用於固體生物對象的分析的方法

2024-04-05 12:03:05 1

專利名稱：用於固體生物對象的分析的方法
技術領域：
本發明涉及用於分析或診斷目的的固體對象的分析領域。更特別地，本發明涉及一種對生物來源(origin)的一個或多個固體對象就所述對象中的預定義結構的存在與數量進行分析的方法。甚至更特別地，本發明涉及通過分析在來自有機體的組織中的預定義結構的存在和數量來診斷疾病或機能障礙。
背景技術：
在現代社會中的很多功能中分析和診斷過程是至關重要的。最普遍的一種是以確定病人是否有特別疾病為目的在健康護理機構(例如醫院)執行的診斷過程。例如，男性血液中的提高的前列腺特異抗原(PSA)濃度是病人中正在發生的前列腺癌症的指示。然而， 這不夠特異，並且需要更好的方法來分析PSA的不同修飾(modification)以基於分析結果而改進臨床決定。其他分析或診斷過程包括但不限於基於對染色組織活檢的目鏡分析的癌症診斷、為了生產安全的食品而在宰殺之前對牲畜的診斷、以治療患病動物為目的的獸醫科學中的診斷過程、對人或動物中的腫瘤的靶向放療、對食品或飼料中的病原體或毒素的檢測、對經處理的食品或飼料中的營養補充物(例如維生素)濃度的確定、對環境中的危險化學品的檢測、等等。每當固體對象結構是複合物，多數當前所使用的方法必須使用高度特異的試劑以放大來自複合物樣本中的一種成分的信號。這樣的複合物結構可以是組織中或者體液中的細胞上的細胞表面。還有其他類型的複合物結構是其中各個蛋白質改變了構型或者可以通過轉譯後修飾所修飾的蛋白質複合物。用於診斷的一種特別方法是免疫組織化學法(IHC)。診斷IHC過程被發展用於多種疾病，最著名地用於癌症。簡言之，IHC是如下的方法其中將薄的組織切片放置於顯微鏡玻璃載片上，接著是對選定的受體染色。由染色的組織切片製成圖像，並且受過訓練的操作者判斷該組織是否包含指示疾病的染色模式(pattern)。儘管IHC被全世界使用並且改進了診斷像癌症的嚴重疾病的可能性，但是一般的IHC方法學仍遭受差的可重複性和長的組織製備協議(protocol)(如由 Allen M Gown 在 Modern Pathology 2008 May; 21 Suppl 2:S8-S15 中發表的 艮告"Current issues in ER and HER2 testing by IHC in breast cancer. 」中顯而易見的，該報告通過引用併入本文)。免疫組織化學法是用於分析組織切片的主要方法之一。在大多數主要醫院中被使用，它對於組織分析領域的技術人員而言是公知方法。簡言之，IHC是一種用於通過使用與生物組織中的抗原特異結合(bind)的抗體來定位組織部分的細胞中的蛋白質的方法。IHC 染色在諸如腫瘤的異常組織的診斷中是常用的。組織中的細胞中或細胞上的特異分子結構是指示疾病的特別細胞事件的特性。為了使抗體-抗原相互作用可視化，抗體可以被附到螢光基團諸如FITC (異硫氰酸螢光素)、羅丹明、Texas Red (德克薩斯紅)或者任何其他螢光部分(moiety)。在該過程中，取得感興趣的組織的薄(典型地為20 μ m)切片。隨後通常通過使用去汙劑(例如Triton X-100)來處理該組織以使膜(membrane)破裂。在這些步驟之後，製備組織切片以用於典型地遵循間接法的抗體治療。該間接法涉及與組織抗原起反應的初級(未標記)抗體以及與初級抗體起反應的次級(標記)抗體。次級抗體通常標記有螢光部分或者酶。IHC是有力的檢測技術並且能夠精確示出給定的蛋白質位於組織樣本的什麼地方。IHC在很多生物學領域中廣泛使用，例如在神經科學中使得研究者能夠檢查在特異大腦結構內的蛋白質表達以及在診斷外科病理學中用於測定腫瘤的類型(例如，癌瘤對黑素瘤)。IHC分析的結果總是為包含特定目標受體的區域以可區別顏色染色的組織切片的圖像。照此，IHC是終點測量，即其僅可能檢測在一個時間點處抗體-抗原相互作用的狀態。IHC也遭受圖像的經常人工解釋；受過訓練的操作者對完全相同組織載片的染色範圍和強度可能有不同看法，導致了在操作者和實驗室之間(across)比較結果時的不確定性。 IHC的另一個主要缺點是不可能在IHC中示出該染色與感興趣的蛋白質相對應。臨床實踐中所使用的 IHC 的描述在由 Press MF,Sauter G.Bernstein L,Villalobos IE,Mirlacher Μ、Zhou JY>Wardeh R、Li YT>Guzman R>Ma Y>Sullivan-Halley J>Santiago A>Park JM> Riva A、 Slamon DJ 在 Clinical Cancer Research 2005 Sep 15; 11 (18): 6598-607 中發表的報告"Diagnostic evaluation of HER-2 as a molecular target: an assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large, prospective, randomized clinical trials」中可獲得，該報告通過引用併入本文。

發明內容
本發明的一個目標是便於固體對象的分析或診斷，其中所述分析包括使用與所述對象上的結構相互作用的一個或多個探針。本發明對於通過使用生物或化學來源的探針來分析生物來源的固體對象而言特別有用。本發明特別涉及一種改進的分析或診斷固體對象的方法。該方法基於實時檢測預定義的探針如何與存在於固體對象上或固體對象中的結構相互作用、與計算所記錄的所述探針的結合曲線就相互作用性質而言如何分布組合。相互作用性質的分布被用作固體對象的指紋，並且所述指紋包含指示固體對象的狀態的不同特徵。對該指紋應用分類算法以自動確定固體對象的狀態。該方法對於像與抗體探針組合的組織切片的固體生物對象而言特別有利，所述抗體識別在所述組織切片上已知在疾病狀態中是過表達的受體結構。該方法因此將通過使用探針如何與固體表面相互作用的信息來定義固體表面而改進通常所執行的分析和診斷過程。因此，在一個方面中，本發明提供了一種能夠將固體對象分類為預定義的類別(諸如惡性/良性、好/壞的治療預測、可接受的/不可接受的質量等)的分析方法。該方法包括提供一種其上附接有固體對象的固體支撐物以及一種包含一個或多個探針的溶液，並且提供對探針與固體對象之間的相互作用的存在的檢測與對探針和固體對象的複合物的形成速率的檢測。來自所述檢測的輸出首先被變換為示出結合的探針量相對於時間的圖表(也被稱為結合曲線)。使用表示探針-對象相互作用的結合曲線，計算相互作用性質的分布。相互作用性質的分布被用作固體對象的指紋，所述指紋攜帶不同特徵， 所述不同特徵對於建立用於將固體對象分類為惡性/良性、好/差的治療預測、可接受的/ 不可接受的質量等等的標準而言有用。在權利要求1中定義了根據本發明的方法。因而，在第一方面中本發明提供了一種用於測量可用於分析或診斷過程中的固體對象的性質的方法，該方法包括提供一個或多個探針，所述探針能夠與所討論的固體對象上的結構相互作用以形成探針-對象複合物；將固體對象附接於固體支撐物；提供感興趣的探針的溶液，使所述溶液與附接於支撐物的固體對象相接觸，檢測探針與固體對象之間的相互作用的存在以及探針-對象複合物的形成速率以形成表示與固體對象結合的探針量隨時間的曲線；用原始(primitive)結合曲線的預定義集合中的所有原始曲線的加權和來逼近所述曲線，計算每個原始結合曲線的權重，從而所述權重使所檢測的結合曲線與加權的原始結合曲線和之間的差異最小化；並且通過使用單獨地或者與另外的數據組合地基於所述權重的標準，將用於分析或診斷過程中的所述固體對象進行分類。在優選的實施例中，本發明包括在不使檢測器與所述固體支撐物相接觸的情況下執行所述檢測。在更加優選的實施例中，所述檢測器是放射性檢測器或者螢光檢測器。適當地，原始結合曲線和對應權重的數量至少是九。在其他實施例中，所述探針選自蛋白質、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和有機化合物，所述探針可能標記有放射性或者螢光部分。此外，所述固體對象可以選自哺乳動物組織或者生物來源的對象。在另外的方面中，本發明提供了一種用於基於來自根據權利要求1中所定義的方法的分析的結果進行診斷的方法。在又另外的方面中，本發明也涉及一種探針的工具包(kit)，所述探針可用於通過使用根據本發明的方法而對固體對象進行質量控制或者診斷。


參考附圖，在下面的示例和描述中將更詳細地公開本發明，在所述附圖中 圖1是本發明的方法的示意性表示；
圖2示出了現有技術中已知的用於執行質量控制方法中的測量的適當器械； 圖3說明了作為相互作用圖的結合曲線的表示；
圖4示出了對於與相同固體對象結合的相似探針所得到的兩個相互作用圖的比較。圖5示出了對於與相似固體對象結合的相同探針所得到的兩個相互作用圖的比較；以及
圖6示出了對於與相似固體對象結合的相同探針所得到的四個相互作用圖的比較。圖7示出了對於與相似固體對象結合的相同探針所得到的六個相互作用圖的比較。
具體實施例方式為了本申請的目的並且為清晰起見，待分析的固體對象附接於固體支撐物，並且被設計為與固體對象上的結構相互作用的預定義探針存在於與所述固體支撐物相接觸的液體中。可能的固體對象包括但不限於組織樣本、嵌入的組織樣本及其部分、細胞、細菌、 病毒、磁粒子、表面塗層(例如塗料)、多細胞有機體(活的或死的)、設計用於植入在有機體中的材料(例如，鈦螺釘、陶瓷板及相似物)或者其任意組合。固體對象薄於10mm，並且典型地薄於1mm。固體對象還具有小於IOOcm2的面積並且典型地所述面積大於Imm2並且小於
610cm2。所述固體對象到所述固體支撐物的附接典型地是牢固的附接，像共價結合的蛋白質、在固體支撐物上生長的粘細胞、或者粘到固體支撐物上的非生物對象(僅舉幾例)。然而，可能使用弱附接的固體對象，其中附接的方法通過例如靜電相互作用、疏水性相互作用以及以高粘性凝膠捕獲固體對象(僅舉幾種可能性)而促成(mediate)。在本發明中所使用的探針必須具有兩個特性性質首先，探針必須附接於在待檢查的固體對象中所搜索的結構或者與該結構相互作用。其次，必須可能以時間分辨的方式檢測到探針與所述固體對象相互作用。用於生物對象的典型探針可以是已知與特定受體特異相互作用的蛋白質，預先已知所述受體在生物對象中的存在指示了疾病。所述探針可以還具有為了簡單地檢測與所述生物對象結合的探針量而附接的螢光標籤(例如，FITC、Cy2、 Cy3, Cy5、德克薩斯紅或任何其他螢光標籤)。用於分析或診斷過程中的可能探針包括但不限於大分子(例如蛋白質、DNA、RNA)、抗體、適體、親和體(affibody)、納米體、肽和其他化學化合物以及任何可以溶解於液體中的種類(species)或者甚至是可以懸浮於液體中的細胞、細胞器、有機體或粒子。關於探針的要求是其可以溶解或懸浮於液體中並且其(在正常重力的影響下)在M小時內不沉澱。探針可以附接有某種標記。適當的標記包括但不限於放射性標記和螢光標記。術語原始結合曲線在本上下文中定義為表示根據預定義相互作用模型進行結合的過程的曲線，給定一些(典型地小於10個)相互作用性質來計算所述原始結合曲線。原始結合曲線族的示例是來自單價相互作用模型的曲線，其中給定結合速率(association rate)常數ka、離解速率(dissociation rate)常數kd和在飽和的固體支撐物處的信號Rmax， 可以計算每個原始結合曲線。本發明還包括一種通過該方法用於分析或診斷過程的探針或固體支撐物的工具包。通常，本發明在其第一方面中基於五個特性成分的規定。這五個方面是 適用於分析或診斷測量的一個或多個探針，可能標記有可檢測的標誌， 待研究的固體對象，
對探針和固體對象之間的相互作用的時間分辨測量，
用於表示時間分辨測量的方法，其中所述表示提供了探針與固體對象的相互作用的本質的多維指紋，
對所述指紋應用分類算法以得到關於對象狀態的陳述。本發明目的尤其(k)是通過為經典的分類算法提供相互作用圖作為輸入來改進對用於分析或者診斷過程中的固體對象的分類。在一些分析或診斷過程中，通過固體支撐物中的相關結構的相對分數(relative fraction)來構成固體對象的有利狀態(例如，可接受的質量或者良性腫瘤)和不利狀態(例如，不可接受的質量或者惡性腫瘤)之間的差異。 在腫瘤學中，已知特定受體的過表達指示疾病，這實際上是細胞的受體過多的相對豐度的變更。在藥物發現中，潛在藥物為了到達細胞內的目標受體而通過細胞膜的輸送是對潛在藥物和用作固體對象的細胞培養物或組織的重要質量度量。在設計用於植入在人類病人中的對象中，被植入的對象的表面應當是生物相容的。在非生物來源的其他對象中，表面多孔性和表面的氧化程度對於對象的質量或性能而言可能是不可缺少的。
儘管本發明被描述為分析探針和固體對象之間的結合事件，但是本發明不一定專門用於該實驗布置(set-up)中。例如，可能使用諸如鉻的痕量元素作為探針。對固體對象中的51Cr的直接、實時的檢測先前已在W02009029039中公開，所述W02009029039通過弓|用併入本文。還可能測量固體對象在探針的影響下的固有來源的事件(諸如固體對象兩端的電阻、阻抗或電容)。例如，可以用作為能量補充的不同糖分子(例如果糖、蔗糖和葡萄糖)的存在來測量單層細胞兩端的阻抗隨時間的改變。在該情況下，單層細胞是固體對象而不同的糖分子是不同的探針。用於分析或診斷目的的方法可以被描述為圖1中所概述的五步驟過程。在第一步驟(110)中，固體對象(112)附接於固體支撐物(113)，並且使溶解於液體中的適當探針
(111)可用。在第二步驟(120)中，使包含探針(111)的液體與固體支撐物(113 )和固體對象(112)相接觸。當液體與固體支撐物(113)相接觸時，測量裝置(121)被激活以便測量已與固體對象(112)結合的探針(111)量。在預定的時間之後，包含探針(111)的液體可以用沒有探針的液體來替代。在第三步驟(130)中，來自測量裝置的讀數被呈現為結合曲線(131)，所述結合曲線將探針和固體對象之間的相互作用的存在和探針-對象複合物的形成速率示出為表示與固體對象結合的探針量隨時間的曲線。在結合曲線(131)中識別探針添加(132)和探針移除(133)的時間點，除非它們是預先已知的。在第四步驟(140)中， 所測量的結合曲線(131)被表達為預定義集合的原始結合曲線之和，每個這樣的原始曲線都被乘以權重以調節不同原始曲線在表示所測量的結合曲線(131)的和中的幅度。因而， 可以由多個權重來表示每個所測量的結合曲線(131)，每個權重與原始曲線相關聯。這樣的權重聚集被稱為權重向量。不同的所測量的結合曲線將被表達為不同的權重向量。在一些情況下，權重向量進而可以被呈現為地形圖，其中三元組(典型地為[結合速率、離解速率、 權重])的表面被繪製為等值線圖(141)。該圖中的每個「山」(142)意味著對應的結合和離解速率值具有提高的權重，這意味著結合曲線(131)部分地由對應的結合和離解速率值的相互作用組成，這進而意味著探針(111)正與具有對應的結合和離解速率值的固體對象
(112)的結構相互作用。在生物對象的情況下，每個探針-受體相互作用將導致至少一個這樣的「山」，並且針對給定的生物對象的這些「山」的位置和相對高度將表示生物對象的受體表達濃度或者狀態。在第五步驟(150)中，所述權重可能與另外的數據(152)—起被饋送到分類算法(151)。分類算法可以是神經網絡、線性判別分類器、支持向量機、k-最近鄰分類器或者任何其他能夠基於輸入數據中的特徵來將所述輸入數據的集合分類為至少兩個不同類別的算法。分類算法(151)的輸出被例示為三個不同類別(153，巧4，155)，這三個類別例如可以表示組織樣本的分類[健康；不確定；疾病]。待檢查的固體對象需要被附接到固體支撐物。附接的方法可以根據固體對象的類型而不同。活的或者新鮮的生物對象可以自發地附著到特定塑料和玻璃表面，但是在一些情況下固體支撐物必須塗覆有特定蛋白質(像纖連蛋白、Concavalin A、聚賴氨酸或者牛血清白蛋白(僅舉幾例))以便於附著。在固體對象是塗料或者其他保護性表面塗層的情況下， 它們典型地是固有粘性的。還有其他的對象可以被粘到固體支撐物。本發明中所使用的固體支撐物是剛性結構，典型地由玻璃或者塑料製成，並且是基本平坦的。通常結合檢測技術來設計支撐物。固體支撐物的示例包括但不限於玻璃載片 (例如顯微鏡載片、顯微鏡蓋載片、覆蓋有被設計用於在表面等離子體共振檢測器中進行檢測的金膜的玻璃載片、具有用於幹涉測量檢測的多個不同折射率的塗層的玻璃載片、以及具有壓印光柵的玻璃載片(僅舉幾例))、透明塑料載片(覆蓋有被設計用於在表面等離子體共振檢測器中進行檢測的金膜的塑料載片、具有用於幹涉測量檢測的多個不同折射率的塗層的塑料載片、以及具有壓印光柵的塑料載片(僅舉幾例))、以及由玻璃或者塑料製成的皮氏培養皿(petri dish)。固體支撐物可以含有涉及檢測原理的特徵，包括(但不限於)薄金層、壓印光柵、嵌入電極以及具有酶活性的表面塗層(僅舉幾例)。有若干可用於對探針和固體對象之間的複合物形成速率以及所形成的複合物量值進行測量的方法。基於表面等離子體共振和相似技術的方法是可用的，如在由Rich RL 禾口 Myszka DG 在 Journal of Molecular Recognition 2007 S印-Oct ； 20 (5) : 300-66 中發表的報告"Survey of the year 2006 commercial optical biosensor literature，，(該報告通過引用併入本文)中所描述的。時間分辨的共聚焦顯微術和相似成像技術是備選方法，如由 Praus Ρλ Kocisova ΕΛ Mojzes P、StepcSnek J、Seksek 0、Sureau F 禾口 Turpin PY 在 Annals of the New York Academy of Sciences 2008; 1 130: 1 17—21 中發表的 艮告「Time-resolved microspectrofluorometry and fluorescence imaging techniques: study of porphyrin-mediated cellular uptake of oligonucleotides.，，(該 艮告通過引用併入本文)中所描述的。用於完成圖1中的步驟120的優選方法先前已被公開 [W02005080967，其通過引用併入本文]並且在圖2中被示意性地描述。簡言之，該方法依賴於被固定於固體支撐物(201)上的定義區域(記為「活性區域」)的固體對象(202)。在相同的固體支撐物上，也有基準區域(在該情況下與活性區域相對)。包含所溶解的探針的液體與固體支撐物相接觸以實現對象和探針之間的相互作用。此外，固體支撐物被傾斜並且使用電動機(203)而被緩慢旋轉。在固體支撐物的提高部分上方，安裝能夠檢測附接到所使用的探針的標記的檢測器(204)。所述檢測器典型地不與固體支撐物相接觸，但是登記例如來自螢光標記的發出的光或者發出的放射性核素輻射。當活性區域通過檢測器時，在配體已與目標結合的情況下將登記提高的信號。對於每次旋轉，可以通過從來自活性區域的檢測信號中減去來自基準區域的檢測信號而計算結合水平值。當從一系列旋轉中收集結合水平值時，得到時間分辨的結合曲線。本發明中的檢測方法可以具有空間解析度。例如，可以在測量的過程期間重複地拍攝固體對象的高解析度數字照片。通過將對象的圖片劃分為不同區域，可能在一次測量中為每個區域得到一個結合曲線。因而，給定空間分辨的檢測裝置，本發明可以不僅應用於整個固體對象，而且還應用於所述對象的選擇部分。當分析薄的組織部分時，空間分辨的檢測對於醫療決定而言特別令人感興趣。取決於解析度，若干不同的組織部分可以以陣列狀結構應用在一個固體支撐物上。由若干原始理論結合曲線之和來表示一個或多個結合曲線可以如圖3中所簡要概述地解釋。給定與圖1中記為141的等值線圖相似的等值線圖(300)，每個「山」指示在所測量的結合曲線(350)中存在與該山相關聯的原始結合曲線。在圖3中，山310具有最高的幅度，如等值線的數字所指示的。因此，對應的原始曲線311是對所測量的曲線(350) 的表示的主要貢獻。山320在幅度上較低，但是還具有較慢的結合速率和較慢的離解速率。 這意味著對應的曲線321的特性形狀對於探針攝取和探針離解而言都較慢。在所測量的曲線(350)的表示中，原始曲線321是小貢獻。山330和340分別具有對應的原始曲線331和
9341，並且這些如上所述地被添加到所述表示。因而，由形成等值線圖300的基礎的所有原始曲線之和來表示所測量的曲線350，其中所有權重都是小的，除了根據相互作用圖300被加權的原始曲線311、321、331和341之外。圖 3 中所概述的表示的背景在由 Svitel J、Balbo A、Mariuzza RA, Gonzales NR
P 在 Biophys J. 2003 Jun ； 84 (6) 4062-77 中發表的報告 「Combined affinity and rate constant distribution of ligand populations from experimental surface binding kinetics and equilibria. 」(該報告通過引用併入本文)中關於光學生物傳感器進行了討論。該想法類似將任何曲線表達為正交多項式之和，更被稱為基交換(exchange of base)。在本發明的情況下，原始結合曲線典型地選自單價相互作用的類別。可以解析地表達用於這樣的相互作用模型的理論結合曲線，如由Khomyakova E、Livshits MA、 Steinhauser MC、Dauphinot L、Cohen-Kaminsky S、Rossier J、Soussaline F、Potier MC 在 Biotechniques 2008 Jan; 44(1) 109- 17 中發表的報告 「On-chip hybridization kinetics for optimization of gene expression experiments. 」(該 艮告通過弓I用併入本文)中所描述的。在其中一種已知濃度的探針在時間點tass處被添加並且在時間點tdiss處用沒有探針的液體來替代的探針-固體對象相互作用的情況下，可以根據以下來描述理論單價相互作用模型
對於 t<tass，Y=O
對於 tass ( t<tdiss，Y=Rmax^C/ (C+kd/ka) * (1-EXP (- (ka*C+kd) * (t-tass)) 對於 t 彡 tdiss，Y=RfEXP (-kd*(t-tdiss))
其中Rmax是當固體對象上的所有可能的結合部位都具有與其結合的探針時得到的信號，ka是相互作用的結合速率常數，kd是相互作用的離解速率常數，R0是在時間tdiss時的Y 值。三個參數是預先已知的tass是探針添加的時間，tdiss是探針移除的時間，而C是探針的濃度。然而，原始結合曲線可以選自任何其他類別的相互作用模型，包括(但不限於)具有對擴散限制的校正(也稱為對質量(mass)輸送限制的校正)的單價相互作用模型、具有對由於與固體對象的相互作用導致的探針耗盡的校正的單價相互作用模型、以及二價相互作用模型。在其中使用不與固體對象相互作用的探針(例如，痕量元素)來做出對固體對象狀態的測量的情況下，可以使用其他曲線作為原始曲線，諸如在有或者沒有探針的主動輸送 (例如通過細胞膜中的流入泵和流出泵)的情況下進入固體對象的不同區室的被動擴散。在其中沒有使用探針來做出對固體對象狀態的測量的情況下，可以使用還有其他曲線作為原始曲線。在所有情形下，所有類別的原始曲線典型地具有小於10個自由參數(例如，在擴散進入不同區室的情況下的擴散常數和區室體積)。可能例示使用根據理論單價相互作用模型的原始曲線來表示所測量的結合曲線 (131)。隨後通過作為各自乘以對應的權重Wi (i=l..n)的若干理論曲線^ (i=l..n)之和的Yhat來逼近所測量的曲線131，其中η是在逼近中所使用的預定義[ka，kd]值的總數。Yhat=2i=l5n (Wi^Yi)
其中對於任意Rmax>0 (典型地選擇為Rmax=I), Yi=Y(kai, kdi)。權重Wi被選擇為使成本函數的值最小化。普遍的成本函數是平方殘差之和，其是通過首先從所測量的結合曲線(131)中減去Yhat、隨後計算每個殘差元素的平方並且最後將所有平方殘差元素求和來計算的。當Yhat接近類似所測量的結合曲線(131)時，平方殘差之和的值將是小的。有用於通過使成本函數的值最小化來找出權重Wi的自動方法。一種這樣的可能方法是通過 Marquardt-Levenberg 的方法，如由 Carrot C、Guillet J、May J-F 禾口 Puaux J-P 在 Macromolecular Theory and Simulations 1 (4):215 - 231 ， 2003 中發表的 艮 1Pf"Application of the Marquardt-Levenberg procedure to the determination of discrete relaxation spectra"(該報告通過引用併入本文)中所描述的。其他的可能方法包括但不限於單純性優化、基因算法和基於梯度的優化算法。當計算了權重時，也許可能以三維圖繪製權重。典型地，離解速率常數被指定為X 軸而結合速率常數被指定為y軸。在ζ方向上把權重繪製為其中使用例如從紅到藍的梯度來表示權重值的比色圖或者繪製為很像是地形圖的、其中用等權重水平線來示出較高權重的等值線圖(141)。因而，所測量的結合曲線(131)的該示例性表示通過使用根據理論單價相互作用模型的原始曲線，在逼近中使用[ka，kd]的預定義值的多個權重。在一些情況下，優化問題可能是欠定的(under-determined)，即可能有產生等於所測量的結合曲線(131)的Yhat的^的若干不同集合。在該情況下，優選的是在搜索使 Yhat和所測量的結合曲線(131)之間的差異最小化的Wi的集合時應用正則化算法(例如 Tichonov正則化)。簡言之，正則化算法對導致朝向具有最少數量的大Wi的解(這也將是最簡單的可能解)收斂的、具有高方差的Wi的集合添加懲罰。當把相互作用圖用於不同固體對象和/或不同探針的比較時，在針對經受比較的情形來計算相互作用圖時使用原始曲線的相同預定義集合可能是重要的。在針對經受比較的情形來計算相互作用圖時把相同的初始值用於最小化算法也可能是重要的。使用本發明的方法的益處是很多探針-對象相互作用具有異源本質，並且異源性照此包含關於相似結構在固體對象中的分布的信息。例如，在固體對象是組織切片的情況下，組織中的癌細胞可以大量地表達特定受體而在該受體的胺基酸序列中有突變。為這樣的受體所選擇的探針可以是標記有螢光部分的單克隆抗體。抗體與癌細胞的突變受體的相互作用將很可能不同於與自然受體的相互作用。因為組織切片可能包含癌細胞和正常細胞兩者，所以所測量的結合曲線將反映與突變體的相互作用和與正常受體的相互作用兩者， 並且因此在三維的權重圖中導致兩個峰。兩個峰的相對高度將進一步指示突變體和正常受體的相對數目。基本上，本發明使得可能針對例如癌症發展和治療而測量重要蛋白質的基因變異的濃度。這可以形成測量以下的基礎用於治療的藥物形式的個人化藥品的生物標誌，或者用於在個體病人中進行活體成像的標記分子。例如，使用已知用來識別在疾病狀態中已知是過表達的受體結構的抗體探針來分析來自病人的組織將產生進而可以用於對組織進行分類的權重向量，這實現對所述疾病的狀態做出決定。在細胞生長控制系統中的蛋白質的基因突變對於癌症的發展而言是重要的。例如，表達蛋白質P53的基因中的基因突變在很多癌症中是普遍的。蛋白質的改變的其他示例是轉譯後修飾(例如，蛋白質的糖基化(僅舉一個示例))，其導致可以具有顯著生物學重要性的密切相關分子。這樣的修飾非常難以分析，並且質譜分析法是當前用於這樣的任務的一種可能技術。可以使用抗體技術來檢測突變和轉譯後修飾，但是抗體技術首先需要精確了解要檢測哪種突變/轉譯並且其次需要發展具有非常高特異性和在密切相關抗原之間的大親和性差異的抗體。發展這樣的抗體是困難的。本發明使得可能識別固體對象上或固體對象中的諸如突變蛋白質的密切相關結構。可以使用與具有不同動力性質的密切相關結構(例如，具有不同突變的受體(僅舉一個示例))結合的探針，因為時間分辨的檢測與基於加權原始曲線之和的指紋組合可以用於識別固體支撐物中的結構以及對這些結構的量進行量化。這樣定義的探針更容易發展，因為與對基於終點化驗相比，對多個結合結構之間的差異的要求較不嚴格。也可以通過使用親和性提純的多克隆抗體探針來識別固體對象上或固體對象中的諸如突變蛋白質的密切相關結構。多克隆抗體是從免疫的動物血清中提純的並且因此典型地包含結合於免疫原的不同免疫原表面的若干不同抗體，因此標記(notation)是多克隆的。在組特異配體或者抗原本身上可以將這樣的多克隆抗體提純為不同的程度，諸如免疫球蛋白片段或者親和性提純的製劑。在使用多克隆抗體作為探針時，相互作用將是固有異源的，但是儘管利用不同機制，所有探針都與相同受體表面結構相結合。因為依賴於不同機制的若干相互作用中的僅一種由於受體結構的改變而需要變更，所以在使用多克隆抗體探針時，將檢測到受體結構的小改變(例如，突變、構型改變、轉譯後修飾、磷酸化(僅舉幾個改變固體表面的分子結合性質的修飾))的可能性因此較高。一個或若干「山」的指紋的這樣的改變可以與分子性質或者治療效果的臨床預測或者對用於活體診斷成像方法的分子的選擇都相關。還可能通過混合大量已知或者未知的同源探針，例如通過混合已知與相同受體結合的五個單克隆抗體或者通過在生成人造結合劑(binder)時在搖拍(panning)過程中保持多個潛在結合劑(例如在噬菌體顯示和相似方法中)，來模擬多克隆抗體探針的性質。在這樣的混合物中可以使用其他類型的分子，諸如部分抗體、scFv、納米體、親和體、適體、肽或者任何其他可以結合的分子。現在，在細胞中的DNA或者RNA水平上檢測基因多樣性。使用定量的聚合物鏈反應 (polymer chain reaction，PCR)技術和相關方法，可能以高靈敏度檢測這樣的分子種類。 然而，RNA的細胞含量不是對蛋白質濃度的完美鏡像，如由Ellmark P、ffigerkorp CM, Ek S、Belov L、Berglund Μ、Rosenquist R、Christopherson RI 禾口 Borrebaeck CA 在 Cancer Letters 28; 265(1) :98- 106，2008 中發表的報告 「Phenotypic protein profiling of different B cell sub-populations using antibody CD_microarrays，，(i亥 艮告通過引用併入本文)中所討論的。也可以確定感染原，例如在重要病毒定義的蛋白質中有突變的病毒株。本發明通過使用以由經常突變基因所表達的蛋白質的可變區域為目標的探針而具有檢測這樣的差異的可能性。作為用於在相關結合或者調節部位中識別不同結合性質的探針， 在細胞網絡中所識別的相互作用分子是非常有用的。可以使用具有兩個或更多結合部位的任何探針，並且由於抗體親抗原性 (avidity)效應，本發明使得可能在通過一個、兩個或更多結合部位所結合的結構之間進行區分。使用雙或多功能探針的可能性特別令人感興趣。雙功能探針可以與形成複合物的分子上的兩個獨立結合表面相結合，而多功能探針可以與多於兩個獨立結合表面相結合。因為本發明使得可能識別單價和二價結合的貢獻，所以可能量化緊密分布物質的含量。這是特別令人感興趣的，因為很多生物控制路徑是所形成的分子複合物的後果。
12
當以具有小差異的結構為目標時，等值線圖中的兩個山可能重疊。在該情況下，在提高的溫度下(例如，在37°C下而非在室溫下)執行測量可能是有利的，因為探針-結構相互作用的熱力學性質在過多的不同結構之間可能不同。另一個可能性是在不同環境中執行測量以便分離通常重疊的山。先前已知的是，化驗環境的小改變可以影響一個探針和相似結構之間的相互作用，如由 Andersson K、Choulier L、Hamalainen MD、van Regenmortel ΜΗ、Altschuh D 禾口 Malmqvist M 在 Journal of Molecular Recognition 14(1): 62—71 ， 2001 中發表白勺"Predicting the kinetics of peptide-antibody interactions using a multivariate experimental design of sequence and chemical space" (giMii弓丨用# 入本文)中所報告的。因此，通過適配測量的化學環境，重疊的山可以變得分離，這進而可以改進測量的分析質量。相同的推理也適用於其中使用多於一個探針以及兩個探針與具有相似相互作用性質的它們相應目標相互作用的情況。本發明使得可能使用不同探針的混合物。在該情況下，每個個體探針將具有定義的結合性質，並且將因此以獨特的方式對與固體對象上的結構的相互作用做出貢獻。這使得可能復用該測量。通過使用可以從不同標記(例如，用於不同放射性核素的不同能量或者用於螢光標記的不同發射波長(僅舉幾例))中分離所測量信號的檢測器，可以實現可觀的復用。因為每個探針在其與固體支撐物上的結構的結合性質方面是預定義的，所以即使探針與其他標記分子相混合也可以被識別以及其對固體支撐物上的反應的貢獻。在該情況下，可以確定固體對象上的和探針混合物中的結構的相對比例。當混合物含有非特異吸附於任何結構的物質並且其中吸附過程在時間分辨的性質上可以被分離時，這是特別相關的。本發明也允許例如通過使用酶基底作為探針來測量固體對象中或固體對象上的酶活性。在其中基底具有定義的性質並且所形成的酶產物與固體對象上的或者緊密靠近固體對象的結構結合的情況下。這對於作為固相上的結構的功能酶可以是有效的。如果使用酶來檢測雙功能探針的結合，其組合具有定義的性質的結合以及通過增加的信號生成所進行的結合的酶擴增。這樣的所形成的酶產物可以是具有錨定於表面的標記的聚合物的形成物或者不溶性產物以保持產物緊密靠近固相上的結構。示例 1
在以下示例中，示出的是應用於相同固體對象上的探針的小差異可以導致不同的相互作用圖。使用HNSCC (頭頸鱗癌)細胞系SCC-9 (取自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection))作為固體對象。簡言之，在含有5% CO2的加溼空氣的大氣中在37°C下在完全培養基(complete medium)中培養SCC-9細胞。該示例中的兩個探針是使用螯合劑CHXA』 』-DTPA而標記有1Mn或者mLu的抗體cMAb U36。SCC-9細胞以適於在 LigandTracer Yellow (瑞典烏普薩拉的Ridgeview Instruments AB)中測量的方式生長在塑料皮氏培養皿上，將放射性標記抗體(1_15μ g)添加到培養皿，並且開始測量。在所有情況下，在存在抗體的情況下跟蹤(follow)結合曲線至少四個小時，並且在一些情況下將液體替換為純介質以跟蹤相互作用的洗出階段(wash-out phase)。關於細胞培養、抗體標記、LigandCurver Yellow設置和其他實際問題的詳細說明在由Nestor M、Andersson K、 Lundqvist H在 Journal of Molecular Recognition 2008 May-Jun ； 21 (3): 179—83 中發表白勺題為"Characterization of 111In and 177Lu-Iabeled antibodies binding to CD44v6using a novel automated radiommunoassay.，，的 艮告(該 艮告通過弓I用併入本文)中可獲得。圖4示出了所測量的與SCC-9對象結合的U36-mh (410)和U36_mLu (460)探針的結合曲線。在U36-mIn (410)的情況下，以不同的U36-mh濃度來記錄5個個體曲線: 1 μ g/ml (411)，15μ g/ml (412)，10 μ g/ml (413)，5μ g/ml (414)和 5μ g/ml (415)。此夕卜， 測量415含有洗出階段，其中在特定時間點處移除探針並且測量探針的釋放。在U36-mLu (460)的情況下，以不同的U36-mLu濃度來記錄5個個體曲線15 μ g/ml (461), 10 μ g/ml (462)，5 μ g/ml (463)，1 μ g/ml (464)禾口 5 μ g/ml (465)。此外，測量 465 含有洗出階段， 其中在特定時間點處移除探針並且測量探針的釋放。在圖4中的兩幅結合曲線圖中，為了增強可視性，在y方向上移位了個體所測量的曲線。此外，示出了所測量的曲線(噪聲線)和以求和的原始曲線(平滑線)的表示兩者。所測量的結合曲線被導入到MATLAB 6. 5 (麻薩諸塞州內蒂克的Mattiworks)中，並且使用平方殘差之和成本函數以及單純形優化方法來計算針對屬於單價相互作用族的720 個不同原始曲線的權重。以χ軸上的離解速率常數kd的對數、y軸上的結合速率常數ka的對數以及作為ζ軸的權重值(示為等值線)，將所得到的權重繪製為等值線圖。U36-mIn(416) 的等值線圖不同於U36-mLu (466)的等值線圖，特別是在-5<logl0 (離解速率)<_3的區域中。U36-mIn (416)具有幾個IoglO (離解速率) -4. 2的高山，而U36_mLu (466)具有IoglO(離解速率) -3.5至-4的零星山。這說明了即使不用分類算法，探針設計中的小差異也是可見的。示例 2
在以下示例中，示出的是固體對象中的小差異可能在應用相同探針時導致不同的相互作用圖。使用細胞系SKBR-3和SK0V-3 (取自美國模式培養物保藏所)作為固體對象。簡言之，在含有5% CO2的加溼空氣的大氣中在37°C下在完全培養基中培養這些細胞。該示例中的探針是標記有螢光標誌AlexaFluo488的抗體曲妥單抗(trastuzumab)。已知曲妥單抗與受體HER2相結合，並且已知細胞系SK0V-3和SKBR-3表達這樣的受體。細胞以適於在 LigandTracer Green原型(瑞典烏普薩拉的Ridgeview Instruments AB)中測量的方式生長在塑料皮氏培養皿上。在短基線讀取之後，將螢光標記的抗體添加到培養皿，並且開始測量。在所有情況下，在存在抗體的情況下跟蹤結合曲線至少一個小時，在此之後將液體替換為純介質以跟蹤相互作用的洗出階段。所得到的結合曲線被導入到MATLAB中並且如示例1 中所述地處理。所得到的曲線和等值線圖示於圖5中。圖510示出了所測量的SKBR-3細胞上的曲妥單抗-HER2的結合曲線(噪聲曲線)以及表示所測量的曲線的原始曲線之和(平滑曲線)。在等值線圖520中示出了在原始曲線之和中所使用的權重。在圖520中看到兩個主要山，一個表示強相互作用(521)而一個表示弱且快速離解的相互作用(522 )。還看到幾個低山(523)，但是山523的低量值使得它們較不重要。圖550示出了所測量的SK0V-3細胞上的曲妥單抗-HER2的結合曲線(噪聲曲線) 以及表示所測量的曲線的原始曲線之和(平滑曲線)。在等值線圖560中示出了在原始曲線之和中所使用的權重。在圖560中看到兩個主要山，一個表示強相互作用(561)而一個表示弱且快速離解的相互作用(562)。還看到幾個低山(563)，但是山563的低量值使得它們較不重要。
當比較圖520和560時，主要峰處於略為不同的位置。SKBR-3的強成分(521)具有比SK0V-3的強成分(561)更高的結合速率。此外，較弱的成分具有大約相同的親和性，但是與SK0V-3弱成分(562)相比，SKBR-3 (522)弱成分具有更快開-快關特性。這樣的微妙差異可能是由於細胞膜中的總受體環境或者是由於不同細胞類型中的同和異二聚化(homo and heterodimerization)平衡的變更。還應當注意，SKBR-3得自乳腺癌腫瘤，而SK0V-3 得自卵巢癌腫瘤，這可能影響HER2受體的表達模式和轉譯後修飾路線。在該示例中對所選擇的探針的HER2響應的差異可以具有臨床後果。在該情況下， 通過首先為未知的固體對象確定兩個主要峰的位置並且其次將所檢測的峰位置與預定義位置的集合相比較(每個預定義位置都與所建議的臨床後果相關聯)，將決定最優劑量或者治療或者其他臨床後果。示例 3
在以下示例中，示出的是固體對象中的小差異可能在應用相同探針時導致不同的相互作用圖。使用細胞系SKBR-3和A431 (取自美國模式培養物保藏所)作為固體對象。簡言之，在含有5% CO2的加溼空氣的大氣中在37°C下在完全培養基中培養這些細胞。該示例中的探針是標記有碘125的表皮生長因子(EGF)。EGF是表皮生長受體(EGFR)的配體。 已知A431表達大量的EGFR，而SKBR-3可以表達EGFR但是程度顯著更低。細胞以適於在 LigandTracer Grey (瑞典烏普薩拉的Ridgeview Instruments AB)中測量的方式生長在塑料皮氏培養皿上。在短基線讀取之後，將InM放射性標記EGF添加到培養皿，並且開始測量。在所有情況下，在存在放射性標記EGF的情況下跟蹤結合曲線約一個小時，在此之後將液體替換為純介質以跟蹤相互作用的洗出階段。所得到的結合曲線被導入到MATLAB中，並且如示例1中所述地處理。對於細胞系A431和SKBR-3兩者都將這些測量執行兩次。所得到的等值線圖示於圖6中。等值線圖610示出了來自A431測量之一的相互作用圖。該相互作用證明具有複合物本質，因為7個主要山被識別，如虛線圈(611)所指示的。對應的結合曲線619示出了所記錄的結合信號約為160計數每秒(CPS)。使用新的A431細胞培養皿來重複該測量，這導致等值線圖620，其中七峰模式是可見的(由虛線圈621所突出顯示)。等值線圖630示出了來自於SKBR-3測量之一的相互作用圖。沒有清晰表明所記錄的相互作用相似於A431細胞的相互作用，因為找不到七峰模式。對應的結合曲線639具有約30CPS 的結合水平。對結合於SKBR-3細胞的放射性標記EGF的第二測量導致等值線圖640，其也沒有七峰模式。因為公知A431細胞表達EGFR至高程度，所以導致圖610和620中的七峰模式的大記錄結合信號可能指示強EGF-EGFR相互作用。已知不表達大量EGFR (如果有的話)的其他細胞系SKBR-3示出了低得多的記錄信號以及明顯不同的等值線圖(630，640)， 導致如下結論放射性標記EGF以完全不同於針對A431上的EGFR的方式與SKBR-3上的少量EGFR相結合，或者放射性標記EGF與SKBR-3細胞表面上存在的其他東西相結合。示例 4
在以下示例中，示出的是固體對象中的小差異可能在應用相同探針時導致不同的相互作用圖。使用細胞系A431(取自美國模式培養物保藏所)作為固體對象。簡言之，在含有5% CO2的加溼空氣的大氣中在37°C下在完全培養基中培養這些細胞。這些細胞在三個不同條件下生長完全細胞培養介質(HAMS-F10+10%胎牛血清)、補充有葡萄糖(lg/L)的完全細胞培養介質、以及沒有FCS (胎牛血清)的細胞培養介質。該示例中的探針是標記有碘125的
15抗體西妥昔單抗。已知西妥昔單抗與受體EGFR相結合，並且已知A431細胞表達這樣的受體。細胞以適於在LigandTracer Grey (瑞典烏普薩拉的Ridgeview Instruments AB)中測量的方式生長在塑料皮氏培養皿上。在短基線讀取之後，將4. 4nM放射性標記西妥昔單抗添加到培養皿中，並且開始測量。在所有情況下，在存在放射性標記西妥昔單抗的情況下跟蹤結合曲線約兩個小時，在此之後將液體替換為純介質以跟蹤相互作用的洗出階段。所得到的結合曲線被導入到MATLAB中，並且如示例1中所述地處理。對每種生長條件都將這些測量進行兩次。所得到的等值線圖示於圖7中。示意圖700示出了相互作用圖中的三個區域，其中西妥昔單抗-EGFR相互作用導致主要山。區域701對應於具有約10分鐘壽命的快速相互作用成分。區域702對應於慢(S卩，很多小時)且強的成分。區域703表示需要更高的探針濃度以可見(在與701和702相比時)的弱成分。其他六個相互作用圖包含來自具有在完全細胞培養介質中培養的A431細胞的兩個獨立測量的結果(710和711)、來自具有在補充有葡萄糖的完全細胞培養介質中培養的A431細胞的兩個獨立測量的結果(720和 721)、以及來自具有在無胎牛血清的細胞培養介質中培養的A431細胞的兩個獨立測量的結果(730和731)。具有完全介質的相互作用(710，711)在所有三個區域(701，702，703)中都具有山。區域702和703中的山具有大約相同的量值，而區域701中的山較不突出。具有葡萄糖補充的介質的相互作用(720，721)在區域702和703中具有山。區域702中的山具有比區域703中的山更高的量值。具有飢餓(starvation)介質的相互作用(730，731)也在區域702和703中具有山，但是區域703中的山具有比區域702中的山更高的量值。因而，通過使用相互作用圖，可能在相似的固體對象之間進行區別。還可能相互作用圖揭示可能令人感興趣的生物信息。例如，已知EGFR受體在細胞膜中與其自身(同二聚體)和與相關受體(異二聚體)都形成二聚體。一種假設是三個區域701、702和2703實際上表示單體 EGFR、同二聚體EGFR和異二聚體EGFR。 儘管關於構成當前對發明人已知的最好模式的本發明優選實施例描述了本發明， 但是應當理解，在不脫離如此處所附權利要求所闡述的本發明的範圍的情況下，可以做出如對本領域的普通技術人員將顯而易見的各種改變和修改。
權利要求
1.一種用於對能用於分析或診斷過程中的固體對象的性質進行測量的方法，所述方法包括提供一個或多個探針，所述探針能夠與所討論的固體對象上的結構相互作用以形成探針-對象複合物；將所述固體對象附接於固體支撐物； 提供感興趣的探針的溶液；使所述溶液與附接於所述支撐物的所述固體對象相接觸，檢測探針與固體對象之間的相互作用的存在以及探針-對象複合物的形成速率，以形成表示與所述固體對象結合的探針量隨時間的曲線；用原始結合曲線的預定義集合中的所有原始曲線的加權和來逼近所述曲線， 計算每個原始結合曲線的權重，從而所述權重使所檢測的結合曲線與加權的原始結合曲線和之間的差異最小化；並且通過使用單獨地或者與另外的數據組合地基於所述權重的標準，將用於分析或診斷過程中的所述固體對象進行分類。
2.根據權利要求1所述的方法，其中在不使所述檢測器與所述固體對象相接觸的情況下執行所述檢測。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測器是放射性檢測器或者螢光檢測器。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中原始結合曲線和對應的權重的數量至少是九。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中用於檢測溶液中的探針和固體支撐物上的固體對象之間的相互作用的方法還包括使所述固體對象固定在所述固體支撐物的選定部分上； 在執行所述測量之前，減少覆蓋所述支撐物的選定部分的溶液量； 對所述支撐物的其中沒有發生相互作用的部分執行基準測量。
6.根據權利要求5所述的方法，其中計算檢測和基準測量之間的差異。
7.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述固體支撐物是能夠容納在其邊界內限定的溶液的基本平坦的培養皿。
8.根據任一權利要求5所述的方法，其中通過使所述支撐物以偏離水平的角度定向以提供所述支撐物的提高部分和下部分從而所述提高部分將比所述下部分由更少的溶液覆蓋，來實現溶液量的減少，並且其中所述支撐物以預定的旋轉速度來旋轉。
9.根據任一前述權利要求所述的方法，其中以諸如放射性標誌或者螢光標誌的標誌來標記所形成的複合物的一個構件。
10.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述探針選自蛋白質、DNA、RNA和有機化合物，所述探針可能標記有放射性或者螢光部分。
11.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述固體對象選自哺乳動物組織或者生物來源的對象。
12.—種診斷方法，包括執行根據權利要求1所述的方法，其中所述固體生物對象是與蛋白質探針組合的組織切片，所述蛋白質識別在所述組織切片上已知在疾病狀態中是過表達的受體結構，並且其中所述分類的結果用於做出對所述疾病的狀態的決定。
13. —種工具包，包括能用於通過根據權利要求1所述的方法對固體對象進行質量控制或者診斷的探針。
全文摘要
本發明涉及一種分析或診斷固體對象的方法。該方法基於實時檢測預定義的探針(111)如何與存在於固體對象(112)上或固體對象(112)中的結構相互作用、與計算所記錄的所述探針的結合曲線(131)就相互作用性質(141)而言如何分布組合。相互作用性質被輸入到自動確定固體對象的狀態的分類算法(151)。該方法對於像與抗體探針組合的組織切片的固體生物對象而言特別有利，所述抗體識別在所述組織切片上已知在疾病狀態中是過表達的受體。
文檔編號G01N33/48GK102216772SQ200980146162
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月8日 優先權日2008年9月19日
發明者K·愛迪生, M·馬爾姆奎斯特 申請人:裡奇維尤儀器股份公司