體外診斷結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法

2023-05-01 10:48:21

專利名稱：體外診斷結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法
體外診斷結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法本發明涉及癌學領域。更特別地，本發明提供了通過確定取自患者的生物學樣品 中白細胞彈性蛋白酶抑制劑(LEI)的存在而體外診斷人類患者中的結腸直腸癌的方法，所 述方法可用於早期診斷、篩選、治療隨診以及預後，還可用於結腸直腸癌的復發診斷。結腸直腸癌(CRC)是主要的公共健康問題。據估計1996年其在世界範圍的新發 病例為875000例^考慮到男女性別，其是最常在西方國家發生的癌症，其通常被分類為癌 症所致死亡的前3個主要因素之一。考慮到所有階段，5年存活率在60%範圍內。只有早期診斷才能賦予治癒性治療的希望。然而，目前還沒有血清學篩選檢驗，也 沒有早期特異性診斷檢驗方法。目前在歐洲使用兩種不同方法篩選結腸直腸癌首先，使用臨床異常性 (paraclinical)檢驗，其包括檢查糞便中是否存在血(Faecal Occult BloodTest-FOBT，例 如以Hemoecult 名稱銷售)。已經證實這個技術的臨床實用性。當每2年對在50-74歲之 間的個體使用該技術時，可以使結腸直腸癌導致的死亡率降低15-20% 2。為此，一半以上的 人群必須定期參與篩選，且必須對陽性檢驗事件進行結腸鏡檢查，任選隨後進行適當治療。然而，這種篩選技術具有如下一些不利之處 這個檢驗的主要缺點是其特別是對於腺瘤(癌前異常增生(dysplastic)病變) 的靈敏性較差，如果腺瘤較大，將導致1/10的病例發展為癌症。 這個檢驗也不是非常特異性的。糞便中出現血可以與非腫瘤病變相關潰瘍性結 腸炎、痔瘡、肛瘻等。在這種情況中，必須進行結腸鏡檢查，結腸鏡檢查的缺點在後文描述。 最後，Hemoccult 檢驗難以解釋；因此其必須在專業中心由有資格的能勝任的 人員詮釋。也已經描述了特異於人血紅蛋白的免疫學檢驗(FecaEIA ，Heme Select 等)。 與Hemoccult 相比，它們大概有進步，但是基本上還存在相同問題。因此，由Enterix公司 銷售的Insure 使得可以檢測87%患有CRC的患者，以及47%具有癌前息肉的患者。這是 一種檢測糞便中人血紅蛋白、特別是檢測這個分子中的珠蛋白部分的檢驗方法。第二種篩選方法是在50歲以後對人系統進行結腸鏡檢查，這樣在理論上可以降 低由於結腸直腸癌所致死亡率。然而，對於使用內窺鏡進行篩選的政策，健康個體對這種 檢查的可接受性太低而不能降低死亡率(已經建立這個篩選計劃的歐洲國家結腸鏡檢查 的順從水平是大約2% )。結腸鏡檢查存在並非不顯著的結腸穿孔和出血(0. )及死亡 (1/10000)的風險，而且對於公共衛生事業也是非常昂貴的。此外，結腸鏡檢查需要非常嚴 格的預先結腸準備，這在很大程度上解釋了順從性不佳的原因。長久以來已經描述了可以通過免疫測定化驗結腸直腸癌的腫瘤標記物。所述腫瘤 標記物特別是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。CEA用於隨診。由於其靈敏性和特異性不足而不可用於篩選或者早期診斷結腸直 腸癌。這是因為該標記物由其它類型癌症及在良性病變中表達。無論如何，通過組合CEA 與另一種腫瘤標記物如CA19-9或CA72-4可以增加靈敏性而不喪失其特異性。CA19-9的生理學改變的原因很罕見，但是其它良性病變(肝膽病症、胰腺病症)或者惡性病症可以導致CA19-9增高。因此，單獨這個標記物對於診斷也無意義。然而，由於 其血清濃度與腫瘤的大小和存在轉移瘤相關，因此其也可以用於治療隨診或者早期證實復 發。另外，已經提議可商購的檢驗，如> Colopath / ColorectAlert",由Ambrilia銷售，其是一種快速且相對非侵入
性CRC的篩選檢驗。Colopath 檢測患有結腸直腸病變個體的直腸粘液中的縮醛磷脂(是 磷脂的一部分的複合脂質)，而ColorectAlert 檢測直腸粘液中的一種複合糖，即T-抗原。 Colopath / ColorectAlert"檢驗包括將直腸粘液塗於檢驗條帶上，陽性或陰性結果基於 Schiff 反應。Ambrilia 已經研究了 1787 個個體，證實Colopath / ColorectAlert 3 檢測 出54%的早期結腸直腸癌病例和49%所有階段組合病例。>C0LARIS,由Myriad Genetics銷售，是在血液中檢測MLH1和MSH2基因突變以 篩選遺傳性非息肉性結腸癌(HNPCC症候群)。該檢驗的結果在3周內獲得。Myriad使用 目前可利用的最靈敏和最特異性的測序技術。該檢驗成本昂貴。>m-70 ，由AMDL銷售，是一種篩選各種類型癌症(肺癌、結腸癌、乳腺癌、肝 癌、胃癌等)的檢驗。因此其對於CRC不具有特異性。該檢驗的原理是基於雙夾心ELISA 技術(測定DR-70抗原)。通過酶反應(抗體與生物素或者鏈黴抗生物素蛋白結合)進行 揭示。生色反應表示癌症的存在。本申請人令人驚奇地證實一種新的腫瘤標記物，其由結腸腫瘤釋放至癌組織之 外，且是這些腫瘤的特徵，由此可以在遠離腫瘤的生物學樣品及在腫瘤自身中檢測到。因此，本發明第一方面是體外診斷結腸直腸癌的方法，其通過確定取自疑似患有 結腸直腸癌的患者的生物學樣品、優選遠離腫瘤的生物學樣品中白細胞彈性蛋白酶抑制劑 的存在而進行診斷。本發明還涉及這種方法在結腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診及預後中以及 在結腸直腸癌的復發診斷中的應用。本發明的方法因此可以通過簡便的檢驗方法特異性且早期診斷結腸直腸癌，所述 檢驗方法包括檢查取自患者的生物學樣品、優選遠離潛在腫瘤的生物學樣品中白細胞彈性 蛋白酶抑制劑的存在。這是因為本申請人出乎意料地揭示了結腸腫瘤不僅分泌白細胞彈性 蛋白酶抑制劑，而且特異性釋放其至癌組織之外，這在後文詳細描述，且其在本發明方法的 生物學樣品中的濃度與在健康人體中確定的參考值相比增加。在遠離或非遠離腫瘤的生物學樣品中確定白細胞彈性蛋白酶抑制劑的存在使得 可以推斷查找的病變。本發明方法的一個優勢是可以使用遠離潛在腫瘤的樣品作為診斷樣 品，從而可以進行簡便且非侵入性診斷，而組織學診斷需要進行侵入性活組織檢查。事實 上，例如對組織切片進行的組織標記物的研究(免疫組織化學)也許具有預後意義，但是對 於篩選或者診斷結腸直腸癌無意義。白細胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標記物(Swiss Prot No. P30740，也稱作LEI、 Serpin Bl、單核細胞/中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑、M/NEI或EI)在1992年測序3。LEI 特異性抑制具有彈性蛋白酶型或者糜蛋白酶型性質的蛋白酶，其通過在SDS作用下形成不 可解離的複合物而起抑制作用4。因此LEI抑制由中性粒細胞產生的三種主要的蛋白酶白細胞彈性蛋白酶、蛋白酶_3和組織蛋白酶G。這些蛋白酶能通過蛋白酶解細胞外或吞噬的 底物而使得免疫系統防禦生物體。然而，當這些蛋白酶過量時，其可造成炎症反應。因此， LEI在調節和限制細胞蛋白酶誘導的炎症作用中起作用。不過，目前還沒有報導過LEI有可 能用作癌症的標記物，特別是結腸直腸癌的標記物，以及可在遠離腫瘤的樣品中對其進行 分析。短語「確定腫瘤標記物的存在」是指確定所述蛋白質或者其信使RNA的存在，或者 檢測其基因上編碼或非編碼序列中的修飾如甲基化。短語「由結腸腫瘤釋放」是指無論機制如何由腫瘤細胞自身或者由鄰近的非腫瘤 細胞在損傷後的主動或被動分泌或者釋放的腫瘤標記物，或者是由腫瘤進展引起的細胞表 型的修飾。短語「對其進行本發明方法的生物學樣品」是指可能含有感興趣的腫瘤標記物的 任何生物學樣品。可以提及的非遠離腫瘤的生物學樣品例如可以是固體樣品如源自患者的 腫瘤、該腫瘤的活檢組織、淋巴結或者轉移瘤的組織，以及純化自這些固體樣品的細胞。可 以提及的遠離腫瘤的生物學樣品例如是生物學液體如全血或其衍生物例如血清或血漿、尿 液、唾液和滲出液、骨髓以及糞便，以及純化自這些液體樣品的細胞。優選血液及其衍生物 以及糞便、滲出液和純化自這些液體樣品的細胞。本發明的方法可以通過檢測除了 LEI之外還檢測至少一種其它腫瘤標記物而改 善，所述標記物也適當地由結腸腫瘤釋放至癌組織之外。因此，組合至少兩個標記物使得可 以改善診斷結腸直腸癌的檢驗的特異性和靈敏性。因此，本發明另一方面也包括確定選自如下兩組標記物(單獨或組合考慮)的至 少一種其它腫瘤標記物的存在-A組埃茲蛋白(Ezrin)、醯化胺基酸水解酶1、肝脂肪酸結合蛋白、腸脂肪酸結合 蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白All和I-絲束蛋白(I-Plastin)，其中一些標記物是本申請人 鑑別的新標記物；-B組具有額外的診斷意義的標記物，S卩0 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝 素-3(GaleCtin-3)、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網蛋白、再生胰島衍生蛋白3 a (Regenerating Islet-Derived Protein 3 a )、腫瘤相關鈣離子信號傳導蛋白1、細胞骨架角蛋白II型8、 細胞骨架角蛋白I型18、細胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、 CEA、絨毛蛋白(Villin)、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2,睪酮、TIMP-1、Cripto-1、 Intelectin-1、蛋白質二硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛素 (原)-A5 ((Pro) defensin-A5)，血液中甲基化模式特異性改變的DNA片段的檢測，例如AXL4 基因的甲基化DNA(無芒樣同源框-4基因(aristaless-likehomeobox-4gene)甲基化)或 者s印tin-9基因的甲基化DNA，糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便DNA的特異性突 變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測。 本發明的方法因此可以通過檢測至少兩個標記物而改善，一個是LEI，另一個是選 自A組的另一腫瘤標記物，所述A組即埃茲蛋白、醯化胺基酸水解酶1、肝脂肪酸結合蛋白、 腸脂肪酸結合蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白All和I-絲束蛋白。 「新描述的腫瘤標記物」是指蛋白質或信使RNA或者相應基因的特異性修飾，如突 變或者甲基化。
埃茲蛋白標記物(Swiss Prot No. P15311，也稱作p81，Cytovillin或絨毛蛋 白_2)是提供細胞膜與細胞骨架肌動蛋白絲之間結合的蛋白質，特別是在腸上皮細胞的微 絨毛中5。W. G. Jiang和S. Hiscox6已經揭示了白細胞介素IL_2、IL_8、IL-10等可以抑制 埃茲蛋白在HT29人結腸直腸癌細胞系中的表達。同一作者7也揭示了 HT115和HRT18結 腸直腸癌細胞系中埃茲蛋白表達的抑制降低細胞之間的粘附，且增加細胞的活動性和侵入 行為。他們推斷埃茲蛋白通過與細胞粘附分子E-鈣粘蛋白和連環蛋白(0-Catenin) 的相互作用調節細胞/細胞和細胞/基質之間的粘附。他們提出埃茲蛋白在控制癌細胞的 侵潤潛力中可以起重要作用。此外，T.Xiao等8使用ELISA量化肺癌患者的血漿埃茲蛋白。 然而，他們未觀測到與對照個體的任何差異。本申請人令人驚奇地揭示了這種蛋白質在取 自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離或者非遠離所述腫瘤。醯化胺基酸水解酶1標記物(Swiss Prot No. Q03154,也稱作EC3. 5. 1. 14，N_醯 基-L-胺基酸氨基水解酶或ACY-1)是醯化胺基酸水解酶家族的一部分。它們是催化醯化 的胺基酸水解的酶以提供脂肪酸和胺基酸9。對醯化胺基酸水解酶活性進行的免疫化學測 定在早如1975年由K. Lorentz等「1揭示，其用於檢驗各種組織和血清「。研究示出在肝病 變的病例中醯化胺基酸水解酶活性增加，但是在結腸癌病例中不增加。此外，醯化胺基酸水 解酶1基因已經在染色體3p21. 1上鑑別12。在小細胞肺癌中3p21. 1區域降低為純合性， 在這種情況中醯化胺基酸水解酶表達被抑制或不可檢測13。相似地，S. Balabanov等14已 經揭示在腎癌病例中醯化胺基酸水解酶表達被抑制。本申請人令人驚奇地揭示這種蛋白質 在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品可以是遠離該腫瘤的樣 品或非腫瘤樣品。肝脂肪酸結合蛋白標記物(SwissProt No. P07148，也稱作L_FABP、FABP1、FABPL、 Z_蛋白或者固醇轉運蛋白)屬於FABP家族，其包含9個同種型。每個同種型根據首先檢 測到該同種型的組織命名。這些同種型具有共有的功能及相似的三維結構，但是其序列同 源性不高。L-FABP在1985年被測序15。其是15kDa的小型蛋白質，高豐度存在於細胞溶膠 中，且具有結合游離脂肪酸和膽紅素的能力。近來的一些研究似乎表明L-FABP蛋白表達的 削弱可誘導腫瘤發生。對於前列腺癌，腫瘤活檢組織中L-FABPmRNA表達水平比在正常組織 中高10倍16。對於結腸癌，一些研究小組使用二維電泳技術已經鑑別了與在正常結腸黏膜 組織中的表達相比L-FABP蛋白在腫瘤組織中的表達降低17。這個結果也已經通過免疫組 織化學技術證實。此外，L-FABP蛋白在已經轉移至肝的結腸直腸癌患者中是預後肝臟切除 的標記物18。本申請人令人驚奇地揭示了這種蛋白質在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品 中是良好的標記物，所述樣品遠離所述腫瘤。腸脂肪酸結合蛋白標記物(Swiss Prot No. P12104，也稱作I-FABP、FABP-2或 FABPI)在1987年被測序19。其是15kDa的小型蛋白質，高豐度存在於細胞溶膠中，且具有 結合游離脂肪酸和膽紅素的能力。I-FABP蛋白在小腸的腸上皮細胞中表達，且可以組成這 種類型細胞蛋白質含量的大約2%。在組織水平，十二指腸和空腸與結腸相比顯然含有較 高數量的I-FABP (空腸4. 8 u g/g，結腸0. 25 u g/g)20。I-FABP在健康個體的血漿樣品中 不可被檢測到。另一方面，在某些病理學情況如腸缺血、克羅恩病或者原發性膽汁性肝硬 化中，可以證實在某些個體中血漿I-FABP濃度增加2°。對於前列腺癌，已經揭示了 I-FABP mRNA在腫瘤活檢組織比在正常組織中的表達水平高7倍16。在大鼠中用氧化偶氮甲烷(azoxymethane)誘導的結腸直腸癌模型中，當給予動物降低癌症發生的食物(大豆蛋白或 者乳清水解產物)時，I-FABP mRNA的表達水平降低2. 92-3. 97倍21。本申請人令人驚奇地 揭示了這種蛋白質在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離 所述腫瘤。載脂蛋白是由極性胺基酸組成的蛋白質家族，其可以通過形成稱作脂蛋白的親水 性大分子複合物而轉運血液中的脂質。對於每種人血漿載脂蛋白，存在衍生自遺傳多態性 和/或翻譯後修飾的同種型，其在血液中的存在與某些病變相關22。載脂蛋白的血漿濃度 並非是不顯著的，在mg/ml級別23。載脂蛋白AI標記物(NCBI No. 490098，也稱作Apo A_I、Apo AI和ApoAl)是具有 243個胺基酸的28kDa蛋白質。其基本上由肝和腸合成。通過SELDI-T0F，揭示了這種蛋白 質在結腸直腸癌患者血清與在健康個體血清中相比豐度不高24。然而，這篇文章指出通過 組合Apo AI與其它蛋白質標記物區別CRC患者與健康個體。此外，這篇文章指出由另一研 究小組進行的通過濁度免疫測定分析Apo AI未證實這種蛋白質在CRC患者血清中的豐度 不高25。Hachem等26測定了在結腸直腸癌轉移之後患有肝癌的患者血清中的Apo AI。本 申請人:令人驚奇地揭示了通過免疫測定分析可以證實這種蛋白質在結腸直腸癌患者中的 濃度降低，與先前Engwegen等24提出的結果相反，其僅通過實施SELDI-T0F技術才能證實 這種降低。通過在生物學樣品中進行免疫測定分析Apo AI是診斷結腸直腸癌的良好方法， 所述樣品遠離所述腫瘤，進行的免疫測定分析不是Zhang等的小組所用的比濁法25。載脂蛋白All 標記物(Swiss Prot No. P02652,也稱作 ApoA II、Apo-AII 和 Apo A2)是由每個鏈具有77個胺基酸的兩個多肽鏈組成的173gO-Da蛋白質，所述兩個多肽鏈通 過二硫鍵連接。如載脂蛋白AI —樣，載脂蛋白All也基本上由肝和腸合成。除了 Apo AI 之外，Hachem等26也測定了在結腸直腸癌轉移之後患有肝癌的患者血清中的Apo All。然 而，結果無意義，且不能得以推斷病症。本申請人令人驚奇地揭示了結腸直腸癌患者中這種 蛋白質濃度降低，使其在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品 遠離所述腫瘤。I-絲束蛋白標記物(Swiss Prot No. Q14651，也稱作腸特異性絲束蛋白或者絲 束蛋白1)屬於人絲束蛋白家族，該家族具有三個代表性成員1_絲束蛋白、L-絲束蛋白 和T-絲束蛋白。一些作者將絲束蛋白類稱為「微絲結合蛋白類(Fimbrins)」，另一些作 者將I-絲束蛋白稱為微絲結合蛋白。絲束蛋白類是結合肌動蛋白形成細胞骨架的蛋白 質。它們是70kDa蛋白質，在真核生物進化中相對良好保守。它們呈現出良好組織特異性， 在一個時期僅一種同種型在正常組織中存在27。絲束蛋白類在癌症中的應用已經在專利 US-A-5360715中描述，該專利提議了一種確定細胞是造血細胞還是血管發生性即癌性細胞 的方法。這種方法要求在細胞水平測定L-絲束蛋白和T-絲束蛋白，更特別是測定其mRNA。 然而，儘管呈現這些性質，但是先前未進行研究以評估絲束蛋白在使用血清或糞便樣品診 斷結腸直腸癌中的重要性。此外，從未設想I-絲束蛋白作為潛在的癌標記物28。本申請人 令人驚奇地揭示了這種蛋白質在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所 述樣品遠離所述腫瘤。在對其進行本發明方法的生物學樣品中，選自A組的腫瘤標記物的濃度根據考慮 的標記物與在健康個體中確定的參考值相比增加或降低。
本發明的方法也可以通過組合檢測LEI與選自B組的一種其它腫瘤標記物 而改善，所述B組標記物即標記物0 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、L-乳酸 脫氫酶B鏈、鈣網蛋白、再生胰島衍生蛋白3a、腫瘤相關鈣離子信號傳導蛋白1、細胞 骨架角蛋白II型8、細胞骨架角蛋白I型18、細胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白 (Epithelial-Cadherin)、CEA、絨毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睪酮、TIMP-1、 Cripto-1、Intelectin-1、蛋白質二硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛 素(原)-A5 ；血液中甲基化DNA的檢測，優選AXL4基因的甲基化DNA (無芒樣同源框_4基 因甲基化)或者s印tin-9基因的甲基化DNA ；糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便 DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測。 當然，本發明的方法也可以在同一測定中檢測LEI、選自B組的至少一種腫瘤標記物以及選 自A組的至少一種其它腫瘤標記物。旦2-微球蛋白標記物(Swiss Prot No. P61769，也稱作3 2_微球蛋白，3 2M)是在 大多數有核人細胞表面發現的一種低分子量(ll_12kDa)蛋白質。在某些癌症患者中，血清 3 2-微球蛋白水平增加，這種增加不是特異性的，或者與腫瘤的性質、疾病的階段或嚴重性 不相關。在其它疾病如紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、乾燥症候群、淋巴系統惡性疾病(多發 性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或AIDS)以及在血友病患者中也觀測到 顯著增加。由於02-微球蛋白被腎小球濾過，且由近端小管重吸收，因此在腎臟疾病中其 在血液中的濃度可以改變。因此測定0 2-微球蛋白主要用於診斷腎臟病症，或者用於獲得 性免疫缺陷病毒感染的隨診中。然而，已知這種標記物是腫瘤標記物，特別是結腸癌的標記 物。蛋白酶體20S標記物(也稱作Prosome)是蛋白酶體的中心結構，其自身是參與遍 在蛋白的細胞內降解的分子複合物29。蛋白酶體是由在7個亞基的4個環締合的28個亞基 組成的700kDa的分子複合物。在人體中，已知7個a單位(al，a 2，a 3，a 4，a 5，a 6 和 a 7)及 10 個 3 單位(3 1，3 2，3 3，3 4，3 5，3 6，3 7，3 li，3 2i 禾口 3 5i)。通過其 催化性質，蛋白酶體在細胞增殖、生長、調節和凋亡中且因此在癌化途徑中起關鍵作用。用 Bortezomib (Velcade)抑制蛋白酶體是公認的治療多發性骨髓瘤的方法。現在正對血液癌 症或腫瘤進行II期或III期治療試驗。T. Lavabre-Bertrand等3°揭示了在某些病理狀況 特別是在癌症(骨髓瘤、淋巴瘤和實體瘤)中，蛋白酶體的血清水平可增加。半乳凝素-3標記物(Swiss Prot No. P17931，也稱作Gal_3、半乳糖特異性凝集 素3、MAC-2抗原、IgE-結合蛋白、35kDa凝集素、碳水化合物結合蛋白35、CBP 35、昆布氨 酸_結合蛋白、凝集素L-29、L-31、半乳糖苷結合蛋白或者GALBP)是能結合N-乙醯氨基乳 糖(acetyllactosamine)型的0 -半乳糖苷結構的凝集素。其是參與多種生物學功能的多 功能蛋白質，所述功能包括腫瘤細胞的粘附、增殖、分化、血管發生、細胞凋亡、轉移癌進展 31 o多項研究表明Gal-3可以與許多分子形成複合物CEA、IgE、昆布氨酸(Laminin)、粘蛋 白(Mucin)、Mac-2BP、LAMP 1、LAMP2、纖連蛋白(Fibronectin)等。Gal_3 的血清測定已經 由I. Iurisci等32描述。Gal-3在用Mac-2-結合蛋白(Gal_3-結合蛋白)包被的微滴定 平板上被捕獲，然後用抗-Gal-3大鼠抗體揭示。這項研究揭示了 Gal-3在胃腸道癌症、乳 腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤中增加的血清水平。L-乳酸脫氫酶B鏈標記物(Swiss Prot No. P07195,也稱作LDH-B，LDH心單位或LDH-H)是可以以同源四聚體形式形成複合物的蛋白質。這種蛋白質也可以與L-乳酸脫氫 酶A鏈蛋白(Swiss ProtNo.P00338，也稱作LDH-A、LDH肌單位或LDH-M)以異源四聚體形 式形成複合物。血流中稱作LDH的這種四聚體複合物的血清劑量和/或血清酶活性在許多 實體瘤中與腫瘤大小成比例地增加。推薦其與人絨毛膜促性腺激素(日-hCG)和胎盤鹼性 磷酸酶組合用於精囊癌的隨診中。LDH被認為是預後淋巴瘤、白血病或者結腸癌的重要標記 物33。鈣網蛋白標記物(SwissProt No. P27797,也稱作 CRP55、Calregulin、HACBP、 ERp60或grp60)是多功能蛋白質。其是能與內質網的幾乎所有單糖基化蛋白質瞬時相互作 用的凝集素。D.J.McCool等34因此已經揭示了鈣網蛋白參與結腸粘蛋白MUC2的成熟。在 組織、糞便或體液中使用鈣網蛋白測定診斷CRC的方法在專利申請W0 03/065003中描述。再生胰島衍生蛋白3a標記物(Swiss Prot No. Q06141，也稱作Reg Ill-a、胰腺 炎相關蛋白1或者胰腺炎相關蛋白I (PAP 1))是在正常胰腺中微弱表達的蛋白質。其在 急性胰腺炎和在某些慢性胰腺炎患者中過表達。在這種情況中，其出現在胰液和血流中35。 Y. Motoo等36通過ELISA已經揭示了某些結腸癌、胃癌、肝癌或胰腺癌以及在腎功能衰竭患 者血液中PAP 1水平增加。為此,他們使用Dynabio(La Gaude,France)公司銷售的ELISA 測定法(PANCEPAP)。腫瘤相關鈣離子信號傳導蛋白1標記物(Swiss Prot No. P16422，也稱作主要胃腸 道腫瘤相關蛋白GA733-2、上皮細胞表面抗原、EpCAM、上皮糖蛋白EGP、腺癌相關抗原、KSA、 KS 1/4抗原、細胞表面糖蛋白Trop-1或者CD326抗原)根據其由結腸直腸癌細胞的抗體識 別的能力在1979年被鑑定37。已知這種蛋白質有許多名稱，如上文描述，但是最常用的是 稱其為EpCAM。其是在某些上皮細胞以及許多癌症細胞的基底面中表達的跨膜蛋白38。在 1982年，Herlyn等39揭示了注射抗-EpCAM單克隆抗體可以抑制結腸直腸癌患者體內腫瘤 生長。這些結果使得可以基於稱作Edrecolomab的抗-EpCAM抗體開發抗腫瘤治療方法。這 種治療以Panorex 名稱銷售。此外，H. Abe等4°通過ELISA揭示了稱作MK-1的可溶形式 的EpCAM在10%研究的癌症患者血流中增加。細胞角蛋白是組成上皮細胞細胞骨架的中間絲的蛋白質部分。目前已經鑑別了超 過20種的人細胞角蛋白。細胞角蛋白8 (Swiss Prot No. P05787，也稱作細胞角蛋白、CK_8、 角蛋白-8或K8)、18 (Swiss Prot No. P05783，也稱作細胞角蛋白_18、CK_18、角蛋白-18或 K18)和19 (Swiss Prot No. P08727，也稱作細胞角蛋白_19、CK_19、角蛋白-19或K19)在上 皮細胞中豐度最高，且是診斷癌病變的有效工具41。這種臨床重要性與細胞凋亡或增殖期上 皮細胞釋放細胞角蛋白相關。在細胞凋亡情況中，這個釋放以可溶片段形式出現，似乎在半 胱氨酸蛋白酶的蛋白酶解作用下出現。血流中未降解的細胞角蛋白形式從未有報導。三種 臨床最常用的細胞角蛋白測定是組織多肽抗原(TPA)測定，組織多肽特異性抗原(TPS)測 定和CYFRA 21-1測定。TPA是測量細胞角蛋白8、18和19的廣譜檢驗法。TPS和CYFRA21-1 測定分別更特異性測量細胞角蛋白18和細胞角蛋白19的片段。這三種檢測法檢測可溶 的細胞角蛋白片段，所述片段可以以其自身或者以蛋白質複合物形式呈現。TPA、TPS或者 CYFRA-21-1已經用於結腸直腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某些 ENT癌的治療隨診中。事實上，血液中可溶的細胞角蛋白的測定在篩選腫瘤復發或者評估所 用治療(放療、化療、激素治療)的反應中具有臨床價值。定期檢測使得特別可以評估腫瘤的進展。可溶的血液細胞角蛋白的量也具有預後腫瘤階段和轉移形成的意義。目前，最常 用的細胞角蛋白血液測定是CYFRA 21-1。高度推薦其用於非小細胞肺癌患者的隨診。有 許多可商購的 TPA(AB SangtecMedical Co.，Byk-Roland 等)、TPS(IDL Biotech AB, BEKI Diagnosiss 等)禾口 CYFRA-21-1 (Roche Diagnosiss, CIS Bio-International, Fujirebio Diagnosiss等)的試劑盒。此外，H. Kim等42揭示了測定糞便細胞角蛋白19 (DiNonA Inc.) 組合便潛血測定可用於篩選胃腸道疾病。最後，細胞角蛋白20 (Swi ss ProtNo. P35900，也稱 作細胞骨架I型角蛋白20、CK-20、角蛋白-20、K20或者IT蛋白)在結腸直腸癌中作為標 記物的應用在專利申請US 2002/0160382中描述。上皮鈣粘蛋白標記物(Swiss Prot No. P12830，也稱作E-鈣粘蛋白、Uvomorulin、 鈣粘蛋白-1、CAM 120/80或者CD324抗原)是介導鈣離子依賴性細胞粘附的跨膜蛋白。其 在上皮細胞中特異性表達，在此參與維持其表型。E-鈣粘蛋白的細胞質結構域結合連 環蛋白，其自身結合細胞骨架的肌動蛋白絲網。這種E-鈣粘蛋白連環蛋白結合在穩 定上皮組織的細胞/細胞粘附中起重要作用。因此，E-鈣粘蛋白的喪失可降低細胞粘附且 增加癌細胞的侵潤能力。E-鈣粘蛋白或者連環蛋白的表達降低通常與腫瘤特別是胃 腸道癌症的更大的侵潤性和去分化性相關聯。因此，F. Roca等43揭示了患有結腸直腸癌且 E-鈣粘蛋白低表達的患者與具有正常表達水平的患者相比具有更不利的預後。在1983年， Damsky等44揭示了可溶形式的E-鈣粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌細胞系釋放。這種可溶形式 相應於E-鈣粘蛋白胞外部分的裂解。隨後，M. Katayama等45揭示了可溶形式的E_鈣粘蛋 白在癌症情況中可以釋放進入血流中；C.Willmarms等46揭示了血液中E-鈣粘蛋白量增加 與結腸直腸癌的腫瘤階段相關聯。此外，可商購的試劑盒由Takara BioChemicals (Tokyo, Japan)公司提供。自1965年以來，P. Gold和S. Freedman47已經提議測定CEA(癌胚抗原)用於診 斷結腸直腸癌，但是血液中這個標記物的測定對於診斷相對非晚期結腸直腸癌的靈敏性不 佳。因此，測定血清CEA尤為推薦用於評估肝轉移風險48以及用於治療隨診。此外，其對於 結腸直腸癌不是非常特異性的標記物；事實上其在許多其它癌症(肺癌、乳腺癌等)中均增 加。另一方面，測定糞便CEA似乎比測定血清CEA或者測定便血更靈敏且更具特異性49。然 而，這種測定還未被常規提議。反應性抗原性決定簇1116-NS-19-9，更通常稱作CA19-9 (碳水化合物抗原19. 9)， 由高分子量蛋白質攜帶5°。測定血液中CA 19-9與測定CEA相比更具特異性。血液中CA 19-9水平在結腸直腸癌、胰腺癌和肝癌(肝膽管型肝癌)中增加，但是在非癌病症(膽管炎 等)中也增加。在診斷癌症及該病症的隨診中推薦其與CEA組合。J. Holmgren等51揭示了在結腸直腸癌患者血清中CA 50抗原的量增加。CA 50抗 原根據其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。關於CA 72標記物，T. L. Klug等52揭示了在結腸直腸癌患者血清中CA 72抗原的 量增加。CA 72抗原根據其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。相似地，P. Kuusela等53揭示了在結腸直腸癌患者血清中CA 242抗原的量增加。 CA 242抗原根據其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。M. Holland等54提議測定睪酮以診斷結腸直腸癌。這些作者揭示了結腸直腸癌患 者血液睪酮水平降低。
關於TIMP-1，或者1型基質金屬蛋白酶的組織抑制劑這個標記物，專利申請US 2007/0020707描述了通過測定體液中TIMP-1診斷結腸直腸癌。F. Model等55在2006年7月在胃腸道癌症國際會議期間揭示了可以檢測結腸直 腸癌患者血漿中s印tin-9基因的甲基化形式。M. P. Ebert等56揭示了 ALX4基因或者無芒樣同源框_4基因在結腸直腸癌患者 血清中比在對照血清中更通常被甲基化(P < 0. 0001)。使用41. 4pg/mL閾值，他們獲得了 83. 3%的靈敏性和70%的特異性。絨毛蛋白在專利申請FR2581456中被描述為診斷結腸直腸癌的血液標記物。C. Bianco等57揭示了在結腸直腸癌患者血清中Cripto-1的量增加。測定Intelectin-1 (Swiss Prot No. Q8WWA0，也稱作腸乳鐵蛋白受體、呋喃半乳 糖結合凝集素、內皮細胞凝集素HL-1或者Omentin)用以診斷結腸直腸癌在專利申請US 2003/0082533 中描述。蛋白質二硫鍵異構酶(Swiss Prot No. P07237,也稱作EC 5. 3. 4. 1、PDI、脯氨醯 4-羥化酶0亞基、細胞甲狀腺激素結合蛋白或者p55)、翻譯控制的腫瘤蛋白(Swiss Prot No.P13693，也稱作TCTP、p23、組胺釋放因子、HRF或Fortilin)以及防衛素(原)-A5 (Swiss Prot No. Q01523)用作結腸直腸癌標記物分別在專利申請EP1724586、US 2003/0172388和 US 2006/0179496中描述。術語「防衛素(原)」是指前體(即裂解前的防衛素原)；前肽 (即防衛素原裂解後的N末端部分)；以及成熟蛋白質(即防衛素，相應於裂解後C末端部 分)。最後，測定人糞便血紅蛋白是已知的檢驗法，且可以如前述實施。對其進行本發明方法的生物學樣品中選自B組的腫瘤標記物的濃度根據考慮的 標記物與在健康個體中確定的參考值相比是增加或降低的。優選地，B組腫瘤標記物選自0 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、L-乳酸 脫氫酶B鏈、鈣網蛋白、再生胰島衍生蛋白3a、腫瘤相關鈣離子信號傳導蛋白1、上皮鈣粘 蛋白、CEA、CA19-9、睪酮、TIMP-l、Intelectin-l、蛋白質二硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、翻譯 控制的腫瘤蛋白、防衛素(原)"A5及檢測人糞便血紅蛋白。當然，本發明的方法也可包括檢測本領域技術人員已知的結腸直腸癌任何其它標 記物。如上所述，感興趣的腫瘤標記物以蛋白質形式或者以信使RNA形式或者通過相應 DNA改變(突變或甲基化修飾)而被檢測。可以通過本領域技術人員已知的確定樣品中蛋白質存在的任何方法確定生物學 樣品中感興趣的「蛋白質」腫瘤標記物的存在，例如生物化學檢驗，包括免疫測定，或者通過 質譜分析。所述生物化學檢驗可以是本領域技術人員熟知的任何檢驗，包括分子相互作用， 即所述腫瘤標記物與特異於或者非特異於所述腫瘤標記物的一或多種結合配偶體之間的 反應。優選地，所述生物化學檢驗是本領域技術人員已知的免疫測定，包括腫瘤標記物 (即抗原)與一或多種特異性結合配偶體(即該抗原的抗體)之間的免疫學反應。本發明方法中特異於或非特異於腫瘤標記物的結合配偶體是能結合所述標記物的任何配偶體。當其能以高特異性、甚至以100%特異性結合這些標記物時，認為其是特異 性的。當其與這些標記物的結合特異性較低且同時能結合其它配體如蛋白質時，認為其是 非特異性的。例如，可以提及的是抗體、抗體一部分、受體及能結合這個標記物的任何其它 分子。所述結合配偶體抗體是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。多克隆抗體可以通過用相關的腫瘤標記物免疫動物，隨後回收純化形式的希望的 抗體而獲得，通過從所述動物取血清，將所述抗體從其它血清組分中分離，特別是在附著有 該抗體特異性識別的抗原、特別是所述標記物的柱上通過親和層析分離。單克隆抗體可以通過雜交瘤技術獲得，其一般原理在後文描述。首先，用感興趣的腫瘤標記物免疫動物(通常是小鼠)，隨後所述動物的B淋巴細 胞可以產生該抗原的抗體。這些產生抗體的淋巴細胞隨後與「永生化的」骨髓瘤細胞(例 如鼠)融合以產生雜交瘤。使用由此獲得的細胞異源混合物，選擇能產生特定抗體且無限 增殖的細胞。每個雜交瘤均以克隆形式增殖，導致單克隆抗體產生，其由所述腫瘤標記物識 別的性質可例如通過ELISA、通過一維或二維Western印跡、通過免疫螢光或者通過生物傳 感器檢測。隨後純化由此選擇的單克隆抗體，特別是通過上述親和層析技術純化。所述單克隆抗體也可以是通過本領域技術人員熟知的遺傳工程化技術獲得的重 組抗體。已知抗-白細胞彈性蛋白酶抑制劑抗體的實例，且可得自Abeam目錄兔抗_LEI多 克隆抗體，Cat. No.Ab47731。抗-LEI單克隆抗體，克隆ELA-1，由R. Yasumatsu等描述58。已知抗-埃茲蛋白抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗-埃茲蛋白單克隆抗體， 克隆3C12，Cat. No. Ab4069和兔抗-±矣茲蛋白多克隆抗體，Cat. No. Ab47418。已知抗-醯化胺基酸水解酶1抗體的實例，且可得自Abnova目錄，抗-醯化氨基 酸水解酶1單克隆抗體，克隆4F1-B7, Cat. No. H00000095-M01,以及Abeam目錄，雞抗-醯 化胺基酸水解酶1多克隆抗體，Cat. No. Ab26173。已知抗-肝脂肪酸結合蛋白抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗_L_FABP單克隆 抗體，克隆 6B6，Cat. No. Abl0059，及兔抗-L-FABP 多克隆抗體，Cat. No. Ab7807。已知抗-腸脂肪酸結合蛋白抗體，且可得自R&D Systems目錄，抗-I-FABP單克 隆抗體，克隆323701，Cat. No.MAB3078，及Abeam目錄，兔抗_I_FABP多克隆抗體，Cat. No.Ab7805o已知抗-載脂蛋白AI抗體的實例，且可得自Biodesign Meridian LifeSciences 目錄，抗-Apo AI單克隆抗體，克隆4A90，〇&1唚.朋540211，和山羊抗-六口(^1多克隆抗體， Cat. No. K45252P。已知抗-載脂蛋白All抗體的實例，且可得自US Biological目錄，抗-ApoAII單 克隆抗體，克隆 1402，Cat. No. A2299-31C，及 Biodesign Meridian LifeSciences 目錄，山 羊抗-Apo All 多克隆抗體，Cat. No. K74001P。已知抗-I-絲束蛋白多克隆抗體的實例，且可得自Santa CruzBiotechnology目 錄。兔多克隆抗體H-300(Cat.No. sc-28531)與1_絲束蛋白、L-絲束蛋白和T-絲束蛋白 反應。本申請人揭示了 I-絲束蛋白的單克隆抗體。已知抗2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睪酮抗體的實例，且可用於本申請人的測定試劑盒中，分別是Vidas 3 2-微球蛋白、Vidas CEA、vidas CA19-9 和 Vidas 睪酮。已知抗-蛋白酶體20S抗體的實例，且可得自Affinitiy Research Products目錄。已知抗-半乳凝素-3、抗-L-乳酸脫氫酶B鏈、抗-鈣網蛋白、抗-腫瘤腫瘤相關 鈣離子信號傳導蛋白1、抗_細胞骨架II型角蛋白8、抗-細胞骨架I型角蛋白18、抗-細 胞骨架I型角蛋白19、抗-上皮-鈣粘蛋白、抗_絨毛蛋白和抗-TIMP-1抗體的實例，且可 得自Abeam目錄。已知抗-再生胰島衍生蛋白3 a抗體的實例，且用於Dynabio測定試劑盒(La Gaude, France)中。已知抗-CA 242、抗-CA 50和抗_CA 72_4抗體的實例，且可得自Fujirebio目錄。已知抗-Intelectin-1抗體的實例，且可得自Alexis Biochemicals目錄， 抗-Intelectin-1 單克隆抗體，克隆 Saly-1，Cat. No. ALX-804-850-C100，以及 rabbit 抗-Intelectin-1 多克隆抗體，Cat. No. ALX-210-941。已知抗-蛋白質二硫鍵異構酶抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗_PDI單克隆 抗體，克隆RL77，Cat. No. Ab5484，以及兔抗-PDI多克隆抗體，Cat. No. Ab3672，已知抗-細胞角蛋白20抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗-細胞角蛋白20 單克隆抗體，克隆Ks20. 8，Cat.No.Ab962,以及兔抗-細胞角蛋白20多克隆抗體，Cat. No.Ab367560已知抗-TCTP抗體的實例，且可得自目錄，抗-TCTP單克隆抗體，克隆3C7，Cat. No. 157H00007178-M01,以及抗-TCTP 多克隆抗體，Cat. No. 157H00007178-A01。已知抗-防衛素-A5抗體的實例，且可得自Santa Cruz Biotechnology目 錄，抗-防衛素-A5單克隆抗體，克隆8C8，Cat. No. sc-53997，以及AlphaDiagnosis International Inc.目錄，兔抗-防衛素 _A5 多克隆抗體，Cat. No. HDEFA51-A。本發明方法中特異於或者非特異於腫瘤標記物的結合配偶體可用作捕獲劑，作為 檢測劑，或者作為捕獲劑和檢測劑。可以通過任何檢測方式如直接或間接檢測方式觀測免疫反應，即腫瘤標記物/結 合配偶體的結合。在直接檢測即不包含標記情況中，免疫反應通過例如表面等離子共振技術或者在 具有傳導性聚合物的電極上通過循環伏安法(cyclic voltametr)觀測。間接檢測是利用標記「揭示試劑」結合配偶體，或者是感興趣的腫瘤標記物自身進 行。在後者情況中，其隨後被描述為競爭方法。術語「標記」是指使標記試劑的附著能直接或間接產生可檢測的信號。這些標記 試劑非限制性包括 酶，其產生例如通過比色法、螢光或者發光而可被檢測的信號，所述酶例如是辣 根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、3 "半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脫氫酶； 生色團，如螢光或發光化合物或染料； 放射性分子，如32p、35S或1251，以及 螢光分子如Alexa或藻藍蛋白。
也可以使用間接檢測系統，例如能與抗配體反應的配體。配體/抗配體對為本領 域技術人員熟知，例如如下一對生物素/鏈黴抗生物素，半抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝 集素，多核苷酸/與該多核苷酸互補的序列。在這種情況中，其是具有結合配對物的配體。 抗配體可以通過前文所述標記試劑直接檢測，或者通過配體/抗配體自身檢測。這些間接檢測系統在一定條件下可以導致信號放大。這種信號放大技術為本領 域技術人員熟知，可參見本申請人先前的專利申請FR98/10084或W0-A-95/08000，或者 Chevalier等的文章59。根據所用標記的類型，本領域技術人員加入使得可以觀測顯示標記的試劑。舉例的上述免疫測定可以提及的是「夾心」方法，如ELISA、IRMA和RIA，「競爭」方 法和直接免疫檢測方法如免疫組織化學、免疫細胞化學、Western印跡和Dot印跡方法。質譜分析法也可用於在生物學樣品中檢測本發明方法探求的腫瘤標記物。光譜法 的原理為本領域技術人員熟知，例如在Patterson，S.60中描述。為此，將預處理或未預處理的生物學樣品經過質譜分析儀，將獲得的質譜與本發 明方法尋找的腫瘤標記物的質譜對比。舉例的樣品預處理方法包括將其經過免疫捕獲支持 物，所述免疫捕獲支持物包含本發明方法尋找的腫瘤標記物的結合配偶體之一，例如本發 明方法尋找的腫瘤標記物的抗體。另一種樣品預處理方法包括預先分級分離所述生物學樣 品，以將樣品的蛋白質彼此分離。在本領域技術人員熟知的技術中，樣品的主要蛋白質可例 如首先被耗竭。利用最近的技術進步，也可以量化複雜的生物學介質中的蛋白質，使用以MRM(多 反映監測)模式運轉的三聯四極分析儀(triple quadripoleanalyzer)進行串聯質譜分析 (MS/MS)。這種運轉模式具有雙重選擇性(兩個分析儀，親本離子選擇和產物離子選擇)，而 且與其它掃描模式相比檢測靈敏性得以改良。這種方法的技術可行性最近已經由Anderson and Hunter61證實，其成功地在免疫耗竭豐度最高的蛋白質後檢測到血漿濃度在一百ng/ml 級別的蛋白質。確定生物學樣品中感興趣的「mRNA」腫瘤標記物的存在可以通過確定樣品中mRNA 存在的任何方法進行，即通過直接檢測mRNA或者間接檢測mRNA，或者通過確定樣品中RNA 存在的本領域技術人員已知的任何其它方法進行。術語「直接檢測mRNA」是指證實生物學樣品中所述mRNA自身。直接檢測生物學樣品中mRNA可以通過本領域技術人員已知的任何方式進行，例 如通過與特異於該mRNA的結合配偶體雜交，其中進行適當的PCR擴增，或者NASBA技術。術語「雜交」是指在合適條件下兩個核苷酸片段通過穩定且特異的氫鍵彼此結合， 形成雙鏈複合物。這些氫鍵在互補鹼基之間形成，如腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)(或者尿嘧 啶(U))(稱作A-T鍵)，或者鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)(稱作G-C鍵)。兩個核苷酸片段的雜 交可以是完全的(參見互補核苷酸片段或序列)，即在此雜交期間獲得的雙鏈複合物僅包 含A-T鍵和C-G鍵。這種雜交也可以是部分雜交(參見足夠互補的核苷酸片段或序列)，即 獲得的雙鏈複合物包含使得可以形成雙鏈複合物的A-T鍵和C-G鍵，但是也包含與互補鹼 基未鍵合的鹼基。兩個核苷酸片段之間的雜交依賴於使用的雜交條件，特別是嚴格性。嚴 格性被特別定義為兩個核苷酸片段的鹼基成分的函數(function)，以及兩個核苷酸片段之 間錯配程度。嚴格性也可以依賴於反應參數，如雜交溶液中存在的離子的濃度和類型、變性劑的性質和濃度和/或雜交溫度。本領域技術人員熟知所有這些數據，且可以確定合適的 條件。通常地，根據希望雜交的核苷酸片段的長度，雜交溫度介於大約20-70°C之間，特別是 介於35-65°C之間，鹽溶液的濃度介於大約0. 5-1M之間。特異於或非特異於所述mRNA的結 合配偶體是能結合該mRNA的任何配偶體。例如，可以提及的是核酸探針、擴增引物，以及能 結合該mRNA的任何其它分子。術語「雜交探針」是指包含5-100個核酸單位、特別是10-35個核酸單位的核苷酸 片段，其在指定條件下具有雜交特異性，與特異於感興趣的靶基因的材料形成雜交複合物。 雜交探針可包含使其可以被檢測的標記。對於本發明，術語「擴增引物」是指包含5-100個核酸單位、優選15-30個核酸單 位的核苷酸片段，其可以起始酶促聚合化如酶促擴增反應。術語「酶促擴增反應」是指通過 至少一種酶的作用產生核苷酸片段的多個拷貝的過程。這種擴增反應為本領域技術人員熟 知，可以特別提及的是如下技術_PCR(聚合酶鏈反應)，如專利 US 4 683 195、US 4 683 202 和 US4 800 159 所 述；_NASBA(基於核酸序列的擴增)，見專利申請W0 91/02818所述；及-TMA (轉錄介導的擴增)，見US 5 399 491專利所述。術語「檢測」是指插入染料如SYBR Green I或者溴化乙錠的物理方法或者化學 方法，或者使用標記檢測的方法。有許多檢測核酸的方法62。合適的標記如上文所述。對於本發明，雜交探針可以是「檢測」探針。在這種情況中，「檢測」探針用如上述 標記進行標記。根據這種標記的存在，可以檢測指定檢測探針與被檢測的轉錄物之間的雜 交反應的存在。所述檢測探針可以特別是「分子信標」檢測探針63。這些「分子信標」在雜交期間 成為具有螢光性。它們具有一個莖-環結構，且含有螢光團和猝光基團。特異性環序列與 其互補靶核酸序列的結合使得莖伸展，以及在激發期間以合適波長發射螢光信號。雜交探針也可以是「捕獲」探針。在這種情況中，「捕獲」探針可以通過任何適當 方式被固定或者可以固定於固體支持物上，即例如通過共價鍵或者吸附而直接或間接固 定。合適的固體支持物為本領域技術人員熟知，例如可以提及的是合成材料或天然材料、 乳膠、磁性粒子、金屬衍生物、凝膠等。所述固體支持物可以是微滴定平板形式，專利申請 W0-A-94/12670中描述的膜或者粒子。在該支持物上也可以固定一些不同的捕獲探針，每個 捕獲探針均特異於靶轉錄物。特別地，可以使用其上固定了大量探針的生物晶片作為支持 物。探針固定於支持物上也為本領域技術人員已知，可以提及的是通過直接轉移、顯 微沉積(microd印osition)、原位合成及光刻術固定探針。生物學樣品中編碼感興趣的腫瘤標記物的基因中的DNA修飾或異常的證實可以 通過確定樣品中DNA改變的任何方法進行，即直接檢測突變，或者證實感興趣的基因座的 甲基化模式改變，或者通過本領域技術人員已知的確定樣品中DNA改變的任何其它方法進 行。突變可包括一個核苷酸由另一個核苷酸取代、缺失一或多個核苷酸以及插入一或 多個核苷酸。所述突變可位於感興趣的腫瘤標記物基因的編碼區，或者位於5』和3』非編碼區，如轉錄啟動子區或者轉錄終止區。證實突變的策略基於分子生物學技術，包括如下步驟DNA提取、PCR擴增或者另 一擴增技術、雜交和/或測序。在結腸直腸癌情況中，如下方法已經成功用於檢測糞便DNA 中的突變通過沉澱濃縮DNA，使用磁珠上的捕獲寡核苷酸使靶富集，PCR擴增感興趣的基 因，固相測序以鑑別點突變64。根據預期參考片段與突變片段之間大小的差異鑑別缺失。 Imperiale等64描述了位於K-ras、APC和p53基因中的一組21個突變，使得可以檢測16/31 侵潤性癌。其它使用的DNA標記物是BAT-26缺失，其是微衛星不穩定性的標記物，以及稱作 長DNA(L-DNA)的可高度擴增的DNA，其不是特異性標記物，但是似乎反映結腸腔中脫落的 腫瘤細胞的紊亂的凋亡65。這些標記物在靈敏性或特異性方面均不令人滿意。如前所述，DNA改變也可相應於感興趣的腫瘤標記物基因的甲基化模式的修飾。所 述甲基化模式的修飾可相應於低甲基化(甲基化數目減少)或者高甲基化(甲基化數目增 多)。改變的單位位於感興趣的腫瘤標記物基因的編碼區內，或者位於5』和3』非編碼區， 如轉錄啟動子區或者轉錄終止區。DNA甲基化的分析可以使用基於定性和/或定量PCR的技術進行，如MSP(甲基化 特異性PCR)、亞硫酸氫鹽測序、結合PCR用甲基化敏感的限制酶消化、C0BRA(組合亞硫酸氫 鹽限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感的單核苷酸引物延伸)。所有這些技術均已經充分 綜述以及在方法學文章中詳細描述66。在文獻中已經報導了在結腸直腸癌病例中的一些高甲基化基因。例如可以提及的 是ALX4(無芒樣同源框-4)基因56、TPEF/HHP1 (含有表皮生長因子和卵泡抑素結構域的跨 膜蛋白)基因的啟動子區67或者s印tin-9基因68。在本發明方法中，當檢測至少兩個標記物時，可以例如使用不同的免疫測定或者 在同時多元測定中單獨證實。在本發明方法中，當檢測不同性質的兩個標記物時，例如蛋白質標記物和mRNA標 記物，可以使用選自上述那些的兩種不同檢測方法。它們也也可以在系統反應條件下在同 一檢測介質中同時檢測，如專利申請W0 03/104490所述。這個專利申請中描述的檢測方法 包括如下步驟，該檢測方法包括同時檢測樣品中的雜交和免疫反應，可含有由至少一種核 酸和不同性質的至少一種其它配體組成的靶分析物(i)將已知體積的在反應緩衝液中稀釋的樣品沉積在用所述靶分析物的捕獲配偶 體預先包被的捕獲表面上，所述捕獲配偶體包含至少一個核酸探針和至少一個抗配體，(ii)在介於15°C -60°C之間的溫度下反應，(iii)觀測因此獲得的雜交和免疫反應。所述生物學樣品可能需要特殊處理，因為其可能含有本發明方法尋找的腫瘤標記 物，或者另外其可能含有具有本發明方法尋找的標記物的循環腫瘤細胞，和/或能分泌本 發明方法尋找的標記物的循環腫瘤細胞。因此，根據本發明的一個實施方案，對生物學樣品進行預處理以分離所述液體中 含有的循環腫瘤細胞。短語「分離循環腫瘤細胞」是指獲得富含循環腫瘤細胞的細胞級分。可以通過如下方式對生物學樣品進行處理以分離循環腫瘤細胞在流式細胞儀中進行細胞淘選，在Ficoll上富集，用特異性抗體包被的磁珠富集，或者使用本領域技術人 員已知的特異性富集的任何其它方法。在血液作為生物學樣品的情況中，循環腫瘤細胞可以通過如下技術分離，即在 Ficoll上分離細胞，組合使用與磁珠結合的抗-⑶45抗體耗竭血細胞(Dynal Biotech ASA, Norway)。可以通過如下方式使用分離自生物學樣品的循環腫瘤細胞直接進行本發明方法 中探求的腫瘤標記物檢測，即在通過細胞離心塗片器使循環腫瘤細胞沉積在載玻片上之 後，例如通過用本發明方法尋找的腫瘤標記物的抗體對這些細胞進行免疫細胞化學標記。 也可以在循環腫瘤細胞中直接進行本發明方法尋找的腫瘤標記物的檢測，使用如M6t6zeaU 等69所述的流式細胞術進行。在這些條件下，所述循環細胞可以在一定條件下處理，以使其能在所述細胞內部 阻斷本發明方法尋找的腫瘤標記物。這種處理由Mathieu等7°描述。在使得細胞膜可滲透以使特異於本發明方法尋找的標記物的結合配偶體能進入 細胞之後，進行本發明方法尋找的腫瘤標記物的檢測。基於循環細胞直接檢測本發明方法中使用的腫瘤標記物也可以通過ELISP0T方 法進行，例如通過本申請人申請的專利申請W0 03/076942中描述的方法進行。這種方法是 檢測和/或量化生物學樣品的循環腫瘤細胞，該細胞在體外能釋放或分泌一或多種腫瘤標 記物，所述方法包括如下步驟(i)使一定量的所述細胞沉積於培養表面的底部，該底部附著了特異於所述腫瘤 標記物的至少一種結合配偶體，(ii)在一定條件下培養所述細胞，使其釋放或分泌所述腫瘤標記物，該標記物被 免疫捕獲於所述培養表面的底部，(iii)通過洗滌除去細胞，(iv)加入特異於所述腫瘤標記物的至少一種標記的綴合物，及(v)觀測由此獲得的標記。直接檢測腫瘤細胞中本發明方法使用的腫瘤標記物也可以在所述細胞的培養基 中進行，在一定條件下培養細胞，由此其分泌本發明方法中使用的腫瘤標記物，之後進行檢 測。釋放腫瘤標記物或者腫瘤標記物表達的培養條件是常規條件，如37°C溼化環境及 5% C02的條件。當生物學樣品是固體樣品時，腫瘤標記物的存在也可以在體內、在腫瘤原位示出。為了在體內在腫瘤中示出腫瘤標記物的存在，可以使用本領域技術人員已知的任 何成像技術。為此，所述腫瘤標記物的結合配偶體可以與成像示蹤劑結合。術語「結合配偶體與成像示蹤劑的結合」是指能通過本領域技術人員已知的任何 成像方法檢測的示蹤劑或者直接或間接產生可檢測信號的示蹤劑的附著。因此，所述示蹤 劑可以是放射性示蹤劑，如鎝-99。在這種情況中，具有原發癌或者轉移癌的器官將結合所 述腫瘤標記物及其示蹤劑。可以用特殊相機如相機使由該器官發射的放射線成像。該 設備收集由放射性物質產生的閃爍，並因此可以觀測所述器官。在本發明另一方法中，所述示蹤劑可包含發射正電子的放射性物質(氟18)。然後
17通過正電子發射斷層成像系統成像。在本發明另一優選方法中，腫瘤標記物的配偶體可以與納米粒子結合。所述納米 粒子可以例如是超磁性(supramagnetic)納米粒子，如用於指導細胞標記和通過核磁共振 成像技術在體內檢測的陰離子磁性納米粒子。它們也可以是金納米粒子。禾IJ用可以在體內檢測腫瘤標記物的本發明方法，可以觀測身體中結合腫瘤標記物 的結合配偶體的區域、產生腫瘤標記物的癌瘤，特別是在結腸直腸癌中，以及其遠離轉移癌 的位置和包含的淋巴結的位置。本發明的方法不僅可用於結腸直腸癌的早期診斷，也可以用於結腸直腸癌的篩 選、治療隨診、預後及復發診斷，因為只有癌細胞分泌LEI，且其產生依賴於癌的級別，這些 方面組成了本發明的另一方面。本發明通過如下實施例以及附

圖1-21得以更清晰地理解，這些實施例只是例證 本發明而不限制本發明之意。-圖1是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 LEI (ng/ml)的圖示，-圖2是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中埃茲 蛋白(ng/ml)的圖示，-圖3是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中醯化 胺基酸水解酶1 (ng/ml)的圖示，-圖4是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 L-FABP (ng/ml)的圖示，-圖5是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 I-FABP(pg/ml)的圖示，-圖6是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中載脂 蛋白AI(i!g/ml)的圖示，通過微滴定平板ELISA (圖6A)或者使用Lincoplex試劑盒(圖 6B)，-圖7是使用Linco多元試劑盒分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-) 血清中載脂蛋白AlKyg/ml)的圖示，-圖8是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中1_絲 束蛋白的RFV(相對螢光值)的圖示，-圖9是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 3 2-微球蛋白(ng/ml)的圖示，-圖10是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 CEA (ng/ml)的圖示，-圖11是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中CA 19-9 (U/ml)的圖示，-圖12是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中睪酮 (ng/ml)的圖示，-圖13是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中E_鈣 粘蛋白(ng/ml)的圖示，
-圖14是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 PAP1 (ng/ml)的圖示，-圖15是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中半乳 凝素_3的RFV的圖示，-圖16是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中 LDH(ng/ml)的圖示，-圖17是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中蛋白 酶體20S (ng/ml)的圖示，-圖18是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中醯化 胺基酸水解酶1 (ng/ml)的圖示，-圖19是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中半乳 凝素_3的RFV的圖示，-圖20是通過ELISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中蛋白 酶體20S的RFV的圖示，-圖21是對LEI、埃茲蛋白和半乳凝素-3進行ELISP0T測定的示意圖，示出 Caco-2、HT-29和HT29-B6的每106個癌細胞的斑點數目。棚列1 ■別■示適白條剛械輔會目舶馳表汰1. cDNA擴增與克降將Caco-2結腸直腸癌細胞系在DMEM培養基中培養，該培養基含有2mM的L_穀氨 醯胺，不含FCS (胎牛血清)(均來自Gibco)。為了克隆LEI、L-FABP和Gal_3基因，從108個Caco_2細胞沉澱中提取信使RNA， 使用Invitrogen FastTrack 2. 0試劑盒(Cat. No. 45-0019)根據廠商提供的方案進行。在 一個步驟中進行逆轉錄和PCR，使用450ng的Caco-2mRNA及Superscript III One Step RT-PCR System試劑盒(Invitrogen Cat. No. 12574-018)以及使用 Platinum Taq DNA聚合 酶，根據廠商提供的方案進行。用於基因擴增的PCR引物在表1中提供。表 1 將獲得DNA片段通過使用TA克隆試劑盒(Invitrogen Cat. No. K4520-01)克隆進 載體pCR2. 1T0P0(LEI和Gal-3)中，或者克隆進用Bsm BI和Xba I消化後的來自Origene 的載體PCMV6-XL4 (L-FABP)中。對質粒進行測序，以核實cDNA確實符合預期序列。對於編碼醯化胺基酸水解酶1的基因的克隆，使用來自Qiagen的RNAEasy Mini試 劑盒根據廠商提供的方案從108個Caco-2細胞沉澱中提取總RNA。使用10ng的Caco-2RNA 和Superscript II酶(Invitrogen)根據廠商提供的方案進行逆轉錄。該逆轉錄引物是 oligo(dT)0得自這個反應的cDNA用作PCR中模板，使用AccuPrime Pfx試劑盒(Invitrogen Cat. No. 12344-024)根據廠商提供的方案進行反應。所述PCR引物是ACY_1 Fwd2 (SEQ ID No. 7 5' -GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCGGAAGAGGAGCACCCATCG-3') 和 ACY-1 Rev(SEQ ID No. 8 :5，-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3』)。在這些條件下，可以擴增1.3kb片段，將其克隆進Zero Blunt T0P0 PCR克隆試劑 盒型克隆載體(Invitrogen Cat. No. K2820-20)中。對這個質粒測序以核實cDNA確實符合 預期序列。通過化學合成方法獲得含有I-FABP開放讀框的如下DNA片段(SEQ IDNo. 9)，該合 成由Geneart公司進行。SEQIDNo. 9:GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAA
ACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC。
5'-ATGGAGCAGCTGAGCTCAGCAAAC-3' 5，-CTAAGGGGAAGAAAATCTCCCCAA-3 『
5'-CGGAGCGTCTCCCATGAGTTTCTCCGGCAAGTA-3'
5，-GA A ATGC AGACTTGTCTAG ATGCGCTTGCTGATGCGCTTGA A
GACAATG-3'
5 '-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 『 5'-TTATATCATGGTATATGAAGCACTGG-3'
2.表汰載體構津將編碼LEI和半乳凝素_3的基因亞克隆進原核表達載體PMR7871中，以及將 L-FABP 基因克隆進載體 pET3d(New England Biolabs)中。使用質粒 pCR2. 1 T0P0-LEI、 pCR2. 1 TOPO-Gal-3和pCMV6-LFABP作為模板通過PCR導入克隆所需的限制位點。所述PCR 酶是Promega Pfu DNA聚合酶，PCR反應根據廠商指導進行，引物示於表2中。表2 將含有編碼LEI或半乳凝素-3的開放讀框的PCR產物用Eco RI和Hindlll限制 酶消化。將片段導入用相同的酶限制的載體PMR78中(質粒pMR-LEI和pMR-Gal-3)。載體 PMR78含有與表達的蛋白質符合讀框的6-組氨酸序列，使得可以通過金屬螯合親和層析純 化。將L-FABP PCR產物克隆進載體pET3d中Nco I和Bam HI限制位點。對於醯化胺基酸水解酶1，將T0P0克隆載體直接用Eco RI和Hind III限制酶消 化，以產生含有acyl開放讀框的1. 3kb片段，其被導入pStabyl (Eurogentec)中。該重組 質粒被稱作pStabyl-ACY。對於I-FABP，將由Geneart提供的克隆載體用Eco RI和Sal I限制酶消化，以產生 含有編碼序列的大約400bp片段，將其導入載體pMRCH79(衍生自載體pMR78，bi0M6rieuX) 中。該重組質粒被稱作pMRCH-IFABP。可以分別表達與GST (穀胱甘肽S-轉移酶)融合的埃茲蛋白和I-絲束蛋白的質 粒pGEX-埃茲蛋白和pGEX-I-絲束蛋白由Institut Curie提供。3.重組蛋白質表達與純化將產生重組腫瘤標記物的表達質粒導入大腸桿菌BL21及其衍生物(Stratagene) 中。在室溫搖動培養。每種蛋白質的精確培養條件示於表3中。IPTG是異丙基-0-D-1-硫 代半乳糖酶。將細菌沉澱置於2XPBS(磷酸鹽緩衝鹽水)緩衝液中，並以1. 5kbar通過細胞粉 碎機(Constant System)。將裂解產物在3000g在4°C離心30分鐘。上清含有可溶蛋白質。
5，- ATGGG AATTC AGG AGC AGCTGAGCTC AGCAA-3 』 5'-CGATAAGCTTAAGGGGAAGAAAATCTCCCC-3 』
5 』 -GCTGGCC ATGGGCAGCAGCC ATC ATC ATC ATC ATCAC ATGAG TTTCTCCGGCA AGTACC AAC-3，
5，-GCACGG ATCCTAG ATGCGCTTGCTGATGCGCTTG A AGAC-3 『
5 『 - ATGGGAATTCAGGC AGAC AATTTTTCGCTCC-3 『 5 』 -CGATA AGCTTATATCATGGTATATGAAGC ACTGG-3 『
21所述沉澱含有包涵體。增溶包涵體的緩衝液根據所述蛋白質而定。對於LEI，在含有5mL的Ni_NTA_S印harose樹脂(Qiagen)的柱上使用可溶分級分 離法進行純化，蛋白質用含有450mM咪唑的2XPBS pH 7. 5洗脫。對於半乳凝素-3，將包涵體在含有1M尿素的2XPBS中溶解，經過5mL的 Ni-NTA-Sepharose樹脂柱(Qiagen)，用含有450mM咪唑和1M尿素的2XPBS pH 7. 5洗脫 Gal-3蛋白。對於L-FABP，使用可溶分級分離法進行純化，使用來自Macherey-Nagel的Ni_IDA 試齊U盒。表3 對於GST-埃茲蛋白，通過GST親和層析，使用在含有8M尿素和10mMDTT的lOOmM Tris緩衝液中溶解的包涵體進行純化。使用含有5mL穀胱甘肽瓊脂 糖4快速流動凝膠(Amersham)的層析柱。平衡和洗滌緩衝液是含有0. 05% Tween 20的 2XPBS。洗脫緩衝液是含有20mM還原的穀胱甘肽的50mM Tris_HCl(pH 8)。對於醯化胺基酸水解酶1，將培養物的可溶級分經過Amersham HiTrapQ FF柱，並 且使用0. 3M NaCl (pH 7. 5)洗脫ACY-1蛋白。由於一些其它蛋白質在這些條件下被共洗脫， 因此繼續在疏水性相互作用柱(HIC Phenyl HP，Amersham)上進行純化。使用0. 5M NaCl (pH 7)洗脫ACY-1蛋白。重組GST-I-絲束蛋白蛋白由Institut Curie以純化形式提供。；￡會且 丐網胃白胃白由 Proteus Services for Industry (Dijon, France) 產。編碼鈣網蛋白的序列通過化學合成方法獲得。實施例2 腫瘤標記物的單克降抗體的產牛1.動物樽型對6-8周齡的雌性BALB/c (H_2d)小鼠在第一次免疫時進行免疫試驗。2.免疫原和免疫為了增加在小鼠中獲得的免疫應答以及為了能產生單克隆抗體，根據實施 例1所述的程序產生重組蛋白質形式的腫瘤標記物。LDH蛋白得自SciPac公司(Cat. No. 103-133)。這些蛋白質與Freimd's佐劑(Sigma)混合，所述佐劑以油包水乳狀液形式制 備，且已知其具有良好的免疫原性。每種腫瘤標記物免疫3隻小鼠。小鼠在第0、2和4周連續接受3次10 yg劑量。所有注射均是皮下注射。第一次注射給予與完全Freimd』 s佐劑 的混合物，隨後兩次注射給予與不完全Freimd's佐劑的混合物。在第一次注射後D50-D70 之間，通過靜脈內注射100 yg該重組蛋白質再次刺激體液應答。3.監測體液應答的出現為了監測抗體的出現，定期從小鼠取血樣。使用ELISA檢測抗-腫瘤標記物抗體 的存在。感興趣的蛋白質用於捕獲(lPg/孔)；飽和後，使抗原與不同稀釋度的檢測血清 反應(在37°C保溫1小時)。血清中特異性抗體的存在通過使用與鹼性磷酸酶綴合的結 合尋找的抗體的 AffiniPure 山羊抗-小鼠 IgG 抗體(H+L, Jackson Immunoresearch, Cat no. 115-055-146) (0. 1 u g/well)表明。4.單克降抗體的產牛在最後一次注射每種腫瘤標記物3天後，處死一隻免疫的小鼠。取血液和脾。將得 自脾的脾細胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細胞一起培養，以使其融合併變成永生化，根據K6hler and Milstein所述方案72』73進行。在保溫12-14天之後，篩選獲得的雜交瘤上清以確定抗 腫瘤標記物抗體的存在，使用在這個實施例第3點描述的ELISA測定。當GST融合蛋白用 作免疫原時，針對GST的克隆通過使用未結合的GST捕獲進行ELISA篩選得以消除。根據 限制稀釋技術將陽性雜交瘤集落亞克隆兩次，這種技術為本領域技術人員熟知。5.通過免疫印跡鑑定單克降抗體針對各種腫瘤標記物獲得的單克隆抗體列於表4中。通過Western印跡技術分析 這些單克隆抗體。表 4 5. 1.方法學製備Caco-2和HT-29細胞培養提取物，通過用含有8. 3M尿素、2M硫脲、4 % 3_[(3-膽胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、100mM DTT,2% Servalyte 4-9 (Serva, Heidelberg, Germany)和0. lg/1 Orange G的600 yl水溶液溶解細胞沉澱，然後根據 NuPAGE Novex凝膠樣品製備方案(Invitrogen)進行處理。為了獲得組織提取物，使用 手術刀切下GHBD001、GHBD004和CLSP109患者的腫瘤和黏膜活檢組織，然後使用50-y m Medicons以及lml含有2. 5mM EDTA和蛋白酶抑制劑(片劑，Roche)的PBS緩衝液在 Medimachine系統(Becton Dickinson)中提取10次。集合這些10ml的細胞懸浮液，製成 25ml，然後在600g離心15分鐘。上清相應於根據NuPAGENovex凝膠樣品製備方案處理的組 織提取物。使用還原的樣品，最終總蛋白質濃度為0.4mg/ml。在NuPAGE Novex Bis-Tris4-12%凝膠上沉積體積為20 u 1/孔，使用MOPS運轉緩衝液。在遷移(200V，1小時)及轉 移至PVDF膜(400mA，45分鐘)之後，通過用氨基黑染色評定轉移物的性質。
將該膜用在 TNT(15mM Tris、0. 14M NaCl.O. 5% Tween 20，pH 8)溶液中的 5% 脫脂乳(R6gilait)在室溫飽和1小時。在飽和後，將該膜與在飽和溶液中稀釋為lOyg/ ml的各種檢測抗體一起保溫1小時。在用TNT漂洗後，將該膜在室溫與在飽和溶液中 稀釋為1 5000的抗小鼠-辣根過氧化物酶綴合物(Cat No. 115-035-062，Jackson Immunoresearch) {呆 iU 1 /J、時。在漂 1後，使用 Substrate Supersignal West Dura Extended試劑盒(Cat No. 34076, Pierce)根據推薦的使用指導進行顯影。
使用來自Biorad的VersaDoc成像系統測量該膜上的化學發光信號。基於Western 印跡成像，使用QuantityOne軟體(Bio-Rad)評估相應於各種腫瘤標記物的條帶的體積。所 述體積相應於條帶的表面積乘以化學發光信號的強度。5.2.結果Western印跡結果示於表5，表中示出了 Western印跡分析的相應於感興趣的腫瘤 標記物的條帶的體積，其是檢測的各個樣品的函數。這些結果示出檢測的腫瘤標記物確實 由Caco-2和HT-29結腸癌細胞系表達，而且也在組織中表達，這些根據使用得自該患者的 腫瘤和黏膜的提取物示出。可以對比使用抗體在樣品上獲得的信號強度與使用其它樣品和 相同抗體獲得信號強度。所用技術使得可以證實組織(非遠離樣品)中所述標記物的存在 與否，以及抗體對於標記物的特異性。這個技術不用於這個實施例的遠離樣品中，因為其不 可以推斷遠離樣品中腫瘤標記物的存在與否，也不可以確定所述樣品中所述腫瘤標記物的 濃度是否增加或降低。此外，使用的實驗方案不能對比一種抗體的反應性與另一種抗體的 反應性。表 5 NT:未檢測。5.3.抗I-絲束蛋白的單克隆抗體在GHBD004患者中，8C8C5抗體未使得對應1_絲束蛋白的條帶顯色或者僅微弱顯 色。這些樣品中I-絲束蛋白的存在可以通過使用例如8G2D2抗體證實，該抗體在印跡中對 於I-絲束蛋白具有較好親和性。由於I-絲束蛋白是包含具有70%以上同源性的兩個其它同種型(L-絲束蛋白和 T-絲束蛋白)的蛋白質家族成員，我們檢測了獲得的單克隆抗體的所有克隆與GST-絲束蛋 白-L和GST-絲束蛋白-T蛋白質(Institut Curie提供)的反應性。在這個篩選結束時， 我們選擇與其它家族成員不具有任何交叉反應性的克隆3D11D10、8C8C5、3A3H2和8G2D2。 這些抗體確實特異於I-絲束蛋白同種型。實施例3 腫瘤標記物的血清測定1.患者和樣品根據2個Huriet-law協議，血樣收集自分布於法國的8個臨床中心網。為了獲得血清，將該血樣置於乾燥試管中。為了獲得血漿，將該血樣置於EDTA試 管中。在凝固後，將試管以1000g離心10分鐘，取出血清，等份並在-80°c貯存。將血漿試 管以1000g直接離心10分鐘，取出血漿，等份並在-80°C貯存。樣品完全記錄了病人的病 史。2. LEI腫瘤標記物的血清測定
使用實施例2中描述的抗體以及使用Vidas 自動化設備(bioM6rieUX)進行 ELISA 以測定 LEI 蛋白。為此，使用 Vidas HBs Ag Ultra 試劑盒(bioM6rieux，Cat. No. 30315)的試劑進行ELISA。該試劑如相應的信息頁(ref. 11728D-FR-2005/05)所述使 用，具有如下修改1.離心管用10 u g/ml濃度的捕獲抗體10E1H1敏化。2. HBs Ag Ultra cartridge 第二個孔的內容物用 300 ii 1 在Vidas HBs AgUltra 試劑盒的第二個孔的緩衝液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩衝液)中稀釋為1 P g/ml 的與生物素結合的揭示抗體21B10A5替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(50iU)在HBs Ag Ultra cartridge的第二個孔中 直接稀釋，所述樣品是純的或者在Vidas HBs Ag Ultra試劑盒的第二個孔的緩衝液(具 有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩衝液)中1/20稀釋。4.使用Vidas 自動化設備和HBs Ag Ultra試劑盒的方案進行ELISA。5.在減去背景噪音之後獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物)。通過測定重組蛋白質形式的腫瘤標記物的濃度範圍制定標準曲線。繪製的該標準 曲線的x軸是報導的腫瘤標記物濃度，y軸是由Vidas 讀取的信號(RFV或者相對螢光數 值)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標記物的濃度通過報導的相應於 Vidas 讀取的RFV信號的濃度計算。表6給出了在Vidas自動裝置上通過ELISA測定患 者的血清LEI的結果。表6 CRC+
CRC+
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CLSP153/F0
CBSE003/F0
N017197/F0
N017250/F0
N017349/F0
N017357/F0
N017373/F0
N018640/F0
N018667/F0
N030068/F0
N143574/F0
N146628/F0
N146978/F0
N148324/F0
N314199/F0
N314324/F0
N370510/F0
N417852/F0
N469695/F0
N491079/F0
N491124/F0
N491722/F0
N51869/F0
N688038/F0
N688118/F0
N835827/F0
N836221/F0
血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清
III/IV T3N2MX IVT2N0M1
193.46 139.66 209.72 229.34 615.37 794.01
320.75
163.76 282.61 417.23 203.55 335.89 234.39 290.46 101.55 160.39 212.52 115.00
214.77 185.06 231.59 830.54 87.54 238.31 251.21 363.37 216.45a CRC+ 結腸直腸癌患者；CRC-健康個體b : M 組織侵潤階段⑴、淋巴結侵潤(N)及遠處侵潤(轉移，M)
分析患者獲得的量示於圖1。在該圖中，注意到IV期結腸直腸癌患者的3份血清 及III期結腸直腸癌患者的1份血清示出其血清LEI的量明顯增加。3.埃茲蛋白腫瘤標記物的血清測定使用實施例2中描述的抗體以及使用Vidas 自動化設備(bioM6rieUX)進行 ELISA以測定埃茲蛋白蛋白。為此，使用Vidas HBs Ag Ultra試劑盒(bioMerieux, Cat. No. 30315)的試劑進行ELISA。該試劑如相應的信息頁(ref. 11728D-FR-2005/05)所述使 用，具有如下修改1.離心管用30 u g/ml濃度的捕獲抗體4A9H5敏化。2. HBs Ag Ultra cartridge 第二個孔的內容物用 300 u 1 在Vidas HBs AgUltra 試劑盒的第二個孔的緩衝液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩衝液)中稀釋為1 P g/ml 的與生物素結合的揭示抗體4A7A6C1替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(50iU)在HBs Ag Ultra cartridge的第二個孔中 直接稀釋。4.使用Vidas 自動化設備和HBs Ag Ultra方案進行ELISA，其中樣品與捕獲抗 體和揭示抗體的保溫步驟進行100次循環。5.在減去背景噪音之後獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關 於測定LEI所述方法計算。分析患者獲得的量示於圖2。在該圖中，注意到IV期結腸直腸癌患者的3份血清 示出其血清埃茲蛋白的量明顯增加。4.醯化胺基酸水解酶1腫瘤標記物的血清測定使用實施例2中描述的抗體以及使用Vidas 自動化設備(bioM6rieUX)進 行ELISA以測定醯化胺基酸水解酶1蛋白。為此，使用Vidas HBs Ag Ultra試 劑盒(bioMerieux, Cat. No. 30315)的試劑進行ELISA。該試劑如相應的信息頁 (ref. 11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用20 u g/ml濃度的捕獲抗體2A7F6敏化。2. HBs Ag Ultra cartridge 第二個孔的內容物用 300 u 1 在Vidas HBs AgUltra 試劑盒的第二個孔的緩衝液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩衝液)中稀釋為1 P g/ml 的與生物素結合的揭示抗體11H7D9替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(100 ill)在HBs Ag Ultra cartridge的第二個孔 中直接稀釋。4.使用Vidas 自動化設備和HBs Ag Ultra方案進行ELISA，其中樣品與捕獲抗體 和揭示抗體的保溫步驟進行100次循環。5.在減去背景噪音之後獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關 於測定LEI所述方法計算。
分析患者獲得的量示於圖3。在該圖中，注意到II期結腸直腸癌患者的1份血清、 III期結腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結腸直腸癌患者的2份血清示出血清醯化氨基 酸水解酶1的量明顯增加。5. L-FABP腫瘤標記物的血清測定使用Hycult Biotechnology公司銷售的ELISA試劑盒測定人L-FABP蛋白(Cat. No. HK404)。這個試劑盒可以量化細胞培養上清或者血清、血漿或尿液中的L-FABP蛋白，以 確定肝臟損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序，有兩處修改保溫在37°C而不是在室溫 進行，在測定之前血清稀釋為1/10。L-FABP蛋白的測定可以通過本領域技術人員熟知的備 選技術進行。圖4示出這項分析的結果。在檢測的血清中，141個結腸直腸癌患者中的41個患 者的血清L-FABP濃度高於17ng/ml，而在對照組中，無個體的血清L-FABP濃度超過這個數 值。在這41個患者中，I期結腸直腸癌患者8個、II期結腸直腸癌患者8個、III期結腸 直腸癌患者13個，IV期結腸直腸癌患者12個。觀測的141個結腸直腸癌患者的平均血清 L-FABP濃度是16. 6 士 1. 3ng/ml。112個健康個體的平均值為6. 6 士0. 2ng/ml (陰性對照)。 這個差異具有顯著統計學意義(p< 0. 0001，單側t-檢驗，使用Welch』 s校正不等方差)。6. I-FABP腫瘤標記物的血清測定使用Hycult Biotechnology公司銷售的ELISA試劑盒，測定人I-FABP蛋白(Cat. No. HK406)。這個試劑盒可以量化細胞培養上清或者血清、血漿或尿液中的I-FABP蛋白，以 確定小腸中缺血性損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序。可以通過本領域技術人員熟知 的備選技術測定I-FABP蛋白。圖5示出這項測定的結果。在檢測的血清中，40個結腸直腸癌患者中有15個患 者的血清I-FABP濃度高於40pg/ml，而在對照組中，24個個體中僅2個個體超過這個數值。 更明顯地，I期結腸直腸癌患者的3份血清、III結腸直腸癌患者的2份血清以及IV期結腸 直腸癌患者的1份血清的血清I-FABP濃度高於100pg/ml。在CRC-對照組中未發現高於此 數值的濃度。7.載脂蛋白AI腫瘤標記物的血清測定通過兩種不同的免疫測定技術測定血清載脂蛋白AI。首先，使用微滴定平板夾心 ELISA。將96孔平板用liig/孔的抗-Apo AI單克隆抗體-克隆1404(Biodesign Cat. No. H45404)包被。在用PBS-0. 05% Tween 20 (PBS-T)洗滌3次後，將該平板用在PBS-T中 10%奶粉在37°C飽和1小時。將該平板再於PBS-T中洗滌3次，將檢測血清樣品的100 u 1 標準範圍稀釋液或者100 yl的1/100000稀釋液沉積於平板上，將該平板在37°C保溫2小 時。所述標準範圍是通過將Apo AI蛋白(Biodesign Cat. No. A50620H)在PBS_T，BSA 1% (1. 6-100ng/ml)中稀釋而製備。在用PBS-T洗滌3次後，加入0. 1 u g/孔與辣根過氧化物 酶結合的多克隆檢測抗體(Biodesign Cat. No. K45452P)，將該平板在37°C保溫2小時。再 次用PBS-T洗滌3次後，加入100 u 1/孔的OptEIA底物(BD)。20分鐘後，當發生生色時， 用2N硫酸結束反應，在450nm測量吸光度。圖6A示出這項測定的結果。我們證實結腸直腸癌患者中Apo AI的血清濃度降 低。38個I期-IV期CRC患者中的平均濃度為675 士 36 u g/ml，而在27個健康個體(對照 組)中其平均值更高1040 士 39 y g/ml。這個差異具有顯著統計學意義(P< 0.0001，單側t-檢驗)。作為對比，使用夾心ELISA技術，在13個肝癌患者中Apo AI的平均血清濃度為 1175士87i!g/ml。血清濃度降低證實Apo AI因此是結腸直腸癌的特異性標記物，可以通過 免疫測定證實這種降低。使用的第二種測定技術是Linco公司銷售的多元測定法，其可以在同一樣品中同 時測定一些載脂蛋白，包括AI和AII(Cat.No.AP0-62K).。使用廠商推薦的程序進行。圖6B示出這項測定的結果。使用該第二種技術證實CRC患者中Apo AI血清濃度 降低。34個I期-IV期CRC患者中Apo AI平均濃度為768士30 u g/ml，而在17個健康個體 (對照組)中其平均值更高1194士51 u g/ml。這個差異具有顯著統計學意義(P < 0. 0001, 單側t-檢驗)。8.載脂蛋白All腫瘤標記物的血清測定使用Linco多元試劑盒測定血清載脂蛋白All。圖7示出這項測定的結果。我們 證實結腸直腸癌患者中ApoAII的血清濃度降低。34個I期-IV期CRC患者中Apo All平 均濃度為170士 11 ii g/ml，而在17個健康個體(對照組)中其平均值更高277士 16 ii g/ml。 這個差異具有顯著統計學意義(P < 0. 0001,單側t-檢驗)。9. I-絲束蛋白腫瘤標記物的血清測定使用實施例2中描述的抗體以及使用Vidas 自動化設備(bioM6rieUX)進行 ELISA以測定I-絲束蛋白蛋白。為此，使用VidaS HBsAg Ultra試劑盒(bioM6rieux，Cat. No. 30315)的試劑進行ELISA。該試劑如相應的信息頁(ref. 11728D-FR-2005/05)所述使 用，具有如下修改1.離心管用15 ii g/ml濃度的捕獲抗體3D11D10敏化。2. HBs Ag Ultra cartridge 第二個孔的內容物用 300 u 1 在Vidas HBs AgUltra 試劑盒的第二個孔的緩衝液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩衝液)中稀釋為1 P g/ml 的與生物素結合的揭示抗體8C8C5替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(100 ill)在HBs Ag Ultra cartridge的第二個孔 中直接稀釋。4.使用Vidas 自動化設備和HBs Ag Ultra方案進行ELISA。5.在減去背景噪音之後獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關 於測定LEI所述方法計算。分析患者獲得的量示於圖8。在該圖中，注意到檢測的結腸直腸癌患者的2份血清 示出血清I-絲束蛋白的量明顯增加。10. B組腫瘤標記物的血清測定使用本申請人的Vidas 3 2-微球蛋白、Vidas CEA、Vidas CA19-9 和 Vidas 睪酮測定試劑盒根據每個試劑盒的程序分別測定3 2-微球蛋白、CEA、CA19-9和睪 酮腫瘤標記物。使用E-鈣粘蛋白 EIA 試劑盒(Takara Biochemicals, Tokyo, Japan)根據該試劑 盒程序測定E-鈣粘蛋白。使用PANCREPAP ELISA 試劑盒(DynaBio，Marseille, France)根據該試劑盒程序測定再生胰島衍生蛋白3a蛋白，其也被稱作胰腺炎相關蛋白(PAP1)。使用實施例2中描述的抗體測定半乳凝素_3和LDH蛋白。使用專利EP0434670 中描述的抗體測定蛋白酶體20S。為此，使用Vidas 自動化設備(bioM6rieUX)和Vidas HBs kg Ultra試劑盒(bioMerieux, Cat. No. 30315)的試劑進行ELISA測定。該試劑如相 應的信息頁(ref. 11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用5-30 u g/ml濃度的捕獲抗體敏化。2. HBs kg Ultra cartridge第二個孔的內容物用300 yl在具有山羊血清和lg/1 疊氮化鈉的緩衝液中稀釋為1 P g/ml的與生物素結合的揭示抗體替換。3.如果需要，在第二個孔的緩衝液中稀釋之後，將血清、血漿或者糞便樣品 (100 ill)在HBs kg Ultra cartridge的第二個孔中直接稀釋。4.使用Vidas 自動化設備和HBs Ag Ultra方案進行ELISA。樣品與捕獲抗體和 揭示抗體保溫的步驟進行14-100次循環。5.在減去背景噪音之後獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關 於測定LEI所述方法計算。各個腫瘤標記物的測定條件示於表7。表 7 分析患者獲得的0 2-微球蛋白、CEA、CA19_9、睪酮、E-鈣粘蛋白、再生胰島衍生蛋 白3a、半乳凝素-3、LDH和蛋白酶體20S腫瘤標記物的量分別示於圖9-17。結腸直腸癌患者的3份血清示出血清0 2-微球蛋白的量增加。結腸直腸癌患者的10份血清示出血清CEA的量增加。更明顯地，III期結腸直腸 癌患者的1份血清以及IV期結腸直腸癌患者的7份血清示出血清CEA的量明顯增加。結腸直腸癌患者的9份血清示出其血清CA 19-9的量增加。更明顯地，III期結 腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結腸直腸癌患者的7份血清示出血清CA 19-9的量明 顯增加。
結腸直腸癌患者的10份血清示出血清睪酮的量降低。更明顯地，II期結腸直腸 癌患者的1份血清和III期結腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結腸直腸癌患者的2份 血清示出血清睪酮的量降低。結腸直腸癌患者的2份血清示出血清再生胰島衍生蛋白3 a的量增加。IV期結腸直腸癌患者的4份血清、III期結腸直腸癌患者的2份血清以及II期結 腸直腸癌患者的1份血清示出血清半乳凝素_3的量明顯增加。實施例4 組合腫瘤標記物的血清測定的應用本申請人在實施例3中揭示了在某些結腸直腸癌患者血流中可以觀測到腫瘤標 記物的量異常升高或者異常降低。令人驚奇地，在同一患者中未系統地觀測兩個指定標記 物在血液中的量的增加或降低。結果，組合一些腫瘤標記物可以增加經鑑別患有結腸直腸 癌的患者數目。因此，A患者也許存在一或多種腫瘤標記物(X組)升高或降低，X組的所述 標記物在B患者中也許正常；在這個B患者中，一或多種其它腫瘤標記物(Y組)也許升高 或降低，Y組的所述標記物在A患者中也許正常。本申請人測定的各個腫瘤標記物因此可以通過本領域技術人員熟知的各種數學 算法組合。例如非限制性地進行如下方法1.設定每個腫瘤標記物的閾值。2.當結腸直腸癌患者血液中腫瘤標記物的量增加時，將針對指定患者獲得的血液 中的量除以其閾值。當結腸直腸癌患者血液中腫瘤標記物的量降低時，將針對指定患者獲 得的血液中的量變成倒數並乘以其閾值。3.當「血液中的量除以閾值」高於1時，將該比率乘以係數，例如10。由此獲得的 數值稱作所研究的患者、考慮的腫瘤標記物的「得分」。4.累加各個腫瘤標記物的得分，將其用特異於每個標記物的因子進行加權。在下 文實施例中，所有加權因子均設定為1。5.將得分總和除以累加得分總數，由此獲得的數值稱作「總得分」。6.當其總得分高於閾值時，診斷該患者患有結腸直腸癌。包含LEI的選擇的2、4和8個標記物的總得分在表8中示出。LEI與CEA腫瘤標記物的組合因此對於同一組的24個患者可以獲得12個結腸直 腸癌患者增加的總得分「2」，而單獨測定LEI或CEA分別僅示出4個或10個患者的量增加。LEI、0 2-微球蛋白、胺基酸水解酶1與CEA腫瘤標記物的組合因此對於同一組24 個患者可以獲得16個結腸直腸癌患者增加的總得分「4」，而單獨測定LEI、0 2-微球蛋白、 醯化胺基酸水解酶1或CEA分別僅示出4、4、4和8個患者的量增加。LEI、0 2-微球蛋白、醯化胺基酸水解酶1、蛋白酶體20S、L-FABP、PAP、E_鈣粘蛋白 和CEA腫瘤標記物的組合因此對於同一組24個患者可以獲得19個患者增加的總得分「8」， 而單獨測定LEI、0 2-微球蛋白、醯化胺基酸水解酶-1、蛋白酶體20S、L-FABP、PAP、E-鈣粘 蛋白或CEA分別僅示出4、4、4、8、6、2、2和10個患者的量增加。表8
33 a :LEI 與 CEA 的組合b :LEI、0 2-微球蛋白、醯化胺基酸水解酶1和CEA的組合c :LEI、0 2-微球蛋白、醯化胺基酸水解酶1、蛋白酶體20S、L-FABP、PAP、E_鈣粘 蛋白和CEA的組合實施例5 糞便腫瘤標記物測定提取重約lg的糞便，加入含有lg/L疊氮化物的10ml的100mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)。將該混合物旋動均質1分鐘。然後將樣品在冰上進行4次7秒超聲處理。通過以 2000g在4°C離心10分鐘除去不溶的級分。將上清在-30°C貯存直至進行測定。如果需要，在HBs kg Ultra cartridge的第一個孔的緩衝液中適當稀釋糞便之 後，使用實施例3所述的ELISA在糞便中查找腫瘤標記物。使用該檢驗測定醯化胺基酸水解酶1、半乳凝素_3和蛋白酶體20S的結果分別示 於圖18-20。在結腸直腸癌患者的10、14和8份糞便中分別觀測到醯化胺基酸水解酶1、半 乳凝素_3和蛋白酶體20S的量增加。實施例6 通過ELISP0T技術檢測腫瘤標記物1.細胞培養將LnCAP前列腺癌細胞系在RPMI 1640培養基中培養，該培養基中補加了 2mM L_穀氨醯胺、10mM HEPES、lmM丙酮酸鈉和10% FCS(均來自Gibco)。該細胞用作陰性對照。將Caco-2結腸直腸癌細胞系在含有2mM L_穀氨醯胺而無FCS (均來自Gibco)的 DMEM培養基中培養。將HT-29結腸直腸癌細胞系在含有2mM L_穀氨醯胺和10 % FCS (均來自Gibco) 的MEM培養基中培養。將HT-29/B6結腸直腸癌細胞系在含有4mM L_穀氨醯胺而無FCS (均來自Gibco)
的培養基中培養。
將細胞維持在37°C的具有5% C02保溫儀中。2. ELISP0T 技術這種方法可以確定分泌蛋白質的細胞數目。將帶有PVDF膜(Multiscreen IP, Millipore)的96-孔ELISP0T平板用在無菌PBS中的10 y g/ml小鼠抗腫瘤標記物單克隆 抗體(捕獲抗體，見下表9，該表示出了用於ELISP0T中的抗體)在+4°C包被過夜，100 u 1/ 孔。然後將該平板用PBS洗滌，並用含有10%FCS的培養基飽和。平行地，對細胞進行胰蛋 白酶消化、計數，然後稀釋為105個細胞/ml。每個孔分配200 u 1這種細胞懸浮液，這一原液 的連續稀釋液也是如此。然後將該平板在37°C在5% C02溼潤環境中保溫20小時，隨後用含 有0. 05% Tween-20的PBS洗滌。剩餘的細胞通過用冰水處理10分鐘裂解，再次洗滌平板。 然後加入0. 1 y g/孔揭示抗體_即待測腫瘤標記物的生物素醯化的單克隆抗體(表9)(在 室溫保溫2小時)。通過加入Extravidin-鹼性磷酸酶(Sigma)和底物5-溴-4-氯-3-吲 哚基磷酸鹽/硝基藍四唑(BCIP/NBT，Biorad)揭示斑點。背景噪音相應於在LnCap孔中測 量的斑點數目，在所用讀取條件下在0-8之間變化。從特異性信號中減去非特異性斑點的 平均數。表9
埃茲蛋白 4A9H5 4A7A6C1 半乳凝素-3_12F8A12_14A5G1_3.結果每一百萬個保溫的細胞中分泌腫瘤標記物的Caco-2、HT-29和HT-29/B6細胞的數 目示於圖21。ELISP0T技術可以證實所述腫瘤標記物由結腸癌細胞系釋放或分泌。可以使 用這個技術查找患者體內循環腫瘤細胞，根據本申請人申請的專利申請W0 03/076942所 述方法進行。實施例7 使用結腸組織經免疫組織化學方法檢測腫瘤標記物1.方法學首先，對組織微陣列載玻片脫石蠟。為此，將其在如下浴中相繼保溫10分鐘甲基 環己烷(兩次)、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和水。然後將該玻片用含有0. l%Tween 20 的TBS(TBS-T)攪拌漂洗10分鐘。抗原在10mM檸檬酸鹽緩衝液pH 6中通過加熱至90°C 40 分鐘、然後冷卻至室溫30分鐘再活化。內源性過氧化物酶通過在含有3% H202的TBS-T中 保溫5分鐘而被抑制。然後將該玻片用在TBS-T中3% BSA在37°C在溼化箱中飽和1小時。隨後將該玻片與在含有3% BSA的TBS-T中稀釋為10 u g/ml的如下一級抗體一 起保溫2小時(在37°C在溼化箱中保溫)抗-白細胞彈性蛋白酶抑制劑(克隆3D9C2)、 抗-埃茲蛋白(克隆5G2D12)、抗-醯化胺基酸水解酶1 (克隆8A8A10)或者抗-I-絲束 蛋白(克隆8D6A3)。在進行3次在TBS-T中洗滌10分鐘後，將該玻片與在飽和溶液中 稀釋為1/400的辣根過氧化物酶結合的抗小鼠二級抗體(Cat. No. 115-035-003 Jackson Immunoresearch) 一起在37°C在溼化箱中保溫2小時。對該玻片進行3次在TBS-T中洗 滌10分鐘，然後進行3次在PBS中洗滌10分鐘。使用Sigma Fast底物(Cat. No. D—4168，5分鐘。通過在PBS中洗滌終止染色。使用Harris蘇木精 (Cat. No. MHS16，Sigma-Aldrich)復染30秒。在用水和用PBS洗滌後，將玻片置於顯微鏡 下觀察。根據這項應用特異性選擇用於免疫組織化學標記的抗體，不依賴於其在ELISA或 者在Western印跡中的反應性。2.白細胞彈件蛋白酶抑制劑的免疫組織化學檢測組織微陣列載玻片用於篩選大量樣品。這些樣品是點於玻片上的結腸組織。患者 的特性(結腸直腸癌組織微陣列上存在的結腸組織斑點的特性)以及用抗-白細胞彈性蛋 白酶抑制劑抗體免疫標記的結果示於表10。表10 該表中結果證實在健康結腸黏膜活檢組織中，無標記(10個陰性結果)。該標記 在腺瘤中也是陰性的(1/1)。該標記在結腸腺癌的上皮細胞中是陽性的(8/11患者陽性)。在基質中無標記。3.埃茲蛋白的免疫組織化學檢測組織微陣列載玻片用於篩選大量樣品。這些樣品是點滴於玻片上的結腸組織。對 於每個結腸腺癌患者，在腫瘤中心取3份樣品，在侵潤前沿取3份樣品以及在健康組織取3 份樣品。表11示出了用抗-埃茲蛋白抗體免疫標記的結果；示出的標記水平是在分析的3 份樣品的最大強度。表11 在30個患者中，25個患者呈現出與相鄰健康組織相比在腫瘤(腫瘤中心或侵潤前沿)中埃茲蛋白過表達。4.醯化胺基酸水解酶1的免疫組織化學檢測組織微陣列載玻片用於篩選大量樣品。這些樣品是點滴於玻片上的結腸組織。對 於每個結腸腺癌患者，在腫瘤中心取3份樣品，在侵潤前沿取3份樣品以及在健康組織取3 份樣品。表12示出了用抗-醯化胺基酸水解酶抗體免疫標記的結果；示出的標記水平是在 分析的3份樣品的最大強度。表 12
患者標識符 在30個患者的樣品中，21個患者呈現出與相鄰健康組織相比在腫瘤(腫瘤中心或 者侵潤前沿)中醯化胺基酸水解酶過表達。5. I-絲束蛋白的免疫組織化學檢測組織微陣列載玻片用於篩選大量樣品。這些樣品是點於玻片上的結腸和直腸組織。患者的特性(結腸直腸癌組織微陣列上存在的結腸組織斑點的特性)以及用抗-I-絲 束蛋白抗體免疫標記的結果示於表13。表 13 表中結果證實-在健康結腸黏膜活檢組織中，該標記在8個樣品中較弱(+)，在2個樣品中是 ++。該標記在結腸腺瘤樣品(1/1)中也較弱(+)。該標記在結腸腺癌上皮細胞中是強陽性 ++(6/9患者++，3個患者較弱+，包括結腸粘液性腺癌)。在基質中無標記；_在健康直腸黏膜活檢組織中，該標記以非特異性方式存在於表面上皮(3/4)，在 1個樣品中是++水平。該標記在直腸腺瘤中是強陽性++(5/9)或者謹慎+(4/9)。該標記 在直腸腺癌的上皮細胞中也是強陽性++(3/4患者是++，1個患者較弱+)。在基質中無標 記。實施例8 通過LC-MRM-MS技術檢測腫瘤標記物1.方法學為了使檢測限度降低至幾個ng/ml，使用一種改良的MRM-MS方法。這個方法的連 續步驟是1)高豐度蛋白質的免疫耗竭，2)胰蛋白酶消化，3)對所述肽進行SPE(固相提 取)分級分離，4)與MRM-MS結合的液相層析(LC)。通過向對照血清集合中加入10-250ng/ml濃度的ACY、埃茲蛋白、L_FABP、PDI或者 I-絲束蛋白重組蛋白對添加樣品(spike sample)進行設置。載脂蛋白A1和A2天然存在 於血清中。免疫耗竭.血清中高豐度蛋白質的耗竭通過使用來自Vivascience的商業 Vivapure抗-HSA試劑盒進行。或者，也可以使用來自Calbiochem的Proteoextract Albumin/IgG 試劑盒以及來自 Bio-Rad 的 Aurum SerumProtein Minikit。也可以在實驗 室中產生特異性樹脂，通過將待耗竭的蛋白質的單克隆抗體與CNBr-活化的S印harose 4B 樹脂(Amersham Bioscience)根據廠商指導結合。酶消化.將耗竭的血清樣品在用10mM Tris(pH 8)緩衝的、且含有30mM 二硫 蘇糖醇的6M尿素溶液中在40°C去飽和40分鐘，然後用50mM碘代乙醯胺在室溫避光烷 化40分鐘。將其在水中稀釋6倍，然後在37°C用胰蛋白酶消化過夜，所用酶/底物比率 為1 30(Promega)。通過加入終濃度為0. 5%甲酸終止消化。使用Oasis HLB 3cc逆向 cartridges (60mg) (Waters)通過固相提取(SPE)對消化的樣品去鹽化(desalified)。在 應用樣品後，將該cartridges用1ml的0. 1 %甲酸洗滌，然後用含有0. 甲酸的甲醇/水 混合物(80/20v/v)進行洗脫。洗脫物在真空下乾燥。SPE分級分離.將乾燥的樣品置於1ml乙酸鹽緩衝液中，並且加樣於在乙酸鹽緩衝 液和甲醇中預先平衡的Oasis MCX (混合的陽離子交換)60mg混合柱(疏水性和陽離子交 換)(Waters)中。將該柱用1ml乙酸鹽緩衝液和1ml甲醇洗滌。用1ml甲醇/乙酸鹽緩衝 液混合物(50/50v/v)洗脫感興趣的肽(表14)。根據感興趣的肽的等電點選擇乙酸鹽緩衝 液的PH。洗脫物在真空下乾燥，並且溶解於含有0. 甲酸的200 yl乙腈/水(3/97v/v) 溶液中。將50 yl等份注射進與MS-MS系統結合的LC中。液相層析和質譜分析.在HP 1100系列高壓層析系統(HPLC)上進行LC-MS分 析，該系統具有一個雙向泵和注射器(Agilent Technologies)，並且結合了質譜分析儀以增加靈敏性，即 Sciex API 2000triple quadripole 或者 Sciex API 4000 Qtrap (hybrid triple quadripole-ion trap MS) (MDS Sciex) 。$ C18Symmetry fe (Waters)LC ^
離，洗脫流速為300iU/分鐘(洗脫液A =在水中0. 甲酸，洗脫液B =在乙腈中0. 1% 甲酸，5%B至50%B線性梯度25分鐘，然後50% B至100% B線性梯度3分鐘)。以陽性 離子化模式在5500V電壓進行MS分析，以針式電壓(needle voltage)施加，使得來源離子 化。使用Analyst 1. 4. 1軟體進行設備核查和數據獲得。霧化氣體(空氣)和氣簾氣體 (curtain gas)(氮氣)流速分別為30和20psi。Turbo V 離子源調節為400°C，輔助氮氣 流為40psi。對每種肽記錄的MRM躍遷(transitions)示於表14。對於每個選擇的MRM躍 遷優化碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)和碰撞室出口電壓(CXP)。2.結果對於每種腫瘤標記物(表14列出的蛋白質)，使用MIDAS (MRM-起始的檢測和測 序)軟體產生理論MRM躍遷列表。這個表包含質量範圍在800to3000Da的理論上胰蛋白酶 消化的肽的所有雙極或三極親代離子以及y或b型的所有可能的片段離子。對於每種蛋白 質，檢測每個可能的躍遷以確定最靈敏和最特異性的躍遷。這種選擇的結果示於表14。使 用AQUA型(Sigma)的重鏈肽或者作為測定標準的重鏈重組蛋白質，可以絕對方式量化複合 的生物學介質中感興趣的腫瘤標記物。表 14
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權利要求
通過確定得自疑似患有結腸直腸癌的患者的生物學樣品中白細胞彈性蛋白酶抑制劑標記物的存在而體外診斷結腸直腸癌的方法。
2.權利要求1的方法，特徵在於所述生物學樣品是遠離腫瘤的樣品。
3.權利要求1或2的方法，特徵在於其還包括確定選自如下標記物的至少一種其它腫 瘤標記物的存在埃茲蛋白、醯化胺基酸水解酶1、肝脂肪酸結合蛋白、腸脂肪酸結合蛋白、 載脂蛋白Al、載脂蛋白AII和I-絲束蛋白。
4.權利要求1-3任一項的方法，特徵在於其還包括確定選自如下標記物的至少一種其 它腫瘤標記物的存在β 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣 網蛋白、再生胰島衍生蛋白3 α、腫瘤相關鈣離子信號傳導蛋白1、細胞骨架角蛋白II型8、 細胞骨架角蛋白I型18、細胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白、CEA、絨毛蛋白、CA19-9、 CA242、CA 50, CA 72-2、睪酮、TIMP-l、Cripto_l、Intelectin-1、蛋白質二硫鍵異構酶、細胞 角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛素(原)-A5 ；血液中甲基化DNA的檢測，優選AXL4基 因的甲基化DNA或者s印tin-9基因的甲基化DNA ；糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如 糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的 檢測。
5.權利要求1-4任一項的方法在結腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診、預後以及復 發診斷中的應用。
全文摘要
本發明涉及通過確定得自疑似患有結腸直腸癌的患者的生物學樣品中白細胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標記物的存在而體外診斷結腸直腸癌的方法。所述方法可用於結腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診以及預後，以及用於結腸直腸癌的復發診斷。
文檔編號G01N33/574GK101855555SQ200880025227
公開日2010年10月6日 申請日期2008年7月10日 優先權日2007年7月19日
發明者C·博利厄, D·羅蘭, G·肖凱-凱斯狄拉維斯基, J-P·沙裡耶, O·梅讓-勒圖爾納 申請人:生物梅裡埃公司