一種水稻抗白葉枯抗性相關基因、蛋白及其用途的製作方法

2024-03-26 06:19:05 1

專利名稱：一種水稻抗白葉枯抗性相關基因、蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種水稻抗白葉枯抗性相關基因、蛋白及其用途。
背景技術：
在真核生物結構基因轉錄過程中，斷裂基因的內含子與外顯子總是同時被轉錄成為一個很大的mRNA前體(pre-mRNA)分子，再經過不同剪接方式，得到不同的成熟mRNA分子，並翻譯為不同的蛋白質。已有研究表明，幾乎在所有的原生動物組織中通過單個基因的剪接而產生多樣性的功能蛋白是一種極普遍的現象(Lopes et al，Annu.Rev.Genet.1998，32279-305)；這說明在很多基因中，一個基因可以編碼多種蛋白質。如果蠅的DSCAM基因(與神經發育有關)能產生38016種不同的蛋白質(Douglas L.B.et al，Cell.2000，103367-370)。mRNA水平上的不同剪接方式是產生生物多樣性的一種重要且非常經濟的方式。剪接不單能去除內含子，還可以根據不同的組織需要和/或機體發育調節採用不同剪接方式產生不同的蛋白質。
在真核生物的不同組織裡，來自同一基因的轉錄產物經歷著不同的轉錄和RNA加工，從而出現各種剪接方式。在同一條pre-mRNA上進行、並形成成熟mRNA的剪接反應稱為順式剪接(cis splicing)；若把處在2條甚至3條pre-mRNA上的外顯子，剪接成為一條成熟的mRNA，稱為反式剪接(trans splicing)。前體mRNA中的多個內含子被有序地逐一切除後，各外顯子連接為一個成熟mRNA的現象稱為組成型剪接(constitutive splicing)。若同一個基因的前體mRNA中某個內含子5』端供點又可在特定條件下與另一個內含子的3』端受點進行剪接，從而刪除這兩個內含子及其中間的全部外顯子和內含子。這樣，一個前體mRNA就可因剪接方式不同產生多種mRNA，轉譯出多個同I型(isoform)蛋白質，這樣的剪接方式稱為交替剪接(alternative splicing)。交替剪接形成的各個同I型蛋白質既具有相同的同源結構或功能域，又有特異性質的差別。因此，交替剪接是一種重要的調節手段，在不同發育階段、不同組織或細胞分化以及不同生理狀態下對基因表達進行調控，使得一個基因所攜帶的遺傳信息在轉錄後有所擴展。
由於交替剪接的多樣化與基因的開與關密切相關，而且一個基因在轉錄後通過複雜的mRNA前體的剪接加工產生兩個或多個蛋白質，因而這是一種既特殊又重要的基因調控方式。
在植物中，對pre-mRNA剪接的研究還比較膚淺。雖然發現交替剪接事例的數量呈上升趨勢，但對其生物學功能尚不清楚(Simpson，G.G.and Filipowicz，W.Plant Mol.Biol.32，1996，1-41；Brown，J.W.S.and Simpson，C.G.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49，1998，77-95)。如異源內含子在轉化後的植物細胞中通常不能進行加工；高等植物的RNA剪接對植物細胞生物學和病理學可產生多方面的影響，像玉米中由於轉座子剪接產生突變表型(Luehrsen K R et al，Prog Nucl Acid Res Mol Biol.1994，47149-193)；大麥通過內含子複製產生突變表型(Muller K J.等1995)；剪接甚至對一些植物病原體的致病性也產生影響(Magrelli A.et al.Science.1994，2661986-1988)；利用pre-mRNA的剪接來優化轉基因表達；某些內含子會使轉基因株中基因的表達豐度驟然增加(Luehrsen K R，et al.，Prog Nucl Acid Res Mol Biol.1994，47149-193；Zdravko J.L.，Dominika A.W.，et al.trends in plant science.2000，4160-167)等等。因此通過對植物內含子剪接的研究對了解植物基因表達、植物生理及病理、轉基因策略等具有十分重要的意義。
通過用白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)處理水稻抗病品種(IR26)和感病品種(金剛30)愈傷組織，利用植物已知受體蛋白激酶保守區基序(motif)設計簡併引物，運用mRNA差別顯示技術分析其表達特徵，獲得三個大小分別為743bp、680bp、650bp的cDNA片段。三個片段同源性約70～80％，且兩端序列一致，中間一段約300bp各不相同。Northern印跡雜交實驗證實三個片段的表達受白葉枯菌的誘導；Southern印跡雜交實驗證實該基因來源於水稻基因組且以單拷貝形式存在。又應用M-EST陣列、cDNA末端快速擴增(RACE)和RT-PCR等方法最終獲得了RIX-4基因的全長序列並命名，且確定了該基因的完整開放讀碼框架(ORF)，同時獲得了另一個大小為900bp的RIX-4基因的轉錄本。運用中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體的親本為材料，對RIX-4基因進行RFLP進行多態性分析，發現RIX-4基因在親本中以1～2拷貝存在，位於第八號染色體著絲粒附近，且在兩個重組自交系群體的一個公共標記RM210B附近。
如上所述的RIX-4基因及其交替剪接產生的轉錄本經Northern印跡雜交驗證在抗性水稻品系中的誘導表達明顯強於感病品系中的表達，說明這些cDNA片段與水稻抗白葉枯病緊密相關；在水稻基因組中以單拷貝的形式存在。獲得了一個新的RIX-4基因的轉錄本對研究確定RIX-4基因的交替剪接的作用機理、信號轉導、抗病性等方面提供了基礎，因此分離該基因和其多個轉錄本具有非常重要的意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供分離的水稻抗白葉枯抗性相關基因。
本發明的另一個目的是提供RIX-4基因編碼的水稻抗白葉枯抗性相關基因多肽。
本發明的另一個目的是提供含有編碼RIX-4基因的用途。
本發明的另一個目的是提供含有編碼RIX-4基因的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供含有編碼RIX-4基因的多核苷酸的重組載體。
本發明的另一個目的是提供了一種探針分子。
一種分離出的水稻抗白葉枯抗性相關基因是運用重組載體和基因工程化宿主細胞，通過應用模塊表達序列標籤陣列、互補脫氧核糖核酸末端快速擴增、聚合酶鏈式反應和反轉錄聚合酶鏈式反應、分子雜交方法獲得的、存在交替剪接現象的、且已於染色體上定位的具有SEQID No.1所示的多核苷酸序列。
所說的已於染色體上定位，是水稻抗白葉枯抗性相關基因定位於第八號染色體著絲粒附近，且定位在中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體親本的一個公共標記RM210B附近。
水稻抗白葉枯抗性相關基因存在交替剪接現象，是指水稻抗白葉枯抗性相關基因通過轉錄產生具有SEQ ID No.2～4所示的序列的多核苷酸序列，並且具有SEQ ID No.5～7所示的開放讀碼框多核苷酸序列。
一種分離的水稻抗白葉枯抗性相關基因的多肽具有SEQ ID No.8～9胺基酸序列的多肽、其保守性變體、或其生物活性片段，或其活性類似物、或其活性衍生物。
一種重組載體含有權利要求1所述的水稻抗白葉枯抗性相關基因，它包括細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒。
一種基因工程化宿主細胞是用權利要求5所述的重組載體轉化的基因工程化宿主細胞，它包括原核細胞、低等真核細胞、高等真核細胞。
一種探針分子，它含有權利要求1或2所述的水稻抗白葉枯抗性相關基因的多核苷酸序列分子中8～100個連續核苷酸的序列。
所說的多核苷酸序列包括SEQ ID No.1～7所示的序列、其互補序列、多核苷酸序列變體、抑制水稻抗白葉枯抗性相關基因信使核糖核酸的寡核苷酸以及核酶。
多核苷酸序列變體是指一種或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。
一種分離出的水稻抗白葉枯抗性相關基因的用途是用於水稻抵禦白葉枯菌的侵襲。
本發明的優點是1)利用本發明分離的水稻抗白葉枯抗性相關基因而培育出的水稻可以抵禦白葉枯菌的侵襲，從而在農業領域加以推廣，進而減少過度使用農藥而造成對環境的危害。2)利用本發明分離的水稻抗白葉枯抗性相關基因多肽、或其保守性變體、或其生物活性片段、或其衍生物，進行單克隆抗體或多克隆抗體的製備，可以廣泛運用於分子生物學領域。例如，運用免疫組織化學對目的基因進行細胞定位，運用western blot對目的基因進行確認，另外，還可以運用所獲得的抗體進行蛋白晶片的製備，也可以用獲得的抗體作為抗原進行二級免疫，獲得二級抗體。3)本發明的多核苷酸和/或多肽可作為探針分子，用於診斷抗病和/或感病或其他由於RIX-4表達異常所引起的抗病性或感病性。


圖1.pCAMBIA-RIX4正義和反義植物表達載體的構建圖譜；圖2.轉化農桿菌後pCAMBIA-RIX4正義和反義質粒的EcoR I酶切鑑定圖譜，圖中左起第一泳道為標記分子，第二和第四泳道分別為未酶切的正義和反義的pCAMBIA-RIX4表達載體，第三和第五泳道分別為EcoR I酶切的正義和反義的pCAMBIA-RIX4表達載體；圖3.轉RIX4基因後所得到的正義和反義轉基因植株圖譜，圖中左邊為正義轉基因植株，右邊為反義轉基因植株；圖4.轉化農桿菌後pCAMBIA-RIX4正義和反義植株的EcoR I酶切鑑定圖譜，圖中左起第一泳道為標記分子，第二和第三泳道分別為EcoR I酶切的正義的pCAMBIA-RIX4表達載體，第四和第五泳道分別為EcoR I酶切的反義的pCAMBIA-RIX4表達載體；圖5.獲得的RIX4基因蛋白電泳圖譜，第一泳道為中等分子量的蛋白標記分子；第二泳道為連接有RIX4的pET28a載體的樣品；第三泳道為空載體pET28a的陰性對照；
圖6.獲得的轉RIX4基因的抗性植株鑑定圖譜。左圖為對照(高感)植株，右圖為轉基因高抗植株；圖7.RIX4基因交替剪接模式圖。
具體實施例方式
本發明中使用的下列術語除非特別說明具有如下的含義「核酸序列」是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術語「胺基酸序列」是指寡肽、肽、多肽或蛋白質序列及其片段或部分。當本發明中的「胺基酸序列」涉及一種天然存在的蛋白質分子的胺基酸序列時，這種「多肽」或「蛋白質」不意味著將胺基酸序列限制為與所述蛋白質分子相關的完整的天然胺基酸。
蛋白質或多核苷酸「變體」是指一種或多個核苷酸改變的胺基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括胺基酸序列或核苷酸序列中胺基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有「保守性」改變，其中替換的胺基酸具有與原胺基酸相類似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
「缺失」是指在胺基酸或核苷酸序列中一個或多個胺基酸或核苷酸的缺失。
「插入」或「添加」是指在胺基酸序列或核苷酸序列中的改變導致與天然存在的分子相比，一個或多個胺基酸或核苷酸的增加。「替換」是指由不同的胺基酸或核苷酸替換一個或多個胺基酸或核苷酸。
「生物活性」是指具有天然分子的結構、調控或生物化學功能的蛋白質。
「調節」是指RIX-4具有的功能發生改變，包括蛋白質活性的升高或降低、結合特性的改變及RIX-4編碼蛋白的任何其他生物學性質、功能的改變。
「互補的」或「互補」是指在允許鹽濃度和溫度條件下通過鹼基配對的多核苷酸天然結合。例如，序列「CTGA」可與互補的序列「GACT」結合。兩個單鏈分子之間的互補可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補程度對於核酸鏈之間雜交的效率及強度有明顯影響。
「同源性」是指互補的程度，可以是部分同源或完全同源。「部分同源」是指一種部分互補的序列，其至少可部分抑制完全互補的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴格性程度降低的條件下進行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測。基本上同源的序列或雜交探針可競爭和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴格性程度降低的條件下的結合。這並不意味嚴格性程度降低的條件允許非特異性結合，因為嚴格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結合為特異性或選擇性相互作用。
「反義」是指與特定的DNA或RNA序列互補的核苷酸序列。「反義鏈」是指與「有義鏈」互補的核酸鏈。
「衍生物」是指HFP或編碼其的核酸的化學修飾物。這種化學修飾物可以是用烷基、醯基或氨基替換氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學特性。
「分離的」一詞指將物質從它原來的環境(例如，若是自然產生的就指其天然環境)之中移出。如本發明所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸如從天然狀態中同存在的其他物質分開，則為分離純化的。
本發明提供了一種多肽——RIX-4基因編碼的多肽，基本上是由SEQ ID NO.8、9所示的胺基酸序列組成的。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括RIX-4基因編碼的多肽的生物活性片段、或其活性類似物、或其活性衍生物。如本發明所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的RIX-4基因編碼的多肽相同的生物學功能或活性多肽。本發明多肽的生物活性片段、或其衍生物或其活性類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸參加(優選的是保守胺基酸殘基)取代，並且取代的胺基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基的某個基團或其他基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的胺基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員的知識範圍之內。
本發明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有SEQ ID NO.8、9胺基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本發明的多核苷酸是從水稻的cDNA文庫中發現的。它包含的多核苷酸序列全長為1991個鹼基，其開放讀碼框為1530個鹼基，通過Southern雜交證實抗性水稻品系中的誘導表達明顯強於感病品系中的表達，推測這些cDNA片段與水稻抗白葉枯病緊密相關，具有抗白葉枯病的功能。RIX-4基因的全長DNA序列如SEQ ID NO.10所示，包含7個外顯子和6個內含子，且存在交替剪接現象。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO.1所示的編碼區序列相同或是簡併的變異體。如本發明所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO.8、9的蛋白質或多肽，但與SEQ ID NO.1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO.8、9的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位病原體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實際上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優選具有70％的相同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC、0.1％SDS、60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(V/V)甲醯胺、0.1％小牛血清/0.1％Ficoll、42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好在97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO.8、9所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與以上所述的序列雜交的核酸片段。「核酸片段」的長度至少含8個核苷酸，較好是至少20～30個核苷酸，更好是至少50～60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼RIX-4基因的多核苷酸。
本發明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經常選用的方法。更經常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA並進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業途徑獲得(promega)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。還可得到商業供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限於)(1)DNA-RNA或DNA-DNA雜交；(2)標誌基因功能的出現或喪失；(3)測定RIX-4的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少8個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內，較佳的為1000個核苷酸之內。此處所用的探針通常是在本發明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測RIX-4基因表達產物可以用免疫學技術如Western印跡法、放射免疫沉澱法、酶聯免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的多核苷酸序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測定需反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或直接用RIX-4基因的編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
本發明中，編碼RIX-4基因的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發明所述多核苷酸的重組載體。術語「載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7啟動子的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用於構建重組表達載體。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含編碼RIX-4基因的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列強會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100～270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用地二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌地四環素或氨苄青黴素抗性等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發明中，編碼RIX-4基因的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語「宿主細胞」指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS、Bowes黑素瘤細胞等。
用本發明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。
通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的RIX-4多肽(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1)用本發明的RIX-4的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
在步驟(2)中，根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被於細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其他特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法包括但並不限於常規的復性處理、蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌；超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其他各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發明RIX-4基因和交替剪接產生的多個轉錄本及其編碼的多肽可直接用於研究生物體中交替剪接的作用機制、編碼蛋白對生物生理生化的影響、寄主與宿主的互作和抗病性的研究等mRNA的轉錄過程包含mRNA前體的剪接，mRNA前體剪接後產生成熟的mRNA，並翻譯成蛋白質，參與各種生理生化過程。研究發現，RIX-4基因和多個轉錄本及其翻譯產物在抗性植株中都有較高的表達，且植株的結實率明顯降低，說明本發明的RIX-4基因、轉錄本及其多肽參與了抗白葉枯病的過程，以及植物的生殖發育過程。
本發明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，並進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質譜分析。
抑制RIX-4基因mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酶內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼RIX-4基因的多核苷酸可用於植物的疾病診斷。編碼RIX-4基因的多核苷酸可用於RIX-4基因的表達與否。如編碼RIX-4基因的DNA序列可用於雜交以判斷RIX-4基因的表達情況。雜交技術包括Southern印跡法和Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達和基因克隆。用RIX-4基因特異引物進行RNA-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測RIX-4基因的轉錄產物。
檢測RIX-4基因的突變也可用於研究RIX-4基因異常功能相關的疾病。RIX-4基因突變形式包括與正常野生型RIX-4基因DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其他任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、Northern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外。突變有可能影響蛋白的表達，因此用Southern印跡法和Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條水稻染色體具體位置且並可以與其雜交。目前，需要鑑定染色體上的各基因的具體位點。現在，只有很少的基於實際序列數據(重複多態性)的染色體標記物可用於標記染色體位置。根據本發明，為了將這些序列與抗白葉枯病以及植物的生殖發育過程相關聯，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位於染色體上。本發明的研究發現運用中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體的親本為材料，對RIX-4基因進行RFLP進行多態性分析，RIX-4基因在親本中以1～2拷貝存在，位於第八號染色體著絲粒附近，且在兩個重組自交系群體的一個公共標記RM210B附近。
本發明的編碼RIX-4基因的多核苷酸序列的染色體定位可以有多種方法，例如體細胞雜合細胞的PCR定位法、原位雜交、RFLP法和螢光原位雜交(FISH)法等。
簡而言之，根據cDNA製備PCR引物(優選15～35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條水稻染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的水稻基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現亞定位。可用於染色體定位的其他類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA文庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行螢光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human ChromosomesManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
比較抗病與感病個體間的cDNA和基因組序列的差異，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基於cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據目前的物理圖譜和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與抗病有關的染色體區域的cDNA，可以是50至500個潛在抗病基因間之一種(假定1兆鹼基作圖分辨能力和每20kb對應於一個基因)。
下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所介定的本發明範圍。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 RIX-4基因的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取水稻總RNA。用Quick mRNA Isolation Kit(Qiagene)從總RNA種分離poly(A+)mRNA。2μg poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(Clontech)將cDNA片段定向插入到pBS SK(+)載體(Clontech)的多克隆位點上，轉化DH-5α感受態細胞，形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reaction sequencing kit(promega，U.S.A.)和Megabase1000測序儀測定所有克隆的5』和3』末端的序列。將測定的cDNA序列與Genbank資料庫比較，結果發現其中一個克隆的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，該克隆所含的全長cDNA為1991bp(SEQ ID NO.1)。經進一步的研究發現，該全長DNA序列為2661bp(SEQ ID NO.10)，包含7個外顯子和6個內含子，且存在交替剪接現象(圖7)。
實施例2用RT-PCR方法克隆編碼RIX-4多肽的RIX-4基因用白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)處理水稻抗病品種(IR26)和感病品種(金剛30)愈傷組織，分別提取總RNA(嚴格按照Trizol試劑盒說明書要求操作)作為逆轉錄反應的模板，按照下列體系進行逆轉錄反應合成cDNA引物分別為Primer15′-GGCCACGCGTCGACTACTTTTTTTTTTTTTTT-3′(3′(反轉錄用))；Primer25′GGCCACGCGTCGACTACGGGGGGGGGG 3′(5′(反轉錄用))Primer35′-GGCCACGCGTCGACTAC-3′(3′(擴增用))Primer45′-GGCCACGCGTCGACTAC-3′(5′(擴增用))流程為100ng/μl的3′5′2.5μl，RNA 5μl(約200ng)，5μl DEPC-H2O混合後70℃水浴5min，冰浴5min；加入5×RT緩衝液6μl，0.1mol/L DTT3μl，20nmol/L dNTPs3μl，2μl MMLV(200U/μl)，RNasin 1μl，總體積50μl。42℃溫浴2小時。65℃滅活。稀釋50倍後取5μl作模板進行PCR擴增。
擴增反應的條件50μl的反應體系中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Tag DNA聚合酶(Clontech)。在HybaidPCR儀上按照下列程序進行反應94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；36cycles。
在RT-PCR時同時設定-actin為陽性對照和模板為陰性對照。擴增產物用試劑盒純化(Qiagene，Germany)，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrongen，U.S.A.)。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與SEQ ID NO.2所示的20～1991完全相同。
實施例3 Northern印跡法分析RIX-4基因的表達用一步法提取總RNA(Anal.Biochem.1987，162.156-159)。該法包括酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合後離心。吸取水相，加入異丙醇(0.8體積)並將混合物離心得到RNA沉澱，將得到的RNA沉澱用70％乙醇洗滌，乾燥並溶於水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然後轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法製備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為PCR擴增的RIX-4編碼區序列。將32P-標記的探針與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中於42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲醯胺-25mM KH2PO4(Ph7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之後，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中於55℃洗30min。然後，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實施例4 RIX-4多肽的體外表達、分離和純化根據SEQ ID NO.2所示的編碼區序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer55』CTAGCT AGCATG GAT GAG GAA ATT TCC GTA-3』Primer65』-GGCCTC GAGTCA AGC AAC TGA ATG GTC AAA-3』此兩段引物的5』端分別含有Nhe I和Xho I酶切位點，其後分別為目的基因的5』和3』的編碼序列，Nhe I和Xho I酶切位點相應於載體質粒pET-28b(+)(Novagen)上的選擇性內切酶位點。以含有全長RIX-4基因的質粒克隆為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含有質粒模板10pg、引物分別為10pmol、Advantage polymerase mix(Clontech)1μl。94℃，4min； 94℃，20sec；60℃，30sec；72℃，2min； 36cycles。
用Nhe I和Xho I分別對擴增產物和質粒pET-28b(+)進行雙酶切，分別回收大片段，並用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿菌DH-5α，在含卡那黴素(終濃度100μg/ml)的LB平板培養過夜後，用菌落PCR法篩選陽性克隆，並進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(RIX-4基因的質粒克隆)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen)。在含卡那黴素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養中，宿主菌BL21(RIX-4基因的質粒克隆)在37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續培養5小時。離心收集菌體，經超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind QuickCartridge(Novagen)進行層析，得到了純化的目的RIX-4多肽。經SDS-PAGE電泳，得到一條單一的條帶。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端胺基酸序列分析，結果N-端15個胺基酸與SEQ ID NO.8、9所示的N-端15個胺基酸完全相同(圖5)。
實施例5本發明的多核苷酸片段用作雜交探針的應用從本發明的多核苷酸中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針有多方面的用途，如用該探針可與不同來源的正常組織或病理組織的基因組或cDNA文庫雜交以鑑定其是否含有本發明的多核苷酸序列和檢出同源的多核苷酸序列，進一步還可用該探針檢測本發明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常組織或病理組織細胞中的表達是否異常。
本實施例的目的是從本發明的多核苷酸SEQ ID NO.10中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針，並用濾膜雜交方法鑑定一些組織中是否含有本發明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。濾膜雜交方法包括斑點印跡法、Southern印跡法、Northern印跡法和複印方法等，它們都是將待測的多核苷酸樣品固定在濾膜上後使用基本相同的步驟雜交。這些相同的步驟是固定了樣品的濾膜首先用不含探針的雜交緩衝液進行預雜交，以使濾膜上樣品的非特異性的結合部位被載體和合成的多聚物所飽和。然後預雜交液被含有標記探針的雜交緩衝液替換，並保溫使探針與靶核酸雜交。雜交步驟之後，未雜交上的探針被一系列洗膜步驟除掉。本實施例利用較高強度的洗膜條件(如較低鹽濃度和較高的溫度)，以使雜交背景降低且只保留特異性強的信號。本實施例選用的探針包括兩類第一類探針是完全與本發明的核苷酸SEQ ID NO.10相同或互補的寡核苷酸片段；第二類探針是部分與本發明的核苷酸SEQID NO.10相同或互補的寡核苷酸片段。本實施例選用斑點印跡法將樣品固定在濾膜上，在較高強度的洗膜條件下，第一類探針與樣品的雜交特異性較強而得以保留。
一、探針的選用從本發明的多核苷酸SEQ ID NO.10中選擇寡核苷酸片段用作雜交探針，應遵循以下原則和需要考慮的幾個方面1.探針大小優選範圍為18-50個核苷酸；2.GC含量為30-70％，超過則非特異性雜交增加；3.探針內部應無互補區域；4.符合以上條件的可作為初選探針，然後進一步作計算機序列分析，包括將該初選探針分別與其來源序列區域(即SEQ ID NO.10)和其它已知的基因組序列及其互補區進行同源性比較，若與非靶分子區域的同源性大於85％或者超過15個連續鹼基完全相同，則該初選探針一般就不應該使用；5.初選探針是否最終選定為有實際應用價值的探針還應進一步由實驗確定。
完成以上各方面的分析後挑選併合成兩種探針探針1，與SEQ ID NO.10的基因片段完全同源或互補；探針2，與SEQ ID NO.10的基因片段或其互補片段的替換突變序列。
與以下具體實驗步驟有關的其他未列出的常用試劑及其配製方法請參考文獻DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實驗手冊書籍如《分子克隆實驗指南》(1989年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學出版社。
植物基因組DNA的提取在50ml離心管中加入20ml提取緩衝液I，60℃水浴預熱。水稻幼苗或葉子5～10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀後立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30～60min(時間長，DNA產量高)，不時搖動。加20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫靜置5～10min，使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。室溫5000rpm離心5min。仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉澱。在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻棒撈出DNA絮團，乾淨吸水紙上吸乾，轉入含TE的離心管中，DNA很快溶解於TE。若DNA未形成絮狀沉澱，則可用5000rpm離心5min，再將沉澱移入TE管中。這樣收集的沉澱，往往難溶於TE，可在60℃水浴置15min以上，以助溶。將DNA溶液3000rpm離心5min，將上清倒入乾淨的5ml離心管。加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃置20min左右，DNA形成絮狀沉澱。用玻棒撈出DNA沉澱，70％乙醇漂洗，吸水紙吸乾。將DNA重溶於1ml TE，-20貯存。取2μl DNA樣品在0.7％Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質量。分裝後存放於-20℃。
樣膜的製備1)取4×2張適當大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，用鉛筆在其上輕輕標出點樣位置及樣號，每一探針需兩張NC膜，以便在後面的實驗步驟中分別用高強度條件和低強度條件洗膜。2)吸取樣品及對照各15μl，點於樣膜上，在室溫中晾乾。3)置於浸潤有0.1mol/LNaOH，1.5mol/L NaCl的濾紙上5min(2次)，晾乾置於浸潤0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/L NaCl的濾紙上5min(2次)，晾乾。4)夾於乾淨濾紙中，以鋁箔包好，60-80℃真空乾燥2小時。
探針的標記1)3μl Probe(0.1 OD/10μl)，加入2μl Kinase緩衝液，8-10μCi-32P-dATP+2U Kinase，以補加至終體積20μl。2)37℃保溫2小時。3)加1/5體積的溴酚藍指示劑(BPB)。4)過Sephadex G-50柱。5)至少32P-Probe洗出前開始收集第一峰(可用Monitor檢測)。6)5滴/管，收集10-15管。7)用液體閃爍儀監測同位素量。8)合併第一峰的收集液後即為所需製備的32P-Probe(第二峰為游離γ-32P-dATP)。
預雜交將樣膜置於塑膠袋中，加入3-10mg預雜交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/mlCTDNA(小牛胸腺DNA))，封好袋口後，68℃水浴搖2小時。
雜交將塑膠袋剪去一角，加入製備好的探針，封好袋口後，42℃水浴搖過夜。
洗膜一、高強度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。2)2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)。3)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)。4)0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30min(2次)，室溫晾乾。
二、低強度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。2)2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15min(2次)。3)0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15min(2次)。4)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)，室溫晾乾。
實驗結果採用低強度洗膜條件所進行的雜交實驗，以上兩個探針雜交斑放射性強弱沒有明顯區別；而採用高強度洗膜條件所進行的雜交實驗，探針1的雜交斑放射性強度明顯強於另一個探針雜交斑的放射性強度。因而可用探針1定量和定性地分析本發明的多核苷酸在不同組織中的存在和差異表達。
實施例6 DNA Microarray基因晶片或基因微陣列(DNA Microarray)是目前許多國家實驗室和大製藥公司都在著手研製和開發的新技術，它是指將大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻片、矽片、硝酸纖維素膜等載體上，然後用螢光或同位素檢測和計算機軟體進行數據的比較和分析，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的、本發明的多核苷酸可作為靶DNA用於基因晶片技術用於高通量研究新基因功能；尋找和篩選組織特異性新基因特別是疾病相關基因；疾病的診斷，如遺傳性疾病、其具體方法步驟在文獻中已有多種報導，如可參閱文獻Derisi，J.L.，Lyer，V. and Brown，P.O.(1997)Science 278，680-686.及文獻Helle，R.A.，Schema，M.，Chai，A.，Shalom，D.，(1997)PNAS 942150-2155.
(一)點樣各種不同的全長cDNA共計4000條多核苷酸序列作為靶DNA，其中包括本發明的多核苷酸、將它們分別通過PCR進行擴增，純化所得擴增產物後將其濃度調到500ng/μl左右，用GAC Solution點樣儀(購自美國)點於尼龍膜上。將點樣後的玻片進行水合、乾燥、置於紫外交聯儀中交聯，洗脫後乾燥使DNA固定在尼龍膜上製備成晶片。其具體方法步驟在文獻中已有多種報導，本實施例的點樣後處理步驟是1)潮溼環境中水合4分鐘；2)0.2％SDS洗滌1分鐘；3)ddH2O洗滌兩次，每次1分鐘；4)NaBH4封閉5分鐘；5)95℃水中2分鐘；6)0.2％SDS洗滌1分鐘；7)ddH2O洗滌兩次；8)晾乾，25℃儲存於暗處備用。
(二)探針標記用一步法分別從水稻特定的愈傷組織(用白葉枯菌處理水稻抗病品種(IR26)和感病品種(金剛30))中抽提總mRNA，並用Oligotex mRNA Midi Kit(購自QiaGen公司)純化mRNA，運用隨機引物通過反轉錄分別將同位素α-33p-CTP(購自Amersham Phamacia Biotech公司)標記水稻抗病品種(IR26)mRNA和感病品種(金剛30)mRNA，經純化後製備出探針。具體步驟參照及方法見Schena，M.，Shalon，D.，Heller，R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.9310614-10619.Schena，M.，Shalon，D.，Davis，R.W.(1995)Science.270.(20)467-480.
(三)雜交分別將來自以上兩種組織的探針與晶片一起在UniHybTMHybridizationSolution(購自TeleChem公司)雜交液中進行雜交16小時，室溫用洗滌液(1×SSC，0.2％SDS)洗滌後用Scanarray3000掃描儀(購自美國General Scanning公司)進行掃描，掃描的圖象用Imagene軟體(美國Biodiscovery公司)進行數據分析處理，算出每個點的Ratio比值。
實施例7.RIX-4基因的染色體定位為了進一步了解RIX4基因在染色體上位置及其在水稻基因組中存在的拷貝數，我們篩選了該基因在三個重組自交系群體親本間的RFLP多態性，並對該基因在篩選到的重組自交系群體中進行了定位。
材料和方法選用由中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46；協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體的親本為材料，用於RIX4基因的RFLP多態性鑑定。由247個株系組成的珍汕97B/密陽46重組自交系群體和210個株系組成的協青早B/密陽46重組自交系群體分別應用於基因定位研究。
RFLP定位一、DNA提取、酶解、southern轉膜參照《分子克隆實驗方法》(薩姆布魯克J，1989)方法。以BamH I、DraI、EcoR I、EcoR V和Hind III五種限制性內切酶分別對三個重組自交系珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的5個親本進行酶解。
二、探針標記與分子雜交及信號檢測用ECL檢測系統(Amersham pharmacia Biotech)，參照莊傑雲(浙江大學博士論文2001)優化方法。(一)預雜交將濾膜放入預熱到41℃的含有0.5mol/L NaCl和5％封閉試劑的雜交液中，預雜交1h。所有雜交液的用量為每一張10cm×20cm濾膜一般用量為10-15ml。(二)探針標記用雙蒸水稀釋探針為10ng/μl，沸水中變性5min，冰浴5min；加入與探針等體積的標記試劑(辣根過氧化物酶)，緩慢混勻；再加入等體積的化學膠聯試劑戊二醛溶液，緩慢混勻；37℃保溫15min，置於冰上，馬上進行雜交。(三)雜交標記好的探針加入預雜交液中混勻，在41℃下緩慢震蕩，雜交過夜。(四)洗膜將濾膜從雜交液中取出，DNA面朝上，逐張放入洗滌液I(5M尿素、0.5×SSC、0.4％SDS)，於41℃下洗滌2×15min，再用洗滌液II(2×SSC)在室溫下洗滌2×5min。(五)信號檢測在一個空盒中混合等體積的檢測試劑I和檢測試劑II，馬上將濾膜放入，DNA面朝上，使檢測試劑蓋住濾膜；取出濾膜，略微滴幹後置於吸水紙上，DNA面朝上；移到保鮮膜上，DNA面朝下包好；放入裝有增感屏的X光片夾中，DNA面朝上。在暗紅燈下壓上X光片；暴光0.5-2h，常規衝片。
三、數據分析及連鎖圖構建應用MAPMAKER/EXP3.0(Lancoln等，1992a)構建連鎖圖，以LOD＝3.0將各標記歸入連鎖群，以LOD＝2.0確定連鎖群內標記的順序，部分區間含有多個緊密連鎖的標記，標記間順序無法達到LOD＝2.0的置信度，暫以計算結果提供的最佳順序排列。採用Kosambi函數(1944)將重組值轉換成遺傳圖距，根據前人發表的圖譜確定各連鎖群的染色體號(Causse等，1994)RIX4基因的圖譜定位分別選用珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽重組自交系群體的247和210個株系DNA，經EcoR I進行酶解轉膜，以RIX4克隆為探針，進行雜交；經MAPMAKER/EXP3.0連鎖分析，在97B/密陽46重組自交系群體中將其定位於水稻第8染色體上RG108和RM210B之間，距離分別為6.5cM和3.5cM；在協青早B/密陽46重組自交系群體中定位於第8號染色體上的G104和RM210B之間，距離分別為6.0cM和4.8cM。以我們所定位的RIX4基因緊密連鎖G104標記與NCBI公布的水稻基因組第8號染色體圖譜(www.ncbi.nlm.nih.gov/cig-bin/Entrez/maps.cgi？org＝rice8chr)比較，發現該基因位於水稻第8號染色體著絲粒附近(表1，表2)。
表1RIX4基因在珍汕97B/密陽46重組表2RIX4基因在協青早B/密陽46重組自自交系群體的染色體定位 交系群體的染色體定位Markers Distance MarkersDistance1 RG333 6.3 cM 1 RG333 8.0 cM2 RZ562 6.8 cM 2 RM310 10.6 cM3 RG108 6.5 cM 3 G1046.0 cM4 RIX4 3.5 cM 6 RIX41.6 cM5 RM210B 2.7 cM 5 RM210B 4.8 cM6 RG978 2.4 cM 4 RZ617 9.1 cM7 RZ617 5.4 cM 7 RG978 18.8 cM8 R1394 26.5 cM8 RM265A 29.1 cM9 RM210A 13.8 cM9 RM210A 19.6 cM10 RZ66 --------- 10 RZ66----------實施例8.RIX4基因的功能研究通過構建RIX4基因cDNA全長序列正義表達與反義表達的植物轉化載體，用農桿菌侵染法對水稻進行轉化，希望從該基因在水稻中超表達與阻斷表達後水稻表型對比，進一步了解該基因的生理功能。
供試水稻品種粳稻品種(O.sativa L.sub.japonica)中花11號實驗方法一、正義與反義表達的植物轉化載體構建(圖1)，以下載體構建方法參照《重組DNA的原理與方法》(李德葆等，1994)。1)pGEM-T-RIX4質粒的EcoR I酶切；2)酶切片段RIX4/E的回收(嚴格按Concert TM Rapid Gel Extraction Systerm要求操作)；3)pBluescript SK(pBS)載體的EcoR I酶切及抽提；4)回收片段RIX4/E與pBS載體的連接；5)連接產物的轉化感受態細胞及蘭白斑篩選；6)鹼法小量製備重組質粒DNA；7)pBS-RIX4質粒EcoR I酶切鑑定；8)pBS-RIX4質粒的BamH I酶切及RIX4/B片段回收；9)pCAMBIA 1301質粒BamH I酶切及抽提；10)pCAMBIA1301與RIX4/B片段的連接；11)pCAMBIA1301-RIX4(pCAM-RIX4)轉化感受態細胞及鹼法小量製備重組質粒DNA；12)BamH I酶切鑑定pCAMBIA1301與RIX4/B片段連接情況；13)pCAM-RIX4質粒的EcoR I酶切鑑定片段連接方向；14)轉化載體的PCR驗證。運用下列引物對對所得質粒進行PCR擴增，擴增條件94℃30sec、60℃45sec、72℃80sec、40循環。
Primer75』-GGATCCACCAAGTGACAATATGGATGAGGAA-3』Primer85』-TATAAGAATCCATTGTTCAGGCC-3』二、水稻轉化用於本研究的細菌培養基及水稻組織培養培養基見表3、4表3細菌培養基培養基組分 參考文獻16g/L蛋白腖，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl， Sambrook J，20012YTpH7.05g/L蛋白腖，1g/L酵母提取物，5g/L牛肉浸膏，Vervliet等，1975YEB5g/L蔗糖，2mmol/LMgSO4，pH7.03g/L K2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/LNH4Cl， Chilton等，1974AB300mg/L MgSO4，150mg/L KCl，10mg/L CaCl，2.5mg/L FeSO4.7H2O，5g/L葡萄糖，pH7.0表4水稻組織培養培養基培養基 組份愈傷組織誘導及培養用培養基N6(Chu 1978)鹽份和維生素，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，N6D24-D，2.5g/L phytegal，pH5.8懸浮細胞培養用培養基AA(Toriyama等1985)鹽份和胺基酸，MS(Murashige等，1962)維生素，0.5g/LAA水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，0.2mg/L KT，pH5.8共培養培養基AA鹽份和胺基酸，MS維生素，0.5g/L水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/LAAM蔗糖，100μmol/L乙醯丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2，10g/L葡萄糖，100μmol/L乙醯丁香酮，pH5.2N6鹽份和維生素，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2.5g/L phytagel，100μN6Cmol/L乙醯丁香酮，pH5.8篩選培養基N6D2，0.25g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/LN6D2S1玉米素(zeatin)，0.5mg/LKT，2.0g/L phytagel，25mg/L潮黴素，250mg/L頭孢黴素，pH5.8N6D2，0.25g/水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/LN6D2S2玉米素(zeatin)，0.5mg/LKT，2.0g/L phytagel，50mg/L潮黴素，250mg/L頭孢黴素，pH5.8分化培養基MS鹽份，MS維生素、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/LMSBK玉米素(zeatin)、0.2mg/L NAA、50mg/L潮黴素、2.0g/L phytagel，pH5.8生根培養基1/2MSOEM1/2MS鹽份，MS維生素，30g/L蔗糖，0.2mg/L NAA，50mg/L潮黴素，H 1-2mg/L多效唑(劉明華等1995)，2.0g/L phytagel，pH5.8
三、雙元載體導入農桿菌及酶切鑑定參考Hofgen等(1998)的凍融法直接將雙元載體pCAMBIA 1301導入根癌農桿菌菌株EHA105，具體步驟如下1)根癌農桿菌生長於YEB(無抗生素)固體平板上，任挑一單菌落接入5mL YEB液體培養基中28℃、200rpm培養過夜；2)按1％接種量將上述菌液接種於50mL新鮮的YEB液體培養基中，28℃、200rpm培養至對數生長期；3)4000g、4℃、8min離心收集農桿菌菌體，用5mL預冷的TE(pH7.5)(10mmol/L Tris-Cl，pH7.5，1mmol/L EDTA)洗滌一次，加入5mL新鮮YEB培養基重新懸浮；4)取200μl菌液分裝於1.5mL eppendorf管中，液氮速凍後於-70℃保存備用；5)直接取步驟3中200μl菌液(或取一管凍存細胞冰上化凍)加入1μg質粒DNA混勻，然後依次於冰上、液氮上、和37℃水浴中放置5min；6)用新鮮的YEB液體培養基稀釋至1mL，於28℃振蕩培養2-4小時；7)取200μl塗布於含Km 50mg/L的YEB平板上，28℃培養2-3天；8)生長的菌落在含Km 50mg/L的YEB平板上劃分單菌，重複3次；9)隨機挑選2個單菌落，用鹼法小量製備質粒DNA；10)用氯化鈣法將質粒DNA轉化入E.coli DH5α感受態細胞中；11)再隨機挑選2個單菌落，用鹼法小量製備質粒DNA，進行酶切鑑定(圖2)。
四、轉化農桿菌後質粒鑑定導入農桿菌後質粒的酶切鑑定操作參照《重組DNA原理和方法》(李德葆等，1994)的方法。用鹼法小量製備質粒DNA，用EcoR I酶切。質粒DNA經氯化鈣法轉化E.coli DH5α。
五、水稻幼胚愈傷組織的誘導授粉後12-15天的水稻未成熟種子經70％乙醇浸泡1分鐘後於2％的NaClO溶液中(加入2-3滴土溫20)消毒60分鐘以上，用無菌水衝洗4-5次，用解剖刀和鑷子挑出幼胚並培養於N6D2培養基上誘導愈傷組織。
六、根癌農桿菌的培養及水稻的轉化(一)根癌農桿菌培養農桿菌菌種自YEB平板上接種到3mL含Km 50mg/L的YEB液體培養基中於28℃、200rpm培養過夜，第二天按1％接種量接入含Km 50mg/L的AB液體培養基中，28℃、200rpm繼續培養至分光光度計上600nm讀數0.8左右，將新鮮的培養液於5000g、4℃離心5min，收集並重新懸浮於1/3體積的AAM液體培養基中，用於水稻幼胚愈傷組織的轉化。(二)水稻幼胚愈傷組織與根癌農桿菌的共培養轉化轉化前製備N6D2C固體培養基時，在製備好的培養基上鋪一層無菌濾紙，並用少量新鮮的AAM液體培養基潤溼。在6mL培養皿中將預培養後的愈傷組織浸泡於新鮮的AAM農桿菌菌液並不時搖動，20min後將水稻材料取出，在無菌濾紙上吸去多餘的農桿菌菌液，隨即轉移到上述N6D2C培養基上於28℃共培養3天。共培養時，在共培養培養基AAM、N6D2C中添加100μmol/L的乙醯丁香酮(AS)作為農桿菌Vir基因的活化誘導物。共培養三天後，從培養基上取出轉化水稻材料，用無菌水洗一次並於無菌濾紙上吸乾菌液和水份。(三)轉化後愈傷組織的篩選、分化及生根(1)愈傷組織的處理、篩選及分化將愈傷組織從N6D2C固體培養基中取出，無菌條件下用鑷子和解剖刀將芽切除。去除芽的愈傷組織接種於N6D2S1培養基，12-14天後轉接於N6D2S2培養基繼續篩選。兩周後，將抗性愈傷組織接種於MSBK分化培養基誘導分化。轉接時挑選分化狀態良好的愈傷組織，並注意同一愈傷組織所增殖的新愈傷在轉接時不要分開接種，以便準確統計抗性愈傷轉化效率。(2)轉化植株的再生將分化的小苗栽入1/2MSOEMH生根培養基。生根後，將再生植株從生根管取出，自來水將根部培養基衝洗乾淨後，經練苗移栽溫室(圖3)。
七、轉基因株的鑑定(一)轉基因水稻植株總DNA提取，參照《重組DNA的原理與方法》(李德葆等，1994)的方法。(二)轉基因植株的PCR分析用以下引物對正義轉基因株DNA及反義轉基因株DNA進行PCR鑑定。Primer35S15′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′Primer35S25′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3』；PrimerNos15′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′ PrimerNos25′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′ PrimerBBRG35′-ACATCCACCGCTGCTTGAGGCAG-3′ Primer BBRG65′-TGCCTGAGATCCCTCGATTCT-3′ 引物組合為35S1×35S2；35S1×BBRG3；35S1×BBRG6；Nos1×Nos2。反應體系為模板DNA 100ng；10×緩衝液5μl；20mM dNTP 0.5μl；100ng/μl引物各0.5μl；Taq酶2U；加水至體積50μl。反應條件35S與Nos檢測用94℃30sec、54℃45sec、40循環；35S1×BBRG或BBRG6用94℃30sec、56℃45sec、72℃80sec、40循環。轉基因株的PCR鑑定結果(圖4)。
八、RIX-4基因抗病性鑑定將轉RIX4基因的植株用白葉枯菌CR3進行接種，15天後觀察植株的發病情況。試驗結果如圖所示(圖6)。
序 列 表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特徵長度1991個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.1GATTTCGGGCCAAGTGACAAT GATGAGGAAATTTCCGTAGATCCTTCCCAAGGCAACAACTCGGAGGCAGTGAACACCAGTAACATAAATCAGGCAGATAAAGCACCAGATTTACCTGAAATAATGCGTGAAGCACCATTTGAGGGCCCTGAACTTAACTTGCCAGATATTGATGAGGTAAACAATGATCCCATGGATGTGACTGAGGAATCTTCACCATTTGTGTCCAAGAATATCACCCCTCCGGCACTGGAACGAACTATATCCCCTGGTCAAGGTGGATTATCTGGGACATCCATTCCCAATGCACGAGGAAGTACAAGCACCACGTATGACAATATAGAAGATGTTATACCAATGGATATTGGAATGCCTGATTTTAGGATTGAACCATCTCCACCTCGAGTACAAGATGAGATGAATGCACAACCAGTACAAGGTGAGATGAACGCACAACcAGTACAAGATGAGATGAACGCACAACCAGTACAAGATGAGATGAATGCACACCCAGGACAAGATAAGAGGAGAATTAGATATGACAATGAAATAGTGTTCTCCAATGGTTATATGAAGAGACAAATTGATGGCGGGGAACTACATCGTCTGGTCGGCAAGAGGAGGAAACTGCCTCAAGCAGCGGTGGATGTGTGGAAATTCAACAGGATTCGCCAAAAGGATGGTTTCTTGCTTGATCCTTTGGTCCATGGGATGTGCGCTACCCTACGTCAAACCTACGAGAGAACCTTCCCCCATGTGATTGACCCTGAAGCTGAGTCAGGATCTGTCGAGCATACTCCTGGGGTAGCTAATGACAGTATTCAGGATACACATGATCATCAACTCTCCCCGAAGTCTCCTGGAAACACAGATGCACAACCTGAACATCAGTTCAATCAACAAGCTCCAAGAAATTCAGATGGACAACCTGAACCTGAGCTTAACCCAAAGTCTCAGGCGAAGCAGGCACGGTCACACTTTGATGATATGCCTGAGATCCCTCGATTCTCGCCACAAAATATTCCATCTCCAATAAGAGACGACAATTCTCCTTTCAAAACTCCTGGTGCTGGTGGAACTCCGAAATCAAGACTTGGAGAAACTCCTGCCTCTGGGACACCAGCAGATATGAGTTACATGTCACCTGGACAAGACTCTGATCCTCAAGTTTCTCCTTTTCCATTTAATGATGAACTTGATGGAGATTTGCCCGAGATTCCTAGCCTCATGAGTACTCCTGGAGTAATATCTACCGCAGGTACTGGCACCACAGGATTGGGAAGCATGTCTGCTAGGACAAGGGCTGTGGCACAGTACTTCAAAGATCAAATGGCTTCGGCTACATCAGATGACCAACCTGGTAAATTTATCTTGAACAGAATCTTGGAAGGGAGACACAGGAAACAAGCTGCACGCATGTTTTTTGAAACACTGGTTCTAAAGAGTTATGATTATATTGATGTTGAACAAGAAGCAGCCTATGGTGATATAGCAGTTTCAGTTAAACCCTCACTCTCAGGAGCCAATTTTGACCATTCAGTTGCT AACCACATATAATCTCATTTGATCCGCGGGAAGGAGCTTTGGTGGGATTTGCAGAAATGGCCTGAACAATGGATTCTTATATGCGACATGGCTGGCTAATCTACTGCAATTTGCTGGACTCCAATTACTAGAACAAGTAGGCACTCCATGCCATTTAGGTTTATGTTGCAGAATACTGTAGTTGTAAAGCTGTAGCATTAGTAGTTGTCGAAAGCCAATACATCTTGTCCAGTTAGGACTTCAGATGGTAGTCCTTGCCTATGCTTTCTTGGCAGAAAGCAAAGTGAACAACGAATCAGATGAAGATAAGAATTTTTCTTACTTTTGCAGTTTAATTACATGGTAGTGATATGTTAAATACAAGTCGAAAAATGTTGGATGACTAGCATAAGACAATTTTATAAATGTCAGTGTACATAGTCTGATAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID No.2的信息(a)序列特徵長度1615個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.2SEQ ID NO.2(b1)
ggatccaccaagtgacaatatggatgaggaaatttccgtagatccttcccaaggcaacaactcggaggcagtgaacaccagtaacataaatcaggcagataaagcaccagatttacctgaaataatgcgtgaagcaccatttgagggccctgaacttaacttgccagatattgatgaggtaanaatgatccatggatgtgactgaggaatcttcaccatttgtgtccaagaatatcacccctccggcactagaacgaactatatcccctggtcaaggtggattatctgggacatccattcccaatgcacgaggaagtacaagcaccacatatgacaatatagaagatgttataccaatggatattggaatgcctgattttaggattgaaccatctccacctcgagtacaagatgagatgaatgcacaaccagtacaaggtgagatgaacgcacaaccagtacaagatgagatgaacgcacaaccagtacaagatgagatgaatgcacacccagcccaagataagaggagaattagatatgacaatgaaatagtgttctccaatgcttatatgaagagacaaattgatggcggtgaactgcatcgtctggtcagcaagagaaggaaactgcctcaagcagcggtggatgtgtggaaattcaacaggattcgccaaaaggatggtttcttgcttgatcctttggtccatgggatgtgcgctaccctacgtcaaacctacgagagagccttcccccatgtgattgaccctgaagctgagtcaggatctgtcgagcatactcctggggtagctaatgacagtattcaggatacacatgatcatcaactctccccgaagtctctgaaacacagatcacagctgaacatcttcaatcaacaagctccaagaaactcagatggacacctgaatctgagcttaacccaaagtctcaggcggagcaggcacgtcacactttgatgatatgcctgagatccctcgattctcgccacaaaatattccatctccaataagagacgacaattctcctttcaaaactcctggtgctggtggaactccgaaatcaagacttggagaaactcctgcctctgggacaccagcagatatgagttacatgtcacctggacaagactctgatcctcaagtttctccttttccatttaatgatgaacttgatggagatttgcccgagattcctagcctcatgagtactcctggagtaatatctaccgcagctactggcaccacaggattgggaagcatgtctgctaggacaaggctgtgcacagtacttcaaagatcaaatgctccgctacatcagatgaccaacctggtaaatttatcttgaacagatcttggaagggagacacagaaacaagctgcacgcatgttttttgaacactggttctaaggagttgtgattatattgatgttgaacaagaagcagcctatggtgatatagcagtttcagttaaaccctcactctcaggagccaaattttgaccaattcagttgcttagaaccacatataatctcatttgatccgcgggaaggagctttggtgggatttgcagaaatggcctgaacaatggattcttata(3)SEQ ID No.3的信息(a)序列特徵長度1499個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.3SEQ ID NO.3(b2)ggatccaccaagtgacaatatggatgaggaaatttccgtagatccttcccaaggcaacaactcggaggcagtgaacaccagtaacataaatcaggcagataaagcaccagatttacctgaaataatgcgtgaagcaccatttgagggccctgaacttaacttgccagatattgatgaggtaanaatgatccatggatgtgactgaggaatcttcaccatttgtgtccaagaatatcacccctccggcactagaacgaactatatcccctggtcaaggtggattatctgggacatccattcccaatgcacgaggaagtacaaggtgagatgaacgcacaaccagtacaagatgagatgaacgcacaaccagtacaagatgagatgaatgcacacccagcccaagataagaggagaattagatatgacaatgaaatagtgttctccaatgcttatatgaagagacaaattgatggcggtgaactgcatcgtctggtcagcaagagaaggaaactgcctcaagcagcggtggatgtgtggaaattcaacaggattcgccaaaaggatggtttcttgcttgatcctttggtccatgggatgtgcgctaccctacgtcaaacctacgagagagccttcccccatgtgattgaccctgaagctgagtcaggatctgtcgagcatactcctggggtagctaatgacagtattcaggatacacatgatcatcaactctccccgaagtctctgaaacacagatcacagctgaacatcttcaatcaacaagctccaagaaactcagatggacacctgaatctgagcttaacccaaagtctcaggcggagcaggcacgtcacactttgatgatatgcctgagatccctcgattctcgccacaaaatattccatctccaataagagacgacaattctcctttcaaaactcctggtgctggtggaactccgaaatcaagacttggagaaactcctgcctctgggacaccagcagatatgagttacatgtcacctggacaagactctgatcctcaagtttctccttttccatttaatgatgaacttgatggagatttgcccgagattcctagcctcatgagtactcctggagtaatatctaccgcagctactggcaccacaggattgggaagcatgtctgctaggacaaggctgtgcacagtacttcaaagatc
aaatgctccgctacatcagatgaccaacctggtaaatttatcttgaacagatcttggaagggagacacagaaacaagctgcacgcatgttttttgaacactggttctaaggagttgtgattatattgatgttgaacaagaagcagcctatggtgatatagcagtttcagttaaaccctcactctcaggagccaaattttgaccaattcagttgcttagaaccacatataatctcatttgatccgcgggaaggagctttggtgggatttgcagaaatggcctgaacaatggattcttata(4)SEQ ID No.4的信息(a)序列特徵長度1407個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.4SEQ ID NO.4(b3)ggatccaccaagtgacaatatggatgaggaaatttccgtagatccttcccaaggcaacaactcggaggcagtgaacaccagtaacataaatcaggcagataaagcaccagatttacctgaaataatgcgtgaagcaccatttgagggccctgaacttaacttgccagatattgatgaggtaanaatgatccatggatgtgactgaggaatcttcaccatttgtgtccaaggtgagatgaacgcacaaccagtacaagatgagatgaacgcacaaccagtacaagatgagatgaatgcacacccagcccaagataagaggagaattagatatgacaatgaaatagtgttctccaatgcttatatgaagagacaaattgatggcggtgaactgcatcgtctggtcagcaagagaaggaaactgcctcaagcagcggtggatgtgtggaaattcaacaggattcgccaaaaggatggtttcttgcttgatcctttggtccatgggatgtgcgctaccctacgtcaaacctacgagagagccttcccccatgtgattgaccctgaagctgagtcaggatctgtcgagcatactcctggggtagctaatgacagtattcaggatacacatgatcatcaactctccccgaagtctctgaaacacagatcacagctgaacatcttcaatcaacaagctccaagaaactcagatggacacctgaatctgagcttaacccaaagtctcaggcggagcaggcacgtcacactttgatgatatgcctgagatccctcgattctcgccacaaaatattccatctccaataagagacgacaattctcctttcaaaactcctggtgctggtggaactccgaaatcaagacttggagaaactcctgcctctgggacaccagcagatatgagttacatgtcacctggacaagactctgatcctcaagtttctccttttccatttaatgatgaacttgatggagatttgcccgagattcctagcctcatgagtactcctggagtaatatctaccgcagctactggcaccacaggattgggaagcatgtctgctaggacaaggctgtgcacagtacttcaaagatcaaatgctccgctacatcagatgaccaacctggtaaatttatcttgaacagatcttggaagggagacacagaaacaagctgcacgcatgttttttgaacactggttctaaggagttgtgattatattgatgttgaacaagaagcagcctatggtgatatagcagtttcagttaaaccctcactctcaggagccaaattttgaccaattcagttgcttagaaccacatataatctcatttgatccgcgggaaggagctttggtgggatttgcagaaatggcctgaacaatggattcttata(5)SEQ ID No.5的信息(a)序列特徵長度1530個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.5SEQ ID NO.5(b1 ORF 1530bp) ATGGATGAGGAAATTTCCGTAGATCCTTCCCAAGGCAACAACTCGGAGGCAGTGAACACCAGTAACATAAATCAGGCAGATAAAGCACCAGATTTACCTGAAATAATGCGTGAAGCACCATTTGAGGGCCCTGAACTTAACTTGCCAGATATTGATGAGGTAAACAATGATCCCATGGATGTGACTGAGGAATCTTCACCATTTGTGTCCAAGAATATCACCCCTCCGGCACTGGAACGAACTATATCCCCTGGTCAAGGTGGATTATCTGGGACATCCATTCCCAATGCACGAGGAAGTACAAGCACCACGTATGACAA
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權利要求
1.一種分離出的水稻抗白葉枯抗性相關基因，其特徵在於運用重組載體和基因工程化宿主細胞，通過應用模塊表達序列標籤陣列、互補脫氧核糖核酸末端快速擴增、聚合酶鏈式反應和反轉錄聚合酶鏈式反應、分子雜交方法獲得的、存在交替剪接現象的、且已於染色體上定位的具有SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種分離出的水稻抗白葉枯抗性相關基因，其特徵在於所說的已於染色體上定位，是水稻抗白葉枯抗性相關基因定位於第八號染色體著絲粒附近，且定位在中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體親本的一個公共標記RM210B附近。
3.根據權利要求2所述的一種分離出的水稻抗白葉枯抗性相關基因，其特徵在於所說的水稻抗白葉枯抗性相關基因存在交替剪接現象，是指水稻抗白葉枯抗性相關基因通過轉錄產生具有SEQ ID No.2～4所示的序列的多核苷酸序列，並且具有SEQ ID No.5～7所示的開放讀碼框多核苷酸序列。
4.一種分離的水稻抗白葉枯抗性相關基因的多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID No.8～9胺基酸序列的多肽、其保守性變體、或其生物活性片段，或其活性類似物、或其活性衍生物。
5.一種重組載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的水稻抗白葉枯抗性相關基因，它包括細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒。
6.一種基因工程化宿主細胞，其特徵在於，它是用權利要求5所述的重組載體轉化的基因工程化宿主細胞，它包括原核細胞、低等真核細胞、高等真核細胞。
7.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1或2所述的水稻抗白葉枯抗性相關基因的多核苷酸序列分子中8～100個連續核苷酸的序列。
8.根據權利要求7所述的一種探針分子，其特徵在於所說的多核苷酸序列包括SEQ IDNo.1～7所示的序列、其互補序列、多核苷酸序列變體、抑制水稻抗白葉枯抗性相關基因信使核糖核酸的寡核苷酸以及核酶。
9.根據權利要求8所述的一種探針分子，其特徵在於所說的多核苷酸序列變體是指一種或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。
10.一種分離出的水稻抗白葉枯抗性相關基因的用途，其特徵在於它用於水稻抵禦白葉枯菌的侵襲。
全文摘要
本發明公開了一種水稻抗白葉枯抗性相關基因、蛋白及其用途。同時公開了RIX－4基因交替剪接所產生的多個轉錄本多核苷酸序列以及其相應的開放讀碼框序列。這些序列具有SEQ ID NO.1～10所示的多核苷酸序列。這些cDNA片段與水稻抗白葉枯病緊密相關。本發明還提供含有編碼RIX－4基因的多核苷酸的重組載體和基因工程化宿主細胞，提供克隆RIX－4基因的方法，提供RIX－4基因的染色體定位。RIX－4基因在親本中以1～2拷貝存在，位於第八號染色體著絲粒附近，且在中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體親本的一個公共標記RM210B附近。本發明的多核苷酸和/或蛋白或多肽可作為探針分子，用於診斷抗病和/或感病或其他由於RIX－4基因表達異常所引起的抗病性或感病性。
文檔編號C07K14/415GK1546666SQ20031010914
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月5日 優先權日2003年12月5日
發明者董海濤, 姜玉新 申請人:浙江大學