人體C3b/C4b受體(CR1)的製作方法

2023-04-30 12:33:51

專利名稱：人體C3b/C4b受體(CR1)的製作方法
1.簡介本發明涉及C3b/C4b受體(CRl)基因及其編碼的蛋白質。本發明還涉及CRl的核酸順序及其含有70個核苷酸的片段和它們編碼的含有24個胺基酸的肽或蛋白質。本發明還提供了CRl蛋白質及其片段的表達。CRl核酸和蛋白質已被用於診斷或治療涉及補體活性的疾病和各種炎症以及免疫性疾病。
2.發明背景2.1補體系統補體系統是一組蛋白質，它們構成了人體正常血清中球蛋白的10%(Hood，L.E.等人，1984，《Immunology》，第2版，The Benjamin/Cummings出版公司，Menlo Park，加州，第339頁)。補體(C)在介導免疫和過敏反應中起著重要的作用(Rapp，H.J.和Borsos，T.1970，Molecular Basis of Complement Action，Appleton-Century-Crofts(Meredith)，New York)。補體組分的激活導致了包括介導與補體依賴性疾病有關的炎症的趨化肽在內的一組因子產生。補體級聯放大的連續活化可通過包含抗原-抗體複合體的經典型途徑產生，或可通過包括識別某種細胞壁多糖的旁路途徑產生。通過的活的補體蛋白質而介導的活性包括靶細胞的裂解，趨化性，調理作用，血管和其它平滑肌細胞的刺激，和諸如乳房細胞失粒的功能性紊亂，增加的小血管滲透性，白細胞的定向遷移和B淋巴細胞和巨噬細胞的活化(Eisen，H.N，1974，Immunology，Harper Row出版公司，Hagerstown，Maryland，第512頁)。
在蛋白質水解級聯放大步驟中，生物活性肽片段，過敏毒素C3a，C4a和C5a(可參考WHO Scientific Group，1977，WHO Tech.Rep.Ser 6065，此處列為參考)從第3(C3)，第4(C4)和第5(C5)天然補體組分(Hugli，T.E.1981，CRC Crit.Rev.Immunol.1321;Bult，H和Herman，A.G，1983，Agents Actions 13405)中釋放出來。
2.2 C3b/C4b補體受體(CRl)人體C3b/C4b受體(稱為CRl)存在於紅細胞，單核細胞/巨噬細胞，粒細胞，B細胞，部分T細胞，脾卵泡樹突狀細胞和腎小球足狀突細胞中(Fearon，D.T.1980，J.Exp.Med.15220;Wilson，J.G.等人，1983，J.Immunol.131684;Reynes.M.等人，1985，J.Immunol.1352687;Gelfand，M.C.等人，1976，N，Engl.J.Med.29510;Kazatchkine，M.D.等人，1982，Clin.Immunol.Immunopathol.27170)。CRl特異性地與C3b，C4b和i C3b結合。在血漿中已發現了一種具有配體結合活性且與膜相關CRl具有相同分子量的可溶形式的受體(Yoon，SH.和Fearon，D.T.1985，J.Immunol，1343332)。CRl與已與免疫複合體和其它補體激活因子共價連接的C3b和C4b結合，它們相互作用的結果取決於載有該受體的細胞類型(Fearon，D.T.和Wong.W.W.1983，Ann，Rev，Immunol 1243)，紅細胞CRl與免疫複合體結合以轉移至肝中(Cornacoff J.B.等人，1983，J.Clin，Invest 71236;Medof M.E.等人，1982，J.Exp，Med.1561739)。而嗜中性粒細胞和單核細胞的CRl則通過外膜紋孔的吸附性胞吞作用(Fearon D.T.等人，1981，J.Exp.Med.1531615;Abrahamson D.R.和Fearon D.T.1983，Lab，Invest.48162)或通過用佛波醇酯，趨化肽或存在於細胞外基質中的蛋白質，如纖維結合素(fibronectin)和海帶氨酸(Laminin)激活受體後的吞噬作用(Newman.S.L.等人，1980，J，Immunol，125，2236;Wright S.D和Silverstein S.C 1982，J.Exp.Med.156149;Wright S.D.等人，1983，J.Exp Med.1581338)使連接的複合物內在化。CRl的磷酸化可能對獲得吞噬活性起作用(Changelian，P.S.和Fearon.D.T.1986，J.Exp.Med.163101)。儘管用抗CRl抗體處理這些細胞增強了它們對於亞最適劑量的美州商陸植物的有絲分裂素應答，CRl對於B淋巴細胞的作用則未完全確知(Daha，M.R.等人，1983，Immunobiol.164227(Abstr.))。卵泡樹突狀細胞上的CRl有促進抗原遞呈的作用(Klaus，G.G.B.等人，1980，Immunol，Rev，533)。
CRl還可以抑制C3/C5轉化酶的經典和旁路的途徑，以及可作為用因子I裂解C3b和C4b的輔助因子，這表明除了作為受體外，CRl還具有補體調節作用(Fearon，D.T.1979，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867;Iida，K.和Nussenzweig，V，1981，J.Exp，Med.1531138)。在補體激活的旁路途徑中，雙分子複合體C3b，Bb是C3激活酶(轉化酶)。CRl(和H因子，在較高濃度下)可以結合到C3b上並可促進C3b，Bb的解離。此外，C3b，CRl(和C3b，H)的形成使得C3b對於由因子I引起的不可逆的蛋白水解失活作用敏感，而導致了形成失活的C3b(iC3b)。在補體激活的經典途徑中，複合體C4b，2a是C3轉化酶。CRl(和C4結合蛋白質，C4bp，在較高濃度下)可以結合到C4b上，也可促使C4b，2a的解離。這種結合使得C4b對於由因子I引起的不可逆蛋白水解失活作用敏感而分裂為C4c和C4d(失活的補體蛋白質)。
CRl是一種由單個多肽鏈組成的糖蛋白。業已發現了四種異型CRl，其分子量為增加約40，000-50，000道爾頓而各異。兩種最常見的形式，F和S異型體，又稱之為A和B異型體，它們的分子量分別為250，000和290，000道爾頓(Dykman，T.R.等人，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.801698;Wong，W.W等人，1983，J.Clin.Invest，72685)，兩種較少見形式的分子量則為210，000和＞290，000道爾頓(Dykman，T.R.等人，1984，J.Exp.Med.159691;Dykman.T.R.等人，1985，J.Immunol.1341987)。這些差異很清楚地表明了變異發生於CRl的多肽鏈，而不是在糖基化狀態時，因為通過用胞內糖苷酶F處理純化的受體蛋白質不能消除這些差異(Wong.W.W.等人，1983，J.Clin，Invest，72685)，在衣黴素存在下，當受體的異型體被生物合成時，可觀察到這種差異(Lublin，D.M.等人，1986.J/Biol.Chem.2615736)。四種CRl異型體均具有C3b結合活性(Dykman T.R.等人，1983，Proc，Natl，Acad.Sci，USA，801698;Wong W.W.等人，1983，J.Clin.Invest.72625;Dykman T.R等人，1984，J.Exp.Med.159691;Dykman T.R等人，1985，J.Immunol，1341787)。
在很嚴格的條件下，CRl cDNA的兩種不重迭的限制性片段顯示出交叉雜交(Wong W.W.等人，1985.Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.827711)。兩種cDNA探針也與基因組DNA的多個限制性片段雜交，其中大部分片段與兩種探針是共同的(id)。CRl中存在重複編碼順序可通過順序比較而證實(Klickstcin，L.B等人，1985，Complement 244(Abstr))。此外，通過將設有編碼順序的基因組探針與幾個基因組限制性片段交叉雜交證實CRl基因具有重複的插入順序(Wong W.W.等人，1986.J.Exp.Med.1641531)。此外，與來自具有F異型體的個體的DNA相比較，來自具有較大的S異型體的個體的DNA有一個與這個基因組探針雜交的附加的限制性片段，表明基因組順序的重複與較高分子量的CRl等位基因(id)有關。
業已表明，CRl與補體受體2型(CR2)具有同源性(Weis J.J.等人，1986，Proc，Natl，Acad.Sci，U.S.A.835639-5643)。
2.3 人體疾病中CRl的異常來自幾個地區的研究者報導了患有全身性紅斑狼瘡(SLE)的病人的紅細胞中CRl的表達的減少，包括日本(Miyakawa等人，1981，Lancet2493-497;Minota等人，1984.Arthr，Rheum.271329-1335)，美國(Iida等人，1982，T.Exp.Med.1551427-1438i Wilson等人，1982，N，Engl.J.Med，307981-926)和歐洲(Walport等人，初.Clin.Exp，Immunol，59547;Jouvin等人，1986，Complement 388-96;Holme等人，1986，Clin，Exp，Immunol.6341-48)。將病人作為一組來看，其體內每個細胞中受體的平均數是正常人的50-60%。一份早期報導中指出紅細胞中CRl的數目與疾病的活性呈反比的變化，在SLE最嚴重的表現期，CRl的數目最少，而在同一病人中，處於緩解期時，則觀察到較多的CRl(Iida等人，1982，J.Exp，Med，1551427-1438)。研究還發現，CRl的數目與免疫複合體的血清水平，C3d的血清水平和結合紅細胞的C3dg的量呈負相關，這可能反映了補體激活免疫複合體的攝入和作為「單純的旁觀者」在紅細胞上的沉積(Ross等人，1985，J，Immunol，1352005-2014;Holme等人，1986，Clin，Exp Immunol.6341-48;Walport等人，1985，Clin，Exp，Immunol.59547)。我們發現紅細胞上缺乏CRl的SLE的病人對於CRl具有自身抗體(Wilson等人，1985，J.Clin，Invest，76182-190)。抗CRl的抗體效價的減少與病人的臨床情況的改善和受體異常的部分逆轉相應。抗CRl抗體在其它兩個SLE病人身上也已檢測到了(Cook等人，1986，Clin，Immunol，Immunopathol，38135-138)。最近，通過觀察到輸入的紅細胞中受體迅速喪失而證實了在活動期SLE和溶血性貧血病人中，紅細胞CRl的後天性喪失(Walport等人，1987，Clin Exp.Immuniol，69501-507)。
感染人體免疫缺乏病毒(HIV)病人(Tausk，F.A.等人，1986.T.Clin，Invest，78977-982)和麻風病(lepromatus leprosy)(Tausk，F.A.等人，1985 J.Invest Dermat 8558s-61s)的病人中已觀察到了相應的CRl從紅細胞上喪失。
在SLE中補體受體表達的異常不局限於紅細胞CRl，SLE病人的嗜中性粒細胞的全部細胞CRl和B淋巴細胞的胞質膜CRl也已顯示出發生相應缺少(Wilson等人，1986，Arthr，Rheum，29739-747)。
在患有IV型SLE腎炎的病人中，所有可測得的CRl抗原從足狀突細胞中消失，而在較不嚴重的SLE腎炎和非SLE型增生性腎炎，包括膜增生性腎小球性腎炎Ⅰ和Ⅱ型病人中，腎小球足狀突細胞中CRl的表達與正常的並無不同(Kazatchkine等人，1982，J，Clin，Invest 69900-912;Emancipator等人，1983，Clin Immunol.Immunopathol 27170-175)。但是，患有Ⅳ型SLE腎炎的病人的紅細胞CRl的數目並不比患有其它類型的腎狼瘡或無腎炎的SLE病人少。(Jouvin等人，1986，Complement 388-96)。
在體內補體活化可促進嗜中性粒細胞的胞質膜上CRl的表達(Lee.J.等人，1984，Clin Exp.Immunol.56205-214;Moore F.D.Jr等人，1986，N.Engl，J.Med，314948-953)。
3.本發明的概要本發明涉及C3b/C4b受體(CRl)基因和它編碼的蛋白質。本發明還涉及CRl核酸順序和含有70個核苷酸的片段和它們編碼的含有24個胺基酸的肽或蛋白質。此外，本發明提供了CRl蛋白質及其片段的表達。本發明的基因和蛋白質可用於診斷和治療涉及補體活性的疾病和各種免疫系統或炎症疾病。
在下面的實例章節所詳細描述的本發明的特定實施例中，將描述一個全長CRlcDNA及其片段的克隆、核苷酸順序和推斷的胺基酸順序。還將描述CRl蛋白質及其片段的表達，並可得到CRl蛋白質及其含有C3b和/或C4b結合位點並顯示因子I輔助因子活性的片段的表達。
下面的實例還描述了可溶性的CRl分子的製備和純化，這些分子對於治療炎症反應和減小心肌梗塞範圍以及預防腫塊損傷的是有用的。
3.1 定義Ad2MLP＝腺病毒2主要的後期啟動子C 補體C3(ma)＝甲胺處理過的C3C4bp＝C2結合蛋白質CMV＝細胞肥大病毒CRl＝補體受體，1型，C3b/C4b受體CR2＝補體受體，2型DCFDA＝二氯螢光黃二乙酸酯(dichlorofluorescin diacetate)HPLC＝高壓液相色譜iC3b＝失活C3bLHR＝長同源重複mAb單克隆抗體
PAGE＝聚丙烯醯胺凝膠電泳RPAR＝反向被動Arthrus反應SCR＝短一致重複SCRl＝可溶性CRl分子4.圖表說明

圖1完整的CRl編碼區的核苷酸和胺基酸順序。該順序始於在克隆λT109.1的八聚體EcoR1接頭後的第一個核苷酸。該順序的1532號核苷酸是圖3中描繪的順序中的1號核苷酸的第1個5′核苷酸。推斷的胺基酸順序，顯示在與mRNA相應的鏈的下面。推斷的由28-147號核苷酸編碼的推斷的信號順序在括號內。
圖2.人體CRl cDNA的5.5kb的限制酶圖譜。黑線表示cDNA，限制酶位點是H.Hind Ⅲ;B，BamHⅠ;R，EcoRⅠ;P，PstⅠ;A，ApaⅠ;S，SacⅠ;G，BglⅡ;K，KpnⅠ。獲得該順序的cDNA克隆顯示於圖的下面。箭頭表示採用雙脫氧核苷酸鏈終止方法分析順序的方向和長度。根據限制酶圖譜和重迭順序同一性而確定cDNA克隆的方向。
圖3，人體CRl cDNA的5.5kb的核苷酸順序。圖中顯示了與mRNA相應的鏈，鹼基1(相應於圖1中的鹼基1532)是大多數5′克隆中EcoRⅠ接頭後的第一個鹼基。終止密碼子用下劃線表示。在核苷酸147和148(箭頭)之間發現一段110-bp順序，用方框表示，我們認為，它表示插入順序部分。
圖4，人體CRl cDNA的5.5kb的核苷酸順序的點陣分析。如果90bp中至少有40bp匹配，則標繪一個斑點。沿正方形對角線劃分的黑線表示與順序本身相重合。與相重合的線相平行的另外兩條黑線1.35和2.7kb代表兩者一前一後，引導每一個為1.35kb的長同源重複(LHRs)。在兩個LHRs之間的六條較淺的破折號線對應於～2kb的短一致重複。短一致重複(SCRs)沿長同源重複延伸出0.4kb。
圖5.人體CRl的推斷的胺基酸順序。每一個殘基用一字母碼表示(Lehninger A.L，1975，Biochemistry，第2版，Worth印刷公司，New York，P.72)。將長同源重複中的殘基排成一行以表明它們的同源性。LHR-B中的所有殘基均被表示了，只有當殘基不同於LHR-B中的時，才給出LHB-C和LHB-D的殘基。親水性排列於蛋白質的COOH末端下以說明假定的轉移膜區。緊靠在疏水順序後的四個帶陽性電荷的殘基的範圍用上劃線表示，而與表皮生長因子受體中的蛋白質激酶C磷酸化位點67%同源的六個胺基酸順序用下劃線表示，CRl蛋白質的圖譜示於上述的順序的上面。(TM)跨膜區，(Cyt)胞質區，(3′UT)非翻譯順序。
圖6.(A)CRl的SCRs的排列。重複是從NH末端到COOH末端的1-23號，其中已增加空間以儘可能增大排列。一個殘基如果在至少一半SCRs中存在，則被視為保守或保守置換。水平箭頭表示一個SCR，它也是從CRl基因組克隆2.38來的順序且由單一的外顯子編碼。(B)限制酶圖譜，測序方法和基因組克隆入2.38的部分順序。限制位點是(B)BamHⅠ，(S)SacⅠ，(E)EcoRⅤ，(K)KpnⅠ，(P)PstⅠ。水平箭頭表示測序的方向和長度，垂直的箭頭表示外顯子一內含子分界線。
圖7，已知具有該結構的蛋白質的SCRs的一致順序的排列。在其中增加空間以儘可能增大排列。殘基被視為保守如圖5所示，除了只具有1或2個SCRs的那些蛋白質，其中如果殘基在至少一半其它蛋白質中存在，則殘基為保守的，破折號相應於非保守的位置。CR2和C2b的下劃線部分表示對於這些蛋白質來說，在尚未有過公開發表的該區域的順序資料。方框表示不變異的半胱氨酸。順序右邊的數字表示用於產生一致順序的SCRs的數目。用於表示確定一致順序的順序資料的蛋白質縮寫和參考是(CRl)補體受體1型，(H)因子H(Kristensen，T.等人，1986，J.Immunol.1363407)，(C46p)C4結合蛋白質(Chung，L.P.等人，1985，Biochem.J.230133)，(CR2)補體受體2型(Weis J.J.等人，1986，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 835639)，(Ba)因子B的蛋白質水解片段(Morley B.J.和Campbell R.D.1984.EMBO J.3153)，(C2b)C2的蛋白水解片段(Gagnon，J.1984，Philos，Trans，R.Soc，Lond.B.Biol.Sci.306301)，(Clr)Cl的r亞基(Leytus S.P.等人，1986，Biochemistry 254855)，(ⅩⅢb)因子ⅩⅢ的b亞基(Ichinose A，等人，1986，Biochemistry 254633)，(β2 GP1)β2糖蛋白I(Lozier J.等人，1984.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)，(Hap)結合珠蛋白(Kurosky，A.等人，1980，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.773388)，(IL-2-R)白細胞介素(interleukin)-2受體(LeonardW，J.等人，1985，Science 230633)。星號表示不完全順序是可以得到的。
圖8，人體CRl的推斷的結構圖。COOH末端胞質區是位於類脂雙層膜的右邊。30SCRs被線性地排列在質膜的細胞外一邊，括號表示LHRs。插入圖是放大的單個SCR，說明三環結構。
圖9.編碼人體CRl的質粒pBSABCD插入的限制酶圖譜。在表示含有編碼順序的區的方框中顯示有來自八個cDNA克隆的九個片段，它們被連接後形成CRl結構。括號分別指出了LHR-A，-B，-C，和-D的位置。方框下面的線表示新分離的5′cDNA克隆的位置。限制酶位點是A，Apal，B，BamHⅠ;G，BglⅡ，H，HindⅢ;K，KpnⅠ;M，BspMⅡ;P，PstⅠ;R，EcoRⅠ;和S，SacⅠ。
圖10，編碼LHR-A的七個SCRs的5′cDNA克隆的推斷的胺基酸順序，以及LHR-B，-C和-D相應的SCRs的這個順序的排列。在每一個SCR中保守的四個胱氨酸用下劃線表示。只有當殘基與LHR-A中的不同時，LHR-B，-C和-D的殘基才表示出來。
圖11表達質粒piABCD和pMTABCD的限制酶圖譜。PmMT和Pcmv分別代表鼠類金屬硫因(metallothionein)和細胞肥大病毒最近的早期啟動子。
圖12，分別用piABCD(a和b組)和CDM8載體(c和d組)單獨轉染COS細胞，然後用YZ1單克隆抗-CRl抗體和螢光素標記的山羊抗鼠F(ab′)2間接染色的相差顯微鏡(a和c組)和免疫螢光顯微鏡(b和d組)的分析。
圖13，採用表達重組CRl的COS細胞的結合C3b和C4b的分析。用piABCD(a和c組)或CDM8載體(b和d組)單獨轉染的COS細胞與EAC4b(lim)，3b(a和b組)或EAC4b(c和d組)一起孵育，通過相差顯微鏡檢查玫瑰花結的形成。
圖14，由轉染的COS細胞表達的重組CRl的SDS-PAGE分析。分別用CDM8載體單獨轉染(通道1和4)和piABCD轉染(通道2和5)的COS細胞，和來自於具有CRl的F和S異型的個體的紅細胞(通道3和6)的表面用125I標記。用去垢劑處理的細胞溶解產物，用瓊脂糖UPC10(通道1-3)和瓊脂糖-YZ1(通道4-6)連續地進行免疫吸附，在非還原條件下用SDS-PAGE和放射自顯影分析洗脫物。
圖15，在免疫固相化重組CRl的存在下，用因子I裂解125I-C3(ma)。在因子H(通道1)，與CDM8載體單獨(通道)轉染的COS細胞的溶解產物預孵育的瓊脂糖-UPC10(通道2)，與PiABCD轉染的COS細胞的溶解產物預孵育的瓊脂糖-UPC10(通道3)，用CDM8轉染的COS細胞的溶解產物預孵育的瓊脂糖-YZ1(通道4)，和與piABCD轉染的COS細胞的溶解產物預孵育的6μl(通道5)，12μl(通道6)和25μl(通道7)的瓊脂糖-YZ1存在下，用因子I處理125I-C3(ma)的重複樣品。還在無因子I的條件下，用25μl已經與piABCD轉染的COS細胞(通道8)的溶解產物預孵育過的瓊脂糖-YZ1處理125I-標記的C3(ma)的樣品。還原後，採用SDS-PAGE和放射自顯影分析125I-C3(ma)。
圖16，編碼CRl缺失型突變體的cDNA結構。在全長piABCD結構(其上顯示了用於製備缺失型突變體的限制酶位點)上面，用括號表示編碼四個LHRs的cDNA片段的位置。在每一個突變體中所保留的cDNA限制片段均由實線表示。限制酶位點是A.ApaⅠ;B.BamⅠ;E，BstEⅡ和P.PstⅠ。
圖17，CRl重組缺失型突變株與野生型CRl的F和S異型的比較。分別用瓊脂糖-UPC10抗果聚糖抗體(通道1-6)，瓊脂糖-YZ-1抗CRl單克隆抗體(通道7-11)和兔抗CRl抗體和瓊脂糖-蛋白質A(通道12)免疫沉澱125I表面標記紅細胞(通道1和7)及分別用CDM8載體單獨(通道2和8)，piABCD(通道3和9)，piBCD(通道4和10)，piCD(通道5和11)和piD(通道6和12)轉染的COS細胞去垢劑處理的溶解物。在還原條件下，將洗脫物進行SDS-PAGE和放射自顯影分析。
圖18，在表達全長和CRl缺失型突變體的COS細胞的存在下，用因子I裂解125I-C3(ma)。分別用CDM8載體單獨(通道1和7)，piABCD(通道2和8)，piAD(通道3和9)，piBD(通道4和10)，piCD(通道5和1)，和piD(通道6和12)轉染的COS細胞，在因子I缺乏(通道1-6)或存在(通道7-12)的情況下，與125I-C3(ma)的重複樣品一起孵育。並分別用因子H和因子I(通道13)和單獨用因子I(通道14)與125I-C3(ma)樣品一起孵育。還原後，用SDS-PAGE和放射自顯影分析I-C3(ma)。
圖19，描述包括CRl的每一個LHR的SCRs的類型，和決定C3b和D4b受體的專一性的預計位點的圖解模型。它們的次級結合專一性用圓括號表示。
圖20，保留在可溶性CRl DNA結構中的DNA區域的示意圖。全長CRl cDNA的區域由圖上面的方框表示。
圖21，pTCS系列表達載體中主要成份的示意圖。
圖22，表達載體pTC Sgpt的圖。多聚腺苷化位點來自於鼠Ig卡巴粒順序(NBRF Nucleic database accession ＃ Kams，bp1306-1714)，Ad2MLP和三分區來自於Ad2順序(NBRF Nucleic database accession ＃ Gdad2，bp 5791-6069);SV40早1期啟動子來自於SV40基因組(NBRF Nucleic Database accession ＃ GSV40W)。gpt基因，氨苄青黴素基因和細菌複製起點來自於載體pSV2gpt(ATCC Accession No.37145)。
圖23.抗體親和純化的sCRI的4-20% SDS-PAGE。非還原(通道1，2，3)和還原(通道4，5，6)的條件下。通道1，3分子量標記，通道3，5細胞培養上清原材料;通道4，6通過抗體親和層析法純化的sCRl。
圖24.陽離子交換HPLC洗脫圖。洗脫蛋白在280nm下測定吸收值(y軸)來監測洗脫的蛋白質。流過的(0-100分鐘)和洗脫的sCRl(150-165分鐘)的吸收部分均被切下。X軸表示洗脫時間(以分表示)。
圖25.陽離子和陰離子交換HPLC純化的sCRl的4-20%梯度SDS-PAGE。SDS-聚丙烯醯胺凝膠在非還原條件下走電泳。通道1，一部分生物反應物的上清液;通道2，經陽離子HPLC初始緩衝液透析的一部分生物反應物的上清液;通道3，從陽離子交換HPLC柱上洗脫的sCRl峰的一部分;通道4，從陽離子交換HPLC層析柱得到的再經陰離子HPLC的初始緩衝液透析的一部分sCRl峰;通道5和6，從陰離子HPLC上洗脫的sCRl的兩個不同分部的一部分。
圖26.在人體嗜中性粒細胞中C5a所引起氧突增。隨著C5a引起氧突增後，DCFDA被氧化並發出很亮的螢光。用流動血球計數法測定螢光強度，螢光強度對應於X軸，細胞數對應於y軸。a組細胞的圖和入口(gate);b組加入C5a後0分鐘;c組;1分鐘;d組2分鐘;e組3分鐘;f組4分鐘;g組20分鐘。該DCFDA分析顯示C5a很敏感。
圖27，在sCRl存在下，人體補體的激活顯示還原的C5a活性(DCFDA分析)。a組，未刺激的細胞，b組，顯示出高度螢光的無sCRl的對照物1;c組，在sCRl存在下DCFDA分析顯示出螢光強度降低75%。y軸是細胞數，x軸是螢光強度。
圖28，通過sCRl抑制在人血清中通過經典途徑產生C5a和C3a。用抗體親和純化或HPLC純化的sCRl觀察到相似的圖。
圖29，通過重組sCRl抑制補體介導的溶血作用。用親和純化或HPLC純化的sCRl觀察到相似的圖。
圖30，在sCRl處理(左)和未處理(右)過的鼠中RPAR的粗形態。(a)兩個大鼠均接受卵白蛋白靜脈注射，然後用sCRl(左邊的鼠)或PBS(右邊的鼠)與抗卵白蛋白，純的(左邊的位置);抗卵白蛋白，1/2稀釋(中間位置)或兔IgG(右邊位置)的混合物進行皮下注射。注射進行二次;頂端和底部呈現相同的結果。接受sCRl的鼠幾乎無肉眼可見的變化，而未處理的鼠則顯示了RPAR的全部症狀。(b)由(a)得到的皮膚活體組織的皮膚表面。從未處理的鼠(右)中得到的活體組織明顯地顯示出肉眼可見的損害，而從sCRl處理過的鼠(左)中得到的活體組織則顯示了正常的形態。
圖31.從sCRl處理過的(a)和未處理的(b)鼠中得到的皮膚活體組織的光學顯微鏡檢查。(a)觀察到在血管周圍聚集的多形核細胞和單核細胞，但是，未看到嗜中性粒細胞的大量滲入和紅細胞的外滲。(b)可見到多形核細胞的大量滲入和紅細胞的外滲。
5.發明的詳細描述本發明涉及C3b/C4b受體(CRl)基因和它編碼的蛋白質。本發明還涉及CRl核酸順序及其含有70個核苷酸的片段和它們編碼的包含24個胺基酸的肽或蛋白質。此外，本發明還提供了CRl蛋白質及其片段的表達。這種CRl順序和蛋白質在炎症或免疫系統疾病，和涉及補體活性疾病的診斷和治療中是有價值的。
在一個特例中，本發明涉及可溶性CRl分子和它們的表達，純化和應用。在這裡所採用的術語「可溶性CRl分子」意指與天然的CRl蛋白質相反，部分CRl蛋白質不能以膜蛋白質的形式在細胞表面表達。尤其是，大量缺少跨膜區的CRl分子是可溶性CRl分子。在一個較佳實例中，可溶性CRl分子被表達它們的細胞所分泌。
在下面將要詳細描述的本發明的特例中，描述了全長CRl cDNA以及其片段的克隆和全部核苷酸順序和推斷的胺基酸順序，和編碼CRl產物的表達。具有C3b和/或C4b的結合位點，且抑制因子I輔助因子活性的CRl以及其片段的表達也將描述。本發明通過可溶的，平截的CRl分子的製備和純化而進一步加以描述。在一個特例中，這類分子被證明對於減輕炎症，減小心肌梗塞範圍和防止腫塊損傷的治療是有用的。
5.1 CRl基因的分離CRl基因的完整編碼順序及其推斷的胺基酸順序列於圖1。
任何人體細胞都有可能作為CRl基因的分子克隆的核酸源。CRl基因的分離包括編碼顯示CRl相關結構或性能(例如，結合C3b或C4b或免疫複合體，調節吞噬作用，免疫激活作用或增殖，以及補體的調節)的蛋白質的那些DNA順序的分離。DNA可以通過該領域已知的標準方法從克隆的DNA(如，DNA「庫」)中獲得，可採用化學合成，cDNA克隆，或基因組DNA克隆或它的片段的克隆;和從所需要的人體細胞中提純(如，可參考Maniatis等人，1982，Molecular Cloning，實驗室手冊，Gold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York;Glover D.M.1985，DNA克隆Apractical Approach，MRL Press有限公司，Oxford，U.K.Vol.I，Ⅱ.)。可作為CRl基因cDNA克隆的核酸源的細胞包括(但不局限於此)單核細胞/巨噬細胞，粒細胞，B細胞，T細胞，脾卵泡樹狀突細胞和腎小球足狀突細胞。來自於基因組DNA的克隆除編碼區外還可能包含調節和內含子DNA區;來自於cDNA的克隆則僅包含外顯子順序。不管來源如何，CRl基因均應分子克隆進入用於基因增殖的合適的載體中。
在對來自於基因組DNA的基因進行分子克隆時，產生DNA片段，它們中的一些將編碼所需要的CRl基因。採用不同的限制酶，DNA可在特定的位點切斷。或者，在錳存在下，我們可使用DNA酶分解DNA，或DNA可通過諸如聲處理方法而被物理地剪切。然後可採用包括(但不局限於此)瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠電泳和柱層析在內的常規方法根據大小將線狀的DNA片段分離。
一旦產生了DNA片段，則可用許多方法來鑑定包含CRl基因的特定DNA片段。例如，如果可以得到CRl基因或它的特定RNA，或它們的片段，並可被純化和標記，則所產生的DNA片段就可通過與標記探針的核酸雜交進行篩選(Benton W和Davis R，1977，Science 196180;Grunstein M和Hogness D，1975，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.723961)。與探針大量同源的那些DNA片段將能雜交。如果純化的CRl專一探針得不到，則富含CRl的核酸部分可以作為探針而用於初步選擇方法。作為一個實例來說，可以使用已去除了成纖維細胞表達的信息的表現B細胞cDNA的探針。也可通過限制酶酶切並根據已知的限制酶圖譜(如果它是可以得到的)與預期的片段進行片段大小比較來鑑定合適的片段。在初步選擇後，根據基因的性能，或它的表達產物的物理，化學或免疫性能(如後面要描述的)，可以進行進一步的選擇。
CRl基因也可以通過核酸雜交然後體外翻譯進行mRNA選擇而被鑑定。在這個過程中，片段被用於通過雜交來分離互補的mRNAs。這些DNA順序可代表可以得到的，純化的CRl DNA，或已被富集CRl順序的DNA。
分離的mRNAs的體外翻譯產物的免疫沉澱分析或功能鑑定(如，C3b或C4b的結合，或吞噬作用或免疫激活的促進，或補體調節等)識別了mRNA和含有CRl順序的互補DNA片段。此外，通過從細胞中分離出來的多核糖體對專一地抗CRl的固相抗體的吸附，可以選擇出特定的mRNAs。用選出的mRNA(來自於被吸附的多核糖體)作為模板可以合成放射標記的CRlc DNA。然後可用放射標記的mRNA或cDNA作為探針將CRl DNA片段從基因組其它DNA片段中識別出來。
分離CRl基因組DNA的其它方法包括(但不局限於此)從已知的順序中化學地合成基因順序本身或製備編碼CRl基因的mRNA的cDNA。例如，如上面所描述的，用於CRl基因的cDNA克隆的RNA可以從包括(但不限於)單核細胞/巨噬細胞，粒細胞，B細胞，T細胞，樹狀突細胞和足狀突細胞在內的細胞中分離出來。在一個較佳具體實施例中，扁桃體(tonsilar)細胞可以作為用於cDNA克隆的mRNA的來源(見後面)。在本發明範圍內的其它方法也是可行的。
然後，可將經確定和分離的基因插入合適的克隆載體中。該領域已知的很多載體宿主系統均可採用。可能的載體包括(但不局限於)質粒或經修飾的病毒，但是載體系統必須與所採用的宿主細胞相容。這類載體包括(但不局限於)噬菌體，如λ衍生物;或質粒，如pBR322或pUC質粒或CDM8質粒(Seed B.1987，Nature 329840-842)或衍生物。重組子可以通過轉化，轉染，感染，電刺激(electroporatio)等而導入宿主細胞。
在另一個方法中，在以「鳥槍」法插入合適的克隆載體後，可以確定和分離CRl基因。在插入克隆載體前，可通過諸如大小分部分離的方法而富集CRl基因。
CRl基因被插入可以用於轉化、轉染或感染合適的宿主細胞的克隆載體中，這樣，可產生很多基因順序的拷貝。在一個特例中，克隆載體可以是CDM8載體，它可用於在哺乳動物宿主細胞中獲得表達。插入至克隆載體內可以通過將DNA片段連接到具有互補的粘性末端的克隆載體中而完成。但是，如果在克隆載體中不存在可用於切割DNA的互補限制酶位點，則DNA分子的末端可進行酶修飾。換句話說，任何所需要的位點均可通過將核苷酸順序(接頭)連接到DNA末端而產生;這些連接接頭可以包含能編碼限制性核酸內切酶識別順序的特定的化學合成的寡核苷酸。在另一個方法中，切割的載體和CRl基因可以用同聚加「尾」加以修飾。
根據DNA本身的性能，或者，根據它所編碼的蛋白質的物理、免疫學的或功能的性能，可以用許多不同的方法來進行克隆的CRl基因的鑑定。例如，DNA本身可以通過將噬菌斑或菌落與標記的探針進行核酸雜交而檢測(Benton W和Davis R.1977，Science 196180;Grunstein M和Hongness D，1975，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.723961)。或者，CRl基因的存在可以通過根據它的表達產物的性能的測定而檢測。例如，可以將能產生這樣的蛋白質，如與已知的CRl具有相近或相同的電泳遷移，等電聚焦現象，蛋白質水解消化圖譜，C3b和/或C4b和/或免疫複合體結合活性，補體調節活性，對吞噬作用或免疫制激的影響，或抗原性的cDNA克隆或能雜交選擇合適的mRNAs的DNA克隆選出來。採用一種CRl抗體，用ELISA(酶連免疫吸附分析法)的方法，CRl蛋白質就可通過將標記的抗體與推測的合成CRl的克隆相結合而得以鑑定。
在一個特例中，用插入了分離的CRl基因，cDNA，或合成的DNA順序的重組DNA分子進行的宿主細胞的轉化能夠產生多個基因拷貝。因此，通過使轉化子生長，從轉化子中分離重組DNA分子和，當需要時，從分離的重組DNA中重新得到所插入的基因，就可以獲得大量的基因。
在一個特例中，在CDM8載體中的CRl cDNA克隆可以被轉染入COS(猴腎)細胞，以在細胞肥大病毒啟動子的控制下進行大量的表達(見下面第8章節)。
如果最終的目的是將基因插入病毒表達載體，如牛痘病毒或腺病毒，將插入CRl基因的重組DNA分子進行修飾，以使該基因側面與病毒順序相接，這些病毒順序允許在被該病毒感染的細胞內發生遺傳重組從而使CRl基因能插入到病毒的基因組內。
當含CRl DNA的克隆鑑定，生長和收集後，它的DNA插入的特性如下面5.4.1中所描述的。
當CRl基因的遺傳結構已知時，就有可能操作該結構，使其最佳地用於本發明。例如，啟動子DNA可以與編碼CRl的順序的5′相連接，此外，還可替代天然啟動子以增加蛋白質的表達。能表達CRl缺失突變體的表達載體也可製備，以得到CRl順序的確定的片段的表達(見下面8.3章節)。在一個特例中，可以構建能編碼可呈現所需要的C3b和/或C4b結合活性(見下面9章節)的CRl蛋白質的片段(例如，結合C4b的LHR-A，或結合C3b的LHR-C)的缺失突變體。在另一個實例中，編碼帶有缺失跨膜區的CRl分子的表達載體可被用於製備可溶性的CRl蛋白質。在本發明的範圍內，很多操作都是可能的。
5.2克隆的CRl基因的表達編碼CRl蛋白質(圖1)或它的一部分的核苷酸順序可以被插入合適的表達載體，即含有插入的蛋白編碼順序的轉錄和翻譯所必需的成份的載體。必要的轉錄和翻譯信號也可由天然CRl基因和/或它的側面區所提供。各種宿主-載體系統可用於表達蛋白編碼順序。它們包括(但不局限於)被病毒(如牛痘病毒，腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系統;被病毒(如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統;微生物，如包含酵母載體的酵母(菌);或用噬菌體DNA，質粒DNA或cosmidDNA轉化的細菌。這些載體的表達成份的強度和特性不同。根據所採用的宿主-載體系統，可以使用任何一種合適的轉錄和轉譯成份。例如，當在哺乳動物細胞系統中克隆時，可以採用自哺乳動物細胞的基因組或在這些細胞中生長的病毒(如腺病毒，猴病毒40，細胞肥大病毒)分離得的啟動子。也可以使用由重組DNA或合成技術所製備的啟動子以轉錄插入的順序。
為了有效地翻譯插入的蛋白編碼順序，專一起始信號也是需要的。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近的順序。在包括其固有的起始密碼子和鄰近的順序的完整CRl基因被插入合適的表達載體內的情況下，不需要附加的翻譯控制信號。但是，在只有部分CRl的編碼順序被插入的情況下，一定要提供包括ATG起始密碼子在內的外源翻譯控制信號。此外，起始密碼子必須與蛋白編碼順序的讀碼同相，以保證整個插入部分的翻譯。這種外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種來源的，天然或合成的均可。
上述用於將DNA片段插入載體的任何方法均可用於構建包含由合適的轉錄/翻譯控制信號和蛋白質編碼順序所組成的嵌合基因的表達載體。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術和體內重組(遺傳重組)。
上述用於將DNA片段插入載體的任何方法均可用於構建包含由合適的轉錄/翻譯控制信號和蛋白質編碼順序所組成的嵌合基因的表達載體。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術和體內重組(遺傳重組)。
在一個特例中，可溶性CRl分子可以被表達。這種可溶性分子可以通過採用重組DNA技術，刪除編碼CRl跨膜區的DNA順序而製備(見下面11-14章節)。如在下面所演示的，表達可溶性CRl分子的能力不受任何一種CRl核酸順序的遺傳修飾的限制，只要刪除編碼CRl跨膜區的大部分的核酸順序，就可獲得可溶性的CRl結構。
含有CRl基因插入部分的表達載體可以通過三種普通的方法來鑑別(a)DNA-DNA雜交，(b)「標記」基因的功能的存在或缺乏，和(c)插入的順序的表達。在第一種方法中，被插入於表達載體中的外源基因的存在可以通過DNA-DNA雜交，採用含有與插入的CRl基因同源的順序的探針，來加以檢測。在第二種方法中，重組載體/宿主系統可以根據由外源基因插入載體而引起的一定的「標記」基因的功能(例如，胸腺嘧啶核苷激酶活性，耐抗生素性，轉化表型，在杆狀細菌中閉合體的形成等等)的存在或缺乏而加以鑑別和選擇。例如，如果CRl基因被插入於載體的標記基因順序中，包含CRl插入部分的重組子可以通過標記基因的功能的缺乏而鑑別。在第三種方法中，可以通過測定由重組子所表達的外源基因產物而鑑定重組表達載體。這種測定方法可以根據基因產物的物理，免疫或功能的特性而進行。
一旦當一個特定的重組DNA分子被鑑別和分離，則可用該領域中已知的幾個方法使它增殖。當一個合適的宿主系統和生長條件被建立，則重組表達載體可以大量地繁殖和製備。
在本發明的實例中詳細描述的一個特例中，攜帶CRl cDNA插入部分的CDM8載體可被轉染入COS細胞，在其中CRl cDNA插入部分被表達以產生CRl蛋白質。在下面章節的實例中詳細描述的一個特例中，攜帶相應於部分CRl編碼區的CRl cDNA插入部分的CDM8載體可被轉染入COS細胞，在其中CRl或片段被表達。在下面將要描述的另一實例中，通過採用表達載體，如在11.3.1章節中所描述的pTCS載體，平截的，可溶性CRl分子可以在哺乳動物細胞中表達。如前面所述的，可以採用的表達載體包括(但不局限於)下列載體或它們的衍生物人體或動物病毒，如牛痘病素或腺病毒;昆蟲病毒，如杆狀病毒;酵母載體;噬菌體載體(如λ-噬菌體載體)和質粒和cosmid DNA載體，前面例舉的只是少數。
此外，可以選擇一個宿主細胞系，它能調節插入順序的表達，或按所需要的特定形式修飾和加工嵌合基因產物。在一定的誘導物存在下，一定的啟動子的表達可以增強;因此，遺傳工程的CRl蛋白質的表達可以控制。而且，不同的宿主細胞對於蛋白質的翻譯和翻譯後加工和修飾具有特定和專一的機制。可以選擇合適的細胞系或宿主系統以保證所表達的異源蛋白質的所需要的修飾和加工。例如，在一個實施例中，在細菌系統中進行表達可用於產生一種具有圖1中所推斷的胺基酸順序的未糖基化的CRl蛋白質。而在酵母中表達則得到一種糖基化的產物。在另一個實施例中，為了保證異源CRl蛋白質的「天然」糖基化作用，可以採用哺乳動物的COS細胞。此外，不同的載體/宿主表達系統可能影響加工反應，如產生不同程度的蛋白質裂解。在本發明的範圍內，可以得到CRl蛋白質的多種不同的加工產物。
在本發明的一個較佳實施例中，可溶性CRl分子的大量製備可以如下面12.1等章節中所描述的那樣進行。
5.3.表達的基因產品的鑑別和純化一旦表達CRl基因的重組子被鑑別了，就應該分析基因產物。這可以通過產物的物理，免疫或功能的特性的測定而完成。
CRl蛋白質可通過包括色譜法(如離子交換，親和層析，和大小分離柱層析，高壓液相層析)，離心，差異溶解性，或通過純化蛋白質的其它常規技術而被分離和純化。
在下面的實例中詳細描述的本發明的一個較佳實例，大量的可溶性CRl可以通過包括HPLC在內的方法而純化(見12.2等章節)。如下所述，純化的CRl的大量製備可以通過採用一種表達系統來進行，它產生可溶性CRl作為初始物質，這就不需要對膜結合CRl用去垢劑以使之溶解。在生物反應培養物中牛胎血清濃度的減小和/或在這些培養物中採用選擇性培養基就消除了在後面的純化中從含有可溶性CRl初始物質中除去高濃度的外源蛋白質的需要。在這個較佳實例中，陽離子HPLC或陽離子HPLC，然後陰離子交換HPLC相結合的方法可以用於純化。這樣，僅以一或二個步驟，就可高產率地獲得基本純化的可溶性CRl。
或者，一旦由重組子所產生的CRl蛋白質被鑑定，則蛋白質的胺基酸順序就可以從包含於該重組子中的嵌合基因的核苷酸順序來推斷。結果，蛋白質可以通過該領域已知的常規化學方法來合成(例如，可參考Hunkapiller M.等人，1984，Nature 310105-111)。
在本發明的一個特例中，這種CRl蛋白質(不管是由重組DNA技術還是用化學合成方法製得的)包括(但不局限於)包含初級胺基酸順序，圖1中描繪了全部或部分胺基酸順序包括在該順序內的由功能相同的殘基進行取代而產生同義變化(Silent Change)的改變順序。例如，在該順序中的一個或多個胺基酸順序可以被一個具有相似極性的起同樣功能的胺基酸所取代而產生同義置換。非保守的置換也可產生功能相同的蛋白質。
在一個實施例中，CRl順序內的胺基酸的置換可以從該胺基酸所屬的組的其他組份中選擇。例如，非極性(疏水的)胺基酸包括丙酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電荷(鹼性)的胺基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。在翻譯中或翻譯後，進行各種不同的修飾，如糖基化，蛋白質水解等的CRl蛋白質也包括在本發明的範圍內。
在下面要詳細描述的本發明的一個實例中，顯示了由轉染的細胞表達的克隆重組CRl，它不能用SDS-PAGE方法與紅細胞的F-異型體區別開來(圖14)，它可介導載有C4b或C3b的羊紅細胞的結合，和能夠再產生CRl的配體專一性(圖13)，並顯示出對於切割C3(ma)的α多肽的因子I輔助因子活性(圖15)。
5.4.CRl基因和蛋白質的結構CRl基因和蛋白質的結構可以通過該領域已知的多種方法來分析，包括(但不局限於)下面描述的那些。
5.4.1.遺傳分析與CRl基因相應的克隆的DNA或cDNA可以用包括(但不局限於)Southern雜交(Southern E.M.1975，J.Mol.Biol.98503-517)，Northern雜交(可參考Freeman等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.804094-4098)，核酸限制內切酶圖譜(Maniatis T.1982，Molecular Cloning，實驗室手冊，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York)，和DNA順序分析在內的方法來分析。Southern和Northern雜交的雜交條件的嚴格程度可進行控制以保證與所用的特定CRl探針具有所需的核酸順序的檢測。例如，在不很嚴格的條件下，與含有編碼LHR-B和LHR-C的CRl基因順序的探針雜交可用於檢測CR2核酸順序。
限制性核酸內切酶圖譜可用於粗略地確定CRl基因的遺傳結構。在一個特例中，用限制酶切割可以得到如下面的圖2中所示的限制酶圖譜，由限制性核酸性內切酶切割所得到的限制酶圖譜可以通過DNA順序分析而得以證實。
DNA順序分析可以通過該領域已知的任何技術來進行，包括(但不局限於)Maxam和Gilbert方法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)，Sanger雙脫氧方法(Sanger，F.等人，1977，Proc.Natl.Acael.Sci.U.S.A.745463)或使用自動DNA測序儀(如，Applied Biosystems，Foster City，CA.)。CRl基因的cDNA順序包括在後面的圖1中所標繪的和在第6，第7章節所描述的順序。
5.4.2.蛋白質分析CRl蛋白質的胺基酸順序可以通過從DNA順序推斷，或者直接測蛋白質的順序，如採用自動胺基酸順序儀。一個典型的CRl蛋白質的胺基酸順序主要包括在圖1中和下面的第6章節中詳細描述的順序。如下面所要描述的，所有F異型體CRl的編碼順序均已克隆，在切去41個胺基酸的信號肽後，成熟受體包含1998個胺基酸，其中包括形成30SCRs的1930殘基的細胞外結構區(其中28個SCRs被組入LHR-A，-B，-C和-D(圖10))，25個胺基酸的跨單層膜區和43個胺基酸的相對較短的胞質區。
在包含多個SCRs的C3/C4結合蛋白中，CRl是唯一具有幾組組入LHRs的SCRs的。比較CRl的四個LHRs顯示，每一個均由四種類型的SCRs組成，即a、b、c和d型(圖19)。例如，LHR-A的SCR-1和SCR-2的順序與LHR-B，-C和-D的前二個SCRs分別只有62%，62%和57%相同。但是，SCR-3至SCR-7與LHR-B上相應的SCRs公在一個位置上不同，SCR-3和-4與LHR-C上相應的SCRs僅在三個位置上不同(圖10)。因此，LHR-A的「a」型SCRs中的一些也存在於LHR-B和-C中。與LHR-A上相應的SCRs不同的LHR-B的前二個SCRs與LHR-C上相應的SCRs有99%相同，因此，LHR-B和-C在這些位置上共有「b」型SCRs。LHR-C上的SCR-5，-6，-7隻有77%與在這些位置上的LHR-A和-B的「a」型SCRs相同，被認為是「c」型SCRs。LHR-D的1-4個SCRs是相對獨特的，是「d」型，而SCRs5-7有約93%與在LHR-C中發現的「c」型相同。
CRl蛋白質順序可進一步通過親水性分析(Hopp T.和Woods K.1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.A，783824)來定性。親水性的圖可用於鑑別CRl蛋白質的疏水區和親水區，以及編碼這些區域的基因順序的相應區域。圖5描繪了CRl蛋白質的COOH末端的親水性圖。
為了預測CRl特異性二級結構區，可以進行二級結構分析(Chou P.和Fasman G.，1974，Biochemistry 13222)。
可以採用其它方法進行結構分析。它們包括(但不局限於)X-射線結晶學(Engstom A.1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)和計算機模型(Fletterick R.和Zoller M.ceds.)，1986，Computer Graphics and Molecular Modeling，in Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York)。
5.5.與CRl有關的衍生物，類似物和肽與CRl有關的衍生物，類似物和肽的製備和使用也是可以展望的，關在本發明的範圍內。這類具有所需要的免疫原性或抗原性的衍生物、類似物或肽可以被用於諸如免疫分析，免疫接種，治療等中。這類分子保留或者抑制了一個所需要的CRl性能，例如，C3b或C4b的結合，補體活性的調節，或促進免疫刺激或吞噬作用等，它們可分別用作這些特性的誘導物，或抑制劑。
本發明的CRl相關衍生物，類似物和肽可以通過該領域已知的多種方法來製備。製備它們的操縱可在基因或蛋白質水平上進行。例如，克隆CRl基因可以通過該領域已知的多種方法(Maniatis T.1982，Molecular Cloning，實驗室手冊，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York)加以改進得到。可以作核酸限制內切酶(一種或多種)將CRl順序在合適的位點酶切，如果需要的話，再進一步用酶進行修飾，分離，並在體外連接(見下面第8章節)。在製備編碼CRl相關衍生物，類似物或肽的基因時，必須十分仔細以保證經修飾的基因在編碼所需要的CRl專一活性的基因區內，保留在與CRl相同的翻譯閱讀框架中，不被翻譯終止信號打斷。在一個特定的實例中，可生產出編碼融合蛋白的核苷酸順序，其組成包括部分CRl順序和非CRl順序。
此外，CRl基因可以在體外或體內突變，以產生和/或破壞翻譯，起始，和/或終止順序，或在編碼區內產生變異和/或新的限制性核酸內切酶位點或破壞先前所存在的位點，促進在體外的進一步修飾。該領域已知的任何突變技術均可使用，包括(但不局限於)在體外直接點突變(Hutchinson C.等人，1978，J.Biol.Chem.2536551)，TAB接頭的使用(Pharmacia)，等等。
CRl順序的操縱也可以在蛋白質水平上進行。可採用已知的技術來進行幾種化學修飾中的任一種，包括(但不局限於)通過溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH的特異性化學裂解;乙醯化，甲醯化，氧化，還原;在衣黴素的存在下，代謝合成;等等。
此外，CRl相關類似物和肽可以用化學方法合成。例如，與可介導所需要的活性(例如，C4b和/或C3b結合，免疫刺激，補體調節等)的一部分CRl相應的肽可以採用肽合成儀(例如，Applied Biosystems Model 380A)來合成。
5.6. CRl的用途5.6.1測試和診斷CRl蛋白質、類似物、衍生物及其亞序列(subsequence)、及抗-CRl抗體可應用在測試及診斷中。本發明的具有所需的CRl性質或功能的分子可用於測試這類性質或功能。例如表現出以游離的或複合物形式連接C3b及/或C4b的CRl蛋白質或其片段可用於測定某一樣品，例如病人體液中的該物質的量。
在一個特定的實例中，具有結合C3b(例如參見下述之表Ⅱ、第9章)ic3b或C4b(例如參見表Ⅱ)的在細胞表面表達的全長CRl或CRl缺失突變體(例如在以下的第8章所述者)可用於在同一個樣品中分別測定C3b、ic3b、或C4b的水平。在另一個實施例中，用重組DNA技術構建的缺失一個跨膜序列的一個CRl蛋白或其片段被分泌並被採用。
在一個特殊的實例中，這類對C3b及/或C4b的測定可以用作對補體活性的標誌，從而可用於對炎症及免疫系統疾病的診斷。這類疾病包括(但不限於)因燒傷引起的組織損傷或心肌梗塞引起的創傷成年人的呼吸窘迫症候群(shock lung)，自身免疫性疾病，諸如風溼性關節炎、全身性紅斑狼瘡，以及其他的涉及不希望的或不正常的補體活性的各種疾病或不適(參見文獻e.g.，Miescher，P.A.and Muller-Eberhard，H.J.，eds.，1976，Text Book of Immunopat hology，2d Ed.，Vols.Ⅰ and Ⅱ，Grune and Stratton，New YorkSandberg，A.L.，1981，in Cellular Functionsin Immunity and Inflammation，Oppenheim，J.J.et al.，eds.，Elsevier/North Holland，New York，P.373;Conrow，R.B.et al.，1980，J.Med.Chem.23242;Regal，J.F.and Pic kering，R.H.，1983，Int.J.，Immunopharmacol.571;Jacobs H.S.，1980，Arch.Pathol.Lab.Med.104617)。
CRl蛋白及其片斷含有一個表位，可用於(但不限於)免疫測定等測試中。可以採用的免疫測定包括(但不限於)競爭性和將競爭性測定系統，採用的技術諸如放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫附試驗)、「夾心式」免疫測定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散試驗、凝集試驗、補體結合試驗、免疫放射量測定、螢光免疫測定、蛋白A免疫測定及免疫電泳測定等，以上列舉的是部分。
CRl基因及相關的核酸序列及亞序列可以用於雜交測試法。這類雜交測試法可以用於監測與CRl表達相關的炎症或免疫應答，用於診斷某些與CRl表達的變化相關的疾病狀態，用於確定某個病人的CRl異型，用於檢測CRl基因及相關基因(例如，CR2)的存在及/或表達。
用於進行本發明的測試的成套工具也有供應。
5.6.2治療CRl蛋白及其片段、衍生物及類似物可在調節CRl介導的功能上有治療作用。這類功能包括(但不限於)以游離或複合物的形式結合C3b及/或C4b、促進吞噬作用、補體的調節、免疫刺激等等。有效劑量的本發明的CRl蛋白及相關分子對於與這些功能相關的許多疾病或不適，諸如免疫或炎症疾病(例如，如以上第5.6.1章節所述)具有治療價值。例如，那些顯示了所需活性的全長的CRl或其片段和相關分子可用於補體抑制的治療中，通過其作為因子I輔助因子的能力，促進補體成分C3b或C4b的不可逆失活(參見Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867;Iida，K.and Nussenzweig，V.，1981，J.Exp.Med.1531138)，及/或其通過抑制旁路或經典的C3或C5轉化酶的能力。
本發明的一個特定的實例中，可以構建一個表達載體，它編碼缺乏跨膜區域的一個CRl分子(例如，使C-末端缺失，到為大多數C-末端SCR所編碼的精氨酸為止)，從而產生一種，在游離或複合物形式下保持了連接C3b及/或C4b能力的可溶性CRl片段。在一個特別的實例中，這樣的一種CRl蛋白可以不再顯示出因子I輔助因子的活性。這種可溶性的CRl產物可施於患者體內，以便使可溶性的CRl有效地與天然的細胞表面CRl競爭地結合C3b及/或C4b，從而阻斷細胞表面CRl因子I輔助因子活性，並提高補體活性。
當C3b被共價地結合到顆粒及可溶性的免疫複合體後，經過蛋白水解加工C3b失活形成ic3b及C3dg，具有兩種生物學結果阻止補體系統通過放大途徑的過多的激活，以及形成可以結合非CRl的受體的配位體。由於ic3b片段不能連接B因子，因而轉變成這種狀態後可阻斷通過另一放大途徑的額外的補體激活。然而，ic3b可以與CRl及CR3結合，兩種補體受體介導骨髓單核細胞的吞噬作用。因而，C3b轉化成為ic3b的初級生物學結果是在不幹擾由CRl-及CR3介導的對C3包被的(C3-coated)複合物的清除的情況下，中止補體的激活。相反，ic3b向C3dg的另外的轉化所產生的一個片段僅與CR2作用而不與CRl及CR3作用。這種情形限制了依賴補體的載有C3dg的複合物與表達CR2的那類細胞的連結，這類細胞包括B淋巴細胞、濾泡樹狀突細胞，也許還包括真皮的上皮細胞、並且減少或排除了與吞噬作用型細胞的作用。這種改變的細胞聯合形式的生物學結果，應該將涉及免疫應答傳入期的細胞而非那些涉及清除及降解顆粒及複合物的細胞作為載有C3dg複合體的靶子。因而，CRl在治療上不僅可用以影響清除過程，而且可用以將參與抗原遞呈及抗體形成的載有CR2的細胞類型作為複合物的靶子。
在另一個實例中，能與C3b或C4b結合、及/或保留抑制旁路的或經典的C3或C5轉化酶能力或保留因子I輔助因子活性的CRl蛋白或其片段可以用以促進補體的失活。在該實例中，該CRl蛋白或片段在醫治那些涉及不希望的或不合適的補體活性的疾病(例如，成年呼吸窘迫症(Shock lung)，因燒傷引起的組織損傷或心臟局部缺血的病情，自身免疫性疾病，類症情況等等)方面具有價值。
在下述舉例的11-14章中細述的特定的實施例，一種可溶性CRl分子被表達，它保留了所需的功能活性，例如在體外具有對經典的補體介導的血細胞胞溶，經典的C5a產生，經典的C3a的產生，或中性粒細胞的氧突增(Oxidative burst)等的抑制能力。在一個特殊的實施例中，該種可溶性的CRl分子可用於減輕炎症及其損害，或減小心肌梗塞的區域大小或預防腫塊(reperfusion)損傷等等。這種體內治療試驗中有用的CRl分子可用各種現有技術中的模型系統進行測定，包括(但不限於)反相被動阿圖斯氏反應(見第14.1章節)及大鼠心肌梗塞模型(見第14.3章節)。
在本發明的另一個實施例中，一個顯示能抑制所需的CRl性質或功能的CRl的片段或其類似物或衍生物可用以預防或治療與這些功能有關的疾病或不適。
已知各種傳遞系統可用於遞送CRl及相關分子，例如，用脂質體微分子包囊法或微膠囊法、在基因治療中用造血幹細胞後代來表達等等。其它的引入的方法包括(但不限於)皮膚內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內及口服等等施用途徑。
本發明還提供了藥理學組合物。這些組合物包括治療上有效量的CRl蛋白，或其類似物，衍生物，或片段，及藥理學上可接受的載體。這種載體包括但不局限於鹽水、緩衝鹽溶液，右旋糖及水。
5.6.3聯合療法本發明的另一方面提供了治療血栓形成的方法，尤其是人類及動物中的急性心肌梗塞，這個方法包括給需要的人或動物服用本發明的有效量的可溶性CRl蛋白質，及有效量的溶血栓劑。
本發明還提出了將可溶性CRl蛋白質和溶血栓劑製成藥物，治療人類及動物中的血栓形成疾病。
在上述方法中，化合物可以任何方便的方式給藥，如輸注或藥用注射，可以依次或一併給藥。當依次給予本發明的可溶性CRl蛋白質和溶血栓劑時，可在接受溶血栓劑前或後使用可溶性CRl蛋白。當同時給予可溶性CRl蛋白質和溶血栓劑時，較好的方法是以包含兩種藥劑的藥理學組合物的形式給藥。因此，在本發明的另一方面，提供了一種藥理學組合物，它包含一種可溶性CRl蛋白質和一種溶血栓劑，在一種藥理學上可行的載體上。
在一個較佳實施例中，組合物可用常規方法加工成適合於人類靜脈內給藥的形式。
典型的靜脈內給藥的組合物為在無菌等滲緩衝液中的溶液。如必要的話，組合物還可包括一種增溶劑和一種局部麻醉劑，如利多卡因，以緩解注射處的疼痛。一般來說，各組分可以單位劑量形式分別或混合提供，例如，以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式在密封的容器如安瓿或袋中，上面以活性單位形式標明活性劑的量。如組合物以輸注方式給藥，可將它在含無菌藥學級「注射用水」或鹽水的輸注瓶中配藥。當組合物是以注射方式給藥時，需提供一安瓿元菌注射用水或鹽水，以便在給藥前先混合組分。
包含一個或更多個基中有一個或更多個藥理學組合物組分的容器的藥物包也在本發明的範圍內。
使用的材料量，以及溶血栓劑對CRl蛋白質的比率，將根據血栓栓塞嚴重的程度及血塊的位置和大小來決定。所用的精確量及給藥形式需考慮到病的性質，由主治醫生根據情況決定。但是，通常情況下，治療血栓的病人一般接受每標準劑量的溶血栓劑0.5至50毫克補體抑制劑(可溶性CRl組分)。
用於上述聯合療法的特定的溶血栓劑為溶(血)纖維蛋白酶，包括(血)纖維蛋白溶酶原激活劑。
名詞(血)纖維蛋白溶酶原激活劑包括但不局於鏈激酶，人體組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)及尿激酶(u-PA)(單鏈或雙鏈形式)。這些酶可從天然來源或從組織中或通過重組DNA方法得到，在DNA重組技術中，異種宿主有機體如細菌、酵母、真菌或哺乳動物類細胞編碼特定酶的基因，這一術語還包括(a)在EP(歐洲專利公開文本)-A-0155387和EP-A-0297882中公開的蛋白質，這二篇文獻公開了具血纖維蛋白溶解活性的雜交蛋白質，該蛋白質包括二鏈蛋白酶中的一條鏈與另一個不同的二鏈蛋白酶的一條鏈連結，在雜交蛋白質中至少有一條鏈來自有血纖維蛋白溶解活性的蛋白酶，這樣雜交蛋白質具有對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點，它可被一個可移動的阻遏基團阻遏;
(b)EP-A-0152736公開的蛋白質結合物，如與可逆性阻遏的的血纖維蛋白溶酶連接的尿激酶;
(c)由EP-A-155388公開的血纖維蛋白溶解酶的衍生物，其中酶上的與血纖維蛋白溶解活性有關的催化位點被一種人體蛋白所阻遏，該蛋白通過可逆性連接基團而附著在其上，例如尿激酶可逆地與人類血纖維蛋白溶酶活性中心連接;
(d)EP-A-0183503公開的結合物，包括一種血纖維蛋白溶解酶與一種水溶性多聚物通過一種可逆的連接基團連接;及(e)基因工程得到衍生物，包括如EP-A-0201153、EP-A-0207589、WO(PCT出版物)-8604351、EP-0041766、EP-0213794、EP-0199574、EP-A-020334、EP-A0241208、EP-A-0241209、EP-A-0241210、EP-A-0233013、EP-A-290228、EP-A-292326、EP-A-0213794、EP-A-0231883、WO 8704722、EP-A-0242836、EP-A-0234051、EP-A-0253582、EP-A-0253241、WO-8604351、EP-A-0236040、EP-A-0200451、EP-A-0238304、EP-A-0225286、DE(西德出版物)-3537176、EP-A-0236289、WO-8601538、EP-0227462，AU(澳大利亞出版物)-08661804、WO-8703906和EP-0199574公開的自然產生血纖維蛋白溶酶原激活劑的突突蛋白質，如des(cys51-asp87)t-PA。
在本發明的一個特定方面，血纖維蛋白溶酶原激活劑為一個雜交分子，如EP-A-0297882所述，它包括血纖維蛋白溶酶原的5個區域通過一胺基酸順序與t-PA或u-PA以B鏈連結，該B鏈上依次包括在殘基275和276之間的t-PA的切割位點，及t-PA的264半胱氨酸殘基，或者在殘基158至159之間的u-PA的切割位點，及u-PA的148半胱氨酸殘基。
這些雜交分子的例子包括含有一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-544/t-PA262-527，lys78和glu1變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-544/t-PA 262-257(arg275→gln)，lys78和glu1變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-514/t-PA 262-257，lys78和glu1變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-gly-ser/血纖維蛋白溶酶原84-544/t-PA 262-527，gly-3，ser1和val4變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的t-PA 1-91/pro-gly-ser/血纖維蛋白溶酶原84-544/t-PA 262-527，gly-3，ser1和val4變異體，及其混合物;或包括一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-546/u-PA 137-411，lys78和glu1變異體，及其混合物。
在一較佳實施例中，在聯合療法中用的溶血栓劑是一種被可逆阻遏的體內血纖維蛋白溶解酶，具有在美國專利號4，285，932中Smith給的含意，即一種體內血纖維蛋白溶解酶，其中對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點被一基團所阻遏，該基團可通過水解除去，水解率為水解的恆定準一級速率在10-6/秒至10-3/秒之間，在等滲含水介質中進行，PH為7.4，溫度為37℃。
當血纖維蛋白溶解酶為血纖維蛋白溶酶原激活劑，包括t-PA或尿激酶的絲氨酸蛋白酶區時，可移動的阻遏基團的一個例子是2-氨基苯甲醯基，其中3或4位被一個滷原子取代，也可任意地進一步被一個或多個弱吸電子或供電子基團取代，其中衍生物水解的恆定準一級速率在6.0×10-5/秒至4.0×10-4/秒之間，它是在一種緩衝液系統中測定的，該系統含0.05M磷酸鈉，0.1M氯化鈉，0.01%v/v的去垢劑包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇含油酸基化合物，其分子量約為1300，該緩衝液PH為7.4，溫度為37℃。
較佳的是，可逆阻遏的體內血纖維蛋白溶解酶是一個鏈激酶和血纖維蛋白溶酶原的二元複合物，更佳的是無內部鍵裂解的對甲氧苯甲醯鏈激酶/血纖維蛋白溶解酶原複合物，如美國專利號4，808，405所述，由Beecham Group Inc.以商標EMINASE銷售(一般名稱為anistreplase，以後稱作APSAC，即甲氧苯甲醯化人類血纖維蛋白溶酶原-鏈激酶-激活劑複合物，參見如J.P.Monkand R.C.Heel，1987，Drugs 3425-49)。
在一較佳實施例中，在聯合療法中用的可溶性CRl組分由核苷酸載體編碼，該載體從下述組中選出，它包括pBSCRlc，pBSCRls，pBM-CRlc，pBSCRlc/pTCSgpt及pBSCRls/pTC Sgpt，以及尤其是從上述的pBSCRlc/pTCSgpt製備的(見第12章)。
在聯合療法中所用的特定溶血栓劑(有給藥劑量和方法例子)如下鏈激酶 1.0-3.0兆單位 在30分鐘至3小時中APSAC 30單位 注射2-5分鐘t-PA(野生型) 50-150毫克 輸注6小時二鏈尿激酶 40-100毫克 輸注6小時(3-12兆單位)單鏈尿激酶 30-100毫克 輸注5小時雜交的血纖維蛋白 20-100毫克 注射或輸注溶酶原激活劑和醯基衍生物(如EP-A-0155387)血纖維蛋白 10-100毫克 注射或輸注溶酶原激活劑的突變蛋白(如EP-A-0207589)6.例子人類C3b/C4b受體(CRl)的克隆及測序在此詳述的例子中，我們就5.5千鹼基對(kb)的CRl編碼區的克隆及核苷酸順序進行了描述(Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.1651095-1112)。
10個全長5.5kb的重疊的CRl cDNA克隆從扁桃體庫中分離出，並對其整個或部分進行測序。已經鑑定了一個自該克隆5′端開始的、向下遊延伸4.7kb到中止密碼子處的長的單獨的開放閱讀框架。它代表了預計為6kb的CRl F異型的編碼序列的80%。還確定了三個450個胺基酸的串聯的長同源重複(LHRs)。胰蛋白酶肽順序分析為CRl F異型存在第四個LHR提供了證據。各LHR之間的胺基酸的同一性範圍為自第一及第三個重複之間的70%，到第一個重複及第二個重複的氨基末端的250個胺基酸之間的99%。每個LHR包括七個60-70胺基酸的短一致重複(SCR)，類似於其它C3/C4結合蛋白，諸如補體受體2型、因子B及H、C4結合蛋白及C2的SCRs。有兩個另外的SCRs將LHRs與25個胺基酸的單一的跨膜區域相連接因而，CRl的F異型可能含有至少30個SCRs，其中的個23已被測序。預計每個SCR形成一個三環結構，四個保守的半胱氨酸形成二硫橋。作為一種半堅固結構，該線狀排列的30個SCR可自質膜伸出1，140埃，並且可以促進CRl與位於免疫複合物及微生物細胞壁的空隙中的C3b及C4b的作用。43個殘基的羧基末端胞質區域含有一個六個胺基酸的序列，它與被蛋白激酶C磷酸化的表皮生長因子受體序列是同源的。
6.1.材料及方法6.1.1.CRl胰蛋白酶肽的分離及測序CRl是用連續的Matrex紅A及YZ-1單克隆抗體親和層析法從洗過的人類紅細胞上提純的(參見Wong，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82303)。胰蛋白酶肽是用所述的連續梯度及常液反相HPLC製備並提純的(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。胰蛋白酶肽的分析是用一個470 A蛋白質測序儀(Applied Biosystems，Inc.，Foster city，CA)進行的，而對每個降解循環的分析是通過採用一個120PTH胺基酸分析儀(Applied Biosystems，Inc.)進行的。
6.1.2.cDNA克隆及基因組克隆的分離如上所述，用人類扁桃體poly(A)+RNA在λgtll中構建了一個cDNA庫(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。用RNA印跡雜交法，使扁桃體(tonsil)供體對於CRl的F等位基因為同型接合的(id)。在瓊脂糖凝膠上進行cDNA選擇，使之在克隆之前包括2至7kb的組份。該庫的起始容量為每100ng cDNA有4.5×106重組子，該庫在大腸桿菌Y1088株中擴增。該庫的篩選(Maniatis，T.，et.，al.，1982，Molecular Clonig，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)採用CRl探針、CRl-1(ATCC保藏號第57330號(含CRl-1質粒的大腸桿菌)、第57331號(純化的CRl-1DNA)及CRl-2(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)，其已通過缺口轉移進行放射標記達比活性為2-8×108cpm/μg。雜交過程是在50%甲醯胺(使用5×SSC(1×SSC15mM檸檬酸鈉，150mM氯化鈉))，在43℃下進行的，而將濾紙在60℃下於0.2×SSC中洗滌，這些條件不能用於檢測CR2 cDNA克隆(參見Weis，J.J.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835639)。在進行限制酶圖譜及DNA序列分析之前先對陽性克隆進行兩次噬菌斑純化。
用由Sau3 AI部分酶切人類白細胞DNA所產生的15-20kb片段，在EMBL-3中組建一個基因組庫。最初的容量為1.2×106，並將該庫在大腸桿菌P2392株中進行擴增。該庫同樣用cDNA探針CRl-1及CRl-2進行篩選(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。
6.1.3 DNA順序分析cDNA克隆的限制性片段被亞克隆λM13mp18或M13mp19並用雙脫氧核苷酸鏈終止法(參見Sanger F.，et al.，1977 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)進行測序。通過首先用核酸外切酶Ⅲ產生預定的缺失突變子的方法，全部地或部分地對一些克隆進行測序(參見Henikoff，S.，1984，Gene 28351)。每個區域在兩條鏈上都進行測序，在大多數情況下，每個區域在由兩個獨立分離的cDNA克隆(圖2)所組建的M13亞克隆上進行測序。在對序列數據進行分析時，採用了威斯康星大學遺傳學計算機組設備。
6.2 結果6.2.1CRl基因的核苷酸序列用從CRl cDNA克隆、λT8.3中得的CRl-1及CRl-2探針對經大小選擇的扁桃體cDNA庫進行篩選(Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。從1.5×106個重組體中確定出15個陽性噬菌體，而其中的13個為不同的克隆。對其中10個進行了限制酶圖譜分析，並用雙脫氧核苷酸鏈終止法進行全部的或部分的測序。cDNA克隆根據其重疊序列的一致性(圖2)而排列成直線，並且已發現其長為5.5kb(圖3)。已經確定自該cDNA克隆的5′端起一直延伸至下遊的4.7kb處的一個終止密碼子為單一的長的開放閱讀框架。在該庫中CRl的編碼順序預計為6kb，依據為該非糖基化的受體的估計分子量為220，000(參見Wong，W.W.，et al.，1983，J.Clin Invest.72685)。因而這些克隆佔了所估計的編碼序列的約80%。
克隆T49.1及T55.1在其5′端含有編碼序列，表明附加的5′編碼及非編碼序列仍待確定。在3′區域，重疊克隆T8.2、T43.1及T87.1含有由各個克隆中的相同序列所編碼的跨膜及細胞質區。延伸到最遠3′端的克隆T8.2含有一個無poly(A)序列的807個鹼基對的不翻譯序列，與克隆T6.1及T55.1中所發現的序列比較，克隆T8.3在1，406-1，497之間缺失91bp的核苷酸，而克隆T40.1在1，498-1，507之間缺失9-bp的核苷酸。這些缺失出現在具有與5′拼接位點同源序列的區域，可能表示這是mRNA中的拼接錯誤。克隆T49.1及T55.1在開放閱讀框架的147及148核苷酸之間含有一個110bp的插入片段(圖3)。該序列據判斷為內含子的一部分，因為它不與扁桃體poly(A)+RNA印跡雜交，它含有一個5′拼接位點(參見Breathnach，R.，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.754853)(圖3)，它在CRl基因組克隆中位於cDNA序列的側翼，而且，它還移動了讀碼。克隆T9.4在3′端含有0.88kb的插入順序，該插入順序不與扁桃體poly(A)+RNA印跡雜交。
6.2.2CRl的核苷酸及胺基酸順序分析CRl的核苷酸順序(圖3)的點陣(Dot)分析揭示出有兩種類型的內在同源性(圖4)。第一類型的內在同源性如粗黑的實線所示，在1.35kb中存在三個正向的高度同源的串聯重複。這些核苷酸順序編碼CRl的長同源重複(LHRs)。第二類型的重複由平行的虛線所示，指明具有較低同源性的區域。每隔190-210個核苷酸這些序列總要出現，並且編碼CRl的短一致重複(SCRs)。
從cDNA順序推斷的胺基酸序列如圖5所示，這三個LHR分別稱為LHR-B、LHR-C及LHR-D，它們在圖中被排成直線以示其同源性。LHR-B自殘基1延伸至殘基438，LHR-C相應於殘基439-891，而LHR-D自殘基892延伸到殘基1，341。LHR-C的殘基451-694 99%相同於LHR-B的殘基1-244，然而與LHR-D相應殘基只有61%相同。相反，LHR-C的殘基695-891 91%相同於LHR-D的殘基1，148-1，341，而與LHR-B相應區域只有76%相同。由此看來，LHR-C為一個雜合體，包括的序列與LHR-B的前半部，及LHR-D的後半部非常同源。
LHRs後接兩個不重複的SCR，即為一個25殘基的疏水片段及一個與該SCR無序列同源性的43個胺基酸COOH末端區域(圖5)。
CRl編碼序列的5′的1.3kb的片段為第四個LHR，即LHR-A(參見以上的圖1及以下的第七章)。該結果由紅細胞CRl的胰蛋白酶水解肽的分析來支持。十個胰蛋白酶水解肽具有與來自於cDNA克隆的胺基酸序列相同的序列(表Ⅰ)表Ⅰ發現於衍生的胺基酸序列＊中的CRl胰蛋白酶水解肽肽號碼 胺基酸序列在衍生序列中殘基數66VDFVCDEGFQLKGS-A 330-34528GAASL----QG-WSPEAP 732-749,1,185-1,20249------------IFC-NP-AIL 805-826,1,258-1,27935CQALNKWEPELPSCSR 228-243,678-69341c DKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLR 260-28134b AV-YTCDPHPDRGTSFDLIGESTIR393-41744d VCQPPPEILHG 694-704,1,147-1,15754d VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152-179,602-62957b YECRPEYYGRPFS19-31,469-48139b LIGHSSAECILSGNAA 85-100＊發現於衍生的胺基酸序列中的來自人類紅細胞CRl的胰蛋白酶水解肽。
列於右手一欄內的數字範圍表明該肽位於衍生胺基酸序列中的位子。在肽66、28及49中的每個破折線表明在那一輪中已確定多個殘基。而在肽34b中的破折線表明在那一輪中已確定無殘基。
每個LHR包括七個60-70胺基酸SCR，它們是C3及C4結合蛋白(C4bp)族的特徵(圖6A)。通過在線性排列的序列(圖6A)中引入空間，可以觀察到CRl的23個SCRs中最大的同源性。概括起來在每個重複中平均65個殘基中共有29個保守。有六個殘基存在於所有的SCRs中四個半胱氨酸位於相似的相關位置上，這一點表明它們各自涉及關鍵的二硫鍵，及第二個半胱氨酸後面的色氨酸及第二個甘氨酸。(圖6A)。採用周氏(chou)及範斯曼(Fasman)的規則(參見chou，P.Y.and Fasman，G.D.，1974，Biochemistry 13222)對那些恆定的半胱氨酸之間順序的二級結構的分析，作出的預言為，它具有較高的形成β-摺疊的機率而具有較低的形成α-螺旋的機率。對兩種CRl基因組克隆，即2.38(圖6B)及2.46克隆的序列分析表明，SCR-14(圖6A)是由一個單一的外顯子編碼的，而SCR-23的COOH的末端相應於一個外顯子的末端。因而，CRl的SCRs可以被不相連的外顯子編碼，正如在B因子的SCRs(參見Campbell，R.D.and Bentley，D.R.，1985，Immunol.Rev.8719)及在1L-2-R的SCRs(參見Leonard，W.J.，et，al.，1985，Science 230633)所表現的那樣。
將CRl SCRs的相同序列與具有該特徵性結構(圖7)的超家族(Superfamily)的其它成員的SCRs相比較。這類成員不僅包括具有C3/C4結合功能的蛋白，如CR2(參見Weis，J.J.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835639)、C4bp(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133)、H因子(參見Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.1363407)、B因子(參見Morley，B.J.and Campbell，R.D.，1984，EMBO J.3153;Mole，J.E.，et al.，1984，J.Biol.Chem.2593407)及C2(參見Bentley.D.R.and Porter，R.R.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811212;Gagnon，J.，1984，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.306301)，而且還包括那些還不知其有該功能的蛋白，諸如白細胞介素(interleukin)2受體(參見Leonard，W.J.，et.，al.，1985，Science 230633)、β2-糖蛋白I(參見Lozier，J.，J.et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)、Clr、(參見Leytus，S.P.，et al.，1986，Biochemistry 254855)、觸珠蛋白α鏈(參見Kurosky，A.，et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.773388)，以及ⅩⅢb因子(參見Ichinose，A.，et al.，1986，Biochemistry 254633)。除了觸珠蛋白缺乏第三個半胱氨酸外，半胱氨酸殘基在所有蛋白的SCRs中都不變化。色氨酸同樣也保持不變，但β2-糖蛋白I中的第五個SCR及ⅩⅢb因子中的兩個重複為例外。其它雖保守但並不在每一個SCR中都存在的殘基趨向於聚集在半胱氨酸周圍。在B因子及C2中僅有一個游離的巰基(參見Christie，D.L.and Gagnon，J.，1982，Biochem.J.201555;Parkes，C.，et al.，1983，Biochem.J.213201)而在β2-糖蛋白I的SCRs中第一個半胱氨酸與第三個形成二硫鍵，而第二個與第四個形成二硫鍵(參見Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)。
在衍生的CRl的胺基酸序列中，存在17個N-連接寡糖的潛在位點，而且它們均位於細胞外區域(圖6A)。在存在與不存在衣黴素的情況下合成的CRl在分子量上的差異(參見Lublin，D.M.，et al.，1986，J.Biol.Chem.2615736)及對氨基葡萄糖含量的分析(參見Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232883)表明僅有6-8N連接複合寡糖存在，說明潛在位點並未全部用上。例如，肽41C中已確定了衍生的胺基酸序列(圖5)的第263殘基位上為天冬醯胺(表Ⅰ)，表明在該位點不存在糖基化作用。相反，在肽34b上未經確定的胺基酸也許在第395殘基上對應於一個糖基化的天冬醯胺。
在5.5kb cDNA上的已確定的唯一的不重複的CRl序列位於COOH末端區域。對於該區域的二級結構的分析確定了有一個單一的25個殘基的推定的跨膜片段，它具有很強的疏水性，從而具有很高的形成α-螺旋的潛力(圖5)。該序列之後緊跟著四個帶正電的殘基，這是許多膜蛋白的特徵。推測的CRl的細胞質區域包括43個殘基，含有一個六個胺基酸的序列，即VHPRTL，該序列與作為在表皮生長因子(EGF)受體及erb B致癌基因產物的蛋白激酶C的磷酸化作用位點的VRKRTL有同源性(參見Hunter，T.，et al.，1984，Nature 311480;Davis，R.J.and Czech，M.P.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.821974)。扁桃體CRl的細胞質區域中不存在酪氨酸殘基。
6.3討論通過對重疊cDNA克隆進行測序，已經獲得CRl的F異型初級結構的約80%。在這個分析中發現的最為不尋常的CRl結構特點為，存在450個胺基酸的正向串聯LHRs，預計有四個出現在長約2，000殘基的多肽鏈CRl的F異型中(參見Wong，W.W.，et al.，1983 J.Clin.Invest.72685;Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232883)。這些LHRs中的三個已被克隆並測序，而其中的第四個存在的依據已由胰蛋白酶肽的分析而提供。每個LHR含有七個SCRs，它們是其它C3/C4連接蛋白的基本結構成分。在每個SCR中都有四個保守的半胱氨酸，第1與第3及第2與第4個半胱氨酸之間可能形成二硫鍵(參見Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)，還有，保守的胺基酸諸如脯氨酸、甘氨酸及天冬醯胺常常出現於β-摺疊中(參見Rose，G.D.，et al.，1985，Adv.Protein Chem.371)，所有這些情況導致這樣一個推斷，即SCR是借二硫鍵維持而形成的一個三環結構(圖8)。對半胱氨酸的這一作用的推測，通過以下的發現得到支持，即經胰蛋白酶溫和處理的CRl(參見Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232883)及H因子(參見Sim，R.B.and Di Scipio，R.G.，1982，Biochem.J.205285)當用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)在非還原條件下進行分析時發現它們作為一個完整的分子進行遷移，而當還原之後則轉化成多個胰蛋白酶片段。
預聯的重複的SCRs系列將形成一個延長的結構(圖8)，與對H因子及人類C4bp的各個亞基的預計一樣(參見Sim，R.B、and Di Scipio，R.G.，1982 Biochem.J.205285;Whaley，K.and Ruddy，S.，1976 J.Exp.Med.1441147;Dahlback，B.，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.803461)。對於C4bp亞基進行的電子顯微鏡的研究表明其大小為300×30埃(參見Dahlback，B.，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.803461)。因為每個亞基是由8個SCRs組成的(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133)，一個單獨的SCR的大小計為38×30埃。假設CRl的各個SCR有相近的大小並且F異型具有30個SCR，受體可以自細胞膜向外伸展至1，140埃的距離。與對CRl結構的預言相一致的是早先的發現，即結合於中性粒細胞上的CRl的鐵蛋白標記抗體常常與質膜的外層小葉相距500埃(參見Abrahamson，D.R.and Fearon，D.T.，1983，Lab.Invest.48162)。CRl的這種延伸的結構可以促進載有受體的細胞與共價地結合於相對地不易接近的免疫複合物及微生物細胞表面上的位點的C3b發生作用。
SCR是主要的也許是唯一的CRl的細胞質外的成分的發現為受體與H因子及C4bp的緊密關係提供了結構方面的依據，H因子和C4bp這兩個原生質蛋白是由大量的SCR或主要由SCR組成的(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133，Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.1363407)。CRl最初是作為一個具有類H因子活性的紅細胞膜蛋白用去垢劑溶解法分離的(參見Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867)，隨後發現當其位於原生質膜上時具有H因子及C4bp的調節功能(參見Lida，K.and Nussenzweig V.，1981，J.Exp.Med.1531138)。通過對CRl、H因子、及C4bp的結構多態性的遺傳分析，表明編碼這三種蛋白的基因是相連的(參見deCordoba，R.，et al.，1985，J.Exp.Med.1611189)，最近，通過原位(in situ)雜交作用及體細胞雜合體的分析已經顯示出該連接組及結構上相關的受體CR2的位置位於1號染色體長臂q32帶(參見Weis，J.H.，et al.，1987，J.Immunol.138312)。在本研究之前，這些蛋白結構上關係的依據僅是這些蛋白質的胺基酸組成明顯相似(參見Wong，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82303)。因而，本發明在CRl中至少有23個SCR的發現為受體與具有類似功能的蛋白，H因子及C4bp之間的結構關係(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133;Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.1363407)、和為受體與B因子及C2的Ba及C2b片段之間的關係提供了直接而正式的證據，B因子及C2分別為與C3b和C4b形成酶複合物的成分(參見Morley，B.J.and Campbell，R.D.，1984，EMBOJ.3153;Mole，J.E.，et al.，1984，J.Biol.Chem.2593407Bentley，D.R.and Porter，R.R.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811212;Gagnon，J.，1984，Philos，Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.306301)。然而，SCR也同樣可見於幾個非補體蛋白中(參見Campbell，R.D.，and Bently，D.R.，1985，Immunol.Rev.8719;Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640;Leytus，S.P.，et al.，1986，Biochemistry 254855;Kurosky，A.，et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.773388;Ichinose，A.，et al.，1986，Biochemistry 254633)(圖7)，這表明它並不一定代表一個C3/C4結合結構。
在那些具有SCR的蛋白中，CRl在將該種基本結構及遺傳單位組織到較高的有序的LHR的結構單位方面是獨特的。對於與S異型表達相關的基因組DNA的14.5kb BamHⅠ片段的分析表明，在CRl中至少有一個重複基因組單位是一個含有編碼至少五個SCR的外顯子及與其鄰側相接的內含子的延伸了的DNA片段(參見Wong，W.W.，et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)。這類研究還表明與F等位基因中存在的數目相比，S等位基因含有這類基因組單位的額外拷貝。這一觀察連同胰蛋白酶肽圖譜的研究(參見Nickells，M.W.，et al.，1986 Mol.Immunol.23661)及LHR代表了一個40-50KD的肽這一發現，使我們可以預言，相對於估計在F異型(分子量為250，000道爾頓)中有四個LHR，而在S異型(290KD)中具有一個附加的LHR。
除了提供重複方面的依據之外，LHRs的序列還表明CRl基因內存在著轉變。LHR-B與LHR-D在全長範圍內有67%的同源性，而LHR-C與LHR-B在NH末端四個SCR中有99%的同源性，與LHR-D在COOH末端三個SCR中有91%的同源性。在這個雜合LHR起源時這樣的結構不可能通過相同親代等位基因之間的一次單一的重組而引起，而是雜合的LHR可能通過基因轉變而產生(參見Atchison，M.and Adesnik，M.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.832300)，即一個LHR-C前體中的序列被存在於LHB-B或LHR-D中的序列取代了。三個LHRs中近乎完全相同的和精確的線性排列的同源順序(圖5)同樣可能採用一個涉及基因轉變的機制來維繫。對編碼該LHRs的CRl基因的那些片段的插入順序之間的同源性程度進行分析，可以確定是基因轉變還是基於功能性限制的選擇嚴格地限制了順序的差異。
儘管原先的研究表明CRl為單價的(參見Wilson，J.G.，et al.，1982，N.Engl.J.Med.307981)，而每一個LHR可能代表一個單獨的C3b/C4b結合區域，從而使受體成為多價的，並且適應於與載有多個C3b及C4b分子的複合物結合。或者，各種LHR能夠分別地連結C3b及C4b，(見下文，第9章)從而為在CRl中的H因子及C4bp結合活性提供結構基礎。結果，如假設的結構模型(圖8)所示，CRl的LHR可以代表使CRl自質膜向外延伸的結構區域，以及正如H因子中所發現的，NH2末端區域的SCR結合C3b及C4b(參見Sim，R.B.and Di Scipio，R.G.，1982，Biochem.J.205285;Alsenz，J.，et al.，1984，Biochem.J.224389)。
用佛波醇酯激活蛋白質激酶C誘導了嗜中性粒細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞(參見Changelian，P.S.and Fearon，D.T.，1986，J.Exp.Med.163101)中的CRl的磷酸化作用，在43個胺基酸的CRl細胞質區域具有一個與在表皮生長因子受體中被蛋白激酶C磷酸化的位點同源的序列(參見Hunger，T.，et al.，1984，Nature 311480;Davis，R.J.and Czech，M.P.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.821974)。然而，存在於扁桃體庫中三個獨立克隆中的這個細胞質順序，最有可能是在蛋白激酶C激活後未被磷酸化的B細胞CRl(參見Changelian，P.S.and Fearon，D.T.，1986，J.Exp.Med.163101)。
7.例子含有第四個長同源重複的CRl 5′DNA序列對於CRl的部分cDNA順序的分析顯示了一種結構，在該結構中有三個450個胺基酸的LHR，即LHR-B、LHR-C、LHR-D，它們各自含有七個具有C3/C4結合蛋白特徵的65個胺基酸的一致短重複(SCR)(參見上文第6章節)。在此所述的例子中，我們將通過對5′cDNA克隆測序來對第四個氨基末端LHR，即LHR-A的克隆核苷酸序列進行描述(參見Klickstein，L.B.，et al.，1987，Complement 4180)。對LHR-A的分析顯示，在五個3′SCR中它與LHR-B的同源性有99%，而在兩個5′SCR中僅有61%的同源性。
7.1材料及方法7.1.1 cDNA庫的構建一個選擇性預備的cDNA庫，λHH，是用自DMSO誘導(induced)細胞中純化的3μg poly(A)+RNA構建的(有下列修飾)(參見Chirgwin，J.M.et al.，1979，Biochemstry 185290;Aviv，H.and Leder，P.，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.691408;Ausubel，F.M.，et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York)。一個LK35.1，35-mer寡核苷酸，即5′-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3′用以代替寡(dT)12-18，並且在第二鏈合成中加入40μCi αP-dCTP。三分之一的cDNA被克隆進入λgtll，並且如上文的第6.1.2所述自人類扁桃體poly(A)+RNA中構建了一個cDNA庫。獲得了750，000個獨立的重組子。
7.1.2克隆的分離、探針及DNA順序分析用於篩選cDNA庫的探針為CRl-1(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)(ATCC accession no.57331)、CR-2(Wong，W.W.，et al.，supra)、CRl-4(參見Wong，W.W.et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)、及CRl-18，及一個252bp Sau 3AI片段，它來自cDNA克隆λH3.1的相應於圖1中核苷酸101-352的0.5kb EcoRⅠ片段。在高度嚴格的條件下，CRl-18僅與編碼LHR-A的NH2末端SCR或者信號肽的cDNA克隆雜交。在將片段亞克隆入M13mp18及M13mp19之後(參見Yanisch-Perron，C.et al.，1985，Gene 28351)，通過雙脫氧核苷酸技術(參見Sanger，F.，et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)對cDNA克隆插入部分進行測序。
7.2結果一個特別預備的λgtll cDNA庫，即λHH含有7.5×105個重組子，是從DMSO誘導的HL-60細胞的poly(A)+RNA合成的cDNA。這些細胞僅僅表達那些預計有四個LHR(參見Lapata，M.A.，et al.，1984，Nucl.Acids Res.125707)的CRlF異型(參見Lublin，D.M.，et al.，1986，J.Biol.Chem.2615736)。引物，LK35.1，為一個反意35-mer，相應於圖3所示的CRl部分的cDNA順序的896-930核苷酸部分。這個寡核苷酸顯示在反轉錄條件下可與LHR-B、LHR-C及LHR-D雜交。在用CRl-1及CRl-4的混合CRl cDNA探針進行篩選的未擴增的含有3.8×105個重組噬菌體的平板上確定了250個陽性克隆。挑出38個陽性克隆並進行噬菌斑提純。來自這些克隆的經EcoRⅠ酶切的DNA的Southern印跡是用23-mer寡核苷酸，KS23.1，即5′-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3′，也就是相應於圖3的部分CRl cDNA序列的核苷酸763-785來進行篩選。該探針在高度嚴格的條件下，僅在編碼LHR-B的順序的一個位點進行雜交，而不與LHR-C或LHR-D的編碼序列雜交。克隆λH7.1(圖9)的插入部分含有三個EcoRⅠ片段，1.0kb、0.9kb及0.4kb，其中兩較大的片段與KS23.1雜交，這一點表明該克隆含有編碼LHR-A的3′的七分之五及LHR-B的全部順序。這一發現證實了LHR-A是與LHR-B是高度同源的。克隆λH3.1(圖9)含有一個單獨的KS23.1-陽性的1.0kb EcoRⅠ片段，及一個在高度嚴格的條件下與CRl-4有弱雜交的5′0.5kb的片段。據認為該克隆含有構成完全LHR-A的額外的5′序列(5′Sequence completing LHR-A)，包括SCRs-1、SCRs-2及0.1kb的上遊順序。所有與CRl-1雜交的剩餘的36個克隆，均不能用探針CRl-18檢測到，該探針為不與編碼LHR-B、-C或-D的序列雜交的來自克隆λH3.1的0.5kb EcoRⅠ片段的252bp的Sau 3AⅠ片段。
λH3.1的DNA序列分析揭示了開放閱讀框架持續至cDNA的5′末端，這表明該克隆不延續至翻譯起始位點。因而，用探針CRl-18重新篩選cDNA庫，即λHH及λS2T，並分別找到了一個克隆λH10.3及λT109.1。這些與CRl-18雜交的克隆的EcoRⅠ片段和來自克隆λH3.1及λH7.1的插入部分一樣被進行測序，該組成的序列列於圖1中，在圖1中數碼為1531號之後的核苷酸為圖3中的核苷酸＃1。來自HL-60的cDNA克隆的重疊序列與扁桃體庫是相同的。
緊靠LHR-A的上遊處的克隆λH10.3及λT109.1含有相同的編碼41個胺基酸，包括一個與ATG相配的被認為是真核生物翻譯起始位點的(圖10)NNA/GNNATGG一致順序(參見Kozak，M.，1986，Cell 44283)的推定的疏水前導序列(參見Von Heijne，G.，1986，Nucl.Acids Res.144683)。位於所選的ATG上遊六個密碼子處，且在一個框架內終止密碼子下遊處的第二個ATG與該一致序列的匹配很差。CRl的該前導序列的頭三個胺基酸為MGA，與所報導的CR2的一樣。這兩個克隆的序列偏離ATG的上遊，而來自克隆λ10.3的序列據信代表了一個插入序列的一部分，這已在上文的第6章節中對CRl cDNA的其它克隆進行了敘述。
預計信號肽的酶切(參見Von Heijne，G.，1986，Nucl.Acids Res.144683)將發生於gly-46及gly-47之間，這一點表明，被阻斷(blocked)的CRl NH2-末端(參見Wong.，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82303;Holeis，V.M.，et al.，1986，Complement 363)可能是由於吡咯烷酮醯胺的存在引起的。這些克隆中LHR-ANH2-末端的頭兩個SCR與LHR-B的相應區域僅有61%的相同。而LHR-A的SCRs3-7與LHR-B的相應SCRs(圖10)有99%的相同。將LHR-A與LHR-C相比較顯示，僅僅是各自的第三及第四個SCRs才有較高的同源性(99%相同)。LHR-A及LHR-D僅有68%整體同一性，在每個LHR的第六個SCR之間的最高同一性為81%。因而，CRl5′cDNA序列的完全測定表明，F異型由2039個胺基酸組成，包括41個胺基酸信號肽、四個各有七個SCRs的LHRs、兩個額外的COOH-末端SCRs、一個25殘基的跨膜區及一個43個胺基酸的細胞質區域。有25個潛在的N-連接的糖基化位點。
7.3討論CRl的F異型的信號肽及NH2-末端的初級結構，已通過對5′cDNA克隆的分離及測序而推斷出來。CRl序列的高度重複的特性，使之成為製備及鑑定編碼受體該區域的cDNA克隆的方法發展的關鍵。以一個已知在反轉錄條件與LHR-B、-C及-D雜交的35-mer寡核苷酸為引物，製備一個cDNA庫。該引物可能也會與被預測與LHR-B具有高度的同源性的LHR-A發生雜交(參見上文第6章節)。合適的cDNA克隆是通過採用另一個在嚴格條件下僅與LHR-B雜交的寡核苷酸，KS23.1，從而使找到5′cDNA克隆的機率提高的方法來檢出的。發現兩個克隆差不多包括了CRl的所有的殘餘順序，其中一個Sau3AI片段，CRl-18，具有十分獨特的順序可用於鑑定其它5′克隆(圖9，10)。
一個來自LHR-A5′區域的250bp的探針，CRl-18，在嚴格的條件下不僅與7.9kb及9.2kb的CRl轉錄產物雜交，而且與人類扁桃體RNA的2kb的轉錄產物雜交。這種交叉雜交mRNA未在採用來自其它的LHRs的CRl cDNA探針時發現，也未在來自二甲基亞碸誘導的HL-60細胞及HSB-2T類淋巴母細胞的northern印跡中發現。因而，CRl含有與兩種附加的B細胞蛋白同源的序列，其一種是這種新確定的mRNA編碼的，以及CR2。
8.例子人類CRl重組子的表達如上文所述，人類CRl cDNA克隆已被分離，其長為7.0kb，包含一個編碼2039胺基酸(圖1)的開放閱讀框架。假設的受體的前體形式包括一個41個胺基酸的信號肽、四個450個胺基酸的各含七個短一致重複(SCRs)的長同源重複(LHRS)、兩個65個胺基酸的COOH末端SCRs、一個25個胺基酸的跨膜區域，以及一個43個胺基酸的細胞質區域。因而，該CRlF異型含有30個SCRs。NH-末端LHR(LHR-A)(見上文的第7章節)在頭兩個SCR中與LHR-B的相應區域有61%的同源性，而在COOH-末端五個SCRs中有99%的同源性。八個CRl cDNA克隆的限制性片段，拼接而形成一個全長的6.9kb的結構，並且置於小鼠金屬硫因啟動子的下遊或巨大細胞病毒啟動子的下遊，隨後轉染入L(小鼠)細胞或者COS(猴)細胞中。重組細胞表面CRl用間接放射免疫測試法及免疫螢光法來檢測。在僅用親代載體(CRl-)轉染的細胞上未檢測出抗原。用抗-CRl單克隆抗體對轉染的、表面用125I標記的COS(猴)細胞進行免疫沉澱測試，以及用非還原的、十二烷基磺酸鹽(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳加以分析，得出一種與人類紅細胞的F異型共遷移的190，000道爾頓的區帶，對於正確分子量的重組CRl抗原的表達(參見Klickstein，L.B.，et al.，1988，FASEBJ.2A1833)為該cDNA含有人類CRl完整的編碼序列提供了證據。
8.1 含有完整的CRl編碼序列的質粒pBSABCD的構建我們在此描述一個編碼全長(SCRs1-30)CRl蛋白的質粒載體pBSABCD的構建。
將來自cDNA克隆λT8.2的2.3kb插入部分(參見Klickstein，L.B.，et al.，1987，J，Exp.Med，165105;see Section 6，supra)作為一個EcoRⅠ片段亞克隆至pUC18中，以使5′末端靠近質粒多聚接頭中的HindⅢ位點。這質粒稱為p188.2。p188.2用ApaⅠ及HindⅢ酶切，對較大的4.7kb的含有CRl序列自SCR26至3′非翻譯區及載體序列的片段進行膠提純。
來自cDNA克隆λT50.1(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，J.Exp.Med.1651095 see Section 6，supra)的插入部分作為一個EcoRⅠ片段亞克隆入M13mp18。該噬菌體稱為18R50.1。來自該克隆的複製型DNA用HindⅢ及ApaⅠ進行酶切，分離其中含有CRl SCRs18-25的1.45kb的片段，並連接至來自p188.2的4.7kb的片段上，再將該連接產物轉化入大腸桿菌DH5α中。該質粒稱為p8.250.1。
將來自cDNA克隆λT8.3(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 227711)的0.75kb及0.93kb的EcoRⅠ片段亞克隆入質粒pBR327。這些亞克隆分別稱為pCRl-1及pCRl-2，它們分別含有11-14SCRs及17-21SCRs。EcoRⅠ插入部分被各自從中提純出來。用SamⅠ酶切0.75kbpCRl-l片段，隨後將其連接到用EcoRⅠ及SmaⅠ切開的pUC18DNA上去。分離出一種具有0.5kb的相應於SCRs12-14的插入部分的亞克隆p181-1.1。用HindⅢ酶切0.93kb pCRl-2的片段，並連接到用EcoRⅠ及HindⅢ切開的pUC19上，並且分離出一種含有0.27kb的包括SCRl7的插入部分的亞克隆p191-2.1。
用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λT6.1(參見上文第6章節、Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.1651095;Wong，W，W，et al.，1987，J.Exp.Med.1641531)並將相應於CRl SCRl5及16的0.37kb的片段亞克隆λpBR322。該克隆稱為pCRl-4。用EcoRI及ScaⅠ酶切克隆p181-1.1，並且分離出1.4kb的片段。用EcoRⅠ及ScaⅠ酶切克隆p191-2.1(參見Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.1651095;see Section 6，supra)，分離2.0kb的片段，並連結到來自p181-1.1的1.4kb片段上，隨後將混合物轉化入大腸桿菌DH5α中。獲得的質粒稱為pl-11-2。質粒pl-11-2用EcoRⅠ進行酶切，通過連接插入來自pCRl-4的0.37kb的插入片段。將獲得的質粒用於轉化大腸桿菌DH5α。
選擇一個含有0.39kb的BamHⅠ-HindⅢ片段的亞克隆。該質粒稱為p142，含有CRl SCRs12-17。將來自p8.250.1的3.5kb的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段轉移到pGEM3b中。該質粒稱為pG8.250.1。提純來自p142的1.2kb HindⅢ片段，並且連接到已用Hind Ⅲ切開的pG8.250.1上。選擇一個含有2.4kb的PstⅠ-ApaⅠ插入部分的亞克隆，隨後選擇正確的方向。該質粒稱為pCD，含有自SCRl2直至3′端的CRl序列。
用PstⅠ切斷cDNA克隆λ5′7.1(參見Klickstein，L.B.，et al.，Sept.1987，Complement 4180see Section 7，supra)，隨後分離出相應於SCRs6-12的1.35kb的片段，再連接到PstⅠ酶切的pCD上。轉化該混合物，隨後選擇一個含有1.35kb及1.1kbHindⅢ片段的亞克隆。該克隆稱為pBCD。
用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λ5′3.1(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4180see Section 7，supra)並將其連接到EcoRⅠ酶切的pUC18上。分離出一個含有1.0kb相應於SCRs3-7的插入部分(該插入部分用凝膠提純)的亞克隆p3.11-1。用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λ5′10.3(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4180;see Section 7，supra)，並將含有SC Rsl及2的0.63kb插入部分亞克隆入pUC18。該克隆稱為p10.3.5。質粒p10.3.5用EcoRⅠ進行部分酶切，並分離出一個相應於線性質粒的3.4kb的片段，隨後，連接到來自p3.11-1的1kb的片段上。在正確的插入位點及方向上含有一個1.3kb的PstⅠ片段的亞克隆pLA被挑出。
用EcoRⅠ酶切cDNA克隆λT109.4(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4180;see Section 7，supra)，並亞克隆入pUC18。選擇一個含有相應於5′非翻譯區直至前導序列及SCRs1及2的0.55kb的EcoRⅠ片段的亞克隆。用PstⅠ及BspMⅡ酶切質粒p109.4，並且分離出一個含有載體、前導序列及SCRl的3.0kb片段。將該片段連接到含有SCRs2-5的來自pLA的0.81kbPstⅠ-BspMⅡ片段上。該新的質粒稱為pNLA。質粒pNLA先用EcoRⅠ部分酶切再用PstⅠ完全酶切，將一個含有自前導序列直至SCR5的CRl序列的1.1kb的EcoRⅠ-PstⅠ片段分離出來，並連到pBluescript KS+上(Stratagene，San Diego，CA)，以在cDNA的5′端上放置一個XhoⅠ位點。該質粒稱為pXLA。
用EcoRⅤ酶切質粒pBCD，而後用PstⅠ部分酶切，然後分離出一個含有自SCR6直至3′非翻譯區的CRl序列的6.0kb的PstⅠ-EcoRⅤ片段，接著將其連接到用PstⅠ及SmaⅠ酶切過的pXLA上。所獲的含有完整的CRl cDNA編碼序列的細菌表達質粒稱為pBSABCD。
8.2.質粒piABCD，一種含有全部CP1編碼順序的哺乳動物表達載體的構建和鑑定用XhoⅠ和NotⅠ酶切pBSABCD質粒，在業已用這些限制性內切酶酶切的表達載體CDM8(Seed，B.，1987，Nature 329840-842)的4.4kb片段中的CMV啟動子的下遊連接插入部分。所得的結構稱之piABCD(圖11)。另外，在業已用這些限制性內切酶酶切的表達載體pMT.neol中的金屬硫因啟動子的下遊連接6.9Kb XhoⅠ-NotⅠ片段。所得的結構稱之pMTABCD(圖11)。
通過用C1、C2和125I-C3先後處理EAC4b(lim)(Diamedix)，隨後在37℃下、在含有EDTA 40mM的明膠凡羅那緩衝鹽溶液中孵育60分鐘，製備用兔的抗體(EA)及少量的C4b[EAC4b(lim)]和每個細胞[EAc C4b(lim)，3b]12，000cpm的125I-C3b致敏的羊紅細胞。另外，把經甲胺處理的C3[C3(ma)]共價連接到用3-(2-吡啶基二硫代)丙炔酸N-羥基丁二醯亞胺酯(Sigma)處理的羊E(紅細胞)上(Lambris，J.D.，et al.，1983，J.Immunol.Methods 65277)。用純化的C4製備EAC4b(Hammer，C.H.，et al.，1981，J.Biol.Chem.2563995)。
採用DEAE(二乙胺乙基)-葡聚糖法，把piABCD和pMTABCD轉染入COS(猴)細胞中。在經轉染的細胞表面上，用抗CRl單克降抗體YZ-1免疫螢光法;和由125I標記細胞的免疫沉澱法及非還原性SDS-PAGE，(它顯示一種具有與由F異型純合的供體的人的紅細胞免疫沉澱的CRl的相同泳動速度的蛋白質)(Wong，W.W.，et al.，1983，J.Clin.Invest.72685);以及通過用C3b包被的羊紅細胞形成玫瑰花結(Fearon，D.T.，1980，J.Exp.Med.15220)來檢測重組子CRl。天然的和重組CRl蛋白質的相同的電泳泳動速度證實CRl F異型含有SCRs1-30。
此外，採用DEAE-葡聚糖法(Ausubel，F.M.，et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Seidman，J.G.and Struhl，K.，eds.，John Wiley Sons，New York;Seed，B.，1987，Nature 329840)，用雙份0，2或4μg piABCD或者pMTABCD和2μg pXGH5，一種指示生長激素表達的信息質粒(Selden，R.F.，et al.，1986，Mol.Cell.Biol.63173)共轉染鼠類L細胞。兩天後收集該細胞且通過與YZ1單克隆抗CRl抗體的結合檢測CRl的表達。重組體質粒DNA和CRl抗原的表達之間存在一種劑量應答關係(表Ⅱ)。
表Ⅱ重組CRl和人類生長激素在在共轉染的L細胞中的劑量應答測定板 pXGH5 pMTABCD pIABCD YZ1 抗CRl 生長激素編號 (μg) (μg) (μg) mAB RIA＊ (ng/ml)(cpm)1 2 0 0 1444 1202 2 0 2 6058 1303 2 0 2 6531 1404 2 0 4 10620 1805 2 0 4 9898 806 2 2 0 3111 1807 2 2 0 2747 160＊放射免疫測定(RIA)在0℃，在含有1%牛血清蛋白和0.02%疊氮化鈉的0.1ml磷酸鹽緩衝液中將3×105的轉染細胞的重複樣品與3μg/ml YZ-1抗CRl Ig G1一起孵育60分鐘(Changelian，P.S.，et al.，1985，J.Immunol.1341851)。細胞經洗滌且重新懸浮在含有1-2μci/ml125I-F(ab′)山羊抗小鼠Ig G或者125I-蛋白A的0.1ml緩衝液中。在0℃下1-2小時之後，洗滌細胞且測定125I。
質粒piABCD指導的CRl抗原的表達幾乎比pMTABCD的多三倍。除了測定板5之外，培養基中的生長激素濃度的變化小於兩倍。補充的實驗顯示，piABCD在COS細胞中的CRl抗原的瞬時表達較在L細胞中多三倍。
當由用YZ1抗CRl mAB染色的細胞的間接免疫螢光法測定時，CRl抗原在轉染的COS細胞的表面上呈束狀(圖12)。重組CRl在COS細胞上的這種分布類似野生型CRl在人類白細胞上的分布(Fearon et al.，1981，J.Exp.Med.1531615)。
重組CRl的分子量通過piABCD轉染的COS細胞的表面碘化、用Sepharose-YZ1的細胞裂解物的免疫沉澱、SDS-PAGE以及放射自顯影術確定。重組CRl的分子量不小於190，000，相等於F異型的分子量而小於紅細胞CRl的S異型的分子量(圖14)。
通過在經轉染的COS細胞和EAC4b或EAC4b(lim)，3b之間形成玫瑰花結來測定重組CRl的C3b結合功能和C4b結合功能。在31次單獨轉染中，5%-50%用質粒piABCD轉染的COS細胞結合5個或5個以上EAC4b或EAC4b(lim)，3b.(圖13)。表達CRl的COS細胞並不同EAC4b(lim)，3bi形成玫瑰花結，雖然這種中間體與表達CR2的Raji B類淋巴母細胞形成玫瑰花結。
8.3.CRl片段的表達如下所述，構建編碼部分CRl編碼順序的表達載體(缺失突變型體)，當它們轉化入COS細胞時能表達它們各自的CRl插入部分。CRl片段被表達為細胞表面蛋白質。
8.3.1缺失突變型piBCD、piABD、piACD、piAD、piBD、piCD和piD的構建這些缺失突變型的構建是利用在4個CRl長同源重複(LHRs)的每一個接近氨基未端的同源位置中存在一個單BsmⅠ位點，而在CRl cDNA的其他位置和Bluescript載體中無BsmⅠ位點(Stratagene，San Diego，CA)進行的。
用50單位限制性內切酶BsmⅠ部分酶切10微克質粒pBSABCD45分鐘，並且用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物。純化分別對應於缺少一個、二個或三個LHRs的親本質粒線型片段的8.55kb、7.20kb和5.85kb的DNA片段。把這三種片段中的每一片段自身連接起來，連接產物分別用於轉化感受態的E.Coli DH5 α使之抗氨苄青黴素。
8.55kb片段是由於pBSABCD在二個鄰近的BsmⅠ位點上酶切而產生的，故而在連接之後有三種可能的質粒產物，pBCD、pACD或pABD，其中大寫字母代表質粒中仍然存在的LHRs。這些是可通過用SmaⅠ做的限制酶圖譜區別的。從12個克隆製備DNA，用SmaⅠ酶切和瓊脂糖凝膠電泳分離。5個克隆具有二個SmaⅠ片段，2.5kb和6.1kb對應於LHR-A的編碼順序的缺失，因此代表pBCD。3個克隆具有8.5kb單個線型片段，對應於pACD。4個克隆具有1.2kb和7.4kb兩個SmaⅠ片段，預計為LHR-C的編碼順序的缺失，形成pABD。這三種結構中的每一種的5.6kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切之後經凝膠純化，連接到在用相同限制性內切酶酶切之後業已經凝膠純化的表達載體CDM8上。用連接混合物轉化E.Coli DK/p3且由各自的5個克隆製備DNA。在用SacⅠ酶切的每種情況下都表明，在表達載體中存在缺失的CRl cDNA插入部分，這顯示了4.20kb和5.75kb的兩個所預期的片段。這些質粒稱之piBCD、piACD和piABD。
pBSABCD的部分酶切產生的7.20kb片段是BsmⅠ在三個鄰近的位點上酶切的結果，或者對該大片段而言，在兩個位點間有一個未被酶切的位點，這樣，在轉化之後可得到兩種可能的產物pAD和pCD。這些可用XhoⅠ和PstⅠ雙酶切來區別，在pAD情況下得到1.0kb和6.2kb兩個片段，而對pCD則得到一個7.2kb線型片段。自這些質粒的每一質粒中來的4.2kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切之後經凝膠純化，再亞克隆入上述的CDM8。由PstⅠ和BglⅡ雙酶切表明，在表達載體中有缺失的CRl cDNA。克隆piAD具有2.4kb和6.2kb兩片段，而piCD具有一個8.6kb片段。
自pBSABCD的BsmⅠ酶切中來的5.85kb片段，代表一種完全酶切的產物，而單克隆pD是在轉化E.Coli DH5α之後得到的。這可用Hind Ⅲ和BglⅡ雙酶切，得到所預期的3.7kb和2.2kb兩片段來證實。該克隆的2.9kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切之後經凝膠純化後連接到上述的表達載體上。所得piD克隆的HindⅢ酶切得到了預期的7.3kb片段，XhoⅠ和BglⅡ雙酶切得到2.2kb和5.1kb兩片段，SacⅠ酶切產生預期的1.5kb和5.8kb兩片段。
由pBCD的BsmⅠ部分酶切製備質粒pBD。凝膠純化相應於在兩鄰近BsmⅠ位點酶切產生的7.2kb線型片段，經如上所述的自身連接，再轉化E.coli DH5α為抗氨苄青黴素。通過在SmaⅠ酶切時存在1.2kb和6.0kb兩片段來識別pBD。4.2kb插入部分在用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切之後經純化且轉移到上述的CDM8。通過在HindⅢ酶切後看到預期的0.8kb和7.8kb兩片段證實了克隆piBD。
用125I分別對瞬時表達piABCD、piBCD、piCD和piD的COS細胞作表面標記，再用抗CRl抗體作免疫沉澱。在還原性SDS-PAGE上，piABCD結構的產物與CRl的F異型共遷移，而缺失突變型表明約為45，000道爾頓逐漸減少，分別表示一個、二個和三個LHRs的缺失(圖17)。
8.3.2.缺失突變型piP1、piE1、piE2、piE-2、piU1、piU-2和piA/D的構建用BstEⅡ完全酶切質粒piABCD，1.35kb(一種二聯體)和8.6kb的兩個片段經凝膠純化、混合以及連接，並且使E.coli DK1/p3轉化成抗氨苄青黴素和四環素。通過與CRl cDNA探針CRl-4雜交篩選菌落(參見上述8.1節)，挑選強陽性克隆並且通過用SmaⅠ酶切進一步篩選。piE1通過存在2.7kb和7.3kb兩個片段來識別，piE2由10.0kb一個線型片段來識別。piE-2被認為是一種含有一個8.6kb SmaⅠ片段的弱CRl-4陽性克隆。
通過用PstⅠ完全酶切piABCD以及凝膠純化10.0kb大片段得到質粒piP1。連接該片段且用連接混合物轉化E.coli DK1/p3。所得到的質粒piP1含有一個10.0kb SmaⅠ片段。
通過首先用質粒pXLA轉化dcm-菌株GM271/P3，再分離DNA來製備質粒piU1和piU-2。這種DNA用StuⅠ和NotⅠ雙酶切，凝膠純化3.3kb片段。質粒pBSABCD用NsiⅠ部分酶切，產生的4個鹼基對的3′凸出通過用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段處理來去除。然後，用Not完全酶切IDNA，凝膠純化5.4kb和4.0kb片段。把這些片段連接到來自pXLA的3.3kb StuⅠ-NotⅠ片段上，再用連接混合物轉化E.coli DH5 α成抗氨苄青黴素。通過與CRl cDNA探針CRl-4雜交篩選菌落，然後用HindⅢ限制性酶切進一步驗證陽性克隆，對於pU1來說得到0.8kb、1.3kb和6.5kb三個片段，對於pU-2得到0.8kb和6.5kb二個片段。通過這些質粒的DNA測序證實StuⅠ鈍化的NsiⅠ剪接是處於框架內。在XhoⅠ和NotⅠ雙酶切之後，凝膠純化分別為5.6kb和4.2kb的pU1和pU-2的插入部分，再連接在如上所述的表達載體CDM8上。經用XhoⅠ′PstⅠ限制性酶切證實了克隆piU1和piU-2的結構，對於piU1，得到1.2kb和8.8kb兩個預期的片段，對於piU-2，得到8.7kb一線型片段。
通過首先用PstⅠ完全酶切piABCD來製備質粒piA/D。然後，用ApaⅠ部分地酶切PstⅠ酶切產物，再用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段去除了3′凸出。隨後，用瓊脂糖凝膠電泳使DNA分開，分離7.5kb片段，連接並轉化E.coli DK1/P3轉化成抗氨苄青黴素和四環素。用KpnⅠ+SacⅠ雙酶切證實了該結構，即得到0.8kb、1.5kb、1.7kb和3.3kb四個預期的片段。
9.實例C3b和C4b結合區域的鑑定9.1.測定和結果將含有由它們名稱的大寫字母表示的LHR(s)的質粒piABCD、piAD、piCD和piD轉化入COS細胞，在測定中，它們用於評定它們的編碼的CRl片段結合C3b或C4b的能力。結合測定這樣進行;即觀測由通過在其細胞表面上表達一個全長CRl分子或者一個CRl缺失突變型(瞬時表達)的COS細胞結合C3b或C4b包被的紅細胞而引起的紅細胞玫瑰花結。在20℃下，用在0.02ml中有2-6×108/ml的載有C3或C4的紅細胞與1-4×106/ml的轉染細胞一起孵育60分鐘。用顯微鏡評定形成玫瑰花結的轉染細胞的百分數，將一個至少附著有五個紅細胞的轉染細胞計為一個玫瑰花結。其結果示於表Ⅲ。
表Ⅲ表達CRl的重組形式的COS細胞轉染子和載有C3(ma)或C4(ma)的羊紅細胞之間玫瑰花結的形成形成玫瑰花結的轉染子%具有抗CRl的螢光轉染子%COS細胞轉染子 EC3(ma)＊ EC4(ma)＃piABCD 109(3)π62(2)piAD 8(3) 107(2)piBD 107(3) 12(2)
piCD 127(3) 32(2)piD 0(3) 0(2)piA/D 11(2) 83(2)piE-2 1(1) 102(1)＊每個紅細胞中的C3(ma)數目，在採用這種中間體的三次試驗中分別為60，000、350，000和900，000。
＃每個紅細胞中的C4(ma)數目，在採用這種中間體的二次試驗中分別為160，000和140，000。
π試驗次數。
在三次單獨試驗的每一次中，根據用YZ1單克隆抗CRl抗體或者兔抗CRl抗血清免疫螢光評定表明(表Ⅲ)，與EC3(ma)形成玫瑰花結的表達全長piABCD結構的COS細胞的比例與具有可檢測的重組受體的百分率相似。反之，表達piD的細胞不形成玫瑰花結，這表明C3結合位點一定存在於或者要求有LHR-A、-B或-C的存在。通過論證表達piBD或piCD結構的細胞與EC3(ma)形成玫瑰花結，說明一個位點同時存在於LHR-B和LHR-C中。表達piAD、piA/D或piE-2的細胞並不具有相等的C3結合功能。由於piE-2結構與piCDM不同僅在具有LHR-A的SCR-1和-2而不是LHR-C的開頭二個SCRs，故LHR-C中C3結合位點的功能必須要求這些NH2末端的SCRS。
與EC4(ma)形成玫瑰花結的表達全長piABCD重組子的COS細胞的比例小於與EC3(ma)呈玫瑰花結的百分率，也許這反映了每個紅細胞中C4(ma)較少(表Ⅲ)或者每個受體中C4結合位點較少。具有全部或部分LHR-A的缺失突變型piAD、piA/D和piE-2結構與EC4(ma)的結合優於缺失突變型piBD和piCD;piD缺少這種功能。因此，CRl的C4結合位點主要存在於LHR-A中，雖然二級位點可以存在於LHR-B和-C中。piE-2結構相對於piCD具有較高呈玫瑰花結能力，說明LHR-A的SCR-1和-2與C4結合位點有關。
放射性免疫測定指出表達piABCD、piAD、piBD和piCD結構的COS細胞與YZ1單克隆抗CRl抗體的結合是顯著的(表Ⅳ)。用由LHR-A的五個NH2末端SCRs和LHR-D的三個COOH末端SCRs組成的piD和piA/D轉染的細胞並不與YZ1抗CRl抗體結合，雖然這些結構的產物與多克隆抗CRl抗血清結合(表Ⅳ)。因此，YZ1表位在LHR-A、-B和-C中重複出現，但不存在於LHR-A的NH2末端SCRs中，也不存在於或者在LHR-D中是不可接近的。
表Ⅳ單克隆和多克隆抗CRl抗體對表達CRl重組形式的COS細胞轉染子的結合COS細胞 結合的YZ1 結合的兔的轉染子 單克隆抗體＊ 多克隆抗體＊piABCD 2362 12277piAD 2879 19891piBD 3646 21922piCD 2189 19926piA/D 410 23052piD 404 16386CDM8 428 4886＊在0℃下，用3μg/ml YZ1 Ig G1抗CRl mAb(Changelian，P.S.，et al.，1985，J.Immunol.1341851)或者用90μg/ml兔的Ig G抗CRl抗體與3×105轉染細胞的重複樣品在含有1%牛血清白蛋白和0.02%疊氮化鈉的0.1ml磷酸鹽緩衝液中孵育60分鐘。細胞經洗滌且重新懸浮在含有1-2μci/ml125I-F(ab′)山羊抗小鼠Ig G或者125I-蛋白A的0.1ml緩衝液中。在0℃下1-2小時之後，洗滌細胞且測定125Ⅰ。所示的數值為二次測定的平均值，每3×105COS細胞中的cpm。
9.2.討論在每個LHR中第一個SCR的編碼順序中間找到的保守的BsmⅠ位點使得精密地相應於LHRs的界面的一系列缺失突變型的構建有可能，並保持了開放性閱讀框架和保留了形成推測的二硫鍵所必需的四個半胱氨酸的合適的位置(圖16)。這些缺失突變型的C3(ma)和C4(ma)結合功能的比較不僅識別了具有這些特異性的LHRs，而且識別了那些對確定配位體特異性致關重要的SCRs。故而，受體的piAD、piA/D和piE-2形式(但不是piD形式)在介導轉染的COS細胞和EC4(ma)之間的玫瑰花結形成方面的能力表明，LHR-A的NH2末端的二個SCRs包含一個與這種補體蛋白質相互作用的位點(表Ⅲ)。這個位點對C4(ma)僅相對專一，因為表達piAD和piA/D的轉染子還能夠結合EC3(ma)(表Ⅲ)。由玫瑰花結測定和因子I-輔因子對C3(ma)的酶切作用證明的由piBD和piCD結構編碼的受體的C3(ma)結合功能(表Ⅲ;圖18)指出在這些LHRs的開關二個SCRs中存在著對C3(ma)的專一性位點。這些位點也能夠與C4(ma)相互作用(表Ⅲ)。因此，在LHR-A、-B和-C中具有優先的但是重疊的C4和C3結合活性。
另外，表達piBD和piCD結構的COS細胞結合EC4(ma)的能力可能是編碼NH2末端36胺基酸的核苷酸從LHR-A的SCR-1經過BsmⅠ片段的連接轉到LHR-B和-C形成的。然而，這些36胺基酸單獨並不使piD產物具有與C4形成玫瑰花結的功能。我們不可能排除LHR-D在這些反應中的輔助作用，因為這種LHR存在於所有用於測定功能的結構中。在CRl中發現三個性質不同的配位體識別位點，對C3b為二個和對C4b為一個(圖19)，這表明，每個受體分子能夠有效地結合帶有多價C4b和C3b分子的複合體，儘管它們對單價配位體具有較低的親和性(Arnaout，M.A.，et al.，1983，Immunology 48229)。這種發現還為可溶性C4b不能阻止在帶有C3b的紅細胞和人類B類淋巴母細胞株系之間形成玫瑰花結提供一種解釋(Gaither，T.A.，et al.，1983，J.Immunol.131899)。CRl特別適合的可能的配位體可能是分子複合體C4b/C3b和C3b/C3b，它們分別在經典和旁路的途徑的激活過程中產生。因為四個LHRs中的三個中有不同的結合位點，所以其LHRs數目不同的CRl結構異型可能具有由配位體結合位點的數目變化而引起的重要的功能差異。雖然，在體外研究中尚未報導過F，S和F′(分別為A、B和C)異型的不同結合活性，但是推測僅有三個LHRs的較小的F′異型可能具有一種削弱的清除免疫複合體的能力。據報導，F′異型可能與全身性紅斑狼瘡有關(Van Dyne，S.，et al.，1987，Clin.Exp.Immunol.68570)。
10.實例因子I-輔因子活性的證明有人證明，在細胞表面和可溶形式中的重組CRl蛋白質及其特定的片段具有C3b因子I-輔因子活性。
用改進的一種公開發表的方法進行因子I-輔因子活性的測定(Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867)。
為測定可溶CRl和片段的因子I-輔因子的活性，用Nonidet P-40使細胞表面CRl蛋白質和片段溶解，再用偶聯在瓊脂糖珠上的抗CRl單克隆抗體YZ-1免疫沉澱裂解液。接著用SepharoseUPC10抗果聚糖和Sepharose-YZ-1免疫沉澱1×106的轉染COS細胞的去垢劑處理的裂解液。然後，通過用0.5μg125I-C3(ma)和200ng因子I，在37℃下與洗滌過的珠在0.05mlPBS，0.5%NP-40中孵育60分鐘，測定免疫沉澱物的因子I-輔因子活性。孵育之後，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和放射自顯影術分析含有放射性標記的C3(ma)的上清液。放射自顯影照片上的，由因子I蛋白分解功能產生的C3(ma)的α鏈的低分子量形式的出現表明了因子I-輔因子的活性。
為了測定細胞表面CRl和片段的因子I-輔因子活性，用0.5μg125I-C3(ma)和0.2μg因子I孵育帶有CRl表達載體(如上所述的piABCD、piAD、piBD、piCD或piD)的轉染COS細胞(Fearon，D.T.，1977，J.Immunol.1191248)且按上述分析。
細胞表面重組CRl的因子I-輔因子活性示於圖15。因子I僅僅在有免疫制動的重組CRl或者因子H的情況下才使C3(ma)的α鏈分解成分子量為76，000和46，000的片段(圖15)。自凝膠中切去相應於放射自顯影照片上的帶的區域，測定125I以確定分解的α鏈的數量。在因子H存在下，91%的α鏈被分解，而在重組CRl的數量逐漸增加的情況下，則分解分別為26%、41%和55%。雖然，只用CDH8載體轉染的COS細胞具有一些內源的因子I-輔因子活性，但是用piABCD、piBD和piCD轉染COS細胞，這種功能會增大(圖18)。在用piAD或piD轉染COS細胞的情況下，未見125I-C3(ma)的分解增大。因此，在這些結構中，只有給COS細胞提供了結合C3能力的缺失突變型piBD和piCD具有分解C3的因子I輔因子活性。
用CRl及其片段的細胞表面和溶解形式測定因子-輔因子活性的結果示於表Ⅴ。
表ⅤCRl及其片段的細胞表面和溶解形式及CRl片段的因子I-輔因子活性因子I-輔因子活性b質粒a細胞表面溶解的piABCD + +piAD - -piBD + NDcpiCD + +piD - NDda 編碼測定的CRl蛋白質或片段，為表達轉染入COS細胞。
b (+)表示輔因子活性在只用CDM8載體轉染時所觀測的內源水平以上的增量。
c 未測定d 未測定，由於在LHR-D中缺少用抗CRl單克隆抗體YZ1識別的表位。
如表Ⅴ所示，piABCD(編碼-全長CRl蛋白質)、piBD(編碼LHR-B和-D)或者piCD(編碼LHR-C和-D)表達形成一種具有C3b因子I-輔因子活性的產物。這樣，表Ⅴ的數據提供了CRl蛋白質或其一個片段可以促使補體失活的證據。
11.實例可溶性CRl重組子的表達用重組DNA方法修飾CRl cDNA，以便形成CRl或CRl片段的可溶性形式(sCRl)。在能從細胞中分泌表達蛋白質的哺乳動物系統中表達sCRl結構。與膜結合形式的CRl蛋白質不同，形成大量可溶性的多肽，不必為了獲得溶液中的多肽而使它們溶解。
11.1材料和方法11.1.1.酶切根據製備者的建議(New England Biolabs，Inc，Beverley，MA)進行所有的限制性內切酶酶切，接頭連接以及T4 DNA連接酶和E.Coli DNA聚合酶反應。用Morrison，D.A.，1979.Meth，Enzymol 68326-331中的方法，使E.Coli DH1或DH5α成感受態細胞。按照Maniatis，T.，et al.，1982.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York的方法，用DNA轉化感受態細菌細胞。用鹼性裂解或者用沸騰法(上述的Maniatis，T.，et，al)以純化質粒。
11.1.2.DNA片段分離如下所示，用瓊脂糖凝膠(Bio Rad，Richmond，CA)純化DNA片段。用刀片從凝膠中切除合適的DNA帶，並且把瓊脂糖塊置於一片石蠟膜(parafilm)上，切成較小的片再轉移到一片新的石蠟膜上。搗碎瓊脂糖片，把瓊脂糖轉移到1.5ml試管中。加入等體積苯酚%(超純級，BRL，Gaithersburg，MD)，使混合物振蕩，然後在-70℃下冷凍10分鐘，再離心10分鐘。水相用苯酚/氯仿(11)提取兩次，再用氯仿提取兩次。爾後，用乙醇沉澱DNA，洗滌沉澱物，經真空乾燥，重新懸浮在10mM鹽酸三羥甲基氨基甲烷緩衝液(Tris-HCl)，pH7.0，1mM EDTA中。
如下所述，由低熔點膠瓊脂糖中分離DNA片段(FMC，Corp.，Rockland，ME)。將瓊脂糖凝膠中切出來的合適的DNA帶置於1.5ml試管中，在65℃下熔融15分鐘。用含有0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS，超純級，BRL，Garthersburg，MD)的苯酚提取液化凝膠。水相再用苯酚-SDS提取一次，用氯仿提取兩次。然後，在2.0M乙酸銨中乙醇沉澱DNA，經乾燥並重新懸浮在水中。
11.1.3.轉染入哺乳動物的細胞中通過Ca PO4沉澱和Graham和Van der Eb的甘油刺激方法(1973，Virology 52456-467)，把DNAs轉染入哺乳動物細胞中。在用DNA磷酸鈣製劑培養4-6小時之後，通過以吸氣法去除生長培養基和1分鐘內加入5ml20%甘油DMEM培養基，使DUX BllCHO細胞受甘油刺激。然後，在完全的αMEM中洗滌兩次且在該培養基中培養48小時。
11.1.4.CHO轉染細胞培養使DUX Bll CHO細胞轉染子在DHFR(二氫葉酸還原酶)選擇性培養基中生長，該培養基由沒有核苷的αMEM培養(Gibco)組成。補充有10%經透析的胎牛血清(Gibco)和4mM L-穀氨醯胺。通過提高氨甲蝶呤(Sigma，＃A-6770，Amethopterin)的濃度使細胞生長進行擴增(Kaufman，R.J.et al.，1985，Molec.Cell Biol.51750-1759)。
11.1.5.可溶的CRl濃度水平測定的酶連接免疫吸附劑試驗(ELISA)11.1.5.1CRl標準把無血紅蛋白的紅細胞(RBC)血影細胞去汙劑裂解液用作ELISA(enzyme-liked immunosorbent assay)中的CRl標準。血影細胞按上所述製備(Wong，WW，and Fearon D.T.1987.Meth，Enzymol 150579-585)。簡言之，由紅十學會獲得死亡後的全血。紅細胞用PBS洗滌三次，然後裂解在6份體積的低滲的裂解緩衝液(10mM Tris pH8，0.1mM PMSF(苯基甲基磺醯氟)，0.1mM TPCK(甲苯基亞磺醯氨基氯甲基酮)，aprotonin，2m M EDTA)中。血影細胞用裂解緩衝液洗滌幾次，用紅細胞計數器計數、分裝並在-70℃下冷凍待用。對於CRl ELISA來說，在溶解性緩衝液(10mM Tris pH8，50mM KC1，0.2% NP4O，0.3% DOC，6.2mM PMSF，0.2mM碘乙醯胺，aprotonin，0.1mM TPCK，2mMEDTA，0.3%Na N3)中把血影細胞稀釋到1.6×108血影細胞/ml，接著稀釋到2.5×106血影細胞/ml，用作ELISA的標準。標繪出490nm下的吸收度的曲線，任何未知的樣品參照該曲線可得到相當血影細胞/ml。
11.1.5.2.CRl ELISA用PBS中0.4μg/ml濃度的抗CRl單克隆抗體(克隆J3D3，AMAC IOT17)(Cook，J.，et al.，1985，Molec.Immunol.22531-538)以100μl/井包被Immulon-Ⅱ試驗板且在4℃培養過夜。然後丟棄抗體溶液，再通過添加封阻緩衝液(PBS中有1.0%BSA)，以300μl/井封阻試驗板，在37℃下培養2小時。封阻之後，立即使用試驗板或者在4℃貯存待用。
用含有0.05% Tween-20的PBS洗滌試驗板三次。以100μl/井添加樣品且在37℃下培養2小時(平行作兩份)如需要，用溶解緩衝液稀釋樣品。在每塊試驗板上包含標準的RBC血影細胞。在樣品培養之後，洗滌試驗板三次，加100ul/井的以50%FCS，50%封阻緩衝液按18000稀釋的辣根過氧化物酶(HRPhorseradish per oxidase)(wilson，M.B.and Nakane，P.K.，1978，Immunofluorescence and Related Staining Techniques，NorthHolland Biomedical press，pp.215-224)和單克隆抗體YZ1(Changelian，p.s.，et al.，1985，J，Immunol.1841851-1858)的結合物。在37℃下培養2小時之後，再用含有0.05% Tween-20的PBS洗滌試驗板三次。每井加入100μl0.2%濃度底物鄰苯二胺(OPD)，底物緩衝液為0.36%檸檬酸H2O，1.74% Na2HPO4·7H2O，0.1%乙基汞硫代水楊酸鈉，0.4% H2O，pH6.3。在室溫下20分鐘後用50μl/井2NH SO4停止反應。記錄490nm下的吸收度。
11.2.CRl編碼順序的基因修飾CRl cDNA由大約6，951核苷酸鹼基對組成(如上圖1，6，7節)。不然cDNA的轉譯終止信號是位於6145鹼基對。蛋白質是一種膜結合受體分子，由暴露在細胞膜外表面上的四個長同源重複(LHRs)組成的加上一種約為25胺基酸的跨膜區，緊接為一延伸到細胞質中的羧基末端區，這種細胞質結構區由43胺基酸組成。我們所採用的生產可溶性CRl分子(SCRl)的方法是去除把蛋白質固定在細胞膜上的跨膜區，然後把切斷的結構表達為分泌出來的多肽。
11.2.1.pBSCRlc的結構質粒pBSABCD(上述實例8)含有核苷酸1-6860中的CRl cDNA，缺少3′到6860核苷酸處的EcoRⅤ位點的未翻譯順序。CRl cDNA在鹼基對5914處具有唯一的BalⅠ限制性的核酸內切酶識別位點，離跨膜結構區起始點有29鹼基對。首先用BalⅠ酶切pBSABCD，以形成一個具有平頭的線型分子，然後用TDNA連接酶把它連接到由兩股具有以下順序的38核苷酸互補鏈組成的合成的寡核苷酸上5′CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG3′GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC所得的分子具有一個恢復的BalⅠ位點和一個經過改變的順序，它再現了天然CRl順序一直到並且包含在跨膜區起始點的丙氨酸殘基。此外，緊跟在丙氨酸之後引入一轉譯終止信號(在下面情況和以上劃線部分)，接著為一個XhoⅠ限制性位點，以促進形成亞克隆改變的cDNA。
這個質粒(稱之pBSCRlc)的XhoⅠ酶切，是切割在cDNA上的加了寡核苷酸的XhoⅠ位點和在CRl cDNA的5′末端上pBSKS+多克隆部位中的XhoⅠ位點，去除了cDNA插入部分(稱之SCRlc)。pBSCRlc含有下列C末端順序鹼基No.5911CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG胺基酸 L A K C T S R A H D A ENDxhoIsite11.2.2.pBSCRls的結構如下所示，形成了缺少跨膜區的第二個sCRl結構。用SacⅠ酶切pBSABCD，該酶在CRl cDNA中5485核苷酸鹼基對處唯一的SacⅠ位點和宿主質粒的多克隆部位中的SacⅠ位點處被切割，該位點位於CRl cDNA的3′末端上。這一酶切導致在cDNA的3′末端切除DNA順序中的1375核苷酸。然後電泳去除這種片段。用T4DNA聚合酶修平所得到的含有殘餘SCRl cDNA的質粒的暴露末端，再進行平末端連接。該連接中還包括Pharmacia的廣譜轉譯終止子(catalog＃27-4890-01)，Pharmacia，Inc.，piscataway，NJ)，一在全部三個閱讀框架中均含有轉譯終止信號的自補寡聚體。連接時，插入的寡聚體為SCRl cDNA提供了一個新的轉譯終止信號。
11.2.3.pBM-CRlc的結構pBMT3X是一種真核表達載體(Krystal，M.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad Sci USA 832709-2713)，它含有人類金屬硫因-1A基因，它使細胞具有抵抗重金屬諸如鎘含量增加的能力。該載體還含有小鼠金屬硫因-1基因，它含有一個位於Mt-1蛋白質的起始密碼子前的構建的XhoⅠ位點。XhoⅠ位點作為在小鼠Mt-I啟動子控制下表達基因的插入部位。
用XhoⅠ從pBSCRl上c切下SCRlc插入部分(約為5.9kb)，然後連接到載體pBMT3 X的唯一的XhoⅠ位點上。用限制性酶切確定pBMT3X中SCRl插入部分的正確定向(Maniatis，T.，et al.，1982.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。所得質粒稱之pBM-CRlc。
11.2.4.缺失型突變體pT-CRlc1、pT-CRlc2、pT-CRlc3、pT-CRlc4和pT-CRlc5的構建SCRl cDNA缺失特定的部分可以構建各種不同的缺失型突變體(圖20)。每種缺失型突變體均缺少全長度cDNA的跨膜區，所以突變體的表達會產生可溶性多肽。
11.2.4.1.pT-CRlc1用SmaⅠ酶切pBSCRlc，獲得大小分別為2.5kb和7.3kb的兩個片段。它們用瓊脂糖凝膠電泳分離，再純化7.3kb片段，然後自身連接。使E.coli DH52細胞成感受態(Morrison，D，A.，1979.Meth.Enzymol，68326-331)，然後用連接混合物轉化。所得質粒稱之pBL-CRlc1。這種結構去除了CRlc插入部分的38%LHR-B、100%LHR-C及51%LHR-D。此外，在連接處2335/4894bp上重新形成SmaⅠ位點，保持了正確的轉譯框架。用XhoⅠ酶切pT-CRlC1，把CRl插入部分與pBlueseript載體分離。然後，將分離的CRl片段插入到表達載體pTC Sgpt上唯一的XhoⅠ位點中，形成質粒pT-CRlc1。
11.2.4.2.pT-CRlC2用ClaⅠ和BalⅠ酶切pBSCRlC，得到大小為3.96kb和5.9kb的兩個片段，這兩個片段用瓊脂糖凝膠純化。用ClaⅠ和BalⅠ酶切質粒pBR322，純化2.9kbBR322片段且連接到pBSCRlc中的5.9kb片段上。用連接混合物轉化E.coli DH5α細胞，所得的質粒稱之pBR8.8。用XbaⅠ酶切該質粒，形成大小為7.45kb和1.35kb的兩個片段。由瓊脂糖凝膠純化7.45kb片段，然後再自身連接。所得的質粒pBR7.45用ClaⅠ和BalⅠ酶切，把分離得的含有SCRl cDNA的4.5kb片段連接到pBSCRlc中的3.96kb片段上，得到質粒pBL-CRlc2。這種結構去除了SCRl插入部分中90%LHR-B，在連接處1637/2987bp重新形成XbaⅠ位點，且保持了正確的閱讀框架。用XhoⅠ酶切pBL-CRlc2，使SCRl插入部分與pBluescript載體分離。然後，將分離的SCRl片段插入到表達載體上pTC Sgpt上唯一的XhoⅠ位點中，形成質粒pT-CRlc2。
11.2.4.3.pT-CRlc3用NsiⅠ酶切pBSCRlc，得到大小為1.09kb、1，35kb和7.46kb的三個片段。由瓊脂糖凝膠純化7.46kb片段，再自身重連接，由此形成質粒pBL-CRlc3。這種結構去除了SCRl插入部分中77%LHR-A和100%CHR-B。在連接處463/2907bp重新形成NsiⅠ位點，同時保持了正確的閱讀框架。用XhoⅠ酶切pBL-CRlc3，使SCRl插入部分與pBluescript載體分離。然後，將分離的SCRl片段插入到表達載體pTC Sgpt中唯一的XhoⅠ位點上，形成質粒pT-CRlc3。
11.2.4.4.pT-CRlc4用PstⅠ酶切pBSCRlc。在把CRl cDNA連接到該載體p Bluescript上的過程中，去除了pBluescript的多聚接頭區中的PstⅠ位點為1.35kb和8.5kb的片段，純化8.5kb片段，再自身連接，形成質粒pBL-CRlc4。這種結構去除了SCRl插入部分的31%LHR-A和69%LHR-B。在連接處1074/2424bp重新形成PstⅠ位點，由此保持了正確的閱讀框架。用XhoⅠ酶切pBL-CRlc4，使SCRl插入部分與pBlueseript載體分離。然後，把分離的SCRl片段插入到表達載體pTC Sgpt中唯一的XhoⅠ位點上，形成質粒pT-CRlc4。
11.2.4.5.pT-CRlc5用SmaⅠ酶切pBL-CRlc1，由此在唯一的SmaⅠ位點上使質粒線性化。使該質粒去磷酸化，再連接到含有一無義密碼子的經磷酸化的NheⅠ接頭上(New England Biolabs，Beverley，MA。)這類接頭含有一個在所有三個可能的閱讀框架中的均有的轉譯終止密碼子，並且還包含一NheⅠ限制位點，這便於確認SCRl cDNA中存在無義接頭。所得的質粒稱之pBL-CRlC5，它保留了SCRl cDNA的LHR-A和62%LHR-B。用XhoⅠ酶切pBL-CRlC5，使SCRl插入部分與pBluescript載體分離。然後，把分離出來的SCRl片段插入到表達載體pTC Sgpt上唯一XhoⅠ位點中，形成質粒pT-CRlc5。
11.3.可溶性CRl的表達如本文所述，可以從細胞中以高產量分泌的CRl的可溶形式的表達(ⅰ)不限於用於缺失或切斷的CRl cDNA中一個精確的位點，(ⅱ)也不限於應用一種特殊的表達載體(參見上述)。可以兩個不同的表達系統來說明形成分泌SCRl的能力。
11.3.1.表達載體的pTCS系列的構建所用的pTCS系列表達載體由三個質粒組成，每個均具有一插入cDNA的唯一XhoⅠ克隆位點(圖21)。由一組串聯啟動子驅動插入的cDNA的轉錄。SV40早期啟動子位於腺病毒的主要晚期啟動子(AD2MLP)的上遊。腺病毒的三聯前導順序處於cDNA開頭和AD2MLP之間。經轉錄的mRNAs由位於XhoⅠ cDNA克隆位點下遊的鼠類免疫球蛋白卡巴(Igk)順序提供的多腺苷化信號終止。通過插入pSV 2gpt，pSV 2dhfr或pSV 2neo中的相應的標記，分別提供了可選擇的標記黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)或者新黴素抗性(neor)。這些質粒還是細菌複製起點和抗氨苄青黴素的β-內醯胺酶基因的來源。一般來說，對載體的選擇取決於什麼樣的選擇標記或組合標記對選擇重組子是較好的。
人們已經知道腺病毒2(Ad2)、SV40、pSV 2cat(Gorman，c，1985，DNA Cloning，VolumeⅡ，A Practical Approach，ed.D.M.Glover，IRL Press，pp.143-190)以及鼠類免疫球蛋白卡巴的全部DNA順序。這些順序在基因庫(Gen Bank
資料庫和National Biomedical Research註解和參考文獻中。這些中的任何一些還用作pTCS載體的適當部分的來源。
由中間質粒pEA Xgpt和pML Egpt構建的載體pTC Sgpt、pTC Sneo和pT Sdhfr如下11.3.1.1.pEAXgpt的構建步驟1從M13mp9/MLP中得到Ad2MLP DNA片段(Concino，M.F.，et al.，1983，J.Biol.Chem.2588493-8496)。這個質粒含有腺病毒2的核苷酸5778(XhoⅠ位點)到6231(HindⅢ位點)的順序，其中包括核苷酸6069上的PvuⅡ限制位點和核苷酸5791上的SacⅡ位點(參見NBRL核酸資料庫，保藏號＃Gdad2)。把XhoⅠ到HindⅢ片段克隆到M13mp)的HindⅢ和SalⅠ位點中，產生質粒M13mp9/MLP。
用EcoRⅠ和HindⅢ酶切質粒M13mp9/MLP，分離出較小的含MLP片段。再用EcoRⅠ和HindⅢ酶切pUC質粒(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)，然後，把該質粒中較大的片段連接到EcoRⅠ到HindⅢ的MLP片段上。結果形成一個具有pUC質粒骨架的含MLP的新質粒。用SamⅠ酶切該質粒，連接到SalⅠ接頭上，再重新環化。然後，用PvuⅡ酶切這個新質粒，質粒的PvuⅡ位點位於腺病毒2插入順序中＃6069位置上。把所得的線型片段連接到XhoⅠ接頭上，再重新環化。爾後，用XhoⅠ和SalⅠ酶切該質粒，分離出含有MLPDNA的較小的片段(片段＃1)。
步驟2 用PvuⅡ酶切質粒pSV 2gpt(American Type Culture Collection(ATCC)保藏號37145)，連接到SalⅠ接頭上，再用SalⅠ酶切。最終產物為線型pSV 2gpt片段(片段＃2)。它可作為gpt基因的來源。
步驟3 用HaeⅢ和AvaⅡ酶切鼠類免疫球蛋白Igk片段(Hieter，P.A.，et al;1980.Cell 22197-207)，分離含有多腺苷化順序的片段。在可由NBRF核酸資料庫(入藏號＃Kcms)中得到的鼠類Ig卡巴順序中，Ig終止密碼子在1296位上，緊接的是1306上的AvaⅡ位點、1484上的AATAAA多腺苷化位點以及1714上的HacⅢ位點。用E.coli DNA聚合酶修平該片段的突出末端，然後把片段連接到XhoⅠ接頭上，再用XhoⅠ酶切。這個片段(片段＃3)用作多腺苷化位點的主源。
步驟4 片段1、2和3與T4 DNA連接酶一起連接，形成一環狀質粒。用限制性內切酶分析證實該質粒中的片段的正確定向。XhoⅠ cDNA克隆位點的下遊是鼠類卡巴多腺苷化位點，該位點的更下遊是SV40啟動子和gpt基因。XhoⅠ位點的上遊是MLP啟動子，該啟動子的更上遊是細菌複製起點和氨苄青黴素基因。然後，用SalⅠ酶切該質粒，用E.coli DNA聚合酶修平突出末端。使所得的補平末端片段連接到EcoRⅠ接頭上，用T4DNA連接酶重新環化。這個最終質粒稱之pEAXgpt。
11.3.1.2.pML Egpt的構建步驟1 質粒pMLPCAT(Lee，R.F.，et al.，1988.Virology，16551-56)是一個具有pML載體骨架的表達質粒，它含有腺病毒2MLP和三聯前導順序，5′到CAT基因。用XhoⅠ和SacⅡ酶切pMLP CAT;XhoⅠ的酶切位點在CAT基因和三聯前導順序的L3區之間，SacⅡ的酶切位點在除MLP的5′以外的腺病毒DNA中的＃5791位上。由此AD2 MLP和三聯前導順序位於這個小的XhoⅠ到SacⅡ的片段上(片段＃4)。
步驟2 用XhoⅠ和SacⅡ酶切質粒pEA Xgpt，除去含有MLP的較小片段。分離較大的片段(片段＃5)。使均具有SacⅡ和XhoⅠ末端的片段4和5連接，形成質粒pML Egpt。
11.3.1.3.pTC Sgpt的構建步驟1 用SacⅡ酶切pML Egpt，用T4 DNA聚合酶修平末端，得到一補平末端的片段(片段＃6)。這個SacⅡ位點是位於腺毒2順序中MLP三聯前導順序5′的核苷酸5791上。
步驟2用HindⅢ和PvuⅡ酶切pSV 2dhfr(ATCC保藏號37146)。用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段修平含有SV40早期啟動子的較小的342核苷酸片段(片段＃7)的末端。用T4 DNA連接酶連接片段6和7。限制性酶的分析證實了這些片段定向正確，在XhoⅠ cDNA克隆位點的上遊有兩個前後排列的啟動子，每個啟動子能啟動在相同方向上的RNA合成。這一質粒稱之pTC Sgpt(圖22)。
11.3.1.4 pTC Sdhfr的構建步驟1 HindⅢ和PvuⅡ酶切p SV 2dhfr，然後用瓊脂糖凝膠純化較大的片段(片段＃8)。捨棄較小的含有SV40早期啟動子的片段。
步驟2 用EcoRⅠ酶切pTC Sgpt，然後用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段填充，形成補平末端。再用HindⅢ酶切這種線型片段，分離含有SV40啟動子、MLP、三聯前導順序物、XhoⅠ cDNA克隆位點、鼠類Ig λ順序以及第二SV40啟動子的pTCS轉錄單元的片段(大約1600核苷酸)(片段＃9)。該片段具有一平末端和一HindⅢ突末端。連接片段8和9形成質粒pTC Sdhfr。
11.3.1.5.pTC Sneo的構建步驟1 用HindⅢ和BamHⅠ酶切pSV 2neo(ATCC保藏號37149)，再分離較大的片段(片段＃10)。該片段含有質粒骨架和neo基因。
步驟2 用HindⅢ和BamHⅠ酶切pTC Sdhfr，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳之後，分離出pTCS轉錄單元(片段＃11)。連接片段10和11形成質粒pTC Sneo。
11.3.2.含有可溶性CRl編碼順序的哺乳動物表達載體質粒pBSCRlc、pBSCRls和pBM-CRlc表達和鑑定11.3.2.1 在CRl cDNA中的不同位置上切斷的CRl結構的表達構建質粒pBSCRlc和pBSCRls，它們保存了除跨膜區和胞質區之外的大部分cDNA編碼區(上述的11.1.節)(圖20)。pBSCRls比pBSCRlc短，因為它缺失了pBSCRlc中所含有的LHR-D和SCRS29及30部分。將這些質粒的SCRl部分插入到pTC Sgpt中，接著如上所述進行轉染和表達。
pBSCRlc/pTCSgpt的構建用XhoⅠ酶切pBSCRlc，得到5.9kb的插入部分，SCRlc。將SCRlc插入到pTC Sgpt的XhoⅠ cDNA克隆位點中，產生pBSCRlc/pTC Sgpt。
pBSCRls/pTC Sgpt的構建用XhoⅠ和PvuⅠ酶切pBSCRls得到SCRls插入部分。用T4DNA聚合酶修平插入部分的末端。用瓊脂糖凝膠純化該插入部分。用XhoⅠ酶切載體pTC Sgpt，用E.coli DNA聚合酶I填平XhoⅠ突末端。接著，把SCRls插入部分連接到末端補平的載體上，形成pBSCRls/pTC Sgpt。
用FspⅠ酶切質粒pBSCRlc/pTCSgpt和pBSCRls/pTC Sgpt，與質粒p SV 2dhfr經磷酸鈣共沉澱，把所得的線型DNA′s轉染到dhfr基因為突變體的中國倉鼠卵巢(ChineseHamsterOvary)細胞中(CHO DUX Bll細胞)。讓它們在DHFR選擇性培養基上生長而選擇轉染子。用ELISA鑑定轉染子克隆的培養上清中分泌的SCRl。鑑定50個pBSCRlc/pTC Sgpt重組子的培養上清，並且通過在把它們提高的氨甲喋呤濃度中培養的擴增方法獲得陽性重組子。此外，通過每管共同培養8個pPBSCRlc/pTC Sgpt轉染子並且使它們經相同的擴增方法，製備數管轉染子。擴增的結果示於表Ⅵ。
表ⅥpBSCRlc/pTC Sgpt的表達分泌的可溶性CRl(μg/ml)CLONEO MTX20 nm MTX50 nm MTX100 nm MTX500 nm MTX2＊ 0.7 3.411 10.940.04 0.160.0490.0210 0.211 0.1212 0.1413 0.0714 0.215 0.45 1.1 7.39.021 0.0730 0.27 ＜0.02 ＜0.0235＊↑ 0.826.3 8.4 10.9 10.940 0.0541 0.0550 0.1252 0.12
POOLA 0.02B 0.04C 0.23D＜0.02 ＜0.02E 0.271.1F 3.6 5.8 9.1G 0.27H 0.04＊選擇克隆2和35以大規模生產SCRl。
+通過有限稀釋將克隆35進行亞克隆，測定每種亞克隆形成的可溶性CRl。
pBSCRc/p TC Sgpt-克隆35.6的產量最高，為17.7μg/ml sCRl。
MTX氨甲喋呤(methotrexate)用ELISA鑑定pBSCRls/pTC Sgpt的12個重組子形成的可溶性CRl。所有12個鑑定物都顯示分泌可檢測水平的SCR。最好的生產者產生的SCRl的水平可與最好的pBSCRlc/pTC Sgpt轉染子產生的相比。
pBSCRlc/pTC Sgpt和PBSCRls/pTC Sgpt重組子產生具有相似水平的可溶性CRl。這表明，產生可溶性CRl多肽的能力並不取決於CRl cDNA中的一個確切的切斷點。
11.3.2.2.在兩種不同的表達系統中sCRlc的表達將切斷的CRl cDNA插入部分，sCRlc插入至表達載體pTCSgpt中，並如上所述進行表達。它還被插入至表達載體pBMT3X中，如上面的11.2.3章節中所描述，產生pBM-CR1c。這兩種表達載體都具有非常強的啟動子。在兩種系統中測試可溶性CRl的表達以確定是否有一個系統可以獲得較好產量的分泌多肽。
採用磷酸鈣方法(Graham，F.L.和Van derEb，A.J.1973，Virology 52456-467)，用pBM-CRlc轉染C127 I鼠細胞(ATCC保藏號.CRL 1616，Rockville，Maryland)。經甘油刺激後，用含有10%胎牛血清和2mML-穀氨醯胺的D-MEM培養基恢復細胞，在37℃下培養48小時。然後，用胰酶消化細胞，分成1∶5和1∶10的比例加入完全D-MEM培養基+10μm氯化鎘中，10天內出現耐鎘菌落。採用克隆圓筒將10個菌落取出，將每個菌落都轉移到含有完全D-MEM培養基的陪替氏培養皿中，在37℃，5%CO下培養直至細胞融合。然後，對每一個培養皿中的細胞進行胰酶消化，並分裝入三個60mm的培養皿中用於製備冰凍細胞原種，RNA抽提物，並用於採用ELISA法測試細胞培養基中是否存在分泌sCRlc。
當從每一個融合的陪替氏培養皿中移出細胞培養基並進行ELISA分析時，發現被測試的所有pBM-CRlc克隆對生產可溶性CRl均為陽性。將來自pBM-CRlc重組子的分泌sCRl的量與來自pBSCRlc/pTC Sgpt重組子的那些進行比較。結果表明高產量地生產分泌sCRl多肽的能力並不依賴於僅使用某些啟動子或表達系統。
11.3.3 含有可溶性CRl編碼順序的哺乳動物表達載體，pT-CRlc系列，質粒pT-CRlc1，pT-CRlc2，pT-CRlc3，pT-CRlc4和pT-CRlc5的表達和測試。
pT-CRlc系列缺失突變體缺失跨膜和胞質區，和pBSCRlc和pBSCRls的結構一樣。此外，缺失突變體還包括相當大量的CRl cDNA的各種LHR區的缺失(見圖20)。將缺失突變體在CHODUXBll細胞中表達，並測定其產生的可溶性CRl多肽的量。
對於每一種缺失結構，選出40種不同管的克隆進行ELISA分析以確定是否產生了可溶性CRl多肽。通過ELISA或通過在細胞在培養基中檢查其功能活性的存在，發現所有5種pT-CRlc結構均可在細胞培養基內分泌sCRl。用5種pT-CRlc結構中的4種轉染的細胞的上清液中所產生的sCRl，通過溶血分析測定認為是功能性的(見表Ⅶ和下面的13.2章節)。
表Ⅶ功能性sCRl片段的製備＊結構 ELISA 溶血分析pT-CRlc1 - +pT-CRlc2 + +pT-CRlc3 - +pT-CRlc4 + 未測定pT-CRlc5 - +＊用於ELISA測試或溶血分析的上清液是從生長在T75燒瓶或24井培養板中培養物中獲得。因為在這些條件下，不同量的可溶CRl都可以累積於培養上清中，所顯示的結果是定性的。(+)表示由所指定的分析法檢測，產生了功能性的sCRl。
缺失突變體也能夠產生可溶性CRl的事實進一步顯示了表達sCRl的能力不依賴於CRl cDNA的一種確切的遺傳修飾。象刪除跨膜區後，所有的結構均能製備可溶性多肽。
12實例可溶性的CRl的製備和純化大量的sCRl在空心纖維生物反應器系統中製備。所獲得的sCRl的量與接種的重組子克隆的相應產量成正比。為了獲得最佳的純化效果，選用血清培養基，在缺乏大量的外源加入的胎牛血清多肽的情況下，仍可獲得高生產水平的sCRl。
12.1 可溶性CRl的大規模製備與Ⅳ-L型空心纖維生物反應器(30KD分子量中止)相配的細胞-PharmTM細胞培養系統Ⅰ(CD Medical Inc，Miami Lakes，FL)在無菌條件下裝配。將兩個克隆(pBSCRlc/pTC Sgpt的克隆2和克隆35)擴展至8個T-225燒瓶中。當融合時，用胰酶消化細胞，洗滌和制丸，並將其重懸浮於培養基中。約5×108個克隆2的細胞和10×108個克隆35的細胞接種到兩個分開的空心纖維生物反應器中。採用一個20升的料液藏器，其中盛有α-MEM+10%胎牛血清，8mM L-穀氨醯胺，100μg/ml青黴素鏈黴素和適當濃度的氨甲蝶呤(對於克隆2為50nM，而對於克隆35為500nM)。預先混合的氣體(含5%CO2的空氣)通過氧氣發生器向貯藏器中的培養基鼓泡以維持pH。調整培養基的重複循環，替換和氣體流速以獲得最大的產量。將接種的部分在1000rpm下離心10分鐘，通過0.22μM孔徑的過濾而收集樣品，純化前保持於4℃。收集的體積和頻率從25ml，培養初期為每星期3次起逐漸增加，至40ml，2-3個月後每星期5次。通過CRl ELISA來測試所產生的sCRl。接種後第一個月，克隆2和克隆35的產量分別為66μg/天和1060μg/天。產量隨著培養株的形成而增加。
12.1.1 在無血清培養基中sCRl的製備對兩種商業上可購得的無血清培養基支持細胞生長和sCRl產生的能力進行測試。pBSCRlc/pTC Sgpt克隆35的T75燒瓶中的融合物被分裝入2個T75燒瓶中。一個瓶子用補充有10%胎牛血清，L-穀氨醯胺，抗生素和500nM氨甲蝶呤的α-MEM培養。另一個瓶則在α-MEM L-穀氨醯胺，抗生素，500nM氨甲蝶呤+HBCHO生長添加劑(Hana Biologics，Inc.Alameda，CA)中培養並逐步減少胎牛血清，從5%，1%，0.5%至無牛胎血清。比較兩個瓶中細胞的生長和sCRl生產水平。在無血清的培養基中生長的細胞不會達到融合。sCRl生產產量列於表Ⅷ中。在每一種情況下，當細胞在10%的胎牛血清中生長時，sCRl的生產水平是最高的。比較發現，在14天時，無血清培養基中的產量是1.4×1010個血影細胞/ml，而在補充10%胎牛血清的培養基中則為4.2×1010個血影細胞/ml。
表Ⅷ在補充CHO生長補充劑的無血清培養基和含有10%胎牛血清的培養基中sCRl的產生＊第4天 第7天 第11天 第14天瓶1CHO生長補充劑+ 5%FCS 1%FCS 0.5%FCS 0%FCS2.6 2.4 2.95 1.4瓶210%FCS 4.8 3.85 4.3 4.2＊以1010個血影細胞/ml表示。
採用第二種來源的無血清培養基(CHO-1，Ventrex Laboratories，Inc.Protland，ME)測試重組子中細胞的生長和sCRl的產生。因為不需要在該培養基中逐步去掉細胞生長的血清，所以，細胞在無血清的培養基中直接解凍和培養。該培養基由DME-12鹼和生長添加劑組成。將相等數量的細胞解凍並接種入24-井培養板中各個井孔中。細胞附著後，除去培養基，將含有10%胎牛血清的培養基或無血清的培養基加入至適當的井孔中。每一種情況都進行二次。與先前所測試的無血清培養基的情況不同，CHO-1，Ventrex Laboratories培養基可產生與含有牛胎血清的培養基相似水平的細胞生長。
12.1.2.結論上述結果表明產生sCRl CHO細胞可以維持在一定的無血清的培養基中。這就減少了大規模生產所花費的培養基的成本。另一個優點是簡化了從細胞培養上清液中純化sCRl，因為不需要除去胎牛血清蛋白質。
12.2可溶性的CRl的純化隨著專一性抗CRl抗體的出現，用簡化的二步法來代替製備純化的CRl所需的多步層析法就成為可能了。這樣也增加了CRl蛋白質的產量，每5.9×1013個紅細胞可獲得約1-5mg CRl(Wong，W.W等人，1985，J.Immunol.Methods 82303-313)。但是，因為所報導的純化是與膜結合形式的CRl的純化，所以總是需要用去垢劑溶解含CRl的物質。
用重組轉染子所製得的可溶性CRl不必要用去垢劑溶解再純化;它已經是可以溶解的。儘管可溶性CRl可以通過抗CRl抗體層析法純化(見下面)，但該過程本身不適宜於大量製備。擴大產量的程度受到可以得到的用於製備抗體純化柱的抗體基質的抗CRl抗體的量的限制。此外，對於CRl具有高結合親和力的抗體，如YZ-1意味著相當苛刻的條件，如必須達到pH12.2以從抗體基質中去除結合的sCRl產物(Wong，W.W.等人，1985，J.Immunol.Methods 82303-313)。
為了具備純化很大量可溶性CRl的能力，形成了包括HPLC柱在內的純化方法。這些HPLC柱可以容易地擴大以生產相當大量的純化的可溶性CRl。此外，它們不需要在苛刻的條件下洗脫和復原sCRl。
12.2.1.抗體親和柱純化12.2.1.1.方法為了進行sCRl的抗體親和純化，根據製造商的說明，將100mg單克隆抗體YZ-1以共價偶聯到7mg Affi Gel-10(BioRad，Richmond，CA)上。在瓶中用固定的YZ-1孵育來自於細胞培養物的含有CRl的上清液，在4℃振蕩過夜。將物質傾注入玻璃柱中，用10mM Hepes，0.1 M Nacl，pH7徹底衝洗，用20mM磷酸鈉，0.7 M NaCl，pH12洗脫sCRl(Yoon.S.H和Fearon D.T.1985，J.Immunol.1343332-3338)。用Biorad蛋白質分析儀(BioRad，Richmond，CA)來檢驗洗脫的級分中蛋白質的存在。將含有蛋白質的樣品馬上收集起來並在0.1MHepes，pH7(2×11)中，於4℃透析過夜。然後在PBS中透析樣品。通過CRl ELISA分析存在的sCRl。
12.2.1.2.結果將由轉染子pBSCRlc/pTCSgpt克隆2所製得的含有sCRl的細胞培養上清液加到抗CRl抗體親和層析柱上，收集峰值sCRl級分。將一組這種純化的物質在4-20%的SDS-PAGE凝膠上走電泳(DAIICHI;Inc.，聚丙烯醯胺凝膠，modified procedure of Laemmli，U.K.，1970，Nature.227680-685)。在還原條件下，可溶的CRl的表觀分子量是約224，000道爾頓(圖24)。該純化的CRl分子具有抑制補體介導的溶血作用，同樣也抑制C5a和C3a產生，這也表明它是具有活性的(下面第13章節)。
12.2.2.採用HPLC的CRl純化12.2.2.1.方法
12.2.2.1.1.原料當培養物在生物反應器中剛剛形成時，sCRl的生產水平低於培養物已生長了幾個月的時候。通常，在細胞在生物反應器中達到融合和產生最大產量的sCRl以前，有一個幾個星期的周期。含有少量sCRl的細胞培養上清液在純化前可通過硫酸銨沉澱或超濾法而濃縮。用60～80%飽和的硫酸銨分級分離上清液，所沉澱的sCRl呈現基本相當的產量。將沉澱物以最小的體積溶解並在用於陽離子交換HPLC的初始緩衝液中透析。或者，可以超濾濃縮CHO細胞培養上清液並透析到用於陽離子交換層析的初始緩衝液中。
因為生物反應器中產生了較高濃度的可溶性CRl，從這些培養物中得到的CHO細胞培養上清液可直接透析至用於陽離子交換層析的初始緩衝液中。
12.2.2.1.2.陽離子交換HPLC過程將樣品透析至初始緩衝液中(0.02M磷酸鈉，0.06N氯化鈉，pH7.0)，然後通過一個0.2μm過濾器過濾以除去所有的粒狀物質。然後，將樣品加到陽離子交換高壓液相色譜柱上(10cm×10mm，Hyd ropore-SCX HPLC柱，Rainin)。洗滌該色譜柱，並用0.02M磷酸鹽，0.5N NaCl pH7.0形成的氯化鈉梯度洗脫。約在0.06N和0.25N NaCl之間將SCRl洗脫下來。通過280nm處吸收和ELISA監測洗脫。
12.2.2.1.3.陰離子交換HPLC過程如果需要的話，可以由陰離子HPLC對陽離子HPLC純化的sCRl進一步純化。將陽離子HPLC的峰值級分透析至陰離子HPLC的初始緩衝液中。上樣後用0.01M磷酸鹽，pH7.5洗滌(Hydropore-AX，Rainin)。採用0.01M磷酸鹽，0.5N NaCl，pH7.5形成的(NaCl)梯度洗脫該柱(採用一系列的步驟)。約在0.0N和0.3NNaCl之間將sCRl洗脫下來。如前面對於陽離子交換HPLC一樣監測洗脫情況。所給出的陽離子和陰離子HPLC柱緩衝液的濃度和pH只是一些例子。其它濃度的緩衝液，鹽的條件或pH條件也可以採用。
12.2.2.1.4.Western印跡法分析Western印跡法採用Towbin H.等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，764350-4354的修改方法而進行。簡而言之，將純化的sCRl在4-20% SDS-PAGE上凝膠上電泳，再將其轉移至硝酸纖維膜上，用抗CRl抗體(鼠mAb YZ-1或J3 D3)專一探查，並用與鹼性磷酸酯酶連接的山羊抗鼠抗體檢測。
12.2.2.2.結果就一個典型循環而言，將50-100ml取自生物反應器培養物的上清液透析至初始緩衝液中，並加到10cm×10mm陽離子交換HPLC上。通過在280nm處吸光值和ELISA法確定峰值級分，並收集。通過280nm處吸光值((ε值1%)在280nm處＝10，如對於CRlc胺基酸成分估計)而測定收集物中蛋白質的濃度。從100ml擴大培養的上清液中純化得到幾十毫克產品。
在一個實例中，當採用陽離子HPLC純化時，通過在280nm處的吸光值的測定100ml來自轉染子pBSCRlc/pTC Sgpt克隆2的培養物上清液產生22mg純化的sCRl，當採用陽離子HPLC純化時，通過在280nm處的吸光率而測定(圖24)。當用CRl ELISA檢驗時，計算得到產率為202%，另外13%是在流過的或柱的洗滌級分中。產率大於100%可能反映了ELISA分析中的基質的影響。
給定培養物上清液從生物反應器中抽出的速率，在該水平的氨甲蝶呤擴增下，每個生物反應器每周可生產約100mg純化的可溶性CRl。該水平的生產能力可以增加的一些方法包括在接種到生物反應器前，用氨甲蝶呤將初始反應物擴增到最大，增加任何一次生產中生物反應器的數量，和採用較大容量的HPLC柱。
12.2.2.3.純化的可溶CRl的特性從陽離子HPLC得到的含有sCRl的峰值級分在陰離子HPLC中進一步純化(圖24)。通過SDS-PAGE對於在不同的步驟中的sCRl物質的純度進行測試(圖25)。在這些高負載凝膠上可看到的較小的帶代表sCRl片段，如通過採用抗CRl單克隆抗體，YZ1或J3D3的Western印跡法所測定的。在大多數製備中，未觀察到sCRl片段色帶。
純化的sCRl的功能活性通過濃度為0.25μg/ml的純化的sCRl可以抑制50%經典的補體介導的溶血作用的能力而測試。在5μg/ml時，純化的可溶性CRl也能夠抑制50%經典的補體C5a的產生，而在13μg/ml時，則可抑制50% C3a的產生(見下面第13章節)。
12.2.2.4.結論如上所述，我們建立了一種純化可溶性CRl的改進的方法，所述的可溶性CRl可以容易地擴大以生產大量治療應用所需的sCRl。該方法的基本要點包括已經溶解的起始原料，這樣，就不需要用去垢劑來溶解與膜結合的CRl。在生物反應器培養基中胎牛血清濃度的減少和/或在培養中採用另一種培養基排除了在隨後的純化過程中從含有sCRl的原料中去除高濃度外源蛋白質的需要。此外，用HPLC方法進行純化提供了大規模純化的方法。陽離子HPLC或先陽離子HPLC，然後陰離子交換HPLC結合的方法均可用於純化。採用這種方法，只以1或2個步驟就可以高產率地獲得基本純的可溶的sCRl。
13.實例可溶性CRl體外活性的實驗
13.1.抑制嗜中性粒細胞的氧化突增。
在心肌梗塞中遭受損害的組織的重輸注損傷模型中，活化的補體組分誘導嗜中性粒細胞的粘連和活化，活化的嗜中性粒細胞經歷氧化突增形成劇毒氧基，這些和其它一些潛在的毒素在嗜中性粒細胞脫粒時釋放出來，破壞周圍的組織。可溶性CRl可通過阻止在嗜中性細胞活化中產生C3a和C5a以及補體組分而減小被破壞的組織的區域。
為了檢驗可溶性CRl阻止在體外補體激活中產生C5a的能力，採用一種生物分析法，它可以對在C5a誘導的氧化突增過程中由嗜中性細胞所產生的氧基進行定量(Bass，D.A.等人，1983，J.Immunol.1301910-1917)。該分析中採用二氯二乙酸螢光素酯(DCFDA)，一種可進入細胞中並殘留下來的脂溶性分子，氧化時可發出強烈的螢光。
13.1.1.材料和方法13.1.1.1.材料採用新鮮的全血，人體補體來源(Beth Israel Hospital，Boston，MA)，乾燥的Baker′s酵母，具有0.1%明膠和5mM葡萄糖的PBS，100mMEDTA，在HBSS中的10mM DCFDA，(Kodak)，紅血細胞(RBC)溶解緩衝液(Ortho Diagnostics)，純化的C5a(Sigma Chemical CO.St.Louis，MO)，和可溶性CRl。
13.1.1.2.嗜中性粒細胞的製備採用Bass(1983，J.Immunol.1301910-1917)所描述的方法來製備嗜中性粒細胞。將2.0ml全血在PBS-明膠-葡萄糖中洗滌3次，再懸浮於5ml在HBSS中的10μM的DCFDA′5ml PBS-明膠-葡萄糖中，於37℃下孵育15分鐘，然後離心分離細胞並重新懸浮於2.0ml PBS-明膠-葡萄糖+5mMEDTA中。
13.1.1.3酵母顆粒的製備將乾燥的Baker′s酵母重懸浮於H2O中，洗滌2次並沸騰30分鐘。將顆粒再在H2O中洗滌2次，並以0.5g/ml重懸浮於水中，(Simpson P.J.等人，上述的)。
13.1.1.4.用純化的C5a來活化嗜中性粒細胞用RBC溶解緩衝液處理100μl載有DCFDA的細胞，在PBS-明膠-葡萄糖-EDTA中洗滌1次，並重懸浮於1.0ml PBS-明膠-葡萄糖中。將50μ1200ng/ml的純化的C5a或對照物在37℃加入0.5ml靶細胞中，在不同的時間間隔下，用流式細胞光度計進行分析。
13.1.1.5.用人血清或血漿中的純化C5a激活嗜中性粒細胞用50μl在人血清或肝素化的血漿中(100ng/ml)以11稀釋的C5a或對照物在37℃下與100μl載有DCFDA的細胞一起孵育30分鐘。RBC被溶解出來，用流式細胞光度計分析嗜中性粒細胞。
13.1.1.6.用酵母顆粒活化的人血清或血漿活化嗜中性粒細胞在37℃下，25μl酵母顆粒與425μl新鮮冰凍的血清和血漿+50μl sCRl或對照物一起孵育30分鐘。然後，將激活的補體或對照樣品離心分離以除去酵母顆粒。每一個這種樣品都在PBS-明膠-葡萄糖-EDTA中進行10次2倍的稀釋。將50μl每一種稀釋後的對照和活化的血清和血漿加入50μl載有DCFDA的靶細胞中，在37℃下孵育30分鐘。然後，溶解出RBC′s，用流式細胞光度計分析嗜中性粒細胞。
13.1.2.結果13.1.2.1.可用DCFDA測定的C5a誘導的人體嗜中性粒細胞中的氧化突增圖26顯示了用純化的C5a刺激後，人體嗜中性粒細胞的螢光強度迅速增加。在加入C5a(最終濃度為20ng/ml)後4分鐘內，嗜中性粒細胞比載有DCFDA的對照嗜中性粒細胞亮10倍。到20分鐘時，嗜中性細胞的亮度則是對照的亮度的20倍。這個分析似乎是C5a的靈敏檢測器。
13.1.2.2.人體血清可阻斷純化的C5a對於嗜中性粒細胞的氧突增作用在與用人血清稀釋的純化C5a一起孵育的，並載有DCFDA的嗜中性粒細胞中沒有觀察到螢光強度的增加。這個效應可能是由於在血凝過程中從血小板中釋放出來的血小板衍生生長因子(PDGF)作用的結果。業已發現，低水平的PDGF可以抑制C5a誘導的嗜中性粒細胞的活化(Wilson E.等人，1987，Proc Natl.Acad.Sci.USA 842213-2217)。
13.1.2.3.肝素化的血漿不阻滯C5a對嗜中性粒細胞的作用在肝素化的血漿中11稀釋的C5a誘導載有DCFDA的嗜中性粒細胞的氧突增。儘管不如在緩衝液中由C5a引起的作用劇烈，在用該嗜中性粒細胞培養30分鐘後，螢光強度增加了10倍。減弱的信號可能是由於在靜脈放血或血漿分離中釋放的PDGF所引起。更溫和及迅速地從血液細胞組分中分離出血漿可使PDGF的釋放最小並可得到較好的C5a功能。
13.1.2.4.存在於補體活化過程中的sCRl阻止C5a的產生在可溶性CRl的存在下，酵母多糖引起人類補體的活化，當用DCFDA測試時發現減少了C5a的活性。如圖27所示，在sCRl存在下被活化的人類血漿的116稀釋液所產生的中性粒細胞中的螢光密度的增加比不存在sCRl時被活化的血漿的116稀釋液少70%。這意味著sCRl對C5a產生抑制作用。對DCFDA測定法及血漿的收集作進一步的改進，可以獲得一個測定可溶性CRl活性的更高效和更為敏感的方法。
13.2.對補體介導的溶血作用的抑制13.2.1 方法對補體抑制能力的測試是通過測定對補體介導的紅細胞溶胞(溶血作用)的抑制來進行的。對溶血作用的抑制是可溶性CRl溶液的一個功能。將sCRl樣品在0.1M Hepes緩衝劑(0.15N NaCl，pH7.4)中稀釋以進行測定，在V形底的微量滴定板上的每個井中加入50μl，一般同一樣品重複3次。將作為補體來源的人類血清用Hepes緩衝液稀釋成1125，在每個井加入50μl。接著，採用商業上可獲得的具有抗綿羊抗體的綿羊紅細胞(Diamedix Cat.No.789-002)，每井中加入100μl，以起始補體的溶血作用途徑。滴定板在37℃下孵育60分鐘，隨後，在500xg下離心10分鐘。移取上清液並置於一個平底的微量滴定板上。溶血作用的程度是通過樣品在410nm處的吸收值來測定的。將僅含人類血清的紅細胞樣品的吸光值As減去僅含紅細胞的樣品的吸收值Ao，得到最大吸收值(相應於最大的溶血作用)Amax。即Amax＝As-Ao。既含有人類血清又含有sCRl的紅細胞樣品的吸收值與僅含有sCRl的細胞樣品的吸收值之間的差值被稱為A樣品。抑制率IH用比值(Amax-A樣品/Amax)表示，而IH50為IH＝1/2時的sCRl的濃度。在監測層析的分部時，未將無血清的對照包括在內，而抗-補體活性是以樣品在410nm處吸收值的降低而作定性監測的。
上述的溶血測試也用於評價人類重組sCRl通過其他種的動物(諸如豚鼠及大鼠)的補體而對綿羊紅細胞胞溶進行抑制的能力。對於各種物種，可用新鮮冷凍的血清或新鮮冷凍乾燥的血清或血漿作為補體來源。有時血清可以購得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo)。
首先對血清溶解活化的紅細胞的能力進行滴定，選樣至少達到最大紅細胞胞解的80%的最大程度的稀釋液，以評價加入的人類sCRl的作用。隨後如上所述，進行測試，並在較佳的稀釋度時用動物血清替代人血清。
13.2.2.結果如圖28所述，純化的sCRl在濃度為0.12μg/ml時，抑制了50%的經典的補體-介導的胞溶。將抗體親和純化的sCRl抑制血細胞胞溶的能力與使用未純化的材料(含有細胞培養物上清液的sCRl)的情況作比較。純化的sCRl的活力與未純化的sCRl的活力相比，兩者在溶血測試中在1.6×108血影細胞/ml時均有50%抑制作用。這就表明，純化步驟未使最終sCRl產物的功能性活力明顯地下降。
為了確定純化的sCRl是否能冷凍保藏，將一份貯於-70℃達一周。當用CRlELISA測定及在280nm下測定吸收值時，經冷凍的sCRl的濃度與未經冷凍者相同，對血細胞溶解抑制的測定表明冷凍過的sCRl的活力也與未經冷凍者相同。
表Ⅸ羅列了人類重組sCRl對於來源於多種物種的補體所介導的血細胞胞溶的抑制能力。
表Ⅸ採用來源於多種動物血清的補體時，對於致敏的綿羊RBC的血細胞溶解作用動物 採用血清的 sCRl的 抑制作用1H＊＊ 1H＊＊最終濃度 抑制作用 (血影細胞/ml) (血影細胞/ml)豚鼠＊ 1500 是 66%(2.6×109) 1.0×109人 1∶500 是 94%(2.5×109) 2.0×108人 1∶312 是 94%(1.2×109) 1.0×107
大鼠 1∶200 是 85%(2.6×109) 2.4×108大鼠＊ 1∶200 是 77%(3.8×109) 1.0×109狗 1∶50 否兔＊ 1∶20 否小鼠＊ 1∶5 否＊購得的冷凍乾燥的血清(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)＊＊如上文所述(第13.2章節)無論是豚鼠或是大鼠的補體都顯示出被人類sCRl所抑制。對於其他的物種沒有明顯的抑制作用可能反映了(a)在測試系統中採用兔抗體及綿羊紅細胞不合適，或者(b)在這個系統中血細胞胞溶需要高濃度的血清。
13.3.C3a及C5a產生的抑制作用13.3.1.方法對補體的抑制能力也可通過對C3a和C5a產生的特異性抑制作用的測試來測定。在所有的實施例中，採用同一個瓶中的人類血清作為補體的來源並分成若干份置於-70℃冷凍。人類IgG(免疫球蛋白G)被熱凝集後，分成若干份置於-70℃下冷凍。在每一個實驗中，每一份血清用要測定的不同濃度的sCRl於37℃進行平衡。加入凝集的人類IgG引發補體作用途徑。每次都包括不含IgG的對照樣品。經過15分鐘固定的反應時間(這是由先前進行的反應時間的研究所確定的，這段時間內C5a或C3a的產生近乎完全，即大於90%)後，用改良的方法，使用購得的放射免疫測定(RIA)盒(C5aRIA，Amersham Cat NO.RPA.520;C3aRIA，Amersham Cat.NO.RPA.518)用放射免疫測定法對釋放的補體肽(C5a或C3a)的濃度水平進行測定。
因為採用的是競爭性的免疫測定法，補體肽(C5a及C3a)濃度和所得計數呈反比，樣品中結合的計數(counts bound(CB)被定作總計數(每分鐘計數，cpm)，是在小丸中測定的。
圖29中的y軸代表抑制率。抑制率等於某一「樣品」的結合計數(CB)，減去「沒有SCRl樣品」的CB，再除以「無免疫球蛋白對照」的(CB)減去「無SCRl樣品」的CB。
抑制率＝ ([(樣品的CB)-(沒有sCRl的CB)])/([(無IgG的CB)-(無sCRl的CB)])13.3.2.結果純化的sCRl的活性是通過測試其在一個活化的人類血清樣品中抑制C5a及C3a產生能力來測定的。
如圖29所示，在測試條件下，純化的sCRl可最大程度抑制100%的C5a的產生，60%的C3a的產生。對C5a的產生，當sCRl的濃度為5μg/ml時，而對C3a的產生，當sCRl的濃度為15-20μg/ml時，可觀察到有50%的抑制作用。這一結果表明重組sCRl對於C5轉化酶的抑制比對C3轉化酶的抑制為更有效。
14.例子可溶性CRl在體內治療活性中的功能的演示14.1.在反相被動阿圖斯氏反應中進行可溶性CRl的體內功能的演示阿圖斯(Arthus)氏反應是一個經典的免疫學誘導炎症反應，通過局部地注射抗原，隨後在循環中與抗體反應。主要的生物反應的特徵為，免疫複合物沉積、補體結合、多形態核(PMN)白細胞浸潤、溶菌酶的釋放、作用於血管的胺的釋放，及局部的組織損傷(參見Uriuhura，T.and Movat，H.Z.，1966，Exp.Mol.Pathol.5539-558;Cochrane，C.G.，1968，Adv.Immunol.997-162)。作為經改良的直接的阿圖斯氏反應，反相被動阿圖斯反應(RPAR)已在確定抗炎症劑方面用作模型(參見Pflum，L.R.and Graeme，M.L.，1979，Agents and Actions 9184-189)。在RPAR中，局部注射抗體，而抗原存在於循環中。
當在大鼠RPAR模型中測定時，可溶性sCRl可以阻止局部炎症反應。該可溶性CRl在體內的這一功能的作用機制可能是通過抑制補體途徑的酶而介導的抑制。
14.1.1.材料及方法對體重在100-125克範圍內的五周齡的Sprague Dawley大鼠(CD株)(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)腹膜內注射0.1至0.3ml的三溴乙醇使之麻醉。該溶液為用1克三溴乙醇溶於15ml Amel乙醇中而形成的原液經12稀釋而成的。剃去大鼠背部的毛，接著，使鼠尾發熱，先用熱水後用發熱的燈泡。採用一個1ml的注射管，將濃度為5mg/ml的溶於0.15M磷酸緩衝鹽的卵白蛋白0.35ml(Calbiochem Corp.，San Diego，CA)在距尾端大約1至2英寸處靜脈注射注入鼠尾靜脈。五分鐘之後，對大鼠皮膚注射0.08ml的濃度為20mg/ml的兔1g，它是抗-卵白蛋白抗體，抗體效價為4mg/ml(Organon Teknika Corp.，Cappel Division，West Chester，PA)或注射0.08ml 20mg/ml的兔Ig G(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)，或注射PBS。每次注射均同樣地施於兩隻大鼠，注射區域用記號筆劃出。隨後在1、4及18小時對大鼠進行監視。24小時之後，將大鼠埋於乾冰中3分鐘而殺死。將注射位點處的皮膚樣品割下，相同的兩個樣品中的一個置於10%福馬林固定以供石蠟包埋，而另一個則冷凍以作冰凍切片。製成的組織切片用蘇木素及曙紅染色。
14.1.2.結果皮膚內注射抗卵白蛋白抗體3至5小時之後，才開始可見有微弱的RPAR反應(例如水腫及紅斑)。反應強度逐漸地加劇，直到24小時之後，反應區域直徑達到3-5mm(見圖30b)。僅注射非免疫兔IgG或PBS的大鼠皮膚上無反應。
在顯微鏡下對取自受損部位的組織切片進行觀察，發現在真皮上，特別是在血管周圍有許多急性炎症細胞(見圖31b)。這都是典型的血管炎及血管周炎所具有的。被觀察的組織顯現了典型的炎症情況，即在血管外有廣泛的PMN浸潤、結締組織中存在紅細胞、及膠原纖維的疏鬆等。
14.1.3.皮內施用可溶性CRl的效果將40μl的0.75mg/ml sCRl與等體積的抗-卵白蛋白或正常兔IgG或PBS混合而製成純化的sCRl混合物。將sCRl∶抗-卵白蛋白混合物或sCRl∶兔IgG混合物、或sCRl∶PBS混合物通過皮內注射入已經靜脈注射了卵白蛋白的大鼠內。僅在注射了sCRl加上抗-卵白蛋白抗體的注射部位出現了可見的損傷(見圖30a)。正如所料，在注射了sCRl∶兔IgG或sCRl∶PBS的部位未發生損傷。當用顯微鏡觀察sCRl∶抗-卵白蛋白注射位點四周的組織切片時，沿血管四周可見PMN簇及單核細胞簇，但是卻沒有廣泛的PMN浸潤或紅細胞的外滲(見圖31a)。這些數據表明，施用可溶性CRl可引起對內皮細胞損傷及炎症反應的抑制作用。
為了測定在上述的卵白蛋白大鼠模型中，阻止RPAR所必需的sCRl的最低有效數量，分別地將0.75mg/ml SCRl原液十倍地系列稀釋(即原液、1/10、1/100、1/1000及1/10，000)進行測定。對每個sCRl稀釋液與等體積的抗-卵白蛋白抗體的原液或二分之一稀釋液混合。每個注射部位的注射總量為80μl。sCRl抑制RPAR的能力是劑量依賴性的，每個注射位點施用300毫微克時，可明顯地觀察到水腫的減少(見表Ⅹ)。
表ⅩsCRl的劑量對RPAR抑制作用的影響sCRl(微克/位點) RPAR殘留的程度30 +/-3 +/-0.3 +/-0.03 ++0.003 ++++0 ++++14.2.體內施用sCRl的藥物動力學如下對sCRl的體內的生物半衰期進行測定。對相似周齡(六周)及體重(110-125克)的大鼠，通過靜脈注射含250μg sCRl的注射液0.35ml。分別於注射後2分鐘、5分鐘、10分鐘、60分鐘、及24小時，將大鼠殺死，並用靜脈腔穿刺取出血液。在1800rpm下離心10分鐘，從每隻鼠獲得1-2ml血清，用CRl ELISA對每一樣品中的sCRl的量進行測定。將1μg/ml純化sCRl的二倍稀釋液加入對照大鼠血清或無血紅蛋白的血影細胞(1.6×108個血影細胞/毫升)的去垢劑胞溶物中作為CRl的標準物。結果示於表Ⅺ。
表Ⅺ隨時間變化的注射入sCRl的血清濃度變化的藥物動力學數據靜脈注射後的時間 sCRl濃度(μg/ml)對照 0.012分鐘 0.17
5分鐘 0.8010分鐘 1.0160分鐘 0.3824小時 0.49這些數據表明，sCRl在靜脈注射後24小時還可被測出。在24小時，sCRl在血清中的水平為注射後10分鐘所觀察到的峰值的一半。
14.3.sCRl減小大鼠重新輸注(REPERFUSED)梗塞心肌的梗塞區的大小如上所述的在體外試驗中具有抑制補體途徑C3/C5轉化酶活性的能力的sCRl也可在體內用於大鼠心肌梗塞模型，可以減少受重新輸注損傷的程度。
大鼠的心肌梗塞可以通過結紮冠狀血管而引起。如在心肌梗塞發生後頭幾個小時後進行測定，發現重新輸注(reperfusion)可減小梗塞區大小，改善左心室的功能，因而減少死亡率(參見Braunwald，E.and Kloner，R.A.，1985，J.Clin.Invest.761713-1719)。然而，重新輸注至已嚴重局部缺血但並非不可逆的損傷的心肌，其本身可能產生或擴大損傷。重新輸注(reperfusion)引起損傷的機理包括，由於氧自由基及細胞鈣過載而引起損傷等。白細胞單獨地或與微血管內皮細胞一起作用可能對可這種損傷起作用。這一過程可能涉及補體的激活(參見Rossen，R.D.，et al.，1985，Cir.Res.57119-130;Crawford，M.H.，et al.，1988，Circulation 781449-1458)。
14.3.1.方法14.3.1.1引發大鼠心肌梗塞用吸入甲氧氟烷(methoxyflurane)的方法麻醉十四隻體重在200至250克的大鼠，將右頸靜脈切斷，插入套管。其中的一半大鼠(七隻)通過套管得到2ml(1mg)sCRl，而另一半大鼠則以相似的方式被施於2ml製備的鹽水安慰劑。移去大鼠頸套管，結紮頸靜脈，並縫合傷口。隨後在第五、六肋骨間對大鼠施行左胸胸廓切開術，同時對大鼠通以間歇的正壓的95%氧氣及5%二氧化碳混合氣體。接著進行心包切開術，在鄰近主動脈的左側處2-3mm內縫合結紮左冠狀動脈。冠狀動脈扎結的後果是在一個大區域具有形成前透壁梗塞的危險。在大鼠仍處麻醉狀態時暫時關閉胸腔。閉合35分鐘之後，重新打開胸腔，並拆去縫線，要適當地選擇這段時間以保證處於危險之中的區域的相當一部份具有挽救的可能。隨後，永久地關閉胸腔，並且可以讓大鼠從麻醉中甦醒，一般於術後5至10分鐘之內。通過肌肉注射對大鼠施以100，000單位的苄星青黴素G及0.25mg/kg嗎啡硫酸鹽。對大鼠餵以水及標準鼠飼料，一周之後，使之肝素化，用甲氧氟烷(methoxyflurane)麻醉，隨後切除心臟而殺死大鼠。
14.3.1.2.實驗梗塞的形態分析製取供研究的心臟切除心臟之後，迅速地在主動脈上插上套管，首先向冠狀動脈輸以Krebs Henseleit溶液以清除血及血凝塊，隨後輸以30mMKC1以舒張停博的心臟。對冠狀動脈灌注及浸入10%緩衝的福馬林，固定該心臟。為了對注入壓力有足夠的控制，在心臟上二尖瓣瓣膜處通以塑料管。固定之後，將心臟自底部一直至尖端沿著平行於房室溝的平行線橫切成2mm的切片，製成組織切片。
14.3.2.結果兩組的存活率是一致的，即，七隻之中六隻存活7天，用作分析。對組織切片進行大致的觀察，發現用安慰劑(placebo)處理的六隻中五隻呈現較大的透壁性(transmural)心肌梗塞(據估計至少佔有左心室的15%)。而在存活的用sCRl處理6隻的大鼠中，僅一隻發現有大區域透壁性梗塞。其他的經sCRl處理的大鼠在左心室具有小得多的小補釘塊狀的梗塞(少於15%)。事實上，多數梗塞只有憑顯微鏡才可以察出，而用安慰劑處理的大鼠的梗塞十分明顯，粗略一看便可察覺。
14.3.3.結論結果表明，sCRl處理對於減輕體內重新輸注(reperfusion)損傷是有效的，具有可以改善心肌梗塞的病症的效果。甚至可以在一定程度上改善重新輸注的(reperfusion)損傷，被挽救的心肌的絕對數量可以增加，而且可以延長重新輸注(reperfusion)在臨床上是用用的時間。用sCRl治療應該是伴隨於對急性梗塞時所作的溶血栓處理，如下所述，或囊冠狀血管成形術治療中的有用的輔助療法。
15.實例可溶性補體受體1(sCR-1)與對甲氧苯醯化人類血纖維蛋白溶酶原-鏈激酶-激活劑複合物(APSAC)的共同製劑將如12.2節中所述製備的純化sCR-1(0.93毫克在無菌Dulbecco磷酸緩衝鹽水中，1.0毫升)加入在無菌水(4.0毫升)中復甦的一小瓶APSAC中。APSAC製劑具以下成分APSAC 30單位D-甘露醇 100毫克人類血清白蛋白E.P. 30毫克對氨基苯基p′-茴香酸鹽·HCl 0.15毫克L-賴氨酸·HCl 35毫克6-氨基己酸 1.4毫克(所有數字都經過一般分析方差)溶液充分混和，用固體CO2使小瓶在-78℃冷凍。產物在2-3毫巴/-60℃(壓縮溫度)真空冷凍乾燥24小時，小瓶重新塞住，在-70℃保存。復甦時，將小瓶溶於0.1M Hepes，0.15M NaCl pH7.4(1.0毫升)，並置於冰上。測試用的稀釋液也用此Hepes緩衝液製備。作為對照，一瓶單獨的APSAC(同一批)用同樣方式復甦，一種新鮮解凍的sCR-1樣品(同一批)也作為對照進行了測試。根據13.2.1節中所述的方法，測定樣品對補體介導的溶血的抑制作用，結果示於下面的表Ⅻ。
表ⅫSCR-1/APSAC，APSAC和sCR-1抗溶血活性的比較對照溶血的抑制百分數稀釋液 最終sCRl濃度 sCR-1/APSAC sCR-1 APSAC(ng/ml)1500 465 97.5(1.1) 96.8(1.2) O12500 93 90.9(0.7) 90.6(1.3) O15000 46.5 81.5(2.3) 82.6(2.5) ND112500 18.6 54.6(2.4) 51.4(2.6) O150000 4.65 11.0(2.4) 13.2(0.6) O＊在括號內的數字是四次重複測定的標準誤差表Ⅻ中的彎曲排列的數字給出50%抑制溶血的sCR-1的濃度值，對sCR-1/APSAC為15.7±3.0ng/ml，對單獨SCR-1為16.0±2.9ng/ml。這些數字沒有差異，結果表明與一個APSAC藥物劑型的共同製劑並不影響sCR-1的活性。
16.微生物保藏帶有質粒piABCD且編碼全長CRl蛋白質的E.coli菌株DK1/P3(稱之pCRl-piABCD)已於1988年3月31日保藏在美國伊利諾斯州、皮奧裡亞、農業研究培養物收集處(NRRL)。保藏號為B-18355。
帶有編碼可溶性CRl分子的質粒pBSCRlc/PTCSgpt克隆35.6的中國倉鼠卵巢細胞系DUXBll已於1989年3月23日由美國、馬裡蘭州，羅克維萊的美國典型培養物保藏中心(ATCC)保藏，保藏號為CRL10052。
本發明並不限於由保藏的微生物所規定的範圍，因為具體保藏的微生物為本發明的一方面的一個實例，而功能上等同的任何微生物均在本發明的範圍之內。當然，除了本文中所說明和敘述的之外，自上述的說明書和附圖得出的本發明的各種改進對於本技術領域中的技術人員來說將是顯而易見的。應當認為，這樣一些改進均包括在以下的權利要求書的範圍內。
還應指出，文中所給核苷酸的所有鹼基對大小均是近似的且用於敘述的目的。
這裡引用了各種參考資料，本申請結合參考資料已全文公開。
權利要求
1.一種核酸順序，其特徵在於它包括一基本如圖1所示的核苷酸順序，或其包含70個核苷酸的順序。
2.根據權利要求1所述的順序，其特徵在於它包括一cDNA順序。
3.根據權利要求1所述的順序，其特徵在於它包括一基因組DNA順序。
4.根據權利要求1所述的順序，其特徵在於它包括RNA順序。
5.一種重組核酸載體，其特徵在於它包括權利要求1的順序。
6.一種重組核酸載體，其特徵在於它包括權利要求2的順序。
7.一種重組DNA載體，其特徵在於它包括pABCD。
8.一種重組DNA載體，其特徵在於它包括由NRRL保藏的，保藏號為B-18355的piABCD。
9.一種重組表達載體，其特徵在於它包括權利要求1的順序。
10.根據權利要求9所述的表達載體，其特徵在於它能夠在細菌中表達順序。
11.根據權利要求9所述的表達載體，其特徵在於它能夠在一個哺乳動物細胞中表達順序。
12.根據權利要求11所述的表達載體，其特徵在於它包括由NRRL保藏，保藏號為B-18355的piABCD。
13.一種重組細胞，其特徵在於它包括權利要求1的順序。
14.一種重組細胞，其特徵在於它包括一含有權利要求5的核酸載體的細胞。
15.一種重組細胞，其特徵在於它包括一含有權利要求6的核酸載體的細胞。
16.一種重組細胞，其特徵在於它包括一含有權利要求9的核酸載體的細胞。
17.一種重組細胞，其特徵在於它包括一含有權利要求11的核酸載體的細胞。
18.根據權利要求13、14或15所述的重組細胞，其特徵在於它包括一種細菌。
19.一種大腸桿菌(Escherichia coli)，其特徵在於它包含由NRRL保藏，保藏號為B-18355的piABCD。
20.一種核酸順序，其特徵在於它包括一編碼基本缺含跨膜區的CRl分子的順序。
21.根據權利要求20所述的核酸順序，其特徵在於CRl分子由在其中表達的細胞分泌。
22.根據權利要求20所述的核酸順序，其特徵在於經測試體外抑制嗜中性粒細胞的氧化突增、補體介導溶血作用或者C3a和C5a產生的能力，該CRl分子是功能性的。
23.一種重組核酸載體，其特徵在於它包括權利要求20或21的順序。
24.一種如權利要求23所述的重組核酸載體，其特徵在於它是表達載體。
25.根據權利要求24所述的表達載體，其特徵在於它是從由pBSCRlc、pBSCRls、pBM-CRlc、pBSCRlc/PTCSgpt以及pBSCRls/pTCSgpt組成的組中選出來的。
26.根據權利要求24所述的表達載體，其特徵在於它是從由pT-CRlc1、pT-CRlc2、pT-CRlc3、pT-CRlc4以及pT-CRlc5組成的組中選出來的。
27.一種重組DNA載體，其特徵在於它包括由ATCC保藏，保藏號為CRL10052的質粒pBSCRlc/pTC Sgpt。
28.一種重組細胞，其特徵在於它包括權利要求19、20或21的順序。
29.一種重組細胞，其特徵在於它包括一含有權利要求23的載體的細胞。
30.根據權利要求28所述的重組細胞，其特徵在於它包括一種細菌。
31.根據權利要求29所述的重組細胞，其特徵在於它包括一個哺乳動物細胞。
32.一種重組細胞，其特徵在於它包括一含有權利要求24的載體的細胞。
33.一種重組細胞，其特徵在於它包括一種含有權利要求27的載體的細胞。
34.一種中國倉鼠卵巢細胞DUXB11，其特徵在於它帶有由ATCC保藏，保藏號為CRL10052的質粒pBSCRlc/pTCSgpt。
35.一種蛋白質，其特徵在於它包括基本上如圖1所示的胺基酸順序，或其包含24個胺基酸的片段。
36.一種核酸順序，其特徵在於它編碼權利要求35的蛋白質或片段。
37.一種權利要求35的蛋白質或片段，其特徵在於它有結合C3b的能力。
38.一種權利要求35的蛋白質或片段，其特徵在於它有結合C4b的能力。
39.一種權利要求35的蛋白質或片段，其特徵在於它有能夠結合C3b和結合C4b的能力。
40.一種權利要求35的蛋白質或片段，其特徵在於它具有因子I輔助因子活性。
41.一種權利要求35的蛋白質或片段，其特徵在於它具有抑制C3轉化酶活性。
42.一種權利要求35的蛋白質或片段，其特徵在於它具有抑制C5轉化酶活性。
43.根據權利要求35所述的蛋白質或片段，其特徵在於它是糖基化的。
44.根據權利要求35所述的蛋白質或片段，其特徵在於它未被糖基化。
45.根據權利要求35所述的蛋白質或片段，其特徵在於它缺乏信號順序。
46.根據權利要求35所述的蛋白質或片段，其特徵在於它基本上缺乏一跨膜區。
47.根據權利要求35所述的蛋白質或片段，其特徵在於它是分泌的。
48.根據權利要求35所述的蛋白質，其特徵在於它表達為一細胞表面蛋白質。
49.一種CRl分子，其特徵在於它基本上缺少一跨膜區。
50.根據權利要求49所述的CRl分子，其特徵在於它在細胞中表達並被細胞所分泌。
51.根據權利要求50所述的CRl分子，其特徵在於它未被糖基化。
52.根據權利要求50所述的CRl分子，其特徵在於它是糖基化的。
53.根據權利要求49所述的CRl分子，其特徵在於經檢測其體外抑制嗜中性粒細胞的氧化突增、補體介導的溶血作用或者C3a和C5a產生的能力，表明它是功能性的。
54.根據權利要求49所述的CRl分子，其特徵在於它是從由pBSCRlc、pBSCRls、pBM-CRlc、pBSCRlc/pTCSgpt以及pBSCRls/pTCSgpt組成的組中選擇出來的一種核酸載體所編碼。
55.根據權利要求49所述的CRl分子，其特徵在於它是從由pT-CRlc1、pT-CRlc2、pT-CRlc3、pT-CRlc4以及pT-CRlc5組成的組中選擇出來的一核酸載體所編碼。
56.根據權利要求49所述的CRl分子，其特徵在於它由帶有由ATCC保藏，保藏號為CRL10052的質粒pBSCRIC/pTCSgpt的一中國倉鼠卵巢細胞DUXB11表達。
57.一種分子，其特徵在於它包含權利要求37、38或39的蛋白質或片段。
58.一種分子，其特徵在於它包含權利要求40、41或42的蛋白質或片段。
59.一種分子，其特徵在於它包含權利要求49、50或53的CRl分子。
60.一種分子，其特徵在於它包含權利要求54、55或56的CRl分子。
61.一種重組細胞，其特徵在於它在表面上表達權利要求35的蛋白質或片段。
62.一種重組細胞，其特徵在於它在表面上表達權利要求37、38或40的蛋白質或片段。
63.一種重組細胞，其特徵在於它表達權利要求49的蛋白質或片段。
64.一種重組細胞，其特徵在於它表達權利要求50的蛋白質或片段。
65.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病的病人的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求35的蛋白質或片段。
66.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病的病人的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求37或38的蛋白質或片段。
67.一種患有免性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病的病人的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求40、41或42的蛋白質或片段。
68.一種有錫疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病人的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求46、47或48的蛋白質或其片段。
69.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病的病人的治療方法，其特徵在於它包含給病人權利要求49的分子。
70.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病的病人的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求50的分子。
71.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補體活性的疾病的病人的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求56的分子。
72.一種治療或防止心肌梗塞對病人造成損傷的治療方法，其特徵在於它包括給病人權利要求35的分子。
73.一種治療或預防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求49的分子。
74.一種治療或預防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求53的分子。
75.一種治療或預防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求53的分子。
76.一種治療或預防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求54的分子。
77.一種治療或預防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求55的分子。
78.一種治療或預防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求56的分子。
79.一種治療或預防由於炎症所引起的病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求35的分子。
80.一種治療或預防由於炎症所引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求49的分子。
81.一種治療或預防由於炎症所引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求50的分子。
82.一種治療或預防由於炎症所引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求53的分子。
83.一種治療或預防由於炎症所引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求54的分子。
84.一種治療或預防由於炎症所引起病人損傷的方法，其特徵在於它包括給病人權利要求55的分子。
85.一種治療或預防由炎症引起的病人損傷的方法，其特徵在於給病人權利要求56的分子。
86.一種藥物組合物，其特徵在於它包含有效量的權利要求35、37或38的蛋白質或片段，及藥理學上合格的載體。
87.一種藥物組合物，其特徵在於它包含有效量的權利要求39、40或41的蛋白質或片段，及藥理學上合格的載體。
88.一種藥物組合物，其特徵在於它包含有效量的權利要求42的蛋白質或片段，及藥理學上合格的載體。
89.一種藥物組合物，其特徵在於它含有效量的權利要求49、50或53的CRl分子，及藥理學上合格的載體。
90.一種藥物組合物，其特徵在於它包含有效量的權利要求54、55或56的CRl分子，及藥理學上合格的載體。
91.一種CRl蛋白質或其片段的純化方法，其特徵在於它包括(a)獲得含有CRl蛋白質或片段的樣品;(b)使所說的樣品經陽離子交換高壓液相層析;(c)從高壓液相層析柱洗脫所說的蛋白質或片段。
92.根據權利要求91所述的方法，其特徵在於在步驟(c)之後還包括(d)使所說的蛋白質或片段經陰離子交換高壓液相層析;(e)從步驟(d)的高壓液相層析柱洗脫所說的蛋白質或片段。
93.根據權利要求91或92所述的方法，其特徵在於CRl蛋白質或片段基本上缺少一跨膜結構區。
94.一種CRl分子的純化方法，其特徵在於它包括(a)在培養的細胞中表達一種基本上缺少跨膜結構區的CRl分子，並使它分泌;(b)獲得含有CRl分子的細胞培養液的樣品;(c)使所說的樣品經陽離子高壓液相層析;(d)從高壓液相層析柱上洗脫所說的CRl分子。
95.根據權利要求94所述的方法，其特徵在於在步驟(c)之後還包括(d)使所說的分子經陰離子交換高壓液相層析;(e)從步驟(d)的高壓液相層析柱洗脫所說的分子。
96.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求13的細胞生長。
97.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求14的細胞生長。
98.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求15的細胞生長。
99.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求16的細胞生長。
100.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求28的細胞生長。
101.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求29的細胞生長。
102.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求30的細胞生長。
103.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求31的細胞生長。
104.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求32的細胞生長。
105.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求33的細胞生長。
106.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求34的細胞生長。
107.一種產生CRl分子的方法，其特徵在於它包括使權利要求35的細胞生長。
108.一種治療人類和動物中血栓形成疾病的方法，其特徵在於它包括給需要的人或動物有效量的可溶性CRl蛋白質，及有效量的溶血栓劑。
109.根據權利要求108的方法，其中可溶性CRl蛋白質和溶血栓劑是同時給藥的。
110.根據權利要求108的方法，其特徵在於CRl蛋白質是由從由pBSCRlc，pBSCRls，pBM-CRlc，pBSCRlc/pTCSgpt，和pBSCRls/pTCSgpt組成的組中選出的核酸載體編碼的。
111.根據權利要求108的方法，其中溶血栓劑是血纖維蛋白溶酶原激活劑。
112.根據權利要求108所述的方法，其特徵在於溶血栓劑是從下列組中選出的，包括組織血纖維蛋白激活劑或其突變蛋白質，單鏈尿激酶，雙鏈尿激酶，鏈激酶，及血纖維蛋白活性雜合蛋白質，該雜合蛋白質包括雙鏈蛋白酶中的一條鏈與另一不同雙鏈蛋白酶的一條鏈結合，其中至少有一條鏈來自血纖維蛋白溶解活性蛋白酶，這樣雜合蛋白質有對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點，它可任意地被可移動的阻斷基團所阻滯。
113.根據權利要求108的方法，其特徵在於溶血栓劑是一種體內被可逆性阻斷的血纖維蛋白溶解酶，其中對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點被一基團所阻斷，當水解準一級速率為10-6/秒至10-3/秒，在等滲含水介質中，pH7.4，37℃時，該基團可被移動。
114.根據權利要求108所述的方法，其特徵在於該溶血栓劑是甲氧苯甲醯化鏈激酶一血纖維蛋白溶酶原一激活劑複合物(APSAC)
115.一種藥物組合物，其特徵在於它包括可溶性CRl蛋白，一溶血栓劑，以及藥理學上合格的載體或賦形劑。
116.根據權利要求108的藥物組合物，其特徵在於溶血栓劑是甲氧苯甲醯化鏈激酶-血纖維蛋白溶酶原激活劑複合物(APSAC)。
117.根據權利要求108所述的一種藥理學組合物，其特徵在於可溶性CRl蛋白質由中國倉鼠卵巢細胞DUX B11表達，該細胞帶有在ATCC保藏，保藏號為CRL 10052的質粒pBSCRlc/pTCSgpt。
全文摘要
本發明涉及C3b/C4b受體(CRI)基因及其編碼的蛋白質。還涉及CR1核酸順序及其含70核苷酸的片段和其編碼的含24胺基酸的肽或蛋白質。本發明還提供了CR1蛋白質及其片段的表達。本發明的基因和蛋白質用於涉及補體活性的疾病、各種免疫系統或炎症疾病的診斷和治療。本發明實施例敘述全長CR1cDNA及其片段的克隆、核苷酸順序及推斷的胺基酸順序、CR1蛋白質及其片段的表達，以及缺少跨膜區的分泌CR1分子表達。該分泌CR1分子可減少炎症引起的損傷，減小心肌梗塞的大小及防止重輸注損傷。
文檔編號C07K14/715GK1053265SQ9010814
公開日1991年7月24日 申請日期1990年9月26日 優先權日1988年4月1日
發明者道格拉斯·T·費倫, 勞埃德·B·克裡克斯特, 溫尼·W·王, 熱拉爾德·R·卡森, 麥可·F·孔奇諾, 史蒂芬·H·Ip, 薩瓦斯·C·馬克裡德斯, 享利·C·馬奇·Jr 申請人:約翰斯霍普金斯大學, 布裡格姆和婦女醫院, T細胞科學集團