陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用的製作方法

2023-04-28 07:03:36

專利名稱：：陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用。
背景技術：
：特發性肺纖維化(ldiopathicPulmonaryFibrosis,IPF)是一種原因不明、以進行性呼吸困難為突出臨床表現的局限於肺部的一種特殊類型的慢性間質性肺炎，其病理改變為普通型間質性肺炎，以肺泡上皮損傷、成纖維細胞(Fibroblasts)增殖，並形成成纖維細胞灶(FibroblastFoci)為特徵。胸部影像學表現為瀰漫性網狀、網結節陰影或蜂窩樣改變，以中下肺野周邊胸膜下為重，而磨玻璃樣改變較少。肺功能呈限制性通氣功能障礙和/或彌散功能受損，導致低氧血症。近年來，隨著對肺間質性疾病研究的逐步深入，肺纖維化的發現率有明顯上升趨勢。IPF發病機制未完全闡明，至今也仍然沒有有效的藥物能逆轉IPF的自然過程及其終末結局。目前治療藥物仍以糖皮質激素和免疫抑制劑/細胞毒藥物為主，但療效均不理想，對人體具有明顯的毒副作用。如糖皮質激素，有效率僅10%~30%，甚至有報導無效，長期使用可引起嚴重的副作用。肺移植可以作為肺纖維化終末階段，即蜂窩肺階段的唯一有效治療方法，但是由於適當的供體的缺乏、昂貴的醫療費用及免疫排斥等副作用，使它的開展受到限制。IPF預後甚差，確診後平均存活24年，5年生存率為30%~50%，嚴重危害病人的健康和生存。因此，積極尋找能有效阻斷膠原沉積，延緩纖維化進程，並具有毒副作用小、長期服用安全可靠等特點的治療方藥，具有十分重要的理論和現實意義。陳皮為芸香科植物橘(C&mr幼'cw/afeBlanco)及其栽培變種的乾燥成熟果皮。陳皮氣香，味辛、苦，性溫，入脾、肺經。陳皮為常用傳統中藥，採用湯劑入藥方式，具有理氣健脾、燥溼化痰之功效，主要用於治療呼吸系統和消化系統疾病。研究表明陳皮提取液具有抗過敏、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤的作用及免疫調節作用，陳皮提取物能抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖，促進其凋亡及I型膠原分解。在陳皮及其有效成份對肺的藥理學研究中，目前僅發現陳皮揮髮油有刺激性祛痰作用，陳皮水提取物及揮髮油對離體豚鼠支氣管平滑肌具有舒張作用，尚無陳皮對肺纖維化及肺成纖維細胞作用的研究報導。
發明內容本發明提供陳皮提取物在製備治疔肺纖維化藥物中的應用，可以有效減少膠原沉積，延緩纖維化進程。所述陳皮提取物為陳皮加溶媒加熱回流後得到的提取物或陳皮經水蒸汽蒸餾得到的揮髮油。所述溶媒一般為水、乙醇或異丙醇。其中乙醇優選為質量百分比濃度為50%-100%的乙醇，更優選為質量百分比濃度為75%的乙醇。所述陳皮提取物按下述方法製得(1)將乾燥陳皮粉碎成粉狀，加溶媒，浸過陳皮表面l2cm，加熱，回流1小時，趁熱過濾；(2)在藥渣中按(1)中的方法再加溶媒加熱回流，趁熱過濾；(3)合併濾液，將濾液減壓濃縮，乾燥得到陳皮水提物乾粉。其中所述乾燥可以為公知的各種方式，如風乾、60度以下烘乾或冷凍乾燥。作為本發明的改進，所述揮髮油為用水蒸汽蒸餾後用有機溶劑萃取，使有機溶劑揮發後得到的揮髮油。所述有機溶劑為乙醚或石油醚。本發明中利用水、乙醇等溶媒提取，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，或利用水蒸氣蒸餾法得到揮髮油，成功地得到了陳皮提取物，將之作為治療肺纖維化的藥物進行實驗研究，結果表明可以降低與纖維化緊密相關的生物指標血清及肺中羥脯氨酸含量、肺組織中轉化生長因子(31蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表達水平，有效抑制人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖，延緩肺泡炎的產生和肺纖維化進程。同時陳皮為常用傳統中藥，毒副作用小、長期服用安全可靠。具體實施例方式實施例1:陳皮提取物製備具體製備方法如下①將乾燥陳皮粉碎成粗粉，加適量的蒸餾水，浸過藥材表面約l2cm，加熱，回流1小時，趁熱過濾。在藥渣中再加適量蒸餾水同法加熱回流，趁熱過濾，合併濾液。②濾液減壓濃縮，冷凍乾燥得到陳皮提取物乾粉，以下簡稱水提物。實施例2:陳皮提取物製備具體製備方法如下①將乾燥陳皮粉碎成粗粉，加適量的75%乙醇，浸過藥材表面約12cm，加熱，回流1小時，趁熱過濾。在藥渣中再加適量75%乙醇同法煎煮，合併濾液。②濾液減壓濃縮，冷凍乾燥得到陳皮提取物乾粉，以下簡稱醇提物。實施例3:陳皮提取物製備具體製備方法如下乾燥陳皮粉碎成粗粉，用水蒸氣蒸餾法提取揮髮油反覆多次，合併蒸餾液並用乙醚萃取，收集乙醚液，揮幹，得到陳皮提取物，以下簡稱揮髮油。實施例4:陳皮水提物、醇提物和揮髮油對人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖抑制作用實驗在DEME培養液(美國HyClone公司)中加入10%小牛血清和1%青黴素G鉀和鏈黴素製成培養液，取2-3代匯合度80%的HELF細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用上述培養液製成濃度為5xl044(個/毫升)細胞懸液，接種於96孔細胞培養板，每孔接種100微升，置於37'C，5%C02飽和溼度條件下培養，培養12小時。待細胞完全貼壁，形態延展良好後加入含有不同濃度的待測藥的DMEM培養液，培養24小時，其中，藥物濃度為藥物與全體細胞培養液的質量體積比，陽性對照藥潑尼松為目前的臨床使用的肺纖維化治療藥，其加入量為l微摩爾。利用MTT法(波長570nm)測定吸光值，計算抑制率[g卩(對照組吸光值一藥物組吸光值)/對照組吸光值]，結果如下-抑制率(％)待測藥300毫克/毫升150毫克/毫升15毫克/毫升毫克/毫升0.5毫克/毫升0毫克/毫升1微摩爾對照_—一一_0.0±10.7—潑尼松_—————19.8士2.3*水提物—290,7±7.1**—104.0士22.2"一0.9士5.218.6±4.1*16.6±4.6*——醇提物15.9±7.529.2±2.5*51.0±3.7*49.7±2.1*37.5±4.3*——揮髮油46.6±1,1*49.7±5.8*54.5±0.5*44.2±2.7*41.7±6.7*——"一"表示對人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖具有促進作用。*屍<0.05，**P<0.01。從上表可以看出陳皮水提物、醇提物和揮髮油對人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖均有抑制作用，以乙醇提取物和揮髮油作用為強。實施例5:陳皮醇提物對博萊黴素誘導的大鼠肺纖維化的防治作用實驗將35隻SD大鼠編號、稱重後，隨機分為A、B、C、D、E五組，每組7隻。A組正常組。B組對照組。C組潑尼松組，建模後次日起每天用潑尼松5毫克/公斤，灌胃。D組陳皮醇提物組，建模後次日起每天用陳皮乙醇提物100毫克/公斤，灌胃。E組陳皮醇提物組，建模後次日起每天用陳皮乙醇提物200毫克/公斤，灌胃。其中，B-E組按照下列方法建模，步驟如下用苯巴比妥腹腔注射將大鼠麻醉後仰臥於實驗臺上，固定大鼠頭部和四肢，輕輕拉出舌，壓迫舌腹，在額鏡直視下，窺見聲門，趁大鼠吸氣瞬間，迅速將與注射器相連的頂端磨鈍的9號腰穿針(藥液預先裝在注射器內)插入約達氣管分叉處，緩緩注入博萊黴素溶液，用量為0.2毫升/100克。注藥完畢將動物直立、旋轉數分鐘，儘量使藥物在肺內分布均勻。A組按上述步驟一次性氣管內注射生理鹽水0.2毫升/100克，作為正常組。大鼠清醒後常規分籠飼養。各組大鼠均於實驗第28天，灌胃給藥2小時後麻醉，腹主動脈取血後處死，製備血清，並行肺組織取樣，進行下列項目的檢測l)一般情況觀察分別觀察各組大鼠造模前後及給藥幹預前後的-一般狀態，包括體重情況、體毛情況、精神狀態、活動情況、呼吸及死亡情況等。結果見下表(大鼠體重，單位為克)tableseeoriginaldocumentpage6*屍<0.05，**屍<0.01。由於氣管內注入博萊黴素造成大鼠機體呼吸功能障礙，繼發引起機體營養物質的消化、吸收出現嚴重障礙，體內分解代謝大於合成代謝，而使機體出現生長緩慢。大鼠早期出現體重下降(第一、第二周)。潑尼松為目前臨床使用抗肺纖維化治療藥，該藥雖能提高食慾，但因其有促進蛋白質分解、抑制其合成及抑制免疫而導致生長緩慢、肌肉消瘦等副作用，故潑尼松組大鼠體重下降尤為明顯。結果表明第7天時對照組、潑尼松組的體重顯著低於正常組(屍<0.01);而醇提取物100和200毫克/公斤/天劑量組體重與對照組比較有顯著性增加(J°<0.05)，陳皮乙醇提取物200毫克/公斤/天組在第二周還可以顯著增加大鼠的體重(P<0.05)。與潑尼松相比，陳皮乙醇提取物沒有潑尼松的副作用，可以顯著改善由博萊黴素造成的大鼠體重下降。2)血清和肺組織羥脯氨酸含量血清和肺組織羥脯氨酸含量用樣本鹼水解法及紫外分光光度計檢測。結果如下tableseeoriginaldocumentpage6*P<0.05，屍<0.01。肺纖維化的特點是肺中膠原蛋白合成的速度大於降解的速度，膠原纖維顯著增多，最終導致膠原的逐漸積累。羥脯氨酸是組成機體膠原蛋白的一種特有的胺基酸，除彈性蛋白含少量羥脯氨酸(約1%)外，幾乎所有羥脯氨酸都存在於膠原中，故組織中羥脯氨酸含量能反映器官纖維化的程度。結果表明陳皮乙醇提取物200毫克/公斤/天組(E)血清及肺中羥脯氨酸含量顯著低於對照組，陳皮乙醇提取物100毫克/公斤/天組(D)血清羥脯氨酸含量與對照組比較無顯著性差異，但肺組織羥脯氨酸含量與對照組比較有顯著性差異。顯示了陳皮乙醇提取物具有降低羥脯氨酸含量的作用，從而降低纖維化的程度。3)肺組織病理學觀察右肺常規固定後，用PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.4)衝洗、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟定向包埋，製成蠟塊，4微米連續切片，行HE(蘇木精-伊紅)及VanGieson(VG)染色，觀察肺組織病理學變化，奧林巴斯光學顯微鏡觀察並照像，確定肺泡炎和肺纖維化的程度，並將肺泡炎和肺纖維化分級及計算積分，進行病理半定量分析。結果見下表。組別肺泡炎纖維化-+卄4+f積分-+卄積分正常組A2000.3±0,5**1100.4±0.8**對照組B00432.4±0.500162.9±0.4潑尼松組C0401.4±0.5**0221.9±0.9*醇提物組D011.7±0.8*02411.9±0.7*醇提物組E23201.0±0.8"13301.3±0.8***屍<0.05，**P<0.01。肺部病理形態的改變是最為直觀的療效衡量標準。本實驗結果顯示對照組肺泡間隔明顯增厚，大量炎性細胞浸潤，重度纖維組織增生，可見大量成纖維細胞增殖和膠原纖維，胸膜下肺泡結構破壞紊亂，肺泡隔變薄或斷裂，且對照組病理積分較正常組高，存在顯著性差異。結果表明陳皮乙醇提取物100毫克/公斤/天組(D)及200毫克/公斤/天組(E)肺泡炎積分和肺纖維化積分顯著低於對照組，對肺纖維化具有防治作用。4)肺組織中轉化生長因子pi(TGF-PO蛋白及信使核糖核酸(mRNA)的表達水平組別蛋白TGF-^信使核糖核酸面積(平方微米)積分光密度面積(平方微米)積分光密度正常組A359.79±20.73**56.55±6.76"209.72±28.23*59.10±6.31*對照組B567.88±88.8075.05±7.41367.34±46.5577.24±1.92潑尼松組c472.73±39.83*65.44±8.42*279.77±26.95*71.55±2.00*醇提物組D461.19±72.00*64.54±2.00*283.58±26.35*72.32±3.47*醇提物組E368.07±63.72*62.08士2.92*267.75±21.54*69.26±6.01***戶<0.05，**P<0.01。轉化生長因子(31是已知作用很強的致纖維化細胞因子，在肺纖維化發生的細胞因子網絡中佔據著重要地位，對肺纖維化的發生發展至關重要；該因子在肺纖維化發生發展過程中持續上調，它可以趨化並促進成纖維細胞的增殖，刺激成纖維細胞分泌前膠原。結果表明陳皮乙醇提取物100毫克/公斤/天(D)及200毫克/公斤/天組(E)可以顯著降低肺組織中轉化生長因子P1蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表達水平。本結果說明陳皮乙醇提取物可以通過降低轉化生長因子(31蛋白及信使核糖核酸兩個方面的表達發揮抑制肺纖維化的功效。權利要求1.陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用。2.如權利要求1所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述陳皮提取物為陳皮加溶媒加熱回流後得到的提取物或陳皮經水蒸汽蒸餾得到的揮髮油。3.如權利要求2所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述溶媒為水、乙醇或異丙醇。4.如權利要求3所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述乙醇為質量百分比濃度50%-100%的乙醇。5.如權利要求4所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述乙醇為質量百分比濃度為75%的乙醇。6.如權利要求2-5中任一項所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述陳皮提取物按下述方法製得(1)將下燥陳皮粉碎成粉狀，加溶媒，浸過陳皮表面12cm，加熱，回流1小時，趁熱過濾；(2)在藥渣中按(1)中的方法再加溶媒加熱回流，趁熱過濾；(3)合併濾液，將濾液減壓濃縮，乾燥得到陳皮提取物乾粉。7.如權利要求6所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述乾燥為風十、60度以下烘乾或冷凍乾燥。8.如權利要求2所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於揮髮油為用水蒸汽蒸餾後用有機溶劑萃取，使有機溶劑揮發後得到的揮髮油。9.如權利要求8所述的陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，其特徵在於所述有機溶劑為乙醚或石油醚。全文摘要本發明提供陳皮提取物在製備治療肺纖維化藥物中的應用，可以有效減少膠原沉積，延緩纖維化進程。所述陳皮提取物為陳皮加溶媒加熱回流後得到的提取物或陳皮經水蒸氣蒸餾得到的揮髮油。所述陳皮提取物按下述方法製得(1)將乾燥陳皮粉碎成粉狀，加溶媒，浸過陳皮表面1～2cm，加熱，回流1小時，趁熱過濾；(2)在藥渣中按(1)中的方法再加溶媒加熱回流，趁熱過濾；(3)合併濾液，將濾液減壓濃縮，乾燥得到陳皮提取物乾粉。本發明可以降低與纖維化緊密相關的生物指標血清及肺中羥脯氨酸含量、肺組織中轉化生長因子β1蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表達水平，有效抑制人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖，延緩肺泡炎的產生和肺纖維化進程。文檔編號A61K36/752GK101554422SQ20091002793公開日2009年10月14日申請日期2009年5月13日優先權日2009年5月13日發明者周賢梅申請人:江蘇省中醫院