一種打頂後無腋芽菸草的培育方法

2023-04-30 05:32:01

專利名稱：一種打頂後無腋芽菸草的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種打頂後無腋芽菸草的培育方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
菸草作為葉用作物，任其開花結實會消耗大量養分，降低菸葉產量和品質。在優質烤菸的種植中，「打頂」是一項提高菸葉質量的重要措施，必須在適當時期摘去頂部的花蕾或花序，杜絕煙株體內營養物質的無謂消耗，促使營養物質集中供應葉片生長，增大葉面積和單葉重量。
但是，打頂後，腋芽叢生，耗費養分，達不到提高菸葉質量的目的。實際生產中，通常採用在「打頂」後人工抹芽或「打頂」後施以抑芽丹抑制腋芽生長的方法來對腋芽進行抑制。
然而，「打頂」後人工抹芽耗費勞力過大，提高了菸葉的生產成本。「打頂」後施以抑芽丹雖然可以抑制腋芽生長，降低勞動強度，但是並不降低菸葉生產的成本，同時，抑芽丹作為農藥，無法避免對環境和菸葉產生汙染。
高等植物含有許多過氧化物酶同工酶，不同的過氧化物酶基因表現出不同的表達模式。菸草的過氧化物酶基因(tpoxN1)在傷誘導後20分鐘後迅速表達，且能維持至少2周的時間，茉莉酸和乙烯處理tpoxN1的表達並不加強，與其它過氧化物酶基因的表達表現出明顯的不同。tpoxN1啟動子的克隆可以為進一步研究tpoxN1的表達調控打下基礎。
啟動子在植物的遺傳轉化中具有重要的作用，特別是在外源抗性基因的轉化中尤為重要，如使用組成型啟動子，會是目的基因恆定而持續表達，過度消耗細胞內的物質和能量，造成植物體內資源的浪費，影響正常的代謝，不利於產量和品質的提高。而使用誘導型啟動子只有在接受誘導信號後，目的基因才會表達，且脅迫解除後目的基因停止表達，這樣不僅不會造成植物體內資源的浪費，又可提高植物的抗性。誘導型啟動子的研究和應用已成為植物基因工程的熱點。菸草tpoxN1基因啟動子的克隆為下一步將它應用於轉抗病蟲基的研究提供一個有用的工具。
2000年Stafstrom，Joel等用差異顯示技術在豌豆中獲得了能抑制豌豆側芽生長的基因DRM。(Madoka Y，Mori H.Two novel transcripts expressed in pea dormant axillary buds.Plant Cell Physiol.2000 Mar；41(3)274-81)。
2001年TantikanjanaT等人發現缺失SPS基因的擬南芥植株會萌生大量側芽，經實驗確證該基因SPS能壓制側芽的生長。(T，Yong JW，Letham DS，Griffith M，Hussain M，Liung K，Sandberg G，Sundaresan V.control of zxillary bud initiation and shoot architecture in arabidopsis through thesupershoot gene.Tantikanjana.Genes Dev.2001 Jun 15；15(12)1577-88)。
2002年，Madoka Y，MoriH等用反義RNA技術抑制PSA基因的表達，獲得的植株比正常植株側芽數量明顯增加，認為該基因有抑制側芽生長的作用。(Bahrami AR，Bastow R，Rolfe S，Price C，Gray JE.A role for nuclear localised proteasomes in mediating auxin action.Plant J.2002Jun；30(6)691-8.)目前廣泛應用的標記基因為除草劑抗性基因和抗生素抗性基因。隨著轉基因植物的商品化種植，人們擔心轉基因農作物中的除草劑抗性基因可能會經自然雜交傳遞至雜草，轉基因食品中的抗生素抗性基因可能通過轉染腸道細菌從而造成人類對這些抗生素產生抗性，儘管尚無確鑿可信的科學證據，抗性標記基因(resistant marker gene)潛在的生態環境和食用安全性一直頗有爭議，尋找安全標記基因用於植物的遺傳轉化無疑是解決這一問題的最佳途徑。而磷酸甘露糖異構酶基因(pmi)作為標記基因可解決上述問題。來源於Ecoli的pmi作為標記基因已成功應用於甜菜、玉米和水稻的遺傳轉化。
因此，培育一種在打頂後腋芽能夠被有效抑制的菸草品種葉的產品質量和產量，同時避免造成對環境和菸葉的汙染，並且應用安全，能夠降低生產成本和勞動力投入的方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種打頂後無腋芽菸草的培育方法。
本發明方法採用分子生物學技術鑑定「打頂」後促進腋芽萌發和生長的關鍵基因，然後用傷誘導啟動子驅動反義RNA在「打頂」後立即表達，從而抑制促進腋芽萌發和生長的關鍵基因的表達，使腋芽不能萌發和生長。
本發明方法包括抑制側芽生長基因的克隆、傷誘導啟動子POD的克隆和安全標記基因pmi的克隆；將三者置於同一表達載體下，利用農桿菌介導法將該載體導入菸草，經過標記篩選、轉化，得到初篩菸草植株，再經分子檢測、表形檢測，得到轉基因無腋芽菸草植株。
所述的抑制側芽生長基因為豌豆DRM基因、擬南芥SPS基因和菸草PSA基因。
豌豆DRM基因2000年Stafstrom，Joel等用差異顯示技術在豌豆中獲得了能抑制豌豆側芽生長的基因DRM。(Madoka Y，Mori H.Two novel transcripts expressed in pea dormant axillary buds.Plant Cell Physiol.2000 Mar；41(3)274-81)。
擬南芥SPS基因2001年Tantikanjana T等人發現缺失SPS基因的擬南芥植株會萌生大量側芽，經實驗確證該基因SPS能壓制側芽的生長。(T，Yong JW，Letham DS，Griffith M，Hussain M，Ljung K，Sandberg G，Sundaresan V.control of zxillary bud initiation and shoot architecture inarabidopsis through the supershoot gene.Tantikanjana.Genes Dev.2001 Jun 15；15(12)1577-88)。
菸草PSA基因2002年，Madoka Y，Mori H等用反義RNA技術抑制PSA基因的表達，獲得的植株比正常植株側芽數量明顯增加，認為該基因有抑制側芽生長的作用。(Bahrami AR，BastowR，Rolfe S，Price C，Gray JE.A role for nuclear localised proteasomes in mediating auxin action.Plant J.2002 Jun；30(6)691-8.)2002年Sasaki K，Hiraga S等發現菸草過氧化物酶基因(tposN1)在傷誘導20min後迅速表達且能維持至少2周的時間。(Sasaki K，Hiraga S，Ito H，Seo S，Matsui H，Ohashi Y.A wound-inducibletobacco peroxidase gene expresses preferentially in the vascular system.Plant Cell Physiol.2002Jan；43(1)108-17.)上述傷誘導啟動子POD根據tposN1序列，利用Genomerwalker技術克隆了該基因的啟動子序列。該傷誘導啟動子可使目的基因在打頂傷害後誘導表達。
植物在受到傷害時通過激活體內的防衛系統產生的防衛反應來抵抗病原菌，包括活性氧的釋防、防衛基因的表達、過敏反應及系統獲得性抗性。在許多植物中過氧化物酶(Peroxide，POX，EC 1.11.1.7)基因是一種傷誘導應答基因。外源茉莉酸、乙烯加強了傷誘導POX基因的表達，同時也誘導傷應答基因PR的表達。因此，茉莉酸和乙烯被認為是傷誘導信號傳導的中間體。菸草的過氧化物酶基因(tpoxN1)在傷誘導後迅速表達且維持較長的時間，而茉莉酸和乙烯處理tpoxN1的表達並不加強。
本發明方法中對菸草傷誘導型過氧化物酶基因(tpoxN1)啟動子的克隆過程如下材料與方法部分植物材料菸草(Nicotiana tabacum cv.K326)種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；幼葉採集後用於基因組DNA的提取；試劑Universal GenomewalkeTMKit、Advantage Genomic Polymerase Mix購自CLONTECH公司；IPTG、X-Gal、dNTPs、pGEM-T easy Vector購於Promega公司；其它生化試劑和常規試劑均為超純和分析純；方法部分菸草基因組DNA的提取參照傅榮昭的方法(傅榮昭，孫勇如，賈士榮.植物遺傳轉化技術手冊.北京中國科學技術出版社，1994，140-142)進行；構建GenomeWalker文庫及GenomeWalker DNA Walking按Universal GenomewalkerTMKit使用說明書進行；引物的設計根據GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列設計引物GSP 15′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′GSP 25′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′從GenomeWalker文庫中進行PCR-based DNA Walking，按Universal GenomewalkerTMKit使用說明書進行；第一輪PCR在5個0.2ml離心管中分別加入5種DNA文庫，然後依次加入以下成分10XPCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP1(10uM)、GSP1(10uM)、Advantage GenomicPolymerase Mix(50x)；反應總體積50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)進行PCR反應，反應條件為7個循環(94℃，2sec；70℃，3min)→32個循環(94℃，2sec；65℃，3min)→65℃，4min；第二輪PCR在5個0.2ml離心管中分別加入稀釋的第一輪PCR產物，然後依次加入以下成分10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP2(10uM)、GSP2(10uM)、AdvantageGenomic Polymerase Mix(50x)；反應總體積50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)進行PCR反應，反應條件為7個循環(94℃，2sec；70℃，3min)→32個循環(94℃，2sec；65℃，3min)→65℃，4min；AP1、AP2由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTMKit提供，序列為AP15′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；AP25′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′。
PCR產物的回收、連接及重組質粒的鑑定按常規方法(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.分子克隆實驗指南(第二版).金冬雁，等譯.北京科學出版社，1992，80-120)進行；DNA的序列測定由上海生物工程公司測定；結果與分析部分Genomewalker文庫的構建與Genome Walker DNA Walking利用4種產生平末端的限制性內切酶(DraI、EcoR V、PvuII、SspI)分別對菸草基因組DNA進行酶切，並對酶切後的DNA進行純化。然後把純化的DNA與接頭(由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTMKit提供)連接，構建成4種Genomewalker文庫(DraI文庫、EcoR V文庫、PvuII文庫、SspI文庫)；根據GenBank(acession numberAB027753)的tpoxN1的mRNA序列設計了兩個引物，利用Genome Walker的方法，對菸草tpoxN1基因的5』調控區進行了克隆。通過第一輪PCR擴增後，從4種Genomewalker文庫中均能擴增出產物，但都呈彌散狀，經過第二輪PCR擴增後，由DraI文庫、EcoR V文庫、PvuII文庫擴增出清晰的條帶(結果未示)；對獲得的最大的片段(DraI文庫)進行了克隆；PCR產物經瓊脂糖電泳後回收，插入pGEM-T Easy載體，重組質粒經EcoRI酶切獲得約2000bp的片段，見圖9；對重組質粒進行測序結果表明，該片段長為2070bp。
菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列分析用PCGENE對序列分析進行表明，tpoxN1基因的轉錄起始位點(tspA)的保守序列5』YTCAATCA與其它植物基因非常一致([Joshi.CP.Aninspection of the domain betwwen putative TATA box and translation start in 79 genes.Nucleic AcidsRes，1987，156643-6653]；[Bucher P. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase IIpromoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212563-578])，轉錄從tsp下遊79bp處開始。在鄰近5』區域，發現一些真核生物順式調控元件。在-33bp處存在TATAbox序列(TATAAATATGT)；在-71bp處具有TCCAAT序列，與多個高等真核生物的啟動子的『CAAT』相似(Bucher P.Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase IIpromoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212563-578)；在-840處存在GC-box；在-1005處存在CCAAT-box；在-214，-749處也可以發現TCA-like序列，TCA-like序列目前在30多種脅迫誘導基因的啟動子中可以發現(Goldsbrough AP，Albrecht H，Stratford R.Salicylic acid-inducible binding of a tobacco nuclear protein to a 10-bp sequence which ishighly conserved amongst stress-inducible genes.Plant J，1993，3；563-571)，，該序列在酵母的DDR2、ubi4和CTT1等基因中與脅迫應答元件(stress-response element，STRE)有關(Schuller C，BrewsterJL. Alexander MA，et al.The HOG pathway controls osmotic regulation of transcription via the stressreponse element(STRE)of the Saccharomyces cerevisiae CTT1 gene.EMBO J，1994，134382-4389)；將菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列與一些傷誘導啟動子比較，未找到相同的傷誘導相關調控元件。本發明利用已克隆到的菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列與GUS構建了一系列的融合基因，通過轉基因的方法來研究其調控方式；菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列見圖10。
傷誘導啟動子POD是在菸草裡克隆到的誘導型啟動子，使用組成型啟動子，會使目的基因恆定而持續表達，過度消耗細胞內的物質和能量，造成植物體內資源的浪費，影響正常的代謝，不利於產量和品質的提高。例如，很多抑芽基因都與激素代謝水平有關，過早表達可能會影響菸草的正常生理。而使用誘導型啟動子只有在接受誘導信號後，目的基因才會表達，且脅迫解除後目的基因停止表達，不會對植物的其他生理指標造成很大影響。為此本發明使用了傷誘導啟動子POD替換了pBI121載體上的CaMV35S啟動子(將改造後的載體命名為pPOD)，使該基因得以在打頂後(提供傷誘導)表達。
以下詳細說明DRM基因的克隆、植物表達載體的構建及將載體轉化菸草的研究。POD、SPS、PSA三個片段的製備及載體的構建方法和DRM基因的完全相同。
所述的DRM基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草過程為材料與試劑部分植物材料豌豆(Pisum sativum L.cv.Alaska)由中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存。
菌種及質粒大腸桿菌E.coli DH5α、農桿菌EHA105菌株、輔助質粒pRK2013均由熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；限制性內切酶、pUCM18-T載體、T4DNA連接酶均是寶生物公司產品，QIAquick Gel Extraction Kit為QiaGene公司產品L；IPTG、X-gal購自華美生物工程公司，其它生化試劑分別購自曙光、華美、經科、Biolab等國內外公司。
方法與步驟部分DRM基因的克隆植物總DNA的提取參考傅榮昭的方法，具體如下(1)稱取0.1g左右葉片，於研缽中在液氮下研至粉末。
(2)將粉末轉移至一1.5ml離心管中，加入400μl DNA提取緩衝液。
(3)解凍後置於冰上，加入200μl冰預冷的20％PVP存貯液(於-20℃保存)。
(4)加入75μl 20％SDS溶液。
(5)輕輕顛倒數次，混勻後於65℃水浴保溫15min，其間顛倒2～3次。
(6)冷卻至室溫，加入75μl 5mol/L KAc，混勻後，冰浴30min。
(7)4℃12,000r/min條件下離心10min。
(8)轉移600μl上清至另一1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇，混勻後，冰浴10min。
(9)4℃12,000r/min條件下離心15min。
(10)將上清液儘可能去除，沉澱溶於500μl TE(pH8.0)緩衝液中。
(11)加入1μl RNaseA(10mg/ml)，混勻後，室溫放置10min。
(12)用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次。
(13)20℃12,000r/min離心5min，取上相400μl至另一1.5ml離心管中。
(14)加入20μl 3mol/LNaAc(pH5.2)、420μl異丙醇，混勻後，室溫放置5min。
(15)4℃12,000r/min條件下離心5min，去上清液，沉澱用1ml 70％乙醇洗一遍，乾燥後溶於50μlTE(pH8.0)中，存於4℃。
(16)DNA紫外分析取4μl DNA原液加入到400μl TE(pH8.0)緩衝液中，混勻後，用DU-70紫外分光光度計測定260nm、280nm處吸收值，並計算DNA原液濃度。
DNA提取緩衝液500mmol/LNaCl、50mmol/LTris·Cl(pH 8.0)、50mmol/L EDTA、1％(v/v)βMetTE緩衝液10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)RNaseA將RNaseA溶於10mmol/L Tris·Cl pH7.5，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，沸水加熱15min後，使其緩緩冷卻至室溫，分裝成小份存於-20℃。
引物設計根據DRM基因的mRNA序列設計，為構建載體的方便，設計了兩個酶切位點XbaI和BamHI。
DRMP15`-ACTTCTAGAATGGGCCTCCTCGACCAGTT-3`XbaIDRMP25`-ACTGGATCCTCACACATCGAAAGGAGAAG-3`BamHIPCR擴增在0.2ml的離心管中分別加入以下成分ddH2O31.5μl10XPCR緩衝液 5.0μl25mM dNTP 5.0μlP1(10mM) 1.0μlP2(10mM) 1.0μl25mM MgCl25.0μlDNA模板 1.0μl混勻後，在94℃預變性3min後，加入0.5μl Taq DNA聚合酶進行PCR反應。反應參數為94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環後在72℃繼續延伸10min，4℃保存。
PCR產物的回收PCR擴增產物的回收採用QIAquick Gel Extraction Kit，操作按說明書進行(1)10μl PCR擴增反應液進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，2V/cm恆電壓條件下電泳30min。紫外燈下切下含目的片段的瓊脂糖塊，並轉移至一1.5ml離心管中；(2)加入3倍體積的QG緩衝液，50℃水浴保溫10min將瓊脂糖凝膠完全溶解；
(3)溶解液轉移至QIAquick離心柱；(4)2,000rpm/min，25℃離心1min；(5)去除離心管中的液體，加入0.75ml PE緩衝液至QIAquick離心柱；(6)12,000r/min，25℃離心1min；(7)去除離心管中的液體，25℃12,000rpm/min條件下離心1min；(8)加入30μl EB緩衝液至離心柱的膜上，將離心柱置於一個滅過菌的1.5ml離心管中，12,000r/min，25℃離心1min；(9)取1.0μl離心收集的回收液，進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，估算目的DNA片段濃度。
目的片段的克隆按寶生物公司提供的方法，將PCR擴增片段與pUC18-T Vertor連接，向0.5ml的無菌離心管中加入10×T4DNA連接酶Buffer 2.0μlpUC18-T Vector DNA1.0μlPCR回收產物 4.0μlT4DNA連接酶(3U/ul)1.0μlddH2O12.0μl總計20.0μl，充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。
E.coli DH5α感受態細胞的製備(1)從LB瓊脂平板上挑取E.coli DH5α單菌落，接種到10ml不含抗生素的LB液體培養基中，37℃，300rpm振蕩培養過夜。次日按照1％(V/V)的量轉入新鮮LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600在0.3-0.4之間；(2)將50-100ml的培養液轉入兩個預冷的無菌離心管中，於冰上放置30min；(3)4℃、6000rpm離心3min，去上清液；(4)向每個離心管中各加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重懸菌體，冰浴30min；(5)4℃，6000rpm離心3min；去上清液，再將菌體懸浮於2ml冰冷的0.1mol/LiCl溶液中，即為感受態細胞。於4℃冰箱保存，一周內使用。
連接產物的轉化(1)用無菌吸頭取100μl感受態細胞置1.5ml預冷的無菌離心管中，加入5μl連接反應液，輕輕混勻，立即置冰上30min；(2)將管置42℃恆溫水浴中熱激90s；(3)放回冰上3-5min；(4)加入800μl無附加抗生素的LB液體培養基，混勻，37℃預表達培養45-60min；(5)製備LB附加100μg/ml氨苄青黴素(Ampicillin，Amp)的固體平板；(6)取200μl菌液與4μl IPTG及16μl X-gal混勻；(7)用無菌吸頭蔣混合液移至LB平板上，再用無菌三角頭玻棒蔣菌液均勻塗滿整個平板表面；(8)平板於37℃正向放置至液體被吸收，然後倒置平皿，於37℃培養12-16h，LB培養基
酵母抽提物(Yeast Extract)(5g/L)蛋白腖(Tryptone) (10g/L)NaCl(10g/L)加900ml蒸餾水溶解，用NaOH調節pH值至7.0，再定容到1,000ml，分裝後，121℃滅菌20min。
X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)用二甲基甲醯胺將X-Gal配製成50mg/ml的溶液，黑紙包裹後，存於-20℃。
IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)用蒸餾水將IPTG配製成200mg/ml的溶液，通過0.22μm的一次性濾器過濾除菌，分裝後，貯存在-20℃備用。
質粒DNA的小量提取(1)用無菌牙籤從LB平板上挑取白色單菌落並分別接種到盛有含Amp(100μg/ml)3ml LB培養基(含Amp 100μg/ml)的試管中。
(2)37℃300r/min條件下連續振蕩培養8～10h。
(3)分別轉移1.4ml左右培養物至1.5ml離心管中。
(4)12,000r/min，4℃離心30s至60s。
(5)儘可能將上清倒盡，5,000r/min再離心數秒將殘液收集到管底(沉澱物在轉子中的位置應與前一次離心時一致)，並用取液器將殘液吸盡。
(6)加入200μl溶液I，振蕩渦旋將細胞沉澱物徹底重懸。
(7)加入200μl溶液II，蓋緊管蓋並顛倒3～4次至溶液呈透明粘稠狀。
(8)加入200μl溶液III，蓋緊管蓋，顛倒數次至白色絮狀沉澱呈均勻分散狀。
(9)12,000r/min，4℃離心5min。
(10)轉移400μl上清液，並用1ml無水乙醇沉澱質粒DNA。
(11) 12,000r/min，4℃離心5min，去上清液，沉澱物用1ml 70％乙醇洗滌一遍，再稍離心，將殘液吸盡。
(12)乾燥後，用50μl ddH2O將質粒溶解備用。
Solution I50mmol/L Tris·HCl，pH7.510mmol/L EDTA，100μg/ml RNase ASolution II0.2mol/L NaOH，1％SDSSolution III1.32mol/L KAc，pH4.8重組子的酶切鑑定(1)在一0.5ml離心管中，依次混入下列各組分10×BufferM5.0μl質粒DNA5.0μlddH2O 38.0μlXbaI 2.5μlBamHI 2.5μl總計50.0μl。
(2)混勻後，稍離心，37℃溫育30-60min。然後取5.0μl酶切反應液進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，並以PCR標準分子量做對照。5V/cm恆壓條件下電泳30min後，於紫外燈下觀察。
DNA序列測定與分析挑取的陽性克隆進行DNA序列測定，測序由上海生物工程公司完成。
pPOD/DRM植物表達載體的構建目的片段的酶切及回收用XbaI和BamHI雙酶切將DRM從克隆載體上切下，插入到經同樣酶切的植物表達載體pPOD，構建帶有DRM基因的植物表達載體pPOD/DRM。酶切反應體系及步驟，酶切產物的回收步驟同上。
連接反應，連接用寶生物公司T4DNA連接酶，體系如下DRM片段10μlPpod片段 5μlT4DNA連接酶1μl10×Buffer 2.5μlddH2O 6.5μl總計25μl，充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。
pPOD/DRM植物表達載體的鑑定將上述連接產物轉化大腸桿菌然後用PCR法篩選轉化子，將此轉化子再用XbaI和BamHI雙酶切進行酶切鑑定，如圖12所示，所切下的片斷與預期結果相符，說明構建正確。
三親交配法轉化農桿菌三親交配(1)將保存的菌株接種在加有利福平(Rif)25μg/mL鏈黴素(str)25μg/mL的10ml的LB液體培養基中，28℃，200rpm振蕩培養24h；(2)從保存的輔助質粒pRK2013的平板上挑取一個單菌落，接種於10ml不含抗生素LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養8h；(3)從保存的中間載體的平板上挑取一個單菌落，接種於10ml不含抗生素LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養8h.；(4)分別取以上三種細菌培養物50μl於1.5離心管中混勻，取50μl塗布於不含抗生素的LB固體培養基上，28℃，培養2-3天；(5)用接種環將長出的菌落轉接到含有Kanμg/ml，Str25ug/ml和Rif25μg/ml的LB平板上，28℃培養過夜；同時各取1，2，3步驟中的菌液50μl分別塗布於含有三種抗生素的LB平板，作為對照。
農桿菌質粒的提取為了檢測外源基因是否轉移到農桿菌中，採用PCR檢測。
(1)從含有植物表達載體的農桿菌三抗LB平板上挑取一個單菌落，接入含有Kan 50μg/ml，Str 25μg/ml和Rif 25μg/ml的50ml LB液體培養基的100ml的三角瓶，28℃，200rpm振蕩培養24h；(2)取1.5ml菌液置2ml離心管中，4000rpm離心10min，重複3次收集菌液；(3)用STE溶液洗滌菌體2次；
(4)加入0.4ml溶液I，渦混懸浮細菌，室溫放置10min；(5)加入0.8ml新配製的溶液II，顛倒離心管數次，室溫放置10min；(6)加入0.4ml溶液III，輕顛倒離心管數次，使酚和內容物混勻；(7)加入0.2ml 3mol/L乙酸鈉，輕顛倒離心管數次，冰浴中放置5min；(8)1000rpm離心5min，將上清液轉入一個新離心管中，加入2倍體積冰冷的95％乙醇，-20℃放置1h；(9)1000rpm離心5min，棄掉上清液；(10)向沉澱中加入0.5ml 0.3mol/L醋酸鈉溶解沉澱，加入1.0ml無水乙醇，顛倒離心管數次，-20℃放置1h；(11)1000rpm離心5min，輕輕去掉上清液，離心管口向下，用無菌濾紙吸去管壁液滴；(12)加入1ml70％乙醇漂洗沉澱，快速吹乾；(13)用無菌雙蒸水溶解沉澱，加入2ulRNase，37℃放置7h。重組子的PCR檢測PCR反應體系PCR Premix10.0μlDNA質粒 1.0μl引物1 0.5μl引物2 0.5μlddH2O18.0μl總計20.0μl，充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底。PCR反應參數為94℃預變性5min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環，72℃保溫10min。取10μlPCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，並以PCR標準分子量做對照。5V/cm恆壓條件下電泳30min後，於紫外燈下觀察。
農桿菌介導菸草的遺傳轉化菸草無菌苗的培養先用70％的乙醇浸泡K326菸草種子2min，再用15％的次氯酸鈉浸泡20min，期間要不斷的攪動。用無菌水衝洗4-5遍播種於MS培養基上，28℃暗培養3-5待種子開始萌發移至光照培養箱繼續生長。一個月後取葉子為試驗材料。
農桿菌侵染液的製備從培養平板挑取EHA 105/pBI121/ADF4單菌落，接種到LB+50μg/mlKan+25μg/ml Str+25μg/ml Rif的液體培養基中，28℃、200r/min振蕩培養至對數期(OD600值約0.5)，3000rpm離心10min後，取沉澱用等體積的MS培養基懸浮。
葉盤轉化法(1)將剪取0.5cm葉片浸入菌液5min後，用無菌濾紙吸乾後轉移到MS+2.0mg/L BA培養基上。
(2)侵染過的葉盤接種在分化培養基MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA，在28℃黑暗條件培養3d。
(3)經過共培養的葉盤轉移到加有選擇壓培養基MS+0.05mg/L IAA+2.0mg/L BA+600mg/LCef+100mg/LKan，大約15-20d繼代一次，繼代兩次誘導出不定芽。
(4)待不定芽長到2-3cm長時，用解剖刀切下，轉到伸長培養基上MS+0.5mg/L BA+600mg/Lcef+100mg/LKan，兩周更換一次新鮮的伸長培養基，篩選培養2-3代，淘汰白化苗及畸形苗。
(5)選著形態正常、生長旺盛的抗性苗，轉入生根培養基MS+0.2mg/L IAA+600mg/L Cef+100mg/L Kan上培養。
(6)待根系形成後取出小苗，在自來水洗淨根上的瓊脂，移入沙盆室溫中培養。MS培養基大量元素KNO3283mg/l，(NH4)NO3463mg/l，KH2PO4400mg/l，MgSO4.7H2O 185mg/l，CaCl2H2O166mg/l微量元素MnSO4.H2O 76mg/l，H3BO4300mg/l，ZnSO4.7H2O 200mg/l，NaMoO4.7H2O 2.5mg/l，CuSO4.5H2O 2.5mg/l，CoCl2.6H2O 2.5mg/l，KI 7.5mg/l有機物鹽酸硫胺素10mg/l，鹽酸吡哆醛(B6)1mg/l，煙酸1mg/l，肌醇100mg/l鐵鹽FeSO4·7H2O 2.78mg/l，Na2-EDTA 37.25mg/l瓊脂粉6.4g/L蔗糖30g/L圖2-圖8是其他幾個片段PCR擴增及構建過程的圖片。
SPS基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草(植物材料擬南芥)(1)引物SPS1ACTTCTAGA GAAACGA GCACA CAACT CACSPS2ACTGGATCC CGTCGA AACAC ATCAC AGAG(2)PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA 1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，120sec)→30個循環(94℃，30sec；65℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min→4℃.
PSA基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草(植物材料菸草)(1)引物PSA1AGCAATCTAGAAAATGAGTAGAGGCPSA2ATAGGATCCTGATAGCGAACATACATTTC(2)模板因為從美國國家生物技術信息中心(NCBI)資料庫中檢測到的PSA基因是其mRNA序列，引物設計也是根據RNA序列設計的，但是該基因內部有一段很長的內含子序列，所以我們先提取菸草的RNA，然後反轉錄得到其cDNA序列，用cDNA序列作為模板得到了PSA基因。以下是對這個過程的詳細說明PSA基因-cDNA轉基因植株的RNA提取，採用異硫氰酸胍法(1)向50ml離心管中加入10ml異硫氰酸胍溶液，放置冰上於預冷；(2)取1g新鮮幼嫩葉子放在研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末；
(3)將粉末全部轉入冰上預冷的加入10ml異硫氰酸胍溶液離心管，振蕩離心管混合均勻，將離心管放置冰上；(4)加入2mol/L NaAc 1ml、水飽和酚10ml和氯仿/異戊醇(24∶1)2ml，每加一種試劑，輕輕搖晃離心管混合均勻，最後將離心管蓋緊，顛倒幾次混合均勻，冰浴15min；(5)4℃，12000rpm 30min，將上層液轉移到一個乾淨的離心管中，用水飽和酚反覆抽提三次；(6)將上層水相轉移到一個乾淨的離心管中，向管中加入等體積的異丙醇，混勻，放置-20冰凍1h；(7)4℃，12000rpm 30min，小心去除上清液，沉澱溶於3M異硫氰酸胍溶液，在加入等體積的異丙醇，混勻，放置-20冰凍1h；(8)沉澱用70％乙醇洗滌一遍，在超淨臺吹乾，溶於適量體積甲醯胺，-20℃低溫保存；(10)行含有甲醛變性電泳膠，檢測RNA的完整性，調整轉基因植株和對照的RNA濃度一致；異硫氰酸胍溶液4mol/L異硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.1mol/L巰基乙醇；2mol/LNaCl(pH4.0)，用經DEPC處理過的水配製，高壓滅菌。水飽和酚(pH3.5)反轉錄反應按大連寶生物工程有限公司反轉錄試劑盒說明書進行。
(1)在一0.5ml離心管加入1μg的RNA(溶於11μl的DEPC處理的水中)，再加入1μl的oligdT15；(2)70℃加熱10min後，冰上冷卻1min以上；(3)在離心管中依此加入以下成分10×PCR緩衝液2μl25mM MgCl22μl0.1MDTT 2μl10mM dNTP1μl(4)42℃加熱5min後，加入1μl AMV反轉錄酶，42℃反應50min；(5)70℃加熱15min，冰上冷卻；(6)反應混合物於-20℃保存；反應結束後得到的cDNA可用於後面的PCR擴增。
(3)PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板CDNA1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，60sec)→30個循環(94℃，30sec；60℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min→4℃。
POD基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草(植物材料菸草)(1)引物POD15′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′POD25′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′(2)PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min)→30個循環(94℃，30sec；68℃，30min；72℃，2min)→72℃，10min→4℃。
本發明所述的方法，可以同樣的應用在棉花的培育上，所得棉花在質量和產量上均有顯著提高。
對應用本發明方法所得到的菸草進行PCR、Southern、Northern雜交結果顯示，外源基因已經整合到菸草基因組並且得到了表達，並獲得了外形上打頂後不生側芽的植株，且後代性狀穩定遺傳，因而不需人工抹芽或施用抑芽劑抑芽，避免了對環境和菸葉的農藥汙染；應用本發明所得到的菸草在打頂後沒有腋芽產生，避免了煙株體內營養物質的無謂消耗，促使營養物質集中供應葉片生長，葉片寬大，葉厚增加，葉片中乾物質積累量加大，菸葉的可用性提高，葉面積和單葉重量平均增加10％以上，產量和質量顯著提高。
菸草轉化採用的是農桿菌介導法。本發明利用農桿菌介導已經成功的將抑芽基因轉入菸草，對轉化植株進行PCR、Southern、Northern雜交結果顯示外源基因已經整合到菸草基因組並且得到了表達，同時也獲得了外形上打頂後不生側芽的植株，並且後代性狀穩定遺傳。


圖1為本發明所使用的農桿菌介導法示意圖。
圖2為SPS-PCR1標準分子量(2000)2SPS的PCR產物圖3為T-SPS1標準分子量(2000)2質粒T-SPS(對照)3質粒T-SPS XbaI和BamHI雙酶切圖4為POD-SPS1標準分子量(15000)2pPOD/SPS質粒(對照)3pPOD/DRM雙酶切4SPS的PCR產物圖5為T-PSA1標準分子量(2000)2PSA的PCR產物3質粒T-PSA(對照)4質粒T-PSA XbaI和BamHI雙酶切圖6為POD-PSA1標準分子量(15000)2pPOD/PSA質粒(對照)3pPOD/PSA雙酶切4PSA的PCR產物圖7為T-POD1標準分子量(2000)2、3POD的PCR產物4pPOD/POD質粒(對照)5質粒T-POD XbaI和BamHI雙酶切圖8為121-POD1標準分子量(15000)2pPOD/PSA雙酶切3pPOD/POD質粒(對照)4POD的PCR產物圖9為菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列的克隆1.Marker2PCR產物3重組質粒/EcoRI4重組質粒圖10為菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列圖11為T-DRM的雙酶切鑑定1標準分子量(2000)2DRM的PCR產物3質粒T-DRM(對照)4質粒T-DRM XbaI和BamHI雙酶切圖12為pPOD/DRM雙酶切鑑定1標準分子量(2000)2DRM的PCR產物3pPOD/DRM雙酶切4pPOD/DRM質粒(對照)
具體實施例方式本發明方法中對菸草傷誘導型過氧化物酶基因(tpoxN1)啟動子的克隆過程如下
1.材料與方法1.1植物材料菸草(Nicotiana tabacum cv.K326)種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；幼葉採集後用於基因組DNA的提取；1.2試劑Universal GenomewalkerTMKit、Advantage Genomic Polymerase Mix購自CLONTECH公司；IPTG、X-Gal、dNTPs、pGEM-T easy Vector購於Promega公司；其它生化試劑和常規試劑均為超純和分析純；1.3方法1.3.1菸草基因組DNA的提取參照傅榮昭的方法(傅榮昭，孫勇如，賈士榮.植物遺傳轉化技術手冊.北京中國科學技術出版社，1994，140-142)進行；1.3.2構建GenomeWalker文庫及GenomeWalker DNA Walking按Universal GenomewalkerTMKit使用說明書進行；1.3.2.1引物的設計根據GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列設計引物GSP15′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′GSP25′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′1.3.2.2從GenomeWalker文庫中進行PCR-based DNA Walking，按Universal GenomewalkerTMKit使用說明書進行；第一輪PCR在5個0.2ml離心管中分別加入5種DNA文庫，然後依次加入以下成分10XPCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP1(10uM)、GSP1(10uM)、Advantage GenomicPolymerase Mix(50x)；反應總體積50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)進行PCR反應，反應條件為7個循環(94℃，2sec；70℃，3min)→32個循環(94℃，2sec；65℃，3min)→65℃，4min；第二輪PCR在5個0.2ml離心管中分別加入稀釋的第一輪PCR產物，然後依次加入以下成分10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP2(10uM)、GSP2(10uM)、AdvantageGenomic Polymerase Mix(50x)；反應總體積50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)進行PCR反應，反應條件為7個循環(94℃，2sec；70℃，3min)→32個循環(94℃，2sec；65℃，3min)→65℃，4min；AP1、AP2由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTMKit提供，序列為AP15′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；AP25′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′。
1.3.3 PCR產物的回收、連接及重組質粒的鑑定按常規方法(Sambrook J，FritschEF，Maniatis T.分子克隆實驗指南(第二版).金冬雁，等譯.北京科學出版社，1992，80-120)進行；1.3.4 DNA的序列測定由上海生物工程公司測定；2.結果與分析2.1 Genomewalker文庫的構建與Genome Walker DNA Walking
利用4種產生平末端的限制性內切酶(DraI、EcoRV、PvuII、SspI)分別對菸草基因組DNA進行酶切，並對酶切後的DNA進行純化。然後把純化的DNA與接頭(由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTMKit提供)連接，構建成4種Genomewalker文庫(DraI文庫、EcoR V文庫、PvuII文庫、SspI文庫)；根據GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列設計了兩個引物，利用GenomeWalker的方法，對菸草tpoxN1基因的5』調控區進行了克隆。通過第一輪PCR擴增後，從4種Genomewalker文庫中均能擴增出產物，但都呈彌散狀，經過第二輪PCR擴增後，由DraI文庫、EcoR V文庫、PvuII文庫擴增出清晰的條帶(結果未示)；對獲得的最大的片段(DraI文庫)進行了克隆；PCR產物經瓊脂糖電泳後回收，插入pGEM-T Easy載體，重組質粒經EcoRI酶切獲得約2000bp的片段，見圖9；對重組質粒進行測序結果表明，該片段長為2070bp。
2.2菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列分析用PCGENE對序列分析進行表明，tpoxN1基因的轉錄起始位點(tspA)的保守序列5』YTCAATCA與其它植物基因非常一致([Joshi.CP.An inspection of the domain betwwen putativeTATA box and translation start in 79 genes.Nucleic Acids Res，1987，156643-6653]；[Bucher P.Weightmatrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212563-578])，轉錄從tsp下遊79bp處開始。在鄰近5』區域，發現一些真核生物順式調控元件。在-33bp處存在TATA box序列(TATAAATATGT)；在-71bp處具有TCCAAT序列，與多個高等真核生物的啟動子的『CAAT』相似(Bucher P. Weightmatrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212563-578)；在-840處存在GC-box；在-1005處存在CCAAT-box；在-214，-749處也可以發現TCA-like序列，TCA-like序列目前在30多種脅迫誘導基因的啟動子中可以發現(Goldsbrough A P，Albrecht H，Stratford R.Salicylic acid-induciblebinding of a tobacco nuclear protein to a 10-bp sequence which is highly conserved amongststress-inducible genes.Plant J，1993，3；563-571)，，該序列在酵母的DDR2、ubi4和CTT1等基因中與脅迫應答元件(stress-response element，STRE)有關(Schuller C，Brewster JL.Alexander MA，etal.The HOG pathway controls osmotic regulation of transcription via the stress reponse element(STRE)of the Saccharomyces cerevisiae CTT1 gene.EMBO J，1994，134382-4389)；將菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列與一些傷誘導啟動子比較，未找到相同的傷誘導相關調控元件。本發明利用已克隆到的菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列與GUS構建了一系列的融合基因，通過轉基因的方法來研究其調控方式；菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列見圖10。
傷誘導啟動子POD是在菸草裡克隆到的誘導型啟動子，使用組成型啟動子，會使目的基因恆定而持續表達，過度消耗細胞內的物質和能量，造成植物體內資源的浪費，影響正常的代謝，不利於產量和品質的提高。例如，很多抑芽基因都與激素代謝水平有關，過早表達可能會影響菸草的正常生理。而使用誘導型啟動子只有在接受誘導信號後，目的基因才會表達，且脅迫解除後目的基因停止表達，不會對植物的其他生理指標造成很大影響。為此本發明使用了傷誘導啟動子POD替換了pBI121載體上的CaMV35S啟動子(將改造後的載體命名為pPOD)，使該基因得以在打頂後(提供傷誘導)表達。
以下詳細說明DRM基因的克隆、植物表達載體的構建及將載體轉化菸草的研究。POD、SPS、PSA三個片段的製備及載體的構建方法和DRM基因的完全相同。
所述的DRM基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草過程為1.1材料與試劑1.1.1植物材料豌豆(Pisum sativum L.cv.Alaska)由中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存。
1.1.2菌種及質粒大腸桿菌E.coli DH5α、農桿菌EHA105菌株、輔助質粒pRK2013均由熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；限制性內切酶、pUCM18-T載體、T4DNA連接酶均是寶生物公司產品，QIAquick Gel Extraction Kit為QiaGene公司產品L；IPTG、X-gal購自華美生物工程公司，其它生化試劑分別購自曙光、華美、經科、Biolab等國內外公司。
1.2方法與步驟1.2.1DRM基因的克隆1.2.1.1植物總DNA的提取參考傅榮昭的方法。
(1)稱取0.1g左右葉片，於研缽中在液氮下研至粉末。
(2)將粉末轉移至一1.5ml離心管中，加入400μl DNA提取緩衝液。
(3)解凍後置於冰上，加入200μl冰預冷的20％PVP存貯液(於-20℃保存)。
(4)加入75μl 20％SDS溶液。
(5)輕輕顛倒數次，混勻後於65℃水浴保溫15min，其間顛倒2～3次。
(6)冷卻至室溫，加入75μl 5mol/L KAc，混勻後，冰浴30min。
(7)4℃ 12,000r/min條件下離心10min。
(8)轉移600μl上清至另一1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇，混勻後，冰浴10min。
(9)4℃ 12,000r/min條件下離心15min。
(10)將上清液儘可能去除，沉澱溶於500μl TE(pH8.0)緩衝液中。
(11)加入1μl RNase A(10mg/ml)，混勻後，室溫放置10min。
(12)用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次。
(13)20℃ 12,000r/min離心5min，取上相400μl至另一1.5ml離心管中。
(14)加入20μl 3mol/LNaAc(pH5.2)、420μl異丙醇，混勻後，室溫放置5min。
(15)4℃12,000r/min條件下離心5min，去上清液，沉澱用1ml 70％乙醇洗一遍，乾燥後溶於50μlTE(pH8.0)中，存於4℃。
(16)DNA紫外分析取4μl DNA原液加入到400μl TE(pH8.0)緩衝液中，混勻後，用DU-70紫外分光光度計測定260nm、280nm處吸收值，並計算DNA原液濃度。
·DNA提取緩衝液500mmol/L NaCl
50mmol/LTris·Cl(pH 8.0)50mmol/L EDTA1％(v/v)βMet·TE緩衝液10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)·RNase A將RNase A溶於10mmol/L Tris·Cl pH7.5，15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，沸水加熱15min後，使其緩緩冷卻至室溫，分裝成小份存於-20℃。
1.2.1.2 引物設計根據DRM基因的mRNA序列設計，為構建載體的方便，設計了兩個酶切位點XbaI和BamHI。
DRMP15`-ACTTCTAGAATGGGCCTCCTCGACCAGTT-3`XbaIDRMP25`-ACTGGATCCTCACACATCGAAAGGAGAAG-3`BamHI1.2.1.3 PCR擴增在0.2ml的離心管中分別加入以下成分ddH2O 31.5μl10X PCR緩衝液 5.0μl25mM dNTP 5.0μlP1(10mM)1.0μlP2(10mM)1.0μl25mM MgCl25.0μlDNA模板 1.0μl混勻後，在94℃預變性3min後，加入0.5μl Taq DNA聚合酶進行PCR反應。反應參數為94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環後在72℃繼續延伸10min，4℃保存。
1.2.1.4PCR產物的回收PCR擴增產物的回收採用QIAquick Gel Extraction Kit，操作按說明書進行；(1)10μl PCR擴增反應液進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，2V/cm恆電壓條件下電泳30min。紫外燈下切下含目的片段的瓊脂糖塊，並轉移至一1.5ml離心管中；(2)加入3倍體積的QG緩衝液，50℃水浴保溫10min將瓊脂糖凝膠完全溶解；(3)溶解液轉移至QIAquick離心柱；(4)2,000rpm/min，25℃離心1min；(5)去除離心管中的液體，加入0.75ml PE緩衝液至QIAquick離心柱；(6)12,000r/min，25℃離心1min；(7)去除離心管中的液體，25℃12,000rpm/min條件下離心1min；(8)加入30μl EB緩衝液至離心柱的膜上，將離心柱置於一個滅過菌的1.5ml離心管中，12,000r/min，25℃離心1min；(9)取1.0μl離心收集的回收液，進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，估算目的DNA片段濃度。
1.2.1.5目的片段的克隆按寶生物公司提供的方法，將PCR擴增片段與pUC18-T Vertor連接。向0.5ml的無菌離心管中加入
10×T4DNA連接酶Buffer2.0μlpUC18-T Vector DNA 1.0μlPCR回收產物 4.0μlT4DNA連接酶(3U/ul) 1.0μlddH2O 12.0μlTotal20.0μl充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。
1.2.1.6E.coli DH5α感受態細胞的製備(1)從LB瓊脂平板上挑取E.coli DH5α單菌落，接種到10ml不含抗生素的LB液體培養基中，37℃，300rpm振蕩培養過夜。次日按照1％(V/V)的量轉入新鮮LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600在0.3-0.4之間；(2)將50-100ml的培養液轉入兩個預冷的無菌離心管中，於冰上放置30min；(3)4℃、6000rpm離心3min，去上清液；(4)向每個離心管中各加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重懸菌體，冰浴30min；(5)4℃，6000rpm離心3min；去上清液，再將菌體懸浮於2ml冰冷的0.1mol/LiCl溶液中，即為感受態細胞。於4℃冰箱保存，一周內使用。
1.2.1.7連接產物的轉化(1)用無菌吸頭取100μl感受態細胞置1.5ml預冷的無菌離心管中，加入5μl連接反應液，輕輕混勻，立即置冰上30min；(2)將管置42℃恆溫水浴中熱激90s；(3)放回冰上3-5min；(4)加入800μl無附加抗生素的LB液體培養基，混勻，37℃預表達培養45-60min；(5)製備LB附加100μg/ml氨苄青黴素(Ampicillin，Amp)的固體平板；(6)取200μl菌液與4μl IPTG及16μl X-gal混勻；(7)用無菌吸頭蔣混合液移至LB平板上，再用無菌三角頭玻棒蔣菌液均勻塗滿整個平板表面；(8)平板於37℃正向放置至液體被吸收，然後倒置平皿，於37℃培養12-16h，LB培養基酵母抽提物(Yeast Extract) (5g/L)蛋白腖(Tryptone) (10g/L)NaCl (10g/L)加900ml蒸餾水溶解，用NaOH調節pH值至7.0，再定容到1,000ml，分裝後，121℃滅菌20min。
·X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)用二甲基甲醯胺將X-Gal配製成50mg/ml的溶液，黑紙包裹後，存於-20℃。
·IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)用蒸餾水將IPTG配製成200mg/ml的溶液，通過0.22μm的一次性濾器過濾除菌，分裝後，貯存在-20℃備用。
1.2.1.8質粒DNA的小量提取
(1)用無菌牙籤從LB平板上挑取白色單菌落並分別接種到盛有含Amp(100μg/ml)3ml LB培養基(含Amp 100μg/ml)的試管中。
(2)37℃300r/min條件下連續振蕩培養8～10h。
(3)分別轉移1.4ml左右培養物至1.5ml離心管中。
(4)12,000r/min，4℃離心30s至60s。
(5)儘可能將上清倒盡，5,000r/min再離心數秒將殘液收集到管底(沉澱物在轉子中的位置應與前一次離心時一致)，並用取液器將殘液吸盡。
(6)加入200μl溶液I，振蕩渦旋將細胞沉澱物徹底重懸。
(7)加入200μl溶液II，蓋緊管蓋並顛倒3～4次至溶液呈透明粘稠狀。
(8)加入200μl溶液III，蓋緊管蓋，顛倒數次至白色絮狀沉澱呈均勻分散狀。
(9)12,000r/min，4℃離心5min。
(10)轉移400μl上清液，並用1ml無水乙醇沉澱質粒DNA。
(11)12,000r/min，4℃離心5min，去上清液，沉澱物用1ml 70％乙醇洗滌一遍，再稍離心，將殘液吸盡。
(12)乾燥後，用50μl ddH2O將質粒溶解備用。
·Solution I50mmol/L Tris·HCl，pH7.510mmol/L EDTA，100μg/ml RNase A·Solution II0.2mol/L NaOH，1％SDS·Solution III1.322mol/L KAc，pH4.81.2.1.9重組子的酶切鑑定(1)在一0.5ml離心管中，依次混入下列各組分10×BufferM 5.0μl質粒DNA 5.0μlddH2O 38.0μlXbaI 2.5μlBamHI2.5μlTotal50.0μl(2)混勻後，稍離心，37℃溫育30-60min。然後取5.0μl酶切反應液進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，並以PCR標準分子量做對照。5V/cm恆壓條件下電泳30min後，於紫外燈下觀察。
1.2.1.10DNA序列測定與分析挑取的陽性克隆進行DNA序列測定，測序由上海生物工程公司完成。
1.2.2pPOD/DRM植物表達載體的構建1.2.2.1目的片段的酶切及回收用XbaI和BamHI雙酶切將DRM從克隆載體上切下，插入到經同樣酶切的植物表達載體pPOD，構建帶有DRM基因的植物表達載體pPOD/DRM。酶切反應體系及步驟，酶切產物的回收步驟同上。
1.2.2.2連接反應，連接用寶生物公司T4DNA連接酶，體系如下
DRM片段10μlPpod片段 5μlT4DNA連接酶1μl10×Buffer 2.5μlddH2O 6.5μlTotal 25μl充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。
1.2.2.3pPOD/DRM植物表達載體的鑑定將上述連接產物轉化大腸桿菌然後用PCR法篩選轉化子，將此轉化子再用XbaI和BamHI雙酶切進行酶切鑑定，如圖12所示，所切下的片斷與預期結果相符，說明構建正確。
2.3三親交配法轉化農桿菌2.2.3.1三親交配(1)將保存的菌株接種在加有利福平(Rif)25μg/mL鏈黴素(str)25μg/mL的10ml的LB液體培養基中，28℃，200rpm振蕩培養24h；(2)從保存的輔助質粒pRK2013的平板上挑取一個單菌落，接種於10ml不含抗生素LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養8h；(3)從保存的中間載體的平板上挑取一個單菌落，接種於10ml不含抗生素LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養8h.；(4)分別取以上三種細菌培養物50μl於1.5離心管中混勻，取50μl塗布於不含抗生素的LB固體培養基上，28℃，培養2-3天；(5)用接種環將長出的菌落轉接到含有Kanμg/ml，Str25ug/ml和Rif25μg/ml的LB平板上，28℃培養過夜；同時各取1，2，3步驟中的菌液50μl分別塗布於含有三種抗生素的LB平板，作為對照。
2.2.3.2農桿菌質粒的提取為了檢測外源基因是否轉移到農桿菌中，採用PCR檢測。
(1)從含有植物表達載體的農桿菌三抗LB平板上挑取一個單菌落，接入含有Kan 50μg/ml，Str 25μg/ml和Rif 25μg/ml的50ml LB液體培養基的100ml的三角瓶，28℃，200rpm振蕩培養24h；(2)取1.5ml菌液置2ml離心管中，4000rpm離心10min，重複3次收集菌液；(3)用STE溶液洗滌菌體2次；(4)加入0.4ml溶液I，渦混懸浮細菌，室溫放置10min；(5)加入0.8ml新配製的溶液II，顛倒離心管數次，室溫放置10min；(6)加入0.4ml溶液III，輕顛倒離心管數次，使酚和內容物混勻；(7)加入0.2ml 3mol/L乙酸鈉，輕顛倒離心管數次，冰浴中放置5min；(8)1000rpm離心5min，將上清液轉入一個新離心管中，加入2倍體積冰冷的95％乙醇，-20℃放置1h；(9)1000rpm離心5min，棄掉上清液；
(10)向沉澱中加入0.5ml 0.3mol/L醋酸鈉溶解沉澱，加入1.0ml無水乙醇，顛倒離心管數次，-20℃放置1h；(11)1000rpm離心5min，輕輕去掉上清液，離心管口向下，用無菌濾紙吸去管壁液滴；(12)加入1ml70％乙醇漂洗沉澱，快速吹乾；(13)用無菌雙蒸水溶解沉澱，加入2ulRNase，37℃放置7h。
2.2.3.3重組子的PCR檢測PCR反應體系PCR Premix10.0μlDNA質粒 1.0μl引物1 0.5μl引物2 0.5μlddH2O18.0μlTotal 20.0μl充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底。PCR反應參數為94℃預變性5min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環，72℃保溫10min。取10μl PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，並以PCR標準分子量做對照。5V/cm恆壓條件下電泳30min後，於紫外燈下觀察。
2.2.4農桿菌介導菸草的遺傳轉化2.2.4.1菸草無菌苗的培養先用70％的乙醇浸泡K326菸草種子2min，再用15％的次氯酸鈉浸泡20min，期間要不斷的攪動。用無菌水衝洗4-5遍播種於MS培養基上，28℃暗培養3-5待種子開始萌發移至光照培養箱繼續生長。一個月後取葉子為試驗材料。
2.2.4.2農桿菌侵染液的製備從培養平板挑取EHA105/pBI121/ADF4單菌落，接種到LB+50μg/ml Kan+25μg/ml Str+25μg/ml Rif的液體培養基中，28℃、200r/min振蕩培養至對數期(OD600值約0.5)，3000rpm離心10min後，取沉澱用等體積的MS培養基懸浮。
2.2.4.3葉盤轉化法(1)將剪取0.5cm葉片浸入菌液5min後，用無菌濾紙吸乾後轉移到MS+2.0mg/L BA培養基上。
(2)侵染過的葉盤接種在分化培養基MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA，在28℃黑暗條件培養3d。
(3)經過共培養的葉盤轉移到加有選擇壓培養基MS+0.05mg/L IAA+2.0mg/L BA+600mg/LCef+100mg/LKan，大約15-20d繼代一次，繼代兩次誘導出不定芽。
(4)待不定芽長到2-3cm長時，用解剖刀切下，轉到伸長培養基上MS+0.5mg/L BA+600mg/Lcef+100mg/LKan，兩周更換一次新鮮的伸長培養基，篩選培養2-3代，淘汰白化苗及畸形苗。
(5)選著形態正常、生長旺盛的抗性苗，轉入生根培養基MS+0.2mg/L IAA+600mg/L Cef+100mg/L Kan上培養。
(6)待根系形成後取出小苗，在自來水洗淨根上的瓊脂，移入沙盆室溫中培養。MS培養基
大量元素KNO3283mg/l，(NH4)NO3463mg/l，KH2PO4400mg/l，MgSO4.7H2O 185mg/l，CaCl2H2O166mg/l微量元素MnSO4.H2O 76mg/l，H3BO4300mg/l，ZnSO4.7H2O 200mg/l，NaMoO4.7H2O 2.5mg/l，CuSO4.5H2O 2.5mg/l，CoCl2.6H2O 2.5mg/l，KI 7.5mg/l有機物鹽酸硫胺素10mg/l，鹽酸吡哆醛(B6)1mg/l，煙酸1mg/l，肌醇100mg/l鐵鹽FeSO4·7H2O 2.78mg/l，Na2-EDTA 37.25mg/l瓊脂粉6.4g/L蔗糖30g/L圖2-圖8是其他幾個片段PCR擴增及構建過程的圖片。
SPS基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草(植物材料擬南芥)(1)引物SPS1ACTTCTAGA GAAACGAGCACACAACTCACSPS2ACTGGATCC CGTCGAAACACATCACAGAG(2)PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA 1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50，30sec；72℃，120sec)→30個循環(94℃，30sec；65℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min→4℃.
PSA基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草(植物材料菸草)(1)引物PSA1AGCAATCTAGAAAATGAGTAGAGGCPSA2ATAGGATCCTGATAGCGAACATACATTTC(2)模板因為從美國國家生物技術信息中心(NCBI)資料庫中檢測到的PSA基因是其mRNA序列，引物設計也是根據RNA序列設計的，但是該基因內部有一段很長的內含子序列，所以我們先提取菸草的RNA，然後反轉錄得到其cDNA序列，用cDNA序列作為模板得到了PSA基因。以下是對這個過程的詳細說明PSA基因-cDNA轉基因植株的RNA提取，採用異硫氰酸胍法(1)向50ml離心管中加入10ml異硫氰酸胍溶液，放置冰上於預冷；(2)取1g新鮮幼嫩葉子放在研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末；(3)將粉末全部轉入冰上預冷的加入10ml異硫氰酸胍溶液離心管，振蕩離心管混合均勻，將離心管放置冰上；(4)加入2mol/LNaAc 1ml、水飽和酚10ml和氯仿/異戊醇(24∶1)2ml，每加一種試劑，輕輕搖晃離心管混合均勻，最後將離心管蓋緊，顛倒幾次混合均勻，冰浴15min；(5)4℃，12000rpm 30min，將上層液轉移到一個乾淨的離心管中，用水飽和酚反覆抽提三次；(6)將上層水相轉移到一個乾淨的離心管中，向管中加入等體積的異丙醇，混勻，放置-20冰凍1h；(7)4℃，12000rpm 30min，小心去除上清液，沉澱溶於3M異硫氰酸胍溶液，在加入等體積的異丙醇，混勻，放置-20冰凍1h；(8)沉澱用70％乙醇洗滌一遍，在超淨臺吹乾，溶於適量體積甲醯胺，-20℃低溫保存；(11)行含有甲醛變性電泳膠，檢測RNA的完整性，調整轉基因植株和對照的RNA濃度一致；異硫氰酸胍溶液4mol/L異硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.1mol/L巰基乙醇；2mol/LNaCl(pH4.0)，用經DEPC處理過的水配製，高壓滅菌。水飽和酚(pH3.5)反轉錄反應按大連寶生物工程有限公司反轉錄試劑盒說明書進行。
(1)在-0.5ml離心管加入1μg的RNA(溶於11μl的DEPC處理的水中)，再加入1μl的oligdT15；(2)70℃加熱10min後，冰上冷卻1min以上；(3)在離心管中依此加入以下成分10×PCR緩衝液2μl25mM MgCl22μl0.1MDTT 2μl10mM dNTP1μl(4)42℃加熱5min後，加入1μlAMV反轉錄酶，42℃反應50min；(5)70℃加熱15min，冰上冷卻；(6)反應混合物於-20℃保存；反應結束後得到的cDNA可用於後面的PCR擴增。
(3)PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板CDNA1μL，P1 2μL，P2 2μL，反應總體積為50)μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，60sec)→30個循環(94℃，30sec；60℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min→4℃。
POD基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草(植物材料菸草)(1)引物POD15′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′POD25′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′(2)PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min)→30個循環(94℃，30sec；68℃，30min；72℃，2min)→72℃，10min→4℃。
權利要求
1.一種打頂後無腋芽菸草的培育方法，其特徵在於，所述方法包括抑制側芽生長基因的克隆、傷誘導啟動子POD的克隆和安全標記基因pmi的克隆；將三者置於同一表達載體下，利用農桿菌介導法將該載體導入菸草，經過標記篩選、轉化，得到初篩菸草植株，再經分子檢測、表形檢測，得到轉基因無腋芽菸草植株。
2.根據權利要求1所述的培育方法，其特徵在於，所述的抑制側芽生長基因的克隆包括豌豆DRM基因的克隆、擬南芥SPS基因的克隆和菸草PSA基因的克隆。
3.根據權利要求1所述的培育方法，其特徵在於，所述傷誘導啟動子POD根據tposN1序列，利用Genomerwalker技術克隆該基因的啟動子序列。
4.根據權利要求3所述的培育方法，其特徵在於，所述的菸草傷誘導型過氧化物酶基因tpoxN1啟動子的克隆過程如下材料與方法植物材料菸草Nicotiana tabacum cv.K326種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；幼葉採集後用於基因組DNA的提取；試劑Universal GenomewalkerTMKit、Advantage Genomic Polymerase Mix購自CLONTECH公司；IPTG、X-Gal、dNTPs、pGEM-T easy Vector購於Promega公司；其它生化試劑和常規試劑均為超純和分析純；方法菸草基因組DNA的提取參照傅榮昭的方法進行；構建Genome Walker文庫及Genome Walker DNA Walking按Universal GenomewalkerTMKit使用說明書進行；引物的設計根據GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列設計引物GSP15′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′GSP25′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′從Genome Walker文庫中進行PCR-based DNA Walking，按Universal GenomewalkerTMKit使用說明書進行；第一輪PCR在5個0.2ml離心管中分別加入5種DNA文庫，然後依次加入以下成分10XPCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP1(10uM)、GSP1(10uM)、Advantage GenomicPolymerase Mix(50x)；反應總體積50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)進行PCR反應，反應條件為7個循環(94℃，2sec；70℃，3min)→32個循環(94℃，2sec；65℃，3min)→65℃，4min；第二輪PCR在5個0.2ml離心管中分別加入稀釋的第一輪PCR產物，然後依次加入以下成分10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP2(10uM)、GSP2(10uM)、AdvantageGenomic Polymerase Mix(50x)；反應總體積50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)進行PCR反應，反應條件為7個循環(94℃，2sec；70℃，3min)→32個循環(94℃，2sec；65℃，3min)→65℃，4min；AP1、AP2由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTMKit提供，序列為AP15′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；AP25′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′。PCR產物的回收、連接及重組質粒的鑑定按常規方法進行；DNA的序列測定由上海生物工程公司測定；結果與分析Genomewalker文庫的構建與Genome Walker DNA Walking利用4種產生平末端的限制性內切酶DraI、EcoR V、PvuII、SspI分別對菸草基因組DNA進行酶切，並對酶切後的DNA進行純化；然後把純化的DNA與接頭連接，構建成4種Genomewalker文庫DraI文庫、EcoRV文庫、PvuII文庫、SspI文庫；根據GenBank-acession number AB027753的tpoxN1的mRNA序列設計了兩個引物，利用GenomeWalker的方法，對菸草tpoxN1基因的5』調控區進行了克隆。通過第一輪PCR擴增後，從4種Genomewalker文庫中均能擴增出產物，但都呈彌散狀，經過第二輪PCR擴增後，由DraI文庫、EcoR V文庫、PvuII文庫擴增出清晰的條帶；對獲得的最大的片段DraI文庫進行了克隆；PCR產物經瓊脂糖電泳後回收，插入pGEM-T Easy載體，重組質粒經EcoR I酶切獲得約2000bp的片段，對重組質粒進行測序結果表明，該片段長為2070bp；菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列分析用PCGENE對序列分析進行表明，tpoxN1基因的轉錄起始位點(tspA)的保守序列5』YTCAATCA與其它植物基因非常一致，轉錄從tsp下遊79bp處開始；在鄰近5』區域，發現一些真核生物順式調控元件；在-33bp處存在TATAbox序列TATAAATATGT；在-71bp處具有TCCAAT序列，與多個高等真核生物的啟動子的『CAAT』相似；在-840處存在GC-box；在-1005處存在CCAAT-box；在-214，-749處也可以發現TCA-like序列，TCA-like序列目前在30多種脅迫誘導基因的啟動子中可以發現，該序列在酵母的DDR2、ubi4和CTT1等基因中與脅迫應答元件；將菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列與一些傷誘導啟動子比較，未找到相同的傷誘導相關調控元件；利用已克隆到的菸草傷誘導過氧化物酶基因的5』調控序列與GUS構建了一系列的融合基因，通過轉基因的方法來研究其調控方式。
5.根據權利要求2所述的培育方法，其特徵在於，所述的DRM基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草過程為材料與試劑植物材料豌豆(Pisum sativum L.cv.Alaska)由中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；菌種及質粒大腸桿菌E.coli DH5α、農桿菌EHA105菌株、輔助質粒pRK2013均由熱帶作物生物技術國家重點實驗室保存；限制性內切酶、pUCM18-T載體、T4DNA連接酶均是寶生物公司產品，QIAquick Gel Extraction Kit為QiaGene公司產品L；IPTG、X-gal購自華美生物工程公司，其它生化試劑分別購自曙光、華美、經科、Biolab等國內外公司；方法與步驟DRM基因的克隆植物總DNA的提取參考傅榮昭的方法；(1)稱取0.1g左右葉片，於研缽中在液氮下研至粉末；(2)將粉末轉移至一1.5ml離心管中，加入400μl DNA提取緩衝液；(3)解凍後置於冰上，加入200μl冰預冷的20％PVP存貯液，於-20℃保存；(4)加入75μl 20％SDS溶液；(5)輕輕顛倒數次，混勻後於65℃水浴保溫15min，其間顛倒2～3次；(6)冷卻至室溫，加入75μl 5mol/L KAc，混勻後，冰浴30min；(7)4℃12,000r/min條件下離心10min；(8)轉移600μl上清至另一1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇，混勻後，冰浴10min；(9)4℃12,000r/min條件下離心15min；(10)將上清液儘可能去除，沉澱溶於500μl TE、pH8.0緩衝液中；(11)加入1μl RNase A 10mg/ml，混勻後，室溫放置10min；(12)用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提一次；(13)20℃12,000r/min離心5min，取上相400μl至另一1.5ml離心管中；(14)加入20μl 3mol/LNaAc、pH5.2、420μl異丙醇，混勻後，室溫放置5min；(15)4℃12,000r/min條件下離心5min，去上清液，沉澱用1ml 70％乙醇洗一遍，乾燥後溶於50μl TE、pH8.0中，存於4℃；(16)DNA紫外分析取4μl DNA原液加入到400μl TE、pH8.0緩衝液中，混勻後，用DU-70紫外分光光度計測定260nm、280nm處吸收值，並計算DNA原液濃度；DNA提取緩衝液500mmol/L NaCl、50mmol/L Tris·Cl(pH 8.0)、50mmol/L EDTA、1％(v/v)βMetTE緩衝液10mmol/LTris·Cl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)RNase A將RNase A溶於10mmol/L Tris·Cl pH7.5，15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，沸水加熱15min後，使其緩緩冷卻至室溫，分裝成小份存於-20℃；引物設計根據DRM基因的mRNA序列設計，為構建載體的方便，設計了兩個酶切位點XbaI和BamHIDRMP15`-ACTTCTAGAATGGGCCTCCTCGACCAGTT-3`XbaIDRMP25`-ACTGGATCCTCACACATCGAAAGGAGAAG-3`BamHIPCR擴增在0.2ml的離心管中分別加入以下成分ddH2O 31.5μl10XPCR緩衝液 5.0μl25mM dNTP5.0μlP1(10mM) 1.0μlP2(10mM) 1.0μl25mM MgCl25.0μlDNA模板 1.0μl混勻後，在94℃預變性3min後，加入0.5μl Taq DNA聚合酶進行PCR反應；反應參數為94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環後在72℃繼續延伸10min，4℃保存；PCR產物的回收PCR擴增產物的回收採用QIAquick Gel Extraction Kit，操作按說明書進行；(1)10μl PCR擴增反應液進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，2V/cm恆電壓條件下電泳30min。紫外燈下切下含目的片段的瓊脂糖塊，並轉移至一1.5ml離心管中；(2)加入3倍體積的QG緩衝液，50℃水浴保溫10min將瓊脂糖凝膠完全溶解；(3)溶解液轉移至QIAquick離心柱；(4)2,000rpm/min，25℃離心1min；(5)去除離心管中的液體，加入0.75ml PE緩衝液至QIAquick離心柱；(6)12,000r/min，25℃離心1min；(7)去除離心管中的液體，25℃12,000rpm/min條件下離心1min；(8)加入30μl EB緩衝液至離心柱的膜上，將離心柱置於一個滅過菌的1.5ml離心管中，12,000r/min，25℃離心1min；(9)取1.0μl離心收集的回收液，進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，估算目的DNA片段濃度；目的片段的克隆按寶生物公司提供的方法，將PCR擴增片段與pUC18-T Vertor連接；向0.5ml的無菌離心管中加入10×T4DNA連接酶Buffer 2.0μlpUC18-T Vector DNA 1.0μlPCR回收產物4.0μlT4DNA連接酶(3U/ul) 1.0μlddH2O 12.0μl總計20.0μl，充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h；E.coli DH5α感受態細胞的製備(1)從LB瓊脂平板上挑取E.coli DH5α單菌落，接種到10ml不含抗生素的LB液體培養基中，37℃，300rpm振蕩培養過夜。次日按照1％(V/V)的量轉入新鮮LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600在0.3-0.4之間；(2)將50-100ml的培養液轉入兩個預冷的無菌離心管中，於冰上放置30min；(3)4℃、6000rpm離心3min，去上清液；(4)向每個離心管中各加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重懸菌體，冰浴30min；(5)4℃，6000rpm離心3min；去上清液，再將菌體懸浮於2ml冰冷的0.1mol/LiCl溶液中，即為感受態細胞；於4℃冰箱保存，一周內使用；連接產物的轉化(1)用無菌吸頭取100μl感受態細胞置1.5ml預冷的無菌離心管中，加入5μl連接反應液，輕輕混勻，立即置冰上30min；(2)將管置42℃恆溫水浴中熱激90s；(3)放回冰上3-5min；(4)加入800μl無附加抗生素的LB液體培養基，混勻，37℃預表達培養45-60min；(5)製備LB附加100μg/ml氨苄青黴素Ampicillin，Amp的固體平板；(6)取200μl菌液與4μl IPTG及16μl X-gal混勻；(7)用無菌吸頭蔣混合液移至LB平板上，再用無菌三角頭玻棒蔣菌液均勻塗滿整個平板表面；(8)平板於37℃正向放置至液體被吸收，然後倒置平皿，於37℃培養12-16h，LB培養基酵母抽提物Yeast Extract 5g/L蛋白腖Tryptone 10g/LNaCl 10g/L加900ml蒸餾水溶解，用NaOH調節pH值至7.0，再定容到1,000ml，分裝後，121℃滅菌20min；X-Gal，即5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷用二甲基甲醯胺將X-Gal配製成50mg/ml的溶液，黑紙包裹後，存於-20℃；IPTG，即異丙基-β-D-硫代半乳糖苷用蒸餾水將IPTG配製成200mg/ml的溶液，通過0.22μm的一次性濾器過濾除菌，分裝後，貯存在-20℃備用；質粒DNA的小量提取(1)用無菌牙籤從LB平板上挑取白色單菌落並分別接種到盛有含Amp(100μg/ml)3ml LB培養基，含Amp 100μg/ml的試管中；(2)37℃300r/min條件下連續振蕩培養8～10h；(3)分別轉移1.4ml左右培養物至1.5ml離心管中；(4)12,000r/min，4℃離心30s至60s；(5)儘可能將上清倒盡，5,000r/min再離心數秒將殘液收集到管底，沉澱物在轉子中的位置應與前一次離心時一致，並用取液器將殘液吸盡；(6)加入200μl溶液I，振蕩渦旋將細胞沉澱物徹底重懸；(7)加入200μl溶液II，蓋緊管蓋並顛倒3～4次至溶液呈透明粘稠狀；(8)加入200μl溶液III，蓋緊管蓋，顛倒數次至白色絮狀沉澱呈均勻分散狀；(9)12,000r/min，4℃離心5min；(10)轉移400μl上清液，並用1ml無水乙醇沉澱質粒DNA；(11)12,000r/min，4℃離心5min，去上清液，沉澱物用1ml 70％乙醇洗滌一遍，再稍離心，將殘液吸盡；(12)乾燥後，用50μl ddH2O將質粒溶解備用；Solution I50mmol/L Tris·HCl，pH7.5 10mmol/L EDTA，100μg/ml RNase ASolution II0.2mol/L NaOH，1％SDSSolution III1.32mol/L KAc，pH4.8重組子的酶切鑑定(1)在一0.5ml離心管中，依次混入下列各組分10×Buffer M 5.0μl質粒DNA 5.0μlddH2O 38.0μlXbaI 2.5μlBamHI 2.5μl總計50.0μl；(2)混勻後，稍離心，37℃溫育30-60min，然後取5.0μl酶切反應液進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，並以PCR標準分子量做對照，5V/cm恆壓條件下電泳30min後，於紫外燈下觀察；DNA序列測定與分析挑取的陽性克隆進行DNA序列測定，測序由上海生物工程公司完成；pPOD/DRM植物表達載體的構建目的片段的酶切及回收用XbaI和BamHI雙酶切將DRM從克隆載體上切下，插入到經同樣酶切的植物表達載體pPOD，構建帶有DRM基因的植物表達載體pPOD/DRM；酶切反應體系及步驟，酶切產物的回收步驟同上；連接反應，連接用寶生物公司T4DNA連接酶，體系如下DRM片段 10μlPpod片段 5μlT4DNA連接酶 1μl10×Buffer2.5μlddH2O6.5μl總計25μl，充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h；pPOD/DRM植物表達載體的鑑定將上述連接產物轉化大腸桿菌然後用PCR法篩選轉化子，將此轉化子再用XbaI和BamHI雙酶切進行酶切鑑定，如圖12所示，所切下的片斷與預期結果相符，說明構建正確；三親交配法轉化農桿菌三親交配(1)將保存的菌株接種在加有利福平(Rif)25μg/mL鏈黴素(str)25μg/mL的10ml的LB液體培養基中，28℃，200rpm振蕩培養24h；(2)從保存的輔助質粒pRK2013的平板上挑取一個單菌落，接種於10ml不含抗生素LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養8h；(3)從保存的中間載體的平板上挑取一個單菌落，接種於10ml不含抗生素LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養8h.；(4)分別取以上三種細菌培養物50μl於1.5離心管中混勻，取50μl塗布於不含抗生素的LB固體培養基上，28℃，培養2-3天；(5)用接種環將長出的菌落轉接到含有Kan μg/ml，Str25ug/ml和Rif25μg/ml的LB平板上，28℃培養過夜；同時各取1，2，3步驟中的菌液50μl分別塗布於含有三種抗生素的LB平板，作為對照；農桿菌質粒的提取為了檢測外源基因是否轉移到農桿菌中，採用PCR檢測；(1)從含有植物表達載體的農桿菌三抗LB平板上挑取一個單菌落，接入含有Kan 50μg/ml，Str 25μg/ml和Rif 25μg/ml的50ml LB液體培養基的100ml的三角瓶，28℃，200rpm振蕩培養24h；(2)取1.5ml菌液置2ml離心管中，4000rpm離心10min，重複3次收集菌液；(3)用STE溶液洗滌菌體2次；(4)加入0.4ml溶液I，渦混懸浮細菌，室溫放置10min；(5)加入0.8ml新配製的溶液II，顛倒離心管數次，室溫放置10min；(6)加入0.4ml溶液III，輕顛倒離心管數次，使酚和內容物混勻；(7)加入0.2ml 3mol/L乙酸鈉，輕顛倒離心管數次，冰浴中放置5min；(8)1000rpm離心5min，將上清液轉入一個新離心管中，加入2倍體積冰冷的95％乙醇，-20℃放置1h；(9)1000rpm離心5min，棄掉上清液；(10)向沉澱中加入0.5ml 0.3mol/L醋酸鈉溶解沉澱，加入1.0ml無水乙醇，顛倒離心管數次，-20℃放置1h；(11)1000rpm離心5min，輕輕去掉上清液，離心管口向下，用無菌濾紙吸去管壁液滴；(12)加入1ml70％乙醇漂洗沉澱，快速吹乾；(13)用無菌雙蒸水溶解沉澱，加入2ulRNase，37℃放置7h；重組子的PCR檢測PCR反應體系PCR Premix 10.0μlDNA質粒 1.0μl引物1 0.5μl引物2 0.5μlddH2O 18.0μl總計20.0μl，充分混勻後離心數秒，將管壁液滴收到管底。PCR反應參數為94℃預變性5min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環，72℃保溫10min。取10μlPCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，並以PCR標準分子量做對照。5V/cm恆壓條件下電泳30min後，於紫外燈下觀察；農桿菌介導菸草的遺傳轉化菸草無菌苗的培養先用70％的乙醇浸泡K326菸草種子2min，再用15％的次氯酸鈉浸泡20min，期間要不斷的攪動。用無菌水衝洗4-5遍播種於MS培養基上，28℃暗培養3-5待種子開始萌發移至光照培養箱繼續生長；一個月後取葉子為試驗材料；農桿菌侵染液的製備從培養平板挑取EHA105/pBI121/ADF4單菌落，接種到LB+50μg/mlKan+25μg/ml Str+25μg/ml Rif的液體培養基中，28℃、200r/min振蕩培養至對數期(OD600值約0.5)，3000rpm離心10min後，取沉澱用等體積的MS培養基懸浮；葉盤轉化法(1)將剪取0.5cm葉片浸入菌液5min後，用無菌濾紙吸乾後轉移到MS+2.0mg/L BA培養基上；(2)侵染過的葉盤接種在分化培養基MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA，在28℃黑暗條件培養3d；(3)經過共培養的葉盤轉移到加有選擇壓培養基MS+0.05mg/L IAA+2.0mg/L BA+600mg/LCef+100mg/L Kan，大約15-20d繼代一次，繼代兩次誘導出不定芽；(4)待不定芽長到2-3cm長時，用解剖刀切下，轉到伸長培養基上MS+0.5mg/L BA+600mg/Lcef+100mg/LKan，兩周更換一次新鮮的伸長培養基，篩選培養2-3代，淘汰白化苗及畸形苗；(5)選著形態正常、生長旺盛的抗性苗，轉入生根培養基MS+0.2mg/L IAA+600mg/L Cef+100mg/L Kan上培養；(6)待根系形成後取出小苗，在自來水洗淨根上的瓊脂，移入沙盆室溫中培養；MS培養基大量元素KNO3283mg/l，(NH4)NO3463mg/l，KH2PO4400mg/l，MgSO4.7H2O 185mg/l，CaCl2H2O166mg/l微量元素MnSO4.H2O 76mg/l，H3BO4300mg/l，ZnSO4.7H2O 200mg/l，NaMoO4.7H2O 2.5mg/l，CuSO4.5H2O 2.5mg/l，CoCl2.6H2O 2.5mg/l，KI 7.5mg/l有機物鹽酸硫胺素10mg/l，鹽酸吡哆醛(B6)1mg/l，煙酸1mg/l，肌醇100mg/l鐵鹽FeSO4·7H2O 2.78mg/l，Na2-EDTA 37.25mg/l瓊脂粉6.4g/L蔗糖30g/L。
6.根據權利要求2所述的培育方法，其特徵在於，所述SPS基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草過程為植物材料擬南芥引物SPS1ACTTCTAGA GAAACGA GCACA CAACT CACSPS2ACTGGATCC CGTCGA AACAC ATCAC AGAGPCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL；反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，120sec)→30個循環(94℃，30sec；65℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min→4℃。
7.根據權利要求1所述的培育方法，其特徵在於，所述PSA基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草過程為植物材料菸草引物PSA1AGCAATCTAGAAAATGAGTAGAGGCPSA2ATAGGATCCTGATAGCGAACATACATTTC模板因為從美國國家生物技術信息中心(NCBI)資料庫中檢測到的PSA基因是其mRNA序列，引物設計也是根據RNA序列設計的，但是該基因內部有一段很長的內含子序列，所以我們先提取菸草的RNA，然後反轉錄得到其cDNA序列，用cDNA序列作為模板得到了PSA基因。以下是對這個過程的詳細說明PSA基因-cDNA轉基因植株的RNA提取，採用異硫氰酸胍法(1)向50ml離心管中加入10ml異硫氰酸胍溶液，放置冰上於預冷；(2)取1g新鮮幼嫩葉子放在研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末；(3)將粉末全部轉入冰上預冷的加入10ml異硫氰酸胍溶液離心管，振蕩離心管混合均勻，將離心管放置冰上；(4)加入2mol/LNaAc 1ml、水飽和酚10ml和氯仿/異戊醇(24∶1)2ml，每加一種試劑，輕輕搖晃離心管混合均勻，最後將離心管蓋緊，顛倒幾次混合均勻，冰浴15min；(5)4℃，12000rpm 30min，將上層液轉移到一個乾淨的離心管中，用水飽和酚反覆抽提三次；(6)將上層水相轉移到一個乾淨的離心管中，向管中加入等體積的異丙醇，混勻，放置一20冰凍1h；(7)4℃，12000rpm 30min，小心去除上清液，沉澱溶於3M異硫氰酸胍溶液，在加入等體積的異丙醇，混勻，放置-20冰凍1h；(8)沉澱用70％乙醇洗滌一遍，在超淨臺吹乾，溶於適量體積甲醯胺，-20℃低溫保存；(9)行含有甲醛變性電泳膠，檢測RNA的完整性，調整轉基因植株和對照的RNA濃度一致；異硫氰酸胍溶液4mol/L異硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.1mol/L巰基乙醇；2mol/L NaCl(pH4.0)，用經DEPC處理過的水配製，高壓滅菌；水飽和酚pH3.5；反轉錄反應按大連寶生物工程有限公司反轉錄試劑盒說明書進行。(1)在一0.5ml離心管加入1μg的RNA，溶於11μl的DEPC處理的水中，再加入1μl的oligdT15；(2)70℃加熱10min後，冰上冷卻1min以上；(3)在離心管中依此加入以下成分10×PCR緩衝液2μl25mM MgCl22μl0.1MDTT 2μl10mM dNTP1μl(4)42℃加熱5min後，加入1μlAMV反轉錄酶，42℃反應50min；(5)70℃加熱15min，冰上冷卻；(6)反應混合物於-20℃保存；反應結束後得到的cDNA可用於後面的PCR擴增；PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板CDNA1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL；反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，60sec)→30個循環(94℃，30sec；60℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min→4℃。
8.根據權利要求1所述的培育方法，其特徵在於，所述POD基因的克隆、植物表達載體構建及轉化菸草過程為植物材料菸草引物POD15′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′POD25′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′PCR反應體系及條件在0.2mL離心管中分別加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA 1μL，P12μL，P22μL，反應總體積為50μL。反應條件為5個循環(94℃，5min；94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min)→30個循環(94℃，30sec；68℃，30min；72℃，2min)→72℃，10min→4℃。
全文摘要
本發明公開了一種打頂後無腋芽的菸草培育方法。該方法採用分子生物學技術鑑定「打頂」後促進腋芽萌發和生長的關鍵基因，然後用傷誘導啟動子驅動反義RNA在「打頂」後立即表達，從而抑制促進腋芽萌發和生長的關鍵基因的表達，使腋芽不能萌發和生長。本發明所得到的菸草，在打頂後腋芽得到很好的抑制，避免了煙株體內營養物質的無謂消耗，促使營養物質集中供應葉片生長，葉面積和單葉重量平均增加10％以上。
文檔編號C12N15/82GK1824774SQ200510119900
公開日2006年8月30日 申請日期2005年11月12日 優先權日2004年11月12日
發明者賈朝鈞, 陳守才 申請人:賈朝鈞