秋水仙鹼在製備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用的製作方法

2023-05-14 14:51:11

專利名稱：：秋水仙鹼在製備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及秋水仙鹼在製藥方面的應用，特別涉及秋水仙鹼在藥物治療膽汁淤積性肝病中的應用。
背景技術：
：秋水仙鹼來源秋水仙鹼是秋水仙藥材中的主要有效成分和毒性成分，一種卓酚酮類生物鹼。除百合科秋水仙屬外，同科其它屬，包括嘉蘭屬(Gloriosa)、益闢堅屬(Iphigenia)、安圭拉氏蘭屬(Auguillaria)和天南星屬(Arisaema)等植物中也含秋水仙鹼類生物鹼。化學名N-(5，6，7，9-四氫-1，2，3，10-四甲氧基-9-氧-苯並[a]庚間三烯並庚間三烯-7-基)乙醯胺，CAS:64-86-8。結構formulaseeoriginaldocumentpage3秋水仙鹼的主要藥理作用簡要歸納如下1.抗痛風目前秋水仙鹼主要用於急性痛風。秋水仙鹼對急性痛風性關節炎有選擇性的消炎作用，對一般的疼痛、炎症及慢性痛風均無效，其作用主要是消炎，抑制粒細胞浸潤，原因是與粒細的微管蛋白結合妨礙粒細胞的活動，秋水仙鹼能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。這種由秋水仙素引起的不正常分裂，稱為秋水仙素有絲分裂(c-mitosis)。在這樣的有絲分裂中，染色體雖然縱裂，但細胞不分裂，不能形成兩個子細胞，因而使染色體加倍。秋水仙鹼不論是破壞還是抑制紡錘體的形成，作用都是一時的。秋水素可以抑制紡錘體的形成，導致細胞不分裂，「然後過一段時間秋水仙素代謝掉，不再起作用，細胞繼續分裂，-然後才是「染色體數目加倍」(著絲點的分裂)。2.抗腫瘤作用秋水仙鹼是細胞有絲分裂強烈抑制劑，對腫瘤細胞的生長具有抑制作用。秋水仙鹼發揮微管蛋白聚合抑制因子的作用，能引起腫瘤內部新生的毛細血管損傷而導致出血性廣泛壞死。秋水仙鹼的A和C環可與微管蛋白亞單位微管蛋白結合，幹擾微管蛋白的組裝過程，從而使微管蛋比解聚。秋水仙鹼由於作用選擇性較低，毒性大，現已少用。3.神經系統秋水仙鹼具有神經毒性，主要與微管相結合，抑制軸漿運輸，導致神經元去營養退化死亡。秋水仙素可使尾殼核的神經元壞死。秋水仙鹼有增強或延長催眠藥物的作用，能降低體溫，增加對中樞藥物的敏感性，抑制呼吸中樞，增加對擬交感神經的反應。由於神經末端小體與秋水仙鹼結合，幹擾了神經遞質的轉運，從而改變了神經肌肉的功能，增強了胃腸的活動。4.抗纖維化/抗組織增生秋水仙鹼對肝臟纖維化、肺纖維化等均顯示出一定的預防和治療效果。對豬血清免疫性肝纖維化大鼠和血吸蟲感染小鼠，秋水仙鹼具有顯著抗肝纖維化的作用，明顯降低肝內各型膠原蛋白含量。秋水仙鹼對肺纖維化大鼠纖維連接蛋白的形成具有抑制作用。秋水仙鹼具有明顯的抑制炎症細胞和抗腎臟纖維化作用，能預防環孢黴素引起的腎間質纖維化和預防細菌感染引起的腎臟瘢痕形成，並能減緩腎小球硬化和間質纖維化。用腹主動脈縮窄的方法建立心肌肥厚大鼠模型，秋水仙鹼能有效抑制心肌肥厚發生、發展，同時明顯的下調心肌肥厚相關因子表達。秋水仙鹼腹腔注射，可預防家兔手術粘連。秋水仙鹼對體外培養的人大隱靜脈片的內膜增生具有抑制作用，這種抑制作用只有在培養早期施加藥物才能顯著。5.免疫系統和抗炎作用秋水仙鹼對免疫細胞的增殖、分化、趨化和炎症介質釋放等都有抑制作用。顯著抑制T細胞和B細胞功能，特別對白細胞功能及免疫細胞的運動和趨化作用的抑制尤為顯著。秋水仙鹼還能抑制免疫細胞和上皮細胞TNFa、IL-2、IL-6、TGF-β、粒-巨細胞集落刺激因子等的mRNA和蛋白質水平的表達和分泌，但對IL-Ιβ的產生有促進作用。秋水仙鹼通過抑制白細胞等細胞溶酶體酶的釋放、抑制活化的白細胞和巨噬細胞等產生5-脂氧化酶，使胞內cAMP濃度增加、促進前列腺素合成和釋放。秋水仙鹼對於C0X-2的基因表達和蛋白質合成也有抑制作用。秋水仙鹼尚能抑制嗜鹼性粒細胞和巨噬細胞分泌組胺，劑量倚賴性地抑制LPS刺激的大鼠巨噬細胞分泌TNFa，且秋水仙鹼作用於TNFa合成的早期，從而對動物肝毒性具有預防作用。目前秋水仙鹼作為一種常用的抗痛風藥和抗腫瘤藥。抗痛風用法用量治療急性痛風口服首劑lmg，以後23小時0.5mg，直至疼痛緩解。極量每日3mg。預防痛風急性發作每日或隔日0.5lmg。抗腫瘤用法用量靜滴每次24ml(12mg)，加5%葡萄糖50ml，緩慢滴注，每日1次，1療程4080ml。靜注每次2ml。用25%葡萄糖或等滲鹽水40ml，稀釋後緩注。膽汁淤積是由於膽汁生成障礙和(或)流動障礙所造成的一種臨床症候群。分為肝外膽汁淤積和肝內膽汁淤積。肝外膽汁淤積是指肝外膽管系統機械性梗阻所致的膽汁淤積；肝內膽汁淤積是指任何病因引起肝細胞和/或毛細膽管膽汁分泌功能障礙，或肝內小膽管瀰漫性梗阻所致的一系列的病理和臨床表現。膽鹽在肝內淤積，均可導致肝臟損傷和慢性膽汁淤積性肝病。隨著病情的進展，通常伴隨有血清鹼性磷酸酶升高、黃疸和高膽固醇血症，並逐步發展為肝纖維化、肝硬化甚至肝功能衰竭。目前膽汁淤積性肝病無特效藥，熊去氧膽酸作為常用的保肝藥也只能減輕膽汁淤積的症狀。文獻未見有關秋水仙鹼在治療膽汁淤積肝病的報導，發明人首次發現秋水仙鹼可以治療膽汁淤積肝病。
發明內容發明目的發明人提供一種秋水仙鹼在製備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用，特別提供秋水仙鹼在治療妊娠肝內膽汁淤積綜合症、內原發性膽汁性肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)重症黃疸和免疫性黃疸等膽汁淤積性肝病中的應用。技術方案妊娠肝內膽汁淤積綜合症、內原發性膽汁性肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)重症黃疸或免疫性黃疸膽汁淤積性肝病是膽汁淤積性肝病常見的病症之一。α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致膽汁淤積模型是研究PBC、PSC和重症黃疸常用的動物模型，17α-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積模型是常用的研究妊娠肝內膽汁淤積綜合症動物模型，膽管結紮致肝外膽汁淤積模型是常用的研究梗阻性黃疸的動物模型。採用α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致膽汁淤積模型，17α-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積模型，膽管結紮致大鼠肝外膽汁淤積模型，以50和100μg/kg的秋水仙鹼針對上述三種模型進行試驗，試驗結果表明秋水仙鹼對有效的降低肝臟出現明顯的損傷以及減少膽汁淤積，優於臨床常用藥熊去氧膽酸，從而說明秋水仙鹼可以治療膽汁淤積性肝病，增加了秋水仙鹼的新用途。治療膽汁淤積性肝病的潛在靶點有一、減少肝細胞攝取膽鹽及有機陰離子目前尚無特異性的減少肝細胞攝取膽鹽的藥物。研究顯示法尼醇X受體(FXR)激動劑，如GW4064，6-E⑶CA等可能是降低肝細胞攝取膽鹽的有效藥物。這類藥物能下調NTCP和OATPs的表達，減少肝細胞對膽汁酸及其他有機陰離子進入膽汁淤積的肝臟，避免肝內膽汁酸、膽紅素及其他膽汁成分的超載，但有導致血清膽汁酸和其他有機陰離子升高的副作用。相反，膽汁酸多價螯合劑和迴腸轉運抑制劑則無這類副作用，而秋水仙鹼可以上調肝臟膽汁酸受體FXR的表達，下調NTCP和OATPs的表達，減少肝細胞對膽汁酸及其他有機陰離子進入膽汁淤積的肝臟，減少肝損傷。二、促進肝細胞中膽汁酸鹽的轉運膽汁酸鹽和其他物質吸收進入肝細胞後，依靠他的疏水性，通過擴散的方式在細胞質或細胞內脂質膜內到達小管頂端，依靠肝細胞基側膜上的膽汁酸轉運體，如MRP2、MDR3、MRP3、0ATP2C和BSEP等將膽汁酸鹽排洩入毛細膽管。研究顯示，一些遺傳代謝性膽汁淤積症多是由於此類轉運體的缺陷或突變所引起，而慢性膽汁淤積時該類轉運體的表達和功能均下調，致各種潛在毒性的內源性和外源性物質的排洩受到影響。因此促進肝細胞基側膜上膽汁酸鹽轉運體的的表達和轉運能力，則可降低肝細胞內膽鹽及有機陰離子的蓄積和對肝細胞的毒性。秋水仙鹼能有效增加膽管中膽汁酸、膽紅素和磷脂轉運體BSEP、MRP2和MDR3的表達，促進體內淤積的膽汁酸、膽紅素和磷脂的排洩，減輕膽汁淤積。三、促進膽管細胞的排泌膽管細胞排泌功能的重要意義在於稀釋膽汁和清洗膽管。如囊性纖維化時，由於編碼Ca2+依賴的氯離子通道的CFTR基因突變，致氯離子依賴的HC03_分泌受損。而在PBC中，則存在膽管細胞碳酸氫鹽的分泌和Cl2HCO3-交換受損。刺激膽管細胞加強對膽鹽的排泌則可降低膽汁酸對膽管細胞的毒性。秋水仙鹼能有效增加膽管細胞對膽汁酸、膽紅素和磷脂的排洩，從而增加膽汁酸依賴性膽流(BSDF)和非膽汁酸依賴性膽流(BSIF)，促進膽管細胞排泌。四、保護膽管上皮細胞保護膽管上皮細胞免受膽汁酸的毒性損害，是治療以膽管損傷為主的慢性膽汁淤積疾病(如PBC、PSC)的重要措施。這類疾病中膽管上皮細胞是免疫介導損傷的靶點，高濃度的疏水性膽汁酸具有細胞毒性，可進一步加重膽管上皮細胞的損傷。一些少見的膽汁淤積性疾病，如遺傳性MDR3缺乏所致的進行性家族性肝內膽汁淤積III型，由於膽汁中缺乏磷脂，不能形成膽汁-磷脂的微膠粒來降低膽汁的毒性作用。因此改善膽汁酸與磷脂的失衡則可減輕膽汁酸的毒性。秋水仙鹼能有效上調肝臟MDR3表達，促進肝細胞對磷脂排洩，升高膽汁中磷脂的濃度，從而保護膽管上皮細胞，降低血清ALP和GGT水平，減少肝損傷。有益效果1、秋水仙鹼能有效降低膽汁淤積性肝病引起的肝損傷及膽汁淤積，即可以有效地治療膽汁淤積性肝病。2、秋水仙鹼能有效減輕膽汁淤積導致的肝細胞壞死、炎症細胞浸潤和毛細膽管增生。3、秋水仙鹼能有效增加膽管中膽汁酸、膽紅素和磷脂轉運體BSEP、MRP2和MDR3的表達，促進體內淤積的膽汁酸、膽紅素和磷脂的排洩，保護膽管上皮細胞，減少肝損傷。4、秋水仙鹼可以上調肝臟膽汁酸受體FXR的表達，下調NTCP和OATPs的表達，減少肝細胞對膽汁酸及其他有機陰離子進入膽汁淤積的肝臟，減少肝損傷。具體實施例方式實施例1、對α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致大鼠膽汁淤積作用α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致膽汁淤積模型是研究肝內膽汁淤積經典的模型。ANIT致大鼠膽汁淤積是採用ANIT50-100mg/kg灌胃給藥12h後出現膽汁淤積，24h後出現肝損傷和黃疸。實驗方案30隻220-250g雄性Wistar大鼠隨機分為5組，每組6隻正常對照組、模型組(ANIT50mg/kg灌胃)、褪黑素50mg/kg灌胃治療組、秋水仙鹼50和100μg/kg腹腔注射治療組。給藥組預防給藥5天，第5天後禁食過夜，給予ANIT造模，然後於造模後48h分別眼眶採血0.5ml測谷丙轉氨酶(ALT)、穀草轉氨酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)、γ-氨基轉肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)和總膽汁酸(TBA)。取肝臟用中性福馬林固定，石蠟包埋做組織切片，分別做H-E染色和免疫組化檢測FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表達。實驗結果顯示，模型組ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、TBA各項生化指標均顯著升高，肝臟出現肝細胞壞死和炎症細胞浸潤，FXR、BSEP,MRP2和MDR3的表達減低，表明肝臟出現明顯的損傷以及膽汁淤積，而秋水仙鹼2個治療組均能減輕肝細胞壞死和炎症細胞浸潤，增加BSEP、MRP2和MDR3的表達不同程度的明顯降低各項損傷血生化指標。血生化結果見下表。tableseeoriginaldocumentpage7**ρ<0.01，與正常組比較;#Ρ<0.05，·ρ<0·01，與模型組比較。實施例2、對17Ci-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積作用釆用17ex-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積作用造模。EE造模是研究妊娠期膽汁淤積常用的動物模型，釆用EE5mg/kg皮下注射連續5天即會造成膽汁淤積。實驗方案30隻雄性大鼠根據體重隨機分為以下5組，每組6隻正常對照組、模型組(EE5mg/kg，sc)、熊去氧膽酸50mg/kg灌胃治療組、秋水仙鹼50和100μg/kg腹腔注射治療組。其中EE造模給藥5天，造模前Ih給予秋水仙鹼，末次給藥後禁食過夜，眼眶釆血Iml測ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和TBA。取肝臟用中性福馬林固定，石蠟包埋做組織切片，分別做H-E染色和免疫組化檢測FXR、BSEP.MRP2和MDR3的表達。實驗結果顯示，模型組動物血清ALP、GGT、TBIL和TBA水平顯著升高，肝臟出現少量肝細胞壞死，FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表達降低，提示發生明顯的膽汁淤積和膽管損傷，而秋水仙鹼2個治療組均能不同程度的明顯降低各項損傷指標，減輕肝細胞壞死增加BSEP、MRP2和MDR3的表達不同程度的明顯降低各項損傷血生化指標。血生化結果見下表。tableseeoriginaldocumentpage7*ρ<0.05，**ρ<0.01，與正常組比較;#ρ<0.05，##ρ<0.01，與模型組比較。實施例3、對膽管結紮致肝外膽汁淤積作用採用膽管結紮致肝外膽汁淤積作用造模。大鼠膽總管結紮後第二天就出現膽汁淤積性黃疸，大鼠膽管結紮模型是常用的研究肝外淤積性黃疸的動物模型。實驗方案SD大鼠32隻，雌雄各半，腹腔注射劑量為400mg/kg水合氯醛麻醉沿腹白線切開，分離總膽管，雙重結紮並從中間剪斷，其中對照組6隻採用假手術方法，只分離膽管不結紮，用手術線縫合。兩天後存活24隻。分為對照組、模型組、熊去氧膽酸50mg/kg灌胃治療組、秋水仙鹼50和100μg/kg腹腔注射治療組。連續給藥5天，第5天禁食過夜，股動脈取血測血生化。取肝臟用中性福馬林固定做病理組織切片，分別做H-E染色和免疫組化檢測BSEP、MRP2和MDR3的表達。實驗結果顯示，模型組動物血清ALT、AST、ALP、GGT和TBA水平顯著升高，肝臟出現肝細胞壞死，炎症細胞浸潤和毛細膽管增生，FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表達降低，提示發生明顯的膽汁淤積和肝臟損傷，而秋水仙鹼2個治療組均能不同程度的明顯降低各項損傷指標。減輕肝細胞壞死，炎症細胞浸潤和毛細膽管增生，增加FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表達，明顯降低各項損傷血生化指標。血生化結果見下表。tableseeoriginaldocumentpage8**p<0.01，與正常組比較;#P<0.05，##p<0.01，與模型組比較。權利要求秋水仙鹼在製備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用。2.秋水仙鹼在製備治療妊娠肝內膽汁淤積綜合症、內原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎重症黃疸或免疫性黃疸膽汁淤積性肝病藥物中的應用。全文摘要本發明涉及秋水仙鹼在製藥方面的應用，特別涉及秋水仙鹼在藥物治療膽汁淤積性肝病中的應用；秋水仙鹼在製備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應用；秋水仙鹼在製備治療妊娠肝內膽汁淤積綜合症、內原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎重症黃疸或免疫性黃疸膽汁淤積性肝病藥物中的應用；秋水仙鹼能有效降低膽汁淤積性肝病引起的肝損傷及膽汁淤積，即可以有效地治療膽汁淤積性肝病；秋水仙鹼能有效減輕膽汁淤積導致的肝細胞壞死、炎症細胞浸潤和毛細膽管增生；秋水仙鹼能有效增加膽管中膽汁酸、膽紅素和磷脂轉運體BSEP、MRP2和MDR3的表達，促進體內淤積的膽汁酸、膽紅素和磷脂的排洩，減少肝損傷。文檔編號A61K31/165GK101822659SQ20101016855公開日2010年9月8日申請日期2010年5月11日優先權日2010年5月11日發明者周植星,尚靖,張陸勇,江振洲,王濤申請人:中國藥科大學