流感治療劑的製作方法

2023-04-29 17:21:06

專利名稱：：流感治療劑的製作方法
技術領域：
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背景技術：
：流感是在世界範圍內最廣泛傳播的感染之一。在美國，每年2萬與4萬之間的人死於流感A病毒感染或其併發症。據估計，在1918年流感A病毒大流行期間，有2千萬到4千萬人死亡。在流行病流行期間，流感相關的住院數量單在冬季就可超過300,000例。流感病毒的流行病學成功歸因於幾個特性。首先，流感病毒容易通過浮質在人與人之間傳播(飛沫感染)。其次，流感病毒抗原頻繁發生細小變化(抗原漂移(antigenicdrift))以致病毒很容易逃脫通過先前對病毒的不同變異體的暴露而誘導的保護性免疫作用。再次，通過不同菌株之間遺傳物質的重配或混合(抗原轉變(antigenicshift))可容易地產生流感病毒新菌株。在流感A病毒的情況下，所述混合可在侵襲不同物種的亞型或菌株之間發生。1918年的大流行被認為是由豬與人類流感A病毒之間的重配所產生的病毒的雜交菌株而引起。儘管已做出不懈努力，但是仍沒有用於流感病毒感染的令人滿意的療法，並且現有疫苗在部分程度上由於上述抗原轉變和漂移的特性而使得價值有限。為此，流感A病毒的全球監視已進行多年，並且美國國家衛生研究院將其稱作生物防禦的最高優先級病原體之一。儘管基於失活病毒的當前疫苗能夠在大約70-80％的65歲以下的健康個體中預防疾病，但是所述百分比在老年人或免疫功能不全的人中遠遠更低。另外，與疫苗投與相關的費用和可能的副作用使所述方法並非最佳。儘管當前美國所批准的4種用於治療和/或預防流感的抗病毒藥物是有幫助的，但是由於涉及副作用、順應性和可能出現抗性菌株，所以其使用受到限制。因此，仍需要研發用於治療和預防流感病毒感染的有效療法。
發明內容本發明提供用於治療呼吸道病毒感染，例如由A型、B型和/或C型流感病毒所引起的流感病毒感染的新穎組合物和方法。所述組合物和方法是基於RNA幹擾(RNAi)。RNAi是一種保守細胞方法，其中含有與標靶RNA互補的部分的雙鏈RNA的存在以序列特異方式抑制標靶RNA的表達。抑制可通過分裂標靶或抑制其翻譯而引起。與現行流感治療劑相比，本發明的RNAi誘導實體抑制流感病毒轉錄本的表達並因此防止病毒蛋白質合成。這代表一種控制流感病毒感染的根本性的新方法。本發明提供靶向一種或一種以上涉及病毒RNA的病毒產生、複製、感染和/或轉錄等的標靶轉錄本的RNAi誘導劑，諸如短幹擾RNA(siRNA)和短髮夾式RNA(shRNA)分子。另外，本發明提供載體，其在細胞中的存在產生一個或一個以上RNA的轉錄，所述RNA彼此雜交或自身雜交以形成siRNA或shRNA，所述siRNA或shRNA抑制涉及病毒mRNA的病毒產生、病毒感染、病毒複製和/或轉錄等的至少一個標靶轉錄本的表達。優選地，病毒是呼吸道病毒。優選病毒是RNA病毒。RNA病毒包括正鏈病毒和諸如流感病毒的負鏈RNA病毒。病毒基因組可以是分節的或不分節的。根據本發明的某些實施例，標靶轉錄本編碼選自由以下蛋白質組成的群組的蛋白質聚合酶、核衣殼蛋白質、神經氨酸酶、血球凝集素、基質蛋白質和非結構蛋白質。在特定實施例中，標靶轉錄本編碼選自由以下蛋白質組成的群組的流感病毒蛋白質血球凝集素、神經氨酸酶、膜蛋白質1、膜蛋白質2、非結構蛋白質1、非結構蛋白質2、聚合酶蛋白質PB1、聚合酶蛋白質PB2、聚合酶蛋白質PA、核蛋白NP。本發明也提供包含RNAi誘導劑和/或載體(例如本文中所述的RNAi誘導劑和/或載體)的組合物，其中所述組合物另外包含促進RNAi誘導劑或載體的傳遞的遞送劑。優選遞送劑包括陽離子聚合物。本發明另外提供治療或預防病毒性疾病，尤其由呼吸道病毒引起的疾病(例如，流感)的方法，所述方法是通過在暴露至病毒之前，在發生暴露的同時，或在暴露之後，在適當的時間窗內，或在受檢者表現出由病毒引起的疾病的症狀期間的任何點時，將包含RNAi誘導實體的本發明組合物投與受檢者來進行。可通過各種途徑投與組合物。優選途徑包括靜脈內，或通過吸入直接進入呼吸系統中，鼻內，氣溶膠形式等途徑。本發明提供表示作為RNAi優選標靶的流感病毒轉錄本的部分的核酸序列。某些優選標靶部分是RNAi的功能優選標靶。某些優選標靶部分在多種變異體之間是適當保守的，以便基於特定變異體所設計的RNAi誘導劑也將抑制其對應標靶部分的序列不同的變異體。某些優選標靶部分在多種變異體之間是高度保守的。本發明提供核酸，其包含一個或一個以上優選標靶部分，其互補體，和任一者的片段。本發明另外提供為RNAi誘導實體的核酸，例如靶向所述標靶部分中的一個或一個以上部分的RNAi誘導劑和RNAi誘導載體。在優選實施例中，RNAi誘導實體靶向NP、PA、PB1或PB2基因。本發明提供靶向某些優選靶向部分的高度有效的RNAi誘導實體。所述高度有效的RNAi誘導實體可特別適用於治療或預防流感病毒感染。具體來說，本發明提供靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導劑，其中所述RNAi誘導劑包含核酸部分，其序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列、其互補體、或任一具有至少15個核苷酸長度的片段。本發明另外提供靶向選自由以下基因組成的群組的流感病毒基因的RNAi誘導劑聚合酶蛋白質PB1基因、聚合酶蛋白質PB2基因、聚合酶蛋白質PA基因和核蛋白NP基因。本發明也提供分離核酸或其互補體，其序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列，或包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列具有至少15個核苷酸長度的片段，其中所述核酸具有100個或100個以下核苷酸長度。在某些實施例中，長度是至少16個核苷酸。本發明提供診斷病毒感染和確定懷疑具有病毒感染的受檢者是否受特定類型的病毒、菌株等感染的方法。在某些實施例中，所述方法包含確定受檢者是否受易感於本發明RNAi誘導實體中的一種或一種以上實體的抑制作用的流感病毒感染。在一個優選實施例中，患者經診斷具有流感病毒感染，並且投與靶向感染受檢者的特定流感菌株的RNAi誘導實體。本發明因此提供流感診斷和治療的結合方法。某些診斷方法使用一種或一種以上本發明核酸。本發明也提供用於檢測流感病毒感染和/或確定流感病毒是否易感於RNAi誘導實體的抑制作用的診斷試劑盒。試劑盒可包含一種或一種以上本發明核酸和/或用於檢測流感病毒轉錄本的優選靶向部分的探針或引物。本發明另外提供將RNAi誘導實體傳遞到哺乳動物受檢者的呼吸道中的方法。本發明者已經發現，當直接傳遞到哺乳動物受檢者的呼吸道中時，RNAi誘導實體可有效抑制肺中的基因表達。本發明者已進一步發現，可使用常規體積和投與方法，將諸如siRNA的RNAi誘導劑直接傳遞到哺乳動物受檢者的血管系統中，並且可有效抑制呼吸系統中的基因表達，例如肺中的基因表達。舉例而言，靶向流感病毒轉錄本的siRNA在通過靜脈內或吸入途徑被傳遞到小鼠中時，抑制肺中的流感產生，表明可通過任何方法實現呼吸系統中基因表達的治療有效抑制。另外，靶向螢光素酶轉錄本的siRNA在通過吸入或者靜脈內途徑被投與給表達螢光素酶的小鼠中時，抑制螢光素酶表達，表明可使用所述的任何一種方法來抑制基本上任何基因的表達。靶向內源性基因的siRNA在通過吸入傳遞時，也有效抑制在肺中的表達。本發明因此提供允許使用RNAi治療侵襲呼吸系統的廣泛範圍的疾病的方法，所述疾病包括由呼吸道病毒引起的感染。也可使用血管內傳遞的方法來將有效量的RNAi誘導劑傳遞到肺以外的器官或組織中。一個方面，本發明提供抑制轉錄本在哺乳動物受檢者的器官或組織中的表達的方法，其包含將靶向轉錄本的諸如RNAi誘導劑的RNAi誘導實體直接引入受檢者的呼吸系統中。在一個優選實施例中，器官或組織是呼吸道的一部分，例如肺。因此，本發明提供抑制轉錄本在哺乳動物受檢者的呼吸系統中的表達的方法，其包含將靶向轉錄本的諸如RNAi誘導劑的RNAi誘導實體直接引入受檢者的呼吸系統中。在其他實施例中，將RNAi誘導實體直接傳遞到呼吸系統中，進入血管中並且通過血管系統運輸到呼吸系統以外的活性部位，也就是說，呼吸道途徑是用於全身性傳遞。本發明另外提供抑制轉錄本在哺乳動物受檢者的呼吸系統中的表達的方法，其包含將靶向轉錄本的RNAi誘導劑直接引入哺乳動物受檢者的血管系統中。另一個方面，本發明提供抑制轉錄本在哺乳動物受檢者的器官或組織中的表達的方法，其包含將靶向轉錄本的RNAi誘導劑直接引入哺乳動物受檢者的血管系統中。在另一個實施例中，本發明提供抑制轉錄本在哺乳動物受檢者的實質器官或組織中的表達的方法，其包含將靶向轉錄本的諸如RNAi誘導劑的RNAi誘導實體引入受檢者的呼吸系統中，其中RNAi誘導劑進入血管系統中並且運輸到體內的其他位置。在上述方法中任何一種方法的某些實施例中，在基本上不含脂質或增強遞送的聚合物的水性介質中投與RNAi誘導劑。在本發明的其他實施例中，在包含陽離子聚合物的組合物中投與RNAi誘導劑。本發明提供適於向呼吸系統遞送的組合物。具體來說，本發明提供含有液體或固體粒子(例如乾粉)的可呼吸氣溶膠配方，所述液體或固體粒子包含本發明RNAi誘導劑和/或RNAi誘導載體中的一種或一種以上的RNAi誘導劑和/或RNAi誘導載體。配方可包含遞送劑和/或賦形劑。本發明也提供包含RNAi誘導劑或RNAi誘導載體的鼻噴霧劑。本發明另外提供遞送本發明組合物的裝置，例如，將乾燥或液體氣溶膠配方遞送到呼吸系統中的裝置，諸如吸入器或噴霧器。裝置可遞送單劑量或多劑量的組合物。本發明組合物可提供於裝置內部和/或可單獨提供(例如，作為新補充物(refill))。裝置可為一次性的。另一個方面，本發明提供表達靶向流感基因的RNAi誘導劑的非人類轉基因動物。本申請案提及各種專利、期刊文章和其他公開案，其全部以引用的方式併入本文。另外，以下標準參考著作是以引用的方式併入本文Ausubel，F.，等人(編)CurrentProtocolsinMolecularBiology，CurrentProtocolsinImmunology，CurrentProtocolsinProteinScience，andCurrentProtocolsinCellBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.，2002年7月的版本；Sambrook，Russell，andSambrook，MolecularCloningALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，2001；Goodman和Gilman的ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第10版.McGrawHill，2001。除非另外定義，否則本文中使用的所有科技術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的相同含義。儘管類似於或等價於本文所述方法和材料的方法和材料可用於本發明的實施或測試中，但下文描述適合的方法和材料。存在矛盾時，以包括定義在內的本說明書為準。另外，所述材料、方法和實例僅是說明性的而不是限制性的。根據以下實施方式和權利要求書將顯而易見本發明的其他特徵和優點。在元素以馬庫(Markush)群組格式列出時，應了解，也揭示這些元素的各自子群，並且可從群組除去任何元素。在給出範圍時，除非另有說明或從上下文看明顯不同，否則包括端點。圖1A(從下文Julkunen，I.等人一文修改而來)呈現流感病毒的示意圖。圖1B(從下文Fields′Virology一文修改而來)顯示流感病毒和從流感基因組獲得的轉錄本的基因組結構。mRNA的5′端和3′端處的細線表示非翻譯區。陰影或陰影線區分別表示0或+1閱讀框架中的編碼區。內含子由V形線來描述。在mRNA的5′端處的小矩形表示共價連接於病毒核酸的異源細胞RNA。A(n)象徵多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)。圖2(從下文Julkunen，I.等人一文修改而來)顯示流感病毒複製周期。圖3顯示在果蠅(Drosophila)系統中觀察到的siRNA的結構。圖4示意性說明果蠅中RNA幹擾所涉及的步驟。圖5顯示根據本發明有效的各種示範性siRNA和shRNA結構。圖6說明替代性抑制路徑，其中DICER酶分裂在莖(stem)中具有鹼基錯配的底物來產生結合至標靶轉錄本的3′UTR的抑制產物並且抑制翻譯。圖7呈現可用於本發明siRNA的兩個鏈的直接轉錄的一個構建體實例。圖8描述可用於單RNA分子的直接轉錄的一個構建體實例，所述單RNA分子雜交以形成根據本發明的shRNA。圖9顯示具有人類宿主來源的流感病毒A的6種菌株之間的序列比較。暗陰影區用於設計如實例2中所述來測試的siRNA。基本序列是菌株A/波多黎各/8/34的序列。輕微陰影字母表示不同於基本序列的核苷酸。圖10顯示具有人類宿主來源的流感病毒的2種菌株與具有動物宿主來源的流感病毒A的5種菌株之間的序列比較。暗陰影區用於設計如實例2中所述來測試的siRNA。基本序列是菌株A/波多黎各/8/34的序列。輕微陰影字母表示不同於基本序列的核苷酸。圖11A-11F顯示表明siRNA抑制MDCK細胞中的流感病毒產生的實驗結果。通過電穿孔將靶向各種病毒轉錄本的6種不同siRNA引入MDCK細胞中，且8小時後用病毒感染細胞。圖11A是顯示如血球凝集素分析，在用病毒株A/PR/8/34(H1N1)(PR8)感染後的各時間，在0.01的感染複數(MOI)下，在存在或不存在各種siRNA或對照siRNA時所測量，培養物上清液中的病毒滴度的時程。圖11B是顯示如血球凝集素分析，在經流感病毒株A/WSN/33(H1N1)(WSN)感染後的各時間，在0.01的MOI下，在存在或不存在各種siRNA或對照siRNA時所測量，培養物上清液中的病毒滴度的時程。圖11C顯示空斑分析，顯示來自經對照轉染或經siRNANP-1496轉染的病毒感染細胞的培養物上清液中的病毒滴度。圖11D顯示在不同劑量的siRNA下，對流感病毒產生的抑制。MDCK細胞經指定量的NP-1496siRNA轉染，接著在0.01的MOI下，經PR8病毒感染。感染48小時後測量病毒滴度。顯示了來自2個實驗之一的代表性數據。圖11E顯示通過在病毒感染後投與siRNA所引起的對流感病毒產生的抑制。MDCK細胞在0.01的MOI下，經PR8病毒感染2小時，並接著經NP-1496(2.5nmol)轉染。在感染後的指定時間測量病毒滴度。顯示來自2個實驗之一的代表性數據。圖12顯示具有人類或動物宿主來源的12種流感A病毒亞型或分離株的NP序列的3′區的一部分之間的序列比較。陰影區用於設計如實例2和3中所述來測試的siRNA。基本序列是菌株A/波多黎各/8/34的序列。陰影字母表示不同於基本序列的核苷酸。圖13顯示與抑制流感病毒的有效性有關的相對於流感病毒基因片段的各種siRNA的位置。圖14A是發育中的雞胚的示意圖，顯示用於注射siRNA和siRNA/遞送劑組合物的區域。圖14B顯示在發育中的雞胚中抑制流感病毒產生的各種siRNA的能力。圖15是顯示核蛋白與病毒RNA分子的相互作用的示意圖。圖16A和16B顯示說明流感病毒vRNA、mRNA和cRNA(模板RNA)之間的差異和它們之間的關係的示意圖。在圖16B中顯示各個流感A病毒vRNA片段的3′端處的12個保守核苷酸和5′端處的13個核苷酸。mRNA含有m7GpppNm帽結構和從宿主細胞RNA的子集獲得的平均10到13個核苷酸。mRNA的多聚腺苷酸化發生在mRNA中對應於vRNA片段的5′端前的位置15到22個核苷酸的位點。箭頭指示對各種RNA物種具有特異性的引物的位置。(從參考文獻(1)修改而來)。圖17顯示在感染前6-8小時經對照轉染或經siRNANP-1496轉染的細胞中，在用病毒感染後的各時間的病毒NP和NSRNA物種的量。圖18A顯示對流感病毒產生的抑制需要雙鏈體siRNA中的野生型(wt)反義鏈。MDCK細胞首先用由wt和經修飾(m)鏈所形成的siRNA轉染，並且8小時之後在0.1的MOI下，用PR8病毒感染。感染24小時後，分析培養物上清液中的病毒滴度。顯示來自2個實驗之一的代表性數據。圖18B顯示M特異性siRNA抑制特定mRNA的積聚。MDCK細胞經M-37轉染，在0.01的MOI下，用PR8病毒感染，並且在感染1、2和3小時後，收集以用於RNA分離。通過使用RNA特異性引物進行逆轉錄，接著進行實時PCR來測量M特異性mRNA、cRNA和vRNA的含量。將各種病毒RNA物種的含量標準化為相同樣品中γ-肌動蛋白mRNA的含量(下方圖)。RNA的相對含量以平均值±S.D形式表示。顯示來自2個實驗之一的代表性數據。圖19A-D顯示，NP特異性siRNA不僅抑制NP特異性mRNA、vRNA和cRNA的積聚而且抑制M和NS特異性mRNA、vRNA和cRNA的積聚。MDCK(A-C)和Vero(D)細胞經NP-1496轉染，在0.1的MOI下，用PR8病毒感染，並且在感染1、2和3小時後收集以用於RNA分離。通過使用RNA特異性引物進行逆轉錄，接著進行實時PCR來測量對NP、M和NS具有特異性的mRNA、cRNA和vRNA的含量。將各種病毒RNA物種的含量標準化為相同樣品中γ-肌動蛋白mRNA的含量(未圖示)。顯示RNA的相對含量。顯示來自3個實驗之一的代表性數據。圖19E-G，在各個圖中的右側，顯示PA特異性siRNA不僅抑制PA特異性mRNA、vRNA和cRNA的積聚而且抑制M和NS特異性mRNA、vRNA和cRNA的積聚。MDCK細胞經PA-1496轉染，在0.1的MOI下，用PR8病毒感染，並且在感染1、2和3小時後收集以用於RNA分離。通過使用RNA特異性引物進行逆轉錄，接著進行實時PCR來測量對PA、M和NS具有特異性的mRNA、cRNA和vRNA的含量。將各種病毒RNA物種的含量標準化為相同樣品中γ-肌動蛋白mRNA的含量(未圖示)。顯示RNA的相對含量。圖19H顯示NP特異性siRNA抑制PB1特異性mRNA(上方圖)、PB2特異性mRNA(中間圖)和PA特異性mRNA(下方圖)的積聚。MDCK細胞經NP-1496轉染，在0.1的MOI下，用PR8病毒感染，並且在感染1、2和3小時後收集以用於RNA分離。通過使用RNA特異性引物進行逆轉錄，接著進行實時PCR來測量對PB1、PB2和PAmRNA具有特異性的mRNA的含量。將各種病毒RNA物種的含量標準化為相同樣品中γ-肌動蛋白mRNA(未圖示)的含量。顯示RNA的相對含量。圖20A顯示siRNACD8-61和其髮夾式衍生物CD8-61F的序列。圖20B顯示CD8-61和CD8-61F對CD8a表達的抑制。CD8+CD4+T細胞系是通過電穿孔，經CD8-61或CD8-61F轉染。48小時後，通過流式細胞術分析CD8a表達。未標記的細胞系，對照轉染。圖20C顯示pSLOOPIII載體的示意圖，其中由H1RNApolIII啟動子驅動CD8-61F髮夾式RNA的表達。終止子，終止信號序列。圖20D呈現顯示使用pSLOOPIII抑制HeLa細胞中的CD8a的曲線圖。未轉染細胞不表達CD8a。細胞經CD8a表達載體和無啟動子pSLOOPIII-CD8-61F構建體、合成siRNA或含有啟動子的pSLOOPIII-CD8-61F轉染。圖21A顯示NP-1496和GFP-949siRNA和其髮夾式衍生物/前體的示意圖。圖21B顯示呈2種不同順序的NP-1496H和GFP-949H的串聯陣列。圖21C顯示pSLOOPIII表達載體。將siRNA的髮夾式前體單獨(上方圖)、呈串聯陣列(中間圖)，或與獨立啟動子和終止序列一起(下方圖)克隆於pSLOOPIII載體中。圖22A是顯示當在經流感病毒感染之前連同陽離子聚合物PEI一起投與時，siRNA抑制小鼠中流感病毒產生的圖。實心方形(無處理)；空心方形(GFPsiRNA)；空心圓(30μgNPsiRNA)；實心圓(60μgNPsiRNA)。各個符號表示個別動物，顯示不同組之間的p值。圖22B是顯示當在經流感病毒感染之前連同陽離子聚合物PLL一起投與時，siRNA抑制小鼠中流感病毒產生的圖。實心方形(無處理)；空心方形(GFPsiRNA)；實心圓(60μgNPsiRNA)。各個符號表示個別動物，顯示不同組之間的p值。圖22C是顯示當在經流感病毒感染之前連同陽離子聚合物jetPEI一起投與時，與當在PBS中投與時相比，siRNA顯著更有效地抑制小鼠中流感病毒產生的圖。空心方形(無處理)；空心三角形(在PBS中的GFPsiRNA)；實心三角形(在PBS中的NPsiRNA)；空心圓(GFPsiRNA與jetPEI)；實心圓(NPsiRNA與jetPEI)。各個符號表示個別動物，顯示不同組之間的p值。圖22D是顯示當連同陽離子聚(β氨基酯)(J28)一起經靜脈內途徑投與時，靶向NP的siRNA抑制小鼠中流感病毒產生的圖。空心圓(無處理)；實心方形(NPsiRNA與J28)。圖22E是顯示當連同陽離子聚(β氨基酯)(J28或C32)一起經腹膜內途徑投與時，靶向NP的siRNA抑制小鼠中流感病毒產生，而對照RNA(GFP)不具有顯著作用的圖。空心圓(無處理)；空心方形(GFPsiRNA與J28)；實心方形(NPsiRNA與J28)；空心三角形(GFPsiRNA與C32)；實心三角形(NPsiRNA與C32)。顯示對照組與處理組之間的p值。圖23是顯示當在經流感病毒感染之前一起投與時，靶向流感病毒NP和PA轉錄本的siRNA顯示相加效應的圖。實心方形(無處理)；空心圓(60μgNPsiRNA)；空心三角形(60μgPAsiRNA)；實心圓(60μgNPsiRNA+60μgPAsiRNA)。各個符號表示個別動物，顯示不同組之間的p值。圖24是顯示當在經流感病毒感染後投與時，siRNA抑制小鼠中流感病毒產生的圖。實心方形(無處理)；空心方形(60μgGFPsiRNA)；空心三角形(60μgPAsiRNA)；空心圓(60μgNPsiRNA)；實心圓(60μgNP+60μgPAsiRNA)。各個符號表示個別動物，顯示不同組之間的p值。圖25A是表達shRNA的慢病毒載體的示意圖。由U6啟動子驅動shRNA的轉錄。由CMV啟動子驅動EGFP表達。SIN-LTR、Ψ、cPPT和WRE是慢病毒組分。顯示NP-1496shRNA的序列。圖25B呈現流式細胞術結果的曲線圖，證明用圖25B中所述的慢病毒感染的Vero細胞以劑量依賴方式表達EGFP。慢病毒是通過將編碼NP-1496ashRNA的DNA載體和包裝載體共轉染到293T細胞中來產生的。培養物上清液(0.25ml或1.0ml)用於感染Vero細胞。通過流式細胞術分析所得Vero細胞系(Vero-NP-0.25和Vero-NP-1.0)和對照(未感染)Vero細胞的GFP表達。顯示Vero-NP-0.25(上方圖部分)和Vero-NP-1.0(下方圖部分)細胞的平均螢光強度。陰影曲線表示對照(未感染)Vero細胞的平均螢光強度。圖25C是顯示在表達NP-1496shRNA的Vero細胞中抑制流感病毒產生的圖。親代和表達NP-1496shRNA的Vero細胞在0.04、0.2和1的MOI下，用PR8病毒感染。感染48小時後，通過血球凝集作用(HA)分析測定上清液中的病毒滴度。圖26是顯示通過表達靶向流感病毒轉錄本的siRNA的DNA載體的投與抑制小鼠中流感病毒產生的圖。將60μg的編碼RSV、NP-1496(NP)或PB1-2257(PB1)shRNA的DNA與40μlInfasurf混合，並且通過滴注投與小鼠中。對於無處理(NT)組，向小鼠滴注60μl的5％葡萄糖。13小時後，用PR8病毒經鼻內途徑感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。感染24小時後，通過MDCK/血球凝集素分析測量肺中的病毒滴度。各個數據點表示一隻小鼠，顯示組間的p值。圖27A顯示檢測siRNA與聚-L-賴氨酸(PLL)之間的複合物形成的電泳遷移率變動分析的結果。通過在室溫下，將150ng的NP-1496siRNA與遞增量的聚合物(0-1200ng)混合30min來形成siRNA-聚合物複合物。然後使反應混合物在4％瓊脂糖凝膠上跑膠，並且利用溴化乙錠(ethidium-bromide)染色觀測siRNA。圖27B顯示檢測siRNA與聚-L-精氨酸(PLA)之間的複合物形成的電泳遷移率變動分析的結果。通過在室溫下，將150ng的NP-1496siRNA與遞增量的聚合物(0-1200ng)混合30min來形成SiRNA-聚合物複合物。然後使反應混合物在4％瓊脂糖凝膠上跑膠，並且利用溴化乙錠染色觀測siRNA。圖28A是顯示siRNA/PLL複合物的細胞毒性的曲線圖。用siRNA(400pmol)/聚合物複合物處理96孔板中的Vero細胞6小時。然後用DMEM-10％FCS替換含聚合物的培養基。24h後，通過使用MTT分析來測量細胞的代謝活性。方形＝PLL(MW～8K)；圓形＝PLL(MW～42K)；實心方形＝25％；空心三角形＝50％；實心三角形＝75％；X＝95％。數據以三次的平均值表示。圖28B是顯示siRNA/PLA複合物的細胞毒性的曲線圖。用siRNA(400pmol)/聚合物複合物處理96孔板中的Vero細胞6小時。然後用DMEM-10％FCS替換含聚合物的培養基。24h後，通過使用MTT分析來測量細胞的代謝活性。數據以三次的平均值表示。圖29A是顯示PLL刺激siRNA的細胞吸收的曲線圖。用Lipofectamine+siRNA(400pmol)或用siRNA(400pmol)/聚合物複合物培養24孔板中的Vero細胞6小時。然後洗滌細胞並且在0.04的MOI下，用PR8病毒感染。通過HA分析來測量感染後不同時間點的培養物上清液中的病毒滴度。顯示聚合物與siRNA的比率。空心圓＝無治療；實心方形＝Lipofectamine；實心三角形＝PLL(MW～42K)；空心三角形＝PLL(MW～8K)。圖29B是顯示聚-L-精氨酸刺激siRNA的細胞吸收的曲線圖。用siRNA(400pmol)/聚合物複合物培養24孔板中的Vero細胞6小時。然後洗滌細胞並且在0.04的MOI下，用PR8病毒感染。通過HA分析來測量在感染後不同時間點的培養物上清液中的病毒滴度。顯示聚合物與siRNA的比率。0、25、50、75和95％是指ε-氨基在經咪唑乙醯基取代的PLL上的百分比。實心圓＝無轉染；空心圓＝Lipofectamine；空心方形和實心方形＝0％和25％(注意，0％和25％的數據點是相同的)；實心三角形＝50％；空心三角形＝75％；X＝95％。圖30A是顯示在靜脈內注射後，PEI介導肺中的DNA轉染的直方圖。顯示在4天範圍內，不同器官中的0.5mg蛋白質中相對光單位的Luc活性。數據來自2個實驗之一。圖30B是顯示在氣管內投與後，PEI介導肺中的DNA轉染的直方圖。此圖顯示在DNA投與24小時後，每組3隻小鼠的指定器官中的0.5mg蛋白質中相對光單位的平均Luc活性。誤差直方圖指示標準偏差。圖30C是顯示通過靜脈內遞送siRNA抑制肺中的螢光素酶活性的直方圖。此圖顯示在投與螢光素酶構建體24小時後，每組3隻小鼠的指定器官中的0.5mg蛋白質中相對光單位的平均Luc活性。誤差直方圖指示標準偏差。圖30D是顯示通過吸入遞送siRNA抑制肺中的螢光素酶活性的直方圖。此圖顯示在投與螢光素酶構建體24小時後，小鼠肺中的0.5mg蛋白質中相對光單位的平均Luc活性。誤差直方圖指示標準偏差。每組使用3隻小鼠執行雙份實驗，並且獲得類似結果。在此呈現實驗之一的結果。圖31A和31B是顯示在不存在遞送劑時投與siRNA抑制小鼠中流感病毒產生的圖。圖32A-32J顯示用於選擇RNAi的標靶部分的流感病毒株PR8轉錄本的序列。圖33是表17，顯示抑制流感病毒的RNAi的功能標靶部分的序列。圖34是表18，顯示得自人類的流感病毒株之間用於RNAi的適當保守流感病毒標靶部分的序列。圖35是表20，顯示得自人類和禽類的流感病毒株之間用於RNAi的適當保守流感病毒標靶部分的序列。具體實施例方式縮寫DNA脫氧核糖核酸RNA核糖核酸vRNA流感病毒基因組中的病毒粒子RNA，負鏈cRNA互補RNA，vRNA的直接轉錄本，正鏈mRNA從vRNA或細胞基因轉錄的信使RNA，正鏈，用於蛋白質合成的模板dsRNA雙鏈RNAsiRNA短幹擾RNAshRNA短髮夾式RNAmiRNA微RNARNAiRNA幹擾bp鹼基對nt核苷酸定義如本文中所使用，除非另有說明或從上下文看明顯相反(除所述數字將超過可能值的100％外)，否則關於數字的術語「大約」或「約」通常包括任一方向上屬於數字的5％的範圍內的數字(大於或小於所述數字)。如本文中所使用的術語「禽類」用於表示分類鳥綱(ava)的任何物種、亞種或種族生物體，例如，雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀類、鷹和鴉。該術語包括紅原雞(Gallusgallus)，或雞(例如，白來航雞(WhiteLeghorn)、棕色來航雞(BrownLeghorn)、斑紋雞(Barred-Rock)、蘇賽克斯雞(Sussex)、新罕布夏州雞(NewHampshire)、洛德島州雞(RhodeIsland)、Ausstralorp、米諾卡雞(Minorca)、Amrox、加州灰色雞、義大利鵪鶉色雞(ItalianPartidge-colored))的各種已知菌株，以及火雞、雉、鵪鶉、鴨、鴕鳥和其他通常飼養的家禽的菌株。術語「互補」在本文中是根據其所屬領域公認的含義來使用，是指特定鹼基、核苷、核苷酸或核酸之間的精確配對的能力。舉例而言，腺嘌呤(A)和尿苷(U)是互補的；腺嘌呤(A)和胸苷(T)是互補的；以及，鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)是互補的，並且在所屬領域中稱為Watson-Crick鹼基配對。如果將鏈以反平行取向比對時，第一核酸序列的某一位置處的核苷酸與第二核酸序列中反向定位的核苷酸互補，那麼所述核苷酸形成互補鹼基對，並且所述核酸在所述位置處是互補的。第一核酸與第二核酸的互補性百分比可如下評估將這兩個核酸以反平行取向比對，以獲得在沿第二核酸的評估窗口範圍內的最大互補性，測定在窗口內形成互補鹼基對的兩個鏈中的nt總數，除以窗口內的nt總數並且乘以100。舉例而言，AAAAAAAA和TTTGTTAT是75％互補的，因為在總共16個nt中，有12個呈互補鹼基對的nt。在評估窗口範圍內至少70％互補的核酸被認為是在所述窗口範圍內實質上互補。當計算為達到特定互補性百分比所需的互補nt數量時，將分數捨入到最接近的整數。非互補核苷酸所佔的位置構成錯配，即，所述位置由非互補鹼基對佔據。為達到最大互補性，可將間隙引入評估窗口內的核酸的任一者或兩者中。與間隙相對的核苷酸是未成對的並且構成凸出(bulge)，也就是說，在另一核酸中不存在相對的核苷酸。通常，互補性百分比是在長度為至少15個nt，例如19個nt的評估窗口範圍內測定，其中所述長度不包括間隙。為了測定互補性百分比，將1個nt凸出視為單個非互補nt；2與5個nt之間的凸出視為2個非互補nt；6與10個nt之間的凸出視為3個非互補nt。將長度為K個nt的凸出(其中K大於10)視為3+(K-10)個非互補nt。「直接進入呼吸系統中」是指通過鼻、口或氣管，優選通過鼻或口投與，以便組合物中相當大部分的活性劑(例如，大於10％，優選大於25％)進入上和/或下呼吸道。「直接進入血管系統中」是指通過注射或導管或從體外進入血管系統中的任何其他方法(通常涉及穿透血管壁)投與到血管(例如，動脈或靜脈)中。「間接進入血管系統中」是指不穿透血管系統的投與模式。將物質間接遞送到血管系統中的優選實例是將物質直接遞送到呼吸系統中，接著使物質穿過血管壁。然後可將物質運輸到體內其他位置處的標靶組織或器官(並且可返回到肺)。活性劑的「有效量」是指足以引發所希望的生物反應的活性劑的量。如所屬領域的技術人員所了解，為有效的特定藥劑的絕對量可視如所希望的生物終點、待遞送的藥劑、標靶組織等因素而變化。「有效量」可以單劑量或多劑量來投與。舉例而言，RNAi誘導實體的有效量可為足以達到以下各項中的一項或一項以上的量(i)使標靶轉錄本的表達降低至少20％，優選至少40％；(ii)使病毒滴度降低至少25％；(iii)使病毒滴度降低至少2倍；(iv)延緩或預防臨床顯著病毒感染的發展；(v)降低病毒感染的至少一種症狀的持續時間或嚴重性等。如果以重量計，組合物含有小於1％的某一物質，優選小於0.5％，更優選小於0.1％，那麼組合物「基本上不含」所述物質的。更優選地，所述物質完全不存在所述組合物中。如果並非有意將增強遞送的聚合物或脂質包括在所述組合物中，那麼認為組合物基本上不含這樣的聚合物或脂質。如本文中所使用，術語「雜交」是指2種包含或由互補部分組成的核酸序列之間的相互作用，以便形成在所關注的特定條件下，例如在真核細胞中，在果蠅溶胞物中等穩定的雙鏈體結構。通常，如果第一核酸和第二核酸所形成的雙鏈體的Tm，比第二核酸和與第二核酸長度相同並與第二核酸100％互補並且含有相同類型的核苷和核苷間鍵聯的第三核酸所形成的雙鏈體的Tm低小於15℃，優選低小於10℃，那麼認為第一核酸與第二核酸雜交。適於各種應用的雜交條件在所屬領域中是已知的，和/或可見於標準參考著作中，例如上文的Ausubel和上文的Sambrook中。在一個示範性實施例中，嚴格雜交條件包含在比完全互補雙鏈體的Tm低10-15℃的溫度下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)和0.1％SDS，接著在比完全互補雙鏈體的Tm低25℃的溫度下在2XSSC和0.1％SDS中洗滌1-2次歷時30分鐘。「同源性」是指兩個或兩個以上核酸序列的相同程度。在評估窗口範圍內，第一核酸與第二核酸之間的同源性百分比可如下計算將這兩個核酸以平行取向比對，測定評估窗口內與相同核苷酸相對的核苷酸的數量，除以窗口內核苷酸的總數並且乘以100。當計算為達到特定同源性百分比所需的相同核苷酸數量時，將分數捨入到最接近的整數。在評估窗口範圍內至少70％同源(例如，至少80％，至少90％，或90％以上)的核酸被認為在所述窗口範圍內實質上同源。通常，評估窗口是沿第二核酸長度至少15個nt，例如19個nt，其中長度不包括間隙。為了測定同源性百分比，將1個nt間隙視為單個不與相同nt相對的nt；2與5個nt之間的間隙視為2個不與相同nt相對的nt；6與10個nt之間的間隙視為3個不與相同nt相對的nt。將長度為K個nt的間隙(其中K大於10)視為3+(K-10)個不與相同nt相對的nt。在此使用的術語「流感病毒」是指能夠在動物或人類受檢者中引起疾病、或為實驗分析的受關注候選者的流感病毒的任何菌株。Fields，B.等人在Fields′Virology，第4版，PhiladelphiaLippincottWilliamsandWilkins；ISBN0781718325，2001中描述了流感病毒。具體來說，所述術語涵蓋能夠在動物或人類受檢者中引起疾病、或為實驗分析的受關注候選者的流感A病毒的任何菌株。大量流感A分離株已被部分或完全測序。附錄A僅僅呈現已寄存在公共資料庫(流感序列資料庫(InfluenzaSequenceDatabase，ISD)，參見Macken，C，Lu，H.，Goodman，J.，&Boykin，L.，″Thevalueofadatabaseinsurveillanceandvaccineselection.″inOptionsfortheControlofInfluenzaIV.A.D.M.E.Osterhaus，N.Cox&A.W.Hampson(編)AmsterdamElsevierScience，2001，103-106)中的流感A基因組片段完整序列的部分清單。所述資料庫也含有流感B和C基因組片段的完整序列。該資料庫連同允許用戶通過基因組片段、通過由病毒感染的物種和通過分離年份來搜索的方便的搜尋引擎可在全球資訊網網址URLhttp://www.flu.lanl.gov/上獲得。流感序列也可在Genbank上獲得。因此，所屬領域的技術人員可容易地獲得流感基因的序列，或者可由所屬領域的技術人員確定。如本文中關於RNAi誘導劑的合成、加工或活性所使用，術語「活體內」通常是指與無細胞系統相對而言，發生在細胞內的事件。通常，細胞可維持在組織培養物中或者可以是完整生物體的一部分。如本文中所使用的「分離的」，意思是1)從至少一些通常天然中相關的組分分離；2)通過涉及人工的方法製備或純化；和/或3)天然中不存在。本文中描述的核酸和核酸結構中的任何核酸和核酸結構可呈分離形式。如本文中所使用的「配體」意思是通過不同於抗原-抗體相互作用的機制特異地結合第二分子的分子。舉例而言，該術語涵蓋天然存在的或合成的多肽、肽和小分子，包括已被人創造出結構的分子。「基於核酸的分析」是指檢測核酸的存在和/或識別核酸的任何分析或方法。該分析可以是定性的或定量的。如本文中所使用的「核酸鹼基(nucleobase)」意思是，能夠形成氫鍵，優選為Watson-Crick氫鍵，與互補核酸鹼基或核酸鹼基類似物配對，例如與嘌呤或嘧啶配對的含氮雜環基部分。典型核酸鹼基是天然存在的核酸鹼基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和天然存在的核酸鹼基的類似物(Fasman，PracticalHandbookofBiochemistryandMolecularBiology，第385-394頁，CRCPress，BocaRaton，Fla.，1989)。術語「核酸鹼基」和「鹼基」可在本文中交替地使用。「核苷酸」包含含氮鹼基、糖分子和磷酸基。核苷包含連接於糖分子的含氮鹼基(核酸鹼基)。在天然存在的核酸中，磷酸基共價地連接鄰近核苷，形成聚合物。核酸可包括天然存在的核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)，核苷類似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯並-嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)，經化學修飾的鹼基，經生物學修飾的鹼基(例如，甲基化鹼基)，經插入的鹼基，經修飾的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。核苷可包含通用鹼基，也就是說，鹼基可取代常發現於核酸中的天然鹼基中的一個鹼基，或優選地，任何鹼基(當在雙鏈體中使所述鹼基相對時)(參見，例如，142-149)。在本發明的某些實施例中，核酸包含無鹼性殘基。如本文中所使用「可操作連接」是指2個核酸序列之間的關係，其中核酸序列之一的表達是通過另一核酸序列來控制、調節、調整等。舉例而言，由可操作連接的啟動子序列引導核酸序列的轉錄；由可操作連接的加工序列引導核酸的轉錄後加工；由可操作連接的翻譯調控序列引導核酸序列的翻譯；由可操作連接的運輸或定位序列引導核酸或多肽的運輸或定位；以及，由可操作連接的加工序列引導多肽的翻譯後加工。優選地，可操作連接於第二核酸序列的核酸序列是直接或間接地與所述序列共價連接，但是也可以接受任何有效的三維締合。如所屬領域使用的術語「器官」是指構成生物體的形態學和功能相異部分的組織或組織群組。實例包括肺、心臟、肝、胰腺、乳房、腎、腸、膀胱、骨、皮膚等。如所屬領域使用的術語「組織」是指一般具有類似結構，通常經組織以執行一種或一種以上相同或相關功能的細胞群組。紅細胞、白細胞和血小板被認為是包含個別細胞或細胞片段的循環組織。「預防」是指使疾病、病症、病狀，或其症狀或表現，或其嚴重程度的惡化不發生。預防包括降低疾病、病症、病狀，或其症狀或表現，或其嚴重程度的惡化將發生的風險。因此，如果組合物或方法以個體或群體為基礎，降低疾病、病症、病狀，或其症狀或表現，或其嚴重程度的惡化將發生的風險，那麼就稱所述組合物或方法預防所述疾病、病症、病狀，或其症狀或表現，或其嚴重程度的惡化。如本文中所使用的術語「引物」是指，無論是天然的還是合成的，只要能夠在引發引物延伸的條件下(例如聚合酶催化的引物延伸)與核酸模板雜交時，擔當核酸合成的起始點的寡核苷酸。引物的適當長度視引物的預期用途而定，但通常在15到35個nt的範圍內。在一些情況下，引物可以更長，例如長度長達約60個nt。短引物分子通常需要更冷的溫度來與模板形成足夠穩定的雜交複合物。引物不需要反映模板的確切序列，但必須是足夠互補的，以便與用於引物延伸的模板發生雜交。當提到核酸時，如本文中所使用的術語「探針」是指可與互補核酸雜交並進而檢測互補核酸的存在的核酸。探針應與所檢測的核酸足夠互補，以便在所用的雜交嚴格條件下可發生特異雜交。可用諸如螢光部分、生物素等標記修飾探針。如本文中所使用的「純化的」意思是從許多其他化合物或實體中分離。化合物或實體可以是部分純化的、實質上純化的或者純的，其中當從實質上所有其他化合物或實體中除去時，稱其是純的，也就是說，優選為至少約90％，更優選為至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大於99％純度。本文中使用術語「調控序列」來描述引導、增強或抑制可操作連接的序列的表達(尤其是轉錄，但在一些情況下是諸如剪接或其他加工的其他事件)的核酸序列的區域。該術語包括諸如啟動子、增強子和其他轉錄控制元件的表達信號。在本發明的一些實施例中，調控序列可引導核苷酸序列的構成性表達；在其他實施例中，調控序列可引導組織特異性和/或誘導型表達。調控序列可僅在已用感染劑感染的細胞中引導核苷酸序列的表達。舉例而言，調控序列可包含啟動子和/或增強子，諸如由病毒蛋白質，例如病毒聚合酶、轉錄因子等所識別的病毒特異性啟動子或增強子。或者，調控序列可包含在例如呼吸道上皮細胞的上皮細胞中具有活性的啟動子和/或增強子。舉例而言，可使用編碼表面活性劑蛋白質的基因的啟動子。「呼吸系統」是指任何上呼吸道組分(例如，鼻孔、鼻咽、口咽)或下呼吸道組分(例如，氣管、支氣管、細支氣管和/或肺泡)。喉可被認為是上呼吸道或下呼吸道的組分。術語「呼吸系統」和「呼吸道」可在本文中交替地使用。「呼吸道病毒」是感染存在於受檢者的上呼吸道和/或下呼吸道中的細胞的病毒。優選地，病毒感染呼吸道上皮細胞。可能被感染的其他細胞包括(但不限於)支氣管肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞等。呼吸道病毒的實例包括流感病毒、副流感病毒(PIV)、肺炎病毒、偏肺病毒、冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、呼腸孤病毒、皰疹病毒和漢坦病毒(hantavirus)。術語「RNAi誘導劑」是指siRNA、shRNA，和可加工產生siRNA或shRNA或通過RNA幹擾抑制標靶轉錄本的表達的其他小RNA物種的其他雙鏈結構(例如dsRNA)。在本發明的某些實施例中，RNAi誘導劑通過涉及翻譯阻遏的RNA幹擾路徑來抑制標靶RNA的表達。術語「RNAi誘導實體」涵蓋RNA分子和載體，其在細胞中的存在產生RNAi並引起RNAi誘導實體所靶向的轉錄本的表達降低。RNAi誘導實體例如可以是諸如siRNA、shRNA的RNAi誘導劑，或RNAi誘導載體。術語「RNAi誘導實體」、「RNAi誘導劑」或「RNAi誘導載體」的使用並不打算暗示，所述實體、藥劑或載體通常上調或激活RNAi(儘管可能如此)，而是簡單表明所述實體、藥劑或載體在細胞內的存在產生RNAi介導的標靶轉錄本的表達降低。如本文中所使用的「RNAi誘導實體」是一種實體，是通過人工修飾或產生和/或其在細胞中的存在是人類幹預結果，例如，其與內源性RNA物種或在病毒感染的天然進程期間，在細胞中所產生的RNA物種不同。「RNAi誘導載體」是一種載體，其在細胞內的存在產生一種或一種以上RNA的轉錄，所述RNA彼此雜交或自身雜交以形成諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導劑。在本發明的各種實施例中，所述術語涵蓋質粒或病毒，其在細胞內的存在引起一種或一種以上RNA的產生，所述RNA自身雜交或彼此雜交以形成RNAi誘導劑。通常，載體包含可操作連接至表達信號的核酸，以便當載體存在於細胞中時，轉錄一種或一種以上雜交或自身雜交以形成RNAi誘導劑的RNA分子。因此，載體提供用於RNAi誘導劑的細胞內合成的模板。為了誘導RNAi，細胞內病毒基因組的存在構成細胞內病毒的存在。如果將載體引入細胞中，載體進入細胞中或載體是從親代細胞遺傳而得，那麼不管其隨後在細胞內是被修飾還是被加工，都認為載體存在於細胞內。如果載體包含用於轉錄靶向轉錄本的RNAi誘導劑的模板，那麼認為RNAi誘導載體靶向所述轉錄本。除在細胞中的轉錄本抑制作用外，所述載體具有許多其他的用途。舉例而言，其可用於活體外產生RNAi誘導劑，和/或用於在可能含有或不含載體所靶向的轉錄本的細胞中產生RNAi誘導劑。「短幹擾RNA」包含雙鏈(雙鏈體)RNA，其長度在15與大約29個核苷酸之間或在15與29之間的間隔內的任何其他子範圍或特定值，例如，16-18、17-19、21-23、24-27、27-29個nt長，並且視需要另外包含一或兩個單鏈突出端，例如一或兩個鏈上的3′突出端。在某些實施例中，雙鏈體是大約19個nt長。突出端可為(例如)1-6個殘基長度，例如，2個nt。siRNA可由雜交在一起的2個RNA分子形成，或者，由shRNA產生。在本發明的某些實施例中，siRNA的5′端的一或兩個末端具有磷酸基，而在其他實施例中，5′端的一個或一個以上末端沒有磷酸基。在本發明的某些實施例中，3′端的一或兩個末端具有羥基，而在其他實施例中，不具有羥基。被稱作「反義鏈」或「引導鏈」的siRNA的一條鏈包括與標靶轉錄本雜交的部分。在本發明的某些優選實施例中，siRNA的反義鏈與標靶轉錄本的區域100％互補，也就是說，其與標靶轉錄本雜交而在長度在15與大約29個nt之間，優選長度為至少16個nt，更優選長度為18-20，例如19個nt的目標區範圍內沒有一個錯配或凸出。互補區可為在17與29之間的間隔內的任何子範圍或特定值，例如，17-18、19-21、21-23、19-23、24-27、27-29。在其他實施例中，反義鏈與目標區實質上互補，也就是說，在由反義鏈和標靶轉錄本所形成的雙鏈體中，存在一個或一個以上的錯配和/或凸出。siRNA的2個鏈是實質上互補的，優選在雙鏈體部分中彼此100％互補。術語「短髮夾式RNA」是指一種RNA分子，其包含至少2個經雜交或能夠雜交以形成足夠長以介導RNAi(與對siRNA雙鏈體所述一樣)的雙鏈(雙鏈體)結構的互補部分，和至少一個形成連接形成雙鏈體的shRNA的區域的環的單鏈部分。該結構也被稱為莖/環結構，其中莖是雙鏈體部分。所述結構可另外包含在5′或3′端上的突出端(例如，與對siRNA所述的一樣)。優選地，環是約1-20，更優選約4-10並且最優選約6-9個nt長和/或突出端是約1-20，並且更優選約2-15個nt長。環可位於與希望抑制的標靶轉錄本互補的區域的5′或3′端(即，shRNA的反義部分)。在某些實施例中，突出端包含一個或一個以上U殘基，例如在1個與5個U之間。如下文進一步所述，利用保守細胞RNAi機器將shRNA加工成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前體，並且通常同樣能夠抑制與shRNA的部分(稱為shRNA的反義鏈或引導鏈)互補的標靶轉錄本的表達。通常，shRNA的反義鏈與標靶轉錄本之間所形成的雙鏈體的特徵類似於siRNA的引導鏈與標靶轉錄本之間所形成的雙鏈體的特徵。在本發明的某些實施例中，shRNA的5′端具有磷酸基，而在其他實施例中不具有磷酸基。在本發明的某些實施例中，shRNA的3′端具有羥基，而在其他實施例中不具有羥基。如本文中所使用，術語「受檢者」是指易感於例如流感病毒的病毒感染的個體。該術語包括鳥類和動物，例如馴養鳥類和動物(諸如雞，包括豬、馬、狗、貓等的哺乳動物)和野生動物，非人靈長類動物，和人類。為了本文所述的目的，如果(1)RNAi誘導劑包含一條與標靶轉錄本至少80％，優選至少約85％，更優選至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互補的鏈以達到長至少約15，更優選至少約17，仍更優選至少約18或19到約21-23，或24-29個核苷酸的一段；和/或(2)RNAi誘導劑的一條鏈與標靶轉錄本雜交，那麼認為RNAi誘導劑「靶向」標靶轉錄本。適當雜交條件是通常見於哺乳動物細胞的細胞質或細胞核中和/或果蠅溶胞物中的條件，例如，如美國公開案20020086356和20040229266和參考文獻21和28中所述。在本發明的某些實施例中，就確定RNAi誘導劑是否靶向轉錄本而言，不認為在由反義鏈和標靶轉錄本所形成的雙鏈體中的GU或UG鹼基對是錯配。在細胞中的存在引起靶向轉錄本的RNAi誘導劑的產生的RNA誘導載體也被認為靶向轉錄本。靶向轉錄本的RNAi誘導劑也被認為靶向引導轉錄本合成的基因。據稱，抑制涉及病毒產生、病毒複製、病毒病原性和/或病毒感染的標靶轉錄本的表達的RNAi誘導劑抑制病毒。「標靶部分」是與RNAi誘導劑的反義鏈雜交的標靶轉錄本的區域。術語「標靶轉錄本」是指為RNAi的標靶的任何RNA。信使RNA是優選標靶。術語「標靶RNA」和「標靶轉錄本」可在本文中交替地使用。如本文中所使用，「治療」包括逆轉、減緩和/或抑制所述術語所適用的疾病、病症或病狀的進程，和/或逆轉、減緩和/或抑制所述疾病、病症或病狀的一種或一種以上症狀或表現。術語「載體」是指能夠介導第二核酸分子進入(例如，轉移、運輸等)到細胞中的核酸分子。所轉移的核酸通常連接至(例如，插入)載體核酸分子中。載體可包括引導自發複製的序列，或可包括足以允許併入宿主細胞DNA中的序列。有用的載體包括(例如)質粒(儘管RNA質粒也是已知的，但是通常是DNA分子)、柯斯質粒(cosmid)和病毒載體。如所屬領域中所熟知，術語病毒載體可指包括通常促進核酸分子的轉移或併入的病毒衍生核酸元件的核酸分子(例如質粒)(實例包括逆轉錄病毒或慢病毒載體)，或指介導核酸轉移的病毒或病毒顆粒(實例包括逆轉錄病毒或慢病毒)。如所屬領域的技術人員所顯而易見的，除核酸外，病毒載體還可包括各種病毒成分。I.流感病毒生命周期和特徵流感病毒是正粘液病毒科(Orthomyxoviridaefamily)的包膜、負鏈RNA病毒。其被分類為流感A型、B型和C型，其中流感A最具致病性並且被認為是是唯一能夠經歷與動物菌株的重配的類型。流感A型、B型和C型可通過其核蛋白和基質蛋白質的差異來區分(參見圖1)。如下文進一步所討論，流感A亞型是通過其血球凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)基因的變化來定義並且通常通過結合對應蛋白質的抗體來區分。流感A病毒基因組是由分布於8個RNA片段中的10種基因組成。所述基因編碼10種蛋白質包膜糖蛋白細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)；基質蛋白質(M1)；核蛋白(NP)；3種聚合酶(PB1、PB2和PA)，是在本文中又稱作聚合酶或聚合酶複合物的RNA依賴性轉錄酶的組分；離子通道蛋白質(M2)和非結構蛋白質(NS1和NS2)。關於流感A病毒和其分子致病原因的其他細節，參見Julkunen，I.，等人，CytokineandGrowthFactorReviews，12171-180，2001。也參見Fields，B.，等人，Fields′Virology，第4版，PhiladelphiaLippincottWilliamsandWilkins；ISBN0781718325，2001。流感B病毒基因組的組織極其類似於流感A的組織，而流感C病毒基因組含有7個RNA片段並且沒有NA。流感A病毒分類是基於血球凝集素(H1-H15)和神經氨酸酶(N1-N9)基因。世界衛生組織(WHO)命名法通過其動物宿主來源(規定除人類外)、地理來源、菌株數量、分離年份和HA和NA的抗原性描述來定義各種病毒株。舉例而言，A/波多黎各/8/34(H1N1)稱為菌株A，分離株8，是於1934年，在波多黎各產生於人類中，並且具有HA和NA的抗原性亞型1。作為另一個實例，A/雞/香港/258/97(H5N1)稱為菌株A，分離株258，是於1997年，在香港產生於雞中，並且具有HA的抗原性亞型5和NA的抗原性亞型1。具有HA的H1型、H2型和H3型和NA的N1型和N2型的病毒已引起人類流行病。如上所述，在流感病毒A中，通過2種主要機制發生遺傳變異。遺傳漂變(geneticdrift)，通過點突變發生，因來自宿主免疫反應的選擇性壓力而常發生於抗原性顯著位置，和遺傳漂移(geneticshift)(也稱為重配)，涉及一種亞型的整個病毒基因組片段被另一個亞型所取代。許多不同類型的動物物種包括人類、豬、鳥類、馬、水生哺乳動物和可變為受流感A病毒感染的其它動物。一些流感A病毒局限於特定物種並且通常不感染不同物種。然而，一些流感A病毒可感染若干不同動物物種，主要為鳥類、豬和人類。所述能力被認為是引起流感A病毒中主要抗原轉變的原因。舉例而言，假定豬變為經來自人類的流感A病毒感染並且同時變為經來自鴨的不同流感A病毒感染。當2種不同病毒在豬細胞中繁殖時，人類菌株和鴨菌株的基因可「混合」，產生具有RNA片段的獨特組合的新病毒。所述過程稱為遺傳重配。如同其他病毒一樣，流感病毒在細胞內複製。流感A病毒在呼吸道的上皮細胞中複製。然而，單核細胞/巨噬細胞和其他白細胞也可被感染。許多具有含有擔當病毒受體的唾液酸的細胞表面糖蛋白的其他細胞類型易感於活體外感染。流感A感染/複製周期示意性地描述於圖1中。如圖1A中所示，流感A病毒粒子100包含基因組101，基因組101由8個負鏈RNA片段組成PB2(102)、PB1(103)、PA(104)、HA(105)、NP(106)、NA(107)、M(108)和NS(109)。按照慣例從1到8編號，PB2＝1，PB1＝2，PA＝3，HA＝4，NP＝5，NA＝6，M＝7和NS＝8。基因組RNA片段包裝在膜蛋白質M1120的層內部，膜蛋白質M1120周圍是脂質雙層130，包膜糖蛋白HA140和NA150的胞外域和離子通道M2160從脂質雙層130突出出來。RNA片段102-108被核蛋白MP170覆蓋並且含有由聚合酶PB1、PB2和PA組成的病毒聚合酶複合物180。在病毒粒子內還發現非結構蛋白質NS2190。在受感染細胞內發現非結構蛋白質NS1(未圖示)。圖1B顯示流感病毒和從流感基因組產生的轉錄本的基因組結構(未按比例繪製)。8個基因組RNA片段中的6個(PB1(102)、PB2(103)、PA(104)、HA(105)、NP(106)和NA(107))各自充當用於編碼對應蛋白質的單一、未剪接轉錄本的模板。3種mRNA轉錄本已被識別為得自流感病毒A片段M(108)編碼M1蛋白質的共線性轉錄本191，編碼M2蛋白質並且含有689核苷酸內含子的經剪接mRNA192，和具有編碼還未在經病毒感染的細胞中檢測到的9胺基酸肽(M3)的能力的另一種經剪接mRNA193。2種mRNA轉錄本是得自流感病毒A片段NS編碼NS1蛋白質的未剪接mRNA194和編碼NS2蛋白質並且包括473核苷酸內含子的經剪接mRNA195。當病毒粒子100通過其血球凝集素連接到易感細胞的表面時，感染周期(圖2)開始。經連接的病毒通過網格蛋白(clathrin)依賴性內吞作用而內吞到包被膜泡200中。內體中的低pH值觸發病毒膜和內體膜的融合，引起病毒核糖核蛋白(vRNP)複合物(核衣殼)210釋放到細胞質中。病毒核衣殼被引入細胞核中，其後，由PB1、PB2和PA聚合酶組成的病毒RNA聚合酶複合物引發初級病毒mRNA合成。通過PB2蛋白質的核酸內切酶活性而在宿主細胞前體mRNA(pre-mRNA)上產生的引物用於引發使用病毒RNA(vRNA)220作為模板的病毒mRNA合成。PB1蛋白質催化病毒特異性mRNA230的合成，mRNA230被運輸到細胞質中並且被翻譯。將新合成的聚合酶運輸到核中並且調節複製和次級病毒mRNA合成。PB1、PB2、PA和NP引發從病毒RNA(vRNA)合成互補RNA(cRNA)240，其後，合成新vRNA分子250。病毒聚合酶複合物使用所述vRNA作為模板來合成次級mRNA260。因此，通過經病毒編碼的轉錄酶進行的vRNA轉錄產生用作病毒蛋白質合成的模板的mRNA，並且也產生用作另外合成用於新病毒粒子產生的vRNA的模板的互補RNA(cRNA)。將病毒mRNA運輸到細胞質中，在細胞質中產生病毒結構蛋白質270。將蛋白質PB1、PB2、PA和NP運輸到核中，即裝配vRNP複合物(核衣殼)280的位點。病毒顆粒的出芽和釋放發生在質膜處。流感A病毒在細胞中快速複製，造成宿主細胞因細胞溶解作用或細胞凋亡而死亡。感染引起廣泛種類的細胞活性和包括抑制宿主細胞基因表達的方法的改變。病毒聚合酶複合物結合併分裂核中新合成的細胞聚合酶II轉錄本。NS1蛋白質阻斷細胞前體mRNA剪接並且抑制宿主mRNA的核輸出。細胞mRNA的翻譯被大大抑制，而病毒mRNA被有效翻譯。病毒mRNA的有效翻譯的維持部分上是通過細胞幹擾素(IFN)反應的病毒下調實現，所述細胞幹擾素反應是一種通常在經病毒感染的細胞中起抑制翻譯作用的宿主反應。具體來說，病毒NS1蛋白質結合經IFN誘導的PKR並且抑制其活性。因此，顯然，流感病毒感染造成細胞生物合成的深刻改變，包括細胞mRNA的加工和翻譯的改變。II.RNAi誘導實體的選擇、設計和合成A.RNAi誘導實體的選擇和設計本發明提供靶向一種或一種以上流感病毒轉錄本的RNAi誘導實體。各種病毒RNA轉錄本(初級和次級vRNA，初級和次級病毒mRNA，和病毒cRNA)在經流感病毒感染的細胞中存在並且在病毒生命周期中起重要作用。所述轉錄本中的任何轉錄本是用於通過根據本發明的直接或間接機制實現的RNAi介導抑制的適當標靶。靶向任何病毒mRNA轉錄本的優選RNAi誘導實體將以直接方式，例如通過引起轉錄本的降解而特異地降低轉錄本自身的含量。另外，靶向某些流感病毒轉錄本(例如NP、PA、PB1)的RNAi誘導劑將間接引起並非其所特異靶向的流感病毒轉錄本的含量降低。可充當根據本發明的基於RNAi的療法的標靶的病毒轉錄本包括(例如)，1)任何流感病毒基因組片段；2)編碼任何病毒蛋白質的轉錄本，包括編碼蛋白質PB1、PB2、PA、NP、NS1、NS2、M1、M2、HA或NA的轉錄本。儘管本發明者已經獲得暗示病毒mRNA是RNAi的唯一或主要標靶的數據，但是單一RNAi誘導劑可能靶向轉錄本的vRNA、cRNA和/或mRNA形式。在特別優選實施例中，標靶轉錄本編碼流感病毒蛋白質NP、PA、PB1或PB2。RNAi誘導劑的一般特徵在所屬領域中是已知的。RNA幹擾最初被識別為長dsRNA(通常數百個nt)在細胞中的存在引起含有與dsRNA的一條鏈互補的區域的mRNA的序列特異性降解的現象(第6,506,559號美國專利)。如WO01/75164和第20020086356號與第20030108923號美國公開案中所述，siRNA首先發現於在果蠅中的RNAi研究中。具體來說，據發現，在果蠅中，長dsRNA被叫做Dicer的類似於RNaseIII的酶(Bernstein等人，Nature409363，2001)加工成由2條21nt鏈組成的更小dsRNA，每一條都具有5′磷酸基和3′羥基，並且包括與另一條鏈精確互補的19nt區，以便存在側接2nt3′突出端的19nt雙鏈體區。圖3顯示在果蠅中發現的siRNA的示意圖。結構包括19核苷酸雙鏈(DS)部分300，其包含有義鏈310和反義鏈315。各條鏈具有2nt3′突出端320。所述短dsRNA(siRNA)起抑制任何包括與dsRNA鏈之一互補的區域的基因的表達的作用，估計可能是因為解螺旋酶活性解開siRNA中的19bp雙鏈體，使得在siRNA的一條鏈(「反義」或「引導」鏈)與標靶轉錄本之間形成另一種雙鏈體。反義鏈被併入核酸內切酶複合物，即RISC中，而指向互補標靶RNA。酶促活性存在於RISC分裂物(「切片」)中的單一位置處，產生通過細胞機器迅速降解的不受保護的RNA末端(圖4)。如下文所述，由短RNA物種(微RNA)介導的另外的抑制機制也是已知的(參見，例如，Ruvkun，G.，Science，294，797-799，2001；Zeng，Y.，等人，MolecularCell，9，1-20，2002)。應了解，對機制的論述和描繪機制的圖並不是旨在暗示對用於本發明的RNA幹擾機制的任何限制。在線蟲(C.elegans)到人類的各種物種中發現了Dicer酶的同系物(Sharp，GenesDev.15；485，2001；Zamore，Nat.Struct.Biol.8746，2001)，從而提高了以下可能性類似於RNAi的機制也許能抑制包括哺乳動物或甚至人類細胞在內的各種不同細胞類型中的基因表達。然而，已知長dsRNA(例如，具有比約30-50個核苷酸長的雙鏈區的dsRNA)激活哺乳動物細胞中的幹擾素反應。因此，比起達到用果蠅RNAi機制所觀察到的特異基因抑制，更希望長dsRNA在哺乳動物細胞中的存在引起由幹擾素所介導的對翻譯的非特異性抑制，而可能造成細胞死亡。因此不認為長dsRNA適用於抑制哺乳動物細胞中特定基因的表達。然而，本發明者和其他人已經發現，當引入哺乳動物細胞中時，siRNA可有效降低包括病毒基因在內的標靶基因的表達。本發明者已經發現，當包括在siRNA或shRNA中並且按下文和同在申請中的專利申請案U.S.S.N.10/674,159中所述來測試時，使用本文所述的第一組設計參數所選擇的相當大比例的序列被證明是有效的抑制序列。來自初始設計組(實例1)的大約15％的siRNA在經流感病毒的PR8或WSN菌株感染的細胞中，顯示強大作用並有效抑制病毒產生；大約40％顯示顯著作用(即，在用PR8感染的細胞中和/或在用WSN感染的細胞中，在存在siRNA相對不存在siRNA的病毒產生之間具有統計學顯著差異(p＜0.05))；大約45％不顯示或顯示極小作用。具體來說，靶向編碼RNA依賴性RNA轉錄酶和核蛋白NP的基因的RNA，顯著降低在受感染哺乳動物細胞中所產生的病毒的含量(實例2、4、5、6)。本發明者也已經證實，靶向流感病毒轉錄本的siRNA可抑制完整生物體(即受流感病毒感染的雞胚)中的活體內流感病毒複製(實例3)。另外，本發明者已經證明，靶向流感病毒轉錄本的siRNA當在病毒感染前或後投與時，可抑制小鼠中的病毒產生(實例12、14、16、23-26等)。此外，本發明者已經證實，投與可用於siRNA前體(shRNA)表達的DNA載體抑制了小鼠中的流感病毒產生。使用第二組設計標準設計另外的有效RNAi誘導劑，包括當測試在細胞和/或小鼠中抑制流感病毒產生的能力時為高度有效的許多siRNA。因此，本發明證明，用諸如siRNA、shRNA的RNAi藥劑，或用在細胞中的存在引起所述藥劑的表達的載體進行治療，是抑制例如流感病毒的呼吸道病毒的感染和/或複製的有效策略。隨後針對高致病禽流感病毒株測試2種高度有效的siRNA，並顯示對病毒珠的抑制作用，證實所述siRNA抑制廣泛範圍的流感病毒株的能力(Tompkins，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，101(23)8682-6，2004)。因此，本發明提供在經多種不同流感病毒株的任何病毒株感染的細胞中抑制病毒產生的RNAi誘導劑。雖然不希望受任何理論的束縛，但是本發明者建議，鑑於在經流感病毒感染後發生的例如新陳代謝和生物合成活性等細胞活性的深刻改變，所述發現尤其有意義。流感病毒感染抑制諸如細胞mRNA剪接、運輸和翻譯等基本細胞過程，並且造成對細胞蛋白質合成的抑制。不管所述改變如何，靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導劑抑制病毒複製的發現暗示，RNAi所介導的基因表達抑制的潛在細胞機制繼續以足以抑制流感基因表達的水平在被流感病毒感染的細胞中起作用。對任何所選擇的特定基因標靶來說，根據本發明使用的RNAi誘導劑的設計將優選遵循某些準則。通常，期望標靶序列對病毒來說是特定的(與宿主比較)，並且優選地對病毒功能來說是重要或基本的。因此，期望避免標靶轉錄本可能與其他不希望降解的轉錄本所共有的部分。可實施資料庫搜索來確定任一鏈是否實質上與藥劑將遞送到其的生物體(例如，人類)的基因組中的任何序列互補，且因此可避免這樣的序列。如本文所述，在多種變異體之間為保守病毒轉錄本的部分是優選標靶。根據本發明使用的優選RNAi誘導劑包括在15與大約29個nt之間長(例如長度為大約19個nt)的鹼基對區，並且可視需要具有一個或一個以上的游離端或成環端。圖5呈現根據本發明可用作RNAi誘導劑的各種結構。圖5A顯示發現在上述果蠅系統中和哺乳動物細胞中呈活性的結構。本發明涵蓋將具有圖5A中所示結構的siRNA投與哺乳動物細胞以治療或預防流感感染。然而，並不需要所投與藥劑具有所述結構。舉例而言，所投與的組合物可包括能夠在活體內加工成圖5A結構的任何結構，只要所投與的藥劑不引起諸如誘導幹擾素反應的不期望或有害事件即可。本發明也可包含投與未精確地加工成圖5A中所示結構的藥劑，只要所述藥劑的投與如本文中所討論充分降低病毒轉錄本含量即可。在一些情況下，根據本發明遞送到細胞中的藥劑在變成活性抑制劑之前可能經歷一個或一個以上的加工步驟(進一步討論參見下文)；在所述情況下，所屬領域的技術人員應了解，將相關藥劑優選設計成包括可能是其加工所必需的序列。圖5B和5C表示可用於介導RNAi的另外的結構。所述髮夾式(莖-環)結構可直接起抑制性RNA的作用或可經過細胞內加工(例如，通過Dicer)而產生諸如圖5A中所述結構的siRNA結構。圖5B顯示包含RNA分子的藥劑，所述RNA分子含有2個互補區，這2個互補區彼此雜交，形成表示為莖400的雙鏈體區、環410和突出端320。據稱所述分子是自身雜交，並且將所述類別的結構稱為shRNA。對於shRNA結構的實例，也參見圖20和21。圖5C顯示包含RNA圓環的藥劑，所述RNA圓環包括足以形成大約19個bp長的莖400的互補元件。與本文所述的各種其他siRNA比較，所述藥劑可顯示改善的穩定性。在RNAi誘導劑和其活性的描述中，如在siRNA的情況下，常方便地將藥劑視為具有2條鏈。通常，RNAi誘導劑的一條鏈的雙鏈體部分的序列與標靶轉錄本在所述區域中實質上互補。RNAi誘導劑的另一條鏈的雙鏈體部分的序列通常與標靶轉錄本的所靶向部分實質上相同。包含與標靶互補的部分的鏈稱作「反義鏈」，而另一條鏈常稱作「有義鏈」。與標靶互補的反義鏈部分可稱作「抑制區」。可認為shRNA的雙鏈體結構包含反義鏈和有義鏈，其中反義鏈是與分子的第二部分形成雙鏈體或能夠與分子的第二部分形成雙鏈體的分子的第一部分，並且與標靶轉錄本的所靶向部分互補。有義鏈是與第一部分形成雙鏈體或能夠與第一部分形成雙鏈體的分子的部分。所屬領域的技術人員應了解，靶向來自負鏈RNA病毒的vRNA鏈的「反義鏈」對vRNA來說將是反義的，而相對於病毒cRNA來說是「有義鏈」。同樣地，靶向來自負鏈RNA病毒的cRNA鏈的「反義鏈」對cRNA來說將是反義的，而相對於vRNA序列來說是「有義鏈」。為進行描述，以下論述常是指siRNA。然而，若所屬領域的技術人員所顯而易見，與siRNA的2條鏈相關的教示一般適用於，例如可經過細胞內加工而產生siRNA的相應shRNA的任何RNAi誘導劑的莖部分的有義鏈和反義鏈。因此，通常下文的討論也適用於本發明RNAi誘導劑的設計、選擇和遞送，例如，經過細胞內加工而產生介導標靶分裂或翻譯抑制的RNA的shRNA。通常，優選siRNA反義鏈與標靶位點雜交，所述標靶位點包含或由標靶轉錄本中的外顯子序列組成。在本發明的某些實施例中，反義鏈與5′或3′非翻譯區雜交。通常，可利用可用於與反義鏈雜交而產生轉錄本的切斷和降解和/或翻譯抑制的任何位點。可根據各種方法來選擇RNAi誘導劑。通常，如上所述，本發明RNAi誘導劑優選包括一區域(所述「雙鏈體區」)，其中的一條鏈含有與標靶轉錄本的一部分(「標靶部分」)足夠互補的長度在15-29個nt之間的抑制區，以便在所述鏈與標靶轉錄本之間可活體內形成雜交。應了解，所述雙鏈體區-又稱作「核心區」-不包括突出端。如果存在突出端，那麼突出端可(但不必)與標靶轉錄本互補。優選地，所述雙鏈體區包括圖3、4和5中所述的大多數或所有雙鏈結構。優選地，抑制區是100％互補於標靶。然而，所屬領域的技術人員將認識到，錯配和凸出可存在於通過反義鏈和標靶形成的雙鏈體中。因此，抑制區只需要與標靶足夠互補，以便(例如)在細胞中和/或在諸如上述果蠅提取物系統的提供RNAi的活體外系統中，在生理條件下，可發生雜交。優選地，抑制區和標靶至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％並且最優選100％彼此互補。優選地，在所述區域中少於6個殘基或者約20％(例如1、2、3、4個)的反義鏈殘基在15-29個nt(例如，19個nt)的窗口範圍內與標靶錯配。優選地，在所述區域中少於4個殘基或者約15％的反義鏈殘基與標靶錯配。優選地，僅存在1個或2個錯配。錯配中的一個或一個以上(或所有)錯配可以是U-G錯配。舉例而言，如果抑制區是15-16個nt長，那麼可存在0-3個錯配；如果抑制區是17個nt長，那麼可存在0-4個錯配；如果抑制區是18個nt長，那麼可存在0-5個錯配；如果抑制區是19個nt長，那麼可存在0-6個錯配。可允許的錯配數由存在於抑制區中每一個另外的nt增加一個nt直到RNAi誘導劑抑制區的上限，例如大約30個nt的長度。在某些實施例中，錯配不處於連續位置上。在某些實施例中，沒有長於2個nt長度的錯配段。在優選實施例中，15-19個nt的評估窗口含有0-1個錯配(優選為0個)，並且20-29個nt的評估窗口含有0-2個錯配(優選為0-1個，更優選0個)。所屬領域的技術人員應認識到，被凸出中斷的雙鏈體結構通常會允許更大數量的未成對nt。所屬領域的技術人員也應認識到，可優選地避免反義鏈/標靶RNA雙鏈體中心部分中的錯配(參見，例如，Elbashir等人，EMBOJ.206877，2001)。舉例而言，siRNA的反義鏈的3′核苷酸常常不明顯促進標靶辨別的特異性並且對於標靶分裂並不至關重要。在某些實施例中，反義鏈和標靶是在反義鏈抑制區的位置10處互補。在其他實施例中，它們不互補。某些RNAi誘導劑含有與標靶位點雜交的鏈，所述標靶位點包括或完全由3′UTR序列組成。所屬領域的技術人員應了解，所得雙鏈體可允許較大數量的錯配和/或凸出，特別是在雙鏈體中心區中的錯配，同時仍產生有效抑制。舉例而言，一條或兩條鏈可包括一個或一個以上形成如圖6中所示的凸出的「額外(extra)」核苷酸。可存在(例如)5-10個nt長的一個或一個以上的凸出。通常，完全互補段的長度至少5個nt，例如6、7個或7個以上的nt，而錯配區例如可以是1、2、3或4個nt長。雙鏈體常包括由錯配區分開的2個完全互補段。各種結構都有可能。舉例而言，可存在多個錯配區。一些錯配可能是所需要的，因為在3′UTR或在其他位置中的雙鏈體形成可能抑制由轉錄本所編碼的蛋白質的表達，所述抑制的機制與作為經典RNA抑制的標誌的分裂相關但有所不同。如圖6所示，已知在上述果蠅系統中以及在各種生物體中產生siRNA的Dicer酶也將小的、短暫RNA(stRNA)底物加工成抑制劑，所述抑制劑在結合到標靶轉錄本的3′UTR內時，阻斷轉錄本的翻譯(參見Grishok，A.等人，Cell106，23-24，2001；Hutvagner，G.等人，Science，293，834-838，2001；Ketting，R.等人，GenesDev.，15，2654-2659)。隨後的發現已顯示，在線蟲到哺乳動物的生物體的基因組編碼叫做微RNA(miRNA)的一類短(約19-25個核苷酸)RNA，所述微RNA抑制與其部分互補的內源性mRNA的翻譯。在Barrel，DP.，Cell，116(2)281-97，2004；Novina，C.和Sharp，PA，Nature，430161-164，2004；和美國公開案第20050059005號中討論了微RNA。miRNA在部分互補位點結合標靶mRNA轉錄本並阻止其翻譯。具有siRNA的結構(彼此雜交的2個個別短鏈)的RNAi誘導劑可以類似於miRNA的方式起作用，也就是說，通過降低轉錄本的翻譯而不是降低其穩定性來起作用(Doench，JG等人Genes&Development，17438-442，2003)。據認為，所述siRNA經過細胞內加工而產生單鏈RNA，所述單鏈RNA通過miRNA翻譯抑制路徑起作用。對本發明的目的來說，一條鏈結合標靶轉錄本並降低其表達(即，降低轉錄本的含量和/或降低由轉錄本所編碼的多肽的合成)的本文所述的任何部分或完全雙鏈短RNA，被認為是RNAi誘導劑，而不管它是通過觸發降解、抑制翻譯還是通過其他方式起作用。另外，可經過活體內加工(即，在細胞或生物體中)而產生所述RNAi誘導劑的任何前體RNA結構適用於本發明中。在一些情況下，選擇RNAi誘導劑的序列以便整個反義鏈(包括(如果存在)3′突出端)與標靶轉錄本完全互補。然而，突出端並非必需與標靶轉錄本互補或相同。任何所要求的序列(例如UU)可簡單地附加於反義和/或有義核心區的3′端以產生3′突出端。通常，使用含有一個或一個以上嘧啶，通常為U、T或dT的突出端。當合成RNAi誘導劑時，可更方便地在突出端中使用T而不是U。使用dT而不是T可增加穩定性。優選地，RNAi誘導劑的鏈在核心區中彼此100％互補。然而，所屬領域的技術人員應認識到，在由反義鏈和有義鏈所形成的雙鏈體中可存在錯配和凸出。鏈只需要彼此足夠互補，以便(例如)在細胞中和/或在諸如上述果蠅提取物系統的提供RNAi的活體外系統中，在生理條件下，可發生雜交。優選地，RNAi誘導劑的2條鏈在核心區中實質上互補，例如在核心區中，至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％並且最優選100％彼此互補。舉例而言，15-16個nt長的核心區可含有0-3個錯配；17個nt長的核心區可含有0-4個錯配；18個nt長的的核心區可含有0-5個錯配；19個nt長的核心區可含有0-6個錯配。可允許的錯配數由存在於抑制區中每一個另外的nt增加一個nt直到RNAi誘導劑抑制區的上限，例如大約30個nt的長度。在優選實施例中，15-19個nt的核心區含有0-1個錯配(優選為0個)，並且20-29個nt的核心區含有0-2個錯配(優選為0-1個，更優選0個)。所屬領域的技術人員應認識到，被凸出中斷的雙鏈體結構通常會允許更大數量的未成對nt。總之，RNAi誘導劑可通過選擇標靶部分和設計RNAi誘導劑來設計，所述RNAi誘導劑包含序列足夠互補以與標靶雜交的反義鏈，例如，在15-29個核苷酸，例如在19個核苷酸範圍內與標靶轉錄本實質上互補或100％互補；序列足夠互補以與反義鏈雜交的有義鏈，例如與反義鏈實質上互補或優選100％互補。然後可將諸如上述突出端的3′突出端添加到所述序列中以產生siRNA結構。所屬領域的技術人員應了解，諸如siRNA的RNAi誘導劑可根據上述原則而展現一定範圍的熔化溫度(Tm)。Tm定義為50％的核酸和其完全互補體是在呈溶液狀態的雙鏈體中時所處的溫度。基於本文實例中揭示的siRNA序列，使用所屬領域中熟知的方法，實驗性地或使用適當經驗性或理論導出方程式，可容易確定公認Tm的代表性實例。在本發明的某些實施例中，由反義鏈和標靶轉錄本所形成的雙鏈體的Tm計算值，相比於將在標靶與具有與標靶完全互補的抑制區的反義鏈之間所形成的雙鏈體的Tm計算值，低至多5℃，低至多10℃或低至多15℃。在本發明的某些實施例中，由RNAi誘導劑的反義鏈和有義鏈所形成的雙鏈體的Tm計算值，相比於將在反義鏈與完全互補(視需要排除突出端)的有義鏈之間所形成的雙鏈體的Tm計算值，低至多5℃，低至多10℃或低至多15℃。所屬領域的技術人員將能計算Tm值。若干研究已經使用用於最近鄰相互作用的熱力學基組，導出了用於Tm的準確方程式。熱力學參數值可在文獻中獲得。對於RNA，參見Freier，S.M.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.83，9373-9377，1986。Rychlik，W.，等人，Nucl.AcidsRes.18(21)，6409-6412，1990。優選地，使用Walter，A.E.，Proc.Natl.Acad.Sci，91，9218-9222，1994中較近的值和方法，或更優選地，使用Mathews，DH，J.Mol.Biol，288，911-940，1999中的所述值和方法。用於計算Tm的電腦程式是廣泛可用的。參見，例如，網址URLwww.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html。優選地，使用用於計算諸如AG和Tm的相關參數的程序，該程序可在URLwww.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold的mfold網絡伺服器上獲得，如Zuker，M.，Nucl.Acids.Res.，31(13)，2003中所述。本發明的一個方面是辨別感染劑的多種菌株、亞型等(通稱為變異體)何時存在，誰的基因組在序列中有變化，常需要選擇和/或設計靶向在不同變異體之間高度保守的區域的RNAi誘導劑。通過比較足夠數量的序列和選擇高度保守的區域，可能用靶向所述高度保守的區域的單一RNAi誘導劑靶向多種變異體，例如，所述RNAi誘導劑的反義鏈在足夠長度的範圍內與高度保守的區域實質上互補，以便RNAi誘導劑介導RNAi。根據本發明的某些實施例，如果一區域在多種變異體之間是相同的，那麼稱該區域在這些變異體之間高度保守。根據本發明的某些實施例，如果由RNAi誘導劑所靶向的區域，例如15-29個核苷酸，優選19個核苷酸的區域，在變異體之間相差最多一個核苷酸(即，在0或1核苷酸位置處)，那麼就是高度保守的。根據本發明的某些實施例，如果一區域在變異體之間相差最多2個核苷酸(即，在0、1或2核苷酸位置處)，那麼所述區域在多種變異體之間是高度保守的。根據本發明的某些實施例，如果一區域在變異體之間相差最多3個核苷酸(即，在0、1、2或3核苷酸位置處)，那麼所述區域在多種變異體之間高度保守。根據本發明的某些實施例，RNAi誘導劑靶向在至少5、10、15、20、25、30、40、50種或50種以上的變異體之間高度保守的區域。為識別在一組多種變異體之間高度保守的區域，可使用於下程序。選擇序列組中的一個成員作為基本序列，也就是說，其他序列將與其進行比較的序列。根據本發明的不同實施例，基本序列可以是被比較的組中的序列之一，或者可以是從組中的序列得到的一致序列，例如，通過對於每個位置確定組中的序列之中在所述位置處的最常見核苷酸而得到。選擇了基本序列之後，將多種變異體組的各成員的序列與基本序列比較。基本序列與多種變異體組的任何成員之間的在序列區域(例如15-29個核苷酸，諸如19個核苷酸的區域)範圍內的差異數，用於確定所關注的特定區域在基本序列與正與其比較的組成員之間是否高度保守。如上所述，在本發明的各種實施例中，如果在2個區域之間，序列不同的位置數是0；0或1；0、1或2；或0、1、2或3，那麼認為所述區域是高度保守的。可選擇RNAi誘導劑的反義序列以跨越具有15-29個核苷酸，例如19個核苷酸的高度保守區與基本序列互補，或可進行選擇以跨越高度保守區與其他序列之一互補。通常，選擇有義鏈序列以跨越高度保守區與基本序列或其他序列之一相同，以便反義鏈和有義鏈在RNAi誘導劑的雙鏈體部分中彼此100％互補。通常，關於如上文所述的基本序列選擇反義鏈序列。然而，在本發明的某些實施例中，特別是如果存在於正在比較的組中的第二序列中的特定位置處的核苷酸，在正在比較的序列中比在基本序列中的對應定位的核苷酸更多見，那麼可關於第二序列來選擇反義鏈序列(例如，與存在於第二序列中的高度保守區100％互補)。另外，根據本發明的某些實施例，如果在存在差異的位置處的一致核苷酸(最常存在的核苷酸)不同於在基本序列中所發現的所述核苷酸，那麼可使用一致核苷酸。注意，此舉可能產生與正在比較的序列的任何序列所不同的序列(因為可能使用一致序列作為基本序列)。實例1描述基於來自具有人類宿主來源的6種流感A菌株的序列組的比較，和來自具有不同動物宿主來源(包括人類)的7種流感A菌株的序列組的比較，選擇高度保守的標靶部分，並且設計靶向所述部分的siRNA序列。可使用選擇高度保守區的不同方法。本發明涵蓋RNAi誘導劑，其雙鏈體部分(和視需要任何突出端)是基於滿足本文中提供的標準的高度保守的區域來選擇，而不管如何選擇高度保守的區域。也應了解，本發明涵蓋靶向不滿足對於本文所述的優選標靶區的標準的流感病毒轉錄本部分的RNAi誘導劑。舉例而言，不靶向高度保守或適當保守的標靶部分的RNAi誘導劑對於某些菌株而言可能仍然是流感病毒產生的有效抑制劑。不太有效的RNAi誘導實體也可以用於評估標靶特異性，識別RNAi功效的決定因素，改進RNAi設計等。表1A列出21核苷酸區域，其在病毒基因片段的每一個片段的流感病毒序列組中高度保守。表1A中所列的各個序列包括19nt區域(nt3-21)；和初始2nt序列，其在對應siRNA的有義鏈中不存在但與siRNA的反義鏈的3′突出端互補。應了解，19nt區域可用作有義鏈，以設計各種在有義鏈和反義鏈的任一鏈或兩者中具有不同3′突出端的siRNA分子。因此，可從表1A中所列的各個序列獲得各種有義和反義siRNA序列。表2中列出20種這樣的siRNA序列。表1B列出基於流感病毒的高度保守區所設計的另外的siRNA。兩條鏈以5′到3′方向顯示。dTdT3′突出端附加於各條鏈上。表1B中列出的有義鏈序列的各個序列中的核苷酸1到19具有與流感病毒轉錄本的高度保守區相同的序列。對應的反義序列與有義鏈互補。在本發明的某些實施例中，「高度保守區」是指表1A中所列序列中的任何序列中的nt3-21，或表1B中所列有義鏈的任何有義鏈中的nt1-19。所述區域以雙鏈形式存在於某些本發明的RNAi誘導劑中，以便藥劑的反義鏈靶向高度保守的部分。將所述區域的序列稱作「高度保守序列」或「高度保守的標靶部分」。高度保守的標靶部分的選擇，是設計將成功抑制多種不同流感病毒株的RNAi誘導實體的一種方法。然而，本發明也提供選擇優選標靶部分的代替方法，所述優選標靶部分是適當保守的，以便提高靶向標靶部分的RNAi誘導劑抑制標靶轉錄本在多個不同菌株中的表達的可能性，所述不同菌株在標靶部分中的序列有所不同。根據本發明，如果標靶部分是適當保守的，那麼反義鏈包含與在一種或一種以上菌株(例如PR8)中所發現的標靶部分100％互補的抑制區的RNAi誘導劑，優選地抑制存在於一種或一種以上其他菌株中的對應轉錄本的表達，在所述其他菌株中，對應標靶部分與反義鏈的抑制區小於100％互補。本發明提供靶向流感A病毒轉錄本的適當保守部分的各種RNAi誘導劑，其中根據本發明的方法來選擇適當保守的標靶部分。在本發明的某些實施例中，標靶部分跨越從人類分離得到的多個流感A病毒株是適當保守的。在本發明的某些實施例中，所述部分跨越從例如禽類的人類以外的動物分離得到的多個流感A病毒株是適當保守的。在本發明的某些實施例中，所述部分跨越從人類分離得到的多個流感A病毒株以及跨越從例如禽類的非人類動物分離得到的多個流感A病毒株是適當保守的。舉例而言，所述部分可能在至少5、10、15、20種或20種以上具有人類和/或動物來源的變異體之間適當保守。在本發明的某些實施例中，標靶部分是適當保守和高度保守的。對任何病毒標靶來說，適當保守的標靶部分可通過以下方法來識別首先將來自多種變異體的轉錄本序列比對，並將其與所選的基本序列比較以識別差異，即，所述序列中的一個或一個以上序列中核苷酸的身份與基本序列中不同的位置。評估差異的性質來確定該差異是否顯著。當討論被比對和比較以選擇保守區的序列組時，「差異」是指序列中的一個或一個以上序列中與基本序列所不同的位置，而不管有多少序列與基本序列不同。可以各種方式選擇基本序列。舉例而言，可方便地從高度流行的或在實驗室裝配下可容易使用的菌株選擇一序列。當比較組內變異體中所存在的對應標靶部分時，適當保守的標靶部分滿足以下標準(1)在任何位置允許基本序列與對應序列之間的A為G或C為U的差異；(2)僅在位置1、18和19中的一個或一個以上位置允許基本序列與對應序列之間的G為A或C為A的差異；(3)在位置1與9之間，在基本序列與對應序列之間，存在0、1、2或3個差異；(4)在基本序列與對應序列之間存在不超過2個連續差異；和，(5)在位置11與17之間，在基本序列與對應序列之間，存在最多1個差異。可選擇任何菌株作為基本菌株。優選地，比較至少5種變異體來識別適當保守的標靶部分。在禽類和/或其他動物宿主中循環的流感病毒有時獲得感染人類的能力。可能部分上是由於人類中缺乏免疫力，這樣的菌株常常導致高死亡率。實例包括1918年的大流行病和在香港(1997)和越南(2004)，因禽流感感染人類而引起的死亡。關於具有禽類或其他動物宿主來源的菌株傳播到人類群體中的可能性的關注日益增加，而現有疫苗不能保護人類避免禽流感病毒或豬流感病毒感染。本發明識別跨越多個最初從人類分離得到的菌株(人類衍生菌株)和最初從例如禽類的非人類動物分離得到的菌株(禽類衍生菌株)的適當保守和/或高度保守的標靶部分，並且提供靶向所述標靶部分的RNAi誘導劑。所述RNAi誘導劑能夠提供保護以抵抗多種流感病毒株，包括人類衍生菌株和從非人類動物宿主得到的菌株。實例17描述，對於RNAi是適當保守標靶的流感轉錄本標靶部分的識別。第一步是識別所有可能的19核苷酸流感病毒標靶部分。本文中考慮列出表15A-15H或表19A-19F中所列出的發現於PR8或另一種流感病毒株中的各個19核苷酸可能標靶部分的序列，只是未具體陳述。通過參考圖32A-32J中的流感病毒片段的序列，可容易地識別所述序列。下一步是識別RNAi的優選功能標靶部分，即，序列特徵暗示具有與標靶雜交的反義鏈的RNAi誘導劑將有效抑制其表達的基因的區域。優選功能標靶部分滿足關於GC含量和不存在G或C殘基的連續段的各種標準。表17(圖33)列出存在於基本病毒株PR8中的優選功能標靶部分的序列。為了識別適當保守標靶部分，接著將發現於大量人類衍生流感病毒株中的對應功能標靶部分比對。通常，當基因組序列經過比對以達到最大同源性和/或是同源時，例如在不同菌株中至少50％相同時，不同菌株中的「對應標靶部分」通常存在於不同病毒株的基因組中的大約相同位置上。通常，在比較2種菌株時對應標靶部分的同源性程度是至少60％、70％、80％或80％以上。舉例而言，對應標靶部分可不同於在基本病毒株中的1、2、3或4位置上所發現的標靶部分。通過以下方法容易識別所述優選同源標靶部分的確切序列訪問在諸如Genbank的資料庫中的相關流感病毒片段序列，將其與基本菌株序列比對，並定位某一部分，所述部分在大約相同核苷酸位置處和/或與在基本病毒株(例如，PR8)中所發現的標靶部分至少80％相同，優選至少90％相同。同源標靶部分是本發明的一個方面。使用上文所述的標準來選擇適當保守標靶部分。表18(圖34)列出了在得自人類的流感菌株之間適當保守的標靶部分的序列，如基本病毒株PR8中所存在的。除考慮從人類宿主分離得到的菌株外，也將從禽類宿主分離得到的菌株比對並進行比較，以識別在來自人類宿主的分離株和來自禽類宿主的分離株之間適當保守和/或高度保守的標靶部分。來自一種或一種以上其他動物宿主的分離株也可用於所述比較。將基本序列的適當保守標靶部分與經比對的禽類序列比較，並且使用用於識別人類分離株之間適當保守標靶部分的相同標準，來選擇適當保守標靶部分。表20(圖35)列出了在得自人類和禽類的流感菌株之間適當保守的標靶部分的序列，如在基本病毒株PR8中所存在的。表15A-15H或表19A-19F列出的發現於PR8或另一種流感病毒株中的各個19核苷酸可能標靶部分是本發明的一個方面。表15A-15H或表19A-19F列出的發現於PR8或另一種流感病毒株中的各個優選功能標靶部分是本發明的一個方面。表15A-15H或表19A-19F列出的發現於PR8或另一種流感病毒株中的各個適當保守和/或高度保守的標靶部分是本發明的一個方面。各個所述序列(也就是說，在人類衍生菌株之間可能的、優選功能、適當保守的序列，在人類衍生菌株和禽類衍生菌株之間高度保守的序列，和/或在人類或禽類衍生菌株或兩者之間高度保守的序列)的互補序列可用作靶向標靶部分的RNAi誘導劑的反義鏈的抑制區的序列。具有包含所述序列中的各序列或其至少15個核苷酸長的片段的反義鏈的RNAi誘導劑是本發明的一個方面。然而，如本文所述，也可使用包含展現與標靶部分的不及完全互補性或為更短或更長的反義鏈的各種RNAi誘導劑。標靶部分的序列可充當RNAi誘導劑的有義鏈。與反義鏈不完全互補的有義鏈也可如本文所述來使用。如上所述，表17、18和20中列出的標靶部分與流感A病毒PR8轉錄本的部分相同。在其他流感病毒A菌株中發現與表17、18和20中所列出的標靶部分相同或高度同源的各個轉錄本的對應標靶部分。在本發明的某些實施例中，靶向可能的流感病毒標靶部分，例如表17、18或20中列出的標靶部分的RNAi誘導劑的反義鏈的抑制區，並非與PR8序列100％互補，而是與表15A-15H或表19A-19F中列出的發現於一種或一種以上其他菌株中的對應標靶部分100％互補。本發明提供RNAi誘導實體，例如靶向本文所述的可能的標靶部分、功能標靶部分、適當保守部分和高度保守的標靶部分中的各個部分的RNAi誘導劑，例如siRNA或shRNA。本發明也提供RNAi誘導實體，例如靶向包含本文所述的可能的標靶部分、功能標靶部分、適當保守部分或高度保守標靶部分的至少15個連續nt的標靶部分的RNAi誘導劑，例如siRNA或shRNA。本發明也提供RNAi誘導實體，例如靶向包含本文所述的可能的標靶部分、功能標靶部分、適當保守部分或高度保守標靶部分的長度為多達大約29個nt的標靶部分的RNAi誘導劑，諸如siRNA或shRNA。標靶部分的其他核苷酸優選地直接定位於來自本文中列出的19nt標靶部分的5′和/或3′。換句話說，所述較長標靶部分中多達大約10個nt的一些其他部分可以是19nt標靶部分的上遊，而一些可以是19nt標靶部分的下遊。通過以下方法可容易識別確切序列訪問包含來自任何菌株的所列標靶部分或對應標靶部分的基因組片段的適當入口，並識別直接為所列或對應標靶部分的5′和/或3′的核苷酸。圖32A-32J呈現PR8(正鏈形式)的基因組片段序列。本發明提供RNAi誘導劑，已經在細胞培養物和/或在動物模型中經過測試以驗證其有效性並且識別可以高度有效方式被靶向的流感病毒轉錄本的部分。實例18描述，用於識別有效降低所靶向的流感病毒轉錄本的含量的siRNA的高通量篩選(HTS)。實例19-22描述，用於識別有效降低細胞中的流感病毒產生的siRNA的高通量篩選。某些優選的有效siRNA在以100nM的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少4倍。某些優選的高度有效siRNA在以100nM的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少8倍，或甚至更高程度。某些優選的有效siRNA在以1nM的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少4倍。某些優選的有效siRNA在以100nM的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少4倍、至少8倍或至少16倍。某些高度有效的siRNA在以5nM或5nM以下的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少2倍。某些甚至更高度有效的siRNA在以1nM或1nM以下的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少2倍。而更高度有效的siRNA在以0.8pM或0.8pM以下的濃度與細胞接觸時，使流感A病毒滴度降低至少2倍。濃度是指在引入時，siRNA存在於細胞外部的培養基中的濃度。在某些實施例中，RNAi誘導劑靶向來自例如NP、PA、PB1或PB2基因的基因的3′端的200個nt內的標靶部分。發現7種高度有效的siRNA靶向所述區域內的標靶部分。本發明者觀察到，流感基因片段的5′和3′端包含約10個鹼基，所述鹼基跨越不同基因片段和跨越不同流感病毒株是高度保守的。特別是，3種靶向PB1轉錄本的5′UTR的siRNA在100nM下顯示病毒滴度降低4倍。B.RNAi誘導實體的合成本發明的RNAi誘導劑可根據任何可用技術製備，所述技術包括(但不限於)化學合成、活體內或活體外酶促或化學分裂，或活體內或活體外模板轉錄。舉例而言，可通過酶促合成或通過部分/完全有機合成產生RNA，並且可通過活體外酶促或有機合成來引入經修飾的核苷酸。在一個實施例中，以化學方法製備siRNA。RNA分子的合成方法在所屬領域中是已知的，特別是如Verma和Eckstein，Annu.Rev.Biochem.6799-134(1998)中描述的化學合成方法。在另一個實施例中，以酶促方法製備siRNA。舉例而言，可通過將具有足夠互補性的長dsRNA酶促加工成所要求的標靶RNA來製備siRNA。長dsRNA的加工可(例如)使用適當的細胞溶胞產物而活體外完成，並且隨後可通過凝膠電泳或凝膠過濾來純化siRNA。舉例而言，RNA可通過用溶劑或樹脂進行提取、沉澱、電泳、色譜法或其組合而從混合物純化。或者，RNA可不經過純化或經最小純化而使用，以避免由樣品加工帶來的損失。本發明的RNAi誘導劑可以單一shRNA分子形式或以彼此雜交的2條鏈形式來遞送。舉例而言，可產生2條單獨的21ntRNA鏈，其中各鏈包含與另一條鏈互補的19nt區域，並且個別鏈可雜交在一起以產生諸如圖5A中所描述的結構。在一些實施例中，siRNA的各條鏈是通過由啟動子活體外或活體內轉錄來產生。舉例而言，構建體可包含2個單獨的可轉錄區，其中各區產生含有與另一者互補的19nt區域的21nt轉錄本。或者，可利用單一構建體，其包含經定位以便產生2種不同轉錄本的相反啟動子P1和P2和終止子t1和t2，其中所述2種不同轉錄本各自與另一者至少部分互補(圖7)。在另一個實施例中，shRNA是作為單一轉錄本產生，例如，通過對編碼自身互補區的單一轉錄單元進行轉錄而產生。圖8描述一個這樣的實施例。如所說明，使用包括第一和第二互補區並且視需要包括環區的模板。本發明涵蓋編碼一種或一種以上siRNA和/或shRNA鏈的構建體。除啟動子外，構建體還視需要包括一種或一種以上其他調控元件，例如終止子。可使用包括T7、SP6和T3啟動子/聚合酶體系(例如，可購自Promega、Clontech、NewEnglandBiolabs等的體系)的各種可用體系來執行活體外轉錄。當活體外合成siRNA時，可在轉染或遞送到受檢者之前使其雜交。應了解，本發明的siRNA組合物不需要完全由雙鏈(經雜交的)分子組成。舉例而言，siRNA組合物可包括小比例的單鏈RNA。通常，優選組合物包含至少大約80％的dsRNA，至少大約90％的dsRNA，至少大約95％的dsRNA，或甚至至少大約99-100％的dsRNA。然而，siRNA組合物可含有小於80％的雜交RNA，只要其含有有效的足夠dsRNA即可。所屬領域的技術人員應了解，如果本發明的siRNA或shRNA藥劑是活體內產生，那麼通常優選的是，通過對一種或一種以上轉錄單元進行轉錄來產生。可視需要加工(例如利用一種或一種以上的細胞酶)主要的轉錄本以產生實現基因抑制的最終藥劑。應另外了解，可容易地選擇適當的啟動子和/或調控元件以允許在哺乳動物細胞中表達相關轉錄單元。在本發明的一些實施例中，可能需要利用可調控的啟動子；在其他實施例中，可能需要構成性表達。如本文中關於siRNA或siRNA前體合成(轉錄)所使用的術語「表達」並不暗示經轉錄RNA的翻譯。在本發明的某些優選實施例中，用於引導一種或一種以上siRNA或shRNA轉錄單元的活體內表達的啟動子是RNA聚合酶III(PolIII)的啟動子。PolIII引導小轉錄本的合成，所述小轉錄本在模板中遇到一段4-5T殘基後終止。諸如U6或H1啟動子的某些PolIII啟動子在所轉錄的區域中不需要順式作用的調控元件(不同於先被轉錄的nt)，並因此根據本發明的某些實施例是優選的，因為這些啟動子使得容易選擇所要求的siRNA序列。參見，例如，Yu，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，99(9)，6047-6052(2002)；Sui，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，99(8)，5515-5520(2002)；Paddison，P.等人，GenesandDev.，16，948-958(2002)；Brummelkamp，T.等人，Science，296，550-553(2002)；Miyagashi，M.和Taira，K.，Nat.Biotech，20，497-500(2002)；Paul，C等人，Nat.Biotech，20，505-508(2002)；Tuschl，T.等人，Nat.Biotech，20，446-448(2002)。也可使用PolII啟動子，例如，如Xia，H.等人，Nat.Biotechnol，20，第1006-1010，2002頁中所述。如文中所述，可使用如下構建體其中將髮夾式序列並置於轉錄開始位點的附近並且接著polyA盒，在所轉錄的髮夾中產生最少到不產生突出端。在本發明的某些實施例中，可使用組織特異性、細胞特異性或可誘導PolII啟動子，只要滿足上述要求即可。在各種實施例中也可使用PolI啟動子(McCown2003)。應了解，提供用於合成siRNA或shRNA的模板的構建體(諸如圖7和8中所描述的)的活體內表達，可如下理想地實現將構建體引入諸如DNA質粒或病毒載體的載體中，並將載體引入哺乳動物細胞中。儘管在某些實施例中，可能需要選擇能將構建體遞送到易感於流感病毒感染的一種或一種以上細胞中的載體，但是可選擇各種載體中的任何載體。本發明涵蓋含有siRNA和/或shRNA轉錄單元的載體，以及含有所述載體或另外經工程操作而含有編碼一個或一個以上siRNA或shRNA鏈的轉錄單元的細胞。在本發明的某些優選實施例中，本發明載體是適於將表達siRNA或shRNA的構建體遞送到哺乳動物細胞，最優選為人類細胞的基因療法載體。所述載體可在暴露至流感病毒之前或之後被投與受檢者中，以提供對因病毒感染而引起的疾病和病狀的預防或治療。本發明因此提供各種病毒載體和非病毒載體，其在細胞中的存在引起一個或一個以上RNA的轉錄，所述RNA自身雜交或彼此雜交以形成抑制至少一種流感病毒轉錄本在細胞中的表達的RNAi藥劑。在本發明的某些實施例中，使用含有2個啟動子的單一載體來轉錄2條單獨的、互補的siRNA鏈，所述2個啟動子的每一個都引導單一siRNA鏈的轉錄，也就是說，可操作連接至用於siRNA的模板以使轉錄發生。2個啟動子可處於相同取向，在此情況下，各個啟動子可操作連接至用於siRNA鏈之一的模板。或者，啟動子可處於相反取向，側接單一模板以便由啟動子進行的轉錄合成出2條互補RNA鏈。在本發明的其他實施例中，使用含有一個啟動子的載體，所述啟動子驅動包含2個互補區的單一RNA分子(例如shRNA)的轉錄。在本發明的某些實施例中，使用含有多個啟動子的載體，所述啟動子的各個啟動子驅動包含2個互補區的單一RNA分子的轉錄。或者，可由單一啟動子或由多個啟動子對多個不同的shRNA進行轉錄。各種結構都有可能。舉例而言，單一啟動子可引導含有多個自身互補區的單一RNA轉錄本的合成，所述自身互補區的各個區域可雜交以產生多個莖-環結構。所述結構例如可通過Dicer發生活體內分裂，以產生多個不同的shRNA。應了解，所述轉錄本優選地在轉錄本的3′端而不是在個別shRNA單元之間含有終止信號。在本發明的另一個實施例中，載體包括多個啟動子，所述啟動子的各個啟動子引導發生雜交而形成shRNA的自身互補RNA分子的合成。多個shRNA可全部靶向同樣的轉錄本，或者可靶向不同的轉錄本。可靶向病毒轉錄本的任何組合。參見實例11和圖21。所屬領域的技術人員將另外了解，根據本發明的RNAi誘導劑的活體內表達可產生在長時期內(例如大於幾天，優選至少數周到數月，更優選至少一年或更長，可能終生)產生藥劑的細胞。所述細胞可被無限地保護以避免流感病毒。用於組合物中以提供RNAi誘導劑的細胞內表達的優選病毒載體包括(例如)逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體、皰疹病毒載體等。舉例而言，參見Kobinger，G.P.，等人，NatBiotechnol19(3)225-30，2001，描述了基於絲狀病毒(Filovirus)包膜蛋白質的載體-假型HIV載體，該載體有效地從頂端表面轉導完整的氣道上皮。也參見Lois，C，等人，Science，295868-872，2002年2月1日，描述了FUGW慢病毒載體；Somia，N.等人J.Virol.74(9)4420-4424，2000；Miyoshi，H.，等人，Science283682-686，1999；和美國專利6,013,516。所屬領域的技術人員應了解，諸如本文中描述的核酸的藥劑，包括(但不限於)具有圖5中所描述結構中的任何結構，或本文中所述的任何其他有效結構的核酸，可完全由諸如發現於天然存在核酸中的核苷酸的核苷酸組成，或者可取而代之包括所述核苷酸的一種或一種以上的類似物，或者可能以其他方式不同於天然存在核酸。含有經修飾骨架或非天然存在核苷間鍵聯的核酸可用於本發明中。經修飾核酸不必沿整個分子長度均勻地修飾。舉例而言，在核酸中的各位置上可能存在不同的核苷酸修飾和/或骨架結構。在本發明的某些實施例中，可能需要使siRNA結構穩定，例如，通過在一個或一個以上游離鏈末端處包括核苷酸類似物以降低(例如)出核酸外切酶引起的消化來實現。為此，可在一個或一個以上的游離端處包括脫氧核苷酸，例如，嘧啶，諸如脫氧胸苷。或者或另外，可能需要包括一種或一種以上的核苷酸類似物，以便特別是當與將通過RNAi藥劑的一條鏈與標靶轉錄本的相互作用所形成的任何雜交物比較時，增加或降低19bp莖的穩定性。所屬領域的技術人員應了解，核苷酸類似物可位於標靶特異活性，例如RNAi介導活性實質上不受影響的任何位置上，例如位於RNA分子的5′端和/或3′端的區域中。舉例而言，在某些實施例中，在siRNA或shRNA鏈的5′和/或3′端處的1-5殘基之間的是核苷酸類似物。在本發明的某些實施例中，本發明的RNAi誘導劑中的核酸的一種或一種以上核酸包含至少50％未修飾RNA，至少80％經修飾RNA，至少90％未修飾RNA或100％未修飾RNA。在本發明的某些實施例中，本發明的RNAi誘導劑中的核酸的一種或一種以上核酸，在參與RNAi誘導劑中的雙鏈體形成的部分中包含100％未修飾RNA。根據本發明的某些實施例，在siRNA、shRNA或微RNA前體的有義鏈或反義鏈中選擇性地使用各種核苷酸修飾。舉例而言，優選可在反義鏈中利用未修飾核糖核苷酸，而在有義鏈中的一些或全部位置處使用經修飾核糖核苷酸和/或經修飾或未修飾脫氧核糖核苷酸。根據本發明的某些實施例，在反義鏈和/或有義鏈的雙鏈體部分中僅使用未修飾核糖核苷酸，而反義鏈和/或有義鏈的突出端可包括經修飾核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸。在本發明的某些實施例中，一條或兩條siRNA鏈包含一個或一個以上的O-甲基化核糖核苷酸。許多核苷酸類似物和核苷酸修飾在所屬領域中是已知的，並已經研究了其對諸如雜交和核酸酶抗性的性質的作用。已證實，許多修飾改變寡核苷酸的一個或一個以上的方面，諸如與互補核酸雜交的能力、穩定性、生物可用性、核酸酶抗性等。舉例而言，2′修飾包括滷素、烷氧基和烯丙氧基。在一些實施例中，2′-OH基團被選自以下基團的基團替換H、OR、R、滷素、SH、SR1、NH2、NHR、NR2或CN，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基並且滷素是F、Cl、Br或I。經修飾鍵聯的實例包括硫代磷酸酯和5′-N-亞磷醯胺鍵聯。第6,403,779號；第6,399,754號；第6,225,460號；第6,127,533號；第6,031,086號；第6,005,087號；第5,977,089號美國專利和其中的參考文獻揭示了可用於實施本發明的多種核苷酸類似物和修飾。也參見Crooke，S.(編)″AntisenseDrugTechnologyPrinciples，Strategies，andApplications″(第1版)，MarcelDekker；ISBN0824705661；第1版(2001)和其中的參考文獻。對本發明的目的來說，化學元素是根據PeriodicTableoftheElements，CAS版本，HandbookofChemistryandPhysics，第75版，內封來識別，並且具體官能團一般如文中所述加以定義。可使用(例如)本文中描述的分析或其他適當的分析來測試類似物和修飾，以選擇有效降低病毒基因表達的類似物和修飾。在某些實施例中，RNAi誘導劑包含對糖、核苷或核苷間鍵聯的一種或一種以上的修飾，諸如描述於第20030175950號、第20040192626號、第20040092470號、第20050020525號、第20050032733號美國公開案和/或參考文獻137-139中的任何修飾。在本發明的某些實施例中，通過修飾產生具有以下特性的核酸吸收性增加(例如，跨越粘液層的吸收性增加，口服吸收增加等)、在血流中或在細胞中的穩定性增加、腎系統清除率降低、橫穿細胞膜的能力增加、逃離諸如內體的細胞內隔室的能力增加等。如所屬領域的技術人員所了解，類似物或修飾可引起Tm改變，而可使得引導序列與標靶之間的錯配容忍度增加，同時仍達到有效抑制，或者可引起對所要求的標靶轉錄本的特異性增加或減少。所屬領域的技術人員將另外了解，根據本發明使用的有效RNAi誘導劑可包含一個或一個以上不是核苷酸或核苷酸類似物的部分。在某些實施例中，核酸主要包含核苷酸殘基，但也包含一個或一個以上不是核苷酸的殘基。舉例而言，在某些實施例中，在有效抑制劑的任一鏈中的殘基中有1、2、3、4、5個或5個以上不是核苷。在某些實施例中，參與雙鏈體形成和/或與標靶轉錄本互補的RNAi誘導劑的部分由核苷組成，而突出端由非核苷殘基組成。在本發明的某些實施例中，RNAi誘導劑的有義鏈和反義鏈是通過含有非核苷的接頭彼此連接。III.基於識別優選流感病毒標靶部分的RNAi誘導劑和其他核酸本發明提供基於識別可能的標靶部分、功能標靶部分、適當保守標靶部分和高度保守標靶部分的各種核酸。具體來說，本發明提供序列包含或由上文所述可能的標靶部分中的任何可能的標靶部分組成的核酸，所述序列包括表1A、1B、17、18、20和/或34中列出的流感序列，或其長度為至少15個核苷酸的子序列(片段)。靶向某些標靶部分的SiRNA出人意料地顯示高效力。為了評估效力，在經流感病毒感染之前6小時，將siRNA投與細胞中，並且在感染24小時後測試流感病毒產生。在某些實施例中，序列選自SEQIDNO272-380。靶向所述標靶部分的SiRNA(包含與標靶部分100％互補的反義鏈)在100nM下顯示，細胞中的病毒產生降低4倍(減少75％)。在某些實施例中，序列選自SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、309、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366。靶向所述標靶部分的SiRNA(包含與標靶部分100％互補的反義鏈)在5nM下顯示，細胞中的病毒產生降低2倍(減少50％)。在某些實施例中，序列選自SEQIDNO297、309、310、311、346、347、364和366。靶向所述標靶部分的SiRNA在5nM下顯示，細胞中的病毒產生降低2倍(減少50％)，甚至當標靶部分在最多2個位置上與PR8中的對應標靶部分不同時，也就是說，在反義siRNA鏈與標靶部分之間存在最多2個錯配時，也是如此。也提供所述核酸和片段的互補體。在一些實施例中，片段長度為16、17或18個nt。核酸可以是單鏈的或雙鏈的並且可以是未修飾RNA或DNA或其經修飾型式。序列可另外包括3′突出端，例如dTdT突出端。本發明也提供如下核酸與表1A、1B、17、18、20和/或34中所列序列中的任何序列或其長度為至少15個nt的子序列實質上相同(例如，至少70％、至少80％相同、至少90％相同、100％相同)、100％互補或實質上互補(例如，至少70％，至少80％互補，至少90％互補，100％互補)。本發明另外提供包含上述核酸中的一種或一種以上核酸的載體。核酸包括RNAi誘導劑，諸如(i)siRNA；(ii)shRNA；(iii)與互補單鏈RNA雜交以形成siRNA的單鏈RNA；和(iv)包含用於上述核酸中的任何核酸轉錄的模板的載體。在序列呈現為RNA時，本發明也提供對應的DNA序列(反之亦然)。在序列呈現於本文中時，本發明涵蓋包含序列和其互補序列的雙鏈核酸。本發明核酸中的任何核酸可在尺寸上加以限制。舉例而言，核酸的長度可為19個nt或以下，29或30個nt或以下，35個nt或以下，50個nt或以下，或100個nt或以下。本發明涵蓋任何含核酸鹼基的結構，其中例如核苷酸的殘基以有序方式，通常以線性方式連接在一起，以便核酸鹼基序列可被分配到所述結構中，其中所述序列是本文所揭示序列中的任何序列。上文描述了各種核酸鹼基和經修飾核苷酸和骨架，可使用其中的任何一者。在本發明的各種實施例中，所述結構是核酸、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或嵌合分子等。參見，例如，WO92/20702、第6,316,230號美國專利和其中的參考文獻。本發明也涵蓋包含交替核酸鹼基的結構，所述核酸鹼基具有相同的鹼基配對特異性，或可另外取代存在於序列中的核酸鹼基。單鏈核酸可用作諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導劑的反義鏈或有義鏈(視需要在3′端添加一個或一個以上的核苷酸以形成突出端)。本發明的核酸也可用作(例如)常規反義試劑，用作探針(例如，用於檢測流感病毒感染)等。「常規反義」是指通過活體外或向受檢者投與單鏈寡核苷酸來抑制轉錄本表達的方法。據認為，所述抑制是通過相異於RNAi機制的機制來運作，並且不需要雙鏈RNA分子(不同於反義寡核苷酸與標靶轉錄本之間所形成的雙鏈體)。參見，例如，Crooke，S.，下文。本發明因此提供包含流感A病毒轉錄本的標靶部分的核酸，其中核酸的序列包含表1A、1B、17、18、20和34的一個或一個以上表中所列序列的至少15、16、17、18或19個相鄰的nt。在某些實施例中，序列由表1A、1B、17、18、20和34的一個或一個以上表中列出的序列組成，或含在所列出的序列內。本發明另外提供包含流感A病毒mRNA轉錄本的標靶部分的核酸，其中核酸的序列包含任何可能的流感病毒標靶部分的至少15、16、17、18或19個相鄰的核苷酸。5′和3′端處的核苷酸被認為是含在序列中。在某些實施例中，序列的長度是30個nt或以下，35個nt或以下，50個nt或以下，或100個nt或以下。本發明另外提供，包含序列與任何可能的流感病毒標靶部分(例如表1A、1B、17、18、20和/或34中所列標靶部分中的任何標靶部分)實質上相同(至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％相同)的部分的核酸。某些所述部分在1、2、3、4或5個位置處相對於可能的流感病毒標靶部分(例如表1A、1B、17、18、20和/或34的任何表中列出的標靶部分)存在差異。在本發明的某些實施例中，在1、2、3、4或5個位置處的差異是通過實質上相同序列中的U替換標靶部分中的C，或通過實質上相同序列中的G替換標靶部分中的A。本發明的某些核酸的序列包含發現於標靶轉錄本中的與可能的流感病毒標靶部分(例如表1A、1B、17、18、20和/或34中列出的標靶部分)的序列鄰近的序列，即，位於標靶部分的5′或3′。本發明提供RNAi誘導劑，其具有在至少15個nt、至少16個、至少17個nt、至少18個nt、優選19個nt的窗口範圍內，與可能的流感病毒標靶部分(例如表1A、1B、17、18、20和/或34中列出的標靶部分)互補的反義鏈。舉例而言，反義鏈可與所列出的高度保守標靶部分在15、16、17、18或19個nt範圍內100％互補，或者可實質上互補，例如相對於標靶部分，具有1個與5個之間的錯配。在某些實施例中，反義鏈的抑制區與標靶之間的一個或一個以上錯配，例如所有錯配，是U-G錯配。RNAi誘導劑的有義鏈可與反義鏈100％互補或實質上互補。本發明也提供具有有義鏈的RNAi誘導劑，所述有義鏈的序列與表1A、1B、17、18、20和/或34的一個或一個以上表中列出的高度保守和/或適當保守序列在15、16、17、18或19個nt範圍內100％相同或實質上相同。舉例而言，本發明提供靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導劑，其中RNAi誘導劑包含核酸部分，其序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列、其互補體、或任一具有至少15個核苷酸長度的片段。RNAi誘導劑優選地包含與第一核酸部分形成雙鏈體結構的第二核酸部分。在某些實施例中，第一和第二核酸部分各自長度為50個nt或以下，例如長度為35個nt或以下，例如長度為21-23個nt等。在某些實施例中，序列選自由以下序列組成的群組SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、309、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366，其互補體，或任一者的具有至少15個核苷酸長度的片段。在某些實施例中，序列選自由以下序列組成的群組SEQIDNO297、309、310、311、346、347、364和366，其互補體，或任一者的具有至少15個核苷酸長度的片段。在本發明的某些實施例中，基於可能的流感病毒標靶部分(例如序列被列於表1A、1B、17、18、20和/或34中的標靶部分)所設計的RNAi誘導劑的反義鏈的序列，包括與所列出序列100％互補的至少10個，至少12個，至少15個，至少17個或至少19個連續的nt。所述RNAi誘導劑的有義鏈可與反義鏈100％互補或實質上互補。在本發明的某些實施例中，基於可能的流感病毒標靶部分所設計的RNAi誘導劑的有義鏈的序列(例如表1A、1B、17、18、20和/或34中呈現的序列)，包括所列出序列的至少10個，至少12個，至少15個，至少17個和/或至少19個連續的nt。在本發明的某些實施例中，基於可能的流感病毒標靶部分(例如表1A、1B、17、20和/或34中呈現的標靶部分)所設計的RNAi誘導劑的反義鏈的序列，除可能存在1或2個錯配外，包括與所列出序列100％互補的至少10個，至少12個，至少15個，至少17個和/或至少19個連續的nt。所述RNAi誘導劑的有義鏈可與反義鏈100％互補或實質上互補。在本發明的某些實施例中，基於可能的流感病毒標靶部分所設計的RNAi誘導劑的有義鏈的序列(例如表1A、1B、17、18、20和/或34中列出的序列)，除1或2個nt可能與所列出序列不同外，包括所列出序列的至少10個連續的核苷酸，更優選至少12個連續的nt，更優選至少15個連續的nt，更優選至少17個連續nt，且仍更優選19個連續的nt。在反義鏈在小於19nt的範圍內與所述序列實質上或100％互補的本發明的實施例中，反義鏈的剩餘部分可以並且優選地與處在所列出的標靶部分的外部並與之鄰近的流感序列實質上互補或100％互補。因此，本發明涵蓋RNAi誘導劑，其所含反義鏈的序列與從表1A、1B、17、18、20和/或34中的序列「移動」1或1個以上的nt，例如高達9個nt的流感序列互補。鄰近序列可見於圖32中。根據本發明的某些實施例，RNAi誘導劑靶向在天然感染至少2、3、4、5種或5種以上不同物種生物體的流感變異體之間適當保守和/或高度保守的區域。物種可包括人類、馬(equine/horse)、禽類、豬和其它。在本發明的某些優選實施例中，物種包括人類。本發明也提供可用於本發明RNAi誘導劑的轉錄的載體，含有所述載體的細胞和用於治療和/或預防流感A病毒感染的方法。本發明提供可能的流感病毒標靶部分的變異體，例如表1A、1B、17、18、20和/或34中列出的核酸中的任何核酸的變異體，和包含變異體的核酸(例如，包含所述變異體的RNAi誘導劑)，其中變異體的序列在1、2、3、4、5或6個位置處不同於所列出的序列。在本發明的某些優選實施例中，所列出的序列的變異體與來自PR8以外的流感病毒株(諸如表15A-15H和/或表19A-19F中列出的流感A病毒株中的任何病毒株)的轉錄本的序列的一部分相同或實質上相同。另外，也涵蓋本文中揭示的各種序列的子序列。優選子序列長度在15-18個nt之間，例如，長度為15、16、17或18個nt。也涵蓋關於本文列出的特定序列通過核苷酸刪除和/或添加所得到的序列。舉例而言，涵蓋從本文列出的序列中的任何序列刪除1、2、3、4、5或6個nt或向其中添加1、2、3、4、5或6個nt所得到的核酸序列。另外，涵蓋從本文列出的序列中的任何序列的變異體(如上文所述)刪除1、2、3、4、5或6個nt或向其中添加1、2、3、4、5或6個nt所得到的序列。所刪除或添加的核苷酸可相對於原始序列鄰接地或非鄰接地定位。可位於內部或位於一個或兩個末端處。所添加的核苷酸可定位於序列內的任何地方，或可附加在一個或兩個末端處。本發明的核酸，例如RNAi誘導劑或載體，可通過任何可用的方法引入細胞中。舉例而言，核酸或編碼所述核酸的載體可通過常規轉化或轉染技術引入細胞中。如本文所使用，術語「轉化」和「轉染」是指用於將外來核酸(例如DNA或RNA)引入細胞中的所屬領域公認的各種技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質轉染、注射或電穿孔。可使用遞送劑，諸如下文所述的遞送劑。本發明涵蓋任何經過操縱而含有本發明核酸的細胞，所述本發明核酸例如為RNAi誘導劑，諸如siRNA、shRNA，或提供用於合成本發明RNAi誘導劑的模板的載體。細胞可以是哺乳動物細胞，例如人類細胞或非人類哺乳動物細胞，或非哺乳動物細胞。優選地，細胞是在哺乳動物受檢者的鼻孔和/或呼吸道或肺中所發現的細胞，並且易感於流感病毒感染。最優選地，細胞是呼吸道上皮細胞。視需要，所述細胞也含有流感病毒RNA。IV.診斷方法和試劑盒本發明涵蓋識別對感染性疾病(例如由呼吸道病毒引起的感染)的基於RNAi的療法，可理想地併入診斷步驟中，用於確定需要治療的受檢者是否受易感於一種或一種以上RNAi誘導實體的抑制作用的感染劑所感染。「易感於抑制作用」的意思是，感染劑的一種或一種以上的生物活性可通過向受檢者投與RNAi誘導實體而被有效地抑制。優選地，感染劑的複製、病原性、傳播和/或產生被抑制。舉例而言，優選地，當在耐受劑量下向受檢者投與RNAi誘導實體時，所述藥劑的複製、病原性、傳播和/或產生被抑制至少25％。優選地，抑制足以產生治療有效作用。流感病毒用作說明本發明診斷方法的一個實例，所述診斷方法經過調整以便選擇適於遭受感染的受檢者的RNAi誘導實體。當然，也可(例如)向與受感染的個體接觸的個體投與所選的RNAi誘導實體以用於預防，而不管所述個體是否已經發展感染的症狀。本發明因此提供用於診斷流感病毒感染和確定受檢者是否受流感病毒感染的方法。在某些實施例中，方法包含確定受檢者是否受由本發明RNAi誘導實體的一種或一種以上實體所抑制的流感病毒感染。舉例而言，從可能被懷疑具有例如流感的病毒感染的受檢者中獲得樣品(例如，痰液、唾液、鼻洗液、鼻腔拭子、喉拭子、支氣管洗液、支氣管肺泡灌洗(BAL)液、活檢標本等)。樣品可經受一個或一個以上的加工步驟。任何所述經加工的樣品被認為是從受檢者獲得的。分析樣品以確定是否含有流感病毒特異性核酸。「流感病毒特異性核酸」是源於或得自流感病毒並可用作樣品中存在流感病毒的指示，並且視需要用於識別流感菌株和/或流感基因的序列的任何核酸或其互補體。核酸可在分離之後經受加工步驟。舉例而言，可被逆轉錄、擴增、分裂等。優選地，序列長度為至少15個nt，例如20-25個nt，25-30個nt或更長。在某些實施例中，序列相異於在其他病毒中發現的序列，以便其存在是流感病毒存在的明確指示。在某些實施例中，將存在於樣品中的流感病毒特異性核酸或其互補體的序列與諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導劑的反義鏈或有義鏈的序列比較。「比較」一詞是在廣義上使用來指任何可評估序列的方法，例如，可通過所述方法確定序列是否在一個或一個以上的位置處與參考序列相同或不同，或可通過所述方法評定差異程度。可使用多種基於核酸的分析的任何分析。在某些實施例中，診斷分析利用包含適當保守和/或高度保守標靶部分或其互補體，或適當保守和/或高度保守部分或其互補體的片段的核酸。在某些實施例中，(例如)在諸如下文所述分析的一種分析中，核酸用作擴增引物或雜交探針。在某些實施例中，將樣品中的流感特異性核酸擴增。可使用任何適當的擴增方法，包括指數擴增、聯合線性擴增、基於連接的擴增和基於轉錄的擴增。指數核酸擴增方法的一個實例是聚合酶鏈反應(PCR)，例如，在以下文獻中有所描述Mullis等人ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51263-273(1986)；PCRCloningProtocolsFromMolecularCloningtoGeneticEngineering，MethodsinMolecularBiology，White，B.A.，編，第67卷(1998)；MullisEP201,184；Mullis等人，第4,582,788和4,683,195號美國專利；Erlich等人，EP50,424、EP84,796、EP258,017、EP237,362；和SaikiR.等人，第4,683,194號美國專利。聯合線性擴增是由Wallace等人在第6,027,923號美國專利中揭示。基於連接的擴增的實例是由Wu等人(Genomics4560(1989))教示的連接擴增反應(LAR)和連接酶鏈反應(第0320308B1號EP申請案)。Hampson等人(Nucl.AcidsRes.24(23)4832-4835，1996)描述了方向隨機寡核苷酸引物擴增(DROP)法。等溫標靶擴增方法包括轉錄介導的擴增(TMA)、自主序列複製(3SR)、基於核酸序列的擴增(NASBA)和其變化形式。(參見Guatelli等人Proc.NatLAcad.Sci.U.S.A.871874-1878(1990)；第5,766,849號(TMA)；和5,654,142號(NASBA)美國專利)和其它(例如，如Malek等人，第5,130,238號美國專利；KacianandFultz，第5,399,491號美國專利；Burg等人，第5,437,990號美國專利中所述)。檢測或比較可使用所屬領域中已知的各種方法中的任何方法來執行，例如，基於擴增的分析、雜交分析、引物延伸分析(例如，等位基因特異性引物延伸，其中不同流感病毒株的對應標靶部分類似於基因的不同等位基因)、寡核苷酸連接分析(第5,185,243號、第5,679,524號和第5,573,907號美國專利)、分裂分析、異源雙鏈示蹤分析(heteroduplextrackinganalysis，HTA)等。實例包括Taqman_分析，AppliedBiosystems(第5,723,591號美國專利)。在此分析中，2個PCR引物側接中央探針寡核苷酸。探針寡核苷酸含有2個螢光部分。在PCR方法的聚合步驟期間，聚合酶分裂探針寡核苷酸。分裂引起2個螢光部分變成物理上分離的，從而改變螢光發射波長。當產生更多PCR產物時，新波長的強度增加。也可使用循環探針技術(CPT)，該技術是一種基於信號或探針擴增而不是標靶擴增的核酸檢測系統(第5,011,769號、第5,403,711號、第5,660,988號和第4,876,187號美國專利)。侵入分裂分析，例如描述於Eis，P.S.等人，Nat.Biotechnol.19673，2001中的Invader_分析(ThirdWaveTechnologies)，也可以用於檢測流感特異性核酸。可使用基於分子信標(第6,277,607號；第6,150,097號；第6,037,130號美國專利)或螢光能量轉移(FRET)的分析。分子信標是在結合完全匹配模板後經歷構象變化的寡核苷酸髮夾。寡核苷酸的構象變化增大存在於寡核苷酸上的螢光團部分與淬滅劑(quencher)部分之間的物理距離。所述物理距離增大引起淬滅劑作用減小，因此增強來自螢光團的信號。第20050069908號美國公開案和其中的參考文獻描述可用於檢測核酸的各種其他方法。本發明的探針可因此包含一個或一個以上與流感特異性序列雜交的部分和一個或一個以上根據特定分析來設計的部分。第5,854,033號、第6,143,495號和第6,239,150號美國專利描述了用於涉及滾環式複製(rollingcirclereplication)的所關注分子的擴增和多重檢測的組合物和方法。該方法適用於同時檢測樣品中的多種特異性核酸。舉例而言，可用於確定一種或一種以上流感特異性核酸在樣品中的存在。視需要對核酸測序。第20050026180號美國公開案描述包括擴增、檢測和基因分型在內的用於倍增(multiplexing)核酸反應的方法，所述方法可適於檢測流感特異性序列，以及確定在所關注的特定位置處的序列以便確定對RNAi誘導實體的敏感性。在某些實施例中，所述分析確定樣品中的流感特異性核酸是否包含與RNAi誘導實體的有義鏈或反義鏈相同或不同的部分。視需要，識別確切的差異(如果存在)。使用所述信息來確定流感病毒是否易感於RNAi誘導實體的抑制作用。除上文討論的分析外，在MolecularMicrobiologyDiagnosticPrinciplesandPractice，Persing，D.H.，等人，(編)Washington，D.C.ASMPress，2004一文中描述了適用於感染劑的檢測和/或基因分型的分析。可使用自動化系統執行所述分析中的任何分析。用於執行基於核酸的診斷分析的許多系統在所屬領域中是已知的，並且可容易地用於本發明的目的。在一個實施例中，將來自樣品的核酸應用於微陣列(又稱「晶片」)，所述微陣列上連接著與各種不同流感病毒轉錄本或其部分互補的許多核酸。雜交圖譜被檢測並且提供足夠的信息以確定流感病毒是否易感於RNAi誘導實體的抑制作用。在某些實施例中，對存在於樣品中的流感特異性核酸測序(通常在擴增之後)。可使用多種不同的分析。診斷分析可使用在第III部分中所述的核酸中的任何一種核酸。在本發明的某些實施例中，核酸包含不與流感病毒轉錄本實質上互補或實質上相同的核酸部分。舉例而言，核酸可包含引物結合位點(例如，用於通用測序引物或擴增引物的結合位點)、雜交標記(例如可用於將核酸從包含其他核酸的樣品分離出來)等。在本發明的某些實施例中，核酸包含非核苷酸部分。非核苷酸部分可連接至核酸的末端核苷酸，例如，連接在3′端。所述部分可保護核酸以避免降解。在某些實施例中，非核苷酸部分是可檢測的部分，諸如螢光染料、放射性原子、螢光能量轉移(FRET)對的成員、淬滅劑等。在某些實施例中，非核苷酸部分是結合部分，例如生物素或抗生物素蛋白。在某些實施例中，非核苷酸部分是半抗原，諸如地高辛(digoxygenin)，2，4-二硝基苯基(TEG)等。在某些實施例中，非核苷酸部分是可用於核酸分離的標記。在本發明的某些實施例中，核酸是連接於視需要為磁性的支撐物，例如微粒，諸如珠粒。本發明另外提供包含本發明的許多核酸(例如至少10個、20個、50個核酸等)的陣列。核酸是共價地或非共價地連接於支撐物，例如實質上平坦的支撐物，諸如載玻片。參見，例如，第5,744,305號；第5,800,992號；第6,646,243號美國專利。關於具有特定病毒株的流感病毒還是在標靶部分內具有特定序列的流感病毒是否易感於特定RNAi誘導實體(例如包含具有特定序列的反義鏈的siRNA或shRNA)的抑制作用的信息，被稱為「敏感性信息」。敏感性信息可包括關於敏感性程度的定量信息。對本發明的目的來說，如果諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導實體在當與細胞接觸時或在耐受劑量下被投與受檢者中時，使受感染細胞中的病毒產生降低至少25％，那麼就認為流感病毒易感於RNAi誘導實體的抑制作用。在一個優選實施例中，如果流感病毒轉錄本包含與SEQIDNO272-380中的任一者100％相同，優選與SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、309、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366的中的任一者100％相同，仍更優選與SEQIDNO297、309、310、311、346、347、364和366中的任一者100％相同的標靶部分，那麼就認為流感病毒易感於包含與標靶部分100％互補的反義鏈的RNAi誘導實體。在其他實施例中，如果流感病毒轉錄本包含在1、2或3個位置處，優選1或2個位置處，更優選僅1個位置處不同於SEQIDNO272-380中的任一者的標靶部分，那麼就認為流感病毒易感於包含與標靶部分100％互補的反義鏈的RNAi誘導實體。在其他實施例中，如果流感病毒轉錄本包含在1、2或3個位置處，優選1或2個位置處，更優選僅1個位置處不同於SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、309、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366中的任一者的標靶部分，那麼就認為流感病毒易感於包含與標靶部分100％互補的反義鏈的RNAi誘導實體。在其他實施例中，如果流感病毒轉錄本包含在1、2或3個位置處，優選1或2個位置處，更優選僅1個位置處不同於SEQIDNO297、309、310、311、346、347、364和366中的任一者的標靶部分，那麼就認為流感病毒易感於包含與標靶部分100％互補的反義鏈的RNAi誘導實體。從處理在標靶部分內具有特定序列的流感病毒的實驗或先前經驗所獲得的信息，也可用於判斷病毒是否易感於給定RNAi誘導實體或其組合的抑制作用。敏感性信息也可包括基於(例如)在流感病毒序列與抑制劑的反義鏈之間所存在的任何錯配的預期作用的理論預測。敏感性信息可以計算機可讀形式存儲於計算機可讀媒體中，例如，以有組織方式存儲於資料庫中。將在從受檢者獲得的樣品上執行的診斷測試的結果提供給計算機化系統，所述系統訪問信息並且確定感染受檢者的流感病毒的敏感性分布。在某些實施例中，所述系統推薦特定的RNAi誘導劑或其組合和/或劑量。本發明因此提供用於確定例如流感病毒的病毒對RNAi誘導實體的敏感性的計算機化系統。本發明另外提供含有敏感性信息的資料庫。計算機化系統和用於執行分析的自動化系統可以是單一整合自動化系統的一部分或者可以單獨提供。本發明提供用於檢測流感病毒感染的診斷試劑盒。某些試劑盒包含一種或一種以上的本發明核酸。某些試劑盒包含可用於檢測包含RNAi的優選標靶部分的流感病毒轉錄本的部分的一種或一種以上的核酸。試劑盒可包含一種或一種以上選自由以下各物組成的群組的物品探針、引物、序列特異性寡核苷酸、酶、底物、抗體、核苷酸群體、緩衝液、正對照物和負對照物。可將核苷酸進行標記。舉例而言，可提供一個或一個以上的經螢光標記核苷酸群體，諸如dNTP、ddNTP等。探針可以是包括標靶部分(例如，高度保守或適當保守的標靶部分)或其互補體的全部和部分的核酸，或者是與標靶部分至少80％相同或互補(例如100％相同或互補)的核酸。在某些實施例中，提供多個探針。探針在一個或一個以上的位置處有所不同，並且可用於確定流感病毒轉錄本在所述位置處的確切序列。舉例而言，探針可有差異地與轉錄本雜交(例如，只有當探針與轉錄本的標靶部分100％互補時才發生雜交)。引物可以與位於標靶部分的上遊和下遊的位點互補，並且可用於擴增包含標靶部分的流感病毒核酸的區域，然後進行測序或經受另外的加工。經擴增的區域的長度例如可以為100-200個nt、200-300個nt或以上。選擇結合離標靶部分足夠距離的位點以擴增具有所要求長度的區域的引物。用於選擇擴增引物的方法在所屬領域中是為人熟知的。試劑盒可包含序列特異性寡核苷酸。寡核苷酸是序列特異性的，因為當寡核苷酸與實質上互補的核酸(例如流感病毒特異性核酸)雜交時，如果寡核苷酸的3′端核苷酸與所述核酸完全互補，那麼寡核苷酸將僅支持由聚合酶介導的延伸或連接。優選地，提供多個序列特異性寡核苷酸。寡核苷酸在3′端位置處有所不同，並因此可用於在寡核苷酸與所關注的核酸(例如流感病毒特異性核酸)雜交時，確立位於相對所述位置上的核苷酸的身份。本發明的試劑盒可包含樣本收集材料，例如拭子、試管等。試劑盒的組件可封裝在個別器皿或試管中，所述器皿或試管通常連同試劑盒的使用說明書一起提供於容器中，例如適於商業銷售的塑料容器或泡沫聚苯乙烯(styrofoam)容器。V.轉基因動物本發明涵蓋經過工程操作而含有或表達本發明的RNAi誘導劑的轉基因動物。所述動物適用於研究本發明RNAi藥劑的功能和/或活性，和/或用於研究流感病毒感染/複製系統。若本文所使用，「轉基因動物」是非人類動物，其中動物細胞的一個或一個以上的細胞，優選大多數或所有細胞，包括轉基因。轉基因是外源DNA，或內源染色體DNA的重排(例如，刪除)，優選地被併入或發生於轉基因動物細胞的基因組中。優選地，轉基因包含可操作連接至核酸以便在細胞中發生核酸表達的啟動子。轉基因可引導RNAi誘導劑在轉基因動物的一種或一種以上的細胞類型或組織中的表達。某些優選轉基因動物是非人類哺乳動物，例如齧齒動物，諸如大鼠或小鼠。轉基因動物的其他實例包括非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、山羊、諸如雞的鳥類、兩棲動物等。根據本發明的某些實施例，轉基因動物用作用於測試可能的流感治療劑的動物模型(例如，鼠科動物、雪貂或靈長類動物)。本發明所涵蓋的其他非人類動物包括馴養動物，包括(但不限於)家畜和寵物，或為盈利而使用或飼養的任何動物。所述動物對流感病毒感染有部分或完全抵抗力。RNAi誘導劑例如可以是siRNA或shRNA。RNAi誘導劑可靶向任何可能的流感病毒標靶部分，例如表1A、1B、17、18、20和/或34中的任何表中列出的標靶部分。在某些實施例中，RNAi誘導劑靶向序列選自以下各序列的標靶部分SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、309、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366，例如SEQIDNO297、309、310、311、346、347、364和366中的任一者。舉例而言，在優選實施例中，RNAi誘導劑具有與上述標靶部分中的任何標靶部分互補的反義鏈和與反義鏈形成雙鏈體的有義鏈。製造轉基因非人類動物的方法在所屬領域中是已知的。簡而言之，所述方法包括(i)通過顯微注射將包含轉基因的適當載體引入受精卵的核中，接著將卵轉移到假孕雌性動物的生殖道中；和，(ii)將包含轉基因的適當載體引入經培養的體細胞中(例如，使用諸如橫切、電穿孔等任何適宜技術)，選擇其中轉基因已經併入基因組DNA中的細胞，將核從所選細胞轉移到卵母細胞或受精卵中，視需要將卵母細胞或受精卵活體外培養到桑椹胚或囊胚期，並且將胚胎轉移到雌性受體中。根據其他方法，使用包含轉基因的逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體是通過感染，作為DNA質粒或作為病毒粒子引入細胞中。也可使用將適當載體引入卵母細胞或胚細胞中的細胞質顯微注射。也涵蓋精子介導的基因轉移。識別使用所述方法獲得的雜合或嵌合動物並使其繁殖以產生純合子。載體優選為靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導載體。在一個優選實施例中，載體包含用於靶向標靶部分的諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導劑轉錄的模板，所述標靶部分在得自轉基因動物物種生物體的流感病毒之間適當保守和/或高度保守，並且視需要在得自諸如人類的另一個物種的流感病毒之間適當保守和/或高度保守。載體包含可操作連接至用於RNAi誘導劑轉錄的模板的啟動子。可產生如上文所述呈包含互補部分的單一RNA分子形式或在細胞內雜交的2種RNA分子形式的RNAi誘導劑。啟動子可(但不必)得自轉基因動物的物種。可使用RNAPolI、II或III啟動子。啟動子可以是構成型或可誘導型。在一個優選實施例中，轉基因動物是禽類，例如雞。用於製造轉基因禽類的方法在所屬領域中是已知的，並且包括上文描述的方法和其變化形式。適於產生轉基因禽類和其他轉基因動物的載體和方法描述於(例如)第6,730,822號美國專利、第20020108132號和第20030126629號美國公開案，和所述專利的參考文獻中。在某些實施例中，轉基因禽類是使用逆轉錄病毒載體，例如禽白血病病毒載體來產生。在其他實施例中，轉基因禽類是使用不同於逆轉錄病毒載體的真核載體來產生，不過該載體也可包含得自逆轉錄病毒的一種或一種以上的序列。在某些實施例中，轉基因禽類表達多種RNAi誘導劑，所述RNAi誘導劑各自包含具有不同抑制區序列的反義鏈。RNAi誘導劑可各自靶向不同的流感病毒株。本發明提供轉基因禽群，其中禽群的不同成員表達一種或一種以上不同的RNAi誘導劑，所述RNAi誘導劑各自包含具有不同抑制區序列的反義鏈。舉例而言，禽群的第一部分表達包含與第一種禽流感菌株的標靶部分100％互補的反義鏈的第一種RNAi誘導劑，禽群的第二部分表達包含與第二種禽流感菌株的標靶部分100％互補的反義鏈的第一種RNAi誘導劑，並且禽群的第三部分表達包含與第三種禽流感菌株的標靶部分100％互補的反義鏈的第三種RNAi誘導劑，等。成員表達不同RNAi誘導劑的禽群，與所有成員都表達相同RNAi誘導劑的情況相比，更少易感於抗性流感病毒株的出現。在另一個優選實施例中，轉基因動物是哺乳動物，例如豬(pig/swine)、牛等。適於製造轉基因哺乳動物的方法包括上文討論的方法，這些方法的情況另外描述於Gordon等人，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，777380-7384，1980(通過將DNA顯微注射到單細胞胚胎中進行種系轉變)，Hooper等人，Nature，326292-295，1987；Kuehn等人，Nature，326295-298，1987(將經過基因工程操作的胚胎幹細胞轉移到胚泡中)，和，Campbell等人，Nature，38064-66，1996(將核從經過工程操作的細胞轉移到去核卵母細胞中)中。其他參考文獻描述轉基因技術對豬(第6,558,663號美國專利；Machaty，Z等人，CloningStemCells，4(l)21-7，2002；Wall等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，881696-1700，1991)，綿羊(Wright等人，Biotechnology，9830-834，1991)，山羊(Wang，B.，等人，MolReprodDev.，63(4)437-43，2002)和牛(Krimpenfort等人，Biotechnology，9844-847，1991；Galli，等人，Theriogenology，59(2)599-616，2003)的應用。在另一個優選實施例中，轉基因動物是齧齒動物，例如小鼠。已經使用各種不同的方法產生表達RNAi誘導劑的小鼠和大鼠(參見，例如，Hasuwa等人，FEBSLett.2002Dec4；532(1-2)227-30，Xia，等人，Nat.Biotechnol.，20(10)1006-10，2002；Rubinson等人，NatGenet，33(3)401-6，2003)。VI.用於遞送RNAi誘導實體的組合物和方法RNAi誘導實體可根據各種方法來投與。在本發明的一個實施例中，向受檢者投與單種RNAi誘導劑。一個非限制性實例是單一siRNA物種，其包含與來自各種流感病毒株的適當保守和/或高度保守標靶部分互補的反義鏈。在相關實施例中，向受檢者投與兩種或兩種以上不同的RNAi誘導劑的群體。在一個實施例中，兩種或兩種以上的RNAi誘導劑的群體包括含有反義鏈的藥劑，所述反義鏈的序列是與來自例如流感病毒的特定病毒的各種菌株的相同的適當保守和/或高度保守區域實質上互補(優選100％互補)。在另一個實施例中，兩種或兩種以上的RNAi誘導劑的群體包括含有反義鏈的藥劑，所述反義鏈的序列是與來自相同病毒株的不同保守區域實質上互補(優選100％互補)。在另一個實施例中，兩種或兩種以上的RNAi誘導劑的群體包括含有反義鏈的藥劑，所述反義鏈的序列是與來自例如流感病毒的特定病毒的各種菌株的相同的適當保守和/或高度保守區域實質上互補(優選100％互補)，並且RNAi誘導劑包括含有反義鏈的藥劑，所述反義鏈的序列是與來自相同病毒株的不同高度保守區域實質上互補(優選100％互補)。本發明者已經認識到，通常包括流感病毒感染的預防和治療在內的有效的RNAi療法，通過將RNAi誘導劑和/或RNAi誘導載體有效遞送到完整生物體中的細胞中，將得到增強。在流感病毒的情況下，必需將所述藥劑引入通常發生流感感染的呼吸道中的細胞內。用於人類中時，可優選使用促進RNAi誘導劑的細胞內吸收的非病毒方法。本發明因此提供組合物，其包含用於增強RNAi誘導劑和/或載體向例如哺乳動物和禽類的完整生物體中的細胞內的遞送的各種非病毒遞送劑中的任何一種遞送劑。如本文所使用，「遞送」的概念包括將RNAi誘導劑或RNAi誘導載體從其進入身體的部位運輸到其起作用的細胞位置，細胞吸收和/或產生藥劑或對細胞內RNAi機器可用的任何後續步驟(例如，siRNA或shRNA從內體的釋放)。本發明組合物也可包括使RNAi誘導劑穩定的組分，只要在體內或在配製所述藥劑來進行遞送的過程中抑制藥劑降解即可(例如，RNase抑制劑，諸如RNAsin)。通常，可使用完全或部分地抑制RNase活性的任何藥劑。實例包括從人類胎盤純化得到的RNase抑制劑或其重組型式。雖然遞送劑主要用於增強RNAi誘導劑的遞送，但是也可用於增強RNAi誘導載體的遞送。在本發明的某些實施例中，遞送劑提高穩定性，抑制清除率，促進組合物的細胞吸收，促進RNAi誘導實體在細胞內的釋放，降低細胞毒性或將組合物引導到特定細胞類型、組織或器官。「抑制清除率」意思是降低組合物通過腎系統從身體中除去的速率。遞送劑可通過諸如巨噬細胞的網狀內皮系統的細胞來抑制吸收。RNAi誘導實體自身可經過修飾(例如，經共價修飾)來提高穩定性，抑制清除率，促進細胞吸收，促進RNAi藥劑和/或載體從諸如內體的細胞內隔室的釋放，降低細胞毒性或將組合物引導到特定細胞類型、組織或器官。舉例而言，可將RNAi誘導劑聚乙二醇化，和/或可將富含精氨酸的肽結合至RNAi誘導劑。本發明因此涵蓋組合物，其包含(i)靶向轉錄本的RNAi誘導劑，和/或在細胞中的存在引起靶向轉錄本的RNAi誘導劑的產生的RNAi誘導載體；和(ii)各種遞送劑中的任何一種遞送劑，包括(但不限於)陽離子聚合物、經修飾陽離子聚合物、肽分子運輸體(包括富含精氨酸或組氨酸的肽)、碳水化合物、脂質(包括陽離子脂質、中性脂質和其組合)、脂質體、脂質-聚陽離子-DNA複合物(lipopolyplexes)、非陽離子聚合物、適於引入肺中的表面活性劑，或上述任何試劑的混合物等。某些遞送劑併入增加RNAi誘導劑或載體的遞送或向需要抑制轉錄本的細胞中的選擇性遞送的部分。在某些實施例中，轉錄本是呼吸道病毒轉錄本，例如流感病毒轉錄本。雖然在本發明的某些實施例中使用特定的遞送劑是優選的，但是在其他優選實施例中，諸如RNAi誘導劑的RNAi誘導實體是以「裸」形式來投與，也就是說，不存在任何增強轉染、細胞進入等的遞送劑。舉例而言，RNAi誘導劑可在水性介質中投與，所述水性介質基本上不含脂質並且基本上不含增強遞送的聚合物，例如陽離子或非陽離子聚合物，諸如下文描述的聚合物。RNAi誘導劑可以裸形式通過靜脈內途徑或直接投與呼吸系統中(例如，通過吸入穿過鼻或口並且進入肺中)。在某些實施例中，RNAi誘導劑是以有效治療或預防呼吸道病毒感染、同時引起血液最小吸收並因此實現RNAi誘導劑的最小全身性遞送的量來投與。A.遞送方法本發明提供用於將包含RNAi誘導實體的組合物遞送到哺乳動物受檢者中的各種方法。在某些實施例中，將組合物直接遞送到血管系統中並且在受檢者的器官或組織(例如，肺)中達到對標靶轉錄本的抑制。在其他實施例中，將組合物直接遞送到呼吸系統中。某些方法被用於實例16、22、23和24中，其中在使用所述方法的哺乳動物受檢者的標靶器官中，流感病毒產生和螢光素酶或親環素(cyclophilin)B的表達得到抑制。這些結果表明，所述方法廣泛地適用於抑制實際上任何所要求的標靶轉錄本。具體來說，本發明提供抑制哺乳動物受檢者的組織或器官中的基因表達的方法，其包含以下步驟不使用水動力轉染技術，將包含有效量的靶向基因的RNAi誘導劑的組合物直接引入受檢者的血管系統中。優選地，RNAi誘導劑抑制標靶轉錄本在肺中的表達。組織可為非循環組織，也就是說，不同於血液的組織。在一個相關實施例中，本發明另外提供抑制一種病毒在哺乳動物受檢者的呼吸系統中的產生的方法，其中該病毒感染呼吸道上皮細胞，所述方法包含以下步驟不使用水動力轉染技術，通過注射將包含有效量的靶向病毒基因的RNAi誘導劑的組合物引入受檢者的血管系統中。本發明另外提供抑制哺乳動物受檢者的肺中的基因表達的方法，其包含以下步驟將包含有效量的靶向基因的RNAi誘導劑和遞送劑的組合物直接引入受檢者的呼吸系統中。在一個優選實施例中，基因是呼吸道病毒基因，例如流感病毒基因。優選地，有效量抑制流感病毒在受檢者的呼吸系統中的產生。在本發明的方法或任何其他方面的某些實施例中，病毒是RSV以外的呼吸道病毒。舉例而言，組合物可經由鼻或口，通常接著吸入來投與。組合物可包含主要保留在例如鼻、咽等上呼吸道中的粒子，如在典型鼻或口腔噴霧劑中的粒子。在其他實施例中，粒子被吸入下呼吸道中。在下文中討論可用於將組合物直接遞送到呼吸系統中的可呼吸配方。在某些實施例中，直接遞送到呼吸系統中引起全身性遞送，例如，RNAi誘導劑從肺進入血管系統中並且被運輸到體內其它地方的標靶器官或組織。用於將有效量的RNAi誘導劑遞送到哺乳動物受檢者的呼吸系統中的方法具有多種用途，包括(但不限於)預防或治療呼吸道病毒感染。也可以使用本發明方法投與靶向適當轉錄本的RNAi誘導劑來預防和/或治療影響呼吸系統的各種其他疾病和病狀。實例包括例如肺癌等癌症、囊性纖維化(參見，例如，U.S.S.N.10/200,607)、哮喘(參見，例如，U.S.S.N.11/069,611)、肺動脈高壓、肺纖維化、肺氣腫等。適合的標靶基因包括(例如)致癌基因、編碼促血管生成分子和/或生長因子(諸如，血管內皮生長因子)、促炎性分子的基因，等。當然，當RNAi誘導劑被全身遞送時，可靶向在侵襲身體的任何部分的疾病中起作用的轉錄本。在本發明的某些實施例中，有效量介於每千克受檢者體重0.1mg與5mg之間。在其他實施例中，有效量介於每千克受檢者體重0.1mg與10mg之間，或每千克受檢者體重0.5mg與20mg之間。包含RNAi誘導實體的組合物可能包括或不包括遞送劑。適用於本發明的遞送劑包括在下文和同在申請中的U.S.S.N.10/674,087中描述的遞送劑。遞送劑可以組合方式使用。B.陽離子聚合物和經修飾陽離子聚合物本發明者已經確定，各種陽離子聚合物和經修飾陽離子聚合物中的任何聚合物增強RNAi誘導劑通過許多不同途徑的遞送。本發明因此提供組合物，其包含(i)靶向標靶轉錄本的RNAi誘導實體和(ii)陽離子聚合物。本發明另外提供抑制標靶基因表達的方法，其包含向哺乳動物受檢者投與包含靶向標靶轉錄本的RNAi誘導劑的組合物。具體來說，本發明提供治療和/或預防流感病毒感染的方法，其包含向哺乳動物受檢者投與包含靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導劑和陽離子聚合物的組合物。通常，陽離子聚合物是一種在大約生理pH值下，例如在大致7.0到7.6，優選大約7.2到7.6的範圍內的pH值，更優選大約7.4的pH值下，帶正電的聚合物。所述陽離子聚合物包括(但不限於)聚賴氨酸(PLL)，聚精氨酸(PLA)，聚組氨酸；聚乙烯亞胺(PEI)(37)，包括如(例如)(76)中所述的直鏈或支鏈PEI和低分子量PEI；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(38)；殼聚糖(39、40)；魚精蛋白；聚磷酸鹽；聚磷酸酯(諸如第20020045263號美國公開案中描述的聚磷酸酯)；聚(N-異丙基丙烯醯胺)，等。某些所述聚合物包含伯胺基、亞胺基、胍基和/或咪唑基。優選陽離子聚合物具有相對低的毒性。參考文獻85-87；U.S.S.N.6,013,240；WO9602655；和第20040167087和20030157030號美國公開案提供關於PEI和其他適用於實施本發明的的聚合物的其他信息。可使用稱作jetPEITM(Qbiogene，Carlsbad，CA)的市售PEI試劑，它是一種線性形式的PEI(U.S.S.N.6,013,240)。適合的陽離子聚合物還包括具有不同分子量的聚合物的摻合物、包含上述聚合物(或其它聚合物)中的任何聚合物的子單元的共聚物，例如賴氨酸-組氨酸共聚物等。各種子單元在共聚物中的百分比不必相等，但可加以選擇(例如)來優化諸如與核酸形成複合物的能力等性質同時使細胞毒性最小。此外，子單元不必以規則方式交替。實例中描述用於針對所要求的性質來評估各種聚合物的適當分析。優選陽離子聚合物也包括諸如上述的聚合物，另外併入各種修飾中的任何修飾。適當的修飾於下文進行討論並且包括(但不限於)用乙醯基、丁二醯基、醯基或咪唑基來修飾(32)。雖然已經表明陽離子聚合物促進DNA質粒轉染，但是倘若siRNA和shRNA分子與DNA質粒之間在結構和尺寸上存在重大差異，那麼陽離子聚合物在增強siRNA的吸收方面是否有效是非常不確定的。然而，如實例12中所述，本發明者已經證實，當在流感病毒感染之前或之後以靜脈內途徑投與時，包含PEI、PLL或PLA和靶向流感病毒RNA的siRNA的組合物顯著抑制小鼠中流感病毒的產生。當使用2種靶向不同流感病毒RNA的siRNA時，所述抑制是劑量依賴性的並且展現相加效應。因此，當與諸如PEI、PLL或PLA的陽離子聚合物組合時，siRNA能夠到達肺，進入細胞中，並且有效抑制病毒複製周期。雖然PEI的存在顯著地增強向肺的遞送，但是在不存在PEI時，也發生有效遞送(實例12；圖22C)，表明使用「裸」siRNA可達到向呼吸系統的有效siRNA遞送。據認為，所述發現是使用siRNA在哺乳動物中抑制感染性病毒產生的功效的第一次報導(例如，相對而言，抑制病毒複製周期中的病毒轉錄本或中間物的產生)。如實例16中所述，siRNA和陽離子聚合物的混合物的肺部投與有效地抑制肺細胞中的標靶轉錄本。實例23和24和圖31進一步提供遞送到哺乳動物受檢者的呼吸系統中的裸siRNA有效地抑制其中的標靶轉錄本的表達的證據。用於通過靜脈內途徑將siRNA遞送到體內的實體器官和組織中的其他研究(參見，例如，McCaffrey2002；McCaffrey2003；Lewis，D.L.，2002)已採用稱作水動力轉染的技術，該技術涉及將大體積的液體快速遞送到小鼠的尾部靜脈中，並且已經顯示在實體器官，尤其是肝中引起顯著量的質粒DNA的積聚(Liu1999；Zhang1999；Zhang2000)。與涉及注射大約200μl的液體的常規技術(Liu1999)相比，所述技術涉及遞送幾乎相當於動物的全血量的液體體積，例如對體重18-20克的小鼠來說為1.6ml，相當於體重的大約8-12％。另外，使用水動力轉染方法的注射在短時間間隔(例如，5秒)內發生，所述時間間隔是有效表達所注射的轉基因所必需的(Liu1999)。也已將siRNA通過靜脈內途徑遞送到裸鼠中的皮下植入腫瘤細胞中(Filleur2003)，但是倘若系統具有區別特徵，那麼所述發現對於將RNAi誘導劑靜脈內遞送到天然器官和組織中的關聯性尚不清楚。此外，本發明證明在每千克受檢者體重5mg或5mg以下，例如0.1-5mg的劑量下，RNAi誘導劑的有效靜脈內遞送。雖然水動力轉染在肝中達到所注射轉基因的轉移和高水平表達的機制尚不完全清楚，但是認為這歸因於DNA溶液由於瞬時心性充血而通過肝靜脈回流到肝中(Zhang2000)。用於人類治療的可比性方法看起來未必可行。可是，本發明者已經使用常規體積的液體(例如200μl)並且已經證明在將預期引起所注射的轉基因甚至在肝(肝是使用水動力轉染最容易達到表達的部位)中的最小表達的情況下，siRNA被有效遞送到肺中。本發明因此提供在哺乳動物受檢者的細胞內抑制轉錄本(例如，病毒轉錄本，諸如流感病毒轉錄本)的表達的方法，其包含使用常規注射技術，例如使用常規壓力和/或常規液體體積的技術，將包含靶向標靶轉錄本的諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導劑的組合物引入受檢者的血管系統中的步驟。在本發明的優選實施例中，靜脈內投與在例如肺的標靶器官中產生治療有效劑量的藥劑。在本發明的某些實施例中，組合物包含陽離子聚合物。在本發明的優選實施例中，組合物是以相當於小於受檢者體重的10％的液體體積來引入。在本發明的某些實施例中，液體體積相當於小於受檢者體重的5％，小於受檢者體重的2％，小於受檢者體重的1％或小於受檢者體重的0.1％。在本發明的某些實施例中，所述方法達到有效量的RNAi誘導劑在例如肺的肝以外的身體組織或器官中的細胞中的遞送。在本發明的某些優選實施例中，組合物是(例如)通過靜脈內注射來引入靜脈中。然而，組合物也可投與動脈中，使用諸如導管、留置靜脈內管等裝置來遞送。在本發明的某些優選實施例中，RNAi誘導劑抑制病毒(例如)在肺中的產生。如實例15中所述，本發明者也已經證實，陽離子聚合物PLL和PLA與siRNA形成複合物並且促進功能性siRNA在所培養的細胞中的吸收。用PLL和NP-1496的複合物或PLA和NP-1496siRNA的複合物進行轉染抑制了流感病毒在細胞中的產生。這些結果和上文討論的在小鼠中的結果證明了使用陽離子聚合物和siRNA的混合物將siRNA遞送到受檢者體內的哺乳動物細胞中的優點。實例15中所述的方法可用於測試另外的聚合物，例如通過添加基團(例如醯基、丁二醯基、乙醯基或咪唑基)來修飾以降低細胞毒性並且優化最初有效聚合物的聚合物。某些優選修飾引起陽離子聚合物的正電荷減少。某些優選修飾將伯胺轉化成仲胺。用於修飾陽離子聚合物以併入所述另外的基團的方法在所屬領域中是為人熟知的。(參見，例如，參考文獻32)。舉例而言，各種殘基的ε-氨基可(例如)通過在合成聚合物之後，與所要求的修飾基團結合來取代。通常，需要選擇取代百分比，以足以相對於未取代聚合物達到細胞毒性的適當降低，而同時不引起聚合物增強RNAi誘導劑的遞送的能力過多降低。因此，在本發明的某些實施例中，將聚合物中的5％與75％之間，例如大約50％的殘基取代。類似效果可通過最初形成具有適當選擇的單體子單元(也就是說，其中一些子單元已經併入所要求的修飾)的共聚物來達到。用於促進RNAi誘導劑的遞送的陽離子聚合物可經過修飾以便其併入一個或一個以上的不同於構成聚合物的主要單體子單元的殘基。舉例而言，可將一個或一個以上的代替殘基添加到聚合物的末端，或者聚合物可通過不同於構成聚合物的主要單體的殘基來連接。也可使用各種另外的陽離子聚合物。實例包括聚(β-氨基酯)(PAE)聚合物(諸如，U.S.S.N.09/969,431；10/446,444；美國公開案20020131951和參考文獻34和93中所述的聚合物)。雖然已經證實一些聚(β-氨基酯)(PAE)聚合物促進DNA質粒轉染，但是倘若siRNA和shRNA分子與DNA質粒之間在結構和尺寸上存在重大差異，那麼陽離子聚合物是否仍會有效增強siRNA的吸收是非常不確定的。然而，如實例12中所述，本發明者證實，當連同聚(β氨基酯)一起經靜脈內途徑投與時，靶向NP(NP-1496)的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生。另外，當連同第二種聚(β氨基酯)一起經腹膜內途徑投與時，所述siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生。也可用於增強本發明RNAi誘導劑遞送的另外的陽離子聚合物包括，聚醯胺-胺(PAMAM)樹枝狀聚合物、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯(pDMAEMA)和其季胺類似物聚甲基丙烯酸(2-三甲基氨基)乙酯(pTMAEMA)、聚[a-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸(PAGA)和聚(4-羥基-1-脯氨酸酯)。其他描述參見Han(2000)。可使用經修飾的陽離子聚合物，例如聚(L-組氨酸)-接枝-聚(L-賴氨酸)聚合物(Benns2000)、聚組氨酸-PEG(Putnam2003)、葉酸-PEG-接枝-聚乙烯亞胺(Benns2002)、聚乙烯亞胺-葡聚糖硫酸酯(Tiyaboonchai2003)等。聚合物可為支鏈或線性形式並且可以是接枝的或未接枝的。在某些實施例中，聚合物與本發明的RNAi誘導實體形成複合物，然後被投與受檢者中。所述聚合物中的任何一種聚合物可經過修飾以併入PEG或其他親水聚合物。陽離子聚合物可經過多重修飾。本發明涵蓋修飾本文所述遞送劑中的任何遞送劑，以併入增強藥劑向細胞中的遞送和/或增強藥劑向特定細胞中的選擇性遞送的部分。可使用各種部分中的任何部分，例如(i)特異結合由需要抑制的細胞(例如，呼吸道上皮細胞)所表達的分子的抗體或抗體片段；(ii)特異結合由需要抑制的細胞所表達的分子的配體。用於將抗體、配體和/或遞送劑與核酸或本文中描述的各種遞送劑相結合的方法在所屬領域中是為人熟知的。參見，例如，「Cross-Linking」，PierceChemicalTechnicalLibrary，可在網址URLwww.piercenet.com上獲得並且最初公開於1994-95PierceCatalog中和其中引用的參考文獻，和WongSS，ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking，CRCPressPublishers，BocaRaton，1991；和G.T.Hermanson，BioconjugateTechniques，AcademicPress，Inc.，1995。C.用於將RNAi誘導實體遞送到呼吸系統中的另外的試劑本發明涵蓋組合物，其包含各種另外的試劑中的任何試劑和RNAi誘導實體，其中所述試劑增強RNAi誘導實體(例如)向呼吸道上皮細胞的遞送。在某些實施例中，肽分子運輸體包括在組合物中，所述肽分子運輸體是可以從細胞表面穿透質膜的肽。其通常由11-34胺基酸殘基組成，高度富集精氨酸，並且常被稱作富含精氨酸的肽(ARP)或穿膜肽(penetratin)(參見文獻42-51、120、134-36)。在其他實施例中，組合物包含適於引入到肺中的表面活性劑。實例包括市售配方Infasurf_(ONY，Inc.，Amherst，NY)；Survanta_(RossLabs，AbbottPark，IL)和ExosurfNeonatal_(GlaxoSmithKline，ResearchTrianglePark，NC)。第4,338,301號；第4,397,839號；第4,312,860號；第4,826,821號；第5,110,806號美國專利，U.S.S.N.4,312,860；4,826,821；和5,110,806描述了另外的表面活性劑組合物。通常，任何不引起對肺的實質損害的含脂質物質都可用作表面活性劑。也可使用洗滌劑和觸變性溶液進行投與。也可使用全氟化學品液體，例如全氟三丁胺(heptacosafluorotributylamine，Fluorinert)和有關的分子。其他討論參見(74、126、150)和美國專利6,638,767。另外，本發明涵蓋使用並有本發明RNAi誘導實體的蛋白質/聚乙烯亞胺複合物以用於遞送到(例如)呼吸系統，例如肺中。可使用的其他遞送劑包括天然和合成的環糊精和所述環糊精與其他遞送劑的混合物。其他信息參見Singh，M，等人，BiotechnolAdv.20(5-6)341-59，2002；Eastburn，SD和Tao，BY，BiotechnolAdv.，12(2)325-39，1994；和第20030157030號美國公開案。可使用各種非陽離子聚合物，諸如，聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PLG)和聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)(Panyam2002)、聚乙烯醇、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶)、普流尼克(Pluronic)、聚(醚-酐)。在某些實施例中使用陽離子聚合物與非陽離子聚合物的組合，諸如，聚(乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)接枝的聚(L-賴氨酸)(Jeong2002)，和其他組合，包括PLA、PLG或PLGA和諸如上文討論的聚合物的陽離子聚合物或經修飾陽離子聚合物中的任何聚合物。也可使用嵌段共聚物，其可包含陽離子和/或非陽離子單體。實例描述於第6,800,663號；第6,692,770號；第6,669,959號；第6,616,941號；第6,592,899號；和第6,517,869號美國專利中。VII.用於RNAi誘導實體的吸入遞送的組合物本發明提供用於通過吸入投與的包含RNAi誘導實體的組合物。優選地，RNAi誘導實體是諸如siRNA或shRNA的RNAi誘導實體。如上文所述，RNAi誘導劑可以裸形式或與遞送劑一起，通過吸入穿過鼻或口直接投與呼吸系統中並進入肺中。在某些實施例中，RNAi誘導劑是以有效治療或預防侵襲呼吸系統的病狀(諸如，呼吸道病毒感染)、同時產生進入血液中的最小吸收和由此引起的RNAi誘導劑的最小全身性遞送的量來投與。在本發明的某些實施例中，吸收到血液中的程度是以致於當以在肺中有效的劑量來投與RNAi藥劑時，在呼吸系統外部的器官或組織中觀察不到臨床顯著作用的程度。具體來說，本發明提供乾粉組合物，其包含RNAi誘導實體，優選為RNAi誘導劑。本發明的藥劑優選以氣溶膠噴霧劑形式從加壓容器或分配器，或噴霧器遞送，所述加壓容器或分配器含有適合推進劑，例如，諸如二氧化碳的氣體。在某些實施例中，遞送系統適於將組合物遞送到受檢者的主要氣道(氣管和支氣管)中和/或深入到肺(細支氣管和/或肺泡)中。在某些實施例中，包含RNAi誘導實體的組合物是使用鼻噴霧劑來遞送。遞送劑可包括在醫藥組合物中。然而，本發明者也已經發現，當在不存在特定遞送劑的情況下，通過呼吸道遞送到呼吸系統中時，RNAi誘導劑可有效地抑制流感病毒(實例23)。在某些實施例中，RNAi誘導劑是以組合物形式遞送到肺中，所述組合物基本上由呈乾燥形式(例如乾粉)或在水性介質中的RNAi誘導劑(例如，裸siRNA或shRNA)組成，所述水性介質基本上由水組成，視需要也包括鹽(例如，NaCl、磷酸鹽)、緩衝液和/或乙醇。用於遞送到氣道和肺中的氣溶膠配方可包含具有各種尺寸和性質的液體或乾燥粒子。含有直徑小於約1mm的粒子的乾燥粒子組合物在本文中又稱作乾粉。「乾燥」意思是組合物具有相對低的液體含量，以便粒子可容易地分散在(例如)乾粉吸入裝置中來形成氣溶膠或噴霧劑。「粉末」意思是主要或完全由精細分散的固體粒子組成的組合物，所述固體粒子是相對自由流動的並且能夠容易地分散在吸入裝置中，並且隨後被受檢者(例如，患者)吸入，(優選地)以便粒子可到達肺的肺泡，也就是說，適於肺部遞送。粉末組合物可根據諸如以下各項的各種參數來表徵細粒分數(FPF)、噴射劑量、平均粒子密度和質量中值氣體動力學直徑(MMAD)。適合的方法在所屬領域中是已知的並且見於(例如)參考文獻31和58和第20020146373號、第20030012742號和第20040092470號美國公開案中。在本發明的某些實施例中，使用具有在1μm與25μm之間，優選在1μm與10μm之間的質量平均氣體動力學直徑的粒子。在某些實施例中，使用具有在3與15μm之間的平均幾何直徑和在0.04與0.6g/cm3之間的振實密度的大孔粒子(31、58)。用於製造乾燥粒子的方法在所屬領域中是已知的。適合方法包括噴霧乾燥、噴霧-冷凍乾燥、相分離、單或雙乳液溶劑蒸發、溶劑萃取以及簡單和複合凝聚法。微粒組合物也可使用造粒、擠壓和/或滾圓法來製造。適於製備乾粉寡核苷酸配方的方法在所屬領域中是已知的。參見，例如，第20040092470號美國公開案。優選使用的方法不會大大降低核酸的物理完整性和其抑制標靶轉錄本的能力。需要避免已知會引起核酸顯著降解的溫度或pH值的極限值。應了解，降解程度通常可隨特定條件和核酸暴露至所述條件的時間而變化，因此將暴露時間最小化可能是所要求的並且可能允許使用更多的極限值條件。可對組合物進行測試來確定所選擇的方法對保持足夠功效來說是否是適當的。優選地，所選配製方法所產生的組合物中，由核酸組成的部分具有輸入核酸的活性水平的至少10％，優選至少20％、50％或50％以上。用於製備粒子的條件可經過選擇以產生具有所要求的尺寸或性質(例如，疏水性、親水性、外部形態、「粘性」、形狀等)的粒子。製備粒子的方法和所使用的條件(例如，溶劑、溫度、濃度、空氣流速等)也可取決於包括在組合物中的特定活性劑和其他組分。如果通過上述方法中的任何方法所製備的粒子具有在所要求範圍以外的尺寸範圍，那麼可(例如)使用篩子，通過研磨等來對粒子分級。可使用方法的組合。乾粉可基本上由一種或一種以上的RNAi誘導劑組成。在某些實施例中，配方包括一種或一種以上的另外的試劑，例如穩定劑、諸如上文所述試劑的增強遞送的試劑、賦形劑等。按本文中所使用的術語「賦形劑」是指存在於本發明的配方中的不同於活性劑或增強遞送的試劑的物質。適用於肺部遞送的賦形劑在所屬領域中是已知的。所屬領域公認的大量化合物中的任何化合物可包括在本發明的配方中。通常，可使用以重量計濃度在0.1％與100％之間的活性劑(即，RNAi誘導劑)的組合物。用於測試粒子的(例如)降低標靶轉錄本含量和/或抑制流感病毒產生的能力的方法描述於實例10中。類似方法可用於本發明氣溶膠配方中的任何配方。乾燥粒子組合物可溶於適合的溶劑中並以液體氣溶膠形式或通過其他適合的遞送方式來遞送。液體粒子也可(例如)作為氣溶膠配方來遞送。通常，所述粒子的尺寸範圍可類似於上文對乾燥粒子描述的尺寸範圍。儘管也可使用更小或更大粒子，但在某些實施例中，液體粒子是在大約0.5-5μm之間以用於呼吸系統遞送。適合的水性媒介物包括水或鹽水，視需要包括醇。對肺部遞送的另外考慮在Bisgaard，H.，等人，(編)，DrugDeliverytotheLung，第26卷in″LungBiologyinHealthandDisease″，MarcelDekker，NewYork，2002加以討論。如果需要，那麼包含本發明RNAi誘導劑的粒子也可以通過靜脈內途徑投與。對靜脈內遞送來說，大約10nm-50μm的尺寸通常是優選的。VIII.治療應用包含本發明的RNAi誘導實體的組合物可用於抑制或降低呼吸道病毒感染或複製。在所述應用中，在暴露至例如流感病毒的病毒之前，同時或之後，將有效量的本發明組合物遞送到細胞或生物體中。優選地，RNAi誘導實體的量足以降低或延緩一種或一種以上的感染症狀。為進行描述，本部分將常提及本發明的siRNA，但本發明涵蓋靶向病毒轉錄本的其他RNAi誘導實體的類似應用。也應了解，流感病毒在本文中是作為一個實例來使用，但所述方法可應用於廣泛範圍的其他呼吸道病毒中的任何病毒。本發明的組合物可包含靶向單一流感轉錄本中的單一位點的單種RNAi誘導劑，或者可包含靶向一種或一種以上的流感轉錄本中的一個或一個以上的位點的多個不同的物種。在本發明的一些實施例中，將需要利用含有靶向不同流感基因的不同RNAi誘導劑(例如，多種不同的siRNA)的集合的組合物。舉例而言，可能需要使用各種針對不同病毒轉錄本的siRNA，在病毒生命周期中，在多個點處攻擊病毒。根據本發明的某些實施例，組合物含有靶向各個片段的siRNAi。在某些實施例中，組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同的RNAi誘導劑物種，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同的siRNA。在本發明的某些實施例中，RNAi誘導劑靶向具有選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列的流感病毒基因組的部分。在本發明的某些實施例中，RNAi誘導劑靶向具有選自由SEQIDNO272-380的任何所選子集組成的群組的序列的流感病毒基因組的部分。即使不明確地陳述，所有所述子集也包括在本文中用於任何和所有目的。在本發明的某些實施例中，組合物包含至少一種靶向PA的RNAi誘導劑和至少一種靶向例如NP、PB1或PB2的另一種流感病毒基因的RNAi誘導劑。在本發明的某些實施例中，組合物包含至少一種靶向PB1的RNAi誘導劑和至少一種靶向例如NP、PA或PB2的另一種流感病毒基因的RNAi誘導劑。在本發明的某些實施例中，組合物包含至少一種靶向PB2的RNAi誘導劑和至少一種靶向例如NP、PB1或PA的另一種流感病毒基因的RNAi誘導劑。在本發明的某些實施例中，組合物包含至少一種靶向NP的RNAi誘導劑和至少一種靶向例如PA、PB1或PB2的另一種流感病毒基因的RNAi誘導劑。根據本發明的某些實施例，本發明的siRNA組合物可含有一種以上的靶向單一病毒轉錄本的siRNA物種。舉例而言，可能需要包括至少一種靶向標靶轉錄本的編碼區的siRNA和至少一種靶向3′UTR的siRNA。所述策略可額外確保將不會產生由相關轉錄本所編碼的產物，因為組合物中的至少一種siRNA將靶向用於降解的轉錄本，而至少一種其他的siRNA抑制任何避免降解的轉錄本的翻譯。因此，本發明涵蓋本發明的RNAi誘導實體的組合，包括(但不限於)投與多種RNAi誘導劑，例如多種siRNA或shRNA的方法，和單一載體引導抑制多種流感病毒轉錄本的siRNA的合成或可經過加工以產生多個siRNA的RNA的合成的方法。其他細節參見實例11。根據本發明的某些實施例，組合物包括靶向至少一種流感病毒A轉錄本的RNAi誘導劑和靶向至少一種流感病毒B轉錄本的RNAi誘導劑。在某些實施例中，組合物包含靶向流感A病毒轉錄本和流感B病毒轉錄本的RNAi誘導劑。根據本發明的某些實施例，組合物包含具有靶向特定片段的相同部分的不同序列的多種siRNA。根據本發明的某些實施例，組合物包含抑制不同流感病毒株或亞型的多種RNAi誘導劑。流感病毒經歷抗原轉變和抗原漂移，並且可能產生治療劑抗性。可預期，在本發明的組合物已經使用一段時間後，可能發生突變和/或重配，從而可能出現不受所提供的特定RNAi誘導劑抑制的變異體。本發明因此涵蓋進一步的(evolving)治療方案。舉例而言，在特定情況下，回應於特定的突變或重配，可選擇一種或一種以上的新的RNAi誘導劑。舉例而言，常可能設計與原始藥劑相同的新的RNAi誘導劑，只是並有任何已經發生的突變或靶向新獲得的RNA片段；在其它情況下，將需要靶向相同轉錄本中的新的序列；在其他情況下，將需要完全靶向新的轉錄本。常會需要將本發明的RNAi誘導劑與一種或一種以上的其他抗病毒劑組合投與以抑制、減少或預防一種或一種以上的感染症狀或感染特徵。在本發明的某些優選實施例中，本發明的RNAi誘導劑是與一種或一種以上諸如NA抑制劑、M抑制劑等其他抗病毒劑組合。實例包括金剛胺(amantadine)或金剛乙胺(rimantadine)和/或扎那米偉(zanamivir)、奧司他偉(oseltamivir)、帕拉米韋(peramivir)(BCX-1812、RWJ-270201)Ro64-0796(GS4104)或RWJ-270201。然而，本發明的RNAi誘導劑組合物的投與，也可與一種或一種以上包括(例如)各種已知流感疫苗(例如，使用流感病毒或病毒抗原的常規疫苗以及DNA疫苗)在內的各種藥劑中的任何藥劑組合。其他信息參見Palese，P.和Garcia-Sastre，2002；Cheung和Lieberman，2002，Leuscher-Mattli，2000；和Stiver，2003。在本發明的不同實施例中，RNAi誘導劑與其他藥劑存在於相同的混合物中，或者用於個體的治療方案包括不必在相同混合物中遞送或同時遞送的RNAi誘導劑和其他藥劑。因此，如本文中所使用，術語「組合」並不旨在表示化合物必須存在於單一組合物中，或作為單一組合物，例如作為相同劑量單位的部分(例如，在相同氣溶膠配方、粒子組合物、片劑、膠囊、丸劑、溶液等中)投與受檢者中(雖然也可如此)。而是，在本發明的某些實施例中，個別地但同時地投與所述藥劑。如本文中所使用，術語兩種或兩種以上的化合物的「共投與」或「同時投與」並不旨在表示化合物必須在精確相同的時間被投與。通常，如果化合物同時以小於微量(deminimis)的量存在於體內，那麼將化合物共投與或同時投與。因此，化合物可(但不必)作為單一組合物的部分一起投與。另外，化合物可(但不必)同時(例如，小於5分鐘內，或小於1分鐘內)投與或相對彼此在短時間內投與(例如，相隔小於1小時，小於30分鐘，小於10分鐘，大約5分鐘)。根據本發明的各種實施例，在所述時間間隔內投與的化合物可被認為是實質上同時投與的。所屬領域的技術人員將能夠容易地確定化合物投與之間的適當時間間隔，以便各自將以超過微量的含量存在於體內，或優選地，以有效濃度存在於體內。本發明的RNAi誘導劑和載體提供接種疫苗的互補策略，並且可被投與已經或還未用各種現行的或研發中的疫苗的任何疫苗進行接種疫苗的個體(Palese，P.和Garcia-Sastre，A.，J.Clin.Invest.，110(1)9-13，2002一文中進行了評論)。美國的現有疫苗配方含有滅活病毒並且必須通過肌肉內注射來投與。疫苗分成三部分，並且除流感B類型外，還含有來自目前循環中的流感A的兩種亞型(H3N2和H1N1)的代表性病毒株。每種季節特異性推薦標準識別適用於該季節疫苗的特定菌株。其他疫苗方法包括適冷的活流感病毒，可通過鼻噴霧劑來投與；在病毒基因組中含有刪除或其他突變的經基因工程操作的活流感病毒疫苗；缺複製流感病毒，和DNA疫苗，其中以肌肉內或局部途徑投與編碼病毒蛋白質中的一種或一種以上的病毒蛋白質的質粒DNA(參見，例如，Macklin，M.D.，等人，JVirol，72(2)1491-6，1998；Ilium，L.，等人，AdvDrugDelivRev，51(1-3)81-96，2001；Ulmer，J.，Vaccine，20S74-S76，2002)。免疫受損患者和老年個體可從基於RNAi的治療劑獲得特殊益處，因為他們可能經歷了流感病毒疫苗功效降低。在本發明的一些實施例中，可能需要將本發明的組合物的投與靶向經流感病毒感染的細胞，或至少靶向易感於流感病毒感染的細胞(例如，表達含唾液酸的受體的細胞)。在其他實施例中，將需要有效的最大遞送選擇寬度。如上所述，本發明的治療方案包括在暴露至流感病毒之前，同時或之後，投與有效量的RNAi誘導劑或載體。舉例而言，未感染的個體可在暴露至流感之前用本發明的組合物來「免疫」；處於風險之中的個體(例如，老年人、免疫受損個體、近來已與被懷疑、很可能或已知受流感病毒感染的人員接觸的人，等)可實質上在暴露同時，例如在暴露後2小時或2小時以內進行治療。在其他實施例中，受檢者是在被懷疑或已知暴露後的稍晚時間，例如，2-12、12-24、24-36或36-48小時內進行治療。受檢者可以是有症狀或無症狀的。在某些實施例中，受檢者是在暴露之間最多48小時，最多24小時，最多12小時，最多3小時等，通過投與RNAi誘導劑或載體來加以保護。當然，被懷疑或已知受感染的個體可在任何時間接受本發明的治療。某些優選流感病毒抑制劑抑制病毒複製，以使得在含有抑制劑的細胞中的複製水平比在不含有抑制劑的對照細胞中的複製水平低至少約2倍，優選至少約4倍，更優選至少約8倍、16倍、64倍、100倍、200倍或達到甚至更大的程度。某些優選流感病毒抑制劑在藥劑的投與和/或感染後，預防(例如，降低到不可測的水平)或顯著降低病毒複製(例如，相對於不存在RNAi誘導劑時發生的水平，10％或10％以下，25％或25％以下，50％或50％以下，75％或75％以下)至少24小時，至少36小時，至少48小時或約60小時。在本發明的某些實施例中，使用緩釋製劑來實現預防目的，例如，經過一段時期釋放足夠量的活性劑來保護受檢者以避免流感病毒感染，或減輕所述感染的症狀的配方。舉例而言，配方可在數天、一周、1-2周或更長的時期內釋放有效量的藥劑。可使用包含RNAi誘導劑或載體的可生物降解的聚合遞送系統。因此，本發明的RNAi誘導實體在至少3種相異的情況下在治療上有效(i)RNAi誘導實體可投與未被懷疑或不知道已經暴露至流感病毒的受檢者。在所述情況下，RNAi誘導實體優選預防臨床顯著感染的發展或減輕其嚴重性；(ii)RNAi誘導實體可(例如)在最多一周的先行時間間隔內投與被懷疑或已知已經暴露至流感病毒的受檢者。RNAi誘導實體優選預防臨床顯著感染的發展或減輕其嚴重性，(iii)RNAi誘導實體可投與已經變成臨床生病的受檢者。RNAi誘導實體抑制流感病毒複製並且優選減輕流感病毒感染的至少一種症狀的嚴重性和/或持續時間。可治療具有上呼吸道、下呼吸道或兩者的感染的受檢者。在本發明的某些實施例中，受檢者具有由流感病毒感染所引起的病毒性肺炎。在本發明的某些實施例中，使用基因療法來預防流感或治療已經生病的個體。基因療法方案可包括在流感病毒感染之前，實質上同時或之後，向受檢者投與有效量的能夠引導抑制性RNAi誘導劑的表達的基因療法載體。如上所述，除人類外，流感病毒還感染多種物種。本發明包括本發明的組合物用於治療非人類物種，尤其是諸如雞、豬和馬等物種的用途。IX.醫藥配方如上文所討論，RNAi誘導實體的吸入遞送在本發明的某些實施例中是優選的，而靜脈內遞送在本發明的其他實施例中是優選的。吸入遞送可能更適合處於相對較好健康狀態的患者，而靜脈內遞送可能更適合不能進行足夠吸氣和/或遭受可能會阻止經由呼吸途徑的有效遞送的病狀(例如，過量粘液產生；肺的多個部分由於細菌感染而變實或因疤痕組織而堵塞的情形，等)或需要維持藥劑的相對恆定濃度的個體。然而，本發明的組合物可通過包括(但不限於)以下各種途徑在內的任何有效途徑來配製以用於遞送腸道外(例如靜脈內)、皮內、皮下、口、鼻、支氣管、眼、透皮(局部)、透黏膜、直腸和陰道途徑。優選的遞送途徑包括腸道外、透黏膜、鼻、支氣管和口服途徑。本發明的醫藥組合物通常包括RNAi誘導劑或將在遞送後引起RNAi誘導劑產生的載體，以及醫藥學上可接受的載劑。如本文中所使用，「醫藥學上可接受的載劑」一詞包括與醫藥投與相容的溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。也可將補充活性化合物併入組合物中。配製醫藥組合物以與預期投與途徑相容。用於腸道外(例如靜脈內)、肌肉內、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可包括以下組分無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苄醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用於調節滲透壓的試劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。PH值可用酸或鹼調節，諸如鹽酸或氫氧化鈉。腸道外製劑可裝入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料製成的多劑量小瓶中。適於注射用途的醫藥組合物通常包括無菌水溶液(如果是水溶性的)或分散液和用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。對靜脈內投與來說，適合的載劑包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，ParsippanyNJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應當是無菌的，並且應當是呈容易注射程度的液體。優選醫藥配方在製造和存儲條件下是穩定的，並且必須預防諸如細菌和真菌等微生物的汙染作用。通常，有關載劑可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)和其合適混合物的溶劑或分散介質。可(例如)通過使用諸如卵磷脂的塗層，通過在分散情況下維持所需的粒度和通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。對微生物作用的預防可通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)等達到。在許多情況下，將優選在組合物中包括等滲劑，例如，糖，諸如甘露醇、山梨糖醇的多元醇，氯化鈉。通過在組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠的延緩吸收的試劑，可可使注射組合物的吸收延長。無菌注射溶液可通過將所需量的活性化合物與上文列舉的成分之一或組合併入適當溶劑中，接著需要時進行過濾滅菌來製備。優選地，用於注射的溶液不含內毒素。通常，分散液是通過將活性化合物併入含有基礎分散介質和來自上文列舉成分的所需其他成分的無菌媒介物中來製備。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末情況下，優選製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，所述方法從其先前無菌過濾溶液產生具有活性成分加上任何另外的所要求的成分的粉末。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。為進行口服治療投與，可將活性化合物與賦形劑合併，並且以片劑、口含片或例如明膠膠囊的膠囊形式來使用。口服組合物也可使用液體載劑來製備以用作含嗽液。可包括醫藥學上相容的粘合劑和/或輔助物質作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、口含片等可含有以下成分中的任何成分，或具有類似性質的化合物粘合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterote；助流劑，諸如膠體二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調料。用於口服遞送的配方可有利地併入用於改善在胃腸道內的穩定性和/或增強吸收的試劑。本發明RNAi誘導實體中的任何RNAi誘導實體的全身性投與也可以通過透黏膜或透皮方式進行。對透黏膜或透皮投與來說，將適於待滲透的屏障的滲透劑用於配方中。所述滲透劑通常在所屬領域中是已知的，並且對透黏膜投與來說，包括(例如)洗滌劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。透黏膜投與可通過使用鼻噴霧劑或栓劑來完成。對透皮投與來說，將活性化合物配製成通常在所屬領域中已知的軟膏、油膏劑、凝膠或乳劑。化合物也可以用於直腸遞送的栓劑(例如，具有常規栓劑基質，諸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌腸形式來製備。除上文所述的遞送劑外，在本發明的某些實施例中，活性實體是利用保護化合物以避免從身體快速消除的載劑來製備，諸如控釋配方，包括植入系統和微囊化遞送系統。可使用可生物降解的、可生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可在數小時、數天、數周或甚至更長的時期內釋放活性劑的緩釋配方可能特別適用於預防目的。用於製備所述配方的方法對所屬領域的技術人員來說是顯而易見的。所述物質也可以從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc購得。脂質體懸浮液(包括靶向受感染細胞的脂質體與針對病毒抗原的單克隆抗體)也可以用作醫藥學上可接受的載劑。所述懸浮液可根據所屬領域的技術人員所已知的方法來製備，例如，如第4,522,811號美國專利中所述的方法。為達到投與簡便性和劑量均勻性，有利的是，以劑量單位形式配製口服或腸道外組合物。如本文中所使用的劑量單位形式是指適合作為用於待治療受檢者的單元劑量的物理上離散的單元；各個單元含有與所需醫藥載劑結合的經過計算以產生所要求的治療作用的預定量的活性化合物。所述化合物的毒性和治療功效可通過在細胞培養物或實驗動物中(例如)用於測定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體治療有效劑量)的標準藥學程序來測定。毒性作用與治療作用的劑量比率為治療指數並且可表示為比率LD50/ED50。展現高治療指數的化合物是優選的。雖然可使用展現毒性副作用的化合物，但是應謹慎設計將所述化合物靶向被侵襲組織的部位的遞送系統，以便將對未感染細胞的可能損害最小化，並且進而降低副作用。從細胞培養物分析和動物研究所獲得的數據可以用於制定供人類使用的劑量範圍。所述化合物的劑量優選處在循環濃度的範圍內，所述濃度包括具有很小毒性或不具有毒性的ED50。劑量可視所使用的劑型和所利用的投與途徑而在所述範圍內變化。對用於本發明方法中的任何化合物來說，治療有效劑量可最初根據細胞培養物分析來估算。劑量可在動物模型中配製以達到如在細胞培養物中所測定的循環血漿濃度範圍，所述範圍包括IC50(即，達到症狀的半最大抑制時，測試化合物的濃度)。所述信息可用於更精確地確定人類中的有效劑量。可(例如)通過高效液相色譜法來測量血漿中的含量。醫藥組合物的治療有效量通常是在約0.001到30mg/kg體重，優選約0.01到25mg/kg體重，更優選約0.1到20mg/kg體重，並且甚至更優選約1到10mg/kg，2到9mg/kg，3到8mg/kg，4到7mg/kg，或5到6mg/kg體重的範圍內。醫藥組合物可按需要以各種時間間隔和經不同的時期來投與，例如，每天多次，每天一次，每隔一天一次，每周一次歷時約1到10周，2到8周，約3到7周，約4、5或6周等。所屬領域的技術人員應了解，某些因素可能影響有效治療受檢者所需的劑量和定時，所述因素包括(但不限於)疾病或病症的嚴重性、先前的治療、受檢者的綜合健康狀況和/或年齡，和所存在的其他疾病。通常，用如本文中所述的RNAi誘導實體治療受檢者，可包括單一治療或在許多情況下，可包括一系列的治療。示範性劑量包括每千克受檢者或樣品重量的例如siRNA的本發明核酸的毫克或微克數(例如，每千克約1μg/kg到每千克約500mg/kg，約100mg/kg到約5mg/kg，或約1mg/kg到約50mg/kg)。對局部投與(例如，鼻內)來說，可使用遠小於所述劑量的劑量。此外應了解，RNAi誘導劑的適當劑量取決於藥劑的效力，並且可視需要(例如)通過投與遞增劑量直到達到預選的所要求的反應而針對特定受體量身定做。應了解，用於任何特定動物受檢者的特定劑量水平可取決於各種因素，包括所使用的特定化合物的活性，受檢者的年齡、體重、綜合健康狀況、性別和飲食，投與時間，投與途徑，排洩速率，任何藥物組合和待調控的表達或活性的程度。本發明包括含例如siRNA或shRNA的本發明核酸的組合物用於治療包括(但不限於)馬、豬和鳥類的非人類動物的用途。因此，投與的劑量和方法可根據獸醫藥理學和醫學的已知原則來選擇。指導可見於(例如)Adams，R.(ed.)，VeterinaryPharmacologyandTherapeutics，第8版，IowaStateUniversityPress；ISBN0813817439；2001中。本發明的醫藥組合物可連同用於投與的說明書一起包括在容器、包裝或分配器中。例證實例1抑制流感A病毒的siRNA的設計將來自一組流感病毒株的基因組序列以正鏈形式加以比較，並且識別各個片段中最保守的區域。所述病毒群組包括得自鳥、豬、馬和人類的病毒。為執行比較，將來自在不同年份分離得到的不同動物(非人類)物種的流感A病毒的12到15種菌株的個別片段的序列和來自在不同年份分離得到的人類的12到15種菌株的個別片段的序列比對。選擇菌株以涵蓋多種HA和NA亞型。選擇在不同菌株之間有0、1或2個核苷酸不同的區域。舉例而言，使用以下菌株來選擇靶向NP轉錄本的siRNA，各種菌株名稱之前的登錄號是指NP序列的登錄號，並且由核苷酸編號來表示所比較序列的長度。以下清單中的表目順序是登錄號、菌株名稱、所比較序列的長度、年份、亞型。其他基因組片段的登錄號不同，但可在上文提及的資料庫中容易地找到。所比較的菌株是NC_002019A/波多黎各/8/3415651934H1N1M30746A/威爾遜-史密斯(Wilson-Smith)/3315651933H1N1M81583A/列寧格勒/134/47/5715661957H2N2AF348180A/香港/1/6815201968H3N2L07345A/孟斐斯/101/7215651972H3N2D00051A/烏隆(Udorn)/307/7215651972H3N2L07359A/廣東/38/7715651977H3N2M59333A/俄亥俄/201/8315651983H1N1L07364A/孟菲斯/14/8515651985H3N2M76610A/威斯康星(wisconsin)/3623/8815651988H1N1U71144A/秋田(Akita)/1/9414971994H3N2AF084277A/香港/483/9714971997H5N1AF036359A/香港/156/9715651997H5N1AF250472A/水鳥/香港/M603/9814971998H11N1ISDN13443A/雪梨/274/200015032000H3N2M63773A/鴨/馬尼託巴(Manitoba)/1/5315651953H10N7M63775A/鴨/賓夕法尼亞/1/6915651969H6N1M30750A/馬/倫敦/1416/7315651973H7N7M63777A/海鷗/馬裡蘭/5/7715651977H11N9M30756A/海鷗/馬裡蘭/1815/7915651979H13N6A/野鴨/阿斯特拉罕(Astrakhan)(古裡M6378515651982H14N5耶夫(Gurjev))/263/82M27520A/鯨/緬因(Maine)/328/8415651984H13N2M63768A/豬/愛荷華州(Iowa)/17672/8815651988H1N1Z26857A/火雞/德國/3/9115541991H1N1U49094A/鴨/南昌/1749/9214071992H11N2AF156402A/雞/香港/G9/9715361997H9N2AF285888A/豬/安大略(Ontario)/01911-1/9915321999H4N6圖9顯示選擇在6種流感A變異體(全部具有人類宿主來源)之間高度保守的PA轉錄本的某些區域的實例，其中如果相差0、1或2個核苷酸，那麼認為區域是高度保守的。(注意，序列是作為DNA而不是RNA列出並且因此含有T而不是U。)將菌株A/波多黎各/8/34(H1N1)的序列選作基本序列，即，其他序列與之相比較的序列。該組的其他成員是A/WSN/33(H1N1)、A/列寧格勒/134/17/57(H2N2)、A/香港/1/68(H3N2)、A/香港/481/97(H5N1)和A/香港/1073/99(H9N2)。該圖呈現通過電腦程式CLUSTALW(1.4)產生的多序列比對。不同於基本序列的核苷酸加了陰影。圖10顯示選擇在5種流感A變異體(全部具有不同的動物宿主來源)之間以及在具有人類宿主來源的2種菌株之間高度保守的PA轉錄本的某些區域的實例，其中如果相差0、1或2個核苷酸，那麼認為區域是高度保守的。(注意，序列是作為DNA而不是RNA列出並且因此含有T而不是U。)將菌株A/波多黎各/8/34(H1N1)的序列選作基本序列，即，其他序列與之相比較的序列。該組的其他成員是A/WSN/33(H1N1)、A/雞/FPV/羅斯託克(Rostock)/34(H7N1)、A/火雞/加利福尼亞/189/66(H9M2)、A/馬/倫敦/1416/73(H7N7)、A/海鷗/馬裡蘭/704/77(H13N6)和A/豬/香港/9/98(H9N2)。不同於基本序列的核苷酸加了陰影。注意，在圖9和10中的序列比較中，可選擇許多不同的高度保守區，因為序列的大部分滿足高度保守的標準。然而，在5′端處的具有AA的序列提供互補(反義)siRNA鏈中的19核苷酸核心序列和2核苷酸3′UU突出端。因此，掃描高度保守的區域以識別21核苷酸部分，所述21核苷酸部分在其5′端處具有AA以便存在於siRNA的反義鏈中的互補核苷酸是UU。舉例而言，陰影序列中的各個序列在其5′端具有AA。注意，所得siRNA分子的反義鏈中的UU3′突出端可如表2所示由TT或dTdT替換。然而，反義鏈的2nt3′突出端不必是UU。為進一步說明所述方法，圖12顯示在具有人類或動物宿主來源的12種流感A病毒亞型或分離株中的NP序列的3′區域的一部分之間的序列比較。劃線序列和在劃線序列下方的序列的對應部分用於設計siRNANP-1496(參見下文)。這些序列顯示在圖12中。基本序列是菌株A/波多黎各/8/34的序列。陰影字母表示不同於基本序列的核苷酸。表1A列出在病毒基因片段的各個片段的流感病毒序列組之間高度保守的21核苷酸區。除使用T代替U外，根據存在於病毒mRNA中序列，在5′到3′方向上，列出表1A中的序列。編號表示病毒基因組中序列的位置。舉例而言，PB2-117/137表示在片段PB2中從位置117延伸到位置137的序列。許多序列滿足另外的標準，即所述序列在其5′端處具有AA，以便在互補鏈中產生3′UU突出端。對PA片段來說，在存在1或2個核苷酸差異的情況下，siRNA的序列是基於A/PR8/34(H1N1)菌株，除了序列PA-2087/2107AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA(SEQIDNO30)是基於A/WSN/33(H1N1)菌株以外。注意，在位置20處，6種序列中有5種含有G而基本序列(登錄號NC_002019)含有A。因此，在所述情況下，基本序列的序列不用於siRNA設計。術語PA-2087和PA-2087(G)在本文中可交替地使用。為基於表1A中列出的序列來設計siRNA，將核苷酸3-21選作siRNA有義鏈序列的核心區，並且將由dTdT組成的2nt3′突出端添加到各個所得序列中。將與各個序列的核苷酸1-21互補的序列選作對應的反義鏈。舉例而言，為基於高度保守的序列PA-44/64，即，AATGCTTCAATCCGATGATTG(SEQIDNO22)來設計siRNA，選擇具有序列TGCTTCAATCCGATGATTG(SEQIDNO109)的19nt核心區。添加由dTdT組成的2nt3′突出端，(用U替換T後)產生序列5′-UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT-3′(SEQIDNO79)，是siRNA有義鏈的序列。對應的反義siRNA鏈序列的序列與SEQIDNO22，即，CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT(SEQIDNO80)互補，其中除2nt3′突出端外，T已經被U替換。表1B列出基於流感病毒轉錄本的另外的高度保守區而設計的siRNA。在表1B中表示為「有義鏈」的序列的第一個19nt序列是高度保守區的序列。顯示有義鏈siRNA序列在3′端具有dTdT突出端，這不對應於流感病毒序列並且是siRNA的可選特徵。也顯示對應的反義鏈也在3′端併入dTdT突出端作為可選特徵。名稱與表1B中的一樣。舉例而言，PB2-4/22有義表示有義鏈具有PB2轉錄本的核苷酸4-22的序列的siRNA。PB2-4/22反義表示對應於PB2-4/22有義的互補反義鏈。對靶向轉錄本中的跨越剪接位點的位點的siRNA來說，顯示在未剪接轉錄本內的位置。舉例而言，M-44-52/741-750表明在經剪接mRNA中，對應於基因組序列的44-52和741-750的核苷酸被靶向。圖9和10中的陰影區表示滿足高度保守的標準的一些21核苷酸區。基於這些序列如上文所述來設計siRNA。表2中列出了所測試的實際siRNA序列。表1A.用於設計幹擾流感A病毒感染的siRNA的保守區片段1PB2PB2-117/137AATCAAGAAGTACACATCAGG(SEQIDNO1)PB2-124/144AAGTACACATCAGGAAGACAG(SEQIDNO2)PB2-170/190AATGGATGATGGCAATGAAAT(SEQIDNO3)PB2-195/215AATTACAGCAGACAAGAGGAT(SEQIDNO4)PB2-1614/1634AACTTACTCATCGTCAATGAT(SEQIDNO5)PB2-1942/1962AATGTGAGGGGATCAGGAATG(SEQIDNO6)PB2-2151/2171AAGCATCAATGAACTGAGCAA(SEQIDNO7)PB2-2210/2230AAGGAGACGTGGTGTTGGTAA(SEQIDNO8)PB2-2240/2260AACGGGACTCTAGCATACTTA(SEQIDNO9)PB2-2283/2303AAGAATTCGGATGGCCATCAA(SEQIDNO10)片段2PB1PB1-6/26AAGCAGGCAAACCATTTGAAT(SEQIDNO11)PB1-15/35AACCATTTGAATGGATGTCAA(SEQIDNO12)PB1-34/54AATCCGACCTTACTTTTCTTA(SEQIDNO13)PB1-56/76AAGTGCCAGCACAAAATGCTA(SEQIDNO14)PB1-129/149AACAGGATACACCATGGATAC(SEQIDNO15)PB1-1050/1070AATGTTCTCAAACAAAATGGC(SEQIDNO16)PB1-1242/1262AATGATGATGGGCATGTTCAA(SEQIDNO17)PB1-2257/2277AAGATCTGTTCCACCATTGAA(SEQIDNO18)片段3PAPA-6/26AAGCAGGTACTGATCCAAAAT(SEQIDNO19)PA-24/44AATGGAAGATTTTGTGCGACA(SEQIDNO20)PA-35/55TTGTGCGACAATGCTTCAATC(SEQIDNO21)PA-44/64AATGCTTCAATCCGATGATTG(SEQIDNO22)PA-52/72AATCCGATGATTGTCGAGCTT(SEQIDNO23)PA-121/141AACAAATTTGCAGCAATATGC(SEQIDNO24)PA-617/637AAGAGACAATTGAAGAAAGGT(SEQIDNO25)PA-711/731TAGAGCCTATGTGGATGGATT(SEQIDNO26)PA-739/759AACGGCTACATTGAGGGCAAG(SEQIDNO27)PA-995/1015AACCACACGAAAAGGGAATAA(SEQIDNO28)PA-2054/2074AACCTGGGACCTTTGATCTTG(SEQIDNO29)PA-2087/2107AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA(SEQIDNO30)PA-2110/2130AATGATCCCTGGGTTTTGCTT(SEQIDNO31)PA-2131/2151AATGCTTCTTGGTTCAACTCC(SEQIDNO32)片段4HAHA-1119/1139TTGGAGCCATTGCCGGTTTTA(SEQIDNO33)HA-1121/1141GGAGCCATTGCCGGTTTTATT(SEQIDNO34)HA-1571/1591AATGGGACTTATGATTATCCC(SEQIDNO35)片段5NPNP-19/39AATCACTCACTGAGTGACATC(SEQIDNO36)NP-42/62AATCATGGCGTCCCAAGGCAC(SEQIDNO37)NP-231/251AATAGAGAGAATGGTGCTCTC(SEQIDNO38)NP-390/410AATAAGGCGAATCTGGCGCCA(SEQIDNO39)NP-393/413AAGGCGAATCTGGCGCCAAGC(SEQIDNO40)NP-708/728AATGTGCAACATTCTCAAAGG(SEQIDNO41)NP-1492/1512AATGAAGGATCTTATTTCTTC(SEQIDNO42)NP-1496/1516AAGGATCTTATTTCTTCGGAG(SEQIDNO43)NP-1519/1539AATGCAGAGGAGTACGACAAT(SEQIDNO44)片段6NANA-20/40AATGAATCCAAATCAGAAAAT(SEQIDNO45)NA704/724GAGGACACAAGAGTCTGAATG(SEQIDNO46)NA-861/881GAGGAATGTTCCTGTTACCCT(SEQIDNO47)NA-901/921GTGTGTGCAGAGACAATTGGC(SEQIDNO48)片段7MM-156/176AATGGCTAAAGACAAGACCAA(SEQIDNO49)M-175/195AATCCTGTCACCTCTGACTAA(SEQIDNO50)M-218/238ACGCTCACCGTGCCCAGTGAG(SEQIDNO51)M-244/264ACTGCAGCGTAGACGCTTTGT(SEQIDNO52)M-373/393ACTCAGTTATTCTGCTGGTGC(SEQIDNO53)M-377/397AGTTATTCTGCTGGTGCACTT(SEQIDNO54)M-480/500AACAGATTGCTGACTCCCAGC(SEQIDNO55)M-584/604AAGGCTATGGAGCAAATGGCT(SEQIDNO56)M-598/618AATGGCTGGATCGAGTGAGCA(SEQIDNO57)M-686/706ACTCATCCTAGCTCCAGTGCT(SEQIDNO58)M-731/751AATTTGCAGGCCTATCAGAAA(SEQIDNO59)M-816/836ATTGTGGATTCTTGATCGTCT(SEQIDNO60)M-934/954AAGAATATCGAAAGGAACAGC(SEQIDNO61)M-982/1002ATTTTGTCAGCATAGAGCTGG(SEQIDNO62)片段8NSNS-101/121AAGAACTAGGTGATGCCCCAT(SEQIDNO63)NS-104/124AACTAGGTGATGCCCCATTCC(SEQIDNO64)NS-128/148ATCGGCTTCGCCGAGATCAGA(SEQIDNO65)NS-137/157GCCGAGATCAGAAATCCCTAA(SEQIDNO66)NS-562/582GGAGTCCTCATCGGAGGACTT(SEQIDNO67)NS-589/609AATGATAACACAGTTCGAGTC(SEQIDNO68)表1B.用於設計幹擾流感A病毒感染的siRNA的保守區片段1PB2PB2-4/22有義GAAAGCAGGUCAAUUAUAUdTdTSEQIDNO190)PB2-4/22反義AUAUAAUUGACCUGCUUUCdTdTSEQIDNO191)PB2-12/30有義GUCAAUUAUAUUCAAUAUGdTdTSEQIDNO192)PB2-12/30反義CAUAUUGAAUAUAAUUGACdTdTSEQIDNO193)PB2-68/86有義CUCGCACCCGCGAGAUACUdTdTSEQIDNO194)PB2-68/86反義AGUAUCUCGCGGGUGCGAGdTdTSEQIDNO195)PB2-115/133有義AUAAUCAAGAAGUACACAUdTdTSEQIDNO196)PB2-115/133反義AUGUGUACUUCUUGAUUAUdTdTSEQIDNO197)PB2-167/185有義UGAAAUGGAUGAUGGCAAUdTdTSEQIDNO198)PB2-167/185反義AUUGCCAUCAUCCAUUUCAdTdTSEQIDNO199)PB2-473/491有義CUGGUCAUGCAGAUCUCAGdTdTSEQIDNO200)PB2-473/491反義CUGAGAUCUGCAUGACCAGdTdTSEQIDNO201)PB2-956/974有義UAUGCAAGGCUGCAAUGGGdTdTSEQIDNO202)PB2-956/974反義CCCAUUGCAGCCUUGCAUAdTdTSEQIDNO203)PB2-1622/1640有義CAUCGUCAAUGAUGUGGGAdTdTSEQIDNO204)PB2-1622/1640反義UCCCACAUCAUUGACGAUGdTdTSEQIDNO205)片段2PB1PB1-1124/1142有義AAAUACCUGCAGAAAUGCUdTdTSEQIDNO206)PB1-1124/1142反義AGCAUUUCUGCAGGUAUUUdTdTSEQIDNO207)PB1-1618/1636有義AACAAUAUGAUAAACAAUGdTdTSEQIDNO208)PB1-1618/1636反義CAUUGUUUAUCAUAUUGUUdTdTSEQIDNO209)片段3PAPA-3/21有義CGAAAGCAGGUACUGAUCCdTdTSEQIDNO210)PA-3/21反義GGAUCAGUACCUGCUUUCGdTdTSEQIDNO211)PA-544/562有義AGGCUAUUCACCAUAAGACdTdTSEQIDNO212)PA-544/562反義GUCUUAUGGUGAAUAGCCUdTdT(SEQIDNO213)PA-587/605有義GGGAUUCCUUUCGUCAGUCdTdT(SEQIDNO214)PA-587/605反義GACUGACGAAAGGAAUCCCdTdT(SEQIDNO215)PA-1438/1466有義GCAUCUUGUGCAGCAAUGGdTdT(SEQIDNO216)PA-1438/1466反義CCAUUGCUGCACAAGAUGCdTdT(SEQIDNO217)PA-2175/2193有義GUUGUGGCAGUGCUACUAUdTdT(SEQIDNO218)PA-2175/2193反義AUAGUAGCACUGCCACAACdTdT(SEQIDNO219)PA-2188/2206有義UACUAUUUGCUAUCCAUACdTdT(SEQIDNO220)PA-2188/2206反義GUAUGGAUAGCAAAUAGUAdTdT(SEQIDNO221)片段5NPNP-14/32有義UAGAUAAUCACUCACUGAGdTdT′SEQIDNO222)NP-14/32反義CUCAGUGAGUGAUUAUCUAdTdTSEQIDNO223)NP-50/68有義CGUCCCAAGGCACCAAACGdTdTSEQIDNO224)NP-50/68反義CGUUUGGUGCCUUGGGACGdTdTSEQIDNO225)NP-1505/1523有義AUUUCUUCGGAGACAAUGCdTdTSEQIDNO226)NP-1505/1523反義GCAUUGUCUCCGAAGAAAUdTdTSEQIDNO227)NP-1521/1539有義UGCAGAGGAGUACGACAAUdTdTSEQIDNO228)NP-1521/1539反義AUUGUCGUACUCCUCUGCAdTdTSEQIDNO229)NP-1488/1506有義GAGTAATGAAGGATCTTATdTdTSEQIDNO230)NP-1488/1506反義231)ATAAGATCCTTCATTACTCdTdTSEQIDNO片段7MM-3/21有義CGAAAGCAGGUAGAUAUUGdTdTSEQIDNO232)M-3/21反義CAAUAUCUACCUGCUUUCGdTdTSEQIDNO233)M-13/31有義UAGAUAUUGAAAGAUGAGUdTdTSEQIDNO234)M-13/31反義ACUCAUCUUUCAAUAUCUAdTdTSEQIDNO235)M-150/158有義UCAUGGAAUGGCUAAAGACdTdTSEQIDNO236)M-150/158反義GUCUUUAGCCAUUCCAUGAdTdTSEQIDNO237)M-172/190有義ACCAAUCCUGUCACCUCUGdTdTSEQIDNO238)M-172/190反義CAGAGGUGACAGGAUUGGUdTdTSEQIDNO239)M-211/229有義UGUGUUCACGCUCACCGUGdTdTSEQIDNO240)M-211/229反義CACGGUGAGCGUGAACACAdTdTSEQIDNO241)M-232/250有義CAGUGAGCGAGGACUGCAGdTdTSEQIDNO242)M-232/250反義CUGCAGUCCUCGCUCACUGdTdTSEQIDNO243)M-255/273有義GACGCUUUGUCCAAAAUGCdTdTSEQIDNO244)M-255/273反義GCAUUUUGGACAAAGCGUCdTdTSEQIDNO245)M-645/663有義GUCAGGCUAGGCAAAUGGUdTdTSEQIDNO246)M-645/663反義ACCAUUUGCCUAGCCUGACdTdTSEQIDNO247)M-723/741有義UUCUUGAAAAUUUGCAGGCdTdTSEQIDNO248)M-723/741反義GCCUGCAAAUUUUCAAGAAdTdTSEQIDNO249)M-808/826有義UCAUUGGGAUCUUGCACUUdTdTSEQIDNO250)M-808/826反義AAGUGCAAGAUCCCAAUGAdTdTSEQIDNO251)M-832/850有義UGUGGAUUCUUGAUCGUCUdTdTSEQIDNO252)M-832/850反義AGACGAUCAAGAAUCCACAdTdTSEQIDNO253)M-986/1004有義UGUCAGCAUAGAGCUGGAGdTdTSEQIDNO254)M-986/1004反義CUCCAGCUCUAUGCUGACAdTdTSEQIDNO255)M-44-52/741-750有義GTCGAAACGCCTATCAGAAdTdTSEQIDNO256)M-44-52/741-750反義UUCUGAUAGGCGUUUCGACdTdTSEQIDNO257)片段8NSNS-5/23有義AAAAGCAGGGUGACAAAGAdTdTSEQIDNO258)NS-5/23反義UCUUUGUCACCCUGCUUUUdTdTSEQIDNO259)NS-9/27有義GCAGGGUGACAAAGACAUAdTdTSEQIDNO260)NS-9/27反義UAUGUCUUUGUCACCCUGCdTdTSEQIDNO261)NS-543/561有義GGAUGUCAAAAAUGCAGUUdTdTSEQIDNO262)NS-543/561反義AACUGCAUUUUUGACAUCCdTdTSEQIDNO263)NS-623/641有義AGAGAUUCGCUUGGAGAAGdTdTSEQIDNO264)NS-623/641反義CUUCUCCAAGCGAAUCUCUdTdTSEQIDNO265)NS-642/660有義CAGUAAUGAGAAUGGGAGAdTdTSEQIDNO266)NS-642/660反義UCUCCCAUUCUCAUUACUGdTdTSEQIDNO267)NS-831/849有義UUGUGGAUUCUUGAUCGUCdTdTSEQIDNO268)NS-831/839反義GACGAUCAAGAAUCCACAAdTdTSEQIDNO269)實例2靶向病毒RNA聚合酶或核蛋白的siRNA抑制流感A病毒產生材料和方法細胞培養.使Madin-Darby犬腎細胞(MDCK)(來自NY，NewYork，MountSinaiSchoolofMedicine，Dr.PeterPalese的捐贈品)，在含有10％熱滅活FCS、2mML-穀氨醯胺、100單位/ml青黴素(penicillin)和100μg/ml鏈黴素(streptomycin)的DMEM培養基中生長。細胞是在37℃，5％CO2下生長。對電穿孔來說，將細胞保持在不含血清的RPMI1640培養基中。病毒感染是在感染培養基(DMEM、0.3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO)、10mMHepes、100單位/ml青黴素和100ug/ml鏈黴素)中進行。病毒.在37℃下，使流感病毒A/PR/8/34(PR8)和A/WSN/33(WSN)，亞型H1N1，(來自MountSinaiSchoolofMedicine，Dr.PeterPalese的捐贈品)，在10日齡含胚雞卵(CharlesRiverlaboratories，MA)中生長48h。病毒接種48h後收集尿囊液並在-80℃下存儲。在本文所述的實例中全部使用相同病毒株和方法。siRNA.如上文所述來設計siRNA。除符合實例1中所述的選擇標準外，通常根據技術通報#003-RevisionB，″siRNAOligonucleotidesforRNAiApplications″(DharmaconResearch，Inc.，Lafayette，CO80026)所述中的原則來設計siRNA。來自Dharmacon的技術通報#003和#004含有與siRNA設計參數、合成等有關的各種信息，並且以引用的方式併入本文。表2中列出了所測試的有義和反義序列。表2.siRNA序列名稱SiRNA序列(5′-3′)PB2-2210/2230(有義)GGAGACGUGGUGUUGGUAAdTdT(SEQIDNO69)PB2-2210/2230(反義)UUACCAACACCACGUCUCCdTdT(SEQIDNO70)PB2-2240/2260(有義)CGGGACUCUAGCAUACUUAdTdT(SEQIDNO71)PB2-2240/2260(反義)UAAGUAUGCUAGAGUCCCGdTdT(SEQIDNO72)PB1-6/26(有義)GCAGGCAAACCAUUUGAAUdTdT(SEQIDNO73)PB1-6/26(反義)AUUCAAAUGGUUUGCCUGCdTdT(SEQIDNO74)PB1-129/149(有義)CAGGAUACACCAUGGAUACdTdT(SEQIDNO75)PB1-129/149(反義)GUAUCCAUGGUGUAUCCUGdTdT(SEQIDNO76)PB1-2257/2277(有義)GAUCUGUUCCACCAUUGAAdTdT(SEQIDNO77)PB1-2257/2277(反義)UUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT(SEQIDNO78)PA-44/64(有義)UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT(SEQIDNO79)PA-44/64(反義)CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT(SEQIDNO80)PA-739/759(有義)CGGCUACAUUGAGGGCAAGdTdT(SEQIDNO81)PA-739/759(反義)CUUGCCCUCAAUGUAGCCGdTdT(SEQIDNO82)PA-2087/2107(G)(有義)GCAAUUGAGGAGUGCCUGAdTdT(SEQIDNO83)PA-2087/2107(G)(反義)UCAGGCACUCCUCAAUUGCdTdT(SEQIDNO84)PA-2110/2130(有義)UGAUCCCUGGGUUUUGCUUdTdT(SEQIDNO85)PA-2110/2130(反義)AAGCAAAACCCAGGGAUCAdTdT(SEQIDNO86)PA-2131/2151(有義)UGCUUCUUGGUUCAACUCCdTdT(SEQIDNO87)PA-2131/2151(反義)GGAGUUGAACCAAGAAGCAdTdT(SEQIDNO88)NP-231/251(有義)UAGAGAGAAUGGUGCUCUCdTdT(SEQIDNO89)NP-231/251(反義)GAGAGCACCAUUCUCUCUAdTdT(SEQIDNO90)NP-390/410(有義)UAAGGCGAAUCUGGCGCCAdTdT(SEQIDNO91)NP-390/410(反義)UGGCGCCAGAUUCGCCUUAdTdT(SEQIDNO92)NP-1496/1516(有義)GGAUCUUAUUUCUUCGGAGdTdT(SEQIDNO93)NP-1496/1516(反義)CUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT(SEQIDNO94)NP-1496/1516a(有義)GGAUCUUAUUUCUUCGGAGAdTdT(SEQIDNO188)NP-1496/1516a(反義)UCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT(SEQIDNO189)M-37/57(有義)CCGAGGUCGAAACGUACGUdTdT(SEQIDNO95)M-37/57(反義)ACGUACGUUUCGACCUCGGdTdT(SEQIDNO96)M-480/500(有義)CAGAUUGCUGACUCCCAGCdTdT(SEQIDNO97)M-480/500(反義)GCUGGGAGUCAGCAAUCUGdTdT(SEQIDNO98)M-598/618(有義)UGGCUGGAUCGAGUGAGCAdTdT(SEQIDNO99)M-598/618(反義)UGCUCACUCGAUCCAGCCAdTdT(SEQIDNO100)M-934/954(有義)GAAUAUCGAAAGGAACAGCdTdT(SEQIDNO101)M-934/954(反義)GCUGUUCCUUUCGAUAUUCdTdT(SEQIDNO102)NS-128/148(有義)CGGCUUCGCCGAGAUCAGAdAdT(SEQIDNO103)NS-128/148(反義)UCUGAUCUCGGCGAAGCCGdAdT(SEQIDNO104NS-562/582(R)(有義)GUCCUCCGAUGAGGACUCCdTdT(SEQIDNO105)NS-562/582(R)(反義)GGAGUCCUCAUCGGAGGACdTdT(SEQEDNO106)NS-589/609(有義)UGAUAACACAGUUCGAGUCdTdT(SEQIDNO107)NS-589/609(反義)GACUCGAACUGUGUUAUCAdTdT(SEQIDNO108)所有siRNA是由DharmaconResearch(Lafayette，CO)使用2′ACE保護化學來合成。根據製造商的說明書將siRNA鏈去保護，以等摩爾比率混合併且通過加熱到95℃來退火，並且每30s緩慢降低溫度1℃直到35℃和每分鐘緩慢降低1℃直到5℃。siRNA電穿孔.將MDCK細胞的對數期培養物胰蛋白酶化，洗滌並且以每毫升2×107個細胞重新懸浮於不含血清的RPMI1640中。將0.5ml的細胞放入0.4cm比色皿中，並且使用400V，975μF的電穿孔儀(GenePulser)(Bio-Rad)，用2.5nmolsiRNA進行電穿孔。電穿孔效率是活細胞的大約30-40％。將經過電穿孔的細胞分到含有10％FCS的DMEM培養基中的6孔板的3個孔中，並且在37℃，5％CO2下培養。病毒感染.電穿孔後6到8h，衝洗掉含血清的培養基並且在適當感染複數下，將100μl的PR8或WSN病毒接種到孔中，各個孔含有大約106個細胞。用1,000PFU(每1,000個細胞一個病毒；MOI＝0.001)或10,000PFU(每100個細胞一個病毒；MOI＝0.01)的病毒來感染細胞。在室溫下培養1h後，將具有4μg/ml胰蛋白酶的2ml感染培養基添加到各個孔中，並且在37℃，5％CO2下培養細胞。在指定時間，從受感染的培養物收集上清液並且通過雞紅血球(50μl，0.5％，CharlesRiverlaboratories，MA)的血球凝集作用測定病毒的滴度。病毒滴度的測量.在感染24、36、48和60小時後收集上清液。使用如KnipeDM，Howley，PM，FundamentalVirology，第4版，第34-35頁中所述的標準血球凝集素分析來測量病毒滴度。在V形底96孔板中進行血球凝集作用分析。將各個樣品的連續2倍稀釋液在冰上，用等體積的0.5％的雞紅血球懸浮液(CharlesRiverLaboratories)來培養。含有紅血球的貼壁、均質層的孔記分為正。對空斑分析來說，如FundamentalVirology，第4版，第32頁中所述，如所屬領域中所熟知的，測量各個樣品的連續10倍稀釋液的病毒滴度。結果為研究使用siRNA抑制流感病毒複製的可行性，靶向各種流感病毒ARNA。具體地說，利用MDCK細胞系，該細胞系易受感染並且被廣泛用於研究流感病毒。通過電穿孔將各個siRNA個別地引入MDCK細胞群體中。靶向GFP(有義5′-GGCUACGUCCAGGAGCGCAUU-3′(SEQIDNO110)；反義5′-UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3′(SEQIDNO111))的siRNA用作對照物。所述siRNA稱為GFP-949。在後續實驗中(描述於下文實例中)，兩個鏈的3′端處的UU突出端用dTdT替換，對結果沒有影響。也執行對照電穿孔作為對照。電穿孔8小時後，在0.1或0.01的MOI下，用流感A病毒PR8或WSN感染細胞，並且在其後的各時間點(24、36、48、60小時)，使用標準血球凝集作用分析來分析細胞的病毒產生。通過流式細胞術，使用標準方法來分析GFP表達。圖11A和11B比較了實驗的結果，其中個別siRNA抑制流感病毒A菌株A/波多黎各/8/34(H1N1)的複製的能力(圖11A)或抑制流感病毒A菌株A/WSN/33(H1N1)的複製的能力(圖11B)是通過測量HA滴度來測定。因此，高HA滴度表明缺乏抑制，而低HA滴度表明有效抑制。在0.01的MOI下感染MDCK細胞。對所述實驗來說，測試靶向PB1片段(PB1-2257/2277)的一種siRNA、靶向PB2片段(PB2-2240/2260)的一種siRNA、靶向PA片段(PA-2087/2107(G))的一種siRNA和靶向NP基因組和轉錄本(NP-231/251、NP-390/410和NP-1496/1516)的三種不同的siRNA。注意，圖11A和11B中的圖例僅列出了siRNA的5′核苷酸。圖11A和11B中的符號說明如下實心方形表示未接受siRNA的對照細胞。空心方形表示接受GFP對照siRNA的細胞。實心圓表示接受siRNAPB1-2257/2277的細胞。空心圓表示接受siRNAPB2-2240/2260的細胞。空心三角形表示接受siRNAPA-2087/2107(G)的細胞。符號X表示接受siRNANP-231/251的細胞。符號+表示接受siRNANP-390/410的細胞。實心三角形表示接受siRNANP-1496/1516的細胞。注意，在圖表中，某些符號有時重疊。舉例而言，在圖11B中，空心和實心三角形重疊。為加以說明，可參考表3和4，列出了各個點的數值。如圖11A和11B(表3和4)中所示，在不存在siRNA(空白對照TF)或存在對照(GFP)siRNA時，病毒滴度隨時間增加，在感染大約48-60小時後到達峰值。相比之下，在存在任何一種siRNA時，在60小時，病毒滴度顯著較低。舉例而言，在菌株WSN中，與對照物中的相比，在siRNAPB2-2240或NP-231存在下的HA滴度(反映病毒含量)是大約一半大。特別是，在兩種菌株中，在siRNANP-1496存在下，病毒含量是在檢出限(10,000PFU/ml)以下。這表示在PR8菌株中降低超過60倍的因數並且在WSN菌株中降低超過120倍的因數。在菌株WSN中，在siRNAPA-2087(G)存在下，病毒含量也是在檢出限(10,000PFU/ml)以下，並且在菌株PR8中是極低的。甚至從所測量的最早時間點來看，siRNA對病毒產生的抑制是明顯的。在感染後長達72小時的時間點，已經觀察到有效抑制，包括將病毒產生抑制到不可檢測的水平(如通過HA滴度所測定的)。表5概括了在MDCK細胞中，在60小時時的siRNA抑制分析的結果，以抑制倍數來表示。因此，低值表明缺少抑制，而高值表明有效抑制。siRNA在病毒基因中的位置是由基因名稱後的編號來表示。與本文中其它地方一樣，編號表示在基因中siRNA的起始核苷酸。舉例而言，NP-1496表示對NP呈特異性的siRNA，第一核苷酸起始於NP序列的核苷酸1496處。所顯示的數值(抑制倍數)是用來自對照轉染的血球凝集素單位除以來自用指定siRNA轉染的血球凝集素單位來計算的；數值1表示沒有抑制。在MDCK細胞系系統中測試總共20種siRNA，這些siRNA靶向流感病毒基因組的6個片段(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)(表5)。不管使用PR8還是WSN病毒，約15％的所測試的siRNA(PB1-2257、PA-2087G和NP-1496)顯示強大作用，在大多數情況下，在MOI＝0.001下抑制病毒產生超過100倍並且在MOI＝0.01下抑制病毒產生16到64倍。特別是，當使用siRNANP-1496或PA-2087時，抑制是十分顯著的，以致培養物上清液中沒有可檢出的血球凝集素活性。所述有效的siRNA靶向3種不同的病毒基因片段PB1和PA，這兩者包含於RNA轉錄酶複合物中；和NP，是單鏈RNA結合核蛋白。與在其他系統中的發現一致，由所述siRNA靶向的序列全部相對定位於編碼區的3』端附近(圖13)。大約40％的siRNA顯著抑制病毒產生，但是抑制程度視某些參數而變化。不管使用PR8還是WSN病毒，大約15％的siRNA有效抑制病毒產生。然而，在某些siRNA的情況下，抑制程度稍微視使用PR8還是WSN而變化。諸如PB2-2240、PB1-129、NP-231和M-37等一些siRNA，僅在早期時間點(感染後24到36小時)或僅在低劑量感染(MOI＝0.001)下顯著地抑制病毒產生。所述siRNA靶向不同的病毒基因片段，並且對應的序列定位於編碼區的3』端或5』端附近(圖13)。表5A和5B呈現分析結果。大約45％的siRNA對病毒滴度不具有可辨識的作用，表明它們在幹擾MDCK細胞中的流感病毒產生中不是有效的。特別是，4種靶向NS基因片段的siRNA沒有一種顯示任何抑制作用。為更精確地估算病毒滴度，從得自經歷對照轉染或用NP-1496轉染的受病毒感染細胞的培養物上清液，(在60小時時)執行用培養物上清液的空斑分析。在對照上清液中檢測到大約6×105pfu/ml，而在未稀釋的NP-1496上清液中未檢測到空斑(圖11C)。因為空斑分析的檢出限是約20pfu(空斑形成單位)/ml，所以NP-1496對病毒產生的抑制是至少約30,000倍。甚至在0.1的MOI下，NP-1496抑制病毒產生約200倍。為測定siRNA的功效，將分級量的NP-1496轉染到MDCK細胞中，接著用PR8病毒感染。通過血球凝集素分析來測量培養物上清液中的病毒滴度。如圖11D中所示，隨著siRNA量的降低，培養物上清液中的病毒滴度增加。然而，甚至當使用少至25pmol的siRNA進行轉染時，與對照轉染比較，檢測到大約4倍的病毒產生抑制，表明NP-1496siRNA在抑制流感病毒產生中的功效。對療法來說，需要siRNA能夠有效抑制現行病毒感染。在典型流感病毒感染中，在感染約4小時後開始釋放新的病毒粒子。為測定siRNA是否能夠面對現行感染降低或消除新釋放病毒的感染，用PR8病毒將MDCK細胞感染2小時並接著用NP-1496siRNA進行轉染。如圖11E中所示，病毒滴度在對照轉染後隨時間穩定增加，而在經NP-1496轉染的細胞中，病毒滴度僅輕微地增加。因此，病毒感染後siRNA的投與是有效的。綜合來說，所述結果顯示(i)某些siRNA可有效抑制流感病毒產生；(ii)流感病毒產生可通過對不同病毒基因(包括編碼NP、PA和PB1蛋白質的基因)具有特異性的siRNA來抑制；和，(iii)除了在siRNA投與的同時或在siRNA投與之後被感染的細胞外，在siRNA投與之前被感染的細胞中也發生siRNA抑制。表3.siRNA對病毒株A/波多黎各/8/34(H1N1)產生的抑制表4.siRNA對病毒株A/WSN/33(H1N1)產生的抑制表5A.20種siRNA對MDCK細胞中流感病毒產生的作用表5B.siRNA對MDCK細胞中流感病毒產生的作用103pfu/孔(MOI0.001)104pfu/孔(MOI0.01)孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例124HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT25432NT6764128NP14960011NP149635832M315232M35732128M1501328M1506764128M1720214M1726764128PB240318PB245732128PB26815232PB2686764128PB211525432PB21156764128孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例224HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT14216NT7＞8128＞256NP14960112NP14960112NS50318NS56＞864＞256NS914216NS96＞864＞256M21114216M2117＞8128＞256M2320214M2325＞832＞256PB21670214PB21675732128PB247314216PB24737＞8128＞256孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例324HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT15232NT4716128NP14960112NP14960318NS54315232NS54326464NS62315232NS6234716128M72315232M723274128孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例424HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT36864NT＞89＞256512NP14960112NP149614216NP150104116NP15016864256NS64235832NS64289256512NS83135832NS83189256512PB136864PB11618791285121618PB21235832PB21279128512M23225432M2326864256孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例524HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT14216NT5732128NP14960112NP14960112NP1414216NP145732128NP14880112NP14880318PB20214PB222834516322283PA218814216PA2188461664孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例624HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT24416NT78128256NP14960011NP14961122PB295624416PB295678128256M1324416M1378128256M2551224M255563264M6451224M645563264M8081328M8086764128M8321122M832563264M9862348M98677128128NP14880011NP148814216孔數HA單位孔數HA單位4824484824實例724HRHRHR24HRHRHR48HRHRNT25432NT6864256NP1496001NP14962348NP15010416NP1501461664PB24024PB24563264PB2038PB222834616642283M17225432M1725732128M255024M255461664M645038M645461664M832012M832461664實例3靶向病毒RNA聚合酶或核蛋白的siRNA抑制雞胚中的流感A病毒產生。材料和方法SiRNA-oligofectamine複合物形成和雞胚接種.如上文所述製備siRNA。將雞卵維持在標準條件下。將30μl的Oligofectamine(產品編號12252011，來自LifeTechnologies，nowInvitrogen)與30μl的Opti-MEMI(Gibco)混合併且在RT下培養5min。將2.5nmol(10μl)的siRNA與30μl的Opti-MEMI混合併且添加到經稀釋的oligofectamine中。在RT下將siRNA和oligofectamine培養30min。用siRNA-oligofectamine複合物連同100μl的PR8病毒(5000pfu/ml)接種10日齡雞卵。在37℃下將卵培養指定時間並收集尿囊液。如上文所述通過HA分析測試尿囊液中的病毒滴度。結果為確認在MDCK細胞中的結果，也分析siRNA抑制受精雞卵中流感病毒產生的能力。因為不能在卵上使用電穿孔，所以使用Oligofectamine(已經證實促進DNA寡核苷酸的細胞內吸收的基於脂質的藥劑)以及活體外siRNA(25)。簡而言之，將PR8病毒單獨(500pfu)或病毒外加siRNA-oligofectamine複合物如圖14A中示意性顯示注射到10日齡雞卵的尿囊腔中。17小時後收集尿囊液以用於通過血球凝集素分析測量病毒滴度。如圖14B中所示，當單獨注射病毒時(在Oligofectamine存在下)，易檢測到高病毒滴度。GFP-949的共同注射不顯著影響病毒滴度。(當省略Oligofectamine時，觀察不到病毒滴度的顯著降低。)對流感病毒具有特異性的siRNA的注射顯示與在MDCK細胞中所觀察到的結果相一致的結果抑制MDCK細胞中的流感病毒產生的相同siRNA(NP-1496、PA2087和PB1-2257)也抑制雞卵中的病毒產生，而在MDCK細胞中不太有效的siRNA(NP-231、M-37和PB1-129)在受精雞卵中是無效的。因此，siRNA在幹擾受精雞卵中的流感病毒產生中也是有效的。實例4在mRNA水平下siRNA抑制流感病毒產生材料和方法如上文所述執行SiRNA製備。RNA提取、逆轉錄和實時PCR.1×107個MDCK細胞用2.5nmol的NP-1496來電穿孔或對照電穿孔(無siRNA)。8小時後，在MOI＝0.1下，將流感APR8病毒接種到細胞中。在感染後1、2和3小時時間點，除去上清液，並且用Trizol試劑(Gibco)溶解細胞。根據製造商的說明書純化RNA。根據製造商的說明書，在37℃下，使用呈20μl反應混合物中的200ng總RNA、特異性引物(參見下文)和Omniscript逆轉錄酶試劑盒(Qiagen)，執行逆轉錄(RT)1小時。對mRNA、NPvRNA、NPcRNA、NSvRNA或NScRNA具有特異性的引物如下mRNA，dT18＝5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′(SEQIDNO112)NPvRNA，NP-3675′-CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3′(SEQIDNO113)。NPcRNA，NP-1565R5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT-3′(SEQIDNO114)。NSvRNA，NS-5275′-CAGGACATACTGATGAGGATG-3′(SEQIDNO115)。NScRNA，NS-890R5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′(SEQIDNO116)。將1μl的RT反應混合物(即，通過執行逆轉錄獲得的樣品)和序列特異性引物用於實時PCR，所述PCR使用包括SYBRGreenI雙鏈DNA結合染料的SYBRGreenPCRmastermix(ABAppliedBiosystems)。在ABIPRISM7000序列檢測系統(ABappliedBiosystem)中進行PCR循環並且用ABIPRISM7000SDS軟體(ABAppliedBiosystems)來分析。在50℃下，2min，95℃下，10min，然後在95℃下，15sec和60℃下，1min將PCR反應進行50次循環。以0.2個螢光單位的讀數來分析循環時間。將所有反應重複進行。捨棄在重複之間變化超過1.0的循環時間。然後將重複循環時間取平均值並且從其中減去β-肌動蛋白的循環時間，得到標準值。PCR引物如下。對NPRNA來說NP-3675′-CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3′(SEQIDNO117)。NP-460R5′-AGATCATCATGTGAGTCAGAC-3′(SEQIDNO118)。對NSRNA來說NS-5275′-CAGGACATACTGATGAGGATG-3′(SEQIDNO119)。NS-617R5′-GTTTCAGAGACTCGAACTGTG-3′(SEQIDNO120)。結果如上文所述，在流感病毒複製期間，將vRNA轉錄以產生用作另外的vRNA合成的模板的cRNA和用作蛋白質合成的模板的mRNA(1)。儘管已知RNAi以序列特異方式靶向mRNA的降解(16-18)，但是vRNA和cRNA也有可能是siRNA的標靶，因為流感A病毒的vRNA對核酸酶是敏感的(1)。為研究siRNA對各種RNA物種的降解的作用，使用序列特異性引物進行逆轉錄，接著執行實時PCR，以便定量vRNA、cRNA和mRNA的含量。圖16顯示流感病毒vRNA、mRNA與cRNA之間的關係。如圖16A和16B中所示，cRNA是vRNA的確切互補體，但是mRNA在5′端處含有帽結構外加得自宿主細胞mRNA的另外的10到13個核苷酸，並且mRNA在3′端處含有polyA序列，該polyA序列開始於與從vRNA片段的5′端下遊的15-22個核苷酸位點互補的位點。因此，與vRNA和cRNA比較，mRNA在3′端缺少15到22個核苷酸。為區分3種病毒RNA物種，將對vRNA、cRNA和mRNA具有特異性的引物用於首次逆轉錄反應(圖16B)。對mRNA來說，聚dT18用作引物。對cRNA來說，使用與mRNA中缺少的RNA的3′端互補的引物。對vRNA來說，引物可在沿RNA的幾乎任何地方，只要與vRNA互補並且不太接近5′端即可。通過實時PCR來擴增僅從RNA之一轉錄得到的cDNA。流感病毒感染後，通過約4小時，新病毒粒子開始被組裝和釋放。為測定siRNA對第一輪的mRNA和cRNA轉錄的作用，感染後及早分離RNA。簡而言之，將NP-1496電穿孔到MDCK細胞中。也執行對照電穿孔(無siRNA)。6到8小時後，在MOI＝0.1下，用PR8感染細胞。然後在感染後1、2和3小時將細胞溶解並且將RNA分離。通過使用各種RNA物種的引物進行逆轉錄，接著執行實時PCR，來分析mRNA、vRNA和cRNA的含量。圖17顯示在感染之前大約6-8小時經對照轉染或經siRNANP-1496轉染的細胞中，在用病毒感染後的各時間點，病毒NP和NSRNA物種的量。如圖17中所示，感染1小時後，在經或未經NPsiRNA轉染的樣品之間，NPmRNA量不存在顯著差異。在感染後早至2小時，在對照轉染組中，NPmRNA增加38倍，而在經siRNA轉染的細胞中，NPmRNA的含量不增加(或甚至稍微降低)。感染後3小時，在對照轉染中，mRNA轉錄本含量繼續增加，而在接受siRNA處理的細胞中，觀察到NPmRNA量的連續降低。除了僅在感染後3小時，對照轉染中vRNA和cRNA的量增加顯著以外，NPvRNA和cRNA顯示類似圖案。雖然不希望受任何理論束縛，但是其這可能是歸因於流感病毒的生命周期，其中首輪mRNA轉錄發生在cRNA和進一步的vRNA合成之前。所述結果表明，與通過血球凝集素分析或空斑分析測量完整、活病毒的結果一致，所有NPRNA物種的量也通過用NPsiRNA處理而顯著降低。儘管已知siRNA主要介導mRNA的降解，儘管下文所述的結果暗示，由NPmRNA含量降低所致的NP蛋白質含量的降低引起NPcRNA和/或vRNA的穩定性降低，但是來自所述實驗的數據不排除siRNA介導NPcRNA和vRNA的降解的可能性。實例5識別RNA幹擾的標靶材料和方法如上文所述執行未修飾siRNA的siRNA製備。也通過Dharmacon合成經修飾RNA寡核苷酸，其中在有義鏈或反義鏈或兩條鏈的每個核苷酸殘基處，用2′-O-甲基取代2′-羥基。將經修飾寡核苷酸去保護並且如對未修飾寡核苷酸所述退火成互補鏈。通過凝膠電泳法分析siRNA雙鏈體的雙鏈體形成的完成。細胞培養、用siRNA轉染和用病毒感染.基本上如上文所述執行這些程序。簡而言之，對涉及經修飾NP-1496siRNA的實驗來說，先用從野生型(wt)和經修飾(m)鏈形成的NP-1496siRNA(2.5nmol)轉染MDCK細胞，並且8小時後，在0.1的MOI下，用PR8病毒感染。感染24小時後分析培養物上清液中的病毒滴度。對涉及M-37siRNA的實驗來說，用M-37siRNA(2.5nmol)轉染MDCK細胞，在0.01的MOI下，用PR8病毒感染，並且在感染1、2和3小時後進行收集以用於RNA分離。關於M-37有義和反義序列，參見表2。RNA提取、逆轉錄和實時PCR基本上如上文所述來執行。對mRNA、M特異性vRNA和M特異性cRNA具有特異性的用於逆轉錄的引物如下mRNA，dT18＝5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′(SEQIDNO112)MvRNA5′-CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG-3′(SEQIDNO161)McRNA5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3′(SEQIDNO162)。MRNA的PCR引物如下M正向5′-CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG-3′(SEQIDNO163)M反向5′-TAACTAGCCTGACTAGCAACCTC-3′(SEQIDNO164)結果為研究siRNA除幹擾mRNA以外還可能干擾vRNA和/或cRNA的可能性，合成有義(S或+)或反義(AS或-)鏈經過修飾的NP-1496siRNA。在每個核苷酸殘基中用2′-O-甲基取代2′-羥基的修飾不影響用於雙鏈體形成的鹼基配對，但是經修飾的RNA鏈不再支持RNA幹擾。換句話說，有義鏈經過修飾但是反義鏈是野生型(mS:wtAS)的siRNA，將支持具有與反義鏈互補的序列而不是與有義鏈互補的序列的RNA的降解。相反地，有義鏈是野生型但是反義鏈經過修飾(wtS:mAS)的siRNA，將支持具有與有義鏈互補的序列的RNA的降解，而將不支持具有與有義鏈互補的序列的RNA的降解。將MDCK細胞對照轉染，或用有義鏈(mS:wtAS)或反義鏈(wtS:mAS)經過修飾而另一條鏈是野生型的NP-1496siRNA進行轉染。也用兩條鏈都經過修飾(mS:mAS)的NP-1496siRNA來轉染細胞。然後用PR8病毒感染細胞，並且測量上清液中的病毒滴度。如圖18A中所述，在經受對照轉染的培養物中檢測到高病毒滴度。正如所料，在用野生型siRNA(wtS:wtAS)轉染的培養物中檢測到極低的病毒滴度，但是在用兩條鏈都經過修飾(mS:mAS)的siRNA轉染的培養物中檢測到高病毒滴度。在用反義鏈經過修飾(wtAS:mAS)的siRNA轉染的培養物中，病毒滴度是高的，而在用僅有義鏈經過修飾(mS:wtAS)的siRNA轉染的培養物中，病毒滴度是低的。雖然不希望受任何理論束縛，但是本發明者認為，對抑制流感病毒產生的siRNA雙鏈體的野生型反義(-)鏈的需求暗示，RNA幹擾的標靶是mRNA(+)或cRNA(+)或兩者。為進一步區別所述可能性，研究siRNA對對應mRNA、vRNA和cRNA的積聚的作用。為跟蹤一組經同時感染的細胞的轉錄，在感染1、2和3小時後(在新病毒粒子的釋放和再感染之前)收集經siRNA轉染的MDCK細胞以用於RNA分離。首先通過使用特異性引物進行逆轉錄而將病毒mRNA、vRNA和cRNA單獨轉變成cDNA。然後，通過實時PCR定量各種cDNA的含量。如圖18B中所示，當使用M特異性siRNAM-37時，在感染1或2小時後檢測到少量M特異性mRNA。感染3小時後，在不存在M-37時，易檢測到M特異性mRNA。在經M-37轉染的細胞中，M特異性mRNA的含量降低大約50％。相比之下，M特異性vRNA和cRNA的含量不因M-37的存在而受到抑制。雖然不希望受任何理論束縛，但是所述結果表明病毒mRNA可能是siRNA所介導的幹擾的標靶。實例6某些siRNA對病毒RNA積聚的作用材料和方法SiRNA製備如上文所述來執行。RNA提取、逆轉錄和實時PCR如實例3中所述來執行。對mRNA、NPvRNA、NPcRNA、NSvRNA、NScRNA、MvRNA或McRNA具有特異性的引物如實例4和5中所述。對PB1vRNA、PB1cRNA、PB2vRNA、PB2cRNA、PAvRNA或PAcRNA具有特異性的用於逆轉錄的引物如下PB1vRNA5′-GTGCAGAAATCAGCCCGAATGGTTC-3′(SEQIDNO165)PB1cRNA5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3′(SEQIDNO166)PB2vRNA5′-GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3′(SEQIDNO167)PB2cRNA5′-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3′(SEQIDNO168)PAvRNA5′-GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3′(SEQIDNO169)PAcRNA5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT-3′(SEQIDNO170)PB1、PB2和PARNA的PCR引物如下PB1正向5′-CGGATTGATGCACGGATTGATTTC-3′(SEQIDNO171)PB1反向5′-GACGTCTGAGCTCTTCAATGGTGGAAC-3′(SEQIDNO172)PB2正向5′-GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3′(SEQIDNO173)PB2反向5′-AATCGCTGTCTGGCTGTCAGTAAG-3′(SEQIDNO174)PA正向5′-GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3′(SEQIDNO175)PA反向5′-CCGAGAAGCATTAAGCAAAACCCAG-3′(SEQIDNO176)結果為測定NP-1496是否特異地靶向NP基因片段的降解或NP以外的病毒RNA的含量是否也受影響，將對NS具有特異性的引物用於RT和實時PCR，如上文所述(實例4)測量不同NSRNA物種(mRNA、vRNA、cRNA)的量。如圖19中所示，NSmRNA、vRNA和cRNA的改變顯示與對NPRNA所觀察到的相同的圖案。在感染後3小時，在經對照轉染的細胞中，可見到所有NSRNA物種的顯著增加，而在接受NP-1496siRNA的細胞中，未見到NSRNA含量的顯著改變。此結果表明，至少相對於NPRNA來說，不同病毒RNA的轉錄和複製被共調。共調的意思是，一種轉錄本的含量直接或間接地影響另一種轉錄本的含量。未隱含特殊機制。當NP轉錄本通過siRNA處理而降解時，其他病毒RNA的含量也降低。為進一步探究NPsiRNA對其他病毒RNA的作用，在已經用NP-1496處理過的細胞中測量所有病毒基因的mRNA、vRNA和cRNA的積聚。如圖19A中所示(上方圖)，在感染1或2小時後，NP特異性mRNA是低的。感染3小時後，在不存在NP-1496時，易檢測到NPmRNA，而在NP-1496存在下，NPmRNA的含量保持在背景含量，表明siRNA抑制特異性mRNA的積聚。如圖19A中所示(中間和下方圖)，NP特異性和NS特異性vRNA和cRNA的含量因NP-1496的存在而被大大地抑制。所述結果確認了實例4中所述的結果。另外，在經NP-1496處理的細胞中，M、NS、PB1、PB2和PA基因的mRNA、vRNA和cRNA的積聚也被抑制(圖19B、19C和19H)。此外，對PA-2087來說，也觀察到廣泛抑制作用。在圖19E、19F和19G左邊的上方圖、中間圖和下方圖中顯示與圖19A、19B和19C中所呈現的相同的結果，表明了NP-1496siRNA抑制病毒mRNA轉錄和病毒vRNA和cRNA複製。在圖19E、19F和19G右邊的上方圖、中間圖和下方圖中呈現在相同濃度下，用PA-2087siRNA執行的相同實驗的結果。如圖19E，分別在右上方圖、中間圖和下方圖中所示，在感染3小時後，在不存在PA-2087時，易檢測到PA、M和NSmRNA，而PA-2087的存在抑制PA、M和NSmRNA的轉錄。如圖19F，分別在右上方圖、中間圖和下方圖中所示，感染3小時後，在不存在PA-2087時，易檢測到PA、M和NSvRNA，而PA-2087的存在抑制PA、M和NSvRNA的積聚。如圖19G，分別在右上方圖、中間圖和下方圖中所示，感染後3小時，在不存在PA-2087時，易檢測到PA、M和NScRNA，而PA-2087的存在抑制PA、M和NScRNA的積聚。另外，圖19H顯示NP特異性siRNA抑制PB1(上方圖)、PB2(中間圖)和PA(下方圖)特異性mRNA的積聚。雖然不希望受任何理論束縛，但是本發明者認為，NPsiRNA的廣泛作用可能是NP在結合和穩定vRNA和cRNA中的重要性的結果，而不是因為NP特異性siRNA非特異地靶向RNA降解。流感病毒中的NP基因片段編碼單鏈RNA結合核蛋白，可結合vRNA和cRNA(參見圖15)。在病毒生命周期期間，首先將NPmRNA轉錄和翻譯。NP蛋白質的主要功能是使病毒基因組殼體化以用於RNA轉錄、複製和組裝的目的。在不存在NP蛋白質時，vRNA和cRNA的全長合成被極大地削弱。當NPsiRNA誘導NPRNA的降解時，NP蛋白質合成被削弱並且所得的足夠NP蛋白質的缺乏隨後影響其他病毒基因片段的複製。以此方式，NPsiRNA可能在極早階段有效地抑制病毒產生。假設NP蛋白質分子在受感染細胞中的數量以調控mRNA合成相對基因組RNA(vRNA和cRNA)複製的水平(1)。使用NP蛋白質的溫度敏感突變，先前的研究已經證實，cRNA合成而不是mRNA合成在活體外和活體內是溫度敏感的(70、71)。已經證實NP蛋白質是初生cRNA和vRNA轉錄本的延長和抗終止所必需的(71、72)。上文呈現的結果表明，NP特異性siRNA抑制所有病毒RNA在受感染細胞中的積聚。雖然不希望受任何理論束縛，但是似乎可能的是，在NP特異性siRNA存在下，新轉錄的NPmRNA被降解，引起病毒感染後對NP蛋白質合成的抑制。沒有新合成的NP時，進一步的病毒轉錄和複製和由此帶來的新病毒粒子產生被抑制。同樣，在PA特異性存在下，新轉錄的PAmRNA被降解，引起對PA蛋白質合成的抑制。儘管每個流感病毒粒子存在30-60個RNA轉錄酶拷貝(1)，但是在無新合成的RNA轉錄酶時，進一步的病毒轉錄和複製可能被抑制。使用對PB1具有特異性的siRNA獲得類似的結果。相反，不需要基質(M)蛋白質直到病毒感染的晚期(1)。因此，M特異性siRNA抑制M特異性mRNA的積聚而不是vRNA、cRNA或其他病毒RNA的積聚。總之，所述發現證明，在流感病毒RNA轉錄和複製中，對新合成的核蛋白和聚合酶蛋白質的關鍵需求。NP特異性、PA特異性和PB1特異性siRNA幹擾mRNA積聚和其他病毒RNA轉錄的mRNA特異性和病毒特異性機制暗示，所述siRNA可能是流感病毒感染的尤其有效的抑制劑。實例7某些siRNA對流感病毒RNA積聚的廣泛抑制不是由於幹擾素反應或病毒誘導的RNA降解。材料和方法RNA含量測量.在標準條件下使用PCR測量RNA含量。以下PCR引物用於測量γ-肌動蛋白RNA。γ-肌動蛋白正向5′-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3′(SEQIDNO177)γ-肌動蛋白反向5′-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3′(SEQIDNO178)Vero細胞的培養和磷酸化PKR的測量是根據下文引用的參考文獻中所述的標準技術來執行。結果實例6中所述的病毒RNA積聚的廣泛抑制的一種可能的原因是在siRNA存在下，受感染細胞的幹擾素反應(23、65、66)。因此，在Vero細胞中重複上文的實驗，其中刪除整個IFN基因座，包括所有的α、β和ω基因(67、68)(Q.G.和J.C.未公開的數據)。正如在MDCK細胞中一樣，NP特異性、M特異性和NS特異性mRNA的積聚全部被NP-1496抑制(圖19D)。另外，使用PCR分析siRNA對包括β-肌動蛋白、γ-肌動蛋白和GAPDH在內的來自細胞基因的轉錄本的含量的作用。在不存在或存在siRNA時，未檢測到轉錄本含量的顯著差異(圖18C下方圖，顯示M-37siRNA對γ-肌動蛋白mRNA沒有作用，並且數據未顯示)，表明siRNA的抑制作用對病毒RNA是呈特異性的。所述結果暗示，某些siRNA對病毒RNA積聚的廣泛抑制不是細胞幹擾素反應的結果。流感病毒感染後，dsRNA的存在也激活靶向RNA而進行降解的細胞路徑(23)。為研究siRNA對此路徑激活的作用，分析該路徑最關鍵的組分磷酸化蛋白激酶R(PKR)的含量(23)。在不存在病毒感染時，用NP-1496轉染MDCK細胞，不影響經激活PKR的含量(數據未顯示)。用流感病毒感染引起磷酸化PKR含量增加，與先前的研究一致(65、66、69)。然而，在存在或不存在NP-1496時，增加是相同的(數據未顯示)。因此，病毒RNA積聚的廣泛抑制不是在siRNA存在下，由病毒誘導的降解增強的結果。實例8具有單獨或以組合形式抑制流感病毒產生的優越能力的siRNA的系統性識別進行高通量篩選(實例18)來識別具有抑制流感病毒產生的優越能力的siRNA。在細胞培養物中個別地測試siRNA，並且許多進一步在小鼠中測試。也測試某些組合併且證明相加效應。執行另外的組合的系統性測試來識別具有協同(即，大於相加的)效應的組合。進一步針對包括成年人類和禽類病原體在內的另外的流感病毒株，測試siRNA和包含相同反義鏈的其他RNAi誘導實體。實例9促進siRNA的細胞吸收的非病毒遞送劑的評估。測試各種非病毒遞送劑增強siRNA的細胞吸收的能力。後續實例提供，顯示在細胞培養物和動物中利用許多聚合物時的成果(例如，抑制流感病毒產生)的數據。使用類似方法測試另外的遞送劑。實例10在小鼠測試含有RNAi誘導劑的組合物如(58)所述製備包含靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導劑的乾燥粒子。在所述程序中，將水溶性賦形劑(即，乳糖、白蛋白等)和治療劑溶於蒸餾水中。將溶液進料到Niro噴霧器可攜式噴霧乾燥器(NiroAtomizerPortableSprayDryer)(Niro，Inc.，Colombus，MD)中，產生具有在3與15μm之間的平均幾何直徑和在0.04與0.6g/cm3之間的振實密度的乾粉。通過吸入或氣管內投與將乾粉投與小鼠的呼吸系統中。在麻醉小鼠上通過強制通風完成乾粉氣溶膠的吸入遞送。對氣管內投與來說，通過管子將含有治療劑的溶液注射到麻醉小鼠的肺中(54)。在其他實驗中，對遞送液體來說，通過噴霧器將液態氣溶膠產生到放置小鼠的密封塑料籠中(52)。可使用諸如可購自PermCentury(URLwww.penncentury.com)的吹入器(例如ModelIA-IC)進行乾粉向小動物的肺部遞送。實例11由DNA載體或慢病毒提供的模板所轉錄的siRNA對流感病毒感染的抑制作為上文所述方法的代替方法，如實例13和14中所述來探究DNA載體的用途，siRNA前體可由所述DNA載體轉錄並且加工成有效的siRNA。圖20A-20C顯示用於先前研究(27、59)的載體，所述研究的結果顯示於圖20D中，並且另外描述於第10/674,159號美國專利中。圖21A-21C顯示可用於測試包括多種不同siRNA的前體在內的髮夾式前體的功效的另外的構建體。實例12siRNA對小鼠中流感病毒產生的抑制本實例描述，顯示當在經流感病毒感染之前或之後投與時，靶向流感病毒NP或PA轉錄本的siRNA的投與抑制小鼠中流感病毒的產生的實驗。所述抑制是劑量依賴性的，並且當2種各自靶向從不同流感病毒基因所表達的轉錄本的siRNA被一起投與時，顯示相加效應。材料和方法SiRNA製備.所述製備如上文所述來執行。SiRNA遞送.在室溫下，在5％葡萄糖中，用寡核苷酸陽離子聚合物轉染試劑的jetPEITM，N/P比＝5(Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA；目錄號GDSP20130；N/P是指在jetPEI/siRNA混合物中每個核苷酸磷酸鹽的氮數)或用聚-L-賴氨酸(MW(vis)52,000；MW(LALLS)41,800，Sigma目錄號P2636)，將siRNA(30或60μg的GFP-949、NP-1496或PA-2087)培養20min。以靜脈內途徑將混合物注射到小鼠中，注射到眼眶後靜脈中，每隻小鼠200μl，每組4隻小鼠。將200μl5％的葡萄糖注射到對照(無處理)小鼠中。在siRNA注射或鼻內感染之前，用2.5％阿佛丁(Avertin)使小鼠麻醉。病毒感染.通過用移液管將含有病毒的緩衝液滴入小鼠的鼻中，用PR8病毒以鼻內方式感染B6小鼠(維持在標準實驗室條件下)，每隻小鼠30μl(12,000pfu)。病毒滴度測定.在感染後的各時間點犧牲小鼠，並收集肺。使肺均質化，並且將勻漿冷凍並解凍兩次來釋放病毒。通過MDCK細胞感染測量存在於受感染肺中PR8病毒的滴度。以每孔3×104個MDCK細胞接種平底96孔板，並且24小時後，除去含有血清的培養基。將未稀釋或從1×10-1稀釋到1×10-7的25μl肺勻漿接種到三重孔中。1h培養後，將175μl具有4μg/ml胰蛋白酶的感染培養基添加到各個孔中。在37℃下，48h培養後，通過由來自受感染細胞的上清液的雞RBC的血球凝集作用測定病毒的存在與否。在V形底96孔板中進行血球凝集作用分析。將上清液的連續2倍稀釋液與等體積的0.5％(體積/體積比)的雞紅血球懸浮液(CharlesRiverLaboratories)混合，並且在冰上培養1h。含有紅血球的貼壁、均質層的孔記分為正。通過感染50％孔的稀釋終點的內插法，通過Reed和Muench的方法(TCID50)測定病毒滴度，因此TCID50越低，反映病毒滴度越低。利用學生t測試(Studentttest)比較來自任何2組的數據，在本文中所述的實驗中全部使用所述測試來評估顯著性。結果圖22A顯示一個實驗的結果，證明當在感染之前投與時，靶向病毒NP轉錄本的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生。如上文材料和方法中所述，用jetPEI培養30或60μg的GFP-949或NP-1496siRNA，並且以靜脈內途徑注射到小鼠中。3小時後，用PR8病毒以鼻內方式感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。感染24小時後收集肺。如圖22A中所示，不接受siRNA處理(NT；實心方形)或接受靶向GFP的siRNA(GFP60μg；空心方形)的小鼠肺勻漿的平均log10TCID50是4.2。在經30μg靶向NP的siRNA(NP30μg；空心圓)和jetPEI預處理的小鼠中，肺勻漿的平均log10TCID50是3.9。在經60μg靶向NP的siRNA(NP60μg；實心圓)和jetPEI預處理的小鼠中，肺勻漿的平均log10TCID50是3.2。不接受處理的組與接受60μgNPsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度存在顯著性差異，P＝0.0002。個別小鼠的數據呈現於表6A中(NT＝無處理)。圖22B顯示另一個實驗的結果，證明當感染之前，以含有陽離子聚合物PLL的組合物形式經靜脈內途徑投與時，靶向病毒NP轉錄本的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生。如上文材料和方法中所述，用PLL培養30或60μg的GFP-949或NP-1496siRNA，並且以靜脈內途徑注射到小鼠中。3小時後，用PR8病毒以鼻內方式感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。感染24小時後收集肺。如圖22B中所示，不接受siRNA處理(NT；實心方形)或接受靶向GFP的siRNA(GFP60μg；空心方形)的小鼠肺勻漿的平均log10TCID50是4.1。在經60μg靶向NP的siRNA(NP60μg；實心圓)和PLL預處理的小鼠中，肺勻漿的平均log10TCID50是3.0。接受60μgGFP的組與接受60μgNPsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度存在顯著性差異，P＝0.001。個別小鼠的數據呈現於表6A中(NT＝無處理)。所述數據表明，當在病毒感染之前投與時，靶向流感NP轉錄本的siRNA降低肺中的病毒滴度。也表明，當通過靜脈內注射投與時，siRNA與陽離子聚合物的混合物有效抑制肺中的流感病毒，而不需要諸如水動力轉染的技術。表6A.siRNA與陽離子聚合物對小鼠中流感病毒產生的抑制圖22C顯示第三個實驗的結果，證明當在感染之前投與時，靶向病毒NP轉錄本的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生，並且證明陽離子聚合物的存在顯著增加siRNA的抑制功效。如上文材料和方法中所述，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或jetPEI培養60μg的GFP-949或NP-1496siRNA，並且經靜脈內途徑注射到小鼠中。3小時後，用PR8病毒以鼻內方式感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。感染24小時後收集肺。如圖22C中所示，不接受siRNA處理(NT；空心方形)的小鼠肺勻漿的平均log10TCID50是4.1，而接受在PBS中的靶向GFP的siRNA的(GFPPBS；空心三角形)小鼠肺勻漿的平均log10TCID50是4.4。在經60μg在PBS中靶向NP的siRNA預處理的小鼠中(NPPBS；實心三角形)，肺勻漿的平均log10TCID50是4.2，相對於未處理或經靶向GFP的siRNA的處理，僅顯示功效的適度增加。在經60μg在jetPEI中靶向GFP的siRNA預處理的小鼠中(GFPPEI；空心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是4.2。然而，接受60μg在jetPEI中靶向NP的siRNA的小鼠中(NPPEI；實心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是3.2。接受PBS中的GFPsiRNA的組與接受PBS中的NPsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度存在顯著性差異，P＝0.04，而接受GFPsiRNA與jetPEI的組與接受NPsiRNA與jetPEI的組之間肺勻漿的病毒滴度存在高度顯著的差異，P＝0.003。個別小鼠的數據呈現於表6B中(NT＝無處理)。表6B.在陽離子聚合物存在下顯示功效增加的siRNA對小鼠中流感病毒產生的抑制執行另外的實驗來評定當在感染之前或之後各時間點投與時，siRNA在感染後的各時間抑制流感病毒產生的能力。除在病毒感染之前12小時投與120μgsiRNA外，如上文所述投與siRNA。表6C顯示表示為log10TCID50的結果。經NP處理的組與對照組比較的P值是0.049。表6C在另一個實驗中，在感染之前3小時投與siRNA(60μg)。以鼻內途徑投與1500pfu的PR8病毒。感染48h後收集受感染的肺。表6D顯示表示為log10TCID50的結果。經NP處理的組與對照組比較的P值是0.03。表6D在另一個實驗中，在PR8(1500pfu)感染24小時後投與siRNA(120μg)。感染52小時後，收集肺並且測量病毒滴度。表6D顯示表示為log10TCID50的結果。經NP處理的組與對照組比較的P值是0.03。表6E也顯示其他聚合物是有效的siRNA遞送劑。圖22D是顯示當連同聚(β氨基酯)(J28)一起經靜脈內途徑投與時，靶向NP(NP-1496)的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生的圖。圖22E是顯示當連同聚(β氨基酯)(J28或C32)一起經腹膜內途徑投與時，靶向NP(NP-1496)的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生，而對照RNA(GFP)不具有顯著作用的圖。除聚合物與siRNA的比率是重量/重量比(例如，60∶1w/w)外，基本上如上文所述來執行實驗。在用12,000pfu的PR8病毒鼻內感染之前3小時，將聚合物和siRNA混合併且經靜脈內或腹膜內途徑投與小鼠中。24小時後收集肺並且執行HA分析。存在於J28和C32中的胺和雙(丙烯酸酯)單體描述並且描繪於U.S.S.N.10/446,444中。聚合物是Dr.RobertLanger的捐贈品。圖23顯示一個實驗的結果，證明靶向不同流感病毒轉錄本的siRNA顯示相加效應。如上文材料和方法中所述，用jetPEI培養60μg的NP-1496siRNA、60μgPA-2087siRNA或60μgNP-1496siRNA+60μgPA-2087siRNA，並且經靜脈內途徑注射到小鼠中。3小時後，用PR8病毒以鼻內方式感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。感染24小時後收集肺。如圖23中所述，不接受siRNA處理(NT；實心方形)的小鼠肺勻漿的平均log10TCID50是4.2。在接受60μg靶向NP的siRNA的小鼠中(NP60μg；空心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是3.2。在接受60μg靶向PA的siRNA的小鼠中(PA60μg；空心三角形)，肺勻漿的平均log10TCID50是3.4。在接受60μg靶向NP的siRNA+60μg靶向PA的siRNA的小鼠中(NP+PA；實心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是2.4。不接受處理的組與接受60μgNPsiRNA、60μgPAsiRNA或60μgNPsiRNA+60μgPAsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度存在顯著性差異，P分別＝0.003、0.01和0.0001。接受60μgNPsiRNA或60μgNPsiRNA的組與接受60μgNPsiRNA+60μgPAsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度存在顯著性差異，P＝0.01。個別小鼠的數據呈現於表7中(NT＝無處理)。所述數據表明，用靶向流感NP或PA轉錄本的siRNA預處理降低隨後經流感病毒感染的小鼠的肺中的病毒滴度。數據另外表明，靶向不同病毒轉錄本的siRNA的組合顯示相加效應，暗示相對於達到相等功效所需的單一siRNA的量，用靶向不同轉錄本的siRNA的組合的療法會使各種siRNA的劑量降低。表7.在小鼠中siRNA針對流感病毒的相加效應圖24顯示一個實驗的結果，證明當在感染後投與時，靶向病毒NP轉錄本的siRNA抑制小鼠中的流感病毒產生。用PR8病毒(500pfu)以鼻內方式感染小鼠。如上文材料和方法中所述，用jetPEI培養60μg的GFP-949siRNA、60μgPA-2087siRNA、60μgNP-1496siRNA或60μgNPsiRNA+60μgPAsiRNA，並且5小時後經靜脈內途徑注射到小鼠中。siRNA投與28小時後收集肺。如圖24中所示，不接受siRNA處理(NT；實心方形)或接受GFP特異性siRNAGFP-949(GFP；空心方形)的小鼠肺勻漿的平均log10TCID50是3.0。在接受60μg靶向PA的siRNA的小鼠中(PA60μg；空心三角形)，肺勻漿的平均log10TCID50是2.2。在接受60μg靶向NP的siRNA的小鼠中(NP60μg；空心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是2.2。在接受60μgNPsiRNA+60μgPAsiRNA的小鼠中(PA+NP；實心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是1.8。不接受處理的組與接受60μgPA、NPsiRNA或60μgNPsiRNA+60μgPAsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度存在顯著性差異，P分別＝0.09、0.02和0.003。接受NPsiRNA的組與接受PA+NPsiRNA的組之間肺勻漿的病毒滴度的差異具有0.2的P值。個別小鼠的數據呈現於表8中(NT＝無處理)。所述數據表明，當在病毒感染之後投與時，靶向流感NP和/或PA轉錄本的siRNA降低肺中的病毒滴度。表8.siRNA對受感染小鼠中流感病毒產生的抑制實例13通過投與提供用—於產生shRNA的模板的慢病毒抑制細胞中的流感病毒產生材料和方法細胞增養.以在1mlDMEM-10％FCS中每個孔4×105個細胞將Vero細胞接種於24孔板中，並且在37℃，5％CO2下培養。提供用於shRNA產生的模板的慢病毒的產生．如圖25A中所示意描繪的，在慢病毒載體pLL3.7的U6啟動子與終止序列之間克隆用作合成NP-1496ashRNA(參見圖25A)的模板的寡核苷酸(Rubinson，D．等人，NatureGenetics，第33卷，第401-406頁，2003)。在pLL3.7的多克隆位點中的Hpal與Xhol限制性位點之間插入寡核苷酸。所述慢病毒載體也表達EGFP以方便監視經轉染／感染的細胞。通過將包含用於產生NP-1496ashRNA的模板的DNA載體共轉染，並且將載體組裝到293T細胞中來產生慢病毒。48h後，收集含有慢病毒的培養物上清液，在4℃下，在2000rpm下旋轉7min並接著經由0.45μm過濾器過濾。以每孔1×105將Vero細胞接種於24孔板中。過夜培養後，將含有插入物(0.25ml或1.0ml)的培養物上清液添加到存在8μg/ml聚凝胺(polybrene)的孔中。然後在室溫下，在2500rpm下將板離心1h並且返回培養物中。感染24h後，通過流式細胞術分析所得Vero細胞系(Vero-NP-0.25和Vero-NP-1.0)連同親代(未感染)Vero細胞的GFP表達。注意，NP-1496a不同於NP-1496，差別在於有義部分的3′端處非有意包含的額外核苷酸(A)和反義部分的5′端處非有意包含的互補核苷酸(U)，從而形成長度20個nt而不是與NP-1496中一樣19個nt的雙鏈體部分。(參見表2)。根據本發明的其他實施例，使用NP-1496序列而不是NP-1496a序列。另外，NP-1496ashRNA的環部分不同於圖21中所示的NP-1496shRNA的環部分。流感病毒感染和病毒滴度的測定.在0.04、0.2和1的MOI下，用PR8病毒感染對照Vero細胞和經含有插入物的慢病毒感染的Vero細胞(Vero-NP-0.25和Vero-NP-1.0)。如實例12中所述，在感染48小時後，通過HA分析測定上清液中的流感病毒滴度。結果測試含有用於產生NP-1496ashRNA的模板的慢病毒抑制Vero細胞中的流感病毒產生的能力。NP-1496ashRNA包括2個能夠形成莖-環結構的互補區，所述莖-環結構含有具有與上文所述NP-1496asiRNA相同的序列的雙鏈部分。如圖25B中所示，用Vero細胞將含有慢病毒的上清液培養過夜，引起EGFP的表達，表明Vero細胞受到慢病毒感染。陰影曲線表示對照細胞(未感染)中的平均螢光強度。當使用1ml的上清液時，幾乎所有細胞變成EGFP陽性的並且平均螢光強度較高(1818)(Vero-NP-1.0)。當使用0.25ml的上清液時，大多數細胞(約95％)是EGFP陽性並且平均螢光強度較低(503)(Vero-NP-0.25)。接著，在0.04、0.2和0.1的MOI下，用流感病毒感染親代Vero細胞和經慢病毒感染的Vero細胞，並且在流感病毒感染48小時後分析病毒滴度。隨著MOI增加，親代Vero細胞培養物的上清液中的病毒滴度增加(圖25C)。相反，在Vero-NP-1.0細胞培養物的上清液中的病毒滴度仍為極低的，表明流感病毒產生在所述細胞中受到抑制。同樣地，在Vero-NP-0.25細胞培養物中的流感病毒產生也受到部分抑制。病毒滴度呈現於表9中。所述結果暗示，從慢病毒載體表達的NP-1496shRNA可被加工成siRNA以抑制在Vero細胞中的流感病毒產生。抑制的程度似乎與每個細胞的病毒感染程度成比例(由EGFP含量表示)。表9.表達於組織培養物中的細胞中的siRNA對流感病毒產生的抑制實例14通過用於轉錄siRNA前體的DNA載體的鼻內投與抑制小鼠中的流感產生材料和方法構建用作shRNA的模板的質粒.用於表達NP-1496ashRNA的質粒的構建描述於實例13中。如實例13中所述和圖25A中對NP-1496ashRNA所示意描繪的，在慢病毒載體pLL3.7的U6啟動子與終止序列之間克隆用作合成PB1-2257shRNA或RSV特異性shRNA的模板的寡核苷酸。寡核苷酸的序列如下NP-1496a有義5′-TGGATCTTATTTCTTCGGAGATTCAAGAGATCTCCGAAGAAATAAGATCCTTTTTTC-3′(SEQIDNO179)NP-1496a反義5′-TCGAGAAAAAAGGATCTTATTTCTTCGGAGATCTCTTGAATCTCCGAAGAAATAAGATCCA-3′(SEQIDNO180)PB1-2257有義5′-TGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGAGATTCAATGGTGGAACAGATCTTTTTTC-3′(SEQIDNO181)PB1-2257反義5′-TCGAGAAAAAAGATCTGTTCCACCATTGAATCTCTTGAATTCAATGGTGGAACAGATCA-3′(SEQIDNO182)RSV有義5′-TGCGATAATATAACTGCAAGATTCAAGAGATCTTGCAGTTATATTATCGTTTTTTC-3′(SEQIDNO183)RSV反義5′-TCGAGAAAAAACGATAATATAACTGCAAGATCTCTTGAATCTTGCAGTTATATTATCGCA-3′(SEQIDNO184)將從包含上述寡核苷酸的載體表達的RSVshRNA進行活體內加工以產生包含具有以下序列的有義鏈和反義鏈的siRNA有義5′-CGATAATATAACTGCAAGA-3′(SEQIDNO185)反義5′-TCTTGCAGTTATATTATCG-3′(SEQIDNO186)可類似地使用以下寡核苷酸構建PA特異性髮夾PA-2087有義5′-TGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGAGATCAGGCACTCCTCAATTGCTTTTTTC-3′(SEQIDNO187)PA-2087反義5′-TCGAGAAAAAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATCTCTTGAATCAGGCACTCCTCAATTGCA-3′(SEQIDNO270)病毒感染和病毒滴定的測定.所述病毒感染和病毒滴度的測定如實例12中所述來執行。DNA遞送.如上文所述，將能夠用作表達NP-1496ashRNA、PB1-2257shRNA或RSV特異性shRNA的模板的質粒DNA(各60μg)個別地與40μlInfasurf_(ONY，Inc.，AmherstNY)和20μl的5％葡萄糖混合，並且經鼻內途徑投與成組小鼠中，每組4隻小鼠。將40μlInfasurf與20μl的5％葡萄糖的混合物投與無處理(NT)組中的小鼠中。如上文所述，13小時後，用PR8病毒以鼻內方式感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。感染24小時後收集肺並且測定病毒滴度。結果測試從DNA載體表達的shRNA抑制小鼠中流感病毒感染的能力。對所述實驗來說，將質粒DNA與Infasurf混合，Infasurf是來自小牛肺的類似於先前所示媒介物的用於促進肺中的基因轉移的天然表面活性劑提取物(74)。通過使用吸液管將混合物滴入鼻中，將DNA/Infasurf混合物滴注到小鼠中。13小時後，用PR8病毒感染小鼠，每隻小鼠12000pfu。流感病毒感染24小時後，收集肺並且通過MDCK/血球凝集素分析測量病毒滴度。如圖26中所示，在不給與任何質粒DNA或給與表達呼吸道合胞病毒(RSV)特異性shRNA的DNA載體的小鼠中，病毒滴度較高。當給與小鼠表達NP-1496ashRNA或PB1-2257shRNA的質粒DNA時，觀察到較低的病毒滴度。當一起給與小鼠流感特異性質粒DNA(一種表達NP-1496ashRNA，而另一種表達PB1-2257shRNA)時，病毒滴度進一步顯著降低。不接受處理(NT；空心方形)或接受編碼RSV特異性shRNA的質粒(RSV；實心方形)的小鼠肺勻漿的平均log10TCID50分別是4.0或4.1。在接受能夠用作用於NP-1496ashRNA的模板的質粒的小鼠中(NP；空心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是3.4。在接受能夠用作用於PB1-2257shRNA的模板的質粒的小鼠中(PB；空心三角形)，肺勻漿的平均log10TCID50是3.8。在接受能夠用作用於NP和PBshRNA的模板的質粒的小鼠中(NP+PBl；實心圓)，肺勻漿的平均log10TCID50是3.2。在不接受處理或接受RSV特異性shRNA質粒的組與接受NPshRNA質粒、PB1shRNA質粒或NP和PB1shRNA質粒的組之間，肺勻漿的病毒滴度的差異分別具有0.049、0.124和0.004的P值。個別小鼠的數據呈現於表10中(NT＝無處理)。所述結果顯示，從DNA載體表達的shRNA可被加工成siRNA以抑制小鼠中的流感病毒產生，並且證明，Infasurf是適合遞送用於表達shRNA的質粒的媒介物。特別是，所述數據表明，當在病毒感染之後投與時，靶向流感NP和/或PB1轉錄本的shRNA降低肺中的病毒滴度。表10.在小鼠中表達的shRNA對流感病毒產生的抑制實例15陽離子聚合物促進siRNA的細胞吸收材料和方法試劑.從Sigma購買具有2種不同平均分子量的聚-L-賴氨酸[聚-L-賴氨酸(MW(vis)52,000；MW(LALLS)41,800，目錄號P2636)，和聚-L-賴氨酸(MW(vis)9,400；MW(LALLS)8,400，目錄號P2636]、聚-L-精氨酸(MW15,000-70,000，目錄號P7762)和溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)。為進行描述，將假定使用LALLS方法獲得的分子量，但是應了解，分子量是近似的，因為聚合物展現一些尺寸不均勻性。凝膠阻滯分析.通過將10μl的siRNA(10pmol，溶於10mMHepes緩衝液中，pH7.2)與10μl的含有變化量的聚合物的聚合物溶液混合，形成siRNA-聚合物複合物。在室溫下進行複合物形成30min，之後將20μl在4％瓊脂糖凝膠上跑膠。用溴化乙錠染色觀測條帶。細胞毒性分析.通過在室溫下將相等量(50pmol)的在10mMHepes緩衝液(pH7.2)中的siRNA與含有變化量的聚合物的聚合物溶液混合30min，形成siRNA-聚合物複合物。通過MTT分析評估細胞毒性。在0.2ml的含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中，以每孔30,000個細胞將細胞接種於96孔板中。在37℃下培養過夜後，除去培養基並且用0.18mlOPTI-MEM(GIBCO/BRL)替換。將在20μl的Hepes緩衝液中的siRNA-聚合物複合物添加到細胞中。在37℃下培養6h後，除去含有聚合物的培養基並且用DMEM-10％FCS替換。24h後，根據製造商的說明書，使用MTT分析測量細胞的代謝活性。將實驗執行三次，並且將數據取平均值。細胞培養、轉染、siRNA-聚合物複合物形成和病毒滴度測定Vero細胞在37℃下，在5％CO2/95％空氣氣氛下，在含有10％熱滅活FCS、2mML-穀氨醯胺、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的DMEM中生長。對轉染實驗來說，在1ml的DMEM-10％FCS中，以每孔4×105個細胞將對數期Vero細胞接種於24孔板中。在37℃下培養過夜後，通過將50μl(400pmol(約700ng)在10mMHepes緩衝液中，pH7.2)的siRNA添加到50μl的聚合物渦流中，形成siRNA-聚合物複合物。使用不同濃度的聚合物以達到siRNA與聚合物之間完全的複合物形成。在室溫下培養混合物30min以完成複合物形成。除去細胞生長培養基並且剛好在添加複合物之前，用OPTI-MEMI(LifeTechnologies)替換。在37℃下，在5％CO2下，用複合物將細胞培養6h後，除去含有複合物的培養基，並且將在MOI＝0.04，由DMEM、0.3％BSA(Sigma)、10mMHepes、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素組成的感染培養基中的200μl的PR8病毒添加到各孔中。在室溫下伴隨恆定搖動培養1h後，將含有4μg/ml胰蛋白酶的0.8ml感染培養基添加到各孔中，並且在37℃，在5％CO2下培養細胞。在感染後的不同時間點，從受感染的培養物收集上清液並且如上文所述，通過血球凝集作用(HA)分析測定病毒滴度。對於貼壁細胞系，根據製造商的說明書，，通過Lipofectamine2000(LifeTechnology)進行siRNA轉染。簡而言之，在1ml的DMEM-10％FCS中，以每孔4×105個細胞將對數期的Vero細胞接種於24孔板中，並且在37℃下，在5％CO2下培養。第二天，將50μl在OPTI-MEMI中的經稀釋Lipofectamine2000添加到50μl的siRNA(400pmol，溶於OPTI-MEMI中)中以形成複合物。洗滌細胞並且用不含血清的培養基培養。將複合物應用於細胞，並且在37℃下將細胞培養6h，之後如上文所述進行洗滌並用流感病毒感染。在感染後的不同時間點，從受感染的培養物收集上清液並且如上文所述，通過血球凝集作用(HA)分析測定病毒滴度。結果測試聚-L-賴氨酸(PLL)和聚-L-精氨酸(PLA)與siRNA形成複合物並且促進經培養細胞對siRNA的吸收的能力。為測定PLL和/或PLA是否與siRNA形成複合物，將固定量的NP-1496siRNA與遞增量的聚合物混合。然後通過在4％瓊脂糖凝膠中進行電泳來觀測聚合物/siRNA複合物的形成。隨著聚合物量的增加，siRNA的電泳遷移率受到阻滯(圖27A和27B)，表明形成複合物。圖27A和27B分別表示siRNA與PLL(41.8K)或PLA之間的複合物形成。各圖中所用聚合物的量從左到右增加。在圖27A和27B中的各圖中，可在左邊的泳道中看到條帶，表明沒有複合物形成並因此siRNA進入凝膠中並且隨後遷移。當移到右邊時，條帶消失，表明複合物形成並且複合物不能進入凝膠中並遷移。為研究siRNA/聚合物複合物的細胞毒性，將siRNA和PLL或PLA在不同比率下的混合物添加到96孔板中的Vero細胞培養物中。通過MTT分析(74)測量細胞的代謝活性。將實驗執行三次，並且將數據取平均值。細胞存活率隨PLL(MW約42K)的量增加而顯著降低，而PLL(約8K)顯示顯著更低的毒性，在PLL/siRNA比率高達4∶1時顯示最小毒性或不顯示毒性(圖28A；圓圈＝PLL(MW約8K)；方形＝PLL(MW約42K))。如圖28B中所示，細胞存活率隨PLA/siRNA比率增加而降低，但是在PLA/siRNA比率高達4.5∶1時，存活率仍處在80％以上。聚合物/siRNA比率表示在圖28A和28B中的X軸上。繪製於圖28A和28B中的數據呈現於表11和12中。在表11中，數字表示相對於未處理細胞的存活率百分比，在用聚合物/siRNA複合物處理後細胞的存活率百分比。ND＝未進行。在表12中，數字表示如所示的PLA/siRNA比率、存活百分比和標準偏差。表11.PLL/siRNA複合物的細胞毒性(存活百分比)表12.PLA/siRNA複合物的細胞毒性(存活百分比)為測定PLL或PLA是否促進siRNA的細胞吸收，以所有siRNA與聚合物複合的比率將各種量的聚合物和NP-1496混合。在所有情況下，使用相等量的siRNA。對約42K的PLL使用的聚合物/siRNA比率比對約8K的PLL使用的聚合物/siRNA比率低，因為前者被證明對細胞更具毒性。將複合物添加到Vero細胞中，並且6小時後，用PR8病毒感染培養物。在感染後的不同時間點，收集培養物上清液並且通過HA分析來分析培養物上清液的病毒。圖29A是在接受各種轉染處理的細胞中，病毒滴度隨時間的圖(圓圈＝無處理；方形＝Lipofectamine；實心三角形＝PLL(約42K，PLL/siRNA比率＝2)；空心三角形＝PLL(約8K，PLL/siRNA比率＝8))。如圖29A中所示，在非轉染培養物中，病毒滴度隨時間增加。在經NP-1496/Lipofectamine轉染的培養物中，病毒滴度顯著更低，並且在用PLL/NP-1496複合物處理的培養物中甚至更低。繪製於圖29A中的數據呈現於表13A中(NT＝無處理；LF2K＝Lipofectamine)。PLLsiRNA比率表示在圓括號中。類似地在一定的聚合物/siRNA比率範圍內測試PLA。圖29B是在接受各種轉染處理的細胞中，病毒滴度隨時間的圖(實心方形＝對照轉染；實心圓＝Lipofectamine；空心方形＝在PLA/siRNA比率＝1時的PLA；空心圓＝在PLA/siRNA比率＝2時的PLA；空心三角形＝在PLA/siRNA比率＝4時的PLA；實心三角形＝在PLA/siRNA比率＝8時的PLA)。如圖29B中所示，在對照(對照轉染)培養物和在用在1∶1比率時的PLA/siRNA處理的培養物中，病毒滴度隨時間增加。在經NP-1496/Lipofectamine轉染的培養物中，病毒滴度顯著更低，並且在經含有在4∶1或較高的PLA/siRNA比率時的複合物的PLA/siRNA複合物處理的培養物中甚至更低。聚合物量的增加引起病毒滴度更大的降低。繪製於圖29B中的數據呈現於表13B中。表13A.聚合物/siRNA複合物對流感病毒產生的抑制表13B.聚合物/siRNA複合物對流感病毒產生的抑制因此，陽離子聚合物促進siRNA的細胞吸收並且抑制細胞系中的流感病毒產生，並且比廣泛使用的轉染試劑Lipofectamine有效。所述結果也暗示，可容易識別另外的陽離子聚合物以刺激siRNA的細胞吸收，並且描述了其識別方法。PLL和PLA可用作所述研究的正對照。實例16A通過將siRNA遞送到血管系統或呼吸道中抑制肺中的螢光素酶活性材料和方法從Dharmacon獲得siRNAs並如上文所述進行去保護和退火。用於NP(NP-1496)、PA(PA-2087)、PB1(PB1-2257)和GFP的siRNA序列如上文所提供。Luc特異性siRNA如(McCaffrey，AP等人，Nature，41838-39)中所述。小鼠中由PEI介導的DNA轉染.在室溫下，以10的氮/磷摩爾比率(N/P比率)將pCMV-lucDNA(Promega)與PEI(Qbiogene，Carlsbad，CA)混合20min。對靜脈內(i.v.)投與來說，將含有60μgDNA的200μl混合物經眼眶後途徑注射到8周大的雄性C57BL/6小鼠中(TaconicFarms)。對氣管內(i.t)投與來說，使用PermCenturyModelIA-IC吹入器將含有30μg或60μgDNA的50μl混合物投與麻醉小鼠的肺中。小鼠中由PEI介導的siRNA遞送.通過在室溫下，以5的N/P比率將60μg的luc特異性或GFP特異性siRNA與jetPEI混合20min，形成siRNA-PEI組合物。對靜脈內投與來說，經眼眶後途徑注射含有指定量siRNA的200μl混合物。對肺部投與來說，經氣管內途徑遞送50μl。Luc分析.在pCMV-lucDNA投與後的各時間點，收集肺、脾、肝、心臟和腎並且在細胞溶解緩衝液(CellLysisBuffer)(MarkerGeneTechnologies，Eugene，OR)中均質化。用螢光素酶分析系統(LuciferaseAssaySystem)(Promega)分析發光並且用Optocomp_I光度計(MGMInstruments，Hamden，CT)測量。通過BCA分析(Pierce)測量勻漿中的蛋白質濃度。結果為測定小鼠中由PEI介導的核酸遞送的組織分布，經靜脈內途徑注射pCMV-lucDNA-PEI複合物，並且24小時後，在各器官中測量Luc活性。在肺中活性最高，其中檢測Luc活性至少4天(圖30A)，而在心臟、肝、脾和腎中，水平低100-1,000倍並且在注射後檢測較短時間。當經氣管內途徑滴注DNA-PEI複合物時，也在肺中檢測到顯著的Luc活性，只是水平比靜脈內投與後低(圖30B)。為測試靜脈內投與後PEI促進siRNA的肺吸收的能力，先經氣管內途徑給與小鼠pCMV-lucDNA-PEI複合物，接著以靜脈內途徑注射與PEI複合的Luc特異性siRNA、與PEI複合的對照GFP特異性siRNA或相同體積的5％葡萄糖。24小時後，肺中的Luc活性在接受LucsiRNA的小鼠中比在給與GFPsiRNA或無處理的小鼠中低17倍(圖30C)。因為LucsiRNA可僅在經DNA載體轉染的相同肺細胞中抑制Luc表達，所以所述結果表明siRNA-PEI混合物的靜脈內注射在肺中達到標靶轉錄本的有效抑制。為測試肺部投與後PEI促進siRNA的肺吸收的能力，先經靜脈內途徑給與小鼠pCMVDNA-PEI複合物，接著立即經氣管內途徑投與與PEI混合的Luc特異性siRNA、與PEI混合的對照GFP特異性siRNA或相同體積的5％葡萄糖。24小時後，分析肺勻漿中的螢光素酶活性。圖30D顯示來自給與螢光素酶特異性或GFP特異性siRNA的小鼠肺勻漿中的螢光素酶活性，已標準化成蛋白量。螢光素酶活性在用螢光素酶siRNA處理的小鼠中比在用GFPsiRNA處理的小鼠中低6.8倍。所述結果表明siRNA-PEI混合物的肺部投與在肺細胞中達到標靶轉錄本的有效抑制。實例16B通過將siRNA遞送到呼吸系統中抑制肺中的親環素B親環素B是廣泛地表達於哺乳動物中的內源基因。為評定直接遞送到呼吸系統中的siRNA抑制內源基因表達的能力，通過異氟醚/氧麻醉遠交系Blackswiss小鼠(約30g或更大體重)，並且將靶向親環素B的siRNA(Dharmacon，D-001136-01-20siCONTROLCyclophilinBsiRNA(人類/小鼠/大鼠))或對照GFP-949siRNA(2mg/kg)以鼻內途徑投與小鼠中，對於每種siRNA，2隻小鼠為一組。投與24小時後收集肺。從肺提取RNA並且使用隨機引物進行逆轉錄。然後使用親環素B和GAPDHTaqman基因表達分析(AppliedBiosystems)執行實時PCR。結果(表14)顯示通過靶向親環素B的siRNA達到親環素B的70％抑制。表14肺中親環素B的抑制實例17適當保守標靶部分的選擇為識別用作標靶部分的各種流感病毒A轉錄本的適當保守區域(針對所述標靶部分來靶向RNAi誘導劑以抑制在多種菌株中的表達)，將來自一組從人類分離得到的病毒株的基因組片段進行比對(呈其正鏈形式，即，mRNA中所見的序列)。除實例1中列出的菌株外，所述菌株還包括許多菌株。表15A-15H列出用於識別適當保守區的流感A病毒基因組片段的Genbank登錄號(左列)、菌株名稱(中間列)和血清型(右列)。將各片段的整個序列比對和比較，內含子除外。包括5′和3′非翻譯區。對不同片段來說，所比對的菌株組不同，但是每組包括至少19種在跨越1934與2004之間的各年份分離出的菌株。菌株包括已知在人類中循環的所有HA和NA型(H1、H2、H3、H5、H9、N1、N2)。表15A流感A病毒NP片段(從人類分離得到的菌株)AF389119A/波多黎各/8/34/西乃山(MountSinai)H1N1M63752A/新加坡/1/57H2N2M23976A/安娜堡(annarbor)/6/60H2N2AY210103A/韓國/426/68H2N2M76606A/新澤西/8/76H1N1L07351A/孟菲斯/18/78H3N2AJ628066A/斐濟/15899/83H1N1L07369A/孟菲斯/3/88H3N2M63755A/威斯康星/3523/88H1N1L07373A/廣東/38/89H3N2L07357A/上海/6/90H3N2L24394A/MD/12/91H1N1AF038254A/北九州(Kitakyushu)/159/93H3N2AB019358A/長崎/48/95H3N2AJ291400A/香港/156/97H5N1AF255749A/香港/498/97H3N2AF255752A/香港/542/97H5N1AF038259A/滋賀(Shiga)/25/97H3N2AF255753A/香港/97/98H5N1AF342819A/威斯康星/10/98H1N1AJ289871A/香港/1073/99H9N2AJ458276A/瑞士/9243/99H3N2ISDN13443A/雪梨/274/2000H3N2AB126624A/橫濱/22/2002H1N2AY575905A/香港/212/03H5N1AY526749A/越南/1196/04H5N1表15B流感A病毒PA轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389117A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1M26078A/新加坡/1/57H2N2M23974A/安娜堡/6/60H2N2M26079A/韓國/426/68H2N2AJ605762A/斐濟/15899/83H1N1AF037424A/北九州/159/93H3N2U71138A/滋賀/20/95H3N2AJ289874A/香港/156/97H5N1AF257198A/香港/498/97H3N2AF257201A/香港/542/97H5N1AF037429A/滋賀/25/97H3N2AF258519A/香港/427/98H1N1AF257202A/香港/97/98H5N1AY043028A/廣州/333/99H9N2AF257191A/香港/1073/99H9N2AJ293922A/香港/1774/99H3N2AB126627A/橫濱/22/2002H1N2AY576404A/香港/212/03H5N1AY526750A/越南/1196/04H5N1表15C流感A病毒PB1轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389116A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1M25924A/新加坡/1/57H2N2M23972A/安娜堡/6/60H2N2M25935A/韓國/426/68H2N2AJ564807A/斐濟/15899/83H1N1AF037418A/北九州/159/93H3N2U71130A/滋賀/20/95H3N2AJ404633A/香港/156/97H5N1AF258823A/香港/498/97H3N2AF258826A/香港/542/97H5N1AF037423A/滋賀/25/97H3N2AF258526A/香港/427/98H1N1AF258827A/香港/97/98H5N1AY043029A/廣州/333/99H9N2AF258816A/香港/1073/99H9N2AJ293921A/香港/1774/99H3N2AJ489539A/英國/627/01H1N2AB126625A/橫濱/22/2002H1N2AY576392A/香港/212/03H5N1AY526751A/越南/1196/04H5N1表15D流感A病毒PB2轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389115A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1M73521A/新加坡/1/57H2N2M23970A/安娜堡/6/60H2N2M73524A/韓國/426/68H2N2M91712A/烏隆/307/72H3N2AJ564805A/斐濟/15899/83H1N1AF037412A/北九州/159/93H3N2U53158A/威斯康星/4754/94H1N1U71134A/滋賀/20/95H3N2AF036363A/香港/156/97H5N1AF258842A/香港/498/97H3N2AF258845A/香港/542/97H5N1AF037417A/滋賀/25/97H3N2AF258525A/香港/427/98H1N1AF258846A/香港/97/98H5N1AF342824A/威斯康星/10/98H1N1AY043030A/廣州/333/99H9N2AJ404630A/香港/1073/99H9N2AJ293920A/香港/1774/99H3N2AJ489485A/英國/627/01H1N2AB126626A/橫濱/22/2002H1N2AY576380A/香港/212/03H5N1AY526752A/越南/1196/04H5N1表1E流感A病毒M轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389121A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1X08093A/新加坡/1/57H2N2M23978A/安娜堡/6/60H2N2M63531A/韓國/426/68H2N2J02167A/烏隆/72H3N2AJ298947A/斐濟/15899/83H1N1U65562A/北九州/159/93H3N2U53168A/威斯康星/4754/94H1N1U65573A/滋賀/20/95H3N2AJ458306A/南非/1147/96H3N2AF036358A/香港/156/97H5N1AF255370A/香港/498/97H3N2AF255373A/香港/542/97H5N1AF038274A/滋賀/25/97H3N2AF258523A/香港/427/98H1N1AF255374A/香港/97/98H5N1AF342818A/威斯康星/10/98H1N1AY043025A/廣州/333/99H9N2AF255363A/香港/1073/99H9N2AJ293925A/香港/1774/99H3N2AJ458304A/沙烏地阿拉伯/7971/2000H1N1AJ489530A/英國/627/01H1N2AB126629A/橫濱/22/2002H1N2AY575893A/香港/212/03H5N1AY526748A/越南/1196/04H5N1表15F流感A病毒NS轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389122A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1AY210151A/新加坡/1/57H2N2AY210161A/安娜堡/6/60H2N2AY210191A/韓國/426/68H2N2V01102A/烏隆/72H3N2AJ298950A/斐濟/15899/83H1N1D30676A/北九州/159/93H3N2U53170A/威斯康星/4754/94H1N1U65673A/滋賀/20/95H3N2AF036360A/香港/156/97H5N1AF256183A/香港/498/97H3N2AF256187A/香港/542/97H5N1AF038279A/滋賀/25/97H3N2AF258521A/香港/427/98H1N1AF256188A/香港/97/98H5N1AF342817A/威斯康星/10/98H1N1AY043027A/廣州/333/99H9N2AF256177A/香港/1074/99H9N2AJ293941A/香港/1774/99H3N2AJ519463A/沙烏地阿拉伯/7971/2000H1N1AJ489552A/英國/627/01H1N2AB126628A/橫濱/22/2002H1N2AY576368A/香港/212/03H5N1AY526747A/越南/1196/04H5N1表15G流感A病毒NA轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389120A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1AY209895A/新加坡/1/57H2N2AY209903A/安娜堡/6/60H2N2AY209932A/韓國/426/68H2N2M27970A/新澤西/8/76H1N1K01017A/孟菲斯/10/78H1N1AJ006954A/斐濟/15899/83H1N1U42634A/英國/427/88H3N2U47816A/威斯康星/3523/88H1N1U42636A/上海/24/90H3N2U42774A/加利福尼亞/271/92H3N2AF038260A/北九州/159/93H3N2AJ457945A/南昌/933/95H3N2AF036357A/香港/156/97H5N1AF102670A/香港/542/97H5N1AF038264A/滋賀/25/97H3N2AF102661A/香港/97/98H5N1AF533749A/蒙得維的亞(Montevideo)/2728/98H3N2AY043022A/韶關/408/98H9N2AF342820A/威斯康星/10/98H1N1AJ404629A/香港/1073/99H9N2AJ293923A/香港/1774/99H3N2AJ307628A/蒙特婁(Montreal)/MTL516/00H3N2AF503466A/新加坡/63/2001H1N2AJ457947A/愛爾蘭/1092/2002H3N2AB126623A/橫濱/22/2002H1N2AY575881A/香港/212/03H5N1AY555151A/泰國/1-KAN-1/2004H5N1AY526746A/越南/1196/04H5N1表15H流感A病毒HA轉錄本(從人類分離得到的菌株)AF389118A/波多黎各/8/34/西乃山H1N1L20410A/新加坡/1/57H2N2AF270721A/安娜堡/6/60H2N2L11133A/韓國/426/68H2N2AY661044A/比爾託芬(Bilthoven)/628/76H3N2AJ289702A/斐濟/15899/83H1N1AY661055A/英國/427/88H3N2L33755A/芬蘭/75/88H1N1AY661074A/上海/24/90H3N2AF008817A/加利福尼亞/271/92H3N2D30669A/北九州/159/93H3N2AF008725A/南昌/933/95H3N2AF036356A/香港/156/97H5N1AF102678A/香港/542/97H5N1AJ311466A/雪梨/5/97H3N2AF102676A/香港/97/98H5N1AY271794A/孟菲斯/31/98H3N2AY043017A/韶關/408/98H9N2AF342821A/威斯康星/10/98H1N1AJ404626A/香港/1073/99H9N2AJ293926A/香港/1774/99H3N2ISDNOS0022A/奧斯陸(Oslo)/6391/2000H3N2AF503481A/新加坡/63/2001H1N2AY661030A/荷蘭/120/02H3N2AB126622A/橫濱/22/2002H1N2AY575869A/香港/212/03H5N1AY555150A/泰國/1-KAN-1/2004H5N1AY526745A/越南/1196/04H5N1為了在一大組流感A病毒株之間識別一組優選的標靶部分，選擇PR8菌株的序列作為基本序列。使用各片段的整個序列，內含子除外。序列顯示於圖32A-32J(SEQIDNO383-392)中。將這些序列串連起來，形成呈以下順序的單一長序列NP、PB2、PB1、PA、M1、M2、NS1、NS2、HA、NA。通過在5′端開始，應用19核苷酸「窗口」來選擇第一個可能的標靶部分，並接著在3′方向上，將窗口每次移動1個核苷酸以選擇下一個可能的標靶部分，來識別具有19個核苷酸長度的序列的部分。繼續此過程直到達到轉錄本的3′端。儘管認識到也可以選擇較短或較長的標靶部分，但是考慮每個19核苷酸區代表可能的標靶部分。涵蓋2種不同轉錄本的部分的區域排出在外。從所述過程得到的13,472個可能的標靶部分的序列可容易地通過參考圖32中的SEQIDNO383-392來確定。舉例而言，在各序列中，標靶部分延伸的位置是1-19、2-20、3-21、4-22、5-23、6-24等。在NP轉錄本(SEQIDNO383)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...1547-1565。在PB2(SEQIDNO384)轉錄本中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...2323-2341。在PB1轉錄本(SEQIDNO385)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...2323-2341。在PA轉錄本(SEQIDNO386)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...2215-2233。在M1轉錄本(SEQIDNO387)中，標靶部分是1-19、2-3-21、4-22...1009-1027。在M2轉錄本(SEQIDNO388)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...321-339。在NS1轉錄本(SEQIDNO389)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...872-890。在NS2轉錄本(SEQIDNO390)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...400-418。在HA轉錄本(SEQIDNO391)中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...1767-1775。在NA轉錄本中，標靶部分是1-19、2-20、3-21、4-22...1395-1413(SEQIDNO392)。對達到說明性目的，表16中列出了NP轉錄本的前6個標靶部分。表16NP基因中的標靶部分可能的標靶部分經受選擇步驟，以識別具有用於由RNAi誘導劑抑制的優選特徵的標靶部分。應用於選擇步驟中的標準包括基於GC含量的過濾，和基於連續段G或C核苷酸的存在與否的過濾。舉例而言，優選的RNAi誘導劑抑制區優選地含有小於70％的G或C核苷酸，並且優選地不含有超過3G核苷酸或超過3C核苷酸的連續段。因此，優選的標靶部分含有小於70％的G或C核苷酸，並且優選地不含有超過3G核苷酸或超過3C核苷酸的連續段。應用過濾後剩餘的標靶部分稱為「功能標靶部分」。表17列出了2,244個功能標靶部分。將來自PR8的功能標靶部分的序列與表15A-15H中列出的其他菌株的對應標靶部分的序列進行比較。其他菌株中的對應標靶部分容易基於其在片段中的位置和基於其序列而得以識別，通常實質上與PR8中的標靶部分相同。認識到，根據「擺動規則(wobblerules)」，可發生GU鹼基配對。也認識到，維持反義鏈與標靶之間的互補性的重要性在不同位置處有所不同。因此識別了當PR8中的標靶部分與菌株中的對應標靶部分比較(其中都在5′到3′方向上比對)時，與PR8比較的菌毒株的標靶部分的至少80％滿足以下標準的標靶部分(1)在任何位置允許PR8序列與對應序列之間的A為G或C為U的差異；(2)僅在位置1、18和19中的一個或一個以上位置允許PR8序列與對應序列之間的G為A或C為的A差異；(3)在位置1與9之間，在PR8序列與對應序列之間存在0、1、2或3個差異；(4)在PR8序列與對應序列之間存在不超過2個連續差異；和，(5)在位置11與17之間，在PR8序列與對應序列之間存在最多1個差異。滿足上述標準的標靶部分指定為「適當保守標靶部分」。表18中列出了在得自人類的流感菌株之間適當保守的220個標靶部分的序列。標靶部分來自轉錄本NP、PB2、PB1、PA、M、NS和HA。所述適當保守標靶部分是本發明的用於抑制多種不同人類衍生流感A病毒株的RNAi誘導劑的優選標靶，並且與某些優選反義鏈的抑制區完全互補。選擇了適當保守標靶部分之後，將來自從禽類(包括鴨、雞、海鷗、水鴨、燕鷗、鵪鶉、雉、火雞、鵝、鴿子、獵鷹和各種其他鳥類)或從環境(假定具有禽類來源)分離得到的流感A病毒株的對應標靶部分比對，並且與從人類衍生菌株識別的標靶部分比較。除實例1中列出的菌株外，所述菌株還包括大量菌株。表19A-19F列出用於識別適當保守標靶部分的流感A病毒基因組片段(呈其正鏈形式)的Genbank登錄號(左列)、菌株名稱(中間列)和血清型(右列)。對不同片段來說，所比對的菌株組不同，但是每組包括至少30種在跨越1934-2004的各年份分離出的菌株。應用用於識別來自人類衍生菌株的適當保守標靶部分的相同選擇標準。結果產生在人類和禽類衍生菌株之間適當保守的138個標靶部分。標靶部分來自轉錄本NP、PB2、PB1、PA、M和NS。表20列出了這些適當保守標靶部分。所述標靶部分是本發明的用於抑制多種不同人類衍生和禽類衍生流感A病毒株的RNAi誘導劑的優選標靶，並且與本發明RNAi誘導劑的某些優選反義鏈的抑制區完全互補。表19A流感A病毒PA轉錄本(從禽類分離得到的菌株)M21850A/雞/FPV/羅斯託克/34H7N1M26088A/海鷗/馬裡蘭/704/77H13N6M26085A/針尾鴨/艾伯塔(Alberta)/119/79H4N6AY633193A/野鴨/艾伯塔/203/93H6N5AY633305A/野鴨/艾伯特/76/94H6N8AF098606A/雞/香港/728/97H5N1AF156444A/雞/香港/G9/97H9N2AY633393A/水鴨/艾伯塔/16/97H2N9AF536676A/雞/河南/98H9N2AJ291397A/雞/巴基斯坦/2/99H9N2AF216731A/環境/香港/437-8/99H5N1AY633353A/針尾鴨/艾伯塔/207/99H4N8AY180690A/矮腳雞/南昌/9-366/2000H3N3AF508676A/雞/河南/62/00H9N2AY059530A/鴨/香港/ww461/2000H5N1AY180683A/鴨/南昌/4-191/2000H4N6AF523462A/鴨/汕頭/2030/00H9N1AY180693A/鵪鶉/南昌/4-034/2000H4N6AY180696A/鵪鶉/南昌/4-040/2000H9N2AF457716A/雞/加利福尼亞/1002a/00H6N2AY633153A/野鴨/艾伯塔/127/00H3N8AF509210A/雞/香港/866.3/01H5N1AY180709A/鵪鶉/南昌/2-040/2001H3N6AF523454A/野鴨/汕頭/4808/01H9N2AF457683A/雞/加利福尼亞/6643/01H6N2AY180678A/雞/南昌/3-201/01H3N6AY422033A/鴨/北海道/86/01H2N3AY303660A/雞/智利/176822/02H7N3AY576411A/雞/香港/61.9/02H5N1AY586433A/火雞/義大利/220158/2002H7N3AY342420A/雞/荷蘭/1/03H7N7AY616764A/雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY609311A/雞/廣東/174/04H5N1表19B流感A病毒PB1轉錄本(從禽類分離得到的菌株)U48280A/鴨/香港/62/76H11N2M25933A/海鷗/馬裡蘭/704/77H13N6M25925A/火雞/明尼蘇達(Minnesota)/833/80H4N2AY633210A/野鴨/艾伯塔/206/96H6N8AY633186A/野鴨/艾伯塔/202/96H2N5AF098592A/雞/香港/728/97H5N1AF156416A/雞/香港/G9/97H9N2AY633394A/水鴨/艾伯塔/16/97H2N9AF536666A/雞/河南/98H9N2AF508626A/雞/韓國/99029/99H9N2AF216732A/環境/香港/437-8/99H5N1AY633354A/針尾鴨/艾伯塔/207/99H4N8AY180888A/矮腳雞/南昌/9-366/2000H3N3AY180885A/鴨/南昌/4-191/2000H4N6AF523445A/鴨/汕頭/2030/00H9N1AY180891A/鵪鶉/南昌/4-034/2000H4N6AY180892A/鵪鶉/南昌/4-040/2000H9N2AF457698A/雞/加利福尼亞/431/00H6N2AY633154A/野鴨/艾伯塔/127/00H3N8AF509184A/雞/香港/866.3/01H5N1AY180893A/雞/南昌/1-101/2001H3N6AY180864A/鵪鶉/南昌/2-040/2001H3N6AF523431A/野鴨/汕頭/4808/01H9N2AY180872A/雞/南昌/3-201/01H3N6AY422037A/鴨/北海道/86/01H2N3AY303664A/雞/智利/4957/02H7N3AY576400A/雞/香港/YU777/02H5N1AY586436A/火雞/義大利/220158/2002H7N3AY340085A/雞/荷蘭/1/03H7N7AY616765A/雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY609310A/雞/廣東/174/04H5N1AY590582A/雞/佛統(Nakorn-Pathom)/泰國H5N1/CU-K2/2004表19C流感A病毒PB2轉錄本(從禽類分離得到的菌株)M73514A/火雞/明尼蘇達/833/80H4N2M73516A/海鷗/阿斯特拉罕/227/84H13N6AF268115A/翻石鷸(RuddyTurnstone)/德拉瓦H3N4(Delaware)/168/94AY633243A/野鴨/艾伯塔/232/94H6N8AF268119A/水鳥/德拉瓦/23/96H10N9AF508651A/雞/廣東/11/97H9N2AF098579A/雞/香港/728/97H5N1AF156430A/雞/香港/G9/97H9N2AF536686A/雞/河南/98H9N2AJ410602A/鴨/香港/323/98H6N2AF508642A/雞/巴基斯坦/5/99H9N2AF216733A/環境/香港/437-8/99H5N1AY633355A/針尾鴨/艾伯塔/207/99H4N8AY180775A/矮腳雞/南昌/9-366/2000H3N3AY180770A/鴨/南昌/4-191/2000H4N6AF523481A/鴨/汕頭/2030/00H9N1AY180772A/鵪鶉/南昌/4-034/2000H4N6AY180773A/鵪鶉/南昌/4-040/2000H9N2AF457689A/雞/加利福尼亞/465/00H6N2AY633155A/野鴨/艾伯塔/127/00H3N8AF509158A/雞/香港/866.3/01H5N1AY180759A/鵪鶉/南昌/2-040/2001H3N6AF523464A/野鴨/汕頭/4808/01H9N2AF457681A/雞/加利福尼亞/6643/01H6N2AY180763A/雞/南昌/3-201/01H3N6AY422041A/鴨/北海道/86/01H2N3AY576388A/雞/香港/YU777/02H5N1AJ627496A/火雞/義大利/220158/2002H7N3AY342413A/禽類/荷蘭/219/03H7N7AY342414A/雞/荷蘭/1/03H7N7AY616766A/雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY609309A/雞/廣東/174/04H5N1AY590681A/雞/佛統/泰國/CU-K2/2004H5N1表19D流感A病毒M轉錄本(從禽類分離得到的菌株)M23917A/雞/FPV/衛橋(Weybridge)H7N7M63538A/海鷗/麻薩諸塞州/26/80H13N6AJ427302A/彎嘴濱鷸(curlewsandpiper)/香港H10N5/208/89U49117A/鴨/南昌/1749/92H11N2AF073180A/雞/新澤西/15086-3/94H7N3AF098562A/雞/香港/728/97H5N1AF156458A/雞/香港/G9/97H9N2AF250487A/鴨/香港/P169/97H3N8AF250489A/鴨/香港/P54/97H11N9AF250490A/鴨/香港/T25/97H11N8AF250492A/鴨/香港/Y264/97H4N8AY633389A/水鴨/艾伯塔/16/07H2N9AF536726A/雞/河南/98H9N2AY241600A/雞/NY/12273-11/99H7N3AF216727A/環境/香港/437-8/99H5N1AJ427299A/水鳥/香港/399/99H3N8AY633349A/針尾鴨/艾伯塔/207/99H3N3AY180518A/矮腳雞/南昌/9-366/2000H3N3AY180509A/鴨/南昌/4191/2000H4N6AF523500A/鴨/汕頭/2030/00H9N1AY180507A/鵪鶉/南昌/4-034/2000H4N6AY180504A/鵪鶉/南昌/4-040/2000H9N2AY300962A/禽類/NY/53726/00H5N2AY633149A/野鴨/艾伯塔/127/00H3N8AF474055A/雞/加利福尼亞/6643/2001H6N2AF509055A/雞/香港/866.3/01H5N1AY180523A/鵪鶉/南昌/2-040/2001H3N6AF523484A/野鴨/汕頭/4804/01H9N2AY300975A/藍翅水鴨/TX/2/01H7N3AY180505A/雞/南昌/3-201/01H3N6AY422020A/鴨/北海道/86/01H2N3AY241624A/火雞/VA/67/02H7N2AY300974A/鴨/NY/191255-59/02H5N8AY300971A/火雞/CA/D0208651-C/02H5N2AJ627497A/火雞/義大利/220168/2002H7N3AY340091A/雞/荷蘭/1/03H7N7AY611525A/雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY609315A/雞/廣東/174/04H5N1AY590578A/雞/佛統/泰國/CU-K2/2004H5N1表19E流感A病毒NS轉錄本(從禽分離得到的菌株)J02105A/鴨/艾伯塔/60/76H12N5U96743A/海鷗/馬裡蘭/1824/78H13N9U96739A/雞/賓夕法尼亞/1370/83H13N6AF007035A/鴨/俄亥俄/421/87H7N8AF074267A/雞/新澤西/15086-3/94H7N3AF156472A/雞/香港/G9/97H9N2AF319651A/雞/義大利/9097/97H5N9AF250495A/鴨/香港/P169/97H3N8AF250498A/鴨/香港/P54/97H11N9AF250499A/鴨/香港/T25/97H11N8AF250501A/鴨/香港/Y264/97H4N8AY633392A/水鴨/艾伯塔/16/97H2N9AF536736A/雞/河南/98H9N2AJ410587A/鴨/香港/324/98H6N2AY241629A/雞/NY/12273-11/99H7N3AF216726A/環境/香港/437-8/99H5N1AJ427300A/水鳥/香港/399/99H3N8AY633352A/針尾鴨/艾伯塔/207/99H4N8AY180647A/矮腳雞/南昌/9-366/2000H3N3AY180606A/鴨/南昌/4-191/2000H4N6AF523502A/鴨/汕頭/2030/00H9N1AY180614A/鵪鶉/南昌/4-034/2000H4N6AY180617A/鵪鶉/南昌/4-040/2000H9N2AY300986A/禽類/NY/53726/00H5N2AY180620A/野鴨/艾伯塔/127/00H3N8AY300999A/藍翅水鴨/TX/2/01H7N3AF457675A/雞/加利福尼亞/905/01H6N2AY259220A/雞/河北/1/01H9N2AY180600A/雞/南昌/3-201/01H3N6AY422029A/鴨/北海道/86/01H2N3AY241662A/火雞/VA/67/02H7N2AY300998A/鴨/NY/191255-59/02H5N8AY300995A/火雞/CA/D0208651-C/02H5N2AY303645A/雞/智利/4322/03H7N3AY342424A/雞/荷蘭/1/03H7N7AY611528A/雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY609316A/雞/廣東/174/04H5N1AY590580A/雞/佛統/泰國/CU-K2/2004H5N1表19F流感A病毒NP轉錄本(從禽類分離得到的菌株)M63779A/FPV/都布森(Dobson)/′荷蘭′/27H7N7AJ243993A/FPV/羅斯託克/34H7N1M22576A/FPV/羅斯託克/34H7N1M21937A/FPV/羅斯託克/34H7N1M24660A/FPV/羅斯託克/34(突變株ts19)H7N1M24556A/FPV/羅斯託克/34(回復突變株19R)H7N1M24557A/FPV/羅斯託克/34(回復突變株81R)H7N1M24453A/雞/德國/N/49H10N7M63773A/鴨/馬尼託巴/1/53H10N7M63780A/鴨/英國/1/56H11N6M30762A/鴨/捷克斯洛伐克/56H4N6M30763A/鴨/烏克蘭/2/60H11N8M30767A/燕鷗/南非/61H5N3M63781A/鴨/英國/1/62H4N6AF156415A/火雞/加利福尼亞/189/66H9N2M63774A/火雞/安大略/7732/66H5N9M63775A/鴨/賓夕法尼亞/1/69H6N1M27298A/鸌(shearwater)/澳大利亞/72H6N5M27519A/燕鷗/土庫曼斯坦(Turkmenia)/18/72H3N3M22344A/鸚鵡/阿爾斯特(Ulster)/73H7N1M63776A/鴨/孟菲斯/928/74H3N8M22573A/鴨/香港/7/75H3N2M36812A/針尾鴨/比摩治(Primorje)/695/76H2N3AF523423A/鴨/香港/86/76H9N2U49093A/鵝/香港/8/76H1N1M30760A/鴨/紐西蘭/31/76H4N6U49097A/鴨/香港/193/77H1N2M63777A/海鷗/馬裡蘭/5/77H11N9M30765A/虎皮鸚鵡/北海道/1/77H4N6M22574A/鴨/巴伐利亞/2/77H1N1M27521A/海鷗/馬裡蘭/704/77H13N6M76603A/火雞/英國/647/77H1N1M63782A/鴨/北京/1/78H3N6AF523421A/鴨/香港/289/78H9N2AF523424A/鴨/香港/366/78H9N2D00050A/野鴨/紐約/6750/78H2N2M30755A/海鷗/馬裡蘭/1824/78H13N9AF523422A/鴨/香港/552/79H9N2U49095A/鴨/香港/717/79H1N3M30761A/灰水鴨/澳大利亞/2/79H4N4M30756A/海鷗/馬裡蘭/1815/79H13N6M63783A/鴨/澳大利亞/749/80H1N1AF079571A/鴨/北海道/8/80H3N8M30752A/海鷗/麻薩諸塞州/26/80H13N6M30757A/海鷗/明尼蘇達/945/80H13N6M63784A/水鴨/冰島/29/80H7N7M30769A/火雞/明尼蘇達/833/80H4N2M63778A/火雞/明尼蘇達/I661/81H1N1M63785A/野鴨/阿斯特拉罕(古裡耶夫)/263/82H14N5M30764A/野鴨/阿斯特拉罕/244/82H14M30768A/雞/賓夕法尼亞/1/83H5N2AY633119A/野鴨/艾伯塔/743/83H9N1M30753A/海鷗/阿斯特拉罕/227/84H13N6AY633311A/野鴨/艾伯塔/98/85H6N2AY633319A/針尾鴨/艾伯塔/113/85H6N2M30766A/翻石鷸/新澤西/47/85H4N6Z26855A/蠣鷸/德國/87H1N1AY633279A/野鴨/艾伯塔/321/88H9N2M76609A/火雞/北卡羅來納(NorthCarolina)H1N1/1790/88AJ427301A/彎嘴濱鷸/香港/208/89H10N5AY633295A/野鴨/艾伯塔/11/91H9N2AY633167A/野鴨/艾伯塔/17/91H9N2Z26857A/火雞/德國/3/91H1N1U49094A/鴨/南昌/1749/92H11N2AF156410A/鵪鶉/香港/AF157/92H9N2AY633191A/野鴨/艾伯塔/203/92H6N5AF156414A/鵪鶉/阿肯色州/29209-1/93H9N2AY633335A/針尾鴨/艾伯塔/179/93H6N1AF156409A/雞/北京/1/94H9N2AY497120A/雞/希達爾戈(Hidalgo)/232/94H5N2AF098624A/雞/希達爾戈/26654-1368/94H5N2AF156408A/雞/香港/739/94H9N2AF098625A/雞/墨西哥/26654-1374/94H5N2AY497113A/雞/墨西哥/31381-7/94H5N2AF098627A/雞/普韋布洛(Puebla)/14585-622/94H5N2AY497114A/雞/普韋布洛/8623-607/94H5N2AF098626A/雞/普韋布洛/8623-607/94H5N2AY633383A/美洲潛鴨/艾伯塔/291/94H6N8AY633239A/野鴨/艾伯塔/232/94H6N8AY633303A/野鴨/艾伯塔/76/94H6N8AY633327A/針尾鴨/艾伯塔/155/94H6N8AF536699A/雞/北京/1/95H9N2AF213906A/雞/義大利/24/95H1N1AY497117A/雞/普韋布洛/28159-474/95H5N2AF098628A/雞/奎雷塔洛(Queretaro)/14588-19/95H5N2AF508600A/鴨/德國/113/95H9N2AF213905A/野鴨/義大利/24/95H1N1AF508596A/鴕鳥/南非/9508103/95H9N2AB020778A/雞/北京/1/96H9N2AF536703A/雞/河北/1/96H9N2AF156412A/雞/韓國/25232-96006/96H9N2AF156411A/雞/韓國/38349-p96323/96H9N2AF203787A/雞/韓國/MS96/96H9N2AF508613A/雞/山東/6/96H9N2AF144303A/鵝/廣東/1/96H5N1AY633207A/野鴨/艾伯塔/206/96H6N8AF508617A/鵪鶉/上海/8/96H9N2AF156413A/水鳥/德拉瓦/9/96H9N2AY633183A/野鴨/艾伯塔/202/96H2N5AF536700A/雞/北京/2/97H9N2AF508607A/雞/廣東/11/97H9N2AF536702A/雞/廣東/97H9N2AF508609A/雞/黑龍江/10/97H9N2AF046084A/雞/香港/220/97H5N1AF098618A/雞/香港/728/97H5N1AF098619A/雞/香港/786/97H5N1AF098620A/雞/香港/915/97H5N1AF156403A/雞/香港/G23/97H9N2AF156402A/雞/香港/G9/97H9N2AF098617A/雞/香港/y388/97H5N1AF319644A/雞/義大利/312/97H5N2AF319645A/雞/義大利/330/97H5N2AF319646A/雞/義大利/367/97H5N2AF319647A/雞/義大利/9097/97H5N9AF508615A/雞/深圳/9/97H9N2AF508612A/雞/四川/5/97H9N2AF250473A/鴨/香港/P185/97H3N8AF250474A/鴨/香港/P54/97H11N9AF250470A/鴨/香港/T25/97H11N8AF250471A/鴨/香港/T37/97H11N8AF156405A/鴨/香港/Y280/97H9N2AF156406A/鴨/香港/Y439/97H9N2AF098621A/鴨/香港/p46/97H5N1AF098622A/鴨/香港/y283/97H5N1AF508616A/鴨/南京/1/97H9N2ISDN22474A/鴨/新加坡/645/97H5N3AF370122A/鵝/廣東/3/97H5N1AF250475A/鵝/香港/W217/97H6N9AF098623A/鵝/香港/w355/97H5N1AF508603A/雉/愛爾蘭/PV18/97H9N2AF156404A/鴿子/香港/Y233/97H9N2AF156407A/鵪鶉/香港/G1/97H9N2AF250480A/水鴨/香港/W312/97H6N1AF057293A/雞/香港/258/97H5N1AY633135A/野鴨/艾伯塔/117/97H3N8AB049161A/長尾小鸚鵡(parakeet)/千葉(Chiba)H9N2/1/97AY633343A/針尾鴨/艾伯塔/156/97H3N8AY633367A/針尾鴨/艾伯塔/22/97H2N9AY633391A/水鴨/艾伯塔/16/97H2N9AF250472A/水鳥/香港/M603/98H11N1AF508605A/雞/北京/8/98H9N2AF508599A/雞/德國/R45/98H9N2AF536704A/雞/河北/2/98H9N2AF536705A/雞/河北/3/98H9N2AF508608A/雞/河北/4/98H9N2AF536706A/雞/河南/98H9N2AY497116A/雞/普韋布洛/231-5284/98H5N2AF536708A/雞/山東/98H9N2AY253753A/雞/上海/F/98H9N2AY497115A/雞/阿瓜卡連特(Aguascalientes)H5N2/124-3705/98AY633199A/野鴨/艾伯塔/205/98H2N3AY633215A/野鴨/艾伯塔/211/98H1N1AY633231A/野鴨/艾伯塔/226/98H2N3AY633247A/野鴨/艾伯塔/242/98H3N8AY633255A/野鴨/艾伯塔/279/98H3N8AY633263A/野鴨/艾伯塔/295/98H4N6AY633271A/野鴨/艾伯塔/30/98H4N6AY633287A/野鴨/艾伯塔/47/98H4N1AB049162A/長尾小鸚鵡/成田(Narita)/92A/98H9N2AF536701A/雞/北京/3/99H9N2AF222619A/雞/香港/FY20/99H9N2AF222620A/雞/香港/KC12/99H9N2AF222616A/雞/香港/NT16/99H9N2AF186272A/雞/香港/SF2/99H9N2AF508601A/雞/伊朗/11T/99H9N2AF508604A/雞/韓國/99029/99H9N2AF536707A/雞/遼寧/99H9N2AF508611A/雞/寧夏/5/99H9N2AJ291394A/雞/巴基斯坦/2/99H9N2AF508597A/雞/巴基斯坦/4/99H9N2AF508598A/雞/巴基斯坦/5/99H9N2AF508602A/雞/沙烏地阿拉伯/532/99H9N2AF508614A/雞/石家莊/2/99H9N2AF216736A/環境/香港/437-10/99H5N1AF216712A/環境/香港/437-4/99H5N1AF216720A/環境/香港/437-6/99H5N1AF216728A/環境/香港/437-8/99H5N1AF222618A/雉/香港/SSP11/99H9N2AF222615A/鴿子/香港/FY6/99H9N2AF222614A/鵪鶉/香港/A17/99H9N2AF186270A/鵪鶉/香港/NT28/99H9N2AF222617A/鵪鶉/香港/SSP10/99H9N2AF186271A/絲羽烏骨雞(SilkyChicken)/香港H9N2/SF43/99AF222621A/絲羽烏骨雞/香港/SF44/99H9N2AY038019A/火雞/MO/24093/99H1N2AJ427298A/水鳥/香港/399/99H3N8AF261750A/雞/臺灣/7-5/99H6N1AY585429A/鴨/廣西/07/1999H5N1AJ410555A/鴨/香港/3096/99H6N2AJ410556A/鴨/香港/3461/99H6N1AY633127A/野鴨/艾伯塔/111/99H4N6AY633175A/野鴨/艾伯塔/199/99H3N6AY633223A/野鴨/艾伯塔/215/99H6N8AJ410548A/雉/香港/SH39/99H6N1AY633351A/針尾鴨/艾伯塔/207/99H4N8AY633359A/針尾鴨/艾伯塔/210/99H4N6AY633375A/針尾鴨/艾伯塔/37/99H3N8AJ410549A/鵪鶉/香港/1721-20/99H6N1AJ410550A/鵪鶉/香港/1721-30/99H6N1AJ627488A/火雞/義大利/4603/1999H7N1AY180580A/矮腳雞/南昌/9-366/2000H3N3AF474069A/雞/加利福尼亞/650/00H6N2AF508606A/雞/廣東/10/00H9N2AF508610A/雞/河南/62/00H9N2AY180581A/雞/南昌/1-0016/2000H9N2AY180545A/雞/南昌/12-220/2000H3N6AY180527A/雞/南昌/12-301/2000H3N6AY180554A/雞/南昌/2-0527/2000H4N6AY180539A/雞/南昌/3-0128/2000H4N6AY180531A/雞/南昌/4-008/2000H4N6AY180562A/雞/南昌/4-010/2000H9N2AY180529A/雞/南昌/7-010/2000H3N6AY180535A/雞/南昌/9-220/2000H3N6AY059497A/鴨/香港/2986.1/2000H5N1AY059494A/鴨/香港/ww381/2000H5N1AY059495A/鴨/香港/ww461/2000H5N1AY180584A/鴨/南昌/1-0070/2000H9N2AY180549A/鴨/南昌/10-096/2000H3N6AY180553A/鴨/南昌/10-383/2000H3N6AY180583A/鴨/南昌/10-389/2000H9N2AY180542A/鴨/南昌/11-197/2000H9N2AY180544A/鴨/南昌/11-290/2000H9N2AY180537A/鴨/南昌/11-392/2000H9N2AY180586A/鴨/南昌/12-280/2000H3N6AY180524A/鴨/南昌/2-0147/2000H4N6AY180557A/鴨/南昌/2-0485/2000H2N9AY180558A/鴨/南昌/2-0486/2000H2N9AY180573A/鴨/南昌/2-0492/2000H2N9AY180574A/鴨/南昌/3-090/2000H2N9AY180572A/鴨/南昌/4-165/2000H4N6AY180559A/鴨/南昌/4-173/2000H4N6AY180568A/鴨/南昌/4-184/2000H2N9AY180571A/鴨/南昌/4-190/2000H2N9AY180570A/鴨/南昌/4-191/2000H4N6AY180534A/鴨/南昌/7-092/2000H9N2AY180547A/鴨/南昌/8-174/2000H3N6AY180546A/鴨/南昌/8-197/2000H3N6AY180532A/鴨/南昌/8-198/2000H3N6AY180526A/鴨/南昌/9-091/2000H3N6AY180579A/鴨/南昌/9-385/2000H3N6AF523413A/鴨/汕頭/1042/00H9N2AF523410A/鴨/汕頭/1043/00H9N2AF523425A/鴨/汕頭/1588/00H9N1AF523420A/鴨/汕頭/1881/00H9N2AF523426A/鴨/汕頭/2030/00H9N1AF523415A/鴨/汕頭/2102/00H9N2AF523411A/鴨/汕頭/2134/00H9N2AF523419A/鴨/汕頭/2143/00H9N2AF523417A/鴨/汕頭/2144/00H9N2AF523416A/鴨/汕頭/830/00H9N2AY059498A/鵝/香港/3014.8/2000H5N1AF398419A/鵝/香港/385.3/2000H5N1AF398420A/鵝/香港/385.5/2000H5N1AY059492A/鵝/香港/ww26/2000H5N1AY059493A/鵝/香港/ww28/2000H5N1AY059496A/鵝/香港/ww491/2000H5N1AY180530A/鴿子/南昌/11-045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303/2004H5N1AY651486A/Dk/印度尼西亞/MS/2004H5N1AY651496A/Dk/泰國/71.1/2004H5N1AY651509A/Dk/越南/11/2004H5N1AY650273A/GSC雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY648290A/GSC雞B/英國哥倫比亞/04H7N3AY651497A/Gs/泰國/79/2004H5N1AY651533A/Ph/ST/44/2004H5N1AY651494A/Qa/泰國/57/2004H5N1AY651495A/鳥/泰國/3.1/2004H5N1AY611527A/雞/英國哥倫比亞/04H7N3AY646081A/雞/英國哥倫比亞/GSC人類B/04H7N3AY609313A/雞/廣東/174/04H5N1AY684707A/雞/湖北/327/2004H5N1AY653196A/雞/吉林/9/2004H5N1AY590579A/雞/佛統/泰國/CU-K2/2004H5N1AY574189A/雞/越南/HD1/2004H5N1AY574192A/雞/越南/HD2/2004H5N1AY576931A/美洲家鴨/越南/MdGL/2004H5N1AY651528A/遊隼(peregrinefalcon)H5N1/HK/D0028/2004實例18通過高通量篩選識別高度有效的siRNA細胞培養.使人類肺上皮細胞A-549(ATCC)在含有10％熱滅活胎牛血清(FCS)、2mML-穀氨醯胺、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的DMEM培養基中生長。也可使用得自氣道的其他細胞系，諸如Calu-3或HBE細胞(ATCC)，或其他細胞系。使細胞在37℃下，在具有5％CO2的溼潤培養箱中生長。siRNA.設計併合成各種siRNA，各siRNA含有具有與表16中列出的高度保守標靶部分完全互補的19核苷酸抑制區的反義鏈和與反義鏈互補的有義鏈。siRNA在兩條鏈上都含有3′dTdT突出端。所有siRNA都是通過DharmaconResearch(Lafayette，CO)，使用2′ACE保護化學合成得到。通過製造商將siRNA去保護、脫鹽和退火。通過雙螢光素酶分析識別高度有效的siRNA.根據製造商的說明書(參見第329號PromegaTechnicalBulletin，可在www.promega.com/tbs/tb329/tb329.pdf上得到)，將對應於有關流感病毒轉錄本，即來自PR8病毒的NP、PA、PB1、PB2、M、NS、NA或HA基因的全長cDNA克隆到psiCHECKTM-2載體中(目錄號C8021，Promega，Madison，WI)。將cDNA插入經過優化以用於哺乳動物細胞中的表達的合成海腎螢光素酶基因(Renillaluciferasegene)(hLuc)的3′UTR中。根據製造商的說明書，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)將靶向cDNA插入物的DNA和siRNA(或非特異性sicontrol，Dharmacon)共轉染到A-549細胞中。轉染後，轉錄海腎基因與流感病毒基因的融合體。轉染24小時後作為各siRNA的量的函數來測量螢光素酶活性。在此分析中，由與融合轉錄本的標靶部分(即，融合轉錄本的流感特異性部分)雜交的siRNA或shRNA介導的RNAi引起融合海腎流感病毒基因轉錄本的降解，從而降低螢光素酶信號。如PromegaTechnicalBulletin329中所述，從相同載體表達的螢光蟲螢光素酶用作轉染對照和特異性對照。具體地說，轉染24小時後，將溶解物和底物緩衝液(Dual-Glo螢光素酶分析系統)添加到細胞中，並且讀取螢光素酶活性。10min後，添加用於海腎的StopandGlo並且讀取海腎螢光素酶活性。各樣品進行三次。來自各孔的螢光蟲螢光素酶活性用作相同孔中海腎的轉染對照。海腎/螢光蟲螢光素酶活性的比率用作來自各孔的螢光素酶活性的終值。將來自三份流感siRNA的比率的平均值與三份sicontrol的平均值比較。將抑制百分比計算為100×(1-流感siRNA/sicontrol)。表26呈現篩選中識別的許多高度有效的siRNA的數據。該表列出了siRNA的標靶基因(NP、PA、PB1、PB2)、siRNA濃度和ID號。siRNAID一欄列出了所測試的各濃度下的平均抑制百分比。空白處表示未進行實驗。結果表明，許多siRNA甚至在低達0.6nM的濃度時抑制轉錄本表達至少80％。表26標靶基因NP標靶基因PA標靶基因PB1標靶基因PB2如本文中其它地方所述，另外在如實例19中所述的組織培養物和/或動物模型中，針對流感病毒測試使用上述篩選識別為高度有效的某些siRNA和/或shRNA。實例19通過篩選識別抑制病毒複製的高度有效的siRNA細胞培養.使Vero細胞(ATCC)在含有10％熱滅活胎牛血清(FCS)、2mML-穀氨醯胺、100單位/ml青黴素和100ug/ml鏈黴素的DMEM培養基中生長。使細胞在37℃下，在具有5％CO2的溼潤培養箱中生長。病毒感染是在含有0.3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO)、10mMHepes、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的DMEM中進行。siRNA.設計併合成siRNA，其含有具有與表18中列出的高度保守標靶部分中的每一個部分完全互補的19核苷酸抑制區的反義鏈和與反義鏈互補的有義鏈。siRNA在兩條鏈上都含有3′dTdT突出端。所有siRNA都是通過DharmaconResearch(Lafayette，CO)，使用2′ACE保護化學合成得到。通過製造商將siRNA去保護、脫鹽和退火。siRNA轉染.將Vero細胞的對數期培養物胰蛋白酶化，洗滌並且以每孔20,000個細胞接種於96孔板中，並且在37℃下，在具有5％CO2的溼潤培養箱中培養過夜。對於第一次篩選，將10pmol的siRNA(具有dTdT3′突出端的19bp雙鏈體區)添加到25μl的Opti-MEMI(Invitrogen)中。將0.75μl的Lipofectamine2000(Invitrogen)和0.19μlSuperRNAsin(Ambion)稀釋於25μl的Opti-MEMI中，並且輕輕混合。將經稀釋的脂質與經稀釋的siRNA組合(總體積是50μl)，並且在室溫下將混合物培養20min以形成siRNA-Lipofectamine2000複合物。在培養結束時，用吸液管將50μl轉染複合物吸取到含有細胞和50μl含10％FCS的DMEM培養基的各孔中。各siRNA的最終濃度是100nM。將各siRNA測試三次，並且將結果取平均值。NP-1496(100nM)和sicontrol(Dharmacon)分別用作正對照和負對照。除使用濃度1nM的siRNA外，以相同方式執行siRNA轉染的第二次篩選。病毒感染.在37℃下，在具有5％CO2的溼潤培養箱中培養6小時後，除去上清液並且在25μl含有0.3％BSA的PBS中用PR8病毒感染各孔中的細胞。在0.1的MOI下執行感染用於第一次和第二次篩選。在室溫下輕輕搖動板1h，之後將175μl含有0.3％BSA、4μg胰蛋白酶、10mMHEPES的DMEM添加到各孔中。然後在37℃下，在具有5％CO2的溼潤培養箱中培養所述板。病毒滴度的測量.感染24小時後收集上清液。如上文所述測量病毒滴度。結果為了從一組215種靶向流感基因組的高度保守標靶部分的所選siRNA中識別具有較高活性的siRNA，執行了一系列高通量篩選(HTS)。不直接測試siRNA是否可抑制其特異標靶基因的表達，而是決定集中於評估siRNA抑制細胞中流感病毒產生的能力。因此，雖然認識到某些不會顯著降低病毒滴度的siRNA仍可能擁有降解標靶mRNA的能力並因此適用於某些用途，但是仍使用病毒滴度作為讀出數據。在第一次HTS中測試的215種siRNA中，相對於無處理(NT)或sicontrol來說，90種顯示PR8病毒滴度至少降低4倍。當vero細胞是經100nM的sicontrol轉染時，未見到非特異性抑制。轉染效率為約80％。結果概括於表21中，並且就病毒滴度的倍數抑制來進行表示。實際抑制程度可能比表中所呈現的大。表21高通量篩選#1的結果使用較低濃度的siRNA(1nM)執行第二次高通量篩選，以便從在第一次HTS中顯示病毒滴度的至少4倍降低的siRNA中更精確地識別高度有效的siRNA。當在所述較低濃度測試時，30種siRNA顯示Vero細胞培養物中的PR8病毒滴度降低約3到4倍。第二次HTS的結果呈現於表22中。表22高通量篩選#2的結果實例20確認siRNA篩選材料和方法在MDCK細胞中測試選自第二次HTS的30種siRNA和來自第一次HTS的一些siRNA，以確認所述結果。將不含血清的RPMI1640培養基中的1千萬個MDCK細胞與最終濃度100nM的siRNA混合，並且在400V和975μF下，使用電穿孔儀(Bio-Rad)進行電穿孔。將經過電穿孔的細胞分到6孔板的3個孔中，並且在含有10％胎牛血清的DMEM中培養6小時。然後除去培養基，並且將100微升的在由DMEM、0.3％BSA、10mMHepes、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素組成的感染培養基中的PR8病毒添加到各孔中。對3孔中的每個孔來說，分別在0.2、0.02和0.002的MOI下執行感染。在室溫下培養1h後，將含有4μg/ml胰蛋白酶的2ml感染培養基添加到各孔中，並且在37℃下，在5％CO2下培養細胞。在感染後的各時間點，從受感染的培養物收集上清液並且通過血球凝集分析測定病毒滴度。結果為了確認在第一次和第二次篩選中所識別的高度有效的siRNA抑制流感病毒產生的能力，在MDCK細胞中執行第三次篩選。與Vero細胞相比，MDCK細胞對甚至更小量的由流感病毒的實驗菌株所引起的感染敏感。病毒粒子在MDCK細胞比在Vero細胞中的複製快很多。所述在MDCK細胞中的第三次篩選另外比較siRNA在病毒抑制中的效率，並且確認前兩次篩選的結果，準確度為約85-90％。在MOI＝0.2時，3種NPsiRNA在感染24小時後使病毒滴度降低至少16倍。4種NPsiRNA(包括上述3種NPsiRNA)、2種PB2、3種PB1和4種PAsiRNA使病毒滴度降低至少8倍。以下siRNA是所測試的13種最有效的siRNA154、758、1121、1313、2327、3276、4276、5018、5457、7736、7803、8282和8286。在MOI＝0.02時，8種NP、2種PB2、3種PB1和8種PAsiRNA(包括在MOI＝0.2時有效的siRNA)在感染24小時後使病毒滴度降低至少8倍。在MOI＝0.002時，10種NP、8種PB2、11種PB1、10種PAsiRNA(包括在MOI＝0.02時有效的有效siRNA)在感染24小時後使病毒滴度降低至少4倍。對於sicontrolsiRNA未觀察到病毒抑制。篩選的結果呈現於表23中。各列分別顯示在MOI＝0.2/0.02/0.002下，感染後的時間24、36、48和在一些情況下60小時時的HA單位。將板以成組形式測試，並且sicontrol是各組測試的對照siRNA。NT＝無處理。最有效的siRNA以黑體顯示。表23高通量篩選#3的結果實例21siRNA劑量反應測試材料和方法在MDCK細胞中測試選自第三次HTS的13種siRNA和來自第二次HTS的一些siRNA的劑量反應。將在不含血清的RPMI1640培養基中的1千萬個MDCK細胞與處於0.8nM到100nM的範圍內的各種siRNA濃度的siRNA混合。在400V和975μF下，通過使用電穿孔儀(Bio-Rad)將siRNA電穿孔到細胞中。將經過電穿孔的細胞分到6孔板的3個孔中，並且在含有10％胎牛血清的DMEM中培養6小時。然後除去培養基，並且將100微升的在由DMEM0.3％BSA、10mMHepes、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素組成的感染培養基中的PR8病毒添加到各孔中，以獲得對3孔的每個孔來說0.2、0.02和0.002的MOI。在室溫下培養1h後，將2ml含有4μg/ml胰蛋白酶的感染培養基添加到各孔中，並且在37℃下，在5％CO2下培養細胞。在感染後的不同時間，從受感染的培養物收集上清液並且通過如上文所述的血球凝集分析測定病毒滴度。結果在MOI＝0.2和MOI＝0.02時，在感染24小時後抑制病毒產生2倍的siRNA的最小濃度如下，其中星號表示如實例1所述而識別的siRNA。作為標靶的NP基因片段1540.8nM7581nM11211nM13130.8nM14995nMNP1496*4nM作為標靶的PB2基因片段23271nM32761nM作為標靶的PB1基因片段42761nM50185nM54575nM57735nMPB1-2257*5nM作為標靶的PA基因片段77365nM78031nM82825nM82865nM結果是依據對於各種siRNA濃度，在0.2/0.02/0.002的MOI下，感染24、36或48小時後的HA單位而顯示於表24中。表24劑量反應篩選結果實例22使用siRNA組合對流感病毒的有效抑制測試選自第三次HTS的某些siRNA和來自第二次HTS的一些siRNA的組合形式的抗流感作用。如實例21中所述執行轉染、感染和病毒滴度測試。1499和4276一起在12.5nM下用各種siRNA轉染與在25nM下單獨的1499或4276相比，稍微更有效地抑制病毒產生。表25組合形式的siRNA的作用實例23通過將裸siRNA直接遞送到呼吸系統中抑制流感病毒材料和方法如實例12中所述執行siRNA製備、病毒感染、肺收集和流感病毒滴度分析。使用異氟醚(通過吸入投與)麻醉小鼠。通過鼻內點滴遞送為50μl體積的siRNA。使用學生T測試計算p值。結果將在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的siRNA(NP-1496)投與成組小鼠(每組5隻小鼠)中。在siRNA投與3小時後用流感病毒(2000PFU)感染小鼠。感染後24小時收集肺並且測量病毒滴度。在初步實驗中，用阿佛丁麻醉小鼠並且通過鼻內點滴投與2mg/kg的siRNA。觀察到相對於對照組，病毒滴度降低，不過未達到統計顯著性(數據未顯示)。在第二次實驗中，使用異氟醚/O2麻醉黑色瑞士小鼠。將各種量的在PBS中的siRNA經鼻內途徑投與小鼠中，每隻小鼠50μl。3個不同組(每組5隻小鼠)通過鼻內點滴接受2mg/kg、4mg/kg或10mg/kg劑量的在PBS中的siRNA。僅接受PBS的第四組用作對照。3小時後，再次使用異氟醚/O2麻醉小鼠，將30μl的PR8病毒(2000pfu＝4×致死劑量)經鼻內途徑投與小鼠中。感染24h後，收集小鼠肺，均質化並且如上文所述通過估算TCID50來測量病毒滴度。對肺勻漿進行連續5倍稀釋而不是10倍稀釋。在3個處理組的各處理組與對照組的小鼠之間看到病毒滴度的顯著和劑量依賴性差異。在分別接受2mg/kg、4mg/kg和10mg/kg劑量的組中，病毒滴度相對於對照組降低3.45倍(p＝0.0125)、4.16倍(p＝0.0063)和4.62倍(p＝0.0057)。個別小鼠的數據(TCID50)呈現於表27中並且顯示於圖31A中。總之，這些結果證明，在不存在增強遞送的特定試劑的水性培養基中，遞送到的呼吸系統中的siRNA的功效。表27裸siRNA的鼻內遞送抑制流感病毒產生實例24通過將裸siRNA直接遞送到呼吸系統中抑制小鼠中的流感病毒產生本實例確認實例23的結果並且證明，通過在不存在增強遞送的試劑的水性培養基中，將靶向NP的siRNA投與呼吸系統中抑制了肺中的流感病毒產生。除在siRNA遞送2小時後，用PR8病毒以鼻內方式感染小鼠，每隻小鼠1000pfu外，基本上按實例23中所述，將在PBS中的6μg、15μg、30μg和60μg的NP-1496siRNA或60μg的GFP-949siRNA經鼻內途徑滴注到小鼠中。感染24小時後收集肺。如表28和圖31B中所示，當通過鼻內滴注法在不存在遞送劑的水性培養基中投與時，NP特異性siRNA有效抑制流感病毒。在3個處理組的各處理組與對照組中的小鼠之間看到病毒滴度的顯著和劑量依賴性差異。表28使用裸siRNA抑制肺中的流感病毒產生實例25靶向流感病毒轉錄本的siRNA允許標靶區中的錯配本實例證明，反義鏈在抑制區內(例如，與標靶轉錄本互補的19鹼基對區內)與靶向轉錄本小於100％互補的siRNA介導有效的抑制。結果證明，本文中描述的RNAi藥劑將有效抑制序列在標靶部分內與PR8的序列不同的廣泛範圍的流感菌株。材料和方法使用如實例18中所述的雙螢光素酶分析，來評估siRNA抑制在19核苷酸抑制區內與siRNA反義鏈不100％互補的流感基因表達的能力。使用定點突變試劑盒(Stratagene)，將由人類和禽流感病毒株(使用PR8作為標準)的比對所得到的錯配引入DNA載體(psiCHECK)中，也就是說，對流感標靶位點加以修飾以包括相對於PR8序列的1或2個差異，特定差異對應於表15中列出的人類或禽流感菌株的一種或一種以上菌株中所見的差異。表29顯示實驗的結果，證明病毒NP標靶(NP-1496的標靶)的變化實質上不降低RNAi活性。(所示數據是三次的平均值)。測試了在接近反義鏈的5′或3′端或接近中間的位置處的錯配。表29反義鏈與標靶區之間的錯配對NP-1496抑制作用的影響表30顯示實驗的結果，證明病毒PA標靶(PA-2087或PA-8242的標靶)的變化實質上不降低RNAi活性。(所示數據為三次的平均值)。然而，157種人類流感菌株的7種中所見的G18到A18突變實質上影響了RNA幹擾活性。(所示數據是三次的平均值)。測試了在接近反義鏈的5′或3′端或接近中間的位置處的錯配。反義鏈抑制區與標靶之間2個錯配的存在使抑制作用降低約70-75％，但仍觀察到有效程度的抑制。表30反義鏈與標靶區之間的錯配對PA-2087或PA-8242抑制作用的影響表31顯示實驗的結果，證明病毒PB2標靶(PB2-3817的標靶)的變化實質上不降低RNAi活性。(所示數據是三次的平均值)。表31反義鏈與標靶區之間的錯配對PB2-3817抑制作用的影響表32A顯示實驗的結果，證明病毒PB1標靶(PB1-6124的標靶)的變化實質上不降低RNAi活性。(所示數據是三次的平均值)。測試了在接近反義鏈的5′或3′端或接近中間的位置處的錯配。反義鏈抑制區與標靶之間2個錯配的存在使抑制作用降低約70-75％，但仍觀察到有效程度的抑制。表32A反義鏈與標靶區之間的錯配對PB1-6124抑制作用的影響表32B顯示另一個實驗的結果，證明病毒PB1標靶(PB1-6124的標靶)的變化實質上不降低RNAi活性。(所示數據是三次的平均值)。測試了接近反義鏈的5′或3′端的位置處的錯配。反義鏈抑制區與標靶之間2個錯配的存在實質上不降低RNAi活性。表32B反義鏈與標靶區之間的錯配對PB1-6124抑制作用的影響表32C顯示另一個實驗的結果，證明病毒PB1標靶(PB1-6129的標靶)的變化實質上不降低RNAi活性。(所示數據是三次的平均值)。測試了在接近反義鏈的5′或3′端或接近中間的位置處的錯配。在位置10處的錯配(G:U擺動)對抑制僅具有相對小影響，在本文中證明在位置10處的所述錯配實質上不降低RNAi活性。反義鏈抑制區與標靶之間2個錯配的存在適度地降低抑制，但仍觀察到原始抑制作用的約60-70％。表32C反義鏈與標靶區之間的錯配對PB1-6129抑制作用的影響實例26經修飾SiRNA介導有效的抑制為探究含有經修飾核苷酸的siRNA的抑制潛力，合成含有在各條鏈中的交替核糖核苷酸處具有2′-O-甲基修飾的有義鏈和反義鏈的NP-1496siRNA，並且與未修飾NP-1496siRNA比較測試。經2′-O-甲基修飾的NP1496siRNA序列如下(2′-O-甲基顯示為經修飾核苷酸前面的「m」)有義5′-GmGAmUCmUUmAUmUUmCUmUCmGGmAGdTdT-3′(SEQIDNO381)反義5′-mCUmCCmGAmAGmAAmAUmAAmGAmUCmCdTdT-3′(SEQIDNO382)按照製造商的說明書，使用lipofectamine2000(Invitrogen)將經2′-O-甲基修飾的NP1496siRNA和未修飾的NP1496siRNA轉染到24孔板中的Vero細胞中。轉染6小時後，吸出培養基。在0.1的MOI下，用200μl的PR8接種細胞。在感染24、36和48小時後收集培養物上清液。按上文所述測定病毒滴度。經2′-O-甲基修飾的NP1496顯示比未修飾的NP1496稍微更大的病毒生長抑制。結果顯示在表33中。表33使用經修飾siRNA有效抑制流感病毒產生實例27用於識別高度有效siRNA的篩選和測試總結收集並組合上文所述的篩選和活體外和活體內測試的結果，產生為高度保守的和為高度有效siRNA的標靶的流感病毒序列的總清單。標靶部分的清單呈現於表34中。這些序列也是例如siRNA的某些高度有效RNAi誘導劑的反義鏈抑制區的互補體。表34為高度有效RNAi誘導實體的標靶的高度保守流感病毒序列均等論所屬領域的技術人員將認識到或能夠僅使用常規實驗法來確定本文所述的本發明具體實施例的許多等效情況。本發明的範圍不限於上述說明書，而是由附隨權利要求書來限定。參考文獻1.Lamb，R.A.和R.M.Krug.2001.Orthomyxoviridaethevirueseandtheirreplication.FundamentalVirologyEd.D.M.Knipe&P.M.Hpwley725-770。2.Simonsen，L.，K.Fukuda，L.B.Schomberger和N.J.Cox.2000.Theimpactofinfluenzaepidemicsonhospitalizations.J.Infect.Dis，181831-837。3.Webster，R.G.，W.J.Bean，O.T.Gorman，T.M.Chambers和Y.Kawaoka.1992.EvolutionandecologyofinfluenzaAviruses.Microbiol.Rev.56152-179。4.Parvin，J.D.，A.Moscona，W.T.Pan，J.M.Leider和P，Palese.1986.MeasurementofthemutationratesofanimalvirusesinfluenzaAvirusandpoliovirustype1，J.Virol.59377-383。5.Smith，F.L.和P.Palese.1989.Variationininfluenzavirusgenesepidemiology，pathogenic和evolutionaryconsequences.TheinfluenzavirusesKrug，R.M.編NewYorkPlenum。6.Webster，R.G.，W.G.Laver，G.M.air和S.G.C.1982.Molecularmechanismsofvariationininfluenzaviruses.Nature296115-121。7.Webby，R.J.和R.G.Webster.2001.EmergenceofinfluenzaAviruses.Phil.Trans.R.Soc.Lond.3561817-1828。8.Patterson，K.D.和G.F.Pyle.1991.Thegeographyandmortalityofthe1918influenzapandemic.Bull.Hist.Med.654-21。9.Taubenberger，J.K.，A.H.Reid，T.A.Janczewski和T.G.GFannin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長度的片段。4.根據權利要求1所述的RNAi誘導劑，其是包含個別核酸鏈的siRNA，所述核酸鏈的一條或兩條鏈包含位於其3′處的單鏈突出端。5.根據權利要求1所述的RNAi誘導劑，其是包含形成雙鏈體的單一核酸的第一和第二核酸部分的shRNA，其中所述第一和第二核酸部分通過單鏈核酸部分連接在一起，並且其中所述雙鏈體另外包含單鏈突出端。6.一種RNAi誘導劑，其除核酸部分的序列相對於根據權利要求1所述的RNAi誘導劑的核酸部分而言在1或2個位置上不同以外，與所述RNAi誘導劑相同。7.一種載體，其包含用於轉錄根據權利要求1所述的RNAi誘導劑的模板，其中所述模板可操作連接至啟動子。8.一種治療或預防流感病毒感染的方法，其包含向有需要的受檢者投與根據權利要求7所述的RNAi誘導劑。9.一種組合物，其包含根據權利要求1所述的RNAi誘導劑和遞送劑。10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述遞送劑是陽離子聚合物。11.根據權利要求10所述的組合物，其中所述陽離子聚合物選自由以下聚合物組成的群組PEI、PLL、PLA和聚(β)氨基酯。12.一種治療或預防流感病毒感染的方法，其包含向有需要的受檢者投與根據權利要求1所述的RNAi誘導劑。13.一種診斷流感的方法，其包含以下步驟確定受檢者是否受對根據權利要求1所述的RNAi誘導劑的抑制作用敏感的流感病毒感染。14.根據權利要求13所述的方法，其另外包含向所述受檢者投與所述RNAi誘導劑的步驟。15.一種RNAi誘導劑，其靶向選自由以下基因組成的群組的流感病毒基因聚合酶蛋白質PB1基因、聚合酶蛋白質PB2基因、聚合酶蛋白質PA基因和核蛋白NP基因。16.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述基因是PB1。17.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述基因是PB2。18.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述基因是PA。19.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述基因是NP。20.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述藥劑靶向為RNAi的功能優選標靶部分的基因的標靶部分。21.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述藥劑靶向所述基因的適當保守標靶部分。22.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述藥劑靶向所述基因的高度保守標靶部分。23.根據權利要求15所述的RNAi誘導劑，其中所述RNAi誘導劑包含與所述流感病毒基因的標靶部分在至少15個連續核苷酸上100％互補的核酸部分，其中所述標靶部分是RNA的功能優選標靶。24.一種RNAi誘導劑，其除核酸部分相對於根據權利要求23所述的RNAi誘導劑的核酸部分在1或2個位置上不同以外，與所述RNAi誘導劑相同。25.一種載體，其包含用於轉錄根據權利要求15所述的RNAi誘導劑的模板。26.一種分離核酸或其互補體，其序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列，或包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列具有至少16個核苷酸長度的片段，其中所述核酸具有100個核苷酸或100個以下核苷酸的長度。27.根據權利要求26所述的核酸，其中所述序列包含選自由SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、309、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366組成的群組的序列，或包含選自由SEQIDNO274、286、287、292、297、298、304、305、310、311、319、324、327、334、346、347、360、361、364和366組成的群組的序列具有至少16個核苷酸長度的片段，其中所述核酸具有100個核苷酸或100個以下核苷酸的長度。28.根據權利要求26所述的核酸，其中所述序列包含選自由SEQIDNO297、309、310、311、346、347、364和366組成的群組的序列，或包含選自由SEQIDNO297、310、311、346、347、364和366組成的群組的序列具有至少16個核苷酸長度的片段，其中所述核酸具有100個核苷酸或100個以下核苷酸的長度。29.根據權利要求26所述的核酸，其中所述序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列。30.根據權利要求26所述的分離核酸，其另外包含連接到所述核酸的可檢測部分。31.一種RNAi誘導劑，其包含根據權利要求26所述的核酸。32.一種載體，其包含用於轉錄根據權利要求26所述的RNAi誘導劑的模板。33.一種具有序列n1-n2-n3-n4-n5-n6-n7-n8-n9-n10-n11-n12-n13-n14-n15-n16-n17-n18-n19(N19)的分離核酸，所述序列與選自由以下基因組成的群組的流感病毒基因的一部分相同聚合酶蛋白質PB1基因、聚合酶蛋白質PB2基因、聚合酶蛋白質PA基因和核蛋白NP基因，或不同之處在於在任何位置允許A為G或C為U的差異；僅在位置n1、n18允許G到為或C到為的差異，和/或在N19與所述流感病毒之間存在0、1、2或3個之間的差異，有不超過2個連續差異；並且在N19與所述流感病毒之間最多存在1個差異。34.一種RNAi誘導劑，其靶向根據權利要求33所述的核酸。35.一種RNAi誘導劑，其包含根據權利要求33所述的核酸。36.一種載體，其包含用於轉錄根據權利要求33所述的RNAi誘導劑的模板。37.一種診斷受檢者流感的方法，其包含以下步驟確定所述受檢者是否受對RNAi誘導實體的抑制作用敏感的流感病毒株感染。38.根據權利要求37所述的方法，其另外包含以下步驟向所述受檢者投與所述RNAi誘導實體。39.根據權利要求37所述的方法，其中所述確定步驟包含實施基於核酸的診斷分析。40.一種診斷試劑盒，其包含引物或探針，其檢測流感病毒基因的標靶部分的至少部分，所述標靶部分為RNAi的適當保守標靶部分。41.根據權利要求40所述的診斷試劑盒，其中所述適當保守標靶部分包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列。42.一種抑制哺乳動物受檢者的組織或器官中基因表達的方法，其包含以下步驟不使用水動力轉染技術，將包含有效量的靶向所述基因的RNAi誘導劑的組合物直接引入所述受檢者的血管系統中。43.根據權利要求42所述的方法，其中所述器官是肺。44.根據權利要求42所述的方法，其中所述組合物包含陽離子聚合物。45.根據權利要求42所述的方法，其中所述基因是感染呼吸道上皮細胞的病毒的基因。46.根據權利要求45所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。47.根據權利要求42所述的方法，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。48.根據權利要求42所述的方法，其中所述有效量使所述基因的表達降低至少2倍。49.一種抑制哺乳動物受檢者的呼吸系統中病毒產生的方法，其中所述病毒感染呼吸道上皮細胞，所述方法包含以下步驟不使用水動力轉染技術，通過注射將包含有效量的靶向所述病毒基因的RNAi誘導劑的組合物引入所述受檢者的血管系統中。50.根據權利要求49所述的方法，其中所述組合物包含陽離子聚合物。51.根據權利要求49所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。52.根據權利要求49所述的方法，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。53.根據權利要求49所述的方法，其中在未受所述病毒感染的受檢者感染之前將所述組合物投與所述受檢者，並且其中當所述受檢者隨後被感染時，所述組合物有效抑制所述病毒的產生。54.一種抑制哺乳動物受檢者的肺中基因表達的方法，其包含以下步驟將包含有效量的靶向所述基因的RNAi誘導劑和遞送劑的組合物直接引入所述受檢者的呼吸系統中。55.根據權利要求54所述的方法，其中所述組合物是經鼻內投與。56.根據權利要求54所述的方法，其中所述組合物通過吸入投與。57.根據權利要求54所述的方法，其中所述組合物包含陽離子聚合物。58.根據權利要求54所述的方法，其中所述基因是感染呼吸道上皮細胞的病毒的基因。59.根據權利要求58所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。60.根據權利要求54所述的方法，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。61.根據權利要求54所述的方法，其中所述有效量使所述基因的表達降低至少2倍。62.根據權利要求54所述的方法，其中所述組合物基本上不含增強遞送的聚合物和脂質。63.一種抑制哺乳動物受檢者的呼吸系統中病毒產生的方法，其中所述病毒感染呼吸道上皮細胞，所述方法包含以下步驟將包含有效量的靶向所述病毒基因的RNAi誘導劑的組合物直接引入所述受檢者的呼吸系統中。64.根據權利要求63所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。65.根據權利要求63所述的方法，其中所述組合物是經鼻內投與。66.根據權利要求63所述的方法，其中所述組合物是通過吸入投與。67.根據權利要求63所述的方法，其中所述組合物包含陽離子聚合物。68.根據權利要求63所述的方法，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。69.根據權利要求63所述的方法，其中所述有效量使所述病毒的產生降低至少25％。70.根據權利要求63所述的方法，其中所述組合物基本上不含增強遞送的聚合物和脂質。71.根據權利要求63所述的方法，其中在未受所述病毒感染的受檢者感染之前將所述組合物投與所述受檢者，並且其中當所述受檢者隨後被感染時，所述組合物有效抑制所述病毒的產生。72.一種轉基因非人類動物，其表達靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導劑。73.根據權利要求72所述的轉基因非人類動物，其中所述動物是禽類。74.一種RNAi誘導劑的用途，其用於製造治療或預防流感病毒感染的藥劑，其包含向有需要的受檢者投與所述RNAi誘導劑，其中所述RNAi誘導劑包含核酸部分，其序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列、其互補體、或任一具有至少15個核苷酸長度的片段，並且其中所述模板可操作連接至啟動子。75.一種RNAi誘導劑的用途，其用於製造治療或預防流感病毒感染的藥劑，其包含向有需要的受檢者投與所述RNAi誘導劑，其中所述RNAi誘導劑包含核酸部分，其序列包含選自由SEQIDNO272-380組成的群組的序列、其互補體、或任一具有至少15個核苷酸長度的片段。76.一種RNAi誘導劑的用途，其用於製造抑制哺乳動物受檢者的組織或器官中基因表達的藥劑，其包含不使用水動力轉染技術將包含有效量的靶向所述基因的RNAi誘導劑的組合物直接引入所述受檢者血管系統中的步驟。77.根據權利要求76所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述器官是肺。78.根據權利要求76所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物包含陽離子聚合物。79.根據權利要求76所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述基因是感染呼吸道上皮細胞的病毒基因。80.根據權利要求76所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述病毒是流感病毒。81.根據權利要求76所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。82.根據權利要求76所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述有效量使所述基因的表達降低至少2倍。83.一種RNAi誘導劑的用途，其用於製造抑制哺乳動物受檢者的呼吸系統中病毒產生的藥劑，其中所述病毒感染呼吸道上皮細胞，所述用途包含不使用水動力轉染技術通過注射將包含有效量的靶向所述病毒基因的RNAi誘導劑的組合物引入所述受檢者的血管系統中的步驟。84.根據權利要求83所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物包含陽離子聚合物。85.根據權利要求83所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述病毒是流感病毒。86.根據權利要求83所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。87.根據權利要求83所述的RNAi誘導劑的用途，其中在未受所述病毒感染的受檢者感染之前將所述組合物投與所述受檢者，並且其中當所述受檢者隨後被感染時，所述組合物有效抑制所述病毒的產生。88.一種RNAi誘導劑的用途，其用於製造抑制哺乳動物受檢者肺中基因表達的藥劑，其包含將包含有效量的靶向所述基因的RNAi誘導劑和遞送劑的組合物直接引入所述受檢者的呼吸系統中的步驟。89.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物是經鼻內投與。90.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物是通過吸入投與。91.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物包含陽離子聚合物。92.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述基因是感染呼吸道上皮細胞的病毒的基因。93.根據權利要求92所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述病毒是流感病毒。94.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。95.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述有效量使所述基因的表達降低至少2倍。96.根據權利要求88所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物基本上不含增強遞送的聚合物和脂質。97.一種RNAi誘導劑的用途，其用於製造抑制哺乳動物受檢者的呼吸系統中病毒產生的藥劑，其中所述病毒感染呼吸道上皮細胞，所述用途包含將包含有效量的靶向所述病毒基因的RNAi誘導劑的組合物直接引入所述受檢者的呼吸系統中的步驟。98.根據權利要求97所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述病毒是流感病毒。99.根據權利要求97所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物是經鼻內投與。100.根據權利要求97所述的RNAi誘導劑的用途，其中所述組合物是通過吸入投與。101.根據權利要求97所述的用途，其中所述組合物包含陽離子聚合物。102.根據權利要求97所述的用途，其中所述有效量介於每千克受檢者體重大約0.1mg與5mg之間。103.根據權利要求97所述的用途，其中所述有效量使所述病毒的產生降低至少25％。104.根據權利要求97所述的用途，其中所述組合物基本上不含增強遞送的聚合物和脂質。105.根據權利要求97所述的用途，其中在未受所述病毒感染的受檢者感染之前將所述組合物投與所述受檢者，並且其中當所述受檢者隨後被感染時，所述組合物有效抑制所述病毒的產生。全文摘要本發明提供包含靶向流感病毒轉錄本的RNAi誘導實體和各種遞送劑中的任一種遞送劑的組合物。本發明另外包括使用所述組合物抑制流感病毒的生物活性和/或治療或預防流感的方法。本發明提供對在從人類宿主和/或禽類宿主分離得到的多種流感病毒A菌株中的RNAi適當保守標靶部分序列，和靶向所述適當保守標靶部分的RNAi誘導實體，例如siRNA和shRNA。本發明提供各種核酸，其包含與所述適當保守標靶部分序列中的一種或一種以上序列的至少一部分相同或互補的序列。本發明另外提供將RNAi誘導劑遞送到哺乳動物受檢者的器官或組織(例如，肺)的方法和組合物。也提供診斷流感和測定流感病毒對RNAi誘導劑的抑制作用的敏感性的方法。本發明的另一個方面針對表達靶向流感基因的RNAi誘導劑的轉基因動物。文檔編號C12N15/11GK101180395SQ200680017734公開日2008年5月14日申請日期2006年3月22日優先權日2005年3月22日發明者陳建竹,清葛,赫爾曼·N·艾森申請人:麻省理工學院