樣品分離功能。所述三個切換閥的連接可以採取如圖12的方式，為一個十通閥和兩個六通閥，色譜柱連接在切換閥I的位⑦和位④，定量環2連接在切換閥I的位③和位⑩，切換閥I的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑧、位⑨分別連接切換閥2、泵3、泵2、離子色譜分離分析系統、進樣閥、廢液瓶，保護柱連接在切換閥2的位④和位①，切換閥2的位②、位③、位⑤、位⑥分別連接離子色譜分離分析系統、泵5、切換閥I、切換閥3，定量環3連接在切換閥3的位④和位①，切換閥3的位②、位③、位⑤、位⑥分別連接離子色譜分離分析系統、泵4、切換閥2、廢液瓶。所述三個切換閥的連接可以採取如圖13的方式，為兩個十通閥和一個六通閥，色譜柱I連接在切換閥I的位⑦和位④，定量環2連接在切換閥I的位③和位⑩，切換閥I的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑧、位⑨分別連接切換閥3、泵3、泵2、切換閥2、進樣閥、廢液瓶，定量環3連接在切換閥2的位④和位①，切換閥2的位②、位③、位⑤、位⑥分別連接離子色譜分離分析系統、泵4、切換閥I、檢測器，色譜柱2連接在切換閥3的位⑦和位④，定量環4連接在切換閥3的位③和位⑩，切換閥3的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑧、位⑨分別連接離子色譜分離分析系統、泵6、泵5、離子色譜分離分析系統、切換閥I、廢液瓶。利用本發明的多維離子色譜分析系統對樣品進行分析檢測的方法如下一種多維離子色譜分析系統的檢測方法，利用目標組分如非極性組分和極性組分，極性組分中有機酸、胺基酸、糖和醇在不同色譜柱上的分離機理不同和組分的保留時間差異，通過至少一個色譜柱切換富集和閥切換時間選擇，構建二維及二維以上離子色譜分析系統，實現樣品中各組分的同時分離分析。第一維離子色譜，非極性組分如烴類，長鏈脂肪酸，蛋白被保留在反相色譜柱上，極性組分胺基酸、有機酸、陽離子、糖和醇不被保留，被定量環2截留；第二維離子色譜，非極性組分被有機溶劑去除或進入分離柱分離後檢測，極性組分在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和有機酸不保留，被輸送到定量環4中；第三維離子色譜，胺基酸先被洗脫下來並被截留在定量環3中，糖和有機酸被淋洗液帶入陰離子捕集柱分離，糖先被洗脫，流入定量環5，有機酸則被保留在陰離子捕集柱；第四維離子色譜，胺基酸和陽離子分別被淋洗液從定量環3和陽離子捕集柱上洗脫下來，在相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測；第五維離子色譜，糖和有機酸分別被淋洗液從定量環5和陰離子捕集柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測。一種二維離子色譜分析系統的檢測方法，第一維離子色譜，胺基酸在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖被輸送到定量環2中；第二維離子色譜，胺基酸和糖分別被強 鹼性淋洗液洗脫到相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測。具體步驟如下(I)上樣(load)，自動進樣器將樣品裝滿定量環I ;(2)進樣(inject)，第一維的酸性淋洗液通過泵I將樣品從定量環I注入陽離子捕集柱，同時檢測器開始採集信號；胺基酸與陽離子捕集柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，糖則被酸性淋洗液洗脫下來，洗脫下來的糖被截留在定量環2中；(3)當糖被全部洗脫下來，切換閥從上樣狀態切換到進樣狀態，設切換閥從上樣狀態切換到進樣狀態的時間為h，即h為切換閥的切換時間；保留在陽離子捕集柱上的胺基酸被來自泵2的NaOH溶液洗脫，當胺基酸被全部洗下來，陽離子捕集柱裡的陽離子交換樹脂由氫型全部轉化為鈉型，設切換閥處於進樣狀態的停留時間為t2 ;被洗脫的胺基酸繼續在分析柱I上分離並在檢測器I上檢測；在此期間，來自泵3的NaOH溶液將截流在定量環2中的糖帶入分析柱2分離並在檢測器2上檢測；(4)胺基酸全部洗脫後，陽離子捕集柱中陽離子交換樹脂轉化為鈉型，此時，切換閥從進樣狀態切換到上樣狀態，陽離子捕集柱裡的陽離子交換樹脂逐漸轉化為氫型，陽離子捕集柱逐漸恢復到初始狀態，直到整個程序結束；設切換閥再次切換到上樣狀態到陽離子交換樹脂完全轉化為氫型的時間為t4 ；所述的等度的酸性溶液為甲酸、乙酸或鹽酸、硫酸、甲基磺酸，濃度為0. 3 IOmM ;所述的第一維淋洗液優選甲酸，濃度為3mM，流速為0. 05 0. 2ml/min ；所述L 為 0. 5 4min、t2 為 0. I lOmin、t3 為 0. 2 2min、t4 為 5 40min ；所述的tpt2、t3、t4的具體取值，本領域技術人員可以根據用於連接的微管的管長及管逕自行確定；所述來自泵2的NaOH溶液濃度為5. 5 75mM ；所述來自泵3的NaOH溶液濃度為7. 5 75mM ；三個泵的流速分別為泵I :0. 01 lml/min,泵2 :0. I 3ml/min,泵3 :0. I 3ml/min。一種三維離子色譜分析系統的檢測方法，第一維離子色譜，胺基酸在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和有機酸被輸送到定量環2中；第二維離子色譜，胺基酸被洗脫下來並進入分析柱和檢測器進行分離檢測；糖和有機酸被洗脫至保護柱上分離，糖與保護柱結合度弱，流入定量環3，有機酸則被保留在保護柱；第三維離子色譜，糖和有機酸分別被淋洗液從定量環3和保護柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測。具體步驟如下(I)上樣(load)，自動進樣器將樣品裝滿定量環I ;(2)進樣(inject)，第一維的酸性淋洗液通過泵I將樣品從定量環I注入陽離子捕集柱，同時檢測器開始採集信號；胺基酸與陽離子捕集柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，糖、有機酸則被酸性淋洗液洗脫下來，洗脫下來的糖和有機酸被截留在定量環2中；(3)當糖和有機酸被全部洗脫下來，切換閥I從load狀態切換到inject狀態，保留在陽離子捕集柱上的胺基酸被來自泵2的溶液洗脫，直至胺基酸被全部洗下來在胺基酸分析柱上分離並在檢測器I檢測。在此期間，來自泵3的淋洗液將截流在定量環2中的糖和有機酸帶入固定在切換閥2的保護柱ASll-HC Guard，糖的保留弱先流出，先流出的糖被切 換閥3的定量環3截留。來自泵4的淋洗液將截流在定量環3中的糖帶入糖分析柱分離並在檢測器2上檢測。在保護柱ASll-HC Guard強保留的有機酸被來自泵5的淋洗液洗脫，在有機酸分析柱上分離並在檢測器3上檢測。(4)待系統平衡後，回到初始狀態。一種四維離子色譜分析系統的檢測方法，第一維離子色譜，胺基酸和陽離子在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和醇被輸送到定量環3中；第二維離子色譜，胺基酸先被洗脫下來並被截留在定量環2中；第三維離子色譜，胺基酸和陽離子分別被淋洗液從定量環2和陽離子捕集柱上洗脫下來，在相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測，糖和醇被淋洗液帶入陰離子捕集柱分離，醇先被洗脫，流入定量環4，糖則被保留在陰離子捕集柱；第四維離子色譜，醇和糖分別被淋洗液從定量環4和陰離子捕集柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測。—種五維離子色譜分析系統的檢測方法，第一維離子色譜，非極性組分如烴類、長鏈脂肪酸和蛋白被保留在反相色譜柱上，極性組分胺基酸、有機酸、陽離子、糖和醇不被保留，被定量環2截留；第二維離子色譜，非極性組分被有機溶劑去除或進入分離柱分離後檢測，極性組分在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和有機酸不保留，被輸送到定量環4中；第三維離子色譜，胺基酸先被洗脫下來並被截留在定量環3中，糖和有機酸被淋洗液帶入陰離子捕集柱分離，糖先被洗脫，流入定量環5，有機酸則被保留在陰離子捕集柱；第四維離子色譜，胺基酸和陽離子分別被淋洗液從定量環3和陽離子捕集柱上洗脫下來，在相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測；第五維離子色譜，糖和有機酸分別被淋洗液從定量環5和陰離子捕集柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測。本發明的設計原理是採用多個切換閥、多個泵、多個色譜柱和多個檢測器構建一套多維離子分析系統。利用目標組分在色譜柱上的分離機理不同和組分的保留時間差異，通過不同色譜柱富集和閥切換時間選擇，實現複雜樣品的非極性組分如烴類、長鏈脂肪酸和蛋白及極性組分如有機酸、胺基酸、陽離子、糖、醇等的同時分離分析。例如在酸性條件下，複雜樣品通過陽離子交換色譜柱時，胺基酸等兩性離子可形成陽離子從而被陽離子交換色譜柱保留，然後進一步被洗脫並通過分析柱與檢測器進行分離檢測。有機酸、糖和醇類化合物(即碳水化合物，是非常弱的酸，因此在酸性條件下非常穩定，與陽離子交換樹脂相互作用很弱)等中性分子和陰離子則不被陽離子交換色譜柱保留，通過另一個定量環截留進入另一套分析柱和檢測器系統進行分析。即第一維利用陽離子交換色譜柱技術將樣品分成胺基酸等陽離子和糖、有機酸等中性分子及陰離子兩個相對獨立的部分，再分別在第二維用不同的分析柱和檢測器將它們分離和檢測，也可以在第二維將樣品分開而進入第三維進行更精確的分離檢測，樣品成分越複雜時，可以更進一步進行四維、五維至更多維的分離檢測。當基於不同的檢測樣品及色譜柱時，遵循同樣的原理。本發明的有益效果是採用多個切換閥、多個泵和多個離子色譜分離分析系統構建一套多維離子分析系統，可以靈活應用於各種複雜樣品的精確測定。當應用於複雜樣品如有機酸、胺基酸、糖和醇等組分的同時分析時，該方法快速、高效、精確度高，在保證組分較大回收率前提下，消除了組分之間的相互幹擾，確定了最佳的分離條件，可以實現了幾十種組分的同時準確定量。此方法應用於實際細胞培養液樣品的有機酸、胺基酸、糖和醇等組分的同時測定時，平均相對標準偏差小於3%，回收率80%-104%，表明了該技術用於生物樣品中代謝組分或其他研究領域的組分分析是可行的。對於細胞培養液、食品等複雜樣品中 胺基酸和糖和木糖酸的同時分析具有很大的實際意義。


圖I現有技術離子色譜分析系統示意2本發明二維離子色譜分析系統示意3本發明二維離子色譜分析系統運行時二維閥切換的程序4本發明實施例I裝置5本發明實施例I的閥切換的程序圖(實線代表管路相通，虛線代表管路不通)圖6現有技術分離胺基酸和糖標準品的色譜7本發明實施例I分離胺基酸和糖標準品的色譜8本發明實施例2裝置9本發明實施例2的閥切換的程序10現有技術分離含胺基酸和糖樣品的色譜11本發明實施例2分離含胺基酸和糖樣品的色譜12本發明實施例3裝置13本發明實施例4裝置6、7、10 和 11 中l_arginine 精氨酸，2-lysine 賴氨酸，3-asparagine 天冬醯胺，4-glutamine 穀氨醯胺，5-alanine 丙氨酸，6-threonine 蘇氨酸，7-glycine 甘氨酸，8-valine糹顏氨酸,9-serine絲氨酸,10-proline脯氨酸,11-isoleucine異亮氨酸，12-leucine 亮氨酸，13-methionine 蛋氨酸，14-histidine 組氨酸，15-phenylalanine苯丙氨酸，16-glutamic acid 穀氨酸，17-aspartic acid 天冬氨酸，18-cystine 半胱氨酸，19-tyrosine 酪氨酸，20-tryptophan 色氨酸，a-trehalose 海藻糖，b-arabinose阿拉伯糖，c-galactose 半乳糖，d-glucose 葡萄糖，e-mannose 甘露糖，f-fructose 果糖,g-ribose 核糖,h-lactose 乳糖,i_celIobiose 纖維二糖,j-panose 潘糖
具體實施例方式下面結合附圖及具體實施例來進一步說明本發明，但不限制本發明。實施例I儀器設置ICS-3000多功能色譜裝置，包括雙泵(DP)模塊、檢測器/色譜(DC)模塊、自動進樣器(AS)模塊(美國Dionex公司)。雙泵模塊中包含兩個分析型四元梯度泵(即圖4中的泵2和泵3)，檢測器/色譜模塊放置三個六通閥(第一個為進樣閥，後兩個為切換閥)、兩個定量環、CRC陽離子捕集柱(Dionex, 2. OX 15mm)、糖分析柱CarboPacPA20 (4 X 250mm, Dionex)和保護柱 CarboPac PA20Guard (4 X 50mm, Dionex)、胺基酸分析柱Amino Pac PAlO (2 X 250mm, Dionex)和保護柱 Amino Pac PAlOGuard (2 X 50mm, Dionex)、兩個電化學檢測器。溫度均設為30°C，安培檢測器用金工作電極，pH-Ag/AgCl複合參比電極，鈦對電極。P230高壓恆流泵(即圖4中的泵I，大連伊利特儀器公司)(參見圖4)。定量環I固定在進樣閥的位①和位④，進樣閥I的位⑤和位⑥分別連接進樣器和 廢液瓶，位②與泵I連接。CRC陽離子捕集柱固定在切換閥I上，出口和進口分別連在切換閥I的位①和位④。200ul的定量環2連接在切換閥2的位①和位④，位⑤和位⑥分別與切換閥2的進樣口和廢液瓶連接。胺基酸和糖分析柱分別連接在切換閥I的位③和切換閥2的位③。泵2連接在切換閥2的位②，泵3連接在切換閥2的位②。連接管線的長度和尺寸分別為管線I (Tl):13. 7mm(連接在進樣閥位③和切換閥I位⑤)，管線2 (T2):5. 5mm(連接CRC陽離子捕集柱進口和切換閥I位④)，管線3 (T3) :5. 5mm(連接CRC陽離子捕集柱出口和切換閥位①)，管線4 (T4) :39. 4mm(連接切換閥I位⑥和切換閥2位⑤)，上述管線的內徑為0. 127mm，實驗中的其他管路的內徑為0. 254mm (參見圖4，閥切換參見圖5)。儀器連接完成後，運行二維程序實現胺基酸和糖的分組洗脫和分析分析的樣品為含20種胺基酸標準品和10種糖標準品的混合液。(I)上樣(load)，自動進樣器將樣品裝滿定量環I ;0. 3mM甲酸溶液平衡CRC陽離子捕集柱，以NaOH溶液的梯度初始濃度分別平衡分析柱I和分析柱2。(2)進樣(inject),第一維的酸性淋洗液3mM甲酸通過泵I以0. 15ml/min的流速將樣品從定量環I注入CRC陽離子捕集柱，同時檢測器開始採集信號。胺基酸與CRC陽離子捕集柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，糖則被酸性淋洗液洗脫下來，同時切換閥I執行load程序。洗脫下來的糖被截留在定量環2中。(3)當糖被全部洗脫下來，切換閥I從load狀態切換到inject狀態，切換閥I從load狀態切換到inject狀態的時間即切換閥I的切換時間L為I. lmin。保留在CRC陽離子捕集柱上的胺基酸被來自泵2的NaOH溶液洗脫，當胺基酸被全部洗下來，CRC陽離子捕集柱裡的陽離子交換樹脂由氫型全部轉化為鈉型。切換閥I處於inject狀態的停留時間t2為10. Omin。被洗脫的胺基酸繼續在胺基酸分析柱即上分離並在檢測器I上檢測。在此期間，切換閥2由load狀態切換到inject狀態，切換閥2的切換時間t3為0. 9min。來自泵3的NaOH溶液將截流在定量環2中的糖帶入糖分析柱分離並在檢測器2上檢測。(4)胺基酸全部洗脫後，CRC陽離子捕集柱中陽離子交換樹脂轉化為鈉型，此時，切換閥I從inject狀態切換到load狀態，CRC陽離子捕集柱裡的陽離子交換樹脂逐漸轉化為氫型，CRC陽離子捕集柱逐漸恢復到初始狀態，直到整個程序結束。切換閥I再次切換到load狀態到陽離子交換樹脂完全轉化為氫型的時間t4為30min。
本實施例中所有未提及的設置及相關參數均為本領域技術人員的公知技術。分離同樣的20種胺基酸和10種糖標準品，採用現有技術和本發明實施例I的色譜圖比較採用如圖I所示現有技術，即一維色譜分析，選用的分析柱為胺基酸分析柱AminoPacPAlO。由圖6可知,含有胺基酸和糖標準品的樣品,b-arabinose阿拉伯糖、c-galactose半乳糖、d-glucose葡萄糖、e-mannose甘露糖，和4-glutamine穀氨醯胺、5-alanine丙氨酸、6-threonine蘇氨酸，存在嚴重的共淋洗的問題。採用本發明實施例I的二維色譜分析方法，胺基酸和糖經過分離，在第二維的分析柱上分離的色譜圖如圖7所示，所有的胺基酸和糖都得到了很好的分離，互相不存在幹擾，分離度得到顯著提高。實施例2儀器設置ICS-3000多功能色譜裝置，包括雙泵(DP)模塊、檢測器/色譜(DC)模塊、自動進樣器(AS)模塊(美國Dionex公司)。雙泵模塊中包含兩個分析型四元梯 度泵(即圖8中的泵2和泵3)，檢測器/色譜模塊放置一個六通閥(進樣閥)、一個十通閥(切換閥)、兩個定量環、陽離子交換分析柱(定做，2. IX 150mm)、糖分析柱CarboPacPA20 (4 X 250mm, Dionex)和保護柱 CarboPac PA20Guard (4 X 50mm, Dionex)、電化學檢測器。溫度均設為30°C，安培檢測器用金工作電極，pH-Ag/AgCl複合參比電極，鈦對電極。P230高壓恆流泵(即圖8中的泵1，大連伊利特儀器公司)(參見圖8)。定量環I固定在進樣閥的位①和位④，進樣閥的位⑤和位⑥分別連接進樣器和廢液瓶，位③與泵I連接。陽離子交換分析柱固定在切換閥上，出口和進口分別連在切換閥的位④和位⑦。200ul的定量環2連接在切換閥的位③和位⑩。糖分析柱連接在切換閥的位①。泵2和泵3分別連接在十通閥的位⑤和位②(參見圖8，閥切換參見圖9)。儀器連接完成後，運行二維程序實現胺基酸和糖的分組洗脫和分析 分析的樣品為含20種胺基酸標準品和10種糖標準品的混合液。(I)上樣(load)，自動進樣器將樣品裝滿定量環I。平衡陽離子交換分析柱和糖分析柱。(2)進樣(inject),第一維的酸性淋洗液3mM甲酸通過泵I以0. 15ml/min的流速將樣品從定量環I注入陽離子交換分析柱，同時檢測器開始採集信號。胺基酸與陽離子交換分析柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，糖則被酸性淋洗液洗脫下來，同時切換閥執行load程序。洗脫下來的糖被截留在定量環2中。(3)當糖被全部洗脫下來，切換閥從load狀態切換到inject狀態，切換閥的切換時間h為I. lmin。保留在陽離子交換分析柱上的胺基酸被來自泵2的溶液洗脫，直到胺基酸被全部洗下來。切換閥處於inject狀態的停留時間t2為10. Omin。來自泵3的NaOH溶液將截流在定量環2中的糖帶入糖分析柱分離並在檢測器2上檢測。本實施例中所有未提及的設置及相關參數均為本領域技術人員的公知技術。分離同樣的20種胺基酸標準品和10種糖標準品的混合液，現有技術和本發明實施例2的色譜圖比較採用如圖I所示現有技術，即一維色譜分析，選用的分析柱為糖分析柱CarboPacPA20。由圖10可知，採用現有技術，胺基酸和糖標準品的混合物僅在糖分析柱CarboPacPA20上分離，蘇氨酸和絲氨酸在糖的電位波形下也有很高的響應，在分析糖類化合物的過程中容易造成幹擾，而給出假陽性結論。利用本發明實施例2的二維色譜分析方法分離相同樣品，如圖11所示，無胺基酸的假陽性幹擾，糖得到很好的分離。實施例3儀器設置ICS-3000多功能色譜裝置，包括雙泵(DP)模塊、檢測器/色譜(DC)模塊、自動進樣器(AS)模塊(美國Dionex公司)。雙泵模塊中包含四個分析型四元梯度泵(即圖12中的泵2、3、4和5)，檢測器/色譜模塊放置3個六通閥、I個十通閥、3個定量環、陽離子捕集柱、糖分析柱CarboPac PA20 (4X 250mm, Dionex)和保護柱CarboPacPA20Guard (4 X 50mm, Dionex)、胺基酸分析柱 Amino Pac PAlO (2 X 250mm, Dionex)和保護柱Amino Pac PAlOGuard (2 X 50mm, Dionex)、有機酸分析柱 ASl 1-HC (4 X 250mm, Dionex)和保護柱ASll-HC Guard(4X 50mm, Dionex)、三個電化學檢測器。溫度均設為30°C，安培檢測器用金工作電極，pH-Ag/AgCl複合參比電極，鈦對電極。P230高壓恆流泵(即圖12中的泵 1，大連伊利特儀器公司)(參見圖12)。色譜柱連接在切換閥I的位⑦和位④，定量環2連接在切換閥I的位③和位⑩，切換閥I的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑧、位⑨分別連接切換閥2、泵3、泵2、離子色譜分離分析系統、進樣閥、廢液瓶，保護柱連接在切換閥2的位④和位①，切換閥2的位②、位③、位⑤、位⑥分別連接離子色譜分離分析系統、泵5、切換閥I、切換閥3，定量環3連接在切換閥3的位④和位①，切換閥3的位②、位③、位⑤、位⑥分別連接離子色譜分離分析系統、泵4、切換閥2、廢液瓶。儀器按照圖12連接完成後，運行切換程序實現混合物的洗脫和分析本實施例3主要用於樣品中的胺基酸、糖和有機酸類化合物的同時分離測定。(I)上樣(load)，自動進樣器將樣品裝滿定量環I。平衡陽離子捕集柱、胺基酸分析柱、糖分析柱和有機酸分析柱。(2)進樣(inject),第一維的酸性淋洗液3mM甲酸通過泵I以0. 05ml/min的流速將樣品從定量環I注入陽離子捕集柱，同時檢測器開始採集信號。胺基酸與陽離子捕集柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，糖和有機酸則被淋洗液洗脫下來，同時切換閥I執行load程序。洗脫下來的糖和有機酸被截留在定量環2中。(3)當糖和有機酸被全部洗脫下來，切換閥I從load狀態切換到inject狀態，保留在陽離子捕集柱上的胺基酸被來自泵2的溶液洗脫，直至胺基酸被全部洗下來在胺基酸分析柱上分離並在檢測器I檢測。在此期間，來自泵3的淋洗液將截流在定量環2中的糖和有機酸帶入固定在切換閥2的保護柱ASll-HC Guard，糖的保留弱先流出，先流出的糖被切換閥3的定量環3截留。來自泵4的淋洗液將截流在定量環3中的糖帶入糖分析柱分離並在檢測器2上檢測。在保護柱ASll-HC Guard強保留的有機酸被來自泵5的淋洗液洗脫，在有機酸分析柱上分離並在檢測器3上檢測。(4)待系統平衡後，回到初始狀態。本實施例中所有未提及的設置及相關參數均為本領域技術人員的公知技術。用本發明實施例3的三維色譜分析方法在同時分析胺基酸、糖和有機酸時分離效果顯著優於現有技術一維色譜分析方法。實施例4儀器設置ICS-3000和5000多功能色譜裝置，包括雙泵(DP)模塊、檢測器/色譜(DC)模塊、自動進樣器(AS)模塊(美國Dionex公司)。共配置9個梯度泵，I個進樣閥(六通閥)，4個切換閥(十通閥)，5個定量環，2個陽離子捕集柱、2個陰離子捕集柱、陽離子分析柱、陰離子分析柱、糖分析柱和保護柱、醇分析柱和保護柱、胺基酸分析柱和保護柱。3個電化學檢測器和2個電導檢測器。溫度均設為30°C。(參見圖13)。陽離子捕集柱I連接在切換閥I的位⑦和位④，定量環2連接在切換閥I的位③和位⑩，切換閥I的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑧、位⑨分別連接切換閥3、泵3、泵2、切換閥
2、進樣閥、廢液瓶，定量環3連接在切換閥2的位③和位⑩，陽離子捕集柱2連接在切換閥2的位⑦和位④，切換閥2的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑨分別連接胺基酸離子色譜分離分析系統、泵5、泵4、陽離子離子色譜分離分析系統、廢液瓶。定量環4連接在切換閥3的位③和位⑩，陰離子捕集柱I連接在切換閥3的位⑦和位④，切換閥3的位①、位②、位⑤、位⑥、位⑨分別連接切換閥4、泵7、泵6、有機酸離子色譜分離分析系統、廢液瓶。定量環5連接在切換閥4的位③和位⑩，陰離子捕集柱2連接在切換閥4的位⑦和位④，切換閥4的位①、 位②、位⑤、位⑥、位⑨分別連接醇離子色譜分離分析系統、泵9、泵8、糖離子色譜分離分析系統、廢液瓶。儀器按照圖13連接完成後，運行相應的切換程序實現混合物的洗脫和分析本實施例中所有未提及的設置及相關參數均為本領域技術人員的公知技術。本實施例4主要用於樣品中的胺基酸、陽離子、有機酸、糖和醇類化合物的同時分離測定。(I)上樣(load)，自動進樣器將樣品裝滿定量環I。(2)進樣(inject),第一維的酸性淋洗液3mM甲酸通過泵I以0. 15ml/min的流速將樣品從定量環I注入陽離子捕集柱1，同時檢測器開始採集信號。胺基酸和陽離子與捕集柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，有機酸、糖和醇則被淋洗液洗脫下來，同時切換閥
I執行load程序。洗脫下來的有機酸、糖和醇被截留在定量環2中。(3)當有機酸、糖和醇被全部洗脫下來，切換閥I從load狀態切換到inject狀態，保留在陽離子捕集柱I上的胺基酸先被洗脫下來並被截留在定量環3中後，陽離子被保留在陽離子捕集柱2上。切換閥2切換，胺基酸和陽離子分別被帶入色譜柱分離檢測。(4)有機酸、糖和醇被淋洗液從定量環2帶入陰離子捕集柱I分離，醇和糖先被洗脫，流入定量環4，有機酸則被保留在陰離子捕集柱I ;切換閥3切換，有機酸被淋洗液從陰離子捕集柱I上洗脫下來，在相應的分析柱上分離，電導檢測器檢測。(5)糖和醇被帶入陰離子捕集柱2，醇先被洗脫，被定量環5截留。當醇被完全截留，切換閥4切換，醇和糖分別被淋洗液從定量環5和陰離子捕集柱2上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測。(6)待系統平衡後，回到初始狀態。用本發明實施例4的四維色譜分析方法在同時分析胺基酸、陽離子、糖和醇時分離效果顯著優於現有技術一維色譜分析方法。
權利要求
1.一種多維離子色譜分析系統，包括進樣器、進樣閥、定量環、泵、廢液瓶和由保護柱、分析柱、檢測器依次連接成的離子色譜分離分析系統，構成一維離子色譜分析系統，其中進樣閥上連接定量環、進樣器、泵、廢液瓶和保護柱，其特徵在於還包括至少一個切換閥，連接在進樣閥和離子色譜分離分析系統之間，切換閥上連接色譜柱和/或定量環，色譜柱和定量環均連接一個泵，色譜柱和定量環均可通過切換閥切換而連接到相應的離子色譜分離分析系統或下一維連接有色譜柱和/或定量環的切換閥，構成多維離子色譜分析系統。
2.根據權利要求I所述的多維離子色譜分析系統，其特徵在於所述的切換閥是一個，色譜柱和定量環分別連接在切換閥上，色譜柱和定量環均可通過切換閥切換而連接到相應的離子色譜分離分析系統。
3.根據權利要求I所述的多維離子色譜分析系統，其特徵在於所述的切換閥是兩個，進樣閥與切換閥I連接，切換閥I與切換閥2連接，切換閥I上連接色譜柱和泵，切換閥2上連接定量環、泵和廢液瓶，切換閥I上的色譜柱和切換閥2上的定量環均可通過切換閥切換而分別連接到相應的離子色譜分離分析系統。
4.根據權利要求I所述的多維離子色譜分析系統，其特徵在於所述的切換閥是三個，進樣閥與切換閥I連接，切換閥I上連接色譜柱、定量環和泵，切換閥2與切換閥I連接，切換閥2上連接色譜柱和/或定量環和/或保護柱和泵，切換閥3與切換閥I或切換閥2連接，切換閥3上連接色譜柱和/或定量環和/或保護柱和泵，最末一級的色譜柱、定量環、保護柱均可通過切換閥切換而分別連接相應的離子色譜分離分析系統。
5.根據權利要求I所述的多維離子色譜分析系統，其特徵在於所述的切換閥是四個，進樣閥與切換閥I連接，切換閥I上連接色譜柱、定量環和泵，切換閥2與切換閥I連接，切換閥2上連接色譜柱、定量環和泵，切換閥3與切換閥I連接，切換閥3上連接色譜柱、定量環和泵，切換閥4與切換閥3連接，切換閥4上連接色譜柱、定量環和泵，最末一級的色譜柱、定量環、保護柱均可通過切換閥切換而分別連接相應的離子色譜分離分析系統。
6.一種權利要求1-5任一項所述多維離子色譜分析系統的檢測方法，其特徵在於利用目標組分如非極性組分和極性組分，極性組分中有機酸、胺基酸、糖和醇在不同色譜柱上的分離機理不同和組分的保留時間差異，通過至少一個色譜柱切換富集和閥切換時間選擇，構建二維及二維以上離子色譜分析系統，實現樣品中各組分的同時分離分析。
7.根據權利要求6所述多維離子色譜分析系統的檢測方法，其特徵在於為二維離子色譜分析系統檢測方法，第一維離子色譜，胺基酸在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖被輸送到定量環2中；第二維離子色譜，胺基酸和糖分別被NaOH強鹼性淋洗液洗脫到相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測；具體步驟如下 (1)上樣，自動進樣器將樣品裝滿定量環I; (2)進樣，第一維的酸性淋洗液通過泵I將樣品從定量環I注入陽離子捕集柱，同時檢測器開始採集信號；胺基酸與陽離子捕集柱中的陽離子交換樹脂結合保留在內，糖則被酸性淋洗液洗脫下來，洗脫下來的糖被截留在定量環2中； (3)當糖被全部洗脫下來，切換閥從上樣狀態切換到進樣狀態，設切換閥從上樣狀態切換到進樣狀態的時間為h，即h為切換閥的切換時間；保留在陽離子捕集柱上的胺基酸被來自泵2的NaOH溶液洗脫，當胺基酸被全部洗下來，陽離子捕集柱裡的陽離子交換樹脂由氫型全部轉化為鈉型，設切換閥處於進樣狀態的停留時間為t2 ;被洗脫的胺基酸繼續在分析柱I上分離並在檢測器I上檢測；在此期間，來自泵3的NaOH溶液將截流在定量環2中的糖帶入分析柱2分離並在檢測器2上檢測； (4)胺基酸全部洗脫後，陽離子捕集柱中陽離子交換樹脂轉化為鈉型，此時，切換閥從進樣狀態切換到上樣狀態，陽離子捕集柱裡的陽離子交換樹脂逐漸轉化為氫型，陽離子捕集柱逐漸恢復到初始狀態，直到整個程序結束；設切換閥再次切換到上樣狀態到陽離子交換樹脂完全轉化為氫型的時間為t4 ； 所述的等度的酸性溶液為甲酸、乙酸或鹽酸、硫酸、甲基磺酸，濃度為O. 3 IOmM ; 所述的第一維淋洗液優選甲酸，濃度為3mM,流速為O. 05 O. 2ml/min ； 所述 h 為 O. 5 4min、t2 為 O. I IOmin 、t3 為 O. 2 2min、t4 為 5 40min ；所述來自泵2的NaOH溶液濃度為5. 5 75mM ； 所述來自泵3的NaOH溶液濃度為7. 5 75mM ； 三個泵的流速分別為泵I 0. 01 lml/min,泵2 :0. I 3ml/min,泵3 :0. I 3ml/mirio
8.根據權利要求6所述多維離子色譜分析系統的檢測方法，其特徵在於為三維離子色譜分析系統檢測方法，第一維離子色譜，胺基酸在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和有機酸被輸送到定量環2中；第二維離子色譜，胺基酸被洗脫下來並進入分析柱和檢測器進行分離檢測；糖和有機酸被洗脫至保護柱上分離，糖與保護柱結合度弱，流入定量環3，有機酸則被保留在保護柱；第三維離子色譜，糖和有機酸分別被淋洗液從定量環3和保護柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測。
9.根據權利要求6所述多維離子色譜分析系統的檢測方法，其特徵在於為四維離子色譜分析系統檢測方法，第一維離子色譜，胺基酸和陽離子在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和醇被輸送到定量環3中；第二維離子色譜，胺基酸先被洗脫下來並被截留在定量環2中；第三維離子色譜，胺基酸和陽離子分別被淋洗液從定量環2和陽離子捕集柱上洗脫下來，在相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測，糖和醇被淋洗液帶入陰離子捕集柱分離，醇先被洗脫，流入定量環4，糖則被保留在陰離子捕集柱；第四維離子色譜，醇和糖分別被淋洗液從定量環4和陰離子捕集柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器檢測。
10.根據權利要求6所述多維離子色譜分析系統的檢測方法，其特徵在於為五維離子色譜分析系統檢測方法，第一維離子色譜，非極性組分如烴類、長鏈脂肪酸和蛋白被保留在反相色譜柱上，極性組分胺基酸、有機酸、陽離子、糖和醇不被保留，被定量環2截留；第二維離子色譜，非極性組分被有機溶劑去除或進入分離柱分離後檢測，極性組分在酸性溶液中被保留在陽離子捕集柱上，糖和有機酸不保留，被輸送到定量環4中；第三維離子色譜，胺基酸先被洗脫下來並被截留在定量環3中，糖和有機酸被淋洗液帶入陰離子捕集柱分離，糖先被洗脫，流入定量環5，有機酸則被保留在陰離子捕集柱；第四維離子色譜，胺基酸和陽離子分別被淋洗液從定量環3和陽離子捕集柱上洗脫下來，在相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測；第五維離子色譜，糖和有機酸分別被淋洗液從定量環5和陰離子捕集柱上洗脫下來，進入相應的分析柱上分離，分別用電化學檢測器和電導檢測器檢測。
全文摘要
本發明涉及一種多維離子色譜分析系統，屬於分析化學領域。為解決目前色譜技術對複雜樣品中的多種有機酸、胺基酸、糖和醇等分子的分離度不足的難題，開發了一套多維離子色譜分析系統，該系統包括多個泵、一個或多個切換閥和多個檢測器。利用目標組分在色譜柱上的分離機理不同和組分的保留時間差異，通過多個色譜柱切換富集和閥切換時間選擇，根據分離目標組分的不同，可構建包括二維、三維、四維、五維及以上離子色譜連接系統，實現複雜樣品的水溶性代謝物如有機酸、胺基酸、糖、醇等的同時分離分析。本發明的多維離子色譜分析系統能夠對複雜樣品進行快速、高效、精確的分離鑑定,消除了組分之間的相互幹擾。
文檔編號G01N30/88GK102967681SQ20121048881
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日
發明者法芸, 高峻, 楊海燕, 杜鵑, 鄭嶽 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所