具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的製作方法

2023-05-12 12:35:51

專利名稱：：具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用所述多肽的方法。相關技術描述植物細胞壁多糖構成植物細胞壁的90%並且能夠分成以下三組纖維素、半纖維素和果膠。纖維素是細胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細胞壁中第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。植物細胞壁中存在的木聚糖的結構取決於它們的來源可能差異顯著，但是它們總是含有β-1，4-連接的D-木糖主鏈。β-1，4-連接的D-木糖主鏈能夠被多個側基取代，所述側基如L-阿拉伯糖基(L-arabinosyl)、D_半乳糖基、乙醯基、阿魏醯基(feruloyl)、對-香豆醯基(p-coumaroyl)和葡糖醛酸基殘基。木聚糖的生物降解依賴於兩類降解木聚糖主鏈的酶內切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖主鏈切割成較小的寡糖，這些寡糖能夠進一步通過β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。含木聚糖材料的生物降解還需要輔助的(accessory)的酶活性，其從木糖主鏈去除非木糖的取代基，例如，葡糖醛酸取代基。上述輔助的酶活性包括，例如，乙醯木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和對-香豆酸酯酶。α-葡糖醛酸糖苷酶是由幾種微生物天然產生的，所述微生物包括裡氏木黴(Trichodermareesei)RutC30(Siika-aho等，1994,EnzymeMicrob.Technol.16813-819)、綠色木黴(Trichodermaviride)(Ishihara等，1990，Bull.For.&For.Prod.Res.Inst.359:141-157),黑麴黴(Aspergillusniger)(Uchida等，1992，Biosci.Biotech.Biochem.56:1608-1615)>to^1β(Thermoascusaurantiacus)(Khandke等，1989，Arch.Biochem.Biophys.274:511-517)和熱厭氧桿菌屬菌種(Thermoanaerobacteriumsp.)菌株JW/SL-YS485(Shao等，1995,Appl.Environ.Microbiol.61:1077-1081)。WO1997/043423公開了來自麴黴屬(Aspergillus)的α-葡糖醛酸糖苷酶。幾個報導顯示了木聚糖酶、β木糖苷酶和α-葡糖醛酸糖苷酶之間在分解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖(glucuronoarabinoxylans)中的協同作用(Siika-aho等，1994，見上)。因此，α-葡糖醛酸糖苷酶可應用於半纖維素的完全水解而產生木糖(Uchida等，1992，J.Ferment.Bioeng.74153-158)。本發明涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。
發明內容本發明涉及選自下組的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽(a)包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少65%同一性的胺基酸序列的多肽；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中等嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性的核苷酸序列；和(d)包含取代、缺失和/或插入一個或多個(數個)胺基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。本發明還涉及選自下組的分離的多核苷酸，其編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%同一性的胺基酸序列；(b)多核苷酸，其在至少中等嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性的核苷酸序列；和(d)編碼變體的多核苷酸，所述變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(數個)胺基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，並涉及產生具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的方法。本發明還涉及抑制細胞中具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽表達的方法，包括向所述細胞施用或在所述細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發明的多核苷酸的亞序列。本發明還涉及這樣的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地所述dsRNA為siRNA或miRNA分子。本發明還涉及包含編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的分離多核苷酸的植物。本發明還涉及產生具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的方法，包括(a)在有助於所述多肽產生的條件下，培養轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼所述具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及使用具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽降解或轉化含木聚糖材料或纖維素材料的方法。本發明還涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含SEQIDNO2的胺基酸1至15，或由SEQIDNO2的胺基酸1至15組成；涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、表達載體和重組宿主細胞；以及涉及產生蛋白質的方法。附圖簡述圖IA和IB顯示特異腐質黴(Humicolainsolens)DSM1800家族67α-葡糖酸酸糖苷酶基因的基因組DNA序列和推導的胺基酸序列(分別為SEQIDNOs:1和2)。圖2顯示pHinsGH67A的限制圖譜。定義α-葡糖醛酸糖苷酶活性術語「α-葡糖醛酸糖苷酶活性」在本文中定義為α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解活性(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖苷酸水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據deVries,1998,J.Bacteriol.180243-249確定的。一個單位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等於能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出1μmol葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。本發明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的α-葡糖醛酸糖苷酶活性的至少20%，優選至少40%，更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70%，更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少100%。家族67糖苷水解酶術語「家族67糖苷水解酶」或「家族GH67」或「GH67」在本文中定義為根據HenrissatB·,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,禾口HenrissatB.禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬於糖苷水解酶家族67的多肽。木聚糖降解活性術語「木聚糖降解活性」或「木聚糖分解活性」在本文中定義為降解含木聚糖材料的生物學活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎方法包括(1)測定總木聚糖分解活性，和(測定單獨的木聚糖分解活性(內切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結於幾個公開文獻中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes，2006，JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova禾口Biely，2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune，FEBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely禾口Kubicek，1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375—381。總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測定，所述木聚糖包括燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beectiwood)和落葉松木(Iarctiwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測定。最常見的總木聚糖分解活性測定法基於從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產生還原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。就本發明而言，木聚糖降解活性是通過測定由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalCo.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的Iml反應液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對羥基苯甲酸醯胼(PHBAH)測定法進行糖分析。木聚糖酶活性術語「木聚糖酶活性」在本文中定義為1，4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(Ε.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中l，4-i3-D-木糖苷鍵的內水解。就本發明而言，木聚糖酶活性是使用樺木木聚糖作為底物確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在50°C,pH5從每升2g樺木木聚糖作為底物在50mM乙酸鈉，0.01%TWEEN20中水解的起始期間每分鐘產生1.Oymol還原糖(以葡萄糖當量(glucoseequivalents)測定，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述)。β-木糖苷酶活性術語「β-木糖苷酶活性」在本文中定義為β-D木糖苷木糖水解酶(Ε.C.3.2.1.37)，其催化短β(1—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續的D-木糖殘基。就本發明而言，一個單位的木糖苷酶活性定義為在40°C，pH5從ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷作為底物在IOOmM檸檬酸鈉，0.01%TWEEN20中每分鐘產生1.Oμmo1對硝基苯酚。纖維素分解活性術語「纖維素分解活性」在本文中定義為水解纖維素材料的生物學活性。測定纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測定總纖維素分解活性，和(2)測定單獨的纖維素分解活性(內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶)，如^iang等，OutlookforcellulaseimprovementScreeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvancesM:452-481所綜述的。總纖維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括WhatmanNo.1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經預處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用WhatmanNo.1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由hternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。就本發明而言，纖維素分解活性通過測定在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解蛋白/g的PCS中纖維素在50-65°C進行3-7日，與未添加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。通常條件為1ml反應液，經洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉，pH5，ImMMnSO4,50-65°C，72小時，通過AMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)進行糖分析。內切葡聚糖酶術語「內切葡聚糖酶」在本文中定義為內-1，4_(1，3;1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣澱粉中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合型β-1，3-葡聚糖如穀物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纖維素成分的植物材料中β-1，4-鍵的內水解。內切葡聚糖酶活性可基於底物粘度的減少或通過還原糖測定法確定的還原端的增加來確定(Zhang等，2006，BiotechnologyAdvances24:452-481)。就本發明而言，內切葡聚糖酶活性使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據Ghose,1987，PureandApp1.Chem.59:257-268的方法加以確定。纖維二糖水解酶術語「纖維二糖水解酶」在本文中定義為l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4_β-D-葡糖苷鍵的水解，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:NewinsightintothefunctionofeellobiohydroIases,TrendsinBiotechnology15160-167；Teeri等，1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose？，Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發明而言，纖維二糖水解酶活性是依照vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters149:152-156以及vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288所述的方法對螢光性二糖衍生物4-甲基傘形酮醯基-β-D-乳糖苷G-methylumbelliferyl-β-D-Iactoside)確定的。β-葡糖苷酶術語「β-葡糖苷酶」在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，並釋放β-D-葡萄糖。就本發明而言，β-葡糖苷酶活性是根據Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilumproduction,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.4255-66所述的基本方法來測定的，只是如本文所述使用了不同的條件。一個單位的葡糖苷酶活性定義為在IOOmM檸檬酸鈉、0.01%TWEEN20中，在40°C、pH5條件下從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分鐘產生1.O微摩爾對硝基苯酚。纖維素分解增強活性術語「纖維素分解增強活性」在本文中定義為下述生物學活性，即其增強具有纖維素分解活性的多肽對纖維素材料的水解。就本發明而言，纖維素分解增強活性通過測定由於纖維素分解蛋白對纖維素材料在下述條件下進行的水解造成的還原糖的增加或總纖維二糖和葡萄糖的增加來確定l_50mg的總蛋白質/g的PCS中纖維素，其中總蛋白質包含50-99.5%w/w纖維素分解蛋白和0.5-50%w/w纖維素分解增強活性蛋白，在50-65°C進行1-7日，與具有相等的總蛋白質加載量但無纖維素分解增強活性的對照水解相比較(l-50mg的纖維素分解蛋白/g的PCS中纖維素)。在一個優選的方面，將在3%總蛋白質重量的米麴黴(Aspergillusoryzae)β-葡糖苷酶(根據TO02/095014在米麴黴中重組產生)或3%總蛋白質重量的煙麴黴(Aspergillusfumigatus)β-葡糖苷酶(根據WO02/095014所述在米麴黴中重組產生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST1.5L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物用作所述纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強活性的多肽具有GH61多肽的成熟多肽的纖維素分解增強活性的至少20%，優選至少40%，更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70%，更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少100%。所述具有纖維素分解增強活性的多肽通過將達到同等水解程度所需的纖維素分解酶的量減少至少1.01倍，更優選至少1.05倍，更優選至少1.10倍，更優選至少1.25倍，更優選至少1.5倍，更優選至少2倍，更優選至少3倍，更優選至少4倍，更優選至少5倍，甚至更優選至少10倍，且最優選至少20倍來增強由具有纖維素分解活性的蛋白質催化的對纖維素材料的水解。含木聚糖材料術語「含木聚糖材料」在本文中定義為任何包含植物細胞壁多糖的材料，所述多糖包含β-(1-4)連接的木糖殘基的主鏈。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-木吡喃糖(beta-(1-4)-D-xylopyranose)主鏈的雜聚物，其具有短糖鏈的分支。它們包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多種寡糖，包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖。木聚糖類型的多糖可分為同木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan)，後者包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖、阿拉伯木聚糖和複雜的雜木聚糖。參見，例如，Ebringerova等，2005，Adv.Polym.Sci.186:1_67。在本發明的方法中，可使用任何含木聚糖的材料。在一個優選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。纖維素材料所述纖維素材料可以是任何含有纖維素的材料。生物質的初生細胞壁中主要的多糖是纖維素，豐度第二高的是半纖維素，第三是果膠。在細胞停止生長後產生的次生細胞壁也含有多糖，並且通過與半纖維素共價交聯的多聚體木質素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，並因此是一種直鏈i3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有複雜的分枝結構和一系列取代基。雖然纖維素一般是無定形的，但植物組織中發現的纖維素主要為平行葡聚糖鏈的不溶性晶體基質。半纖維素通常通過氫鍵鍵合於纖維素以及其它半纖維素上，其有助於細胞壁基質的穩定化。纖維素通常存在於例如植物的莖、葉、殼(hulls)、皮(husks)和穗軸(cobs)，或者樹的葉、枝、和木材等之中。纖維素材料可以是，但不限於，草本材料(herbaceousmaterial)、農業殘餘物(agriculturalresidues)、林業殘餘物(forestryresidues)、城市固體廢物(municipalsolidwastes)、廢紙(wastepaper)，以及紙漿和造紙廠殘餘物(pulpandpapermillresidue)。(參見例如Wiselogel等，1995,於HandbookonBioethanol(CharlesΕ·Wyman編)，第105-118頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719;Mosier等，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,-fAdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper總編，第65卷，第23-40頁，Springer-Verlag，NewYork)。在本文中應當理解，纖維素可為木素纖維素的形式，即在混合的基質中包含木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優選的方面，所述纖維素材料是木素纖維素。在一方面，所述纖維素材料為草本材料。在另一方面，所述纖維素材料為農業殘餘物。在另一方面，所述纖維素材料為林業殘餘物。在另一方面，所述纖維素材料為城市固體廢物。在另一方面，所述纖維素材料為廢紙。在另一方面，所述纖維素材料為紙漿和造紙廠殘餘物。在另一方面，所述纖維素材料為玉米秸稈。在另一方面，所述纖維素材料為玉米纖維。在另一方面，所述纖維素材料為玉米穗軸。在另一方面，所述纖維素材料為橙皮。在另一方面，所述纖維素材料為稻稈。在另一方面所述纖維素材料為麥稈。在另一方面，所述纖維素材料為柳枝稷(switchgrass)。在另一方面，所述纖維素材料為芒草屬(miscanthus)。在另一方面，所述纖維素材料為甘蔗渣。在另一方面，所述纖維素材料是微晶纖維素。在另一方面，所述纖維素材料是細菌纖維素。在另一方面，所述纖維素材料是藻類纖維素。在另一方面，所述纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一方面，所述纖維素材料是無定形的經磷酸處理的纖維素。在另一方面，所述纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用，或者可以使用本領域已知的常規方法(如本文中所述的)進行預處理。在一個優選的方面，所述纖維素材料經過預處理。預處理玉米秸稈術語「PCS」或「預處理的玉米秸稈」在本文中定義為通過用熱和稀硫酸處理從玉米秸稈得到的纖維素材料。分離的多肽如本文使用的術語「分離的多肽」指從來源分離的多肽。在一個優選的方面，如通過SDS-PAGE測定的，所述多肽為至少1%純，優選至少5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，並且最優選至少90%純。基本上純的多肽術語「基本上純的多肽」在本文表示多肽製備物，所述多肽製備物含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然或重組結合的(associated)其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽按存在於製備物中的全部多肽材料的重量計是至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%純，最優選至少99.5%純，並且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即所述多肽製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過如下實現通過公知的重組方法或通過經典純化方法製備多肽。成熟多肽術語「成熟多肽」在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯後修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之後的最終形式存在的多肽。在一個方面，基於預測SEQIDNO2的胺基酸1-15是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering101-6)，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的胺基酸16-861。成熟多肽編碼序列術語「成熟多肽編碼序列」在本文中定義為編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個方面，基於預測SEQIDNO:1的核苷酸1-45編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上文)，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸46-2583。同一性兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數「同一性」來描述。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)(優選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定的。使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性並且如下計算(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上)(優選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmsch，1970，見上)測定。使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性並且如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)同源序列術語「同源序列」在本文中定義為用SEQIDNO2的特異腐質黴α-葡糖醛酸糖苷酶或其成熟多肽，在tfasty檢索(Pearson,W.R.，1999，於BioinformaticsMethodsandProtocols,S.Misener和S.A.Krawetz編，185-219頁)中具有小於0.001的E值(或預期分數)的預測蛋白質。多肽片段術語「多肽片段」在本文定義為從SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個(數個)胺基酸的多肽；其中所述片段具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個優選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少730個胺基酸殘基，更優選至少770個胺基酸殘基，並且最優選至少810個胺基酸殘基。亞序列術語「亞序列(subsequence)」在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5'和/或3'端缺失了一個或多個(數個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽片段。在一個優選的方面，亞序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少2190個核苷酸，更優選至少2310個核苷酸，並且最優選至少Μ30個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術語「等位變體」在本文中表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸如本文使用的術語「分離的多核苷酸」指從來源分離的多核苷酸。在一個優選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優選至少5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，並且最優選至少90%純。基本上純的多核苷酸如本文使用的術語「基本上純的多核苷酸」指多核苷酸製備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，並且處於適於在遺傳工程蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5』和3』非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%，並且甚至最優選至少99.5%純的。本發明的多核苷酸優選為基本上純的形式，即所述多核苷酸製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用於本文時術語「編碼序列」的意思是直接指定其蛋白產物的胺基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術語「cDNA」在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少可能存在於相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然後作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體如本文使用的術語「核酸構建體」指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。調控序列(controlsequence)術語「調控序列」在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的所有組分。各個調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和目的為引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區的連接。可操作地連接術語「可操作地連接」在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語「表達載體」在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語「宿主細胞」包括任何細胞類型，所述細胞類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)0修飾術語「修飾」在本文的意思是，對包含SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的多肽或者由SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(數個)胺基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語「人工變體」的意思是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為幹預(humanintervention)，通過修飾SEQIDNO1中公開的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發明詳述具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽在第一個方面，本發明涉及包含下述胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性(下文中的「同源多肽」)。在一個優選的方面，所述同源多肽包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個胺基酸，優選相差五個胺基酸，更優選相差四個胺基酸，甚至更優選相差三個胺基酸，最優選相差兩個胺基酸，並且甚至最優選相差一個胺基酸。本發明的多肽優選包含SEQIDNO2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。在一個優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在另一優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一優選的方面，多肽包含SEQIDNO2的胺基酸16至861，或其等位變體；或它們的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段。在另一優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸16至861。在另一優選的方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體，或它們的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段組成。在另一優選的方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成。在另一優選的方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另一優選的方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸16至861或其等位變體，或它們的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段組成。在另一優選的方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸16至861組成。在第二個方面，本發明涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優選極低嚴格條件、更優選低嚴格條件、更優選中嚴格條件、更優選中-高嚴格條件、甚至更優選高嚴格條件、和最優選非常高嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO2的胺基酸序列或其片段，可用於設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬或種的菌株鑑定和克隆編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用於根據標準的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定並從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14個，優選至少25個，更優選至少35個，並且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核酸探針長度上是至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優選至少600個核苷酸，更優選至少700個核苷酸，甚至更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用％PJH、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針涵蓋在本發明中。因而，可從由這些其它菌株製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交並且編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳或通過其它分離技術分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並v且固定於其上。為了鑑定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優選用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈；或其亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸46-2583。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50155中的質粒pHinsGH67A中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。在另一優選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50155中的質粒pHinsGH67A中含有的成熟多肽編碼區。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和低嚴緊性為25%的甲醯胺、對於中和中-高嚴緊性為35%的甲醯胺、或對於高和非常高嚴緊性為50%的甲醯胺，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至M小時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優選在45°C(非常低嚴緊性)，更優選在50°C(低嚴緊性)，更優選在55°C(中嚴緊性)，更優選在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優選在65°C(高嚴緊性)，並且最優選在70°C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比使用*艮據Bolton禾PMcCarthy計算法(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計算出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM磷酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌最佳12至M小時。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.SDS中洗滌一次15分鐘，並使用6XSSC在比計算出的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發明涉及由如下多核苷酸編碼的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、甚至更優選至少90%、最優選至少95%、並且甚至最優選至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成，其編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。參見本文多核苷酸部分。在第四個方面，本發明涉及人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(或數個)胺基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；或其同源序列。優選地，胺基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature)，即保守的胺基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；通常為1至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的胺基酸取代是本領域已知的，並且由例如H.Neurath和R.L.Hi11，1979，於TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個標準胺基酸，非標準胺基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸可以取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質合成後已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結構。非天然胺基酸能夠以化學方法合成，並且優選是商業上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供選擇的是，胺基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(Cunningham和Wells，1989，ScienceM4:1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，並且測試所得突變分子的生物活性(即，α-葡糖醛酸糖苷酶活性)以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271=4699-4708酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點胺基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309:59-64.必需胺基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後是有關的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53-57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或W095/2^25公開的那些方法來進行並測試單個或多個胺基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利5，223，409號；WO92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，並且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個胺基酸殘基的重要性，並且能夠應用於未知結構的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽的胺基酸取代、缺失和/或插入的總數是10，優選9，更優選8，更優選7，更優選至多6，更優選5，更優選4，甚至更優選3，最優選2，並且甚至最優選1。具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的來源本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發明而言，用於本文與給定的來源有關的術語「獲得自」，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。在一個優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Ehterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬O^seudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)多肽，所述多肽具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)>I^jv^ifelflif(Bacillusamyloliquefaciens)菌(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的不產色鏈黴菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈黴菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈黴菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈黴菌(Streptomyceslividans)多月太。本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽也可以是真菌多肽，並且更優選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍黴屬(Yarrowia)多肽，其具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性；或更優選絲狀真菌多肽如枝頂孢黴屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、麴黴屬(Aspergillus)>短梗黴屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)>金包子菌屬(Chrysosporium)>Claviceps>Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)>Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、β急叢赤殼菌屬(Cryphonectria)>隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤黴屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質霄屬(Humicola)、奉巴齒菌屬(Irpex)、蘑範屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛霄屬(Mucor)、毀絲霄屬(Myceliophthora)、新考瑪脂黴屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青黴屬(Paecilomyces)、青黴屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia>j[xHlifM(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha>f艮毛黴屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬/嗜熱黴屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸黴屬(Tolypocladium)、木黴屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性。在一個優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的解纖維枝丁頁？包黴(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱麴黴(Aspergillusaculeatus)、^^ffiβ(Aspergillusawamori)Λffiβ(Aspergillusfumigatus)Λ1ffiβ(Aspergillusfoetidus)、曰本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、漂麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(Aspergillusoryzae)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、杆抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾穀德抱(Fusariumcerealis)、庫威,廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾鬥德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木,廉抱(Fusariumsambucinum)、膚色,廉？包(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮？包(Fusariumsulphureum)、圓鐮孢(Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、^■€#(Mucormiehei)、口f%gig_(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈？包菌(Neurosporacrassa)、繩狀青黴(Penicilliumfuniculosum)、產紫青黴(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium))^(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zhtMJfe_(Thielaviaterrestris)、3^^7^(Trichodermaharzianum)、^^7^(Trichodermakoningii)、長枝木黴(Trichodermalongibrachiatum)、裡氏木黴(Trichodermareesei)或綠色木黴(Trichodermaviride)多肽。在另一優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的灰色腐質黴(Humicolagrisea)、特異腐質黴(Humicolainsolens)或疏棉狀腐質黴(Humicolalanuginosa)月太。在一個最優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的特異腐質黴多肽。在一個最優選的方面，所述多肽是具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的特異腐質黴DSM1800多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽。可理解的是對於前述的種，本發明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域的技術人員會容易地識別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養物保藏機構對於公眾能夠容易地取得，所述保藏機構如美國典型培養物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑑定和獲得這些多肽。用於從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨後可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。本發明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合於本發明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，並包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，並且使所述融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白釋放具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限於，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-576；Svetina，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-ffilsonφ,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等』1995,Biotechnology13:498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基後通過因子fe蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸後通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,ProteinsStructure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg後通過凝血酶切割Gtevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln後通過TEV蛋白酶切割Gtevens，2003，見上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln後通過遺傳工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Mevens，2003，見上)。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在一個優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1或由SEQIDNO1組成。在另一更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLΒ-50155中所含質粒pHinsGH67A中含有的序列，或由該序列組成。在另一優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成。在另一優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸46-2583或由SEQIDNO1的核苷酸46-2583組成。在另一更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50155中所含質粒pHinsGH67A中含有的成熟多肽編碼序列或由該成熟多肽編碼序列組成。本發明還涵蓋編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO2的胺基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的胺基酸序列或其成熟多肽組成；由於遺傳密碼的簡併性，所述核苷酸序列不同於SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的SEQIDNO2的片段。本發明還涉及突變的多核苷酸，其在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDNO2的成熟多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特徵的克隆DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基於核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從腐質黴屬菌株，或另外的或相關的生物體克隆所述多核苷酸，並且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發明還涉及分離的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多核苷酸編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽「基本上相似」指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同於從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的胺基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苷酸取代的概述，參見，例如，Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95一107。對於本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對於分子功能重要的區域之外進行，並且仍然產生活性多肽。對於由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的並且因此優選不進行取代的胺基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(參見，例如，Curminghan^PWfells，1989，見上)來鑑定。在後一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，並且測試所得突變分子的α-葡糖醛酸糖苷酶活性，以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上；Smith等，1992，見上；Wlodaver等，1992，見上)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴格條件下，優選低嚴格條件，更優選中嚴格條件，更優選中-高嚴格條件，甚至更優選高嚴格條件，並且最優選非常高的嚴格條件下，與下述雜交SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈，或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定義的。本發明還涉及通過如下獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴格條件下，將DNA的群體與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(數個)調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可以用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以供多肽的表達。依賴於表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是適當的啟動子序列，其是由用於表達編碼本發明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍鏈黴菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α_澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtac(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21—25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"TScientificAmerican，1980，242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上中描述。用於指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、裡氏木黴β-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶IV、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對於酵母宿主細胞有用的其它啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，其是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3』末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對於酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對於酵母宿主細胞有用的其它終止子由Romanos等，1992，見上描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5』-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。對於酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，宿主細胞將其識別為向轉錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶。對於酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的信號肽，並且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5』端可固有地包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列與編碼分泌多肽的編碼序列區段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5』端可含有對於所述編碼序列為外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養基中)的任何信號肽編碼序列可在本發明中使用。對於細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對於絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶、特異腐質黴內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質黴脂肪酶。對於酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上描述。在一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO2的胺基酸1至15或由SEQIDNO2的胺基酸1至15組成。在另一優選的方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至45或由SEQIDNO1的核苷酸1至45組成。調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位於多肽氨基末端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前(多)肽通常是無活性的並且能夠通過從前多肽催化或自催化切割所述前肽而轉化為成熟活性多肽。前肽編碼序列可從如下酶的基因獲得枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(W095/33836)。當信號肽和前肽序列二者均出現在多肽的氨基末端時，使前肽序列的位置緊接著(nextto)多肽氨基末端，並且使信號肽序列的位置緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些調節序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(數個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在適當的用於表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發明的多核苷酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，從而將該編碼序列與適當的表達用調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個(數個)選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性。對於酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷醯轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優選用在麴黴屬細胞中的是構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發明的載體優選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或允許載體在細胞中獨立於基因組自主複製。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至10，000鹼基對，優選400至10，000鹼基對，並且最優選800至10，000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主複製，載體可以還包含複製起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地複製。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(r印licator)，其在細胞中發揮功能。術語「複製起點」或「質粒複製子」在本文定義為能夠使質粒或載體體內複製的核苷酸序列。細菌複製起點的實例是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的複製起點。用於酵母宿主細胞中的複製起點的實例是2微米複製起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的複製起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據WO00/24883中公開的方法完成。可以將多於一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因包括於多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，從而也含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，其包含本發明的分離的多核苷酸可操作地連接於一個或多個(幾個)調控序列，其指導具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的肽的產生。將包含本發明的多核苷酸的構建體或載體引入宿主細胞從而將所述載體作為染色體整合體或作為自複製的染色體外載體保持，如前文所述。術語「宿主細胞」包含親本細胞的任何子代，其因為在複製過程中發生的突變而與該親本細胞不同。宿主細胞的選擇在很大程度上會依賴於編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發明的多肽的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限於，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限於，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌細胞。在本發明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限於，嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在更優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限於，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優選方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈黴菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈黴菌屬細胞包括但不限於，不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍鏈黴菌、灰色鏈黴菌和淺青紫鏈黴菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是不產色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈黴菌細胞。可通過如下方法實現將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5271—5278)。可通過如下方法實現將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈黴菌屬細胞例如原生質體轉化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實現將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質體轉化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用任何本領域已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。「真菌」用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，於AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第八版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上)。在更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。「酵母」用在本文包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內抱黴目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬於半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，會將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在甚至更加優選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬細胞。在一個最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍黴(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在一個甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬、麴黴屬、短梗黴屬、煙管黴屬(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質黴屬、梨孢菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸黴屬、栓菌屬(Trametes)或木黴屬細胞。在一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)ΛCeriporiopsisaneirina、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa>Ceriporiopsissubvermispora、B譽角質金抱子菌、Ghrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、粗金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、米黑毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、產紫青黴、黃孢平革菌(Wianerochaetechrysosporium)、輻射射脈lif(Phlebiaradiata)、束Ijj^iiJ耳(Pleurotuseryngu)、土生—子包胃、Trametesvillosa>Trametesversicolor、哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用於轉化麴黴屬和木黴屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉化酵母=Becker和Guarente，於Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,182-187頁，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產生方法本發明還涉及產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優選的方面，所述細胞是腐質黴屬的。在一個更優選的方面，所述細胞是特異腐質黴。在一個最優選的方面，所述細胞是特異腐質黴DSM1800。本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養如本文所述的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，所述多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發明還涉及植物，例如，轉基因植物、植物部分或植物細胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用於改進食品或飼料的質量，例如，改進營養價值、適口性(palatability)和流變性質(rheologicalproperties)，或用於破壞抗營養因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和穀類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是菸草(tcAacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細胞質(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什麼組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如為了促進本發明的應用而分離的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)0同樣包含於本發明範圍內的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡而言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼本發明多肽的一個或多個(數個)表達構建體併入植物宿主基因組或葉綠體基因組，並且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞。表達構建體便利地是包含編碼本發明多肽的多核苷酸的核酸構建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該核苷酸序列所需的適當的調節序列可操作地連接。此外，表達構建體可以包含對於鑑定在其中整合了該表達構建體的宿主細胞有用的選擇性標記和將該構建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(後者依賴於使用的DNA引入方法)。調節序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基於期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發育、階段或組織特異性的，並且基因產物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調節序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對於組成性表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294,Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴暮塊蓮禾口果實的啟動子(EdwardsandCoruzzi,1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
公知的任何其它種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology洸85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、乾旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤黴酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用於實現本發明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內含子，其置於啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內可用的那些。將核酸構建體根據本領域已知的常規技術併入植物基因組，所述常規技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，1990，kience2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等，1989，Nature338:274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移(genetransfer)，是產生轉基因雙子葉植物的優選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiology19:15-38)，而且它也可以用於轉化單子葉植物，雖然對於這些植物常常使用其它的轉化方法。目前，產生轉基因單子葉植物的優選的方法，是用粒子(用轉化DNA塗覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。轉化單子葉植物的可供選擇的方法是基於原生質體轉化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-428所描述的。轉化之後，根據本領域熟知的方法選擇併入了表達構建體的轉化體並且再生成為完整植株。通常設計轉化方法用於通過如下方法在再生期間或在後續世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發明還涉及產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或減少α-葡糖醛酸糖苷酶活性本發明還涉及產生親本細胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發明的多肽的多核苷酸或其部分，這導致在相同條件下培養時，與親本細胞相比突變的細胞產生較少的所述多肽。可以使用本領域熟知的方法通過減少或消除編碼本發明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變細胞，所述方法例如，插入、破壞、替代或缺失。在一個優選的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區或其中對活性關鍵的部分，或表達編碼區所需的調節元件。這種調節或調控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用於可能的修飾的其它調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活子。核苷酸序列的修飾或失活可以通過向親本細胞施以誘變，並且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過將所述DNA序列進行PCR產生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合於本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變在合適條件下存在優選的誘變劑時溫育待誘變的親本細胞，並篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過導入、取代或去除基因中的一個或多個(數個)核苷酸或其轉錄或翻譯所需的調節元件可以實現所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產生的誘變可以實現這種修飾或失活。儘管在理論上所述修飾可以在體內進行，即，直接對表達待修飾核苷酸序列的細胞進行，但優選如下面所例示的那樣在體外進行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細胞表達的便利方式的例子是基於基因替代，基因缺失，或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將相應於內源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產生缺陷性的核酸序列，然後將其轉化入親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標記，其可用於選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉化子。在特別優選的方面，用可選擇的標記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列。或者，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術來進行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述互補序列可以在細胞中轉錄並且能夠與細胞中產生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質的量。本發明進一步涉及親本細胞的突變體細胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調控序列的破壞或缺失，這導致與親本細胞相比突變體細胞產生更少的多肽或不產生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變體細胞作為表達天然和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發明進一步涉及產生天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養突變體細胞；和(b)回收所述多肽。術語「異源多肽」在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術對宿主細胞操作的結果其表達在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發明涉及通過發酵產生本發明的多肽以及目標蛋白產物的細胞來生產基本上無α-葡糖醛酸糖苷酶活性的蛋白質產物的方法，通過在發酵之前、之中或發酵完成之後向發酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制α-葡糖醛酸糖苷酶活性的試劑，從發酵液中回收目標產物，並且任選地將回收的產物進行進一步純化。在另一方面，本發明涉及通過如下生產基本上無α-葡糖醛酸糖苷酶活性的蛋白質產物的方法在允許產物表達的條件下培養細胞，將得到的培養液進行組合的PH和溫度處理以實質上(substantially)減少α-葡糖醛酸糖苷酶活性，和從發酵液中回收產物。或者，可以將從培養液回收的酶製備物進行組合的PH和溫度處理。所述組合的ρΗ和溫度處理可任選地與α-葡糖醛酸糖苷酶抑制劑處理組合使用。依照本發明的這個方面，可能去除至少60%，優選至少75%，更優選至少85%，還更優選至少95%，並且最優選至少99%的α-葡糖醛酸糖苷酶活性。可使用此方法獲得α-葡糖醛酸糖苷酶活性的完全去除。組合的ρΗ和溫度處理優選在2-4或9-11範圍內的ρΗ和至少60_70°C範圍內的溫度進行一段足夠的時間以達到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用於培養和純化感興趣的產物的方法可以通過本領域已知的方法進行。本發明用於產生基本上無α-葡糖醛酸糖苷酶的產物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質例如酶的產生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，澱粉分解酶(anxiolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶(cutinase)、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。α-葡糖醛酸糖苷酶缺陷細胞也可以用於表達在製藥上引起興趣的異源蛋白如激素、生長因子、受體等。可理解的是術語「真核多肽」不僅包括天然多肽，也包括通過胺基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強活性、熱穩定性、PH耐受性等的多肽，例如酶。在另外的方面，本發明涉及基本上無α-葡糖醛酸糖苷酶活性的蛋白質產物，其是通過本發明的方法產生的。抑制具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽表達的方法本發明還涉及抑制具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽在細胞中表達的方法，其包括對所述細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在所述細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發明多核苷酸的亞序列。在一個優選的方面，dsRNA長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的雙鏈體核苷酸。dsRNA優選是小幹擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優選的方面，dsRNA是用於抑制轉錄的小幹擾RNA(SiRNA)。在另一優選的方面，dsRNA是用於抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發明還涉及這樣的雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO1成熟多肽編碼序列的部分，用於抑制細胞中的多肽表達。雖然本發明不受限於任何特定作用機制，但dsRNA能進入細胞，並引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內源mRNA。當細胞接觸dsRNA時，來自同源基因的mRNA通過稱為RNA幹擾(RNAi)的過程被選擇性地降解。本發明的dsRNA可以用於基因沉默。在一個方面，本發明提供使用本發明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述方法可以在體外、回體(exvivo)或在體內實施。在一個方面，dsRNA分子能夠用於在細胞、器官或動物中產生功能喪失突變(loss-of-functionmutation)。製備和使用dsRNA分子以選擇性地降解RNA的方法是本領域中熟知的，參見，例如，美國專利號6，506，559；美國專利號6，511，824；美國專利號6，515，109；和美國專利號6，489，127。組合物本發明還涉及包含本發明的多肽的組合物。優選地，所述組合物富含這種多肽。術語「富含」表示所述組合物的α-葡糖醛酸糖苷酶活性得到了增加，例如，以至少1.1的富集因數(enrichmentfactor)±曾力口。所述組合物可以包含本發明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、滷素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶(p^tidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬於以下屬或種的微生物產生麴黴屬，優選棘孢麴黴、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴；鐮孢屬，優選杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質黴屬，優選特異腐質黴或疏棉狀腐質黴；或木黴屬，優選哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木毒ο可以依照本領域內已知的方法製備多肽組合物，並且可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領域內已知方法將包括於所述組合物中的多肽穩定化。下面給出的是本發明多肽組合物的優選用途的實例。本發明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基於本領域內已知的方法確定。用途本發明還涉及使用具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽或其組合物的方法。本發明的多肽可用於降解或轉化植物細胞壁或任何含木聚糖材料，例如，木素纖維素，其來源於植物細胞壁(參見，例如，WO2002/18561)。多種用途的實例如下所述。本發明多肽的劑量和其它使用所述多肽的條件可基於本領域已知的方法確定。通過全部或部分去除側鏈來促進含木聚糖材料的酶降解。本發明的多肽優選與其它木聚糖降解酶，如木聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合一同用於其中含木聚糖材料要被降解的方法。例如，乙醯基基團可由乙醯木聚糖酯酶去除；阿拉伯糖基團可由α-阿拉伯糖苷酶去除；阿魏醯基團可由阿魏酸酯酶去除，而葡糖醛酸基團可由α-葡糖醛酸糖苷酶去除。由木聚糖酶，或由木聚糖酶和側鏈水解酶的組合釋放的寡聚物可由β-木糖苷酶進一步降解為游離木糖。本發明還涉及降解或轉化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用酶組合物在本發明的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下處理所述纖維素材料或含木聚糖材料。在一個優選的方面，所述方法還包括回收降解的或轉化的纖維素材料或含木聚糖材料。本發明還涉及產生發酵產物的方法，包括(a)用酶組合物在本發明具有的α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種發酵微生物發酵經糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產生發酵產物；和(C)從發酵回收發酵產物。本發明還涉及發酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種發酵微生物發酵所述纖維素材料或含木聚糖材料，其中將所述纖維素材料或含木聚糖材料用酶組合物在本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下糖化。在一個優選的方面，所述纖維素材料或含木聚糖材料的發酵產生了發酵產物。在另一優選的方面，所述方法還包括從發酵回收所述發酵產物。本發明的方法可用於將纖維素材料或含木聚糖材料糖化為可發酵的糖，並將所述可發酵的糖轉化為許多有用的物質，例如，燃料、飲用乙醇和/或發酵產物(例如，酸、醇、酮、氣體等)。自所述纖維素材料或含木聚糖材料產生所期望的發酵產物通常涉及預處理，酶法水解(糖化)和發酵。根據本發明對所述纖維素材料或含木聚糖材料的加工可使用本領域常規方法完成。而且，本發明的方法可使用任何經配置以依照本發明操作的常規生物質加工裝置來執行。分別或同時的水解(糖化)和發酵包括但不限於分別水解和發酵(SHF)；同時糖化和發酵(SSF)；同時糖化和共發酵(SSCF)；混合水解和發酵(HHF)；分別水解和共發酵(SHCF)；混合水解和共發酵(HHCF)，以及直接微生物轉化(DMC)。SHF使用分別的過程步驟以首先將纖維素材料或含木聚糖材料酶法水解為可發酵的糖，例如，葡萄糖，纖維二糖，纖維三糖與戊糖，然後將所述可發酵的糖發酵為乙醇。在SSF中，纖維素材料或含木聚糖材料的酶法水解，以及糖發酵為乙醇合併為一步(Wiilippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,於HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.Ε.編，Taylor&Francis，Washington,DC，179-212)。SSCF涉及多種糖類的共發酵(Sheehan，J.和Himmel，Μ.，1999，Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol，Biotechnol·Prog·15:817-827)。HHF涉及分別的水解步驟，並另外涉及同時的糖化和水解步驟，其可在同一個反應器中進行。在HHF過程中的步驟可在不同溫度進行，即，高溫酶法糖化然後是在發酵菌株可容忍的較低溫度的SSF。DMC將所有三個過程(酶產生，水解與發酵)合併於一個或多個步驟，其中使用相同生物體來產生酶用於將纖維素材料或含木聚糖材料轉化為可發酵的糖並將所述可發酵的糖轉化為終產物(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，vanZyl,ff.H.和Pretorius，I.S.，2002，Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文中應理解，包括預處理，酶法水解(糖化)，發酵或其組合的本領域已知的任何方法可用於實施本發明的方法。常規裝置可包括補料分批攪拌反應器(fed-batchstirredreactor)，分批攪拌反應器(batchstirredreactor)，帶超濾的連續流攪拌反應器(continuousflowstirredreactorwithultrafiltration)禾口/或連續的活塞、流柱式反應器(continuousplug-flowcolumnreactor)(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)，磨耗反應器(anattritionreactor)(Ryu,S.K.禾口Lee,J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者帶有由電磁場誘導的強攪拌的反應器(areactorwithintensivestirringinducedbyanelectromagneticfield)(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它類型的反應器包括流化床(fluidizedbed)、上流床(upflowblanket)、固定化的以及擠出機(extruder)型反應器以供水解和/或發酵。預處理在實施本發明的方法時，本領域已知的任何預處理方法可用於破壞植物細胞壁的纖維素材料和/或含木聚糖材料組分(Chmdra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe禾口Zacchi，2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks禾口Zeeman，2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.10010-18；Mosier等，2005，Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh禾口Karimi,2008,Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651；Yang禾口Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costeellulosicethanol，BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。還可在使用本領域已知方法進行預處理之前對纖維素材料和含木聚糖材料進行粒度減少(particlesizereduction)、預浸(pre-soaking),潤溼(wetting),洗滌或調理(conditioning)。常規預處理包括但不限於，蒸汽預處理(爆炸或不爆炸)，稀酸預處理，熱水預處理，鹼性預處理，石灰預處理，溼氧化，溼爆炸，氨纖維爆炸，有機溶劑預處理以及生物預處理。其它預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界吐0、臭氧和Y輻射預處理。纖維素材料或含木聚糖材料可在水解和/或發酵前進行預處理。預處理優選在水解前進行。或者，所述預處理可與酶水解同時進行以釋放可發酵的糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在多數情況下，所述預處理步驟本身導致生物質部分轉化為可發酵的糖(甚至酶不存在時亦如此)。蒸汽預處理。在蒸汽預處理中，將纖維素材料或含木聚糖材料加熱以破壞其植物細胞壁組分(包括木質素、半纖維素和纖維素)，以使纖維素與其它部分(例如，半纖維素)易受酶作用(accessibletoenzymes)。使纖維素材料或含木聚糖材料傳遞至或經過反應容器，在該反應容器中注入蒸汽以將溫度增加至所需溫度和壓力，並在其中保持到所期望的反應時間。蒸汽預處理優選在140-230°C，更優選160-200°C，且最優選170_190°C進行，其中最佳溫度範圍取決於任何化學催化劑的添加。蒸汽預處理的停留時間優選為1-15分鐘，更優選為3-12分鐘，且最優選為4-10分鐘，其中最佳停留時間取決於溫度範圍和任何化學催化劑的添加。蒸汽預處理允許相對較高的固體加載(量)，從而使得纖維素材料或含木聚糖材料通常僅在預處理過程中為潮溼的。所述蒸汽預處理常常與預處理之後材料的爆炸性排出(explosivedischarge)組合，其稱為蒸汽爆炸，S卩，所述材料迅速閃蒸至大氣壓力和湍流以通過碎裂增加其可接觸表面積(Duff和Murray，1996,BioresourceTechnology855:1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美國專利申請No.20020164730)。在蒸汽預處理過程中，半纖維素乙醯基團遭剪切，且所得的酸自催化半纖維素部分水解為單糖與寡糖。僅有限程度地去除木質素。常常在蒸汽預處理前添加催化劑如H2SO4或SO2(通常為0.3到3%w/w)，其減少時間與溫度，增加回收(率)，並改善酶法水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。化學預處理術語「化學預處理」指任何促進纖維素、半纖維素和/或木質素分離和/或釋放的化學預處理。合適的化學預處理過程的實例包括，例如，稀酸預處理、石灰預處理、溼氧化、氨纖維/冷凍爆炸(ammoniafiber/freezeexplosion,AFEX)、氨滲濾(APR)以及有機溶劑預處理。在稀酸預處理中，將纖維素材料或含木聚糖材料與稀酸，通常為&S04，以及水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至所期望的溫度，並在停留時間後閃蒸至大氣壓力。所述稀酸預處理可用多種設計的反應器來實施，例如，活塞流反應器，逆流反應器(counter-currentreactor)或連續逆流收縮床反應器(continuouscounter-currentshrinkingbedreactor)(Duff禾口Murray，1996，見上文；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。亦可使用數種鹼性條件下的預處理方法。這些鹼性預處理包括但不限於，石灰預處理、溼氧化、氨滲濾(APR)與氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。石灰預處理使用碳酸鈣，氫氧化鈉或氨在85-150°C的低溫以及1小時到數日的停留時間進行(Wyman等，2005，BioresourceiTechnol.961959-1966;Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)WO2006/11089UW02006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開了使用氨的預處理方法。溼氧化為如下的熱預處理，即其通常在180-200°C進行5-15分鐘，加以氧化齊Ll如過氧化氧或氧氣超壓(over-pressure)(Schmidt禾口Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.1171-17；Varga^,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin^,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。該預處理優選以1_40%乾物質，更優選2-30%乾物質，且最優選5-20%乾物質進行，且起始pH常常通過添加鹼性物質(如碳酸鈉)來增加。所述溼氧化預處理方法的改進，稱為溼爆炸(溼氧化與蒸汽爆炸的組合)，可處理多達30%的乾物質。在溼爆炸中，氧化劑在預處理過程中在一定停留時間後導入。然後所述預處理通過閃蒸至大氣壓力來終止(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及用液態或氣態氨在中等溫度(如90-100°C)以及高壓(如17-20巴)對纖維素材料或含木聚糖材料處理5-10分鐘，其中乾物質含量可高達60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等，2005,Appl.Biochem.Biotechnol.1211133-1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預處理導致纖維素的解聚和半纖維素的部分水解。木質素-碳水化合物複合物被剪切。有機溶劑預處理通過用乙醇水溶液00-60%乙醇)在160_200°C提取30-60分鐘而使纖維素材料或含木聚糖材料脫木質化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90473-481；Pan等，2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等，2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。通常添加硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，大部分半纖維素得到去除。合適的預處理方法的其它實例由khell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.Vol.105-108,p.69-85與Mosier等』2005,BioresourceTechnology96:673-686,IiLR^布的美國申請2002/0164730描述。在一方面，所述化學預處理優選作為酸處理來進行，且更優選作為連續性稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進行。所述酸通常為硫酸，但亦可使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、鹽酸或其混合物。弱酸處理在PH範圍優選為1-5，更優選為1-4，且最優選為1-3進行。在一個方面，所述酸濃度範圍為優選0.01到20wt%的酸，更優選0.05到IOwt^的酸，甚至更優選0.1到5wt%的酸，且最優選0.2到2.Owt^的酸。所述酸與纖維素材料或含木聚糖材料接觸，並在範圍優選為160-220°C，且更優選為165-195的溫度保持數秒至數分鐘範圍的時間，例如，1秒到60分鐘。在另一方面，預處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預處理步驟)進行。在另一方面，預處理在含水漿料中進行。在一個優選的方面，纖維素材料或含木聚糖材料在預處理過程中以優選為10-80Wt%，更優選為20-70Wt%，且最優選為30-60Wt%，例如約50wt%的量存在。經預處理的纖維素材料或含木聚糖材料可不經洗滌，或使用任何本領域已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機械預處理術語「機械預處理」指不同類型的碾磨或磨製(grindingormilling)(例如，幹磨、溼磨或振雲力球磨(vibratoryballmilling))。物理預處理術語「物理預處理」指任何促進自纖維素材料或含木聚糖材料分離和/或釋放纖維素，半纖維素和/或木質素的預處理。例如，物理預處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解以及其組合。物理預處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一方面，高壓意為範圍在優選約300到約600psi，更優選約350到約550psi，且最優選約400到約500psi，例如約450psi的壓力。在另一方面，高溫意為範圍在約100到約300°C，優選約140到約235°C的溫度。在一個優選方面，機械預處理以分批過程在蒸汽槍水解儀系統中進行，所述系統使用如上所述定義的高壓與高溫，例如，可自SundsDefibratorAB，Sweden得到的SundsHydrolyzer0組合的物理和化學預處理纖維素材料或含木聚糖材料可經物理與化學方法兩者預處理。例如，所述預處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。物理與化學預處理可視需要順序或同時進行。亦可包含機械預處理。因此，在一個優選方面，可對纖維素材料或含木聚糖材料進行機械、化學或物理預處理，或其任意組合以促進纖維素、半纖維素和/或木質素的分離和/或釋放。生物預處理術語「生物預處理」指任何促進自纖維素材料或含木聚糖材料分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質素的生物預處理。生物預處理技術可涉及應用溶解木質素的微生物(參見，例如，Hsu,Τ.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,於HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.Ε.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singt,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionofcellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreainglignocellulosicbiomassareview,於EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.禾口Overend,R.P.編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.Τ.,1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，於AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,Τ.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal，1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；禾口Vallander禾口Eriksson，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。'M^在亦稱為糖化的水解步驟中，將經預處理的纖維素材料或含木聚糖材料水解以將纖維素和半纖維素分解為可發酵的糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。所述水解用酶法通過酶組合物在本發明具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下進行。該組合物中的酶亦可順序添加。酶水解優選在合適的水溶液環境中在本領域技術人員可容易地確定的條件下進行。在一個優選方面，水解在適於所述酶活性，即，對於所述酶為最佳的條件下進行。所述水解可作為分批補料或連續工藝進行，在後者中將經預處理的纖維素材料或含木聚糖材料(底物)逐漸進料至，例如，含有酶的水解溶液中。所述糖化通常在攪拌釜式反應器或發酵罐中在受控的ρΗ、溫度和混合條件下進行。合適的過程時間、溫度與PH條件可由本領域技術人員容易地確定。例如，所述糖化可持續長達200小時，但通常優選進行約12至約96小時，更優選約16至約72小時，且最優選約M至約48小時。溫度範圍優選為約25°C至約70°C，更優選約30°C至約65°C，且最優選約40°C至60°C，特別是約50°C。ρΗ範圍優選為約3至約8，更優選約3.5至約7，且最優選約4至約6，特別為約pH5。幹固形物含量範圍優選為約5至約50wt%，更優選約10至約40wt%，且最優選約20至約30wt%。所述酶組合物優選包含具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在一個方面，所述酶組合物包含一種或多種木聚糖降解酶。在另一方面，所述酶組合物包含一種或多種纖維素分解酶。在另一方面，所述酶組合物包含一種或多種木聚糖降解酶和一種或多種纖維素分解酶。所述一種或多種木聚糖降解酶優選選自下組木聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。所述一種或多種纖維素分解酶優選選自下組內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，所述酶組合物還或甚至還包含具有纖維素分解增強活性的多肽(參見，例如,WO2005/074647,WO2005/074656和WO2007/089290)。在另一方面，所述酶組合物還可或甚至還可包含一種或多種其它的酶活性以改進含纖維素材料的降解。優選的其它酶為半纖維素酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、內切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、內切α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)、糖酯酶(例如，乙醯木聚糖酯酶、乙醯甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯酶)、果膠酶、蛋白酶、木素分解酶(例如，漆酶、錳過氧化物酶、木素過氧化物酶、H2O2產生酶、氧化還原酶)、棒麴黴素(expansinhswollenin(膨脹素)或其混合物。在本發明的方法中，所述其它的酶可在發酵過程之前或之中添加，例如，在糖化中添加，或在所述發酵生物繁殖過程中或之後添加。所述酶組合物的一種或多種組分可為野生型蛋白質、重組蛋白質或野生型蛋白質與重組蛋白質的組合。例如，一種或多種組分可為細胞的天然蛋白質，所述細胞用作宿主細胞以重組表達酶組合物的一個或多個(幾個)其它組分。所述酶組合物的一種或多種組分可作為單組分產生，然後將其組合以形成所述酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白質製備物的組合。用於本發明方法的酶可為任何適用於本文中所述方法的形式，例如，去除或未去除細胞的粗發酵液，半純化的或純化的酶製備物，或作為酶的來源的宿主細胞。所述酶組合物可為乾粉或粒狀物、無粉塵的粒狀物、液體、穩定化的液體或穩定化的受保護的酶。液體酶製備物可，例如，根據已確立的方法通過添加穩定劑來穩定化，所述穩定劑如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有機酸。所述具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽和酶的最佳量取決於幾種因素，包括但不限於，組分纖維素分解酶的混合物，所述纖維素材料或含木聚糖材料，所述纖維素材料或含木聚糖材料的濃度，所述纖維素材料或含木聚糖材料的預處理，溫度，時間，PH和包含發酵生物(例如，供同時糖化和發酵的酵母)。在一個優選的方面，對於纖維素材料或含木聚糖材料的纖維素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量為每g纖維素材料或含木聚糖材料約0.5至約50mg，優選約0.5至約40mg，更優選約0.5至約25mg，更優選約0.75至約20mg，更優選約0.75至約15mg，甚至更優選約0.5至約10mg，且最優選約2.5至約10mg。在另一個優選的方面，具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽對於纖維素材料或含木聚糖材料的有效量為每g纖維素材料或含木聚糖材料約0.01至約50.Omg，優選約0.01至約40mg，更優選約0.01至約30mg，更優選約0.01至約20mg，更優選約0.01至約10mg，更優選約0.01至約5mg，更優選約0.025至約1.5mg,更優選約0.05至約1.25mg,更優選約0.075至約1.25mg,更優選約0.1至約1.25mg,甚至更優選約0.15至約1.25mg,且最優選約0.25至約1.Omg。在另一個優選的方面，具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽對於纖維素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量為每g纖維素分解酶約0.005至約1.0g，優選約0.01至約1.Og,更優選約0.15至約0.75g，更優選約0.15至約0.5g，更優選約0.1至約0.5g，更優選約0.1至約0.5g，且最優選約0.05至約0.2g。所述酶可源自或得自任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物來源。在本文中術語「獲得」指該酶可分離自天然產生該酶作為天然酶的生物。在本文中術語「獲得」也指所述酶可在宿主生物中使用本文所描述的方法重組產生，其中所述重組產生的酶對於所述宿主生物可為天然的或外源的，或具有修飾的胺基酸序列，例如，具有一個或多個缺失、插入和/或取代的胺基酸的修飾的胺基酸序列，即，重組產生的酶，其為天然胺基酸序列的突變體和/或片段，或者其為通過本領域已知的核酸改組方法(nucleicacidshufflingprocess)產生的酶。天然酶含意中涵蓋天然變體，而外源酶含意中涵蓋重組獲得的變體，例如，通過定位誘變或改組獲得的變體。具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可為細菌多肽，例如，所述多肽可為革蘭氏陽性菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬多肽，或革蘭氏陰性菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬多肽。在一個優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍色鏈黴菌、灰色鏈黴菌和淺青紫鏈黴菌多肽。所述具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽也可為真菌多肽，且更優選為酵母多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬多肽；或更優選為絲狀真菌多肽，如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的枝頂孢黴屬、傘菌屬、鏈格孢屬、麴黴屬、短梗黴屬、Botryospaeria、擬￡^菌屬、毛1殼屬、金包子菌屬、Claviceps>Cochliobolus、鬼傘屬、Coptotermes、棒囊殼屬、隱叢赤殼菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、Filibasidium、鐮孢屬、赤黴屬、全鞭毛蟲屬、腐質黴屬、耙齒菌屬、蘑菇屬、L印tospaeria、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha、根毛黴屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬/嗜熱黴屬、梭孢殼屬、彎頸黴屬、木黴屬、長毛盤菌屬、輪枝孢屬、包腳菇屬或炭角菌屬多肽。在一個優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纖維枝頂孢黴、棘孢麴黴、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴、米麴黴、嗜角質金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、IS金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質黴、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、白耙齒菌、米黑毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、繩狀青黴、產紫青黴、黃孢平革菌、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼、Thielaviafimeti、小孢梭孢殼、卵孢梭孢殼、Thielaviaperuvima、瘤孢梭孢殼、毛梭孢殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢黴、哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴、綠^7^^Trichophaea已也可使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的經化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體。所述酶組合物的一種或多種組分可為重組組分，即，通過克隆編碼單一組分的DNA序列並隨後用該DNA序列轉化細胞並在宿主中表達而產生(參見，例如，WO91/17243和WO91/17244)。所述宿主優選為異源(heterologous)宿主(酶對宿主是外源的)，但在某些情況下所述宿主也可為同源宿主(酶對宿主是天然的)。單組分纖維素分解蛋白質也可通過從發酵液純化上述蛋白質來製備。適用於本發明的商業的纖維素分解蛋白製備物的實例包括，例如，CELLICCtec(NovozymesA/S),CELLUCLAST(NovozymesA/S)禾口N0V0ZYM188(NovozymesA/S)。可以使用的包含纖維素酶的其它商業上可得到的製備物包括CELLUZYME、CEREFL0禾ΠULTRAFLO(NovozymesA/S)，LAMINEX禾ΠSPEZYMECP(GenencorInt.),R0HAMENT7069ff(RohmGmbH)以及FIBREZYMELDI、FIBREZYMELBR或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以固形物的約0.001到約5.Owt.%，更優選固形物的約0.025到約4.Owt.%，且最優選固形物的約0.005到約2.Owt.%的有效量添加。可以用於本發明的方法的細菌內切葡聚糖酶的實例包括但不限於，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內切葡聚糖酶(W091/05039；W093/15186；美國專利5，275，944；WO96/02551；美國專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內切葡聚糖酶III(W005/093050)；和Thermobifidafusca內切葡聚糖酶V(W005/093050)。可以用於本發明的方法的真菌內切葡聚糖酶的實例包括但不限於，裡氏木黴內切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263;GENBANK登錄號M15665)；裡氏木黴內切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;GENBANK登錄號M19373)；裡氏木黴內切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK登錄號AB003694)；裡氏木黴內切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249584-591；GENBANK登錄號Y11113)；以及裡氏木黴內切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-2;GENBANK登錄號Z33381)；棘孢麴黴內切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地麴黴(Aspergilluskawachii)內切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995,CurrentGenetics27=435-439)；胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14)；尖鐮孢內切葡聚糖酶(GENBANK登錄號L29381)；灰腐質黴thermoidea變種內切葡聚糖酶(GENBANK登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內切葡聚糖酶(GENBANK登錄號MAL515703)；粗糙脈孢菌內切葡聚糖酶(GENBANK登錄號XM_324477)；特異腐質黴內切葡聚糖酶V；嗜熱毀絲黴CBS117.65內切葡聚糖酶；擔子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內切葡聚糖酶；擔子菌綱CBS494.95內切葡聚糖酶；土生梭孢黴NRRL8126CEL6B內切葡聚糖酶；土生梭孢黴NRRL8126CEL6C內切葡聚糖酶；土生梭孢黴NRRL8126CEL7C內切葡聚糖酶；土生梭孢黴NRRL8U6CEL7E內切葡聚糖酶；土生梭孢黴NRRL8126CEL7F內切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內切葡聚糖酶；以及裡氏木黴菌株VTT-D-80133號內切葡聚糖酶(GENBANK登錄號M15665)。可用於本發明的方法的纖維二糖水解酶的示例包括但不限於，裡氏木黴纖維二糖水解酶I；裡氏木黴纖維二糖水解酶II；特異腐質黴纖維二糖水解酶I、嗜熱毀絲黴纖維二糖水解酶II、土生梭孢黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)、嗜熱毛殼(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I以及嗜熱毛殼纖維二糖水解酶II。可用於本發明的方法的葡糖苷酶的實例包括但不限於米麴黴葡糖苷酶；煙麴黴β-葡糖苷酶；巴西青黴(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶；黑麴黴β-葡糖苷酶；以及棘孢麴黴β-葡糖苷酶。具有β-葡糖苷酶活性的米麴黴多肽可根據WO2002/095014獲得。具有β-葡糖苷酶活性的煙麴黴多肽可根據WO2005/047499獲得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青黴多肽可根據WO2007/019442獲得。具有β_葡糖苷酶活性的黑麴黴多肽可根據Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢麴黴多肽可根據Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲得。所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個方面，所述β-葡糖苷酶是根據WO2008/057637獲得的米麴黴β_葡糖苷酶變體BG融合蛋白或米麴黴β-葡糖苷酶融合蛋白。其它內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶公開於許多使用根據HenrissatB·,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316以及HenrissatB.禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類法的糖基水解酶家族中。其它可用於本發明的纖維素分解酶描述於EP495，257、EP531，315、EP531,372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、W096/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792,WO2002/101078,W02003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、W02004/048592,WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利No.4，435，307、美國專利No.5，457，046、美國專利No.5，648，洸3、美國專利No.5，686，593、美國專利No.5，691，178、美國專利No.5，763，254以及美國專利No.5，776，757。在本發明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強活性的多肽。在第一方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV],其中X是任何胺基酸，XGj)是在4或5個連續位置上的任何胺基酸，而X(4)是在4個連續位置上的任何胺基酸。具有上述指明基序的多肽可另外還包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],其中X是任何胺基酸，X(1，2)是在1個位置或2個連續位置上的任何胺基酸，X(3)是在3個連續位置上的任何胺基酸，而XQ)是在2個連續位置上的任何胺基酸。在上述基序中，使用公認的IUPAC單字母胺基酸縮寫。在一個優選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽另外還包含H-X(l，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]0在另一優選的方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽另外還包含[Εζ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一優選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽另外還包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[Εζ]-Χ-Υ-Χ⑵-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二個方面，具有纖維素分解增強活性的多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4，5)-G—x—Y-[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)~A~[HNQ]，其中χ是任何胺基酸，χ0，幻是在4或5個連續位置上的任何胺基酸，而χ(3)是在3個連續位置上的任何胺基酸。在上述基序中，使用公認的IUPAC單字母胺基酸縮寫。可用於本發明方法的具有纖維素分解增強活性的多肽的實例包括但不限於，來自土生梭孢黴的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02005/074647)；來自桔橙嗜熱黴(Thermoascusaurantiacus)的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02005/074656)；和來自裡氏木黴的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02007/08擬90)。適用於本發明的商業性木聚糖降解酶製備物的實例包括，例如，SHEARZYME(NovozymesA/S)、CELLICHtec(NovozymesA/S)、VISCOZYME(NovozymesA/S)、ULTRAFLO(NovozymesA/S)、PULPZYMEHC(NovozymesA/S)、MULTIFECTXylanase(Genencor)、ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM),DEP0L333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)、DEP0L740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEP0L762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)可用於本發明方法的木聚糖酶的實例包括但不限於，棘孢麴黴木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)，煙麴黴木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭孢黴NRRL81木聚糖酶(W02009/079210)。可用於本發明方法的木糖苷酶的實例包括但不限於，裡氏木黴木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q9M58)，埃默森踝節菌(SwissftOt登錄號Q8X2U)和粗糙脈孢菌(SwissProt登錄號Q7S0W4)。可用於本發明方法的乙醯木聚糖酯酶的實例包括但不限於，紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙醯木聚糖酯酶(W02005/001036)，粗糙脈孢菌乙醯木聚糖酯酶(UniProt登錄號q7s259)，土生梭孢黴NRRL8126乙醯木聚糖酯酶(W02009/042846),球毛殼(Chaetomiumglobosum)乙醯木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q2GWX4)，細麗毛殼(Chaetomiumgracile)乙醯木聚糖酯酶(GenekqP登錄號AAB821M)，穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙醯木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q0UHJ1)和特異腐質黴DSM1800乙醯木聚糖酯酶(W02009/073709)。可用於本發明方法的阿魏酸酯酶的實例包括但不限於，特異腐質黴DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)，粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號Q9HGR3)和費希新薩託菌(Neosartoryafischeri)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號A1D9T4)。可用於本發明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實例包括但不限於，特異腐質黴DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑麴黴阿拉伯呋喃糖苷酶(GenekqP登錄號AAR94170)。可用於本發明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實例包括但不限於，棒麴黴(Aspergillusclavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號alccl2)，裡氏木黴α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q990M)，埃默森踝節菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號Q8X211)，黑麴黴α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q96WX9)，土麴黴(Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q0CJP9)，和煙麴黴α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q4WW45)。用於本發明方法的酶和蛋白質可通過在含合適碳源和氮源和無機鹽的營養培養基上，使用本領域已知方法(參見，例如，Bennett,J.W.andLaSure,L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)發酵上述微生物菌株來產生。合適的培養基可從商業供應商獲得，或可根據公開的組成來製備(例如，公開於AmericanTypeCultureCollection的目錄)。適於生長和酶產生的溫度範圍和其它條件在本領域是已知的(參見，例如，Bailey,J.Ε.禾口Ollis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。所述發酵可為任何培養細胞的方法，其導致酶的表達或分離。因此，發酵可理解為包括搖瓶培養，或小或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、補料分批發酵或固態發酵)，其在實驗室或工業發酵罐中在合適的培養基並在允許所述酶表達或分離的條件下進行。由上述方法產生的所得的酶可從發酵培養基回收，並通過常規方法純化。皿從所述經預處理與水解的纖維素材料或含木聚糖材料獲得的可發酵的糖可由一種或多種能夠將所述糖直接或間接發酵為所需發酵產物的發酵微生物進行發酵。「發酵」或「發酵方法」指任何發酵方法或包含發酵步驟的任何方法。發酵方法亦包括用於可消費醇工業(例如，啤酒與葡萄酒)、乳製品工業(例如，發酵的乳製品)、皮革工業和菸草工業的發酵方法。發酵條件取決於所需發酵產物以及發酵生物，且可由本領域技術人員簡單地確定。在所述發酵步驟中，作為預處理與酶水解步驟的結果自所述纖維素材料或含木聚糖材料釋放的糖由發酵生物(如酵母)發酵為產物，例如乙醇。如本文所述，水解(糖化)和發酵可為分別的或同時的。任何合適的經水解的纖維素材料或含木聚糖材料可在實施本發明時用於所述發酵步驟。所述材料通常基於所期望的發酵產物(即，自發酵獲得的物質)，以及所採用的方法而選擇，如本領域所公知的。在本文中術語「發酵培養基」應理解為指在添加發酵微生物之前的培養基，如，由糖化方法產生的培養基，以及用於同時糖化與發酵方法(SSF)的培養基。「發酵微生物」指任何微生物，包括細菌與真菌生物，其適用於所期望的發酵方法以產生發酵產物。所述發酵生物可為(；和/或C5發酵生物，或其組合。C6與C5發酵生物均是本領域所公知的。合適的發酵微生物能夠將糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖直接或間接發酵(即轉化)為所期望的發酵產物。產生乙醇的細菌與真菌發酵生物的實例描述於Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627_642。可發酵C6糖的發酵微生物的實例包括細菌與真菌生物，如酵母。優選的酵母包括酵母屬菌種(Saccharomycesspp.)，優選釀酒酵母的菌株。可發酵C5糖的發酵生物的實例包括細菌與真菌生物，如酵母。優選的C5發酵酵母包括畢赤酵母屬(Pichia)，優選樹幹畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹幹畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬(Candida)，優選博伊丁氏假絲酵母(Candidaboidinii)，蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)，休哈塔假絲酵母(Candidashehatae)，迪丹氏假絲酵母(Candidadiddensii)，假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產朊假絲酵母(Candidautilis)的其它發酵生物包括發酵單胞菌屬(Zymomonas)，如運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬，如異常漢遜氏酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)的菌株；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的菌株；以及大腸桿菌，特別是經遺傳修飾而改善了乙醇產量(yield)的大腸桿菌菌株。在一個優選方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優選方面，酵母為釀酒酵母。在另一個更優選方面，酵母為糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優選方面，酵母為葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優選方面，酵母為克魯維酵母屬。在另一個更優選方面，酵母為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個更優選方面，酵母為脆壁克魯維酵母。在另一個優選方面，酵母為假絲酵母屬。在另一個更優選方面，酵母為博伊丁氏假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母為蕓薹假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母為迪丹氏假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母為假熱帶假絲酵母。在另一個更優選方面，酵母為產朊假絲酵母。在另一個優選方面，酵母為棍孢屬(Clavispora)。在另一個更優選方面，酵母為葡萄牙棍孢(Clavisporalusitaniae)。在另一個更優選方面，酵母為仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)0在另一個優選方面，酵母屬於管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優選方面，酵母為嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個優選方面，酵母屬於畢赤酵母屬。在另一個更優選方面，酵母為樹幹畢赤酵母。在另一個優選方面，酵母屬於酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個更優選方面，酵母為克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,於HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。可有效將己糖與戊糖發酵為乙醇的細菌包括，例如，運動發酵單胞菌與熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，見上)。在一個優選方面，所述細菌為發酵單胞菌屬。在一個更優選方面，所述細菌為運動發酵單胞菌。在另一個優選方面，所述細菌為梭菌屬(Clostridium)。在另一個更優選方面，所述細菌為熱纖維梭菌。適用於乙醇產生的商業上可得到的酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可得自Fermentis/Lesaffre,USA)，FALI(可得自Fleischmann，sYeast,USA)，SUPERSTART與THERMOSACC新鮮酵母(可得自EthanolTechnology，WI,USA)，BIOFERMAFT與XR(可得自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA),GERTSTRAND(可得自GertStrandAB,Sweden)，以及FERMI0L(可得自DSMSpecialties)。在一個優選的方面，所述發酵微生物經遺傳修飾以提供發酵戊糖的能力，例如利用木糖，利用阿拉伯糖以及共同利用木糖與阿拉伯糖的微生物。將異源基因克隆入多種發酵微生物導致能夠將己糖與戊糖轉化為乙醇(共發酵)的生物的構建(Chen禾口Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,App1.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,App1.Environ.Microbiol.641852-1859；Kotter禾口Ciriacy,1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,App1.Microbiol.Biotechnol.38:776_783；Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.614184~4190；Kuyper等，2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4655-664；Beall等，1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296_303;Ingram等，1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58204~214；Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanolοgenieZymomonasmobilis,Science267240-243；Deanda1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.624465~4470；W02003/062430，木糖異構酶)。在一個優選方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物為釀酒酵母。在另一個優選方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物為運動發酵單胞菌。在另一個優選方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物為大腸桿菌。在另一個優選方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物為產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0在另一個優選方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物為克魯維酵母屬菌禾中(Kluyveromycessp.)。本領域眾所周知的是上述生物亦可用於產生其它物質，如本文所述。所述發酵微生物通常添加至經降解的木素纖維素或其水解物，且將所述發酵進行約8到約96小時，例如約24到約60小時。溫度通常為約26°C到約60°C，特別是約32°C或50°C，且在約pH3到約pH8，如約pH4_5、6或7。在一個優選方面，將所述酵母和/或另一微生物施用於經降解的纖維素材料或含木聚糖材料，且所述發酵進行約12到約96小時，例如通常24-60小時。在一個優選方面，溫度優選為約20°C-約60°C，更優選約25°C到約50°C，且最優選約32°C到約50°C，特別是約32°C或50°C，且pH通常為約pH3-約pH7，優選約pH4_7。然而，一些發酵生物，例如細菌具有較高的最適發酵溫度。酵母或其它微生物優選以每ml發酵液約IO5到1012，優選約IO7到101(1，特別是約2xl08活細胞計數的量施用。關於使用酵母以供發酵的進一步指導可見於，例如，"TheAlcoholTextbook"(K.Jacques,Τ.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999),其通過提述併入本文。對於乙醇產生，在發酵之後，蒸餾經發酵的漿料以提取乙醇。根據本發明的方法獲得的乙醇可用作，例如，燃料乙醇，飲用乙醇(即，可飲用的中性酒精)，或工業乙醇。發酵刺激劑(fermentationstimulator)可與本文所述的任何方法組合以進一步改善所述發酵方法，以及特別是所述發酵微生物的性能，例如，速率增加與乙醇產量。「發酵刺激劑」指針對發酵微生物(特別是，酵母)的生長的刺激劑。優選的對於生長的發酵刺激劑包括維生素與礦物質。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D及E0參見，例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002)，其通過提述併入本文。礦物質的實例包括礦物質與礦物質鹽，其可供應包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu的營養物。發酵產物發酵產物可為源自發酵的仵何物質。發酵產物可為，但不限於醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇與木糖醇)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡萄糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸與木質酸)；酮(例如，丙酮)；胺基酸(例如，天冬氨酸、穀氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；以及氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(C0))。所述發酵產物亦可為作為高價值產物的蛋白質。在一個優選方面，發酵產物為醇。應理解術語「醇」涵蓋包含一個或多個羥基部分(moiety)的物質。在一個更優選方面，醇為阿拉伯糖醇。在另一個更優選方面，醇為丁醇。在另一個更優選方面，醇為乙醇。在另一個更優選方面，醇為甘油。在另一個更優選方面，醇為甲醇，在另一個更優選方面，醇為1，3_丙二醇。在另一個更優選方面，醇為山梨醇。在另一個更優選方面，醇為木糖醇。參見，例如Gong，C.S.，Cao，N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,於AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65207-241；Silveira,Μ.Μ.禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam,P.禾口Singh，D.，1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2)117-124；Ezeji,Τ.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603o在另一個優選方面，發酵產物為有機酸。在另一個更優選方面，有機酸為乙酸。在另一個更優選方面，有機酸為醋酮酸。在另一個更優選方面，有機酸為己二酸。在另一個更優選方面，有機酸為抗壞血酸。在另一個更優選方面，有機酸為檸檬酸。在另一個更優選方面，有機酸為2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優選方面，有機酸為甲酸。在另一個更優選方面，有機酸為富馬酸。在另一個更優選方面，有機酸為葡萄糖二酸。在另一個更優選方面，有機酸為葡糖酸。在另一個更優選方面，有機酸為葡糖醛酸。在另一個更優選方面，有機酸為戊二酸。在另一個更優選方面，有機酸為3-羥基丙酸。在另一個更優選方面，有機酸為衣康酸。在另一個更優選方面，有機酸為乳酸。在另一個更優選方面，有機酸為蘋果酸。在另一個更優選方面，有機酸為丙二酸。在另一個更優選方面，有機酸為草酸。在另一個更優選方面，有機酸為丙酸。在另一個更優選方面，有機酸為琥珀酸。在另一個更優選方面，有機酸為木糖酸。參見，例如，Chen,R.和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435_448。在另一個優選方面，發酵產物為酮。應理解術語「酮」涵蓋含有一個或多個酮部分的物質。在另一個更優選方面，酮為丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見上。在另一個優選方面，發酵產物為胺基酸。在另一個更優選方面，胺基酸為天冬氨酸。在另一個更優選方面，胺基酸為穀氨酸。在另一個更優選方面，胺基酸為甘氨酸。在另一個更優選方面，胺基酸為賴氨酸。在另一個更優選方面，胺基酸為絲氨酸。在另一個更優選方面，胺基酸為蘇氨酸。參見，例如，Richard,Α.和Margaritis，Α.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個優選方面，發酵產物為氣體。在另一個更優選方面，氣體為甲烷。在另一個更優選方面，氣體為H2。在另一個更優選方面，氣體為co2。在另一個更優選方面，氣體為CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya禾口K.Kiriyama，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria，WaterScienceandTechnology36(6-7):41_47；禾口GunaseelanV.N.於BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。Ml^發酵產物可任選地自發酵培養基使用任何本領域已知方法加以回收，所述方法包括但不限於層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，醇自經發酵的纖維素材料或含木聚糖材料分離並通過常規蒸餾方法純化。可獲得純度高至約96vol.%的乙醇，其可用作，例如燃料乙醇、飲用乙醇(即，可飲用的中性酒精)或工業乙醇。其它用途本發明的多肽還可與有限活性的其它木聚糖分解酶一同使用以降解木聚糖，以供產生寡糖。所述寡糖可用作填充劑(bulkingagent)，如從穀類(cereal)細胞壁材料釋放的阿拉伯木聚糖寡糖，或多少純化的來自穀類的阿拉伯木聚糖。本發明的多肽還可與其它木聚糖分解酶組合使用以將木聚糖降解為木糖和其它單糖(美國專利5，658，765號)。可將釋放出的木糖轉化為其它化合物。本發明的多肽可與其它酶如葡聚糖酶一同使用以改善從富油植物材料中提取油，如從玉米胚(corn-embryo)中提取玉米油。本發明的多肽還可用於烘烤以改善生麵團的發麵(development)、彈性和/或穩定性，和/或烘烤產物的體積、碎屑結構(crumbstructure)和/或防腐性(參見美國專利5，693，618號)。所述多肽還可用於製備從任何類型的麵粉或粗粉(meal)(例如，基於小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉米)製備的烘烤產物或生麵團。以本發明的多肽產生的烘烤產物包括麵包、麵包卷(rolls)、長棍麵包(baquettes)等。就烘烤而言，本發明的多肽可用作僅有的或主要的酶活性，或可與其它酶如木聚糖酶、脂肪酶、澱粉酶、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，過氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶組合使用。本發明的多肽還可用於修飾動物飼料，並可在體外(通過修飾飼料的組分)或體內發揮其作用以改善飼料的可消化性，並增加其利用效率(美國專利6，245，546號)。所述多肽可添加至含大量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的動物飼料組合物，例如，含穀物(如大麥、小麥、黑麥、燕麥或玉米)的飼料。當添加至飼料時，所述多肽將改善植物細胞壁材料的體內分解，這部分是由於腸粘度的減少(Bedford等，1993，Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，pp.73-77)，從而實現了動物對植物營養物利用的改善。由此，改善了所述動物的生長速率和/或飼料轉化比(即，攝入飼料的重量相對於重量增加)。本發明的多肽還可用於造紙和紙漿工業，其中包括(interalia)在漂白工藝中增強漂白紙漿的亮度，由此減少用於漂白階段的氯的量(Eriksson，1990，WoodScienceandTechnology24:79_101；Paice等，1988，Biotechnol.andBioeng.32:235_239，以及Pommier等，1989，TappiJournal187-191)。對木素纖維素紙漿的處理可，例如，如美國專利5，658，765號，WO93/08275，W091/02839和WO92/03608所述進行。本發明的多肽還可用於啤酒釀造，特別是改善含有例如大麥和/或高粱麥芽的麥芽汁的可濾過性(filterability)(W02002/24926)。所述多肽可以以與常規用於釀造的戊聚糖酶(pentosanase)相同的方式使用，例如，如ViStor等，1993，J.Inst.Brew.99243-248和EP227159所述。此外，所述多肽可用於處理釀酒酒糟(brewersspentgrain),即來自啤酒麥芽汁生產的殘餘物，其包含大麥或發芽的大麥或其它穀物，從而改善所述殘餘物用於例如動物飼料的利用。本發明的可用於分離植物細胞材料的組分，特別是穀物組分如小麥組分。特別感興趣的是將小麥分離為谷蛋白和澱粉，即具有可觀的商業利益的組分。分離過程可通過使用本領域已知方法來進行，如作為水力旋流器(hydroclone)或傾析器(decanter)工藝進行的所謂打糊(batter)工藝(或溼磨工藝)。在所述打糊工藝中，起始材料是所述植物材料的稀釋的可泵送的分散物，如要進行分離的小麥。在小麥分離工藝中，所述分散物通常由小麥粉和水製備。本發明的多肽還可用於製備果汁或蔬菜汁以增加產量。本發明的多肽還可用作紡織品酶法煮煉(enzymaticscouring)系統的組分。本發明的多肽還可與其它酶功能組合用於洗衣洗滌劑應用。信號月太本發明還涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含SEQIDNO2的胺基酸1至15，或者由SEQIDNO2的胺基酸1至15組成。在一個優選的方面，編碼信號肽的分離的多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸1至45，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至45組成。本發明還涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼蛋白質的基因，其中所述基因與所述編碼信號肽的分離的多核苷酸可操作地連接，其中所述基因對於所述編碼信號肽的多核苷酸是外源的。本發明還涉及包含這樣的核苷酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明還涉及產生蛋白質的方法，包括(a)在有助於產生蛋白質的條件下培養重組宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼所述蛋白質的基因，其可操作地連接於上述編碼信號肽的多核苷酸；和(b)回收所述蛋白質。所述蛋白質對於宿主細胞可以是天然的或異源的。術語「蛋白質」在本文的意思不是指特定長度的編碼產物，並因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質。術語「蛋白質」還涵蓋組合以形成編碼產物的兩種或更多種多肽。所述蛋白質還包括雜合多肽，其包含從至少兩種不同的蛋白質獲得的部分或完全多肽序列的組合，其中一個或多個(幾個)對於宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質進一步包括上述蛋白質和雜合蛋白質天然存在的等位基因變異和工程化變異。蛋白質優選是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報告蛋白(reporter)。在一個更優選的方面，所述蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在一個更加優選的方面，所述蛋白質是氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。基因可以獲得自任何原核、真核或其它來源。通過以下實施例進一步描述本發明，但不應將其理解為對本發明範圍的限制。實施例材料用作緩衝液和底物的化學品是至少試劑級的商業產品。菌株將特異腐質黴DSM1800用作編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的家族67糖苷酶基因的來源。培養基PDA板由每升39g馬鈴薯右旋糖瓊脂組成。YP培養基由每升IOg酵母提取物和20g細菌蛋白腖組成。α-葡糖醛酸糖苷酶活性測定法用於確定α-葡糖醛酸糖苷酶的測定溶液由0.16ml底物(在0.05M乙酸鈉pH5.0緩衝液中的2mg酸糖三糖酸-酸糖二糖酸(aldotriouronicacid-aldobiuronicacid)[80:20])和0.04ml酶溶液(總體積，0.2ml)組成。測定通過添加酶樣品起始。在40°C溫育30分鐘之後，通過將樣品煮沸4分鐘來終止反應。通過離心(IOOOOxg)去除沉澱，之後將上清轉移至新試管。如Milner和Avigad，1967，CarbohydrateResearch4:359_351所述向試管添加0.6ml銅試劑，然後將樣品煮沸10分鐘並在冰上冷卻。隨後，添加如Nelson，1944，J.Biol.Chem.153375-380所述製備的0.4ml砷鉬酸鹽試劑。將樣品輕柔地混合，添加0.8mlH2O,並相對於水測定600nm處的吸光度。對照是通過將完整的測定混合物在零時點煮沸然後在40°C溫育來製備的。底物對照是通過添加水而非酶溶液來製備的。標準曲線是通過使用D-葡糖醛酸來準備的。實施例1特異腐質黴DSM1800基因組DNA提取將特異腐質黴DSM1800在45°C在PDA板上生長至匯合(confluence)。從PDA板切下三個4mm2的方塊，並接種入帶擋板的125ml搖瓶中的25ml含2%葡萄糖的YP培養基中，在41°C以200rpm保持2日。通過使用MIRACLOTH(Calbiochem，LaJolla，CA，USA)過濾來收穫菌絲體，在去離子水中洗滌兩次，並在液氮中凍結。將凍結的菌絲體用杵和研缽磨碎至細粉，並使用DNAEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分離總DNA。實施例2從特異腐質黴DSM1800分離家族67糖苷酶α-葡糖醛酸糖苷酶基因的部分片段使用Consensus-DegenerateHybridOligonucleotidePrimerProgram(C0DEH0P；Rose等，1998，NucleicAcidsResearch26:1628_1635)，針對與已知的α-葡糖醛酸糖苷酶具有同源性的區域設計簡併引物。用於生成特異腐質黴GH67ACI-葡糖醛酸糖苷酶基因片段的簡併引物如下所示弓I物HinsAglucsense35'-AAGTACGGCCCCATCGAYTTYCARGT-3『(SEQIDNO3)簡併引物HinsAglucsense3的蛋白質翻譯KYGPIDFQV弓I物HinsAglucAnti25'-TGGAACCACAGCATCAGGTYRTCNGGNGT-3'(SEQIDNO4)簡併引物HinsAglucAnti2的蛋白質翻譯TPDXLMLffF為了獲得特異腐質黴GH67Aα-葡糖醛酸糖苷酶基因的起始DNA片段，在6個50°C至70.5°C範圍的不同退火溫度進行梯度PCR。擴增反應物(25μ1)由80ng作為模板的特異腐質黴DSM1800基因組DNA，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，各50pmol的引物HinsAglucsense3和引物HinsAglucAnti2，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)禾口1.25單位的ADVANTAGEGCGenomicPolymeraseMix(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)組成。擴增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific，Inc.，Westbury，NY，USA)進行，其程序為95°C預變性1分鐘；30個循環，每個循環為在變性溫度95°C30秒；在退火溫度60°C+/_10°C30秒(6個梯度選項)和在72°C延伸1分鐘；且在72°C最終延伸6分鐘。將反應產物通過在TBE緩衝液(每升10.8gTris鹼，5.5g硼酸和4ml0.5MEDTApH8.0)中的1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。將來自變性溫度51.40C的大約700bp的PCR產物條帶從凝膠切出，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)根據生產商的說明進行純化，並測序。PCR片段的DNA測序是用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA,USA)使用染料終止子化學(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods3847-60)和引物步移策略進行的。獲得了部分序列，其包含與其它已知的α-葡糖醛酸糖苷酶的同源性。實施例3分離全長特異腐質黴GH67Aα-葡糖醛酸糖苷酶基因從特異腐質黴DSM1800使用GEN0MEWALKERUniversalKit(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)根據供應商的說明分離了全長的家族67α-葡糖醛酸糖苷酶基因。簡言之，將來自特異腐質黴DSM1800的總基因組DNA分別用四種產生平端的不同限制性酶(DraI.EcoRV.PvuII和StuI)消化。然後將每批經消化的基因組DNA分別連接於GENOMEWALKERAdaptor(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)以創建四個文庫。然後將這四個文庫在使用六個如下所示的基因特異性引物的PCR反應中用作模板，其中兩個是用於初級和次級PCR擴增靠近所述基因5』端的片段上遊的部分(步移IN-端)，兩個是用於初級和次級PCR擴增直至編碼所述α-葡糖醛酸糖苷酶基因的N端的5』端的上遊(步移2Ν-端)，而兩個是用於初級和次級PCR擴增直至編碼所述α-葡糖醛酸糖苷酶基因的C端的3』端的片段的下遊。下述引物是基於實施例2所述的來自特異腐質黴的部分家族67α-葡糖醛酸糖苷酶基因序列而設計的。N-端步移1引物HinsAGGSP15，R(初級)5'-TTGAAGCGGCTGCCGTTGAGGATGTC-3『(SEQIDNO5)弓丨物HinsAGGSP25，R(次級)5'-AGTTCCTTCCACATGGGCGCGAGGTAG-3『(SEQIDNO6)步移2:引物HinsAGGWseUntermRGSPl(初級)5'-ATAGCCACGCTCGACGCTGCCGTGAAT-3『(SEQIDNO7)引物HinsAGGW2ntermGSP2R(次級)5'-ACTGGTTCACCCAGCGGATGGGAGCAT-3『(SEQIDNO8)C-端:引物HinsAGGSP13，F(初級)5'-TCCAGACGCTGACCGACATCCTGTTGG-3『(SEQIDNO9)引物HinsAGGSP23，F(次級)5'-CCCGAGGTCGCCGAGCTGTATGAACAC-3『(SEQIDNO10)初級擴增物由1μ1(大約6ng)的作為模板的各文庫，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP禾口dCTP,IOpmolAdaptorPrimer1(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol引物HinsAGGSP15，R或HinsAGGWset2ntermRGSPl或HinsAGGSP13'F,IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer禾口1.25單位的ADVANTAGEGCGenomicPolymeraseMix組成，終體積為25μ1。擴增是使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行的，其程序為95°C預變性1分鐘；7個循環，每個循環在變性溫度95°C25秒；在72°C退火併延伸5分鐘；32個循環，每個循環在變性溫度95°C25秒，在67°C退火併延伸5分鐘；且在67°C最終延伸7分鐘。次級擴增物由各1μ1的初級PCR產物作為模板，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP禾口dCTP,IOpmolAdaptorPrimer2(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA),50pmol弓|·HinsAGGSP25'RHinsAGGW2ntermGSP2R或HinsAGGSP23'F,IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer禾口1.25單位的ADVANTAGEGCGenomicPolymeraseMix組成，終體積為25μ1。擴增是使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行的，其程序為在95°C預變性1分鐘；5個循環，每個循環在變性溫度95°C25秒；在72°C退火併延伸5分鐘；20個循環，每個循環在變性溫度95°C25秒，在67°C退火併延伸5分鐘；且在67°C最終延伸7分鐘。通過在TBE緩衝液中的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物。從5』端N-端步移IPCR擴增，分析了3個產物條帶來自EcoRV文庫的500-800bp塗抹的(smear)產物條帶，來自PvuII文庫的800bp產物條帶，和來自StuI文庫的500bp產物條帶。將3個產物條帶從凝膠切出，使用QIAQUICKGelExtractionKit純化，使用TOPOTACloningKit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)克隆入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，並如實施例2中所述進行測序。從5』端N-端步移2PCR擴增，分析了3個產物條帶來自EcoRV文庫的750bp產物條帶，來自PvuII文庫的400bp雙重產物條帶，和來自StuI文庫的2.2kb產物條帶。將3個產物條帶從凝膠切出，使用QIAQUICKGelExtractionKit純化，使用TOPOTACloningKit克隆入pCR2.1-TOPO載體，並如實施例2中所述進行測序。從3』端C-端PCR擴增，分析了2個產物條帶來自PvuII文庫的400bp產物條帶，和來自StuI文庫的2.2kb產物條帶。將2個產物條帶從凝膠切出，使用QIAQUICKGelExtractionKit純化，使用TOPOTACloningKit克隆入pCR2.1-TOPO載體，並如實施例2中所述進行測序。實施例4:pHinsGH67A的構建用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer使用染料終止子化學(Giesecke等，見上)和引物步移策略進行DNA測序。仔細檢查核苷酸序列數據的質量，並將所有的序列在PHRED/PHRAP軟體(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協助下相互比較。將PCR片段序列結果與實施例2中所述的來自特異腐質黴的部分家族67α_葡糖醛酸糖苷酶基因序列進行比較和比對。基於其編碼的蛋白與已知的α-葡糖醛酸糖苷酶同源物的相似性，構建了特異腐質黴α-葡糖醛酸糖苷酶序列的基因模型。設計了如下所示的兩個合成寡核苷酸引物以從實施例1中製備的基因組DNAPCR擴增特異腐質黴DSM1800α-葡糖醛酸糖苷酶基因。HinsAGBDInfNCOl5'-ACACAACTGGCCATGAAGAGCCTCCTGCTGCTCGCGGCCATT-3'(SEQIDΝ0:11)HinsAGBDInfPacl5，-CAGTCACCTCTAGTTATCAATCCACAATCCCCTTTCCATGCG-3，(SEQIDNO12)粗體字母代表編碼序列。剩餘的序列與pBM120a(W02006/078256)的插入位點同源，以供最終克隆入該質粒以供在黑麴黴MBinl20中表達特異腐質黴DSM1800α-葡糖醛酸糖苷酶基因。將五十皮摩爾的上述每種引物用於下述PCR反應，其由SOng特異腐質黴基因組DNA,IXExpandHighFidelityplusReactionBuffer(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，禾Π5單位的ExpandHighFidelityplusEnzymeBlend組成，最終體積為50μ1。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行擴增反應，其程序為1循環的95°C1分鐘，30個循環，每個循環在95°C30秒，620C30秒，和72°C2分30秒；和在72°C最終延伸7分鐘。然後對加熱塊進行4°C的浸泡循環(soakcycle)。將反應產物通過在TBE緩衝液中的1.0%瓊脂糖凝膠電泳來分離，其中將大約2.7kb的產物條帶從凝膠切出，並使用QIAQUICKGelExtractionKit純化。使用TOPOTACLONINGKit將純化的2.7kb凝膠片段克隆入pCR2.1-TOPO載體，以生成pHinsGH67A(圖2)。通過DNA測序來確證pHinsGH67A中的特異腐質黴GH67A插入物。大腸桿菌pHinsGH67A於2008年7月24日作為大腸桿菌NRRLB-50155保藏在農業研究機構專利培養物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北區石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,IL,USA。實施例5表徵編碼GH67Aα-葡糖醛酸糖苷酶的特異腐質黴基因組序列編碼GH67Aα-葡糖醛酸糖苷酶基因的特異腐質黴基因組序列的核苷酸序列(SEQIDNO1)和推定的胺基酸序列(SEQIDNO2)示於圖IA和1Β。基因組片段編碼861個胺基酸的多肽。全長編碼序列和成熟編碼序列的％G+C含量均為64.8%。使用SignalP軟體程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO1-6)，預測了15個殘基的信號肽。預測的成熟蛋白質包含846個胺基酸，具有95.6kDa的分子量。使用如EMBOSS的Needle程序中執行的Needleman-ffunsch算法(Needleman和恥118吐，1970，見上)，及缺口開放罰分(gapopenpenalty)為10，而缺口延伸罰分為0·5，和EBL0SUM62矩陣來確定胺基酸序列的比較配對全局比對(comparativepairwiseglobalalignment)。所述比對顯示特異腐質黴家族67α-葡糖醛酸糖苷酶基因的成熟多肽的推導的胺基酸序列與棒麴黴α-葡糖醛酸糖苷酶的推導的胺基酸序列(UniProt登錄號alccl2)共有63%的同一性。生物材料的保藏依據布達佩斯條約的條款，下述的生物材料已經保藏於農業研究機構專利培養物保藏中心，亦稱農業研究培養物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北區石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter)，1815UniversityStreet,Peoria,Illinois，61604，USA，並給予下述的登錄號保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌pHinsGH67ANRRLB-501552008年7月24日所述菌株於下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，由外國專利法律決定授權的人能夠獲得所述培養物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養物。在提交了題述申請的對應申請或其後續申請(progeny)的國家中，依據該外國專利法律的要求，可以獲得所述保藏物。然而，應當理解，保藏物的可獲得性並不構成對實施題述發明的許可，實施題述發明是對政府行為所授予的專利權的侵犯。通過下述編號的段落進一步描述本發明[1]一種具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少65%同一性的胺基酸序列的多肽；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中等嚴格條件下與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，或其全長互補鏈雜交；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性；和(d)包含取代、缺失和/或插入一個或多個(數個)胺基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。[2]段落1的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少65%同一性的胺基酸序列。[3]段落2的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少70%同一性的胺基酸序列。[4]段落3的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%同一性的胺基酸序列。[5]段落4的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的胺基酸序列。[6]段落5的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少85%同一性的胺基酸序列。[7]段落6的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少90%同一性的胺基酸序列。[8]段落7的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少95%同一性的胺基酸序列。[9]段落8的多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少97%同一性的胺基酸序列。[10]段落1的多肽，其包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段，或者由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段組成。[11]段落10的多肽，其包含SEQIDNO2的胺基酸序列，或者由SEQIDNO2的胺基酸序列組成。[12]段落10的多肽，其包含SEQIDNO2的成熟多肽，或者由SEQIDNO2的成熟多肽組成。[13]段落1的多肽，其是由在至少中等嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的。[14]段落13的多肽，其是由在至少中等_高嚴格條件下與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的。[15]段落14的多肽，其是由在至少高嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的。[16]段落15的多肽，其是由在至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼的。[17]段落1的多肽，其是由包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[18]段落17的多肽，其是由包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[19]段落18的多肽，其是由包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[20]段落19的多肽，其是由包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[21]段落20的多肽，其是由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[22]段落21的多肽，其是由包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少90%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[23]段落22的多肽，其是由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[24]段落23的多肽，其是由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少97%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的。[25]段落1的多肽，其是由如下多核苷酸編碼的，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的核苷酸序列或其編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO1或其編碼具有α「葡糖醛酸糖苷酶活性的片段的亞序列組成。[26]段落25的多肽，其是由如下多核苷酸編碼的，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的核苷酸序列，或由SEQIDNO1的核苷酸序列組成。[27]段落25的多肽，其是由如下多核苷酸編碼的，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。[28]段落1的多肽，其中所述多肽是包含取代、缺失和/或插入一個或多個(數個)胺基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。[29]段落1的多肽，其是由包含於質粒pHinsGH67A中的多核苷酸編碼的，所述質粒pHinsGH67A包含於大腸桿菌NRRLB-50155中。[30]段落1-29任一項所述的多肽，其中所述成熟多肽為SEQIDNO2的胺基酸16到861。[31]段落1-30任一項所述的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列為SEQIDNO:1的核苷酸46到2583。[32]一種分離的多核苷酸，其包含編碼段落1-31任一項所述的多肽的核苷酸序列。[33]段落32的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。[34]一種核酸構建體，其包含段落32或33的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接於一個或多個(數個)調控序列，所述調控序列在表達宿主中指導該多肽的產生。[35]一種重組表達載體，其包含段落34的核酸構建體。[36]一種重組宿主細胞，其包含段落32或33的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接於一個或多個(幾個)調控序列，其指導具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的產生。[37]一種產生段落1-31任一項所述多肽的方法，包括(a)在有助於該多肽產生的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式產生該多肽；和(b)回收所述多肽。[38]一種產生段落1-31任一項所述多肽的方法，包括(a)在有助於該多肽產生的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼該多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。[39]一種產生親本細胞的突變體的方法，包括破壞或缺失編碼段落1-31任一項所述多肽的多核苷酸或其部分，其導致所述突變體與所述親本細胞相比產生較少的該多肽。[40]一種突變體細胞，其是由段落39的方法產生的。[41]段落40的突變體細胞，進一步包含編碼天然或異源蛋白質的基因。[42]一種產生蛋白質的方法，包括(a)在有助於產生所述蛋白質的條件下培養段落41的突變體細胞；和(b)回收所述蛋白質。[43]段落32或33所述的分離的多核苷酸，通過下述方法獲得(a)在至少中等嚴格條件下將DNA群體與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有α「葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。[44]段落43的分離的多核苷酸，通過下述方法獲得(a)在至少中等_高嚴格條件下將DNA群體與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有α「葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。[45]段落44的分離的多核苷酸，通過下述方法獲得(a)在至少高嚴格條件下將DNA群體與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。[46]段落45的分離的多核苷酸，通過下述方法獲得(a)在至少非常高嚴格條件下將DNA群體與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。[47]段落43-46任一項所述的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列為SEQIDNO1的核苷酸46到2583。[48]一種產生包含突變體核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突變體核苷酸序列編碼具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽，所述方法包括(a)將至少一個突變導入SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中，其中所述突變體核苷酸序列編碼包含SEQIDNO:2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成的多肽；和(b)回收包含所述突變體核苷酸序列的多核苷酸。[49]一種由段落48的方法產生的突變體多核苷酸。[50]一種產生多肽的方法，包括(a)在有助於所述多肽產生的條件下培養包含編碼所述多肽的段落49的突變體多核苷酸的細胞；和(b)回收所述多肽。[51]一種產生段落1-31任一項所述多肽的方法，包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[52]一種轉基因植物、植物部分或植物細胞，其用使用編碼段落1-31任一項所述的多肽的多核苷酸轉化。[53]一種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落32或33的多核苷酸的亞序列，其中所述dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。[54]段落53的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其在長度上為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個雙鏈體核苷酸。[55]一種在細胞中抑制具有α_葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽表達的方法，其包括對所述細胞施用或在所述細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含段落33或34的多核苷酸的亞序列。[56]段落55的方法，其中所述dsRNA在長度上為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個雙鏈體核苷酸。[57]一種編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含SEQIDNO2的胺基酸1至15或由SEQIDNO2的胺基酸1至15組成。[58]一種核酸構建體，其包含編碼蛋白質的基因，所述基因可操作地連接於段落57的多核苷酸，其中所述基因對於所述多核苷酸為外源的。[59]一種重組表達載體，其包含段落58的核酸構建體。[60]一種重組宿主細胞，其包含段落58的核酸構建體。[61]一種產生蛋白質的方法，包括(a)在有助於產生下述蛋白質的條件下，培養包含編碼蛋白質的基因的重組宿主細胞，所述基因可操作地連接於段落57的多核苷酸，其中所述基因對於所述多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白質。[62]一種組合物，其包含段落1-31任一項所述的多肽。[63]一種降解或轉化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用酶組合物在段落1-31任一項所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下處理所述纖維素材料或含木聚糖材料。[64]段落63的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是經預處理的。[65]段落63或64的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種纖維素分解酶，一種或多種木聚糖降解酶，或者一種或多種木聚糖降解酶和一種或多種纖維素分解酶的組合。[66]段落65的方法，其中所述一種或多種纖維素分解酶選自下組內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[67]段落65或66的方法，其中所述酶組合物還包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。[68]段落65的方法，其中所述一種或多種木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[69]段落63-68任一項所述的方法，其中所述酶組合物還包含一種或多種選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。[70]段落63-69任一項所述的方法，還包括回收降解的纖維素材料或含木聚糖材料。[71]段落70的方法，其中所述降解的纖維素材料或含木聚糖材料是糖。[72]段落71的方法，其中所述糖選自下組葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。[73]一種產生發酵產物的方法，包括(a)用酶組合物在段落1_31任一項所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種發酵微生物發酵經糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產生發酵產物；和(C)自所述發酵回收發酵產物。[74]段落73的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是經預處理的。[75]段落73或74的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種纖維素分解酶，一種或多種木聚糖降解酶，或者一種或多種木聚糖降解酶和一種或多種纖維素分解酶的組合。[76]段落75的方法，其中所述一種或多種纖維素分解酶選自下組內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[77]段落75或76的方法，其中所述酶組合物還包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。[78]段落75的方法，其中所述一種或多種木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[79]段落73-78任一項所述的方法，其中所述酶組合物還包含一種或多種選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。[80]段落73-79任一項所述的方法，其中步驟(a)和(b)在同時糖化和發酵中同時進行。[81]段落73-80任一項所述的方法，其中所述發酵產物是醇、有機酸、酮、胺基酸或氣體。[82]一種發酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種發酵微生物發酵所述纖維素材料或含木聚糖材料，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是用酶組合物在段落1-31任一項所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下糖化的。[83]段落82的方法，其中發酵所述纖維素材料或含木聚糖材料產生發酵產物。[84]段落83的方法，還包括從發酵回收發酵產物。[85]段落82-84任一項所述的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是經預處理的。[86]段落82-85任一項所述的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種纖維素分解酶，一種或多種木聚糖降解酶，或者一種或多種木聚糖降解酶和一種或多種纖維素分解酶的組合。[87]段落86的方法，其中所述一種或多種纖維素分解酶選自下組內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[88]段落86或87的方法，其中所述酶組合物還包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。[89]段落86的方法，其中所述一種或多種木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[90]段落82-89任一項所述的方法，其中所述酶組合物還包含一種或多種選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。[91]段落82-90任一項所述的方法，其中所述發酵產物是醇、有機酸、酮、胺基酸或氣體。在本文中描述和要求保護的發明在範圍上並不受本文公開的特定方面所限，這是因為這些方面意欲說明本發明的數個方面。任何等同的方面應在本發明的範圍內。事實上，除本文中顯示和描述的那些之外，數種對本發明的修改從前述的描述對本領域技術人員將顯而易見。這些修改亦意欲落入所附權利要求的範圍內。在衝突的情況下，以包括定義的本公開為準。權利要求1.一種具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少65%同一性的胺基酸序列的多肽；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中等嚴格條件下與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性的核苷酸序列；和(d)包含取代、缺失和/或插入一個或多個(數個)胺基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。2.權利要求1的多肽，其包含SEQIDNO2的胺基酸序列或其具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段，或由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的片段組成。3.權利要求1的多肽，其由包含於質粒pHinsGH67A中的多核苷酸編碼，所述質粒pHinsGH67A包含於大腸桿菌NRRLB-50155中。4.一種分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-3任一項所述的多肽的核苷酸序列。5.一種重組宿主細胞，其包含權利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接於一個或多個(數個)調控序列，所述調控序列指導具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽的產生。6.一種產生權利要求1-3任一項所述多肽的方法，包括(a)在有助於該多肽產生的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式產生該多肽；和(b)回收所述多肽。7.—種產生權利要求1-3任一項所述多肽的方法，包括(a)在有助於該多肽產生的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼該多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。8.—種產生親本細胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權利要求1-3任一項所述多肽的多核苷酸或其部分，其導致所述突變體與所述親本細胞相比產生較少的該多肽。9.一種產生權利要求1-3任一項所述多肽的方法，包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。10.一種轉基因植物、植物部分或植物細胞，其是用編碼權利要求1-3任一項所述的多肽的多核苷酸轉化的。11.一種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含權利要求4的多核苷酸的亞序列，其中所述dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。12.—種在細胞中抑制具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽表達的方法，包括對所述細胞施用或在所述細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含權利要求4的多核苷酸的亞序列。13.—種編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含SEQIDN0:2的胺基酸1至15，或由SEQIDNO2的胺基酸1至15組成。14.一種產生蛋白質的方法，包括(a)在有助於所述蛋白質產生的條件下培養重組宿主細胞，所述細胞包含可操作地連接於權利要求13的多核苷酸的編碼蛋白質的基因，其中所述基因對於所述多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白質。15.一種降解或轉化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括在權利要求1-3任一項所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料或含木聚糖材料。16.權利要求15的方法，還包括回收降解的纖維素材料或含木聚糖材料。17.—種產生發酵產物的方法，包括(a)在權利要求1-3任一項所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種發酵微生物發酵經糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產生所述發酵產物；和(c)自所述發酵回收發酵產物。18.一種發酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種發酵微生物發酵所述纖維素材料或含木聚糖材料，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是在權利要求1-3任一項所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化的。19.權利要求18的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料的發酵產生發酵產物。20.權利要求19的方法，還包括從所述發酵回收所述發酵產物。全文摘要本發明涉及具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞以及產生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N9/24GK102112603SQ200980130147公開日2011年6月29日申請日期2009年7月29日優先權日2008年7月29日發明者米歇爾·馬蘭塔,金伯利·布朗申請人:諾維信公司