分化調節試劑及其應用的製作方法

2023-05-17 15:58:36 1

專利名稱：分化調節試劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及用於調節前脂肪細胞(preadipocyte)分化潛能和/或增殖的方法和試劑。本發明尤其涉及引起前脂肪細胞增殖和加強前脂肪細胞向脂肪細胞分化的成纖維細胞生長因子(FGF)信號傳輸，特別是FGF-1和FGF-2信號傳輸。更具體地說，本發明涉及包括Fgf或FGF受體(Fgfr)多核苷酸或其表達產物特異性拮抗劑分子在內的降低、削弱或阻斷FGF信號傳輸的分子及其在脂肪形成的負調節(包括下調前脂肪細胞的分化潛能和/或增殖)中的應用。本發明也延伸到為提高前脂肪細胞的分化潛能和/或增殖而使用包括Fgf多核苷酸和FGF多肽及其具有生物活性的片段、變異體和衍生物在內的FGF或FGFR激動劑分子。此外，本發明延伸到篩選包括調節選自Fgf基因、Fgfr基因或與其屬於同一生物合成或調控途徑的基因的基因表達、或調節該基因表達產物水平或功能活性在內的激活或拮抗FGF信號傳輸的有用試劑的方法。此外，本發明涉及在用於治療或預防包括但不僅限於肥胖、脂肪瘤、脂肪過多症、惡病質或脂肪營養不良等脂肪相關疾病或創傷或萎縮性疾病中的脂肪組織缺失的方法中這些調節試劑的應用。
背景技術：
肥胖隨著傳統「西方」國家的高脂肪飲食和缺乏運動的生活方式優於各種族傳統生活方式被採納，肥胖不再局限於傳統上的「西方化」社會而成為一個全球性的健康問題(Doll等，Int J Obes Relat Metab Disord 26(1)48-57，2002；Fall，Br MedBull 6033-50，2001)。肥胖症的發病率，尤其是兒童肥胖症，正以比幾乎其他任何醫學疾病更快的速度上升。全球約有2千2百萬5歲以下的兒童超重(Deckelbaum等，Obes Res 9增刊4239S-243S，2001)，全球7％以上的成人肥胖，此外還有約21％的成人被歸為超重(Seidell，Acta Paediatr Suppl 88(428)46-50，1999)。世界衛生組織將成人中肥胖症的高發病率描述為「全球流行病」。
肥胖症與諸如心血管疾病和II型糖尿病(2001年秋，同上)等嚴重的並存病的關聯是將其歸為一種嚴重的醫學疾病的原因(James等，Obes Res 9 Suppl 4228S-233S，2001)。肥胖症所引發的對衛生保健預算的明顯財政影響使得肥胖症的治療和預防已成為健康促進戰略中一個主要的優先考慮問題。這些戰略的目標是通過限制熱量攝入和增加體育運動降低體重，這樣的目標的前提是建立在即便是病態肥胖的個體，其體重降低能夠導致肥胖相關病理狀態的減退或好轉這樣的證據上的(Melissas等，Obest Surg 11(4)475-81 2001)。
不幸的是，這些策略只獲得了有限的成功。不斷增長的全球肥胖率已使這些肥胖症治療和預防策略的焦點轉向代謝和遺傳治療手段的介入。為了使得這樣的介入獲得成功，需要對脂肪沉積的細胞機理有詳細的理解。
人體脂肪組織是貫穿生命歷程的由胞內貯存的甘油三酯和脂肪細胞構成的具有恆定通量的動態器官。新的脂肪細胞由前脂肪細胞通過增殖和分化形成，這一過程稱之為脂肪形成。前脂肪細胞是在脂肪組織的基質血管區發現的成纖維細胞類似細胞。抑制脂肪形成的治療介入手段應該會在嚴重超重病人的治療中具有深遠的臨床應用。
迄今為止，研究發現了一些能引起脂肪細胞大小和數量改變的細胞和分子事件的蛋白質、神經肽和轉錄調控因子。這些試劑的作用表明脂肪細胞數量和大小通過一種由激素和營養信號(它們通過以細胞-細胞或細胞-基質模式發生作用的分子觸發下遊信號傳輸)參與的、複雜的相互影響方式發生改變(Gregoire，Exp Biol Med(Maywood)226(11)997-1002 2001)。這些分子的完全功能及其相互作用以及對脂肪細胞的作用方式還未最終確定。
通過動物和人前脂肪細胞分離及其體外複製和分化技術的發展，脂肪形成的很多方面已經得到了認識。通過研究在體外分化成類脂肪細胞的小鼠前脂肪細胞細胞系(如3T3-L1)獲得了更進一步的認識。
在人體組織中，前脂肪細胞通過採用膠原酶消化和在含血清培養基中培養的方式從脂肪組織中分離。在達到融合時(經過或未經過在先的次培養)細胞在不含血清的化學或激素改造過的培養基中分化。這一過程就所需時間和獲得成熟脂肪細胞表型的細胞的低百分率而言是相對低效的。
促有絲分裂原和胰島素能促進複製，這一過程需要血清。血清完全抑制分化期，而胰島素、皮質類固醇、甲狀腺激素和生長激素增強分化。最近的研究表明，噻唑烷二酮(TZD)類藥物通過與PPARγ(在脂肪形成中居於中心地位的配基依賴型轉錄因子)結合激活分化。
在本發明前期的工作中，提出了血管細胞和脂肪細胞之間發生相互作用的假設。已知在脂肪形成之前，先形成了良好的血管網絡(Hutley等，Am J PlaysiolEndocrinol Metab 281(5)E1037-1044，2001)，而前脂肪細胞和微血管內皮細胞之間的旁分泌相互作用也已被提出(Hutley等，如前文引用)(Varzaneh等，Metabolism 43(7)906-12，1994)。在分離侯選的旁分泌化合物的嘗試中，本發明的發明人共培養了人前脂肪細胞和微血管內皮細胞(MVEC)並發現酸性成纖維細胞生長因子(aFGF，也稱之為FGF-1)存在於培養基中。最初的研究意外地指出這一生長因子的來源主要是MVEC，與以前的研究結果相反，與FGF-1共培養的前脂肪細胞明顯促進其生長與複製，並對細胞分化為成熟脂肪細胞具有重要的正向作用。鑑於FGF家族不同成員之間潛在功能的重複性，相信其他的一個或多個FGF可能也與直接或間接調節脂肪形成相關聯。事實上，最初的研究指出鹼性FGF(也稱之為FGF-2)具有與FGF-1類似的促脂肪形成作用。
成纖維細胞生長因子(FGF)成纖維細胞生長因子家族是結構相關的多肽生長因子，包括20多種具有蛋白識別反應能力的成員。家族成員之間具有有限的直接編碼序列同源性。由於刺激生長不是家族成員中普遍的特性，家族名稱易於引起誤解。但是，作為一個家族，FGF在生長發育、細胞複製、血管生成、細胞生存和凋亡、腫瘤發展和形態形成中具有關鍵作用。FGF屬於更大的肝素結合生長因子家族，該家族包括大量生長因子，其中一些具有與FGF相似或互補的作用。
FGF由許多不同的基因編碼並具有相似的內含子-外顯子組織結構，在FGF1-6中有3個編碼區。由120個胺基酸組成的中間核心區域高度保守(70-100％相同)，而其他區域則表現出顯著的序列差異性。
成纖維細胞生長因子在信號肽或定位序列的存在、糖基化位點和翻譯後修飾等方面存在差異。許多FGF在選擇性啟動子使用(如FGF-1)、選擇性剪接(如FGF-1和-2)和選擇性多聚腺苷化位點的使用上(如FGF-1和FGF-2)表現出差異。使用組織特異性啟動子是提供特異性功能的一種機制(如FGF-1)。
所有FGF都能從細胞中釋出，但有些也在產生細胞和靶細胞的細胞核或胞質中積累。此外，分泌的FGF貯存在胞外基質中，其進一步的釋放受蛋白酶控制。FGF通過以下兩種機制中的一種從胞外基質中釋放。第一種，胞外基質成分通過蛋白酶或肝素酶的酶裂解導致FGF釋放。第二種，FGF能與擔體蛋白(FGF-BP)結合，而後者能運送FGF至其受體。目前公認，肝素或乙醯肝素類糖胺聚糖是實現有效FGF信號傳輸的基礎。一些FGF表達的組織特異性和/或分化階段特異性已有報導。
FGF家族與胞外基質成分的結合被認為產生兩個效果a)保護FGF免受循環的蛋白酶降解；b)形成生長因子的局部貯存庫。由於只有與胞外基質接觸的細胞易於接受FGF信號，上述第二個特點允許對FGF信號傳輸實現嚴格的空間調節。
成纖維細胞生長因子受體(FGFR)與其配體類似，FGF受體(FGFR)包括一個編碼至少5種結構上相關聯的蛋白的基因家族。它們是酪氨酸激酶類受體成員並廣泛表達。5種受體的胺基酸序列具有60-95％的同源性，其中最保守的區域與信號轉導密切相關。FGF與受體的結合具有不同的特異性，這一特點結合受體的細胞特異性表達及其不同剪切形式，提供了信號傳輸的進一步差異性。除了定位於細胞膜，FGFR也在核膜內和細胞質基質中表達。針對FGF的信號轉導通過受體的二聚化及與硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)形成複合物的方式發生。隨後，FGFR胞內結構域上多位點的磷酸化引發多種下遊信號轉導分子和信號途徑的募集和/或磷酸化。FGFR包含最多3個典型的類免疫球蛋白(Ig)胞外結構域，這將FGFR歸於Ig受體超家族(還包括PDGFR和IL-1R)。
FGF信號傳輸的差異性歸結於受體組合的細胞特異性表達、受體異構體組合的細胞特異性表達、多種異源二聚體組合以及FGF的不同組成。
硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)HSPG是與核心蛋白共價結合的硫酸化的糖胺聚糖，能促進FGF-FGFR的相互作用。這可能是由於HSPG引起FGF和FGFR的構形改變，使其分別二聚化並互相結合，或是由於HSPG與FGF和FGFR形成具有活性的信號傳輸複合物的一部分。實驗證據支持上述兩種模型的存在，很可能這兩種機制均存在。一些FGF早期反應可能在無HSPG參與的情況下被引發，但HSPG似乎是持續的信號傳輸所必需的。
HSPG同時也保護FGF，使其在胞外基質中免受降解。目前，參與FGF信號傳輸的HSPG包括多配體蛋白聚糖(多配體蛋白聚糖)(細胞關聯的跨膜蛋白聚糖)，磷脂醯肌醇蛋白聚糖(磷脂醯肌醇蛋白聚糖)(通過糖基磷脂醯肌醇基團錨定在質膜上的蛋白聚糖)和基底膜蛋白聚糖(基底膜蛋白多糖)(胞外基底膜蛋白聚糖)。HSPG參與FGF信號傳輸的調控的證據來自於體外研究和對HSPG突變的個體的研究。例如，這些研究表明，磷脂醯肌醇蛋白聚糖(磷脂醯肌醇蛋白聚糖)能促進FGF-2誘導的促有絲分裂但抑制FGF-7反應。
富含半胱氨酸的FGFR富含半胱氨酸的FGFR(CFR)是不含硫酸乙醯肝素鏈的、與FGF結合的、整合在細胞膜上的唾液酸糖蛋白。FGF以互相排斥的方式與CFR和FGFR結合。CFR可能在將FGF定位於胞內位點和調節胞內FGF濃度中發揮作用。
FGF信號傳導途徑1.FGFR依賴的細胞內信號傳輸如上文所描述，並參照圖1所示的FGF信號傳輸途徑的示意性表示，配體的結合導致受體的二聚化和自我磷酸化。突變分析顯示，僅二聚化便足以促進信號轉導。FGFR含有多個磷酸化位點(如FGFR-1含7個磷酸化位點)而磷酸化位點突變的、激酶失活的受體不能傳導多種FGF的生物信號。然而，一些作用得到了保留，這表明非受體介導的信號傳輸途徑是重要的考慮因素。
已知的FGF/FGFR採用的信號傳輸途徑有(1)SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途徑和(2)PLCγ□□、PKC、Ca2+途徑。
a)SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途徑隨著受體磷酸化，含src同源(SH-2)結構域和磷酸酪氨酸結合(PTB)結構域的蛋白與FGFR胞內的特異磷酸酪氨酸結合。這些蛋白包括PLCγ、SHC和FRS2(FGFR底物2)，這些分子中的一些是FGFR特異的(如FRS2)，而其他一些則是更為隨意的(如SHC)。隨著磷酸化，這些「船塢蛋白」(docking protein)直接與GRB2-SOS複合物結合，該複合物的功能是作為與RAS結合的連接物。膜結合的RAS隨後募集並激活MAPK轉導途徑。
值得注意的是，MAPK途徑中多個激酶中的每一個均受FGF(及其他)受體下遊信號分子的調控，這樣的「互相交談」為應答的更高特異性提供了可能。
b)PLCγ、PKC、Ca2+途徑PLCγ是含SH-2結構域的、與FGFR的特異磷酸酪氨酸(FGF-1中的Y766)結合併將磷酸肌醇水解成1，4，5三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)的蛋白。IP3誘導Ca2+從胞內儲備中釋放，而DAG激活絲/蘇氨酸特異性激酶PKC。
總體來說，FGF刺激的生物學結果取決於FGF、FGFR、HSPG和細胞內信號中間體的數量、組合及其亞細胞定位，以及來自其他信號傳輸分子和途徑的調控。
2.FGF靶基因FGF處理改變多種基因的表達，並能通過非FGFR介導的機制實現。推測這是一種直接作用，許多FGF含有核定位基序並發現位於細胞核及核仁中並與染色質結合。FGF對基因轉錄的作用是細胞類型特異的。此外，已經證明FGF能保持其初始誘導依賴於其他因子的基因的表達。除了轉錄調控，FGF也影響mRNA的穩定性以及蛋白的翻譯和翻譯後修飾。
3.與其他生長因子信號途徑的相互作用FGF能對許多其他生長因子產生拮抗或強化。FGF與轉化生長因子(TGF)、類胰島素生長因子1(IGE-1)和WNT信號傳輸協同作用是常見的現象。
由前文所述，依照本發明，我們提出，FGF信號途徑(特別是FGF-1或FGF-2信號途徑)中的分子除其他用途以外，如下文所述，可被用於提供促進或抑制脂肪相關疾病中脂肪形成的藥物靶點和調控劑，也可用於提供肥胖敏感體質的診斷標記。
發明概述因此，本發明的一個方面是提供了調節脂肪形成的方法，這些方法尤其有助於脂肪相關疾病的治療和預防。這些方法通常包括細胞與一種試劑在足以調節FGF信號途徑的條件下接觸一段時間。在一些實施方案中，FGF信號途徑選自FGF-1信號途徑和FGF-2信號途徑。這些途徑的典型成員包括但不僅限於FGFR，HSPG，SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途徑成員，PLCγ-PKC-Ca2+途徑成員，FGF-1核轉移途徑成員以及諸如P34和FIF(FGF互相作用因子)等細胞內結合伴侶。如這裡進一步所述的，合適試劑的實例包括但不僅限於諸如核酸、肽、多肽、擬肽、糖類、脂類或其他有機(含碳的)或無機分子的小分子。
在一些實施方案中，細胞與調節基因表達或基因表達產物的水平或功能活性的試劑接觸，這裡所述的基因選自Fgf基因(如Fgf-1或Fgf-2)和與Fgf基因同屬相同的調控或生物合成途徑的基因(如P34和FIF)。在這些實施方案中，所述細胞是適當的微血管內皮細胞或其前體。
在其他實施方案中，細胞與調節基因表達或基因表達產物的水平或功能活性的試劑接觸，這裡所述的基因選自Fgfr基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Fgfr-3，Fgfr-4，Fgfr-5，特別是Fgfr-1，Fgfr-2，Fgfr-3，Fgfr-4)，與Fgfr基因同屬相同的調控或生物合成途徑的基因(如通過Ras-Raf-MAP激酶途徑和/或通過磷酸酯酶C途徑參與信號傳輸的基因)，其表達直接或間接受Fgf基因表達產物調節的基因(如PPARγ，IGFBP-3，IGFBP-6，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)，或激活或拮抗與一種FGF(如FGF-1或FGF-2)相互作用的FGFR功能的基因。在這些實施方案中，所述細胞是適當的前脂肪細胞或其前體。
在一些實施方案中，所述試劑降低基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Pparγ，C/Ebpα，Plcγ2，Igfbp3，Igfbp6)的表達或該基因表達產物(如FGFR-1，FGFR-2，PPARγ，C/EBPα，PLCγ2，IGFBP3，IGFBP6)的水平或功能活性。在其他實施方案中，所述試劑提高基因(如Fgf-1，Fgfr-3，Igf-2，Irs-2，Pi3激酶，Pkcθ)的表達或該基因(如FGF-1，FGFR-3，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)表達產物的水平或功能活性。在另外其他實施方案中，所述試劑拮抗一種FGFR的功能，包括降低或阻斷FGFR和FGF之間的相互作用。在這些實施方案中，所述試劑拮抗一條FGF信號途徑，從而有助於直接或間接降低或阻斷前脂肪細胞的分化潛能和/或增殖。
在一些實施方案中，所述試劑降低基因(如Fgf-1，Igf-2，Irs-2，Pi3激酶，Pkcθ)的表達或該基因表達產物(如FGF-L，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)水平或功能活性。在其他實施方案中，所述試劑提高基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Pparγ，C/Ebpα，Plcγ2，Igfbp3，Igfbp6)的表達或該基因表達產物(如FGFR-1，FGFR-2，PPARγ，C/EBPα，PLCγ2，IGFBP3，IGFBP6)水平或功能活性。在還有其他實施方案中，所述試劑激活一種FGFR的功能，包括增強、促進或其他方式賦予FGFR和FGF之間相互作用的能力。在這些實施方案中，所述試劑激活一條FGF信號傳輸途徑，從而有助於直接或間接提高前脂肪細胞的分化潛能和增殖。
因此，相對於不存在所述試劑時基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性，所述試劑至少提高或降低所述基因表達或該基因表達產物的水平或功能活性10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％。
另一方面，本發明提供了鑑別調節FGF信號途徑的試劑的方法。這些方法通常包括將一種製品與一種待測試劑接觸，這裡所述的製品包括(1)一條包含對應於FGF信號途徑的一個多肽組分的至少一個具備生物活性的片段或其變異體或衍生物的胺基酸序列的多肽；或(2)一條至少包含調節FGF信號途徑多肽組分的遺傳序列的一部分的多核苷酸，該多核苷酸以可操作方式與一條報導基因相連。相對於沒有待測試劑時的正常或參照水平和/或功能活性，檢測到的多肽組分或報導基因表達產物的水平和/或功能活性的變化表明所述試劑調節FGF信號途徑。
再一方面，本發明提供了鑑別調節FGF信號途徑的試劑的方法。這些方法通常包括將第一個表達FGFR的細胞樣本與FGF接觸並檢測標記物；將第二個表達FGFR的細胞樣本與FGF和一種試劑接觸並檢測標記物；以及將第一細胞樣本的標記物與第二細胞樣本的標記物進行比較。在多種實施方案中，這些方法檢測與前脂肪細胞增殖和/或分化相關的多種標記物(如甘油3-磷酸脫氫酶，G3PDH及FGF途徑中的胞內組分)或標記物組合的水平。
按照本發明所述，前文廣泛描述的試劑有助於調節脂肪相關疾病中的脂肪形成。脂肪相關疾病包括但不僅限於肥胖、脂肪瘤、脂肪過多症、惡病質或脂肪營養不良或創傷或萎縮性疾病中的脂肪組織缺失。因而，本發明的另外一個方面包括為抑制或降低脂肪形成，或為在肥胖或脂肪形成局部異常增加疾病中控制脂肪形成，使用與藥學上可接受的載體或稀釋劑隨意配伍的試劑，其中，如前文廣泛描述的，所述試劑拮抗FGF信號傳輸途徑。
再另一方面，本發明包括為在惡病質或局部脂肪不足的疾病的治療或預防中刺激脂肪形成，使用與藥學上可接受的載體或稀釋劑隨意配伍的試劑，其中，如前文廣泛描述的，所述試劑激活FGF信號途徑。
上述方法中所用試劑的特徵在於，它與如前文廣泛描述的基因表達產物或與調節該基因表達的遺傳序列(如轉錄元件)相結合。這樣的結合通過以下方式測定至少包含如前文廣泛描述的基因表達產物一部分或其變異體或衍生物的，或調節該基因表達的遺傳序列的製品與所述試劑接觸，並檢測至少是表達產物一部分的或其變異體或衍生物的，或所述遺傳序列所表達的產物的水平或功能活性的變化。
在一些實施方案中，抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑與FGF或FGFR或調節Fgf或Fgfr基因表達的遺傳序列(如轉錄元件)相結合。這樣的結合通過以下方式測定包含FGF或FGFR多肽或其生物活性片段或其變異體或其衍生物的，或調節Fgf或Fgfr基因表達的遺傳序列的製品與所述試劑接觸；並檢測FGF或FGFR多肽或其生物活性片段或其變異體或其衍生物，或所述遺傳序列所表達的產物的水平或功能活性的降低。
在其他實施方案中，抑制或以其他方式減少脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方式測定的FGFR和FGF與所述試劑接觸並檢測FGFR與FGF的結合。在這些實施方案中，所述試劑能與FGF或FGFR結合，當其降低或阻斷FGFR與FGF的結合時，該試劑檢測為陽性。所述試劑可以是小分子或針對FGF或FGFR的特異性抗原結合分子。
在其他實施方案中，抑制或以其他方式減少脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方式測定的FGFR和HSPG與所述試劑接觸並檢測FGFR與HSPG的結合。在這些實施方案中，所述試劑可以與FGF或HSPG結合，當其降低或阻斷HSPG與FGFR的結合時，該試劑檢測為陽性。所述化合物可以是小分子或針對FGFR或HSPG的特異性抗原結合分子。
在其他實施方案中，抑制或以其他方式減少脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方式測定的FGF和CFR與所述試劑接觸並檢測FGF與CFR的結合。在這些實施方案中，所述試劑可以與FGF或CFR結合，當其降低或阻斷CFR與FGF的結合時，該試劑檢測為陽性。所述化合物可以是小分子或針對FGF或CFR的特異性抗原結合分子。
在另外其他實施方案中，抑制或以其他方式減少脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方式測定的將選自前脂肪細胞或其前體的第一細胞樣本與FGF接觸並檢測細胞的分化和/或增殖；將選自前脂肪細胞或其前體的第二細胞樣本與一種試劑和FGF接觸並檢測細胞的分化和/或增殖；比較第一細胞樣本的分化和/或增殖與第二細胞樣本的分化和/或增殖。在這些實施方案中，所述試劑通過幹擾FGF和FGFR的結合、通過幹擾FGFR磷酸化、通過幹擾FGF/FGFR相互作用的上遊或下遊信號途徑組分、通過幹擾FGFR和HSPG的結合、通過幹擾FGF和CFR的結合或通過幹擾FGFR的二聚化拮抗FGF信號途徑。在有些實施方案中，拮抗FGF信號途徑幹擾信號途徑的試劑選自TGF、IGF-1和WNT信號途徑的一條信號途徑。
在進一步的實施方案中，抑制或以其他方式減少脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方式測定的用拮抗該信號途徑的試劑對動物模型或人給藥，並檢測動物對該試劑的反應。在這些實施方案中，所述方法可採用如上所述的試劑，動物可檢測肥胖症或脂肪形成局部異常增加疾病中脂肪形成的抑制或降低。
在另外其他實施方案中，刺激脂肪形成的試劑與FGFR或與調節Fgfr基因表達的遺傳序列(如轉錄元件)結合，這是通過以下方式測定的包含FGFR多肽或其生物活性片段或其變異體或其衍生物，或調節Fgf或Fgfr基因表達的遺傳序列的製品與一種試劑接觸；並檢測該FGFR多肽或其生物活性片段或其變異體或其衍生物，或由該遺傳序列所表達的產物的水平或功能活性的提高。
在其他實施方案中，刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號傳輸途徑，這是通過以下方式測定的FGFR和FGF與所述試劑接觸並檢測FGFR與FGF的結合。在這些實施方案中，所述試劑能與FGF或FGFR結合，當其刺激FGFR與FGF的相互作用時，該試劑檢測為陽性。所述試劑可以是小分子或針對FGF或FGFR的特異性抗原結合分子。
在其他實施方案中，刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號傳輸途徑，這是通過以下方式測定的一種FGFR和一種HSPG與所述試劑接觸並檢測FGFR與HSPG的結合。在這些實施方案中，所述試劑能與FGFR或HSPG結合，當其刺激HSPG與FGFR的相互作用時，該試劑檢測為陽性。所述化合物可以是小分子或針對FGFR或HSPG的特異性抗原結合分子。
在其他實施方案中，刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號傳輸途徑，這是通過以下方式測定的一種FGF和一種CFR與所述試劑接觸並檢測FGF與CFR的結合。在這些實施方案中，所述試劑能與FGF或CFR結合，當其刺激CFR與FGF的相互作用時，該試劑檢測為陽性。所述化合物可以是小分子或針對FGF或CFR的抗原結合分子。
在還有其他實施方案中，增強脂肪形成的試劑激活FGF信號傳輸途徑，這是通過以下方式測定的將選自前脂肪細胞或其前體的第一細胞樣本與一種FGF接觸並檢測細胞的分化和/或增殖；將選自前脂肪細胞或其前體的第二細胞樣本與一種試劑和所述FGF接觸，並檢測細胞的分化和/或增殖；比較第一細胞樣本的分化和/或增殖與第二細胞樣本的分化和/或增殖。在這些實施方案中，化合物通過刺激FGF與FGFR的結合、通過刺激FGFR的磷酸化、通過刺激FGFR和HSPG的結合、通過刺激FGF與CFR的結合、通過刺激FGFR二聚化或通過刺激FGF/FGFR相互作用的上遊或下遊信號途徑激活FGF信號途徑。
在還有其他實施方案中，刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號傳輸途徑，這是通過以下方式測定的用一種激活該信號途徑的試劑對動物模型和人給藥，並檢測動物對該試劑的反應。在這些實施方案中，所述方法可採用前文所述的試劑，可檢測動物在惡病質或局部脂肪缺乏疾病的治療和預防中刺激脂肪形成的情況。
本發明還有另外一個方面提供了生產在脂肪相關疾病中調節脂肪形成的試劑的方法。這些方法通常包括如上文廣泛描述的，測試一種可能能調節FGF信號途徑的試劑；在調節能力檢測呈陽性的基礎上合成所述試劑。相應的，所述方法進一步包括衍生該試劑並將衍生物與藥學上可接受的載體和/或稀釋劑任意配伍，以提高所述試劑治療或預防肥胖相關疾病的功效。
本發明的另一個方面，提供了為患者檢測脂肪相關疾病或診斷其風險的方法。這些方法通常包括測定來自患者的生物樣本中參與FGF信號途徑的異常基因或參與FGF信號途徑的基因的異常表達產物的存在，其中所述異常基因或異常表達產物與疾病的存在或患病風險相關。
在有些實施方案中，異常基因選自異常的Fgf基因和異常的Fgfr基因。在其他實施方案中，異常表達產物選自異常的Fgf表達產物和異常的Fgfr表達產物。
本發明還有另外一個方面包括為患者檢測脂肪異常增生相關疾病或診斷其發病風險。這些方法通常包括測定來自患者生物樣本中的參與FGF信號途徑的異常基因或參與FGF信號途徑的基因的異常表達產物的存在，其中所述的異常基因或異常表達產物與疾病的存在或發病風險相關。與脂肪異常增生相關的疾病包括但不僅限於肥胖症或諸如脂肪瘤和脂肪過多症的脂肪形成局部異常增加疾病。
本發明的另外一個方面提供了為患者檢測脂肪異常增生相關疾病或診斷其患病危險度的方法。這些方法通常包括測定細胞內參與FGF信號傳輸途徑的基因表達產物的水平或功能活性，這些指標與該表達產物的正常(如不肥胖的)參照水平或功能活性存在差異。在有些實施方案中，所述方法包括測定一條選自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpa、Plcγ2、Igfbp-3和Igfbp-6的基因表達產物的水平或功能活性的提高或加強。在其他實施方案中，所述方法包括測定一條選自Fgf-1、Fgfrγ-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ的基因表達產物的水平或功能活性的降低。在這些實施方案中，所述細胞是前脂肪細胞或其前體。
在其他實施方案中，所述方法包括測定一條選自Fgf-1和Fgf-2基因表達產物的水平或功能活性的提高或加強。在這些實施方案中，所述細胞是微血管內皮細胞。
本發明的另外一個方面包括肥胖症或脂肪形成局部異常增加疾病中抑制或降低脂肪形成的方法。這些方法通常包括在需要此類治療時給患者服用抑制脂肪形成有效劑量的、如前文廣泛描述的削弱或幹擾FGF信號途徑的試劑和任意藥學上可接受的載體或稀釋劑。
本發明還有一個方面包括治療或預防惡病質或局部脂肪缺乏疾病的方法。這些方法通常包括在需要此類治療時給患者服用增強脂肪形成有效劑量的、如前文廣泛描述的刺激FGF信號途徑的試劑和任意藥學上可接受的載體或稀釋劑。
本發明還有一個方面提供了如前文廣泛描述的試劑在製備用於治療或預防脂肪相關疾病的藥物方面的應用。


圖1.FGF信號途徑示意圖。
圖2.從人體脂肪組織中分離微血管內皮細胞(MVEC)和前脂肪細胞(PA)的方法的示意圖。DPBS去離子化的磷酸鹽緩衝液；RT室溫；HBSSHank平衡鹽溶液；FCS胎牛血清；EC內皮細胞；PECAM-1血小板-內皮細胞黏附分子1。
圖3.脂肪組織來源的微血管內皮細胞(MVEC)形態照片。A分離自人體脂肪組織的MVEC相差顯微照片。注意細胞典型的鵝卵石形態及顯著的、中央分布的細胞核。B血管性假血友病因子(von Willebrand’s因子，vWF)免疫細胞化學染色顯示顯著的核周邊細胞質染色。CPECAM-1(血小板-內皮細胞黏附分子1)免疫細胞化學染色顯示與胞質膜表達相一致的交接區染色(junctional staining)。B和C中細胞核用碘化丙啶對比染色。(圖中比例尺代表10μm，原始放大倍數為200倍)。
圖4.免疫印跡分析照片顯示，FGF-1在脂肪來源的微血管內皮細胞(MVEC)和3T3-L1脂肪細胞中(3T3-L1成纖維細胞中的表達也得到顯示)高表達。在人前脂肪細胞(PAs)(+/-FGF-1)和脂肪細胞中未檢測到FGF-1蛋白。RT-PCR分析驗證了這些表達圖譜。
圖5.以圖表形式顯示人前脂肪細胞(PA)在FGF-1和FGF-2應答中增殖水平的明顯提高(FGF-1對細胞增殖的影響大於FGF-2)。
圖6.以圖表形式顯示人前脂肪細胞(PA)在FGF-1和FGF-2應答中分化水平的明顯提高(FGF-1對細胞分化的影響大於FGF-2)。
圖7.以圖表形式顯示了FGF-1和FGF-2組合作用的效果。結果顯示，無論FGF-1還是FGF-2，在複製或分化過程中均能促進脂肪形成，且FGF-1在複製和分化中的促脂肪形成作用是獨立的和累加的。BRL是指羅格列酮；括號表示重複處理。
圖8.照片顯示採用含血清培養基(SCM)(添加了胰島素，並在前3天添加了地塞米松和羅格列酮)的採用3T3-L1分化方案的人前脂肪細胞(PAs)的分化。A欄顯示在分化之前的增殖過程中未與FGF-1接觸的前脂肪細胞。B欄和C欄分別表示在已存在FGF-1的情況下增殖6周並隨後在SCM中分化的皮下(S)和網膜(0)前脂肪細胞。這是人前脂肪細胞在血清存在的情況下分化的首次報導。(比例尺代表10μm)。
圖9.用表格表示2個獨立的基因晶片實驗結果。這些基因晶片實驗比較了在包含和不含FGF-1的含血清培養基中生長至融合濃度的人前脂肪細胞中的基因表達。如果表達水平始終(CV＜5％)提高或降低至少50％，就認為基因表達受FGF-1的影響。
圖10.照片顯示PLCγ2是FGFR信號轉導中重要的胞內分子。免疫印跡分析和免疫螢光均證實，相對於未與生長因子接觸的細胞，在FGF-1存在情況下，生長至融合濃度的人前脂肪細胞中PLCγ2的表達得以提高。免疫螢光數據同時表明，PLCγ2的表達在融合濃度(分化誘導發生階段)下基本不受調控。(比例尺代表10μm)。
圖11.以圖表形式顯示了抑制PLCγ2明顯降低FGF-1誘導的前脂肪細胞的分化。
圖12.以圖表形式顯示了抗FGF-1中和抗體阻斷FGF-1誘導的人前脂肪細胞複製。
圖13.以圖表形式顯示FGFR信號轉導途徑的抑制對FGF-1介導的人脂肪形成具有顯著影響。

發明內容
1.定義除另有定義，這裡採用的所有科技術語與本發明所屬領域一般技術人員所通常理解的具有相同意義。雖然任何與這裡描述的相似或等價的方法和材料均可用於本發明的實行或測試，對優選的方法和材料進行了描述。為了說明本發明的意圖，下面對下述術語進行定義。
這裡所用的「一種」、「一個」和「一條」是指一個或一個以上(即至少一個)語法對象。舉例來說，「一個元件」指一個或一個以上元件。
「一條屬於相同調控或生物合成途徑的基因」是指一條基因，其表達產物能調節或以其他方式影響FGF或FGFR蛋白水平和/或Fgf或Fgfr轉錄水平。例如，一條與Fgf屬於相同調控途徑的基因可以編碼一個Fgf/FGF的上遊調控物，或一個Fgf/FGF的下遊調控標靶，而不是Fgf/FGF。除此之外，一條與Fgfr基因屬於相同調控或生物合成途徑的基因包括直接或間接調節Fgfr基因表達的基因以及作為FGFR激活的信號轉導分子的基因。本領域內所公知的，這些信號分子參與FGFR激活過程的信號傳遞或介導FGFR激活的效應。它們與其他分子一起參與磷脂酶C(PLC)-γ、Crk、SNT-1/FRS2和/或Src信號途徑。
這裡所採用的術語「異常的多核苷酸」是指一條通過至少一個核苷酸的置換、刪除或添加而區別於「正常」參照的，並與包括與非肥胖的基準值相比脂肪形成速度有所提高在內的脂肪形成缺陷或其風險相關聯的多核苷酸。
術語「異常多肽」是指一條通過至少一個胺基酸殘基的置換、刪除或添加而區別於「正常」參照的，並與包括與非肥胖的基準值相比脂肪形成速度有所提高在內的脂肪形成缺陷或其風險相關聯的多核苷酸。
「擴增產物」是指通過核酸擴增技術產生的核酸產物。
「抗原結合分子」是指具有針對靶抗原的結合親和力的分子。需要理解，這一術語延伸至免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和具有抗原結合活性的非免疫球蛋白來源的蛋白質結構。
「抗原性或免疫原性活性」是指將按照本發明的多肽、片段、變異體或衍生物對動物(適宜地是哺乳動物)給藥後，在動物體內產生抗原性或免疫原性反應的能力，其中反應包括產生與所述多肽或其片段特異性結合的成分。
「生物活性片段」是指保留了親本多肽活性的全長親本多肽的一個片段。如這裡所採用的，術語「生物活性片段」包括缺失變異體和構成親本多肽活性的小肽，例如包含至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50個相連的胺基酸殘基的小肽。此類肽可以通過採用常規的核酸重組技術獲得或通過常規的液相或固相合成技術合成。例如，可以參考關於液相合成或固相合成的描述，如Blackwell ScientificPublications出版的Nicholson主編的《合成疫苗》(Synthetic Vaccines)一書中由Atherton和Shephard撰寫的第9章《肽的合成》(Peptide Synthesis)。除此以外，肽可以通過諸如內切蛋白酶Lys-C、內切蛋白酶Arg-C、內切蛋白酶Glu-C和葡萄球菌V8蛋白酶等蛋白酶消化本發明中的多肽獲得。消化後的片段可以通過如高效液相(HPLC)技術等進行純化。
這裡所用的術語「生物樣本」是指來自患者的可以是經提取的、未經處理的、經過處理的、稀釋的或濃縮的樣本。適宜的生物樣本是組織的活體切片，更優選的是來自皮下或網膜的組織活體切片。
「惡病質」是指低於正常脂肪標準的臨床狀況，可能伴有或不伴有營養不良或普通的健康狀況不良，並可能是一種或多種病理的繼發狀態。術語惡病質延伸包括但不僅限於以下疾病癌症惡病質、氟中毒惡病質、垂體性惡病質、垂體功能缺失性惡病質、瘧疾惡病質、汞中毒惡病質、垂體惡病質、鉛中毒惡病質、腎上腺機能障礙惡病質、尿毒症惡病質或局部脂肪缺失症狀。
在本說明書全文中，除了上下文另有要求以外，「包括」、「包含」應理解為意味著包含指明的步驟或元素或步驟或元素的組合，但不排除任何其他步驟或元素或步驟或元素的組合。
這裡所用的短語「脂肪形成局部異常增加」包括其特徵在於和/或導致有限範圍內脂肪組織堆積的、與解剖學意義上的局部非受控脂肪形成相關的病理。這樣的病徵包括但不僅限於脂肪瘤和脂肪過多症。
「局部脂肪組織缺乏」是指解剖學意義上限制的脂肪組織不足，可以由引起皮下脂肪組織缺失的身體創傷、熱燒傷或化學燒傷、脂肪營養不良或萎縮性病症與其他因素引起。這裡所採用的術語「脂肪營養不良」是指任何與導致先天或後天獲得的部分或全部皮下脂肪缺失的脂肪營養不良相關的或以之為特徵的病理狀態。這樣的病理狀態包括先天性一般脂肪營養不良、先天進行性脂肪營養不良、普通脂肪營養不良、惠普爾病(Whipple’s disease)、局部脂肪營養不良、進行性脂肪營養不良和全身性脂肪營養不良。這裡所採用的術語「萎縮性病症」是指與包括脂肪組織在內的身體組織的解剖學上的局部或全身性的減少或消耗相關的，和/或以之為特徵的病症。除其他因素以外，其原因可能包括中樞和/或周圍神經系統的損傷、靜止和/或無能力。這樣的萎縮性病症包括但不僅限於漿液性萎縮、脊髓性肌萎縮、關節周肌萎縮、壓迫性萎縮、神經性萎縮、廢用性萎縮、內分泌性萎縮和老年萎縮。
「相應」是指(a)具有與參照多核苷酸序列的全部或部分充分相同或互補序列的或編碼的胺基酸序列與一條肽或蛋白的胺基酸序列相同的多核苷酸；或(b)具有與參照肽或蛋白的胺基酸序列充分相同的胺基酸序列的肽或多肽。
「衍生物」是指源自基礎序列的、通過修飾(如通過與其他化學成分結合或形成複合物，或通過如本領域已知的翻譯後修飾技術)的多肽。術語「衍生物」在其範圍內也包括在親本序列上已作出的包括提供功能等同分子的添加或缺失的改造。
這裡所用的術語「分化潛能」是指前脂肪細胞針對能促進其功能成熟為脂肪細胞的信號的反應能力或反應強度。可以觀察到一種待測分子使「分化潛能提高」，例如，在充足時間和適宜條件下前脂肪細胞與所述待測分子共培養導致該前脂肪細胞對分化誘導劑的反應增強，這可以由正在分化的前脂肪細胞數量的增加或前脂肪細胞分化速度的提高及其他方式進行觀察。
「有效劑量」在活性調節或治療或預防一種病症的上下文中是指該劑量的活性組分以單一劑量或系列給藥的一部分給需要這樣的調節、治療或預防的個體服用，對於該作用的調節或對該症狀的治療、預防或改善是有效的。對於受脂肪形成局部異常增加病症困擾的個體而言，這樣的改善的非限制性的實例包括脂肪堆積降低、無脂肪增加、體重減輕及心血管疾病和糖尿病相關症狀的改善。對於受惡病質和局部脂肪缺失病症困擾的個體而言，這樣的改善的非限制性的實例包括脂肪堆積增加、體重增加及萎縮性病症相關症狀的改善。有效劑量隨著所針對個體的健康和生理狀況、所針對個體的分類學組、組分的配方、藥物狀況的評估及其他相關因素而改變。預計該劑量值處於可通過常規實驗測定的相對寬泛的區間內。
如這裡所採用的，術語「功能」是指生物的、酶的或治療的功能。
「功能性Fgf多核苷酸」或「功能性FGF多肽」是指不含結構或功能缺陷的、並與包括提高或削弱脂肪形成在內的脂肪形成缺陷或其風險無關的Fgf多核苷酸或FGF多肽。
這裡所用的術語「基因」是指細胞基因組任何全部離散的編碼區域及與之相連的非編碼和調控區域。基因也用於表示編碼特定多肽的開放讀框、內含子及參與表達調控的鄰接的5』和3』非編碼核酸序列。在這一點上，基因可以進一步包括諸如啟動子、增強子、終止和/或多聚腺苷化信號等與所述基因相連的天然控制信號或外源控制信號。DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或它們的片段。基因可以導入適當的載體用以游離保存於染色體外或用以整合入宿主。
這裡所用的「雜交」表示互補核酸序列的配對以形成DNA-DNA雜合體或DNA-RNA雜合體。互補鹼基序列是指那些通過鹼基配對原則聯繫起來的序列。在DNA中，A與T配對，C與G配對。在RNA中，U與T配對，C與G配對。在這一點上，這裡所用的術語「匹配」與「錯配」是指互補核酸鏈中配對核苷酸的雜交潛能。配對核苷酸有效地雜交，如上面提到的經典的A-T和G-C鹼基對。錯配指不能有效雜交的其他核苷酸組合。
這裡提及的「免疫相互作用」包括涉及的任何相互作用、反應或其他形式的分子間聯合，尤其是其中一種分子是(或者模擬)免疫系統的一個組分。
「分離的」是指充分地或基本地與其天然狀態下通常伴隨的組分分開了的材料。
「調節」是指或直接或間接地提高或降低靶分子的水平或功能活性。例如，一種試劑可以通過與不同於靶分子的一種分子相互作用間接地調節靶分子的水平/活性。在這一點上，編碼目標多肽的基因的間接調節在其範圍內包括第一個核酸分子表達的調節，這一核酸分子的表達產物調節編碼目標多肽的核酸分子的表達。
這裡所用的術語「肥胖症」包括體內脂肪組織過度積累所導致的超出生理需求的體內脂肪的增加的病症。術語肥胖症包括但不僅限於下列病症成年期肥胖症、食餌性肥胖症、內源性或代謝肥胖症、內分泌肥胖、家族性肥胖、胰島功能亢進性肥胖、脂肪細胞增殖型-肥大型肥胖症、性腺機能減退型肥胖、甲狀腺機能減退型肥胖、終身肥胖、病態肥胖和外源性肥胖。
術語「肥胖的治療」包括治療由肥胖引發的病症，包括但不僅限於心血管病、動脈硬化、高血壓、肥胖性心肺功能不全症候群(Pickwickian syndrome)以及糖尿病。
「取自」是指諸如多核苷酸提取物或多肽提取物的樣本分離自或源自宿主的獨特的來源。例如，提取物可取自直接分離自宿主的組織或體腔。
這裡所採用的術語「寡核苷酸」是指由多樣的核苷酸殘基(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或相關的結構變異體或它們的合成類似物)通過磷酸二酯鍵(或相關的結構變異體或其合成類似物)相連構成的聚合體。因而，雖然術語「寡核苷酸」通常是指由核苷酸殘基及其聯接天然形成的核苷酸聚合體，應該理解該術語在其範圍內也包括包含但不僅限於肽核酸(PNAs)、氨基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核酸及其他不同的類似物。所述分子的確切大小可以隨具體應用而改變。寡核苷酸通常相對較短，通常包含10到30個核苷酸殘基，該術語可以表示任意長度的分子，雖然一般採用術語「多核苷酸」或「核酸」來表示大的寡核苷酸。
「以可操作方式連接」是指轉錄和翻譯調控多核苷酸相對於多肽編碼多核苷酸的這樣一種定位方式，這種方式可以轉錄所述多核苷酸及翻譯所述多肽。
術語「患者」是指人或其他動物來源的患者並包括任何需要用本發明所述的方法進行檢測或治療的個體。然而需要理解，「患者」並不意味著症狀已經顯現。本發明的範圍所包括的動物包括但不限於靈長類、家畜(如綿羊、奶牛、馬、驢、豬)、實驗室實驗動物(如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、寵物(如貓、狗)和捕獲的野生動物(如狐狸、鹿、野狗、鳥類和爬行動物)。
「藥學上可接受的載體」是指固體或液體填充劑、稀釋劑或膠囊包被的、可以對哺乳動物局部或全身安全給藥的試劑。
這裡所用的術語「多核苷酸」或「核酸」是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該術語通常指長度大於30個核苷酸殘基的寡核苷酸。
術語「多核苷酸變異體」和「變異體」是指與一個參照多核苷酸序列具有充分序列相同性的多核苷酸或能在如本領域所知的嚴格條件下(參見Sambrook等所著《分子克隆實驗手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Press，1989)與一個參照序列雜交的多核苷酸。這些術語還包括添加了或刪除了或用不同的核苷酸替代了一個或多個核苷酸的多核苷酸。在這一點上，本領域內熟知的是，對一條基準多核苷酸可以進行包括突變、添加、刪除和置換在內的某些改變，而改變後的多核苷酸保持該基準多核苷酸的生物功能或活性。術語「多核苷酸變異體」和「變異體」還包括自然產生的等位基因變異體。
這裡可交替使用的「多肽」、「肽」和「蛋白」是指胺基酸殘基的聚合體及其變異體和合成類似物。因而，這些術語用於其中一個或多個胺基酸殘基是合成的、非天然生成的胺基酸(如相應的天然胺基酸的化學類似物)的胺基酸聚合體以及天然存在胺基酸的聚合體。
術語「多肽變異體」是指其中一個或多個胺基酸被不同的胺基酸取代的多肽。本領域內所熟知的是，如這裡隨後所描述的，一些胺基酸可以替換為其他性質大體相似的胺基酸而不改變所述多肽的活性本質(保守性置換)。這些術語還包括其中添加了或刪除了或以不同胺基酸替代了一個或多個胺基酸的多肽。
「引物」是指當其與單鏈DNA配對時，能夠在合適的聚合化試劑存在的情況下啟動引導延伸產物合成的寡核苷酸。所述引物為實現最高擴增效率優選單鏈，但也可以是雙鏈的。為在聚合化試劑存在的情況下引導延伸產物的合成，引物必須足夠長。引物長度取決於許多因素，包括具體應用、所用溫度、模板反應條件、其他試劑和引物來源。例如，依賴於靶序列的複雜程度，寡核苷酸引物通常包含15到35個或更多的核苷酸殘基，雖然也可能包含更少的核苷酸殘基。引物可以是巨大的多核苷酸，如包含從大約200個核苷酸至幾千個鹼基或更多。可以選擇為與模板雜交設計的、與模板上的序列「充分互補」的引物並作為合成的啟動位點。「充分互補」是指引物充分互補以與目標多核苷酸雜交。優選的引物不包含與設計與之雜交的模板的錯配，但這不是必需的。例如，可以在引物的5』末端附加非互補核苷酸殘基，其餘的引物序列與模板互補。作為另一種選擇，非互補核苷酸殘基或一段非互補核苷酸殘基可能散布在引物中，假如引物序列同與其雜交的模板序列充分互補並從而形成該引物延伸產物的合成所需的模板。
「探針」是指與特異性序列或亞序列或其他分子的一部分相結合的分子。除另有指示以外，術語「探針」通常是指通過互補鹼基配對與通常稱為「靶多核苷酸」的另一條多核苷酸結合的多核苷酸探針。取決於雜交條件的嚴格程度，探針能同與其並不完全序列互補的靶多核苷酸結合。能直接或間接對探針進行標記。
這裡所用的術語「重組多核苷酸」是指通過將一條多核苷酸處理為通常自然界中未被發現形式的手段在體外形成的多核苷酸。例如，重組多核苷酸可以是表達載體的形式。通常，這樣的表達載體包含以可操作方式與多核苷酸連接的轉錄和翻譯調控多核苷酸。
「重組多肽」是指運用重組技術(如通過重組或合成多核苷酸表達)獲得的多肽。
本說明書中所用的「報導分子」是指這樣一種分子，按其化學性質提供可供分析的可辨識信號，該信號可用於檢測包含抗原結合分子及其目標抗原的複合物。術語「報導分子」還延伸至使用細胞凝集或凝集抑制(如乳膠珠上的血紅細胞)及其他方式。
「載體」是指能在其中插入或克隆多核苷酸的多核苷酸分子，優選的是DNA分子來源的，例如，來源於質粒、噬菌體、酵母或病毒的。載體優選地包含一個或多個唯一的限制性位點並能在限定的、包括靶細胞或組織或祖細胞或其組織在內的宿主細胞中自主複製，或可與限定宿主的基因組整合，這樣，克隆的序列可被複製。因而，載體可以是自主複製載體，也就是載體以游離於染色體外的實體形式存在，其複製獨立於染色體複製，例如，線性或閉合的環狀質粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。載體可以包含任何用以確保自我複製的工具。作為另外一種選擇，載體可以在導入宿主細胞時整合入基因組並與整合後的染色體共同複製。載體系統可以包括單獨的載體或質粒、兩個或更多載體或質粒，它們共同包含導入宿主細胞基因組的總DNA或轉座子。載體的選擇通常取決於載體與載體所導入的宿主細胞的兼容性。在本發明中，載體優選地是病毒的或病毒來源的載體，其在動物細胞和優選的哺乳動物細胞中以可操作方式發揮功能。這樣的載體可以來源於痘病毒、腺病毒或酵母。所述載體可以還包含如可用於挑選合適的轉化株的抗生素抗性基因的選擇性標記。這樣的抗性基因的例子是精通本領域的技術人員所知的，包括具備抗生素卡那黴素和G418(Geneticin)抗性的nptll基因和具備抗生素潮黴素B抗性的hph基因。
可交替使用的術語「野生型」和「正常的」是指物種的大部分成員中天然存在的特有的表現型，並例如與突變型的表現型形成對照。
如這裡所採用的，下劃線或斜體的基因名稱表示基因，與其蛋白產物形成對比是，蛋白產物用不加任何下劃線或斜體的基因名稱表示。例如，「Fgf-1」表示Fgf-1基因，而「FGF-1」表示「Fgf-1」基因的蛋白產物或由「Fgf-1」基因的轉錄和翻譯和選擇性剪接生成的產物。
2.調節脂肪形成的方法本發明是部分建立在前脂肪細胞複製過程中MVEC在培養基中的存在能增強體外的前脂肪細胞分化成脂肪細胞(脂肪形成)，並能通過在不含MVEC的培養基中添加FGF-1或FGF-2重複這一效果這樣的發現基礎上的。不希望束縛於任何具體的理論或作用模式，本發明發明人認為，通過MVEC(或者可能其他細胞類型)的FGF-1和FGF超家族其他成員的體內生成激活鄰近前脂肪細胞上的FGF受體，這一過程直接或間接地促進細胞分化成為脂肪細胞。此外，本發明的發明人發現了FGF-1促進人前脂肪細胞的複製(比IGF-1、FGF-2或血清單獨作用更有效)以及在複製階段中用FGF-1處理人前脂肪細胞顯著提高其隨後的分化潛能(亦即「引發」作用)。本發明人進一步證實了在分化過程中用TZD(噻唑烷二酮)處理能顯著提高這種FGF-1的「引發」作用，這說明FGF-1不是PPARg(過氧化物酶體增生物激活受體g)配體。還發現人前脂肪細胞不生成FGF，FGF的中和抗體能阻斷FGF-1的促增殖作用。因此可以認為，FGF信號途徑(特別是FGF-1或FGF-2信號途徑)的調節物可與其他試劑一同用於包括但不限於肥胖症、脂肪形成局部異常增加症、惡病質和局部脂肪缺失症等脂肪組織相關病症的治療或預防以及過度脂肪形成和脂肪形成不足的研究。
因此，本發明提供了調節脂肪形成的方法，該方法包括在足以調節FGF信號途徑(特別是FGF-1或FGF-2信號途徑)的條件下將細胞與一種試劑接觸一段時間。FGF信號途徑的代表成員包括FGF(特別是FGF-1和FGF-2)、FGFR(如FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4和FGFR-5，特別是FGFR-1，FGFR-2，FGFR-3和FGFR-4)，HSPG(如多配體蛋白聚糖-1，多配體蛋白聚糖-2，多配體蛋白聚糖-3，多配體蛋白聚糖-4，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-1，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-4，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-5，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-6，基底膜蛋白多糖和β-glycan)、CFR、SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途徑成員(如SHC，Crk，FRS2(FGFR底物2，也被稱為SNT-1)，Src，FAK，Nek，Shb，SHP2，GRB-2，SOS，80K-H，pp66，Gab1，P38 MAPK(ERK)，PI3K，AKT，PKB，RAS，RAF，ERK1，2，MAPKKK(RAF-1)，MAPKK(MEK)，MAPK，Jun，Fos，FPPS(法呢基焦磷酸合成酶))，PLCγ-PKC-Ca2+途徑成員(如PLCγ(磷脂酶Cγ)，Fes，PIP2，DAG(甘油二酯)，花生四烯酸，Ca2+離子通道，Ca2+離子，IP3(1，4，5三磷酸肌醇)，CaM激酶(Ca2+/鈣調素依賴型激酶)，PKC(蛋白激酶C)，PKA(蛋白激酶A)，cAMP，CREB，CBP(CREB結合蛋白)，FGF-1核轉移途徑成員(如STAT-1和STAT-3)，FGF的細胞內結合伴侶(諸如但不限於P34和FIF(FGF相互作用因子))和FGFR細胞內結合伴侶(諸如STN-2以及包括剪接體在內的其變異體)。
按照本發明，一種試劑能以產生FGF(特別是FGF-1和/或FGF-2)的細胞或作為FGF信號目標的細胞作為目標。因而，在一些實施方案中，所述細胞是MVEC或MVEC前體，而在其他實施方案中，所述細胞是前脂肪細胞或前脂肪細胞前體。
在以FGF生成細胞作為所述試劑的作用對象的實施方案中，所述試劑相應地調節Fgf基因(如Fgf-1，Fgf-2)的表達或其表達的上遊調控子或這些基因表達產物的水平或功能活性。在這些實施方案中，通過增強Fgf基因表達或其表達產物的水平或功能活性，或取決於調控子是否是Fgf基因或其表達產物的抑制子或激活子，通過增強或降低調控子基因的表達或其表達產物的水平或功能活性，刺激脂肪形成。相反的，通過降低或阻斷Fgf基因表達或其表達產物的水平或功能活性，或取決於調控子是否是Fgf基因或其表達產物的抑制子或激活子，分別通過增強或降低調控子基因的表達或其表達產物的水平或功能活性，降低或阻斷脂肪形成。
在以FGF靶細胞作為所述試劑作用對象的實施方案中，所述試劑調節Fgfr基因(如Fgfr-1，Fgfr-2，Fgfr-3，Fgfr-4，Fgfr-5，特別是Fgfr-1，Fgfr-3，Fgfr-4)，或與該Fgfr基因屬於相同調控或生物合成途徑的基因(例如，如以上所述的屬於FGF信號途徑的基因)，或其表達受Fgf基因表達產物直接或間接調節的基因(如PPARγ，IGFBP-3，IGFBP-6，IGF-2，IRS-2，PI3激酶，PKCθ)的表達，或激活或刺激與FGF(如FGF-1或FGF-2)相互作用的FGFR或CFR的功能。在這些實施方案中，通過增強Fgfr基因的表達或其表達產物的水平或功能活性，或通過增強FGF信號途徑組分的表達，或通過增強、促進或以其他方式使FGFR和FGF之間或CFR和FGF之間相互作用，或通過刺激FGFR的二聚化和/或磷酸化，刺激脂肪形成。相反的，通過拮抗FGFR或CFR的功能，包括抑制或阻斷FGFR和FGF之間或CFR和FGF之間的相互作用，或通過抑制或阻斷HSPG和FGFR之間的相互作用，通過阻礙FGFR磷酸化，通過幹擾FGF/FGFR或FGF/CFR相互作用的上遊或下遊信號途徑組分，或通過阻礙FGFR二聚化，降低或抑制脂肪形成。
因此，當需要降低脂肪形成時，所述試劑用於降低或削弱前脂肪細胞的脂肪形成潛能，例如，包括在肥胖症或脂肪形成局部異常增加症的治療中降低或削弱脂肪細胞的形成。這樣的治療方法所關注的病症包括與肥胖相關的或肥胖引起的病理，例如動脈硬化、高血壓、糖尿病和其他內分泌或代謝疾病或病症。脂肪形成局部異常增加症可以包括脂肪腫塊(脂肪瘤和脂肪肉瘤)和脂肪過多症。作為另外一種選擇，當需要提高脂肪形成時，所述試劑用於增強脂肪形成，例如，包括在與惡病質相關病症或局部脂肪缺失症中提高脂肪沉積。
降低或阻斷基因表達的合適的試劑包括但不限於寡核糖核苷酸序列，包括反義RNA和DNA分子和酶性核酸，其作用在於抑制例如編碼FGF或FGFR的mRNA的翻譯。反義RNA和DNA分子的作用是通過與目標mRNA結合併阻礙蛋白翻譯的方式直接妨礙mRNA的翻譯。關於反義DNA，優選的是來源於翻譯起始位點的(例如位於-10和+10區域之間的)寡脫氧核糖核苷酸。
酶性核酸是具有酶活性的RNA分子，能催化RNA的特異性裂解。酶性核酸的作用機理包括酶性核酸分子與互補的靶RNA序列特異性雜交，隨後發生內切核苷酸裂解。遺傳工程改造的、特異高效地催化靶序列內切核苷酸裂解的錘頭狀酶性核酸分子包含在本發明範圍以內。任何可能的RNA靶分子中的酶性核酸特異性裂解位點最初通過對靶分子上酶性核酸切割位點的掃描進行鑑別，這些切割位點包括下列序列GUA、GUU和GUC。一旦完成鑑別，對應於靶基因包含切割位點的區域的介於15到20個核糖核苷酸的短RNA序列可進行預測結構特徵(諸如可能造成寡核苷酸序列不合適的二級結構)的評估。候選靶基因的合適性也可以採用核糖核酸酶保護檢測法通過檢測其與互補的寡核苷酸的雜交可達性進行評估。
反義RNA和DNA分子和酶性核酸均可用任何RNA合成領域內所知的方法製備。這些方法包括本領域內所熟知的諸如固相亞磷醯胺化學合成等化學合成寡脫氧核糖核苷酸技術。作為另一種選擇，RNA分子可以通過編碼反義RNA分子的DNA序列的體內或體外轉錄產生。這樣的DNA序列可以組合入多種包含合適的RNA聚合酶啟動子(如T7或SP6聚合酶啟動子)的載體中。作為另一種選擇，組成型或誘導型(取決於所用的啟動子)合成反義RNA的反義cDNA結構可以穩定地導入細胞系中。
可以採用多種DNA分子的修飾手段，作為提高細胞內穩定性和半衰期的方法。可能的修飾包括但不限於在所述分子的5』或3』末端添加核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸構成的側翼序列，或在寡脫氧核糖核苷酸骨架中採用硫代磷酸或2-O-甲基而不是磷酸二酯酶聯接。
作為另一種選擇，介導靶基因或基因轉錄本的RNA幹擾(RNAi)的RNA分子可用於降低或阻斷基因表達。RNAi是指通過引入與靶基因轉錄本同源的單鏈的、通常是雙鏈的RNA(dsRNA)幹擾或破壞靶基因產物。因而，在一些實施方案中，對應於至少一部分靶基因的dsRNA本身、特別是產生dsRNA的結構可被用於降低或阻斷靶基因的表達。RNAi介導的基因表達抑制可以採用本領域所報導的任何技術實現，例如通過將編碼莖-環結構或髮夾結構RNA的核酸結構轉染進入靶細胞基因組，或通過從收斂的啟動子之間表達轉染的具有與靶基因同源性的核酸結構，或從一個單獨啟動子後以頭部對頭部或尾部對尾部方式重複。可以採用任何類似結構，只要其產生具備自身摺疊能力並形成雙鏈RNA(dsRNA)的單獨RNA，或只要產生兩個獨立的、隨後退火形成與靶基因具有同源性的dsRNA的RNA轉錄本。
RNAi並不要求絕對同源性，其已有描述的較低的臨界值對於約由200個鹼基對組成的dsRNA而言約為85％同源性(Plasterk和Ketting，2000，Current Opinion inGenetics and Dev.10562-67)。因此，取決於dsRNA的長度，RNAi編碼核酸所包含的針對靶基因轉錄本的同源水平可以發生改變，也就是說，對於100到200鹼基對的dsRNA而言，具備與靶基因至少85％同源性，而更長的dsRNA，亦即由300到400鹼基對的，具備與靶基因至少75％同源性。表達針對與分別表達的RNA退火而設計的單一RNA轉錄本的RNA編碼結構，或從收斂的啟動子表達單獨轉錄本的單個結構優選地至少包含100個核苷酸。表達針對通過內部摺疊形成dsRNA而設計的單一RNA的RNA編碼結構優選地至少包含200個核苷酸。
為表達dsRNA形成結構所採用的啟動子可以是任何類型的啟動子，只要最終的dsRNA特異性針對所需破壞細胞系中的基因產物。作為另一種選擇，啟動子可以是譜系特異性的，亦即其只在特殊發育譜系的細胞中表達。這在與非目標細胞譜系中表達的基因具有一些同源性重迭的情況下可能具有優勢。啟動子還可以是由外界控制因素或細胞內環境因素誘導的。
在其他實施方案中，如Tuschl等在申請號為No.20020086356的美國專利中所述，約21到約23個核苷酸的、直接裂解與其相應的特異mRNA的RNA分子可被用於介導RNA幹擾。這樣的21-23核苷酸的RNA分子可以包含3』羥基基團，可以是單鏈或雙鏈的(兩條21-23核苷酸的RNA)，這裡的雙鏈RNA分子可以是平末端的或含粘性末端的(如5』，3』)。
按照本發明，FGF信號途徑的多個階段可以作為調節脂肪形成的目標。在一些實施方案中，FGF的水平或濃度是目標作用對象。因此，通過採用例如RD systems公司的AF232(RD Systems Inc.Minneapolis，MN)等商業提供的或如Cancer Res 1988.484266中所公開的抗FGF抗原結合分子(如中和抗體)，可以降低FGF(特別是細胞外FGF)的水平或功能活性。
在其他實施方案中，FGF-FGFR結合或激活是目標作用對象。例如，通過FGFR的過量表達、或通過促進FGFR在沒有配體存在條件下二聚化/寡聚化並隨之組成型活化的突變，可以實現FGFR信號的激活。作為另外一種選擇，可以採用能誘導受體二聚化的非配體分子以產生類似的效果。受體突變還可以引起生物效果的分離，可用於「剪裁」FGF反應。
在其他實施方案中，FGFR信號傳輸的抑制或阻斷通過降低FGFR表達、FGFR突變(尤其是磷酸化位點的突變，但不排除其它位點)、防止受體聚合、或採用通過阻斷活性位點或相關基序幹擾配體-受體相互作用的方法實現。這樣的策略包括受體的封閉抗體和結合的小分子抑制劑。削弱受體磷酸化的藥理學方法也可以是有效的。典型的FGFR拮抗劑包括可溶形式的FGFR，包括但不限於，例如，如在Oncogene 1991，61195和FASEB J 1992，63362中所公開的可溶的重組FGFR-1(IIIc)/Fc嵌合體、可溶的重組FGFR-2/Fc嵌合體和可溶的重組FGFR-3/Fc嵌合體。本發明也包括採用例如如Cancer Res 1988.484266中所公開的，具有不同阻斷能力的FGFR拮抗的抗原結合分子。在其他實施方案中，例如如J Biol Chem 1992.26711307中所公開的，金屬螯合劑(如EDTA或EGTA)可用於阻滯FGFR二聚化，FGFR結合肽可用於拮抗FGFR的活性或其活化(如Cell Growth and Diff.2001中所公開的FGFR730(p)Y)，以及IUBMB Life 2002.5467中公開的合成肽Ac-ValTyrMetSerProPhe-NH2。本發明也包括使用如TMPP(Cardiovascular Res 2002.53232)的FGF-2抑制劑和如PD161570(Life Sciences 1998.62143)的FGFR1酪氨酸激酶抑制劑。
在其他實施方案中，目標的作用對象是HSPG。在這一點上，已知的是，HPSG表達或類型的改變影響FGF信號傳輸，HPSG突變體(天然的或人工的)與FGF信號傳輸的調節相關聯。例如，如在Simpson-Golabi-Behmel症中所觀察到的磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3上的突變與FGF-1信號傳輸上調相關聯。多種非特異和特異的藥理學方式可以降低HPSG表達，導致FGF信號傳輸的改變。這樣的策略已在降低脂肪形成和腫瘤發育的努力中得到了發展。功能類似於HSPG(亦即能調控配體-受體複合物或其活性)的其他分子也能調節FGF信號傳輸。典型的HSPG拮抗劑包括但不限於八硫酸蔗糖(Mol Cell Biol 2002.227184)、蘇拉明(J Mol Biol 1998.281899)、suradistas(J Mol Biol 1998.281899)、TNP-470(PNAS 2002.9910730)、血管抑素(PNAS 2002.9910730)、內皮抑素(PNAS 2001.9812509和Human Gene Therapy.2001.12347)、諸如PI-88的乙醯肝素酶抑制劑(Cancer Research 1999.593433)、硫酸麥芽六糖(Cancer Research 1999.593433)、肝素酶(J.Biol Chem 1997.27212415和J.Biol.Chem 1994.26932279)、類肝素酶(J.Biol.Chem 1994.26932279)和氯酸鈉(J.Biol.Chem 1994.26932279)。
在還有其他實施方案中，目標的作用對象是FGF信號轉導受體下遊的組分。FGFR下遊信號傳輸的調控能提高或降低FGF的特異性生物學作用。這樣的策略也具備獲得細胞特異性或組織特異性作用的潛力。同時，如上文所指出的，FGFR所利用的信號轉導途徑中的配體或受體經常不是唯一的，通過調節信號通路調控FGF信號傳輸已經得到了證實。SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途徑的典型的拮抗劑包括但不限於諸如calphostin C(Cal C)(J Biol Chem.1999 27418243)的PKC抑制劑、諸如PD 98059(PD)(Diabetes 2003.5243和JBC 1998.27332111)的MEK抑制劑、如Ly 294002(LY)(Cellular Signalling 2001.13363和J.Neurochem.2002.81365)的PI3-K抑制劑、如SB 202474(SB 474)(JBC 1998.27332111)的SB190對照化合物、SB203580(Diabetes 2003.5243和JBC 1998.27332111)、SB 202190(JBC1998.27332111)、12-0-十四烷醯佛波醇13-醋酸鹽(TPA)(Oncogene 2002.211978)以及PD98059。作為另外一種選擇，在這一點上，PLCγ-PI3K-PKC-Ca2+途徑可以作為作用目標，許多研究工作支持這一途徑上任何水平的抑制能干擾包括FGF信號傳輸在內的生長因子信號傳輸這一假設。本發明實際應用中所採用的典型抑制劑包括但不限於如U-73122(Calbiochem)的磷酯酶C抑制劑。
在還有其他實施方案中，目標的作用對象是CFR。在這些實施方案中，CFR的過表達會導致FGF-1和FGF-2胞內累積的減少。這樣的策略能調控FGF作用，尤其通過調控假設的直接轉錄作用。
本發明也包括按照下文第三部分實施例中所描述的方法所鑑定的基因或表達產物抑制劑在上述方法中的應用。
可用於增強目標多肽活性的試劑包括任何合適的、能以如下文第三部分實施例中所公開的常規方法或用非人類動物模型鑑別或產生的誘導劑或穩定/激活試劑。在這種情況下，所述試劑可以包含目標多肽的至少一個生物學活性片段或編碼全長目標多肽或其生物學活性片段的多核苷酸。典型的此類試劑包括FGFR或FGF抗原結合激活分子、Fgf多核苷酸或FGF多肽或其表達產物增強、促進或以其他方式使FGF和FGFR之間發生相互作用的多核苷酸、或這一多核苷酸的多肽表達產物。產生Fgf多核苷酸和FGF多肽的序列信息可在如GenBank和EMBL等公共資料庫中獲得。這樣的分子可由精通本領域的技術人員採用常規技術容易地進行製造。
本發明的調節試劑能合適地影響或調節脂肪形成。因此，優選的測試對象細胞是產生FGF的MVEC或其祖細胞、或可以表達能被FGF激活的FGF受體的前脂肪細胞。前脂肪細胞是通過脂肪形成過程分化產生新的脂肪細胞的細胞類型。脂肪細胞的積累導致先於肥胖的脂肪增加，相反地，在沒有脂肪形成情況下的脂肪過度消耗導致過低的脂肪儲備，就象在惡病質或局部脂肪缺失症中所發生的情況。測試調節試劑對MVEC的作用的合適的檢測方法包括但不限於在假定的FGF調節試劑或FGFR調節試劑存在的情況下與前脂肪細胞共培養。調節試劑抑制或刺激前脂肪細胞分化潛能的能力可以用培養的前脂肪細胞或在活體內通過用本發明中的分子對合適的動物模型給藥進行檢測。本發明的發明人建立了從接受選擇性腹部手術的個體中獲得網膜和皮下脂肪組織活體樣本並用來自這樣的活體組織材料的前脂肪細胞和MVEC進行細胞培養的系統。檢測增殖和分化潛能的檢測方法是本領域內所公知的。培養皮下和網膜前脂肪細胞，隨後在存在或不存在假設的FGF或FGFR調節試劑的情況下與MVEC條件生長培養基接觸。檢測前脂肪細胞增殖與分化的檢測方法也是本領域內所公知的。例如，增殖檢測方法包括如與促增殖生長培養基接觸後用甲化合物比色法(Promega)對前脂肪細胞進行細胞計數。前脂肪細胞分化潛能通過檢測3磷酸甘油脫氫酶(G3PDH)酶活和甘油三酯的積累進行評定。
從事本領域的人員所熟知的活體內的評價手段可用於評價如這裡所述的FGF信號途徑調節試劑對前脂肪細胞分化為脂肪細胞的潛能的影響。這樣的分化導致脂肪組織積累，檢測患者體內脂肪組織總量的檢測手段包括用皮厚度計檢測皮褶厚度。這一檢測方法包括綜合來自合適部位(如三頭肌、二頭肌、肩胛下及上髂骨區域的)的皮褶厚度以獲得身體脂肪百分比數值。其他的活體檢測方法包括水下稱重、生物電阻抗、雙能X射線吸收測定和放射學造影(如CT或核磁共振造影)。
如這裡所述的FGF信號途徑調節試劑也可用於在發生脂肪儲備嚴重損耗的病症(這裡通常用術語惡病質和惡病質相關病症表示)中增強脂肪形成。其他的應用包括存在局部脂肪形成缺陷的病症的臨床治療。這樣的病症包括脂肪營養不良以及物理創傷、燒傷或萎縮性疾病引起的脂肪組織的局部缺失。除其他原因以外，這樣的病症可以源自腫瘤、心臟病、瘧疾和晚期腎衰竭。本發明的方法可以預防或延緩與此類病理狀態相關的脂肪組織消耗。
3.目標調節分子的鑑定本發明也公開了篩選包括調節基因表達或該基因表達產物的水平和/或功能活性等的調節FGF信號途徑的試劑的方法，其中，所述基因選自Fgf基因、Fgfr基因、與Fgf基因或Fgfr基因、屬於相同調控或生物合成途徑的基因、或其表達產物調節(如促進、增強或使之能夠；或抑制或削弱)FGF和FGFR之間相互作用的基因、或其表達直接或間接受控於Fgf基因表達產物的基因、或激活或拮抗與FGF相互作用的FGFR功能的基因。
在一些實施方案中，所述方法包括(1)將一種製品與一種待測試劑接觸，其中所述製品包括(i)一條包含對應於FGF信號途徑中一個多肽組分的至少一個生物學活性片段或其變異體或衍生物的胺基酸序列的多肽；或(ii)以可操作方式與報導基因相連的一條包含至少部分調控該組分的一個遺傳序列的多核苷酸；以及(2)探測相對於不存在該待測試劑時，正常或參照水平和/或功能活性的所述多肽組分或所述報導基因表達產物的水平和/或功能活性的改變，這可說明所述試劑調節FGF信號途徑。
本發明包括任何合適的探測、測量或以其他方式確定脂肪形成的調節(例如，如探測前脂肪細胞增殖和分化潛能)的檢測方法。具有合適性質的檢測方法對於精通本領域的技術人員而言是已知的，這樣的實例在前文第二部分中進行了描述。
在本發明範圍以內的調節試劑包括FGF信號途徑的激動劑和拮抗劑，拮抗劑包括了如第二部分實例中所描述的抗原結合拮抗分子、肽段抑制劑、反義分子、酶性核酸、RNA幹擾分子和共抑制分子、磷脂酶C抑制劑和激酶抑制劑。激動劑包括抗原結合激活分子、FGF信號途徑組分或其生物學活性片段、變異體和衍生物、提高啟動子活性或幹擾負調控機制的分子和克服任何負調控機制的分子。
侯選試劑包括許多類化合物，然而典型地是有機分子，優選地是分子量大於50並小於約2500Da的有機小化合物。侯選試劑包含與蛋白在結構上相互作用所必需的功能基團，尤其是氫鍵，典型地包含至少一個胺基、羰基、羥基或羧基，優選地包含至少兩個所述功能化學基團。侯選試劑經常包含代替一個或多個上述功能基團的碳環或雜環結構或芳烴或聚芳烴結構。侯選試劑也可以是生物分子，包括但不限於肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們的衍生物、結構類似物或其組合。
特別優選地是FGF多肽或FGFR多肽的小分子(非肽類)調節物。在這一點上，特別優選小分子是因為這樣的分子口服後更易於吸收，含有更少的抗原決定簇，或比更大的、以蛋白為基礎的藥物更可能通過細胞膜。有機小分子也可以具備進入適當的細胞並影響基因表達(例如通過與參與基因表達的調控區或轉錄因子相互作用)的能力；或通過抑制或增強輔助分子的結合影響基因的活性。
除此以外，可利用或可便利地產生細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫。而且，天然的或合成手段產生的化合物和庫能通過常規的化學、物理和生化手段便利地進行改進，也可用於生成組合化合物庫。對已知的藥理學試劑可進行定向的或隨機的化學修飾，如醯化、烷化、酯化、氨基化等等，以生成結構類似物。
篩選也可以針對已知具有藥理學活性的化合物及其化學類似物。
可以採用任何合適的方法實現按照本發明的調節試劑的篩選。例如，所述方法可以包括將表達相應的Fgf基因或Fgfr基因或與Fgf或Fgfr基因屬於相同調控或生物合成途徑的基因的細胞與可能具有調節活性的試劑接觸，並檢查該多核苷酸所編碼蛋白的水平或功能活性的調節，或該多核苷酸編碼的轉錄本水平的調節，或所述蛋白或轉錄本(此後表示為靶分子)的下遊細胞目標分子的活性或其表達的調節。檢測這樣的調節能夠通過包括但不限於下列技術手段實現ELISA法、細胞ELISA法、抑制型ELISA法、免疫印跡法、免疫沉澱法、狹縫或點印跡法、免疫染色法、放射免疫法、親近閃爍檢測法(SPA)、採用抗原結合分子或抗原與諸如螢光素或羅丹明等螢光試劑結合的免疫螢光法、Ouchterlony雙重擴散分析法、採用親合素-生物素或鏈親合素-生物素檢測系統的免疫檢測法以及包括RT-PCR在內的核酸檢測方法。
需要理解的是，調控或表達關注的目標分子的多核苷酸可以是天然存在於作為測試對象的細胞中的，也可以出於測試的目的而事先導入宿主細胞。此外，天然存在的或導入的多核苷酸可以是組成型表達的，這樣就提供了在篩選下調該序列編碼產物表達的試劑中的有益的模型，其中下調可以發生在核酸水平或表達產物水平；天然存在的或導入的多核苷酸也可以是需要激活的，這樣就提供了在篩選上調該序列編碼產物表達的試劑中的有益的模型。此外，在多核苷酸導入細胞的情況下，該多核苷酸可以包含編碼靶蛋白的完整編碼序列，或可以包含這一編碼序列的一部分(例如，FGFR的FGF結合結構域，或FGF的FGFR結合結構域，或FGFR的HSPG結合結構域)或調控該多核苷酸編碼產物表達的部分(例如啟動子)。例如，可以將天然與所述多核苷酸相聯的啟動子導入作為測試對象的細胞中。在這一點上，在只利用啟動子的情況下，例如，可以通過以可操作方式將該啟動子與合適的、包括但不限於綠螢光蛋白(GFP)、螢光素酶、β-半乳糖苷酶和乙醯兒茶酚胺(CAT)在內的報導多核苷酸連接實現對所述啟動子活性的檢測。表達調節可以通過檢測與報導多核苷酸相關聯的活性進行測定。
在另一個實施例中，檢測目標可以是靶分子的下遊調控目標而不是靶分子本身，或是以可操作方式與編碼產物表達受靶蛋白調控的基因的啟動子相連的報導分子。
這些方法提供了對推測的、諸如包括合成的、組合的、化學的和天然的化合物庫在內的蛋白類或非蛋白類調節試劑進行高通量篩選的機制。這些方法也能簡化檢測與編碼靶分子的多核苷酸結合的或調節上遊分子表達、隨後調節編碼靶分子的多核苷酸表達的試劑。因而，這些方法提供了檢測直接或間接調節按照本發明的靶分子的表達或活性的試劑的機制。
在一系列實施方案中，本發明提供了鑑別能誘導或抑制按照本發明的靶分子的水平和/或功能活性的小分子或其它化合物(即調節試劑)的檢測方法。採用非轉化細胞、永生細胞系或重組細胞系，這些檢測方法可以在體外實行。此外，在mRNA表達提高或降低(例如，通過採用這裡所公開的核酸探針)、蛋白產物提高或降低(例如，通過採用這裡所公開的抗原結合分子)、或重組結構中以可操作方式與靶分子相關基因調控區相連的報導基因(例如，GFP、β-半乳糖苷酶或螢光素酶)表達水平提高或降低的基礎上，這些檢測方法可檢測到基因或蛋白產物表達提高或降低的存在。
因而，例如，人們可以培養產生特定靶分子的細胞並向培養基中添加一種或多種待測化合物。在使所述化合物得以誘導或抑制靶分子的水平或功能活性的足夠期間(如6-72小時)以後，靶分子水平相對於確定基線的任何變化可以用任何上述本領域內熟知的技術進行檢測。在特別優選的實施方案中，所述細胞是前脂肪細胞或微血管內皮細胞(MVEC)。通過採用適當的核酸探針或抗原結合分子，僅需要常規的實驗，就可以檢測靶分子水平和/或功能活性的改變，並鑑定所述化合物是靶分子的激動劑或拮抗劑。
在一些實施方案中採用重組檢測方法，在這種情況下，編碼如GFP、β-半乳糖苷酶或螢光素酶的報導基因以可操作方式與靶分子相關基因的5』端調控區相連。通過本領域中普通技術可以容易地分離和克隆這樣的調控區。所述報導基因和調控區連接在同一框架中(或在3種可能讀框的任意一種中)，這樣所述報導基因的轉錄與翻譯可以在靶分子相關基因的調控元件的控制下發生。雖然優選的是哺乳動物細胞，最優選的是人的細胞，重組結構可以隨後導入任何適當的細胞類型中。轉化的細胞可以在細胞培養物中生長，並且在確定報導基因表達水平的基線值以後，可以向培養基中添加測試化合物。報導基因表達檢測的簡易性為鑑定本發明中靶分子的激動劑或拮抗劑提供了一種快速、高通量的檢測方法。
通過這一方法鑑定的化合物能在改變體內靶分子相關基因的表達中具備潛在效用。可以進一步在動物模型中測試這些化合物以識別那些具備最佳體內效果的化合物。此外，如以上關於具備目標多肽結合活性的小分子的描述，這些分子可以作為「先導化合物」，通過如對化合物進行連續修飾、分子建模和其他藥物設計中的常規操作，進一步發展為藥物。
在其他實施方案中，提供了識別抑制FGF活性的試劑的方法，在這種情況下，純化的FGF蛋白製品在存在和不存在候選試劑的情況下、在FGF保持活性的條件下溫育，並用合適的檢測方法測定FGF活性水平。例如，可以通過檢測候選試劑降低細胞中(例如，MVEC和前脂肪細胞)FGF活性的能力來識別FGF抑制劑。
在該方法的一個實施方案中，能表達Fgf的MVEC與前脂肪細胞共培養，培養基中的細胞與候選試劑在保持細胞內FGF活性的條件下相接觸(或在存在和不存在候選試劑的情況下培養)，並檢測諸如前脂肪細胞分化潛能增強等脂肪形成相關的活性。如果抑制這一活性，則該候選試劑測試為陽性。
在還有其他實施方案中，提供了一種識別提高FGF活性的試劑的方法，在這種方法中，純化的FGF蛋白製品在存在和不存在候選試劑的情況下、在保持FGF活性的條件下溫育，並通過合適的檢測方法測定FGF活性水平，例如，通過檢測候選試劑在細胞中(例如，MVEC和前脂肪細胞)提高FGF活性或激活FGF的能力，可以識別FGF刺激物或活化劑。在這種方法的一個實施例中，能表達Fgf的MVEC與前脂肪細胞共培養，培養基中的細胞與候選試劑在保持FGF細胞內活性的條件下相接觸(或在存在和不存在候選試劑的情況下培養)，並檢測諸如前脂肪細胞分化潛能增強等與脂肪形成相關的活性。如果能提高該活性，則該候選試劑測試為陽性。
在還有其他實施方案中，提供了識別抑制或防止FGFR激活的試劑的方法，在這些方法中，純化的FGFR蛋白製品在存在和不存在候選試劑的情況下、在保持FGFR結合FGF配體能力的條件下溫育，並通過合適的檢測方法檢測FGFR激活水平。例如，通過檢測在受體配體存在的情況下候選試劑相對基線值降低細胞中(如前脂肪細胞)FGFR活化的能力，可以識別FGFR拮抗劑。在該方法的一個實施例中，能表達Fgfr的前脂肪細胞與MVEC共培養，培養基中的細胞與候選試劑在保持FGF細胞內活性的條件下相接觸(或在存在和不存在候選試劑的情況下培養)，並檢測諸如前脂肪細胞分化潛能增強等與脂肪形成相關的活性。如果能抑制該活性，則試劑測試為陽性。
在其他實施方案中，提供了識別增強FGFR活化的試劑的方法，在這些方法中，純化的FGFR蛋白製品在存在和不存在候選試劑的情況下、在保持FGFR結合FGF配體能力的條件下溫育，並通過合適的檢測方法檢測FGFR激活水平。例如，通過檢測在受體配體存在的情況下候選試劑相對基線值增強細胞中(如前脂肪細胞)FGFR基本活化作用的能力，可以識別FGFR激動劑。在該方法的一個實施例中，能表達Fgfr的前脂肪細胞與MVEC共培養，培養基中的細胞與候選試劑在保持FGF細胞內活性的條件下相接觸(或在存在和不存在候選試劑的情況下培養)，並檢測諸如前脂肪細胞分化潛能增強等與脂肪形成相關的活性。如果能增強或促進該活性，則該候選試劑測試為陽性。
在還有其他實施方案中，附著在固相支持物上的、由胺基酸所有可能的組合構成的隨機肽庫可用於識別能與靶分子或其功能結構域結合的肽。識別能與靶分子結合的分子可以通過用重組的可溶性靶分子篩選肽庫得以實現。所述靶分子可以是純化的、重組表達的或通過任何合適技術合成的。精通本領域的人員可以採用例如如Sambrook等的著作中(1989，同上)尤其是第16和17部分、Ausubel等的著作中(《分子生物學現行技術》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley SonsInc，1994-1998)尤其是第10和16章、Coligan等的著作中(《免疫學現行技術》(Current Protocols in Immunology)，John Wiley Sons Inc，1995-1997)尤其是第1、5和6章所描述的常規實驗方案方便地製備這些分子。作為另一種選擇，按照本發明的目標多肽可以採用如Atherton和Shephard的著作(上文所述)的第9章和Roberge等的文章(1995，Science 269202)中所述的液相或固相合成方法進行合成。
為了識別並分離與靶分子(優選的是靶多肽)相互作用並形成複合物的肽/固相支持物，可能需要對靶多肽進行標記或「加上標籤」。靶多肽可以與包括諸如鹼性磷酸酶和辣根過氧化物酶的酶及諸如異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)和羅丹明的螢光報導分子結合。任何特定的報導分子與靶多肽的結合可以採用本領域內的常規技術得以實現。作為另外一種選擇，可以對靶多肽表達載體進行改造使之表達包含針對商業提供的抗原結合分子的抗原決定簇的嵌和靶多肽。抗原決定簇特異性抗原結合分子可以採用包括酶標記、螢光染料標記或磁珠標記在內的本領域內熟知的方法進行標記。
例如，標記的靶多肽偶聯物與隨機肽庫在22℃下溫育30分鐘到1小時，以使靶多肽與文庫中的肽之間形成複合物。隨後洗滌文庫以除去未結合的靶多肽。如果靶多肽已與鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶結合，則將整個文庫注入含有相應的如5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)或3，3』-二氨基聯苯胺(DAB)的鹼性磷酸酶或過氧化物酶底物的培養皿中。幾分鐘溫育後，肽/固相靶多肽複合物發生顏色改變，並能方便地在配有顯微操縱器的解剖顯微鏡下識別並實體分離該複合物。如果採用了螢光標記的靶多肽，複合物可以用螢光激活篩選技術進行分離。如果採用了具備外源抗原決定簇的嵌合靶多肽，肽/靶多肽複合物的檢測可以通過採用經標記的抗原決定簇特異性抗原結合分子得以實現。分離以後，附著於固相支持物上的肽的特徵可以通過肽段測序進行測定。
4.參與FGF信號途徑的基因表達檢測方法由於FGF信號途徑中的基因(例如，Fgf基因和Fgfr基因)被認為與脂肪形成，尤其是與引發前脂肪細胞分化相關聯，可以推斷這些基因的表達異常可能是脂肪形成機能障礙的基礎或對脂肪形成機能障礙產生影響。脂肪形成機能障礙包括可能與發展成肥胖症或包括但不限於家族性肥胖、動脈硬化、高血壓和糖尿病在內的肥胖相關疾病的誘因相關聯的脂肪形成的提高。因此，本發明提供了一種在患者中檢測肥胖症的存在或診斷肥胖症風險的方法，該方法包括測定取自患者的生物樣本中參與FGF信號途徑的異常基因(如異常的Fgf基因或Fgfr基因)或該基因異常表達產物的存在，其中異常基因或異常表達產物與肥胖症發展或肥胖相關疾病的存在或患病風險相關。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測所述基因表達產物與該表達產物的正常基準水平或功能活性不同的水平和/或功能活性。例如，當Fgf基因產物或Fgfr基因產物以比正常的、非肥胖症患者或未受肥胖影響的患者中的表達水平明顯更高的水平表達時，診斷為存在肥胖症或可能患有肥胖症。作為另外一種選擇，通過檢測Fgf基因或Fgfr基因表達產物的水平或功能活性相對於該基因正常的、非肥胖基準水平或功能活性的增強或提高，來診斷肥胖症。
因而，需要定量或定性地測定FGF信號途徑中的組分的蛋白水平或轉錄水平。另外或此外，需要尋找FGF信號途徑的結構異常基因及其調控區。
所述生物樣本可以是任何合適的組織(如皮下結締組織或網膜組織的活體切片)或體液。
4.1遺傳診斷本發明的一種實施方案包括一種用於檢測參與FGF信號途徑的基因表達增強的方法。例如，通過定量或定性地測定細胞中(如MVEC)Fgf基因轉錄本或細胞中(如前脂肪細胞)Fgfr基因轉錄本，可以檢測Fgf基因或Fgfr基因的表達。本發明的另一種實施方案包括一種通過檢查細胞(如MVEC)的基因和轉錄本而用於檢測參與FGF信號途徑的基因(如Fgf基因或Fgfr基因)表達或功能的增強的方法。在這些實施方案中，按照常規方法(Sambrook等著，《分子克隆實驗手冊》(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，1989；Ausubel等著，《分子生物學現行技術》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley SonsInc，1994-1998)可以從生物樣本所含的細胞中分離核酸。所述核酸可以是基因組DNA或部分或總細胞RNA。在使用RNA的情況下，可能希望將RNA轉換為cDNA。在一種實施方案中，RNA是總細胞RNA；在另一實施方案中，RNA是poly-A RNA。在一種實施方案中，所述核酸通過核酸擴增技術擴增。合適的核酸擴增技術是精通本領域的技術人員所熟知的，並包括如例如Ausubel等在其著作(上文所述)中所描述的聚合酶鏈式反應(PCR)；如例如美國專利No 5,422,252中所述的鏈替代擴增反應(SDA)；如例如Liu等(1996)、國際申請WO 92/01813及Lizardi等(國際申請WO 97/19193)所描述的滾環複製(RCR)；如例如Sooknanan等(1994，Biotechniques 171077-1080)所述的依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)；以及如例如Tyagi等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935395-5400)所述的Qβ複製酶擴增系統。
取決於具體存在形式，待研究的特異核酸直接通過擴增或擴增後採用第二個已知的核酸在樣本中進行鑑定。隨後，對經鑑定的產物進行檢測。在某些應用中，可以通過直接觀察進行檢測(如膠的溴化乙錠染色)。作為另外一種選擇，檢測可以包括通過放射性標記或螢光標記的化學發光、放射性閃爍成像或甚至通過採用電或熱脈衝信號系統(Affymax Technology；Bellus，1994，J Macromol.Sci.Pure，Appl.Chem.，A31(1)1355-1376)的產物鑑別方法。
經過檢測以後，人們可以將特定患者中發現的結果與對照反應或具有統計學意義的正常對象參照組的結果進行比較。通過這種方式，可能使檢測到的表達產物量與肥胖症的進程或嚴重程度相關聯。
除了測定轉錄本水平以外，檢測多種類型的缺陷可能也是有用的。這些缺陷可能包括缺失、插入、點突變和重複。點突變導致形成終止密碼子、移碼突變或胺基酸置換。體細胞突變是存在於非胚系組織中的。胚系組織能存在於任何組織中並遺傳獲得。通過改變基因的轉錄或提高轉錄本(mRNA)或蛋白的穩定性或以其他方式改變它們的處理，編碼區內或之外的突變也可以影響FGF信號途徑組分產生的數量。
在這一點上包括多種不同的檢測方法，包括但不限於螢光原位雜交(FISH)、直接DNA測序、脈衝場電泳(PFGE)分析、核酸印跡雜交(Southern或Northern印跡)、單鏈構象分析(SSCA)、核糖核酸酶保護分析、等位基因特異性寡核苷酸探針法(ASO)、斑點雜交、變性梯度凝膠電泳、核酸限制性片段長度多態性(RFLP)分析和聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析方法(PCR-SSCP)。本發明也包括如Hacia等(1996，NatureGenetics 14441-447)和Shoemaker等(1996，Nature Genetics 14450-456)所述的DNA晶片技術。總而言之，這些技術包括了用於快速精確地對大量基因進行分析的定量方法。通過寡核苷酸標記基因或採用固定的探針陣列，可以運用如高密度陣列的晶片技術分離靶分子並在雜交的基礎上篩選這些分子。也可參見Pease等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.915022-5026)和Fodor等(1991，Science 251767-773)的著作。
4.2 基於蛋白的診斷4.2.1 抗原結合分子在檢測FGF信號途徑基因表達的提高或降低中，可以使用能與本發明中的靶分子免疫相互作用的抗原結合分子。因而，本發明也包括與參與FGF信號途徑的基因表達產物(例如FGF或FGFR多肽或調控或以其他方式影響一個或多個FGF多肽或FGFR多肽的水平和/或功能活性的蛋白)特異性結合的抗原結合分子。例如，抗原結合分子可以包括全部多克隆抗體。這樣的抗體可以通過例如將本發明中的靶分子注入可以包括小鼠或兔在內的生產物種體內以獲得多克隆抗血清的方式製備。對於精通本領域的技術人員而言，生產多克隆抗體的方法是眾所周知的。可以採用的典型的實驗方案參見如Coligan等所著的《免疫學現行技術》(Current Protocols InImmunology)(John Wiley Sons，Inc，1991)和Ausubel等的著作(1994-1998，上文所述)，尤其是第11章第3部分。
與從生產物種中獲得多克隆抗體不同，單克隆抗體可以通過採用例如Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)所述的常規方法、或通過這些方法的最近的改良方案進行生產，例如Coligan等的著作中(1991，上文所述)所述的通過永生脾細胞或源自已接種了本發明中的靶分子的生產物種的其他抗體生成細胞進行生產。
本發明也包括作為抗原結合分子的Fv、Fab、Fab』、和F(ab』)2免疫球蛋白片段。此外，抗原結合分子可以是合成的穩定的Fv片段、單一可變區結構域(也稱作dAbs)、「微型抗體」以及其他本領域內所知的形式。
作為抗原結合分子也包括人源化抗體。人源化抗體是通過將非人源(如齧齒動物，優選的是小鼠)免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區組成的決定簇互補區轉移入人的可變區結構域進行生產的。隨後對非人源的對應物的框架區中人源抗體的典型殘基進行了置換。使用源自人源化抗體的抗體組分避免了與非人源抗體固定區的免疫原性相關連的潛在問題。文獻中描述了克隆非人源(尤其是鼠源)免疫球蛋白可變區結構域的通用技術，例如Orlandi等在1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833中的描述。文獻中描述了生產人源化單克隆抗體的技術，例如Jones等(1986，Nature321522)、Carter等(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285)Sandhu(1992，Crit.Rev.Biotech.12437)、Singer等(1993，J.Immun.1502844)、Sudhir主編的《抗體工程技術方案》(Antibody Engineering Protocols，Humana Press，Inc.1995)、Kelly在《遺傳工程治療性抗體》(「Engineering TherapeuticAntibodies」)中(見Cleland等主編的《蛋白質工程原則與實踐》(「ProteinEngineeringPrinciples and Practice」)一書399-434頁，John Wiley Sons，me.1996)和Queen等在美國專利No.5,693,762(1997)中所描述的。
4.2.2 免疫診斷檢測通過諸如ELISA和免疫印跡雜交等技術，上述抗原結合分子可用於直接或間接檢測在健康和疾病狀態下FGF信號途徑基因表達的調節。能用於檢測本發明的靶多肽的示意性檢測方法包括但不限於包括抗原結合分子與樣本中的靶多肽(FGF多肽)結合併檢測由抗原結合分子和靶多肽組成的複合物的免疫檢測方法。典型的免疫檢測是能檢測本發明中靶分子的水平或功能活性的測定方法。通常，將能與本發明中靶分子免疫相互作用的抗原結合分子與可能含有靶多肽的生物樣本接觸。檢測由抗原結合分子和靶多肽組成的複合物的濃度，隨後建立測定的複合物濃度與樣本中靶多肽的濃度之間的關聯。與本發明相一致，靶多肽異常濃度的存在，尤其是其濃度的提高，表明包括肥胖在內的脂肪形成功能障礙的存在或患病的可能性。
可以採用任何適當的檢測抗原結合分子-目標抗原複合物形成的技術手段。例如，按照本發明具備與之相連的報導分子的抗原結合分子可用於免疫檢測。這樣的免疫檢測包括但不限於放射免疫檢測(RIA)、酶聯免疫吸附檢測(ELISA)和免疫層析技術(ICT)及蛋白印跡雜交等精通本領域的人員所熟知的方法。例如，可以參見Coligan等的著作(1994，見上文所述)，其中公開了多種依照本發明可以採用的免疫檢測方法。如本領域內所能理解的或如例如下文所述的，免疫檢測方法可以包括競爭性檢測方法。需要理解的是，本發明包括定量和定性的免疫檢測方法。
合適的免疫檢測方法在例如美國專利No.4,016,043，No.4,424,279和No.4,018,653中均有描述。這些方法既包括非競爭類的單一位點和雙位點檢測方法，也包括傳統的競爭結合檢測方法。這些檢測方法也包括標記過的抗原結合分子與靶抗原的直接結合。
本發明尤其適合採用雙位點檢測方法。這些方法存在多種不同形式，所有這些形式包括在本發明範圍以內。簡單地說，在典型的正向檢測方法中，諸如未標記抗體的未標記的抗原結合分子固定在固體基質上並通過與固定的分子的接觸檢驗製品。經過合適的、足以形成抗體-抗原複合物的孵育期以後，加入另一種用能產生可檢測信號的報導分子所標記的抗原結合分子(合適的是所述抗原的特異性二抗)並共同孵育足夠長的時間，以形成另一抗體-抗原-標記抗體的複合物。洗去任何未反應的材料，通過觀察報導分子產生的信號以確定抗原的存在。通過單純觀察可見信號，該結果可以是定性結果；或通過與含已知抗原量的對照製品相比較，該結果可以是定量的結果。所述正向檢測方法的不同形式包括同步檢測方法，在這種情況下向已結合的抗體同時添加製品與標記過的抗體。這些技術手段，包括顯而易見的小變化，是精通本領域的技術人員所熟知的。依照本發明，所述製品是包括如上所述組織或體液在內的可能包含抗原的材料。
在典型的正向檢測方法中，具備針對抗原或其抗原性部分的特異一抗共價或被動地連接在固體表面。所述固體表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以是管狀、珠狀、圓盤狀或微平板狀，或任何其他適於進行免疫檢測的表面。結合過程是本領域內所熟知的，通常包括將聚合物-抗體複合物交連、共價結合或物理吸附到固體支持物上，然後進行洗滌以為測試製品作準備。需要測試製品的試樣量隨後添加到固相複合物中並在適合於任何存在的抗原與抗體結合的條件下孵育一段充分的時間。孵育期結束後，抗原-抗體複合物經洗滌、乾燥並與針對所述抗原一部分的特異性二抗孵育。二抗通常含與之相連的用於指示二抗與抗原的結合的報導分子。藉助於連接的報導分子測定的結合的標記抗體的數量與結合在固定化的一抗上的抗原數量成正比。
作為另一種選擇的方法包括固定化生物樣本中的抗原並隨後將固定化的抗原與用報導分子標記或未標記的特異抗體接觸。取決於目標數量及報導分子信號強度，結合的抗原可以通過直接標記抗體進行檢測。作為另一種選擇，針對一抗的特異性標記二抗與靶抗原-一抗複合物接觸以形成靶抗原-一抗-二抗三聯複合物。所述複合物通過報導分子激發的信號進行檢測。
從前面的敘述中需要理解的是，所述與抗原結合分子相連的報導分子可以包括以下類型(a)報導分子直接與抗原結合分子相連；(b)報導分子與抗原結合分子間接相連，也就是報導分子與另一種檢測試劑相連，後者隨後與抗原結合分子結合；和(c)與抗原結合分子隨後反應的產物相連。
報導分子可以從以下試劑中選擇，包括發色團、催化劑、酶、螢光染料、化學發光分子、諸如銪(Eu34)的稀土元素離子、放射性同位素和直接可見的標記。
在直接可見標記的情況下，可以利用膠體金屬或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、乳膠顆粒、脂質體或其他包含信號生成試劑的膜泡及其他。
美國專利說明書U.S.4,366,241，U.S.4,843,000和U.S.4,849,338中公開了大量適於用作報導分子的酶。適合用於本發明的酶包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶及其他酶。所述的酶可以單獨使用或與溶液中第二種酶組合使用。
合適的螢光染料包括但不限於異硫氰酸螢光素(FITC)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)、R-藻紅蛋白(RPE)和德克薩斯紅(Texas Red)。其他典型的螢光染料包括Dower等(國際申請WO 93/06121)論述過的螢光染料。還可以參見美國專利No.5,573,909(Singer等)和No.5,326,692(Brinkley等)中描述的螢光染料。作為另一種選擇，可以參見美國專利No.5,227,487、No.5,274,113、No.5,405,975、No.5,433,896、No.5,442,045、No.5,451,663、No.5,453,517、No.5,459,276、No.5,516,864、No.5,648,270和No.5,723,218中所描述的螢光染料。
在酶免疫檢測中，酶通常通過戊二醛或高碘酸鹽與二抗偶聯。然而，需要理解的是，對於精通本領域的技術人員而言，存在多種不同的偶聯技術可供採用。通常選擇那些被相應酶水解後產生可檢測的顏色變化的與特異的酶配合使用的底物。合適的酶的實例包括上文所述那些酶。也可以採用產生螢光產物的螢光底物而不是前面提到的產生顏色的底物。在所有情況下，向一抗-抗原複合物添加酶標抗體，隨後讓其結合，並洗去多餘的反應物。然後向抗體-抗原-抗體複合物中添加含適當底物的溶液。底物能與同二抗相連的酶發生反應，產生定性的可見信號，該信號可以進一步進行定量分析(通常用分光光度法)，以指示樣本中存在的抗原數量。
另外，諸如螢光素、羅丹明和稀土元素銪(EU34)的螢光化合物可以化學手段與抗體相連而不改變後者的結合能力。被特定波長的光通過照射而激活時，螢光染料標記的抗體吸收光能，這一過程誘導分子內可激發狀態，隨後發生特徵顏色光的發射，發射光可用光學顯微鏡進行觀測。使螢光標記抗體與一抗-抗原複合物結合，洗去未結合的反應物後，保留的三聯複合物隨後暴露於適當波長的光源下。觀測到的螢光表明待研究的抗原的存在。免疫螢光檢測法(IFMA)是本領域內通用的。然而，也可以採用其他報導分子，如放射性同位素、化學發光或生物發光分子等。
需要充分理解，存在其他檢測靶多肽(如FGF或FGFR)水平的方法，這樣的方法包括，例如，涉及檢測FGF與FGFR結合活性變化水平的方法，或採用抗FGF或抗FGFR抗原結合分子對組織、細胞或體液中的FGF或FGFR蛋白水平的免疫印跡雜交分析，或檢測其他未與樣本結合的FGF或FGFR結合伴侶的抗原結合分子數量，並將其從抗原結合分子或添加的結合伴侶的總數中扣除。
5.治療和預防應用按照本發明，可以認為拮抗FGF信號途徑的試劑是作為治療或預防包括肥胖症、肥胖相關疾病、脂肪瘤和脂肪過多症在內的過度脂肪形成的有效手段。也可以認為激活FGF信號途徑的試劑是在例如惡病質和惡病質相關疾病中增強脂肪形成的有效手段。這樣的藥物能單獨地或與合適的藥學上可接受的載體混合後以藥物組合物的形式給患者服用。
本發明中的脂肪形成調節試劑可以與能將其活性限制於特定細胞類型的生物學靶向試劑偶聯。這樣的生物學靶向試劑包括與細胞特異表面抗原發生免疫相互作用的試劑。例如，調節FGFR活性的試劑可與同諸如脂肪分化相關蛋白(ADRP)的前脂肪細胞特異蛋白發生免疫相互作用的試劑偶聯。這一免疫相互作用偶聯的存在使所述FGFR調節試劑的作用具有前脂肪細胞特異性。
取決於需要治療的具體疾病，所述藥物可以進行配方設計及全身或局部給藥。配方設計及給藥的技術可以參見最新版的《雷明頓製藥科學》(「Remington’sPharmaceutical Sciences」)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa一書。例如，適當的給藥途徑可以包括口服、直腸給藥、穿黏膜給藥或小腸給藥；不經腸道給藥，包括肌肉注射、皮下注射、脊髓注射，以及胸腔注射、直接心室注射、靜脈注射、腹膜注射、鼻內注射或眼內注射。
為了用於注射，本發明中的藥物可以配方在水溶液中，優選的是在諸如Hank溶液、林格溶液或生理鹽水緩衝液等與生理條件一致的緩衝液。為了用於穿黏膜給藥，在配方中使用了適於穿透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本領域內所知的。肌肉注射和皮下注射適於如免疫原性成分、疫苗和DNA疫苗的給藥。
通過採用藥學上可接受的、本領域內所熟知的載體，所述藥物可以容易地配方成適於口服的劑量。這樣的載體能將本發明中的化合物配方成如片劑、藥丸、膠囊、液體、膠體、糖漿、藥漿、懸浮液及其他適於被治療的患者口服攝取的用藥形式。這些載體可以選自食糖、澱粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石粉、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸鹽緩衝液、乳化劑、等壓鹽溶液和不含熱源的水。
本發明中適用的藥物組合物包括其中包含能達到預期效果的有效量的活性組分的成分。對患者的給藥劑量應當足以隨時間推移引起患者體內諸如提高或減少脂肪形成的有益反應。給藥量可以取決於治療對象包括其年齡、性別、體重和綜合健康狀況等情況。在這一點上，精確的給藥量將取決於醫師的判斷。在決定調節脂肪形成中有效給藥量時，醫師可以對FGF信號途徑組分的組織水平及肥胖程度進行評估。無論如何，精通本領域的人員能夠容易地決定本發明中藥物的合適劑量。
非經腸道給藥的藥物製劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸浮液可以製備成適當的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介包括如芝麻油的脂肪油，或如油酸乙酯或甘油三酸酯的合成的脂肪酸酯，或脂質體。水性注射懸浮液可以包含提高懸浮液粘性的試劑，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。懸浮液也可以隨意地包含合適的穩定劑或提高所述化合物溶解性的試劑以製備高濃度溶液。
用於口服的藥物製品能通過下述方式獲得活性化合物與固體賦形劑結合，任選研磨獲得的混合物，並對顆粒混合物進行處理，在需要的情況下，添加合適的助劑以獲得藥片或糖衣藥片核心。合適的賦形劑尤其是指如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇在內的糖類的填充劑；如例如玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、土豆澱粉、明膠、黃蓍膠、木質素纖維、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的纖維素製劑。在需要的情況下，可以添加諸如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或褐藻酸或其鹽類(如藻酸鈉)的分裂劑。這樣的成分可以通過任何製藥方法製備，但是所有方法包括將上述一種或多種藥物與構成一種或多種必要成分的載體相連這一步驟。一般而言，本發明的藥物組合物可以通過顯而易見的方式生產，例如，通過常規的混合、溶解、顆粒化、包裹糖衣、研末、乳化、裝入膠囊、截留(entrapping)或凍幹處理。
糖錠的核心具有合適的包衣。為此目的，可以採用濃縮的糖溶液，該溶液可以任選地含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯膠、聚乙二醇、或二氧化鈦、塗膜溶液、以及合適的有機溶劑或溶劑混合物。為識別或突出活性化合物劑量的不同組合，可以對藥片或糖錠包衣添加染料或色素。
可用於口服的藥物包括由明膠製成的推進式(push-fit)膠囊，以及由明膠和增塑劑(如丙三醇或山梨醇)製成的密封軟膠囊。推進式膠囊可以包含與填充劑(如乳糖)、粘合劑(如澱粉)、或滑潤劑(如滑石粉或硬脂酸鎂)以及可選擇添加的穩定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮在合適的液體中(諸如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二醇)。除此以外，可以添加穩定劑。
本發明中藥物的服藥形式也可以包括注入或植入專為此目的而設計的受控釋放裝置或其他形式的、改進成以此方式補充作用的值入物。例如用包括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂族醇、聚乳酸和聚乙二醇酸在內的疏水性聚合物以及某些纖維素衍生物(如羥丙基甲基纖維素)對本發明的試劑進行包被能影響該試劑的受控釋放。除此以外，採用其他的聚合物基質、脂質體或微球體可以影響受控釋放。
本發明的藥物可以藥學上可接受的平衡離子鹽的形式提供。藥學上可接受的鹽可以通過多種酸形成，這些酸包括但不限於鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等等。鹽在作為相應的非鹼性溶劑形式的水或其他質子溶劑中具有更高的溶解度。
對於本發明的方法中所採用的任何化合物而言，治療上的有效劑量最初能由細胞培養物檢測進行估計。例如，能在動物模型中設計藥物劑量，以達到將在細胞培養物中測定的IC50(例如，待測試劑濃度，在此濃度下，達到FGF或FGFR多肽活性的半最大抑制或增強)包含在內的循環濃度區間。這樣的信息能用於更精確地確定在人體中的有效劑量。
這樣的藥物的毒性及治療功效能通過常規的藥物學方法在細胞培養物或實驗動物中測定，例如，為測定LD50(導致群體中50％個體死亡的劑量)和ED50(對群體中50％個體有治療功效的劑量)。毒性與治療功效之間的劑量比稱為治療指數並能用LD50/ED50的比率來表示。優選的化合物具有大的治療指數。從這些細胞培養物檢測和動物實驗中獲得的數據可用於設計在人體中使用的劑量區間。這些化合物的劑量優選地位於包含ED50值在內的、無毒或低毒的循環濃度區間之內。取決於所採用的劑型和給藥途徑，劑量可以在此區間內變動。精確的配方設計、給藥途徑和劑量可由具體醫師考慮患者的狀況進行選擇(參見Fingl等所著的《治療的藥理學基礎》(「The Pharmacological Basis of Therapeutics」)，1975，一書第1章第1頁)。
用藥量及用藥間隔可以進行個體調節以使活性試劑的血漿水平足以維持FGF或FGFR抑制或增強效果。通常的患者全身用藥量區間為1-2000毫克/日，一般為1-250毫克/日，典型地為10-150毫克/日。按照患者體重表示，通常的用藥量區間為0.02-25毫克/公斤/日，一般為0.02-3毫克/公斤/日，典型地為0.2-1.5毫克/公斤/日。按照患者身體表面積表示，通常的用藥量區間為0.5-1200毫克/平方米/日，一般為0.5-150毫克/平方米/日，典型地為5-100毫克/平方米/日。
作為另一種選擇，可以將所述化合物進行局部而不是全身給藥，例如，通過將經常是積存或持續釋放配方的所述化合物直接注射入組織中(優選地是皮下或網膜組織)。
更進一步地，所述藥物可以靶向藥物傳輸系統的方式進行給藥，例如，以組織特異抗體包被的脂質體形式。該脂質體能被引導至該組織並被該組織選擇性攝取。
在局部給藥或選擇性攝取的情況下，所述試劑的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。
本發明還包括哺乳動物基因治療的方法。這樣的方法利用了基因治療構件，該基因治療構件包含由一條編碼FGF信號途徑組分或其生物學活性片段的核酸序列構成的經分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸與具有一個或多個指導該多核苷酸在哺乳動物中表達的調控序列的基因治療載體相連。通常，基因治療載體來源於如腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒和逆轉錄病毒等的病毒DNA序列。目前可供精通本領域的人員利用的合適的基因治療載體可以參見如Robbins等(1998)的著作。如果希望進行「反義」治療(如Fgf)，則Fgf多核苷酸的一個或多個部分可以3』→5』定位於基因治療載體中。
將基因治療構件對哺乳動物(優選地是人體)給藥可以包括通過直接口服投藥、全身性注射、或對選擇的組織或細胞投藥、或通過對分離自該哺乳動物或兼容供體的細胞投藥的間接投藥。後一種方式的實例可以是幹細胞治療，其中用含Fgf多核苷酸的載體轉染經分離的具有生長與分化潛能的幹細胞。所述幹細胞培養一段時間後再轉移到需要治療的哺乳動物。
向哺乳動物細胞或組織傳輸基因治療構件或傳輸兼容供體可以通過例如微彈法、脂質體介導的轉染(如lipofectin或lipofectamine)、電穿孔技術、磷酸鈣法或DEAE-葡聚糖介導的轉染等得以簡化。合適的傳輸方法的討論可以參見Ausubel等著作(1994-1998，上文所述)的第9章。
例如，可以將編碼FGF-1的多核苷酸導入細胞以增強該細胞促進脂肪形成的能力，相反地，可以導入諸如3』→5』寡核苷酸的Fgf-1反義序列以降低或削弱該細胞向脂肪細胞的分化。
在另一種實施方案中，作為以本領域內已知的「裸DNA」製劑形式的治療或預防製劑，可以採用編碼本發明的調節試劑的多核苷酸。例如，可將包含以可操作方式與調控多核苷酸(如啟動子、轉錄終止子、增強子等等)相連的該多核苷酸的表達載體導入動物(優選地是哺乳動物)，該載體在動物體內(優選地是在前脂肪細胞組織中)引起調節試劑的生成。
取決於預期應用與物種，將表達載體導入靶細胞或組織的步驟會有所不同，並可能包括一個或多個非病毒和病毒載體、陽離子脂質體、逆轉錄病毒、和諸如例如Mulligan，R.C.，(1993)所描述的腺病毒。例如，這樣的方法可以包括A.通過注射(Wolff等，1990)、手術植入、滴注或任何其他手段導入的表達載體的局部應用。這一方法也可以與通過注射、手術植入、滴注或其他任何手段導入的對該表達載體所編碼的蛋白敏感的細胞的局部應用結合使用，以提高這種治療方法的有效性。這一方法也可以與通過注射、手術植入、滴注或其他任何手段導入的所述蛋白活性所需的其他因子的局部應用結合使用。
B.通過DNA(Calabretta等，1993)或RNA單獨注射或其與脂質體(Zhu等，1993)、病毒衣殼或納米顆粒(Bertling等，1991)或任何其他傳輸介質組合注射的普通全身性投藥。通過多核苷酸/表達載體與靶向分子連接(所謂的「魔彈」方法採用例如抗原結合分子)，或通過注射、手術植入或其他任何手段導入的該表達載體所編碼的蛋白的活性所需的其他因子或對該蛋白敏感的細胞的局部應用，可以提高靶向性。例如，在含反義Fgf多核苷酸的脂質體的情況下，通過在脂質體膜上結合MVEC表面抗原特異的免疫相互作用試劑，可以引導脂質體到達MVEC。MVEC特異細胞表面抗原的一個實例是PECAM-1。
C.已在活體外通過轉染(例如，在磷酸鈣存在的情況下(Chen等，1987)，或在陽離子脂質體和多胺存在的情況下(Rose等，1991))、感染、注入、電穿孔(Shigekawa等，1988)或其他任何手段進行改造以提高這些細胞中所述多核苷酸表達的細胞的注射、植入或通過任何手段的導入。所述改造能由質粒、噬菌體、柯斯質粒(cosmid)、病毒(如腺病毒或逆轉錄病毒；Mulligan，1993；Miller，1992；Salmons等，1993)或其他載體、或其他如脂質體(Zhu等，1993)的改造試劑、病毒衣殼或納米顆粒(Bertling等，1991)、或任何其他的改造介質所介導。採用細胞作為基因或基因產物的傳輸工具已由Barr等(1991)及Dhawan等(1991)進行過描述。處理過的細胞能與任何營養素、生長因子、基質或其他能促進其在治療對象中存活的試劑組合導入。
為使本發明便於理解並產生實用效果，現在通過下列非限制性實施例對特別優選的實施方案進行描述。
實施例實施例1人前脂肪細胞和MVEC活組織採集、分離和培養材料與方法抗PECAM-1抗體包被的磁珠的生產按照生產商使用說明書，用經純化的小鼠抗人PECAM-1(CD31)的單克隆抗體對含共價結合的羊抗小鼠IgGl的磁珠(Dynabeads M-450)(Dynal)進行包被。由抗PECAM-1抗體包被的磁珠重懸並以30毫克/毫升的濃度滅菌保存在4℃添加了0.1％BSA的去離子磷酸緩衝鹽溶液(DPBS)中。製備好的磁珠至少在4個月中保持活性。
實驗對象從接受選擇性開腹外科手術(婦科或血管手術)的4名男性(平均年齡69歲，介與66-70歲之間；平均體重指數(BMI)27，介與26-29之間)和5名女性(平均年齡55歲，介與39-67歲之間；平均體重指數27，介與20-32之間)患者獲得了成對的網膜(O)和腹部皮下(S)脂肪組織活體切片。所有患者均沒有糖尿病或嚴重的全身性疾病，也均未服用已知能影響脂肪組織量或其新陳代謝的藥物。實驗方案得到了亞利克桑德拉公主醫院研究倫理委員會(Research Ethics Committees of the PrincessAlexandra Hospital)和昆士蘭技術大學(Queensland University of Technology)的核准。所有患者提交了書面的知情同意書。
血管間質細胞的分離參見圖2，活體切片在林格溶液中運至實驗室(運輸時間15分鐘)。前脂肪細胞和微血管內皮細胞分離自所述活體組織切片。(1)去除明顯的神經、血管和纖維組織後，仔細地切碎脂肪組織並在含3毫克/毫升II型膠原酶和1.5％BSA的消化液(25mMHEPES，5mM葡萄糖，120mM氯化鈉，50mM氯化鉀及1mM氯化鈣)中37℃溫育1小時。消化液與脂肪組織之比是4∶1。獲得的消化物通過250微米孔徑的濾網(Sigma)過濾，通過4℃下250g離心5分鐘將脂肪細胞與游離油與血管間質組分分離。(2)在含10％BSA的DPBS中重懸、洗滌並離心(600g，5分鐘，4℃)血管間質沉澱。重複該步驟並最後用DPBS單獨洗滌。(3)最終獲得的沉澱在含1mM EDTA(CSL，Brisbane)的0.25％胰蛋白酶中室溫溫育15分鐘並攪拌幾次。胰蛋白酶用含5％胎牛血清(ICN)的Hanks』平衡鹽溶液(HBSS)中和。(4)大的結締組織片段用100微米孔徑濾網(Sigma)過濾除去。(5)離心分離(600g，5分鐘，4℃)濾液，用含10％胎牛血清(FBS)、100國際單位青黴素、100微克/毫升鏈黴素、2mM L-穀氨醯胺(均購自ICN BiomedicalAustralasia)、90微克/微升肝素、30納克/毫升β-內皮細胞生長因子(β-ECGF)、0.014M HEPES、0.15％NaHCO3的內皮細胞(EC)生長培養基(M-199；ICN)重懸沉澱並接種於1％明膠包被的25cm2的細胞培養瓶中(Corning)。這一混合的細胞群體在37℃，5％CO2條件下培養3-5天。
用抗PECAM-1磁珠篩選微血管內皮細胞依然參見圖2(6)經過短期培養(大約3天)，所述細胞與0.25％胰蛋白酶/1mMEDTA孵育4-5分鐘，隨後用含5％FBS的Hank緩衝鹽溶液(HBSS)中和胰蛋白酶並離心。(7)1毫升HBSS+5％FBS重懸細胞沉澱並與50微升抗PECAM-1抗體包被的磁珠孵育(15分鐘，4℃)。(8)用HBSS+5％FBS將細胞/磁珠懸浮液體積調整為10毫升，並在室溫下用磁性顆粒收集器篩選內皮細胞3分鐘。當試管仍處於磁場中時，將洗液中未被選的細胞(前脂肪細胞)移入另一新試管中。隨後內皮細胞進一步用10毫升HBSS+5％FBS洗滌並再次用磁性顆粒收集器篩選(3分鐘)。這一洗滌/篩選過程重複5次。(9a)挑選出的細胞(內皮細胞)接種於1％明膠包被的細胞培養瓶EC生長培養基中(如上所述)。(9b)離心收集未選擇的細胞(前脂肪細胞，PA)並重懸於含100國際單位青黴素、100微克/毫升鏈黴素、2mM L-穀氨醯胺和10％FBS的1∶1的DMEM/HamF12(ICN Biomedical Australasia)(PA生長培養基)中。
內皮細胞培養物的純化依然參見圖2(10)通過用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(T/V)處理細胞培養物30-40秒，用HBSS+5％FCS溶液中和T/V，並將非貼壁的內皮細胞移至含EC生長培養基的1％明膠包被的培養瓶中，實現內皮細胞與雜質成纖維細胞分離。這樣的胰蛋白酶消化與轉移過程在培養的最初兩周中重複1或2次，直至獲得均一的內皮細胞培養物。
細胞培養細胞保持在37℃5％CO2空氣條件下培養。每2-3天更換培養基，同時細胞日常性地用胰蛋白酶/EDTA傳代。內皮細胞保持在明膠包被的培養瓶中的EC生長培養基中，而前脂肪細胞保持在未包被的細胞培養瓶中的PA生長培養基中。隨著內皮細胞數量的增加，EC生長培養基中β-ECGF的濃度由30納克/毫升降至10納克/毫升。在實驗工作中採用2到4代傳代的內皮細胞和前脂肪細胞。
其他細胞類型的培養人皮膚微血管內皮細胞系CADMEC(Cell Applications，Inc.，San Diego)(以與脂肪來源的初級內皮細胞相同的條件下培養)，以及人皮膚成纖維細胞(通過鑽取活體切片並在與人前脂肪細胞相同的條件下培養獲得)用作內皮細胞研究的相應的陽性和陰性對照。
內皮細胞特徵描述用多種的方式對獲得自脂肪組織活體切片的微血管內皮細胞(MVEC)進行了特徵描述。
形態學為觀察內皮細胞特有的鵝卵石狀形態(圖3A)，通過倒置相差顯微鏡檢查細胞培養物。
免疫螢光採用針對(馮)維勒布蘭德(氏)因子(vWF)(Clone F8/86，DAKO)和血小板內皮細胞吸附分子-1(PECAM-1；CD31)(Clone JC/70A，DAKO)的表達的特異單克隆抗體通過免疫螢光對細胞進行考察。細胞在24孔板(1％明膠包被的)的孔中生長至融合濃度。對照細胞(人皮膚微血管內皮細胞-CADMEC、人前脂肪細胞初級培養物和人皮膚成纖維細胞)平行處理。去除培養基以後，細胞在2％多聚甲醛(BDH Laboratory Supplies，England)中室溫(RT)固定2分鐘。用0.1％Triton X100(Ajax Chemicals，Australia)室溫下對細胞作滲透性處理30秒。洗滌經固定及滲透性處理的細胞並用含1％BSA的PBS(×3)封閉，隨後與所用的在PBS+1％BSA中稀釋(所有抗體按1∶100稀釋度使用)後的一抗4℃孵育4小時。為排除二抗的非特異結合產生的假陽性，所有細胞類型也用緩衝液替代一抗或用非免疫抗體(同種型對照)以相同方式處理。細胞用PBS洗滌(×3)，隨後在室溫下與1∶50稀釋於PBS+1％BSA的異硫氰酸螢光素(FITC)標記的二抗(兔抗小鼠IgG FITC；DAKO)孵育30分鐘。細胞用PBS洗滌(×2)，隨後細胞核用碘化丙啶(貯存液5毫克碘化丙啶溶於100毫升0.1M檸檬酸三鈉；工作液1份貯存液混合3份0.1MPBS)在4℃下反轉染色5分鐘。細胞用PBS再洗滌2次，隨後用含尼康TE-FM Epi-螢光附件的尼康Eclipse TE300倒置顯微鏡和尼康F70相機配合柯達MAX 400 ASA膠片對細胞進行檢測和照相。通過用單克隆抗體(CloneBBIG-E4，RD Systems，Inc)和如上所述的免疫螢光方法，還研究了在含10納克/毫升腫瘤壞死因子(TNF)α(Biosource International，USA)的生長培養基中預處理4小時的細胞中選擇素E-selectin(CD62E)的表達。結果表示在圖3中。
基因表達檢測了MVEC和CADMEC中通過NOS3基因的內皮一氧化氮合成酶(eNOS)的表達。用Tri試劑(Sigma)按照生產商的說明書從細胞中提取總RNA。用逆轉錄酶ExpandReverse Transcriptase(Roche)通過常規方法將2毫克RNA轉為cDNA。PCR在含1×PCR緩衝液、1微升cDNA、每種引物各12.5pmols、1.5mM MgCl2和0.625單位TaqDNA聚合酶的25微升的總反應體積中進行。引物序列及熱循環條件如Rockett等所述(In vitro Cell Dev Biol Anim 31473-481，1998)。PCR產物在1×TBE緩衝液中含1微克/毫升溴化乙錠的1.2％瓊脂糖膠上分離並在紫外燈下觀察並照相。採用了φX174分子量標記。
前脂肪細胞特徵描述在形態學(相差顯微鏡和細胞計數)和分化能力的基礎上進行前脂肪細胞特徵描述。分化能力通過G3PDH酶活性和甘油三酯積累進行評估。
G3PDH活性活性按照Adams等(J Clin Invest 1003149-53，1998)和Hutley等(《主要間充質細胞》第一版，(Primary Mesenchymal Cells)，Kluwer Academic 5173-87，2001)所述的進行評價。
甘油三酯積累採用細胞計數和尼羅紅檢測法評估脂積累。
細胞計數。在分化培養基中處理14天之後，每種處理中的脂質包含細胞的數量用1mm2的測微計網格(Neubauer，West Germany)以100倍放大倍數在相差顯微鏡下估算。每種處理檢測10個不同區域，細胞總數及脂質包含細胞百分數均進行了估算(未公開數據)。
尼羅紅檢測法。如以前所述(Hutley等，2001，上文)，在6孔板中培養的前脂肪細胞在磷酸緩衝鹽溶液(PBS)(pH 7.4)中洗滌3次，並在每個孔內添加150微升胰蛋白酶-EDTA。細胞在37℃下溫育10分鐘，直至細胞從培養平板上脫落。向每個孔內添加含終濃度1微克/毫升尼羅紅的PBS，細胞在室溫下進一步溫育5-7分鐘。室溫下在分光螢光光度計(Aminco Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)下以488nm激發波長/540nm發射波長檢測螢光。結果按表面積進行標準化。每一實驗重複3次。
實施例2MVEC對前脂肪細胞增殖和分化的作用為了研究血管內皮細胞來源的因子在脂肪形成中的作用，發明人檢測了體外培養中的前脂肪細胞在含有微血管內皮細胞來源的生長因子的生長培養基存在的情況下的作用。
材料與方法前脂肪細胞和MVEC的活體切片材料獲取、分離和培養方法如實施例1所述。
條件培養基的製備在1％明膠包被的細胞培養容器中生長至融合濃度的單獨的人脂肪來源微血管內皮細胞(MVEC)、人皮膚微血管內皮細胞(CADMEC)以及人皮膚成纖維細胞(HSF)分別與含10納克/毫升β-ECGF的EC生長培養基(見上文)在37℃，5％CO2下接觸48小時。隨後收集培養基，用0.22μ的低蛋白結合濾器過濾，在進一步使用前-20℃保存。在不含細胞的培養瓶中，也如上所述處理EC生長培養基+10納克/毫升β-ECGF(空白對照)。臨使用之前將每種培養基解凍並進一步向每種培養基添加5％FCS。
前脂肪細胞增殖檢測將皮下和網膜前脂肪細胞以及人皮膚成纖維細胞分別以約1×103細胞/孔的濃度(亞融合濃度)接種於96孔板含10％FCS的1∶1的DMEM/Ham F12(PA生長培養基)中並使其在37℃，5％CO2條件下貼壁生長16-20小時。隨後將培養基換成通過與融合濃度皮下或網膜MVEC、人皮膚成纖維細胞(HSF)、或不含細胞的孔(空白對照)接觸獲得的EC條件生長培養基(見上文)(每一實驗重複4次)。在單獨的實驗中，皮下(S)和網膜(0)前脂肪細胞如上所述進行接種並隨後用S MVEC、O MVEC、人皮膚EC(CADMEC)條件培養基、新鮮EC生長培養基或空白對照進行處理。48小時後，前脂肪細胞細胞數量用甲試劑比色法(Promega)評估。向每個孔添加終濃度為200微克/毫升的水溶性噻唑藍(MTS)。37℃溫育4小時後，490nm處的吸收值用Bio-Rad 3550酶標儀檢測。這一檢測方法的有效性通過兩種方法測定1)前脂肪細胞以每孔250、500、1000、2000、4000個細胞的量接種(重複4次)並檢測490nm處的吸收值；2)經檢測490nm處的吸收值後，細胞隨後用碘化丙啶染色並用螢光顯微鏡進行直接細胞計數。每孔共計數4個區域，並將這些結果與用490nm處甲試劑吸收穫得的數據進行比較。
統計學細胞個數與光密度之間的相關性通過Pearson相關係數進行評估。增殖數據通過對重複檢測的單因素方差分析進行評估。由此可運用α＝0.05的配對t檢驗對符合條件的作用進行多重比較。
結論MVEC條件培養基對前脂肪細胞增殖的作用為了確定是否MVEC分泌任何影響前脂肪細胞增殖的可溶因子，將人的前脂肪細胞用MVEC條件培養基接觸處理48小時。結果顯示與對照相比，前脂肪細胞(皮下和網膜)的增殖速率顯著提高(p＝＜0.001)。用來自皮下(S)和網膜(0)脂肪組織位點MVEC條件培養基處理的前脂肪細胞，這一結果是相似的，不過，用「S」MVEC處理的前脂肪細胞比那些用「O」MVEC處理的在增殖速率方面表現出略高一些的傾向。鑑於由人皮膚MVEC(CADMEC)誘導的增殖不如由脂肪來源的MVEC所誘導的明顯(p＝0.001)，由脂肪來源的MVEC所產生的因子對前脂肪細胞的促有絲分裂作用表現出一定的特異性。來自人皮膚成纖維細胞的條件培養基相對於空白對照不具有提高前脂肪細胞增殖的作用。通過採用已知數量的前脂肪細胞對這些研究中的增殖檢測進行了驗證，結果顯示細胞數量與490nm處的吸收值之間的線性關係(r2＝0.9)。在有限數量的實驗中，還運用直接細胞計數來驗證結果，在檢驗和實驗檢測中，細胞計數與490nm處甲試劑的吸收值呈正相關(Pearson相關係數＝0.97)。
實施例3前脂肪細胞、脂肪細胞和MVEC中FGF-1表達分析在觀察到MVEC產生FGF-1的基礎上，發明人進行實驗以檢查特異性生長因子FGF-1在前脂肪細胞體外複製與分化中的作用。結果(未公開數據)顯示，與在不含FGF-1或其他MVEC來源的因子的條件下培養的前脂肪細胞相比，在存在經純化的FGF-1條件下生長的前脂肪細胞從分離時起顯示出類似的，但不是附加的，分化潛能的提高。發明人隨後設計了實驗以確認FGF-1生成細胞的特徵並對所述細胞中FGF-1mRNA的生成進行定量分析。
材料與方法網膜及皮下組織活體切片以及前脂肪細胞的分離按照實施例1中描述的操作進行。
胞內FGF-1的螢光標記為探測胞內FGF-1，採用特異性抗FGF-1抗體(Sigma F5421)。標記的胞內FGF-1的造影通過採用共聚焦顯微方法進行。
前脂肪細胞、脂肪細胞和MVEC中FGF-1 mRNA表達的評估通過採用實時RT-PCR對FGF-1 mRNA表達進行評估。通過運用常規實驗方案(TRI試劑)從每種細胞類型中提取總RNA，並採用Superscript preamplification system試劑盒(Life Technologies)產生cDNA。隨後FGF-1的表達用TaqManTM檢測法(採用ABI Prism 7700序列檢測器(Perkin Elmer/Applied Biosystems)的建立在螢光基礎上的實時PCR技術)測定。
FGF-1蛋白表達的定量分析運用免疫印跡雜交估算每種細胞類型製品的全細胞溶解產物中FGF-1蛋白的表達量。
結論初始數據顯示，在成熟的人脂肪細胞中FGF-1的mRNA和蛋白以很低的量表達，但在前脂肪細胞中，無論是mRNA還是蛋白均未檢測到。與以前的結果相符，MVEC高水平表達FGF-1的mRNA和蛋白。
實施例4FGF-1誘導的基因表達改變的特徵描述材料與方法人的網膜前脂肪細胞取自實施選擇性開腹外科手術(婦科或血管外科)的患者的活體組織切片。沒有患者患有糖尿病或嚴重的全身性疾病，也沒有患者服用已知能影響脂肪組織量或其新陳代謝的藥物。下述實驗方案得到了亞利克桑德拉公主醫院研究倫理委員會(Research Ethics Committees of the Princess Alexandra Hospital)和昆士蘭技術大學(Queensland University of Technology)的核准。按照實施例1中所述的方法，對前脂肪細胞實行分離與接種。
前脂肪細胞在含有(+)或不含(-)人FGF-1的滅菌血清中生長48小時。隨後按照生產商說明書用微矩陣晶片比較基因表達。在掃描的微矩陣影像上用ImaGene4.1(BioDiscovery)軟體平臺鑑別斑點。數據通過GeneSpring 4.1軟體(SiliconGenetics)進行解讀。
用免疫螢光標記手段採用抗PLCγ2抗體(Santa Cruz sc-5283)通過免疫印跡雜交分析磷脂酶Cγ2(PLCγ2)蛋白的表達。
實施例5引導PLCγ2調節劑至脂肪形成組織由於PLCγ2參與體內所有組織中的大量信號途徑，為增強或拮抗脂肪形成的目的而使用能調節其活性的試劑優選地要求將調節劑靶向至前脂肪細胞。
材料與方法免疫靶向方案針對前脂肪細胞特異蛋白(脂肪分化相關蛋白，ADRP)的單克隆抗體通過常規方案獲得。簡而言之，合成來自該蛋白的肽序列並隨後用於在12周內每周2次接種5隻兔子(近交白兔品系)。期間針對導入的肽的免疫反應通過採用體外免疫細胞化學血清檢驗檢測兔血清與ADRP的反應性進行監控。12周後犧牲實驗兔，為分離和測試抗ADRP抗體變異體培養分離出的脾細胞。選擇具有最高親合常數的抗ADRP IgG抗體用於與U-73122通過碳化二亞胺醯胺化步驟將U-73122上游離的羧基基團與抗ADRP抗體上N-端殘基交連的方式偶聯。
親脂性靶向方案親脂性苯並二氮拮抗劑氟馬西尼(Flumazenil)與U-73122偶聯以促進這種磷脂酶抑制劑在脂肪組織中的積累。通過簡單的交聯反應在每個化合物上一個挑選的碳原子之間形成共價鍵的方式進行偶聯。
為測試每種偶聯的U-73122化合物的拮抗脂肪形成的能力，對每種製品的3個劑量在鏈脲佐菌素(STZ)處理產生的、出生後10日到40日的糖尿病肥胖品系大鼠中進行了測試。通過肌下注射每日兩次給藥。在整個實驗階段中，測試動物的體重指數(BMI)值每日進行測量，並對任何不良藥物反應進行監控。仔細監測氟馬西尼偶聯處理組中任何中樞神經系統不良反應。
實施例6人脂肪組織、人脂肪組織微血管內皮細胞和小鼠3T3-L1細胞中FGF-1的表達從分化的3T3-L1脂肪細胞、脂肪組織MVEC、從分離時起(超過一周)含有和不含FGF-1的網膜和皮下人前脂肪細胞以及網膜和皮下分離的人脂肪細胞製備全細胞溶解物。蛋白通過BCA定量以後，每條泳道上樣20微克總蛋白，蛋白通過SDS/PAGE分離並轉移到硝酸纖維素膜上。感興趣的蛋白通過一組抗FGF-1抗體及相應的二抗進行檢測。結合的抗體通過強化化學發光(ECL)進行檢測。
如圖4所示，在3T3-L1細胞及內皮細胞中檢測到了FGF-1，但在人前脂肪細胞或脂肪細胞中，在任何實驗條件下均未檢測到FGF-1。使用所有檢測抗體的結果是一致的，並通過FGF-1 mRNA的定量RT-PCR得到了確認(未公開數據)。
實施例7FGF-1、FGF-2和IGF-1對網膜和皮下前脂肪細胞複製和分化的作用複製分離並以500個細胞/孔濃度(亞融合濃度)將前脂肪細胞接種於96孔板含血清培養基中，培養12-18小時使其貼壁。隨後細胞在添加1納克/毫升生長因子的含血清培養基(SCM)中孵育48小時並進行MTS增殖檢測(Promega)。圖5中表示的相對於SCM對照的結果表明，作為對FGF-1和FGF-2的回應，增殖水平明顯提高。
分化在分化實驗中，分離前脂肪細胞並在內皮細胞條件培養基(EC-DMEM)或含生長因子培養基中進行2個月以內的次培養，隨後使其在6孔板上達到融合濃度。隨後，細胞在不含血清的、含0.1μM羅格列酮的化學改良分化培養基中分化。分化通過常規的G3PDH檢測法在第21天進行評定。
圖5中表示的結果顯示，在常規條件下，前脂肪細胞與生長因子或脂肪組織MVEC條件培養基接觸促進其隨後的分化。與對複製的作用一樣，FGF-1比FGF-2具有更顯著的作用，而FGF-2又比IGF-1的作用更大。
FGF-1與FGF-2組合處理的效果分離人網膜和皮下前脂肪細胞並在含有和不含FGF-1或FGF-2的SCM中進行次培養。達到融合濃度後，細胞在含有和不含FGF-1或FGF-2的常規化學改良的不含血清+羅格列酮培養基中分化。分化通過G3PDH活性進行評定。圖6中表示的結果顯示，在複製或在分化過程中，FGF-1和FGF-2中任一的存在，均能促脂肪形成。貫穿兩個過程的存在度(presence)是累加的。FGF-1具有比FGF-2更強的促脂肪形成作用。這些數據指出，FGF-1在複製和分化過程中的促脂肪形成作用是獨立的和累加的。
實施例8FGF-1在存在血清的條件下使人前脂肪細胞得以體外分化人前脂肪細胞體外分化的常規要求是必須去除血清。這與小鼠脂肪細胞細胞系(如3T3-L1)形成對比，這些細胞系在含血清培養基(SCM)中具有高分化潛能。人們推測，為人的細胞發展出的培養體系或是誘導分化所必需的因子的下調，或是促進拮抗分化因子的表達(或二者兼有)。在這些實驗中，分離了人的網膜和皮下前脂肪細胞並在存在FGF-1的條件下進行次培養。隨後細胞在添加胰島素和(1-3天)地塞米松和羅格列酮的SCM中得以分化。
圖8中表示的結果顯示在SCM中(A)次培養的前脂肪細胞中完全不存在細胞分化(如通過細胞質脂質積累所證明的)以及在SCM+FGF-1中次培養的皮下(B)和網膜(C)前脂肪細胞的顯著分化。
這是迄今首次證明人前脂肪細胞在存在血清條件下的體外分化，並為FGF-1在人脂肪形成中的中心作用提供了有說服力的證據。
實施例9
由FGF-1引起的人前脂肪細胞基因表達的微矩陣分析從分離並在SCM(對照)或SCM+FGF-1中生長至融合的人皮下前脂肪細胞中提取總RNA。製備cRNA並與晶片雜交，隨後通過Affymetrix系統進行分析。每次處理用一式兩份製品代表並進行了兩次獨立實驗。如果表達量一直(CV＜5％)提高或降低至少50％，就認為基因表達受到了FGF-1的影響。100多個基因落入每個類別，其中那些目前正在研究的在圖9中製成表格表示。
FGFR-1和FGFR-2的上調和FGFR-3的下調說明，人前脂肪細胞中FGF-1的作用可能是由FGFR-1或-2介導的。過氧化物酶體增生物活化受體γ(PPARγ)和CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)的上調指出，這些脂肪形成的關鍵轉錄調控因子介導FGF-1促脂肪形成作用。FGF-1可能促進其表達或防止其在SCM中表達能力喪失(或二者兼有)。PLCγ2的表達提高是適當的，因為它是FGFR下遊的關鍵信號分子。
實施例10由FGF-1引起的人前脂細胞PLCγ表達提高在24孔板SCM+/-FGF-1中培養人前脂肪細胞。PLCγ表達通過間接免疫螢光進行檢測。非免疫一抗和單二抗對照沒有產生螢光染色。圖10中表示的結果顯示，與在單純SCM中生長的細胞相比，在含FGF-1條件下生長至融合的人前脂肪細胞中PLCγ的表達得到了提高。這些數據也表明，PLCγ2表達在融合時-發生分化誘導的階段-極大提高。
實施例11PLCγ的抑制削弱FGF-1誘導的人脂肪形成分離人皮下前脂肪細胞並在含和不含FGF-1且含與不含PLC抑制劑U-73122(Calbiochem)的SCM中次培養。隨後使細胞達到融合併用含和不含FGF-1且含和不含U-73122的含羅格列酮的常規化學改良SFM使細胞分化。分化通過G3PDH活性進行評定。圖11中表示的結果顯示，在複製階段或分化階段，U-73122顯著削弱了FGF-1誘導的分化，並且在這兩個過程中U-73122也具有累加作用。
實施例12抗FGF-1中和抗體阻斷FGF-1誘導的人前脂肪細胞複製分離了人皮下前脂肪細胞並在含FGF-1+/-抗FGF-1抗體的SCM中培養。按前文所述方法對複製進行評估。圖12中表示的結果顯示該抗體降低複製的量效關係。這些數據支持胞外FGF-1降低策略的有效性。
實施例13抑制FGFR下遊信號傳輸對前脂細胞分化的作用分離了人前脂肪細胞並在SCM+FGF-1中次培養。分化前一周，向培養基中添加酪氨酸激酶抑制劑。隨後細胞在最初3天內在SFM+羅格列酮+FGF1+/-所述抑制劑中分化。在第15天收集細胞並通過G3PDH活性檢測分化情況。
在這些實驗中採用了以下化合物(1)PKC抑制劑Calphostin C(Cal C)；(2)MEK抑制劑PD 98059(PD)；(3)PI3-K抑制劑Ly 294002(LY)；(4)p38激酶抑制劑SB202190(SB 190)；以及(5)SB 190對照化合物SB 202474(SB 474)。
圖13中表示的結果顯示，抑制FGFR下遊信號轉導途徑對FGF-1介導的人脂肪形成具有顯著影響。PKC、PI3K以及PLCγ的抑制(如上所示)都能明顯降低分化水平。在前脂肪細胞複製階段，單獨抑制MEK和p38激酶明顯降低隨後的細胞分化。
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權利要求
1.一種調節脂肪形成的方法，其特徵在於，所述方法包括在足以調節一條FGF信號途徑的條件下將細胞與試劑接觸一段時間。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述FGF信號途徑選自FGF-1信號途徑和FGF-2信號途徑。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述試劑調節一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性，其中所述基因選自Fgf基因、Fgfr基因、Hspg基因、屬於SHC/FRS2-RAF/MAPKKK-MAPKK-MAPK途徑的基因、屬於PLCγ-PKC-Ca2+途徑的基因、屬於FGF-1核轉移途徑的基因和編碼FGF胞內結合伴侶的基因。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述細胞與調節一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性的試劑接觸，其中所述基因選自Fgf基因和與該Fgf基因屬於同一調控或生物合成途徑的基因。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述細胞是微血管內皮細胞或其前體。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述Fgf基因選自Fgf-1和Fgf-2。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，與Fgf基因屬於同一調控或生物合成途徑的基因選自P34和FIF。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述細胞與調節一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性的試劑接觸，其中所述基因選自Fgfr基因、與Fgfr基因屬於同一調控或生物合成途徑的基因、其表達受Fgf基因表達產物直接或間接調節的基因、或激活或拮抗與FGF相互作用的FGFR的功能的基因。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述Fgfr基因選自Fgfr-1、Fgfr-3和Fgfr-4。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述與Fgfr基因屬於同一調控或生物合成途徑的基因編碼一種多肽，所述多肽選自多配體蛋白聚糖-1、多配體蛋白聚糖-2、多配體蛋白聚糖-3、多配體蛋白聚糖-4、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-1、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-4、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-5、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-6、基底膜蛋白多糖、β聚糖、CFR、SHC、Crk、FRS2、Src、FAK、Nek、Shb、SHP2、GRB-2、SOS、80K-H、pp66、Gab1、P38 MAPK、PI3K、AKT、PKB、RAS、RAF、ERK1，2、MAPKKK、MAPKK、MAPK、Jun、Fos、FPPS、PLC、Fes、PIP2、DAG、Ca2+離子通道、IP3、CaM激酶、PKC、PKA、cAMP、CREB和CBP。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，其表達受Fgf基因表達產物直接或間接調節的基因選自Pparγ、Igfbp-3、Igfbp-6、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ。
12.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述與FGFR相互作用的FGF是FGF-1或FGF-2。
13.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述細胞是前脂肪細胞或其前體。
14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述試劑拮抗FGF信號途徑以降低前脂肪細胞的分化潛能和/或增殖。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述試劑降低一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性，其中所述基因選自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3和Igfbp-6。
16.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述試劑提高一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性，其中所述基因選自Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ。
17.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述試劑拮抗FGFR的功能或幹擾FGFR與FGF之間的相互作用。
18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述試劑激活FGF信號途徑以提高前脂肪細胞的分化潛能和/或增殖。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述試劑降低一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性，其中所述基因選自Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶和Pkcθ。
20.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述試劑提高一條基因的表達或該基因表達產物的水平或功能活性，其中所述基因選自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3和Igfbp-6。
21.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述試劑激活FGFR的功能，或增強、促進或以其他方式導致FGFR和FGF之間的相互作用。
22.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，相對於不存在所述試劑時的表達、水平或功能活性，所述試劑至少以10％的幅度提高或降低基因表達或表達產物的水平或功能活性。
23.一種識別調節FGF信號途徑的試劑的方法，其特徵在於，所述方法包括將一種製品與一種待測試劑接觸，其中所述製品包括(i)一條包含對應於FGF信號途徑中一個多肽組分的至少一個生物學活性片段或其變異體或衍生物的胺基酸序列的多肽；或(ii)以可操作方式與報導基因相連的一條包含至少部分調控該組分的一個遺傳序列的多核苷酸；並探測相對於不存在該待測試劑時，正常或參照水平和/或功能活性的所述多肽組分或所述報導基因表達產物的水平和/或功能活性的改變，這可說明所述試劑調節FGF信號途徑。
24.一種識別調節FGF信號途徑的試劑的方法，其特徵在於，所述方法包括將表達一種FGFR的第一細胞樣品與一種FGF接觸並檢測至少一種標記；將表達該FGFR的第二細胞樣品與該FGF及一種試劑接觸並檢測所述標記；以及將第一細胞樣品的標記與第二細胞樣品的標記進行比較。
25.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述標記選自甘油3磷酸脫氫酶、FGF途徑胞內組分及其組合。
26.一種試劑在製造用於抑制或降低脂肪形成、或用於在肥胖或脂肪形成局部異常增加疾病中控制脂肪形成的藥物中的應用，其特徵在於，所述試劑拮抗一條FGF信號途徑。
27.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑與FGF或FGFR或調節Fgf或Fgfr基因表達的遺傳序列相結合，這是通過以下方法測定的將包含FGF或FGFR多肽或其生物學活性片段、或其變異體或衍生物、或調節Fgf或Fgfr基因表達的遺傳序列的製品與所述試劑接觸；並探測FGF或FGFR多肽或其生物學活性片段、或其變異體或衍生物、或由所述遺傳序列表達的產物的水平或功能活性的降低。
28.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑拮抗一條FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將FGFR和FGF與所述試劑接觸並檢測FGFR與FGF的結合，當所述試劑降低或阻斷FGFR與FGF的結合時，該試劑測試為陽性。
29.如權利要求28所述的應用，其特徵在於，所述試劑是FGF或FGFR特異的抗原結合拮抗分子。
30.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑拮抗一條FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將FGFR及HSPG與所述試劑接觸並檢測FGFR與HSPG的結合，當所述試劑降低或阻斷FGFR與HSPG的結合時，該試劑測試為陽性。
31.如權利要求30所述的應用，其特徵在於，所述試劑是HSPG或FGFR特異的抗原結合拮抗分子。
32.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將FGF及CFR與所述試劑接觸並檢測FGF與CFR的結合，當所述試劑降低或阻斷FGFR與HSPG的結合時，該試劑測試為陽性。
33.如權利要求30所述的應用，其特徵在於，所述試劑是FGF或CFR特異的抗原結合拮抗分子。
34.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將選自前脂肪細胞或其前體的第一細胞樣品與FGF接觸並檢測細胞的分化和/或增殖；將選自脂肪細胞或其前體的第二細胞樣品與FGF及一種試劑接觸並檢測細胞的分化和/或增殖；將第一細胞樣品的分化和/或增殖與第二細胞樣品的分化和/或增殖進行比較，當所述試劑增強細胞的分化和/或增殖時，該試劑測試為陽性。
35.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述試劑通過幹擾FGF與FGFR的結合、通過幹擾FGFR的磷酸化、通過幹擾FGF/FGFR相互作用的上遊或下遊信號途徑上的組分、通過幹擾FGFR與HSPG的結合、通過幹擾FGF與CFR的結合、或通過幹擾FGFR的二聚化拮抗FGF信號途徑。在一些實施方案中，拮抗FGF信號途徑幹擾信號途徑的試劑選自TGF、IGF-1和WNT信號途徑的信號途徑。
36.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述抑制或以其他方式降低脂肪形成的試劑拮抗FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將拮抗該信號途徑的試劑對動物模型或人給藥並檢測動物對該試劑的反應，當所述試劑抑制或降低動物體內脂肪形成時，該試劑測試為陽性。
37.一種試劑在製造在惡病質或局部脂肪缺失症狀的治療或預防用於刺激脂肪形成的藥物的應用，其特徵在於，所述試劑激活FGF信號途徑。
38.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述刺激脂肪形成的試劑與FGFR或一條調節Fgfr基因表達的遺傳序列結合，這是通過以下方法測定的將包含一條FGFR多肽或其生物學活性片段、或其變異體或衍生物、或調節Fgf或Fgfr基因表達的遺傳序列的製品與所述試劑接觸；並探測所述FGFR多肽或其生物學活性片段、或變異體或衍生物、或由所述遺傳序列所表達的產物的水平或功能活性的提高。
39.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將FGFR及FGF與該試劑接觸並檢測FGFR與FGF的結合，當所述試劑刺激FGFR與FGF的相互作用時，該試劑測試為陽性。
40.如權利要求39所述的應用，其特徵在於，所述試劑是FGF或FGFR特異的抗原結合激活分子。
41.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將FGFR及HSPG與該試劑接觸並檢測FGFR與HSPG的結合，當所述試劑刺激FGFR與HSPG的相互作用時，該試劑測試為陽性。
42.如權利要求41所述的應用，其特徵在於，所述試劑是HSPG或FGFR特異的抗原結合激活分子。
43.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將FGF及CFR與該試劑接觸並檢測FGF與CFR的結合，當所述試劑刺激CFR與FGF相互作用時，該試劑測試為陽性。
44.如權利要求43所述的應用，其特徵在於，所述試劑是FGF或CFR特異的抗原結合激活分子。
45.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述增強脂肪形成的試劑激活FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將選自前脂肪細胞或其前體的第一細胞樣品與FGF接觸並檢測細胞的分化和/或增殖；將選自前脂肪細胞或其前體的第二細胞樣品與FGF及一種試劑接觸，並檢測細胞的分化和/或增殖；將第一細胞樣品的分化和/或增殖與第二細胞樣品的分化和/或增殖進行比較，當所述試劑刺激細胞的分化和/或增殖時，該試劑測試為陽性。
46.如權利要求45所述的應用，其特徵在於，所述試劑通過刺激FGF與FGFR的結合、通過刺激FGFR的磷酸化、通過刺激FGFR與HSPG的結合、通過刺激FGF與CFR的結合、通過刺激FGFR的二聚化或通過刺激FGF/FGFR相互作用的上遊或下遊信號途徑激活FGF信號途徑。
47.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述刺激脂肪形成的試劑激活FGF信號途徑，這是通過以下方法測定的將激活該信號途徑的試劑對動物模型或人給藥，並檢測動物對該試劑的反應，當所述試劑刺激動物體內脂肪形成時，該試劑測試為陽性。
48.一種製造用於在脂肪相關疾病中調節脂肪形成的試劑的方法，其特徵在於，所述方法包括測試懷疑能調節FGF信號途徑的試劑；並在其對調節的測試為陽性的基礎上合成該試劑。
49.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述方法進一步包括衍生該試劑，並任選將所述衍生的試劑與藥學上可接受的載體和/或稀釋劑配伍。
50.一種在患者中發現脂肪相關疾病或診斷脂肪相關疾病風險的方法，其特徵在於，所述方法包括在取自患者的生物製品中確定參與FGF信號途徑的異常基因或參與FGF信號途徑的基因的異常表達產物的存在，其中所述異常基因或異常表達產物與疾病的存在或風險相關。
51.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，所述異常基因選自異常Fgf基因和異常Fgfr基因。
52.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，所述異常表達產物選自異常Fgf表達產物和異常Fgfr表達產物。
53.一種用於在患者中發現與脂肪異常增生相關的疾病或診斷其風險的方法，其特徵在於，所述方法包括在取自患者的生物製品中確定參與FGF信號途徑的異常基因或參與FGF信號途徑的基因的異常表達產物的存在，其中所述異常基因或異常表達產物與所述疾病的存在或風險相關。
54.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述疾病選自肥胖和脂肪形成局部異常增加疾病。
55.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，脂肪形成局部異常增加疾病選自脂肪瘤和脂肪過多症。
56.一種用於在患者中發現與脂肪異常增生相關的疾病或診斷其風險的方法，其特徵在於，所述方法包括確定細胞中參與FGF信號途徑的基因表達產物的水平或功能活性，該水平或功能活性與該表達產物的正常參照水平或功能活性不同。
57.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述方法包括確定選自Fgfr-1、Fgfr-2、Pparγ、C/Ebpα、Plcγ2、Igfbp-3、Igfbp-6的基因表達產物水平或功能活性的提高或增強，其中所述細胞是前脂肪細胞或其前體。
58.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述方法包括測定選自Fgf-1、Fgfr-3、Igf-2、Irs-2、Pi3激酶、Pkcθ的基因的表達產物的水平或功能活性的降低，其中所述細胞是前脂肪細胞或其前體。
59.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述方法包括測定選自Fgf-1和Fgf-2的基因表達產物的水平或功能活性的提高或增強，其中所述細胞是微血管內皮細胞。
60.一種用於在肥胖或脂肪形成局部異常增加疾病中抑制或降低脂肪形成的方法，其特徵在於，所述方法包括給需要這樣治療的患者服用脂肪形成抑制有效量的降低或幹擾FGF信號途徑的試劑，以及任選的藥學上可接受的載體或稀釋劑。
61.一種治療或預防惡病質或局部脂肪缺失症狀的方法，其特徵在於，所述方法包括給需要這樣治療的患者服用增強脂肪形成有效量的刺激FGF信號途徑的試劑，以及任選的藥學上可接受的載體或稀釋劑。
62.一種調節FGF信號途徑的試劑在製備用於治療或預防脂肪相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了用於調節前脂肪細胞分化潛能和/或增殖的方法和試劑。更具體地說，本發明公開了用來調節成纖維細胞生長因子(FGF)信號途徑的，特別是FGF－1或FGF－2信號途徑，以治療或預防脂肪相關疾病的方法和試劑，所述疾病包括但不僅限於肥胖、脂肪瘤、脂肪過多症、惡病質或脂肪營養不良或創傷或萎縮性疾病中的脂肪組織缺失。
文檔編號C12Q1/68GK1678734SQ03820407
公開日2005年10月5日 申請日期2003年6月27日 優先權日2002年6月27日
發明者J·B·普林斯, L·J·赫特雷 申請人:昆士蘭大學, 昆士蘭醫學研究所委員會