提高胚胎生存力的方法

2023-05-18 00:10:01

專利名稱：提高胚胎生存力的方法
技術領域：
總體上，本發明涉及提高胚胎生存力的方法和組合物，具體地，涉及通過輔助生殖技術產生胚胎。本發明進一步涉及保護胚胎不受遺傳或後天缺陷正選擇壓力的方法。
背景技術：
胚胎在其存在的最初幾周不能存活被認為是哺乳動物低受精能力和不育的主要原因。這一點尤其在通過輔助生殖技術(ART)，包括人工受精(IVF)及所有相關技術產生的胚胎中得到例證。大部分的ART胚胎在植入前和剛植入後的時期由於細胞凋亡而死亡。
2000年在澳大利亞進行了共計27,067個ART治療周期(Hurst和Lancaster，2001，AIHW National Perinatal Statistic Unit，Sydney，ISSN1038-7234)，產生了4,319例能成活的妊娠(成功率16％)。假定在每次治療周期中平均轉移2.1個胚胎(90％以上的成功的治療周期轉移了2個或者更多個胚胎)，這相當於ART產生的胚胎中具有長期生存能力的低於10％。ART是昂貴的。在美國每個治療周期的平均費用為US$9547(Collins，2002，Human Reproduction Update.8265-77)。
人們確定ART過程中胚胎生存力的喪失多數發生在植入前階段或者剛植入之後。ART導致特徵性的胚胎發育遲緩，使得在發育程序中受精96-120小時後胚胎通常比它們天然產生的對應物晚至少一整天。每個胚胎中的細胞也較少，而且胚胎中許多細胞經歷調亡(Jurisicova等人，1996，Molecular Human Reproduction.293-8；O』Neill，1997，Biology of Reproduction.56，229-237)。在許多情況下表現型便足以導致整個胚胎的退化。這種遲緩是與培養條件有關的細胞應激物的後果。植入前的胚胎組成性地表達細胞凋亡的部件並具有細胞調亡的效應器和調控元件。胚胎的成功發育看起來要求對這種調亡部件的抑制。處理各種應激物的嘗試僅取得有限的成功。例如，胚胎氧化損傷和還原刺激之間通過自分泌和旁分泌生長/存活因子的相互作用是IVF導致胚胎死亡的重要原因。但是，減輕氧化應激並提供寬範圍的推定胚胎存活/生長因子僅部分改善了IVF的效果。這表明存在其它作用於胚胎的相關應激物，並且/或者應激物對胚胎作用的本質尚未很好地明確。
細胞生存力的喪失是限制ART成功的重要因素，人們明確需要更完整地闡明導致ART過程中細胞死亡率降低的因素，並設計提高ART胚胎生存力的適當策略。
關於體細胞對各種環境應激的反應，人們知之甚多。例如，細胞通過穩定和增加轉錄因子p53的表達而響應於多種形式的基因毒性和非基因毒性應激(例如，參見Agarwal等人，1998，Journal of BiologicalChemistry 273，1-4)。p53是在基因組正常穩定性的維持中起重要作用的細胞應激「傳感物」。p53在相互連接的細胞途徑的複雜網絡內發揮作用，細胞通過其感覺並響應於不適當的應激。其它在該網絡內發揮作用的腫瘤抑制因子包括但不限於Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
p53能夠(通過CDK抑制因子如p21的誘導)誘導周期細胞級數降低，或者(通過誘導前細胞凋亡介體如Bax、PUMA、AIF等的合成)誘導細胞凋亡。p53突變導致對細胞過程的調節喪失，並與多種癌症的發生有關。半數以上的人類癌症中發現有p53突變。現在人們相信許多成年人疾病至少部分源於胚胎和胎兒發育(包括胚胎植入前階段)過程中的約束因素。因此，對作用於胚胎的應激和對這些策略的胚胎反應的理解在使許多成年人疾病的發作降至最低的策略設計中是十分重要的。
植入前哺乳動物胚胎通常產生一批可以刺激胚胎生長並存活的營養因子(Hardy和Spanos(2002)Journal of Endocrinology 172，221-236)。ART產生的胚胎生存力降低的主要原因是這些生長因子產生的數目減少。例如，已經觀察到血小板活化因子(PAF；1-0-烷基-2-乙醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼)和胰島素樣生長因子II(IGF-II)在IVF源胚胎中產生遲緩(O』Neill等人，1987，Fertility and Sterility 47，969-975；和Stojanov等人，1999，Molecular Human Reproduction 5，116-124)。
這些觀察結果已經導致發展了一系列為體外胚胎培養基補充包括PAF在內的外源營養因子的方案(Ryan等人，1990，Journal ofReproduction and Fertility 89，309-315；O』Neill等人，1989，The Lancetii，769-772)，以致力於增加胚胎的生存力。但是，這種培養基補充的效力是有限的。澳大利亞專利申請第608530號描述了使用外源PAF或PAF類似物來增加植入率。但是，觀察到的效果不如預期的顯著。假使有正常胚胎發育中需要自分泌和旁分泌營養因子的實驗證據(O』Neill，1997，Biology of Reproduction 56，229-237)，這一臨床成果是令人驚訝的。
因此，需要提高胚胎生存力的改進方法。

發明內容
根據本發明的第一個方面，提供了一種提高胚胎生存力的方法，該方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
抑制劑可以是以下的一種或多種的抑制劑p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。在一個實施方式中抑制劑為p53抑制劑。抑制劑可以選自小分子抑制劑、核酸基抑制劑、肽基抑制劑及其任意組合。
可以將至少一種抑制劑加入到含胚胎和/或配子的培養基中作為補充。
可以將p53或p53相關途徑的兩種或多種抑制劑給藥。兩種或多種抑制劑可以是相同或不同分子的抑制劑。分子可以選自p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
根據本發明的第二個方面，提供了一種提高胚胎生存力的方法，該方法包括將至少一種p53抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
p53抑制劑可以選自小分子抑制劑、核酸基抑制劑、肽基抑制劑及其任意組合。抑制劑可以是例如p53抑制素(PFT-α)的小分子抑制劑或其衍生物或類似物。抑制劑可以是p53特異性反義分子，如p53-特異性siRNA。
在一個實施方式中，可以將兩種或多種p53抑制劑給藥。兩種或多種p53抑制劑可以是小分子抑制劑和p53特異性siRNA。
根據本發明的第三個方面，提供了一種提高胚胎生存力的方法，該方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
促生長劑可以是營養因子或其類似物或衍生物，或者是能夠激活營養因子相關的信號傳導途徑的製劑。可以通過將胚胎瞬時暴露於例如離子黴素的鈣離子通道來實現這一點。
營養因子可以選自血小板活化因子(PAF)、胰島素樣生長因子-I(EGF-I)和-II(IGF-II)、轉化生長因子-α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)、自血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一個實施方式中，營養因子是PAF或其類似物或衍生物。
在一個實施方式中，營養因子是IGF-II或其類似物或衍生物。
抑制劑可以是以下的一種或多種的抑制劑p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
根據本發明的第四個方面，提供了一種提高胚胎生存力的方法，該方法包括將至少一種p53抑制劑和至少一種促生長劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
在一個實施方式中，至少一種p53抑制劑是PFT-α，至少一種促生長劑是PAF。
在一個實施方式中，至少一種p53抑制劑是PFT-α，至少一種促生長劑是IGF-II。
在一個實施方式中，至少一種p53抑制劑是p53特異性siRNA，至少一種促生長劑是PAF。
在一個實施方式中，至少一種p53抑制劑是p53特異性siRNA，至少一種促生長劑是IGF-II。
根據本發明的第五個方面，提供了一種提高胚胎生存力的組合物，該組合物包含至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
根據本發明的第六個方面，提供了一種提高胚胎生存力的組合物，該組合物包含至少一種p53抑制劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
根據本發明的第七個方面，提供了一種提高胚胎生存力的組合物，該組合物包含至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
根據本發明的第八個方面，提供了一種提高胚胎生存力的組合物，該組合物包含至少一種p53抑制劑和至少一種促生長劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
可以將根據第五到第八個方面的組合物給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
根據本發明的第九個方面，提供了一種提高胚胎生存力的方法，該方法包括將有效量的根據第五到第八個方面中任意一個方面的組合物為胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物中的一種或多種給藥。
根據本發明的第十個方面，提供了一種卵母細胞體外受精的方法，該方法包括以下步驟(a)從雌性動物中採集至少一個卵母細胞；(b)將卵母細胞在體外與精子培育，產生至少一個胚胎；和(c)在適當的胚胎培養基中培養胚胎，其中用有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑對雌性動物、採集的卵母細胞(或多個卵母細胞)、精子、從中分離精子的雄性動物和/或培養的胚胎中的至少一種進行處理。
根據本發明的第十一個方面，提供了一種卵母細胞體外受精的方法，該方法包括以下步驟(a)從雌性動物中採集至少一個卵母細胞；(b)將卵母細胞在體外與精子培育，產生至少一個胚胎；和(c)在適當的胚胎培養基中培養胚胎，其中用有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑對雌性動物、採集的卵母細胞(或多個卵母細胞)、精子、從中分離精子的雄性動物和/或培養的胚胎中的至少一種進行處理。
第十或第十一個方面的方法可以進一步包括以下步驟(d)將胚胎轉移到雌性動物的生殖道中。
根據本發明的第十二個方面，提供了一種用作體外配子或胚胎生長培養基的組合物，該組合物包含有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑，及一種或多種適當的鹽和/或營養物。
根據本發明的第十三個方面，提供了一種用作體外配子或胚胎生長培養基的組合物，該組合物包含有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑，及一種或多種適當的鹽和/或營養物。
根據本發明的第十四個方面，提供了一種防止胚胎中細胞凋亡的方法，該方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
該方法進一步包括將有效量的至少一種促生長劑給藥。
根據本發明的第十五個方面，提供了一種提高輔助生殖技術導致的妊娠率的方法，其中該方法包括暫時抑制p53或p53相關途徑的表達或活性。
所述表達或活性的暫時抑制可以通過將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種體外培養的胚胎、分離的卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
根據本發明的第十六個方面，提供了一種提高經受體外受精的雌性動物妊娠率的方法，該方法包括以下步驟(a)從雌性動物中採集至少一個卵母細胞；(b)將卵母細胞在體外與精子培育，產生至少一個胚胎；(c)在適當的胚胎培養基中培養胚胎；和(d)將胚胎轉移到雌性動物的生殖道中，其中用有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑對雌性動物、採集的卵母細胞、精子、從中分離精子的雄性動物和/或培養的胚胎中的至少一種進行處理。
該方法可以進一步包括將有效量的至少一種促生長劑給藥。
根據本發明的第十七個方面，提供了一種提高雌性動物排卵率的方法，該方法包括將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑為雌性動物給藥。
該方法可以進一步包括將有效量的至少一種促生長劑和/或誘排卵劑給藥。
根據本發明的第十八個方面，提供了一種提高精子受精能力的方法，該方法包括將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑為雄性動物或分離的精子給藥。
該方法可以進一步包括將有效量的至少一種促生長劑給藥。
根據本發明的第十九個方面，提供了一種鑑別提高胚胎生存力的製劑的方法，該方法包括使細胞、細胞提取物或胚胎與候選製劑接觸，確認該製劑是否導致對p53或p53相關途徑組分的表達或活性的暫時抑制，從而確認製劑是否能夠提高胚胎生存力。
根據本發明的第二十個方面，提供了一種提高胚胎生存力的方法，該方法包括將有效量的至少一種經第十九個方面的方法鑑別的製劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
根據本發明的第二十一個方面，提供了一種保護胚胎不受遺傳或後天缺陷正選擇壓力的方法，該方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
根據本發明的第二十二個方面，提供了一種防止或降低發育中的胚胎中p53中失功能突變累積的方法，該方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
根據第十至第二十二個方面，所述的抑制劑可以是p53抑制劑。
根據本發明的上述方面和實施方式，典型地雌性動物是選自靈長類動物、羊、牛、犬、貓科動物、豬、馬或鼠科動物的哺乳動物。根據特定的實施方式，雌性動物是人類或牛。類似地，典型地精子、卵母細胞和胚胎是選自靈長類動物、羊、牛、犬、貓科動物、豬、馬或鼠科動物的哺乳動物胚胎。在特定的實施方式中，精子、卵母細胞和胚胎是人類的精子、卵母細胞和胚胎或者牛的精子、卵母細胞和胚胎。
定義在本說明書的上下文中，術語「包含」是指「主要包括，但並非必然僅僅包括」。而且，單詞「包含(comprising)」的各種變體，例如「包含(comprise)」和「包含(comprises)」的意思相應地變化。
在本說明書的上下文中，術語「p53相關途徑」是指任何形成與p53有關的途徑的互連網絡一部分的細胞途徑。這種途徑可以在p53下遊、p53上遊發揮作用，或者另外可以在p53活性之前、與p53活性相結合或者作為p53活性的後果而發揮作用，並且因此包括可以與p53直接相互作用、與p53間接相互作用，或者另外在p53上遊、p53下遊發揮作用或者另外可以在p53活性之前、與p53活性相結合或者作為p53活性的後果而發揮作用的組分或成員。本文中提到p53相關途徑因此包括該途徑的組分或成員。
在本說明書的上下文中，術語「p53或p53相關途徑的抑制劑」是指任何能夠抑制p53或p53相關途徑組分的表達或活性的製劑或動作。因此抑制劑可以直接或間接地作用於p53或p53基因，或者另外通過任何一種或多種p53相關途徑組分的直接或間接抑制而起作用。這種組分可以是在p53活性之前、與p53活性相結合，或者作為p53活性的後果被激活、抑制或者其它被調節的分子。因此，抑制劑可以發揮作用，以防止轉錄、翻譯、轉錄後或翻譯後加工，或者另外以任何方式通過直接或間接作用抑制p53或p53相關途徑組分的活性。抑制劑可以是，例如，核酸、肽、任何其它適當的化學化合物或分子，或者這些物質的任意組合。另外，應當理解到在直接削弱p53或p53相關途徑組分的活性時，抑制劑可以影響其它可以反過來作為分子本身調節物的細胞分子的活性。類似地，抑制劑可以影響本身經受p53或p53相關途徑組分的調節或調控的分子的活性。
在本發明的上下文中，術語「特異性」當與核酸基抑制劑有關時，如p53特異性反義分子，它是指基本上呈特異性，但是並非必然專有地是這樣。抑制劑應當表現出足夠的對所討論基因的特異性，以暫時抑制該基因的表達或活性。例如，根據本發明的反義分子的核苷酸序列可以表現出與p53編碼核苷酸低於100％的序列同源性，而且可以在保留p53特異性的同時與其它序列交叉雜交。
在本發明的上下文中，術語「活性」當與p53或p53相關途徑組分有關時，它是指任何由p53或組分通過編碼產物的核酸序列或其片段，或者通過基因產物本身或其任意片段而施加的細胞功能、作用、效應或影響。「活性」因此可以涉及p53相關途徑的p53組分對作用於其下遊的基因或基因產物的活性，術語「活性」因此可以理解為還包括依賴p53或相關途徑的表達和這些下遊基因和基因產物的活性。
本文使用的術語「表達」可以交換地指基因或基因產物的表達，其包括所編碼的蛋白。舉例來說，基因的表達可以通過測量信使RNA(mRNA)轉錄產物的水平來確定。舉例來說，多肽基因產物的表達可以通過使用與多肽結合的抗體(或多種抗體)進行的免疫測定來確定。
本文使用的術語「片段」是指編碼全長基因或蛋白的構成部分或者是其構成部分，並且具有同樣於全長分子的定性生物活性的核酸或多肽序列。
在本發明的上下文中，術語「提高胚胎的生存力」和「提高胚胎生存力」是指與沒有直接或間接地用根據本發明的製劑或組合物處理過的或者在其中暴露過的胚胎(或多個胚胎)的存活可能性相比，提高或者增加直接或間接地用這種製劑或組合物處理過的或者在其中暴露過的胚胎(或多個胚胎)的存活可能性。
在本發明的上下文中，術語「有效量」在它的含義之內包括無毒但是足以提供期望效果的製劑或抑制劑的量。所需要的精確量取決於例如被處理的物種、受試者年齡和全身狀況、給予的具體製劑或抑制劑和給藥方式等等的因素根據具體的受試者而不同。
在本發明的上下文中，術語「暫時抑制」是指抑制並非是永久性的，而是短期並且可逆的。也就是說，基因或基因產物的活性或表達並非被永久性滅活，而是表達或活性被抑制足以產生期望效果的一段時間，並且當抑制劑的效果減弱或停止時，分子可以執行它的正常細胞功能。
在本發明的上下文中，術語「促生長劑」是指營養因子或其類似物或衍生物，或者是能夠激活或刺激營養因子相關的信號傳導途徑的化合物。術語「營養因子」是指能夠刺激或促進胚胎的生長和/或發育和/或存活的生長因子，或者刺激胚胎活性增加的生長因子。營養因子可以是自分泌、旁分泌或內分泌營養因子。也就是說，營養因子可以是胚胎自身正常產生或者正常源自母體的營養因子。


現在通過實施例的方式結合附圖對本發明進行說明。
圖1 p53表達的蛋白質印跡分析。(A)稀釋到獲能培養基之後精子的p53產物。(B)從合子階段培養至標明的發育階段或者在標明的發育階段從生殖道中新鮮收集的p53+/+小鼠胚胎中的p53表達。每個印跡顯示了30個胚胎當量所表達的p53。(C)蛋白質印跡檢驗的特異性。(D)不同的胚胎發育階段和T47D細胞中p53和Lis-1表達的對比。
圖2從生殖道新鮮收集的胚胎(AD)、在生殖道內受精但是隨後在體外培養的胚胎(BE)和通過體外受精並隨後在體外培養產生的胚胎(CF)的p53+/+小鼠胚泡(A-C)和桑椹胚(D-F)中p53的免疫定位。胚胎分別在10μL培養基中培養。圖像是通過個圖像的單個共焦界面。對於所有的胚胎，染色、成像、雷射設定和圖像捕獲均在相同條件下進行。
圖3胚胎中p53被PFT-α短期抑制對(A)發育至胚泡階段的胚胎的比例和(B)每個胚泡中細胞數目的影響。將p53抑制素(PFT-α)作為培養基補充加入向通過原位受精(ISF)或體外受精(IVF)產生的合子。
圖4配子中p53被PFT-α短期抑制對(A)受精卵母細胞的比例、(B)發育至胚泡階段的胚胎的比例和(C)每個胚泡中細胞數目的影響。
圖5用p53特異性siRNA(A)或非特異性合成(對照)siRNA(B)處理之後用抗p53抗體進行胚泡染色。
圖6在授精之前用PFT-α對牛精子處理1小時對隨後形成胚泡的卵母細胞比例的影響(各條中顯示了每次處理中卵母細胞的數目)。
圖7胚胎對加入外源PAF的反應。胚胎從生殖道新鮮收集(新鮮)、在生殖道中受精並體外培養(ISF)或者體外受精並培養(IVF)。反應通過細胞內鈣濃度的振幅(A)和2-細胞胚胎反應的比例(B)測量。
圖8 PAF和PFT-α共處理對體外培養的胚胎發育的影響，其通過進行至胚泡的胚胎比例(A)和每個胚泡細胞平均數目(B)測量。胚胎用單獨的PAF、單獨的PFT-α或者PAF和PFT-α二者進行處理。對照胚胎在不存在PAF和PFT-α的條件下培養。
圖9 p53基因型對配子和胚胎生存力的影響。(A)精子基因型對ISF後受精率的影響。(B)精子基因型對IVF和ISF產生的胚胎基因型的影響。(C)雌性動物p53基因型對超數排卵後收集的卵數目的影響。
具體實施例方式
已知p53基因作為腫瘤抑制基因發揮著至關重要的作用——預計半數以上的人類癌症中發現有p53失功能突變。p53的其它功能和正常細胞和組織中的類似腫瘤抑制基因也正在越來越多地得到確認，例如作為細胞周期關卡調節子(Sherr，2004，Cell 116，235-246)。因此，p53的失活通常被視為是不希望發生的。
p53形成使細胞可以感知並響應於不適當應激的途徑互連網絡的一部分。作用於p53相關途徑的腫瘤抑制物的例子包括但不限於Rb、PTEN、P21、P27ARF和INK。
本發明部分基於發明人如下令人驚訝的發現而預測p53的表達在輔助生殖技術(ART)例如體外受精(IVF)產生的胚胎中被增量調節，而且這一增量調節與ART後胚胎生存力差有關。認識到對發育中的胚胎中p53的永久抑制是不希望發生的，發明人在此闡明，在配子或胚胎的體外培養過程中對p53加以短期抑制可以提高胚胎的生存力。例如，發育成形態正常的胚泡的胚胎比例得以增加，每個胚泡中的細胞數目增加，而且胚胎中經歷凋亡的細胞數目降低。
一方面，本發明提供了通過將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑為胚胎、卵母細胞、雌性動物、精子和雄性動物中的一種或多種給藥來提高胚胎生存力的方法。該抑制劑可以是以下的一種或多種的抑制劑p53、Rb、PTEN、P21、P27ARF和INK。根據本發明的方法可以將多於一種抑制劑或以上的一種或多種給藥。
已經顯示大量營養因子對植入前哺乳動物胚胎的生長、發育和存活有影響，許多營養因子是胚胎自身產生的(綜述於Hardy和Spanos(2002)Journal of Endocrinology 172，221-236)。這些營養因子包括但不限於血小板活化因子(PAF)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)和-II(IGF-II)、轉化生長因子-α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
研究表明，ART胚胎缺少幾種營養因子，但是外源提供這些營養因子在恢復發揮功能提高植入率和/或胚胎生存力的正常營養因子方面僅有很少的有益效果。如本文所公開，將PAF作為例子研究，當前發明人已經發現ART胚胎對外源加入營養因子的響應差是由於體外培養的胚胎響應營養刺激的能力降低。這一響應能力降低表現為響應幅度減小以及響應胚胎的比例降低。
有力的證據表明胚胎營養因子對胚胎髮揮作用的多種機制彼此高度重複(Lu等人(2003)Journal of Cell Science 15，1567-1576)，其涉及多種機制當中的phosphosphatidylinositol-3-激酶途徑，並進一步表明幾種營養因子的作用是類似的，但是並不是明顯累積的。因此可以合理地指出，並且本領域技術人員將會很容易理解，ART胚胎中觀察到的與外源PAF給藥有關的營養缺乏對於許多胚胎營養因子同樣發生，其包括IGF-I、IGF-II、TGF-α、EGF、LIF、CSF-I和GM-CSF。
如本文所公開，發明人現已闡述，ART所致胚胎中觀察到的p53增量調節有助於導致在體外向胚胎中加入外源營養因子益處有限。用p53抑制劑和營養因子處理體外培養的胚胎，導致了與單獨用營養因子或單獨用p53抑制劑處理胚胎相比，胚胎存活力大為顯著地增加。
因此，進一方面，本發明提供了通過將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑為胚胎、卵母細胞、雌性動物、精子和雄性動物中的一種或多種給藥來提高胚胎生存力的方法。在具體實施方式
中，促生長劑是營養因子，例如PAF、其類似物或衍生物，或者IGF-II、其類似物或衍生物。
p53形成使細胞(包括配子和胚胎)可以感知並響應於不適當應激的途徑互連網絡的一部分。如本文所公開，本發明的實施方式表明，中斷這一網絡的關鍵組分能夠提高配子和胚胎的生存力。儘管以下的公開內容主要集中於p53抑制，但是本領域技術人員可以很容易地認識到p53相關途徑的其它組分(包括例如Rb、PTEN、P21、P27ARF和INK)也可以被抑制以實現期望的效果。因此，本發明的方法和組合物實施方式考慮使用p53和p53相關途徑的抑制劑。
為了本發明的目的，胚胎生存力可以以若干指標反映。例如，胚胎生存力提高可以導致體外受精後胚胎植入率增加，植入前和植入後胚胎致死率降低，臨床妊娠率增加或者出生率增加。因此本發明還涉及防止胚胎中細胞凋亡或發育遲緩的方法，並涉及增加動物妊娠率的方法。
本發明特別有利於提高ART尤其是IVF後的胚胎生存力。其它適當的可以應用本發明的ART技術包括但不限於配子輸卵管內移植(GIFT)、合子輸卵管內移植(ZIFT)、胚泡移植(BT)、胞漿內精子注射(ICSI)、配子、胚胎和細胞的冷藏、胚胎的體外製備(如卵母細胞體外成熟)、胚胎活組織檢查和其它形式的胚胎顯微操作(包括通過核移植形成胚胎)和轉基因系與基因修飾系的產生。它還可應用於胚胎幹細胞系的產生。
本領域技術人員將會認識到本發明帶來的優勢並不限於ART生成的胚胎。相反，本發明的方法和組合物可以同樣用於進行處理，以提高所有胚胎的生存力，無論它們是通過ART在體外產生，還是在動物生殖道內產生。因此本發明的方法還可應用於提高其它未輔助妊娠的胚胎生存力和妊娠率。本發明的實施方式還提供了增加雌性動物排卵率的方法和增加雄性動物精子受精能力的方法。
本發明的方法和組合物不僅對人類生殖有用，而且對多種物種均有用。例如，本發明的方法和組合物可以用於在具有農業價值物種的畜牧業中，以及在出於保護目的的物種繁殖中提高胚胎生存力和妊娠。具體地，本發明在脊椎動物中獲得應用，更具體地為哺乳動物。例如，如本文所公開，本發明的方法和組合物實施方式在牛生殖中獲得應用。
而且，本發明的方法和組合物不僅可以應用於為了增加妊娠成功率而提高細胞生存力，而且還可以在所有提高細胞生存力有益的情形中獲得應用，例如胚胎幹細胞的產生、克隆胚胎的產生、胚胎嵌合體的產生、轉基因或基因修飾細胞系和器官的產生、冷藏及所有相關技術。
為了實現期望的效果，可以直接地將根據本發明實施方式的製劑和抑制劑為胚胎給藥，例如作為胚胎在其中被體外培養的培養基的補充。另外，可以在受精之前對雄性配子或雌性配子中的一個或二者進行處理。而且，本發明還考慮用本發明的組合物對雌性動物或雄性動物直接進行處理。
本文還公開了篩選和鑑別提高細胞生存力的製劑的方法，該方法包括使細胞、細胞提取物或胚胎與候選製劑接觸，確認該製劑是否導致對p53或p53相關途徑組分的表達或活性的暫時抑制，從而確認製劑是否能夠提高胚胎生存力。典型地，候選製劑是此前尚未已知能夠抑制所討論分子的表達或活性的化合物。例如，細胞可以是精子細胞、卵母細胞或者胚胎幹細胞。
p53和p53相關途徑的抑制根據本發明的實施方式，適於實現期望效果的對p53或p53相關途徑的抑制是暫時抑制。也就是說，抑制是短期並可逆的。例如，由於p53活性的重要性，p53永久抑制是不希望發生的。但是如本文所公開，在胚胎體外培養的過程中對p53的短期抑制可以增加胚胎的生存力。例如，發育成形態正常胚胎的胚胎比例得以增加，每個胚泡中的細胞數目增加，而且胚胎中經歷凋亡的細胞數目降低。
對於體外培養的胚胎和配子，用至少一種適合的抑制劑來處理優選進行胚胎或配子體外培養期間的持續時間，或者進行這段時間的一部分。本領域技術人員可以根據常規地實驗方法很容易地確定暴露於適合的抑制劑的適當時間。
對於ART產生的胚胎，至少一種抑制劑可以作為補充加入到胚胎在其體外培養，或者配子在其中被培養的培養基中。另外或額外地，可以用至少一種抑制劑對從中採集卵母細胞的雌性動物和/或從中收集精子的雄性動物進行處理。將會認識到可以使用任何適當的抑制劑濃度，適當的濃度可能取決於若干因素，其包括但不限於抑制劑作用和毒性的性質、方式，以及有關的動物物種。也就是說，例如，抑制劑的最佳濃度、輸送的最佳時間和方式可以在物種間有所不同。本領於技術人員將能夠在任何指定的情況下通過常規的實驗方法確定適當的參數。
在所有情況下，適當的濃度是足以減輕或預防p53或p53相關途徑組分對胚胎存活負面影響的濃度。作為例子，可以將抑制劑以約0.01μM至約50μM，約0.1μM至約20μM，約0.5μM至約15μM，約1μM至約10μM，或者2μM至約10μM的濃度給藥。適用於本發明的方法的精確濃度將會取決於若干因素，其包括，例如，給藥的受試者(即胚胎、分離的細胞或個體)、待處理的物種、給藥方式和給藥的抑制劑。本領域技術人員將能夠在任何指定的情況下通過常規的實驗方法確定所使用的適當濃度。
以下具體參考p53抑制劑提供了適當抑制劑的說明。但是該說明絕不應當理解為對本發明做出限定。相反，本領域技術人員將很容易地認識到，可以使用類似機制來抑制p53相關途徑和這些途徑的組分或成員以實現期望效果，並且這些抑制落入本發明的範圍之內。
p53抑制適用於本發明方法的p53抑制劑是提供可逆抑制，提供足夠長時間的抑制以防止發育中的胚胎中p53誘發的存活力喪失，並且毒性低的抑制劑。根據本發明適用的p53抑制劑可以是小分子抑制劑、核酸基抑制劑、肽基抑制劑或其任意組合物。
這種抑制劑可以直接或間接地作用於p53。例如，抑制劑可以作用於削弱或防止p53的核輸入和/或輸出，可以降低p53穩定性，或者可以阻斷若干其它作用的任意一種或多種，例如下遊作用基因的轉錄激活。例如，p53激活若干編碼凋亡前和細胞周期敗育介體的基因的轉錄，其包括，例如bax、p21/waf1、IGF-BP3和PUMA(Agarwal等人，1998，Journal of Biological Chemistry 273，1-4)。本發明涉及防止胚胎中p53引發的細胞凋亡或細胞敗育，並因此考慮抑制被p53調節的凋亡或敗育誘導因子(如上文所提到的)的轉錄或功能。
另外，適當的抑制劑可以通過它與p53調節物的相互作用或者對p53調節物的影響而對p53活性發揮其抑制作用。例如，p53活性的關鍵調節物是MDM-2(Momand等人，1992，Cell.691237-45)。MDM-2導致p53的核輸出、泛素化和降解，從而限制了它的作用。MDM-2活性的規範調節物是其通過PI3K/Akt信號傳導途徑發生的磷酸化(Ogawara等人，2002，Journal of Biological Chemistry.27721843-50)。
在本發明的一個實施方式中，p53抑制劑是小分子抑制劑。一種特別適用於本發明方法的小分子抑制劑是p53抑制素(PFT-α；2-(2-氨基-4，5，6，7-四氫苯並噻唑-3-基)-1-對甲苯基ethanone)(Komarov等人，1999，Science.2851733-1737)或其變體或衍生物。當前發明人闡明，向培養的胚胎中加入0.1至20μM的PFT-α對於增加胚胎存活具有顯著效果。
本領域技術人員將會認識到可以通過使用化學抑制劑如PFT-α以外的多種方式來實現暫時抑制。例如，還可以考慮核酸基和肽基抑制劑，而且本發明的方法可以使用若干另外的途徑實現暫時的p53抑制。
例如，本發明的實施方式可以利用反義技術通過阻斷蛋白質翻譯來抑制p53的表達。反義技術利用了核酸以互補序列成對出現這一事實。可以通過化學合成製造適當的p53特異性反義分子，或者在反義RNA的情況下，當連接在啟動子上時通過體外或體內轉錄用本領域技術人員公知的方法進行製造。若干因素可以促使改變使用根據本發明的反義結構實現的抑制水平，其包括，例如，結構設計(核苷酸序列)、所用結構的劑量、任何所用轉染製劑的劑量，以及處理的是配子、卵母細胞還是個體。
例如，可以生成典型地長度為18-30個核苷酸的反義寡核苷酸，其基本上沿其長度與p53基因核苷酸序列的某一區互補。反義寡核苷酸與其互補細胞核苷酸序列的結合可以幹擾轉錄、RNA加工、轉運、反義和/或mRNA穩定性。適當的反義寡核苷酸可以通過該領域技術人員公知的方法製備，並可以設計成靶向並結合核苷酸序列的調控區，或者結合編碼(外顯子)或非編碼(內含子)序列。典型地，反義寡核苷酸在自動合成儀上合成。適當的反義寡核苷酸可以包括為了改善其向細胞中的輸送至細胞內、其一旦進入細胞內的穩定性和/或其與適當靶底的結合而設計的修飾。例如，可以通過加入一個或多個硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵，或者在骨架中包括嗎啉(所謂的「嗎啉代」寡核苷酸)對反義寡核苷酸進行修飾。
僅僅作為例子，可以將p53特異性反義分子以約0.01nM至約200nM，約0.1nM至約100nM，約0.5nM至約50nM，約1nM至約25nM，或者約2nM至約20nM的濃度給藥。但是，本領域技術人員將會很容易地認識到，任何指定情況下均應當根據經驗確定使用任意指定反義分子的精確濃度，該濃度取決於若干因素，其包括，例如，給藥用的分子、轉染方法、所用的轉染製劑(或多種轉染製劑)(如果使用的話)、處理的受試者(即胚胎、分離的細胞、個體)和待處理的物種。本領域技術人員將能夠在任何指定的情況下通過常規的實驗方法確定所使用的適當濃度。
可以使用一種根據本領域公知方法(例如WO 99/49029和WO01/70949，再次結合其公開內容作為參考)的稱為RNA幹擾(RNAi)的適當反義技術，以根據本發明的方法和組合物抑制p53的表達。RNAi是指一種通過小幹擾RNA分子(SiRNA)破壞特定mRNA來進行選擇性轉錄後基因沉默的方式。siRNA通過雙鏈RNA的切割生成，其中一條鏈與待鈍化的信息鏈相同。雙鏈RNA分子可以合成為其中一條鏈與p53mRNA轉錄產物的特定區域相同，並直接引入。另外，可以使用相應的dsDNA，其一旦在細胞內被呈遞便轉化成dsRNA。用於RNAi的適當分子的合成方法以及實現轉錄後基因沉默的方法是本領域技術人員公知的。本領域技術人員可以基於已知的p53核苷酸序列並使用公知技術很容易地設計並生成根據本發明實施方式適用的p53特異性siRNA分子。適當的p53特異性siRNA分子也有市售，例如來自SantaCruz Biotechnology，Inc.。
通過引入能夠切割mRNA轉錄產物並從而防止野生型蛋白產生的催化反義核酸結，例如核糖核酸酶，可以實現另一種抑制p53基因表達的方式。由於兩個區域與核糖核酸酶催化位點兩側靶底的序列互補性，核糖核酸酶靶向特定序列並由其復性。特異性識別並切割p53序列的核糖核酸酶的設計和測試可以通過本領域技術人員公知的技術實現(例如Lieber和Strauss等人，1995，Molecular and Cellular Biology，15540-551，在此結合其公開內容作為參考)。
任何其它適於實現對p53或p53相關途徑暫時抑制的抑制劑均包括在本發明的範圍之內。另外，本領域技術人員將會很容易認識到，多於一種的直接/或間接抑制p53或其作用，或者p53相關途徑的方式之組合可以提供最好的益處。
營養因子本發明的實施方式提供了促生長劑的使用和給藥。典型地，這些促生長劑是營養因子。
適用於本發明方法和組合物的營養因子可以是任何能夠對配子或植入前或植入後的胚胎髮揮作用的營養因子。營養因子可以是蛋白基、多肽、肽或脂質基的營養因子或其任意組合。
營養因子可以是提取白適當來源的天然化合物，可以是具有相同結構和功能的合成或半合成化合物，或者是天然營養因子的合成類似物或模擬物。在具體的實施方式中，營養因子可以是以下的一種或多種PAF、IGF-I、IGF-II、TGF-α、EGF、LIF、CSF-I和GM-CSF，或者上述因子中的一種或多種的類似物或衍生物。在一個特定的實施方式中，促生長營養因子是PAF或其類似物或衍生物，如PAF的C2-氨甲醯基衍生物。在另一特定的實施方式中，促生長營養因子是IGF-II或其類似物或衍生物。本領域技術人員將會很容易地認識到，任何指定情況下均應當根據經驗確定使用任意指定營養因子的精確濃度，該濃度取決於若干因素，其包括，例如，給藥用的營養因子、給藥方式、處理的受試者(即胚胎、分離的細胞、個體)和待處理的物種。本領域技術人員將能夠在任何指定的情況下通過常規的實驗方法確定所使用的適當濃度。僅僅作為例子，營養因子可以是PAF。可以將PAF以約0.01nM至約50nM，約0.1nM至約20nM，約0.5nM至約15nM，約1nM至約10nM，或者約2nM至約10nM的濃度給藥。
本發明還考慮通過營養因子下遊信號傳導途徑的人工刺激來提供營養支持。例如在PAF的情況下，可以通過將胚胎瞬時暴露於例如離子黴素的鈣離子通道來刺激細胞內鈣濃度的瞬時增加。例如，可以在0.1至1μM的離子黴素濃度下暴露近似30秒。另外，由於若干營養因子通過依賴phosphosphatidylinositol-3-激酶(PI3K)的途徑起作用(Lu等人(2004)Journal of Cell Science 15，1567-1576)，本發明的實施方式中可以激活這一途徑，以作為刺激營養因子信號傳導途徑的方式。
製劑(或多種製劑)的給藥在本發明的實施方式中，當它們涉及ART產生的胚胎時，用至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑，並任選地與至少一種促生長劑一起對體外培養的胚胎進行直接處理。抑制劑和/或製劑可以作為補充加入到胚胎在其中被培養的生長培養基中。但是，本發明在其範圍之內還包括其中在其它階段加入適當抑制劑和製劑的實施方式。例如，可以用製劑從經歷ART的雌性動物中採集的卵母細胞進行處理。類似地，同樣也可以處理精子。
另外，可以直接將適當的製劑為雌性和/或雄性動物給藥。例如，動物可以嘗試自然受孕，或者經歷ART處理，例如進行IVF程序處理。另外，可以將處理給予妊娠的雌性動物。
對於其中的方法提供至少一種促生長劑和至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給藥的實施方式，可以將至少一種促生長劑和至少一種抑制劑分別給藥，或者另外地，它們可以是單個組合物的多種組分。如果分別給藥的話，給藥可以是依次或同時的。
可以根據本領域技術人員公知的方法製備根據本發明實施方式的含有適當製劑的組合物。這種組合物可以包含藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。載體、稀釋劑和佐劑在與組合物其它成分相容以及對其受體無害方面必須是「藥物可接受的」。這些組合物可以通過標準途徑給藥。通常，組合物可以通過腸胃外或口服途徑給藥。更優選通過口服途徑給藥。另外，給藥可以是局部的或陰道的，例如以軟膏、霜劑、洗劑或凝膠的形式，或者通過插入陰道栓劑的方式。
應當理解到，任何特定個體的具體劑量水平將會取決於多種因素，其包括，例如，所用具體製劑的活性、年齡、體重、全身健康、飲食、給藥時間、排洩率以及與其它處理或治療方式的結合。可以以處理醫師選擇的劑量水平和模式進行單次或多次的製劑或組合物給藥。無論如何，用於本發明的製劑或組合物應當提供足以提高胚胎生存力的製劑量。
藥物可接受載體或稀釋劑的例子有脫礦質水或蒸餾水；鹽溶液；植物油，例如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、例如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；矽油，包括聚矽氧烷，例如甲基聚矽氧烷、苯基聚矽氧烷和甲基苯基聚矽氧烷；揮發性矽氧烷；礦物油，例如液體石蠟、軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物，例如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級醇，例如乙醇或異丙醇；低級aralkanol；低級聚亞烷基二醇或低級亞烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如軟脂酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜膠；黃芪樹膠或阿拉伯樹膠；和石油凝膠。典型地，載體或多種載體形成組合物的10wt％酯99.9wt％。
本發明的組合物可以是適於腸胃外給藥的形式，或者是適於口服攝入劑型的形式(例如，如膠囊、片劑、囊片、酏劑)。
作為可注射溶液或懸浮液給藥時，無毒的腸胃外可接受稀釋劑或載體可以包含林格氏溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇和1，2-丙二醇。
一些口服適用的載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的例子包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、褐藻酸鈉、阿拉伯樹膠、黃芪樹膠、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服劑型可以含有適當的調味劑或著色劑。當以膠囊形式使用時，膠囊可以塗覆有延遲分解的化合物，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
佐劑典型地包括潤滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩衝劑。
口服給藥的固體劑型可以含有人類和獸醫藥物實踐中可接受的粘合劑、甜味劑、分解劑、稀釋劑、調味劑、塗層劑、防腐劑、潤滑劑和/或延時劑。適當的粘合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米澱粉、黃芪樹膠、褐藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。適當的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天門冬醯苯並氨酸甲酯或糖精。適當地分解劑包括玉米澱粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜耳樹膠、黃原膠、皂土、褐藻酸或瓊脂。適當的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、矽酸鈣或磷酸氫鈣。適當的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、橙子或覆盆子調味劑。適當的塗層劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯的聚合物/或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或谷蛋白。適當的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。適當的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石粉。適當的延時劑包括甘油單硬脂酸酯和甘油二硬脂酸酯。
口服給藥的液體劑型在上述製劑之外可以含有液體載體。適當的液體載體包括水、油，例如橄欖油、花生油、芝麻油、葵花油、紅花油、花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酸酯或其混合物。
口服給藥的懸浮液可以進一步包含分散劑和/或懸浮劑。適當的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、褐藻酸鈉或乙醯基醇。適當的分散劑包括卵磷脂、脂肪酸(如硬脂酸)的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯以及類似物。
口服給藥的乳液可以進一步含有一種或多種乳化劑。適當的乳化劑包括上文例證的分散劑或天然樹膠，如瓜耳樹膠、阿拉伯樹膠和黃芪樹膠。
可腸胃外給藥組合物的製備方法對於該領域技術人員來說是顯而易見的，例如，在Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，MackPublishing Company，Easton，Pa.中得到更詳細的說明，因而在此將其引入作為參考。
組合物中可以加入任何適當的表面活性劑，例如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑，如山梨糖醇酐酯或其聚氧乙烯衍生物。還可以包括懸浮劑，例如天然樹膠、纖維素衍生物或無機材料，如silicaceoussilica和其它例如羊毛脂的成分。
適於局部或陰道給藥的劑型包含活性成分連同一種或多種可接受的載體，而且任選地包含其它治療成分。適於局部或陰道給藥的劑型包括適於穿過皮膚滲透到需要處理部位的液體或半液體製劑，例如洗劑、霜劑、軟膏、糊劑或凝膠。
根據本發明的霜劑、軟膏或糊劑是用於外敷或者陰道內應用的活性成分半固體劑型。它們可以通過將單獨的或者水或非水流體中溶液或懸浮液中的極細或粉末狀形式的活性成分與油性或非油性基底混合而製成。基底可以包括烴類(如硬蠟、軟蠟或液體石蠟)、甘油、蜂蠟、金屬皂；黏膠；源自天然的油，如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸(如硬脂酸或油酸)連同醇(丙二醇或聚乙二醇)。組合物中可以加入任何適當的表面活性劑，例如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑，如山梨糖醇酐酯或其聚氧乙烯衍生物。還可以包括懸浮劑，例如天然樹膠、纖維素衍生物或無機材料，如silicaceous silica和其它例如羊毛脂的成分。
凝膠尤其適用於陰道給藥。本領域技術人員可以將凝膠設計成在將滲漏降至最小的同時提供長期接觸並促進活性成分可控持續的釋放。
還可以將組合物以脂質體的形式給藥。脂質體通常獲自磷脂或其它脂質物質，由分散在水相介質中的單層或多層水合液晶形成。可以使用任何無毒、生理可接受並且可代謝的能形成脂質體的脂質。脂質體形式的組合物可以含有穩定劑、防腐劑、賦形劑以及類似物。優選的脂質是磷脂和磷脂醯膽鹼(卵磷脂)，天然和合成的均可。脂質體的形成方法在本領域中是公知的，與此相關可以具體參考Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，第33頁起，在其結合起內容作為參考。
前體藥物也包括在本發明所用的製劑範圍之內。典型地，前體藥物是很容易在體內轉化成如本文所述本發明所需製劑的本發明製劑的功能衍生物。選擇和製備前體藥物的典型方法是本領域技術人員公知的，例如，其描述於H.Bundgaard(Ed)，Design of Prodrugs，Elsevier，1985，在此結合其公開內容作為參考。
體外培養基本發明提供了用作培養基的組合物，其中培養基包括有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑，任選地除配子或胚胎體外生長和發育所需的必要營養物和輔因子之外還包括至少一種促生長劑。
在ART過程中進行配子或胚胎的體外培育和培養可以使用一系列的適當培養基，其類型和組成對於本領域技術人員是公知的。優選地，培養基含有至少水、鹽、營養物、必需胺基酸、維生素和激素，還可以包括一種或多種生長因子。市售有一系列的培養基，例如Earle’s培養基、Ham’s F10培養基和人輸卵管液(HTF)培養基。
本發明還考慮通過本領域的公知方法在一層「飼養細胞」上進行胚胎的體外共培養。適當的共培養「飼養細胞」可以包括，例如，牛輸卵管細胞或人輸卵管上皮細胞。
失功能突變當前發明人的結果表明，ART導致對p53的增量調節，這是ART誘發的胚胎途徑的主要原因。P53導致若干細胞凋亡效應物和調節元件(包括Bax蛋白)的合成，導致胱天蛋白酶的激活和隨之發生的細胞死亡。因此，p53或p53相關途徑組分中失功能(LOF)突變的呈現可以有利於ART胚胎的存活。
因此ART可以提供p53基因或者編碼p53相關途徑組分的基因中的失功能(LOF)突變正選擇壓力，即使是在半合子的狀態下。有利於LOF突變的選擇可以導致ART產生的子代中腫瘤易感性的過量呈遞。儘管這種LOF突變的種系頻率不高，小鼠模型中觀察到的選擇壓力範圍可能導致基因頻率隨著時間而顯著轉變。應用於人類ART實踐時，LOF突變累積對於該技術的應用將會具有重大的意義。
因此，本發明提供了保護胚胎，尤其是輔助生殖技術產生的胚胎不受遺傳或後天缺陷的正選擇壓力，或者p53基因或編碼p53相關途徑組分的基因中LOF突變的正選擇壓力影響的方法。
現在參考以下具體實施例對本發明進一步更詳細地說明，具體實施例不應當理解為限定本發明的範圍。
實施例一般方法小鼠p53基因敲除小鼠由B6.129S2-Trp53tm1Tti株系(p53-/-)與C57BL/6J回交。變異株系在Massachusetts Institute of Technology的Center for Cancer Research處Dr.Tyler Jacks的實驗室中發育，現在取得許可飼養於Gore Hill Research Laboratory，Royal North Shore Hospital。通過使雜合雌性與純合雄性交配來保持株系，根據需求設定具體交配以產生p53-/-、p53+/-和p53+/+小鼠。從所有離乳仔中收集尾部組織，並使用以下引物通過PCR進行基因型擴增5』-CTT ggg Tgg AgA ggCTAT TC-3』 5』-Agg TgA gAT gAC Agg AgA TC-3』(敲除等位基因)和5』-ATA ggT Cgg Cgg TTC AT-3』 5』-CCC gAg TAT CTg gAA gACAg-3』(野生型等位基因)。
小鼠IVF通過5IU妊娠雌馬血清促性腺激素，之後48小時後為5IU人絨毛膜促性腺激素，使雌性超數排卵。hCG處理後13-15小時後收集卵母細胞並洗滌。將從證實有受精能力的雄性小鼠(14-35周齡)附睪中收集的附睪精子立即置於1ml培養基中。使精子在37℃下分散10分鐘，然後將其加入到0.1×106ml的卵母細胞中。受精在最終體積為1ml的培養基中進行。將卵母細胞和精子在37℃下5％CO2的氣氛下一起培養5小時。然後重新收回卵母細胞，用Hepes緩衝的HTF洗滌，通過原核和極體的顯微檢測，評估它們的受精狀態。將受精的卵母細胞轉移至數滴礦物油修飾的HTF培養基，並且每隔24小時評估它們的發育狀態。
實施例1小鼠胚胎中p53的表達實施例1(A)-mRNA表達使用RT-PCR比較新鮮p53+/+小鼠胚胎(在生殖道中受精並生長的胚胎)和IVF小鼠胚胎中p53mRNA的表達。ForIVF胚胎，模型使用了IVF和生長因子剝奪漸增條件下的培養物誘發的梯度範圍應激。引物設計成5』-GGA GTC TTC CAG TGT GAT GAT，3』-GGG ACA GCCAAG TCT GTT ATG，其成功地產生了大小(429個鹼基對)和序列(SUPAMAC)正確的p53基因的RT-PCR產物。混合多組5個胚胎、卵母細胞或精子。提取mRNA並進行RT-PCR擴增。
檢測從生殖道中而不是從附睪精子中收集的卵母細胞、合子、8-細胞、桑椹胚和胚泡階段的小鼠胚胎中的p53產物。2細胞胚胎中，檢測是不定的。在轉錄抑制劑α-鵝膏毒環肽中培育合子對p53RNA在合子中的定性表達沒有影響，但是在α-鵝膏毒環肽中培育2-細胞胚胎在24小時後生成p53mRNA陰性的胚胎(通常為8-細胞階段)。這一結果表明，合子和早期胚胎中的p53mRNA是配子(可能主要為卵母細胞)的產物，但是其在2-細胞階段後的連續性表達則需要從合子基因組進行新的轉錄。進行p53的定量RT-PCR，以比較新鮮胚胎和IVF胚胎中p53mRNA的表達。新鮮胚胎的卵母細胞、合子、桑椹胚和胚泡中發現了等水平的RNA；晚期2-細胞胚胎比其它發育階段(數據未顯示)中的水平低50-70％。新鮮胚胎和IVF胚胎中觀察到類似的mRNA表達模式。
實施例1(B)-蛋白表達使用F1(C57BL/6j X CBA/J)、C57BI6j和p53-/-胚胎或精子考查p53蛋白表達水平。使用T47D乳腺細胞系作為陽性對照進行p53的檢測。通過i.p.注射10IU妊娠雌馬血清促性腺激素(Folligon，IntervetInternational，Boxmeer，荷蘭)，之後48小時後注射10IU人絨毛膜促性腺激素(hCG，Chorulon，Intervet)，使4至8周齡的雌性超數排卵。雌性或者未交配，或者與證實有受精能力的雄性配對。通過次日清晨陰道塞的存在確定妊娠第一天。
樣品收集通過頸椎脫臼殺死小鼠。用Hepes緩衝的含3mg BSA/mol的人輸卵管液培養基(Hepes-HTF-101.6mM NaCl、4.69mM KCl、0.2mMMgSO4、0.37mM KH2PO4、21.4mM乳酸鈉、2.78mM葡萄糖、2.04mMCaCl2、5mM NaHCO3、0.33mM丙酮酸鈉和21mM Hepes pH7.4)將丘物質(Cumulus masses)或胚胎從生殖道中衝出。所有的培養基成分均為組織培養級別，來自Sigma(St.Louis，MO)，除非另外指出，均含有3mg BSA組分V/ml(CSL Ltd，Melbourne，Vic，澳大利亞)。合子在hCG後20-21小時收集，並通過在Hepes-HTF中簡單暴露於300IU透明質酸酶(Sigma)，使其不含丘細胞。分別在48小時、72小時和96小時的時候從生殖道中收集胚胎、桑椹胚和胚泡。
從證實有受精能力的雌性小鼠(10-15周齡)附睪中收集小鼠精子，並立刻將其置於1ml培養基中(HTF培養基)。。使精子在37℃下分散10分鐘。通過血細胞計(haemocytometer)評估精子的濃度和活力，在含3mg/ml清蛋白的HTF培養基中將精子懸浮液稀釋至0.5×106/ml。將精子培育1、2、3或4小時，然後通過離心收集。
蛋白質印跡分析收集胚胎或精子，以冷PBS洗滌3次，在最大體積為1.5ul的PBS中轉移至1.5μl的2X提取緩衝液(2X PBS、2％ Triton X-100、24mM脫氧膽酸、0.2％十二烷基硫酸鈉、20mM NaF、20mM Na4P2O7、2mMPMSF、3.08μM抑肽酶、42μM亮肽素和2.91μM胃蛋白酶抑制劑)中。通過三次在液氮中冷凍和解凍(具渦流)的循環將細胞溶解。將蛋白樣品用1ul 5X Laemmli buffer(50mM Tris-HCl、5mM EDTA pH8.0、12.5％十二烷基硫酸鈉、0.05％溴酚藍和25％β-巰基乙醇)稀釋，在60℃下保溫10分鐘，使用PhastSystem儀器分離和控制單元(Pharmacia)在20％的均質SDS聚丙烯醯胺凝膠(Pharmacia；瑞典)上進行凝膠電泳。在半乾印跡裝置中使用轉移緩衝液(12mM Tris PH7.0，96mM甘氨酸和20％甲醇)將蛋白在PVDF膜(Hybond-P，Amersham Pharmacia)中印跡過夜。非特異性結合在室溫下被補充有0.05％吐溫-20的PBS(PBST)中5％的脫脂乳阻斷1小時。在4℃下將膜在2.5％的脫脂乳中用1∶5000稀釋的單克隆抗LIS-1抗體標記過夜，並用結合辣根過氧化物酶(Jackson ImmuneResearch Laboratories，West Grove，PA，美國)的第二抗體檢測。在室溫下將膜用Femto SuperSignal ChemiluminescentSubstrate(Pierce，Rockford，IL，美國)顯影5分鐘。
圖1清楚地說明當精子在獲能培養基中培育時p53的表達隨時間而增加。類似地，圖1B說明胚胎中的p53表達至少在從1-細胞胚胎到胚泡過程中隨著胚胎的發育而增加，體外培養的胚胎中p53表達高於從生殖道中新鮮收集的胚胎。
圖1C和1D確認了檢驗的特異性。來自p53-/-胚胎的胚泡中沒有檢測到p53表達，而在來自p53+/+胚胎的胚泡中很容易便檢測到p53蛋白(圖1C)。而且，圖1D確認體外培養後觀察到的p53表達增加並不是胚胎中蛋白表達模式完全改變的後果，組成性表達的蛋白LIS-1的表達得以保持證實了這一點。
實施例2p53在小鼠胚胎中的免疫定位使用免疫螢光研究植入前小鼠胚胎中的p53表達模式。
將胚胎洗滌3次(洗滌培養基含0.1％ BSA、0.1％吐溫-20的PBS)，並在室溫下在PBS PH7.4中用新鮮的2％多聚甲醛(Sigma)固定1小時。將胚胎在室溫下在含2％BSA、0.2％吐溫-20和0.2％Triton X-100的PBS中滲透30分鐘，在2％BSA和30％阻斷血清中阻斷1-3小時。在4℃下將p53抗原在含2％BSA的PBS中用2μg抗-p53綿羊多克隆抗體/ml(Oncogene Research Porducts(PC35)或家兔多克隆抗-Bax(Santa-Cruz Biothechnology，N-20)染色過夜，然後在室溫下用5μg結合家兔抗-綿羊FITC的抗體/ml染色1小時(綠色信道)。對照為2μg代替第一抗體的非免疫IgG/ml。使用採用Nikon PlanApo 60X/1.40油浸物鏡的BioRad Radiance共焦顯微鏡(Australian KeyCentre for Microscopy and Microanalysis，University of Sydney)觀察免疫螢光圖像。使用LaserSharp 20004.0版(build 365)軟體捕獲圖像。將顯微鏡和雷射設定調節成非免疫對照觀察不到螢光。用這些設定和相同設定觀察所有測試樣品。使用NIH圖像軟體進行染色定量分析。為使整個胚胎呈現使用顯微鏡z-切片工具進行1μM切片。
從生殖道中新鮮收集的植入前小鼠胚胎(新鮮胚胎)中(圖2A和2D)可免疫檢測的p53蛋白的表達(圖2)很低。通過IVF產生並單獨在10μl培養基(圖2C和2F)中培養的胚胎或者在生殖道中受精，然後一組10個在10μl培養基中體外培養的胚胎(圖2B和2E)顯示了不同的p53表達模式。新鮮胚胎中桑椹胚至胚泡階段可免疫檢測的p53極少，沒有證據表明胚胎細胞核內有蛋白積聚。8-細胞階段之前p53中僅有中等差異，但是之後的各個階段表達大為增加。從8-細胞階段後，許多IVF細胞顯示出主要染色模式的核染色，胞質染色相對較少。這一蛋白表達模式與ART後胚胎病的模式有關，與8-細胞階段後發生的多數胚胎喪失有關。
對蛋白表達(實施例1B和2)而不是mRNA水平(實施例1A)的調節表明p53調節處於轉錄後水平。
實施例3具有p53失功能突變的胚胎的生存力高水平p53表達和ART後的胚胎生存力差(實施例1B和2)之間的關聯表明p53是胚胎對細胞應激響應的主要效應物。如本文所公開，這一假設被具有p53失功能(LOF)突變的胚胎生存力得以提高的觀察結果證實。p53+/-X p53+/-或者p53+/+X p53+/+親體的交配通過IVF進行，生成的合子培養96小時。與野生型雜交產生的胚胎相比，p53+/-X p53+/-雜交產生的胚胎中有更多的比例達到胚泡階段(75％與57％)，胚胎具有更多的細胞(P＜0.01)，而且凋亡細胞更少(P＜0.001)。p53+/-X p53+/-雜交還導致了發育顯著遲緩或顯示出片段形態退化的胚胎數目降低(5％與19％)，培養96小時後從其透明帶中孵化的p53-/-胚胎(36％)是p53+/+胚胎(11％)的3倍。
p53+/-X p53+/-雜交的合子在體外培養96小時後，選擇形態正常的胚泡進行轉移。比起p53+/+Xp53+/+雜交的胚胎，妊娠率顯著更高，而且存活胎兒的比例更高。+/+；+/-和-/-基因型分別觀察到每個轉移胚胎4.7％；9.9％；和60.0％的胎兒存活率。由於相同的親本系的自然交配導致正常的孟德爾初生分離(Mendelian segregation at birth)，這一基因型的高度顯著偏移並非小鼠株系的正常性質。當從生殖道新鮮收集+/+胚胎並立刻轉移至假孕待孕母親時，胎兒存活率為57％。因此p53基因的缺乏看起來補償了ART的不良影響，並因此導致胎兒存活率增加。
實施例4p53抑制和胚胎生存力p53具有多種重要的細胞功能，因此對它進行永久抑制作為提高胚胎生存力的方法是不希望發生的。上述結果表明，生殖道內胚胎中的p53正常表達是非常低的，因此可以預計如果抑制是短期的，將不會有不良影響，而且可以提高胚胎生存力。
使用兩種不同類型的p53抑制劑——小分子抑制劑(實施例4A)和其為p53特異性siRNA分子的核酸基抑制劑(實施例4B)驗證這一假說。
實施例4(A)-小分子抑制劑一種最近發展的選擇性p53抑制劑p53抑制素(PFTα[2-(2-氨基-4，5，6，7-四氫苯並噻唑-3-基)-1-對甲苯基ethanone]，Sigma-Aldrich)是可逆地阻斷依賴p53的轉錄激活和細胞凋亡的小分子(Komarov等人，1999，Science.2851733-1737)。最初通過在二甲亞碸中溶解至10mM的濃度，然後稀釋至工作濃度製備PFT-α。
(i)用PFT-α處理胚胎通過體外受精(IVF)或原位受精(ISF)產生合子，並分別以10μl滴在修飾的HTFM培養基中培養96小時。以0.1-20μM的劑量範圍加入PFT-α作為培養基補充。評價發育至胚泡階段的胚胎比例(圖3A)、每個正常胚泡的細胞數目和經歷凋亡的細胞比例(圖3B)。
結果顯示，PFT-α導致了對IVF胚胎發育至胚泡階段比例的顯著二次效應，而且ISF和IVF二者在每個正常胚泡的細胞數目上均有顯著增加，在經歷凋亡的細胞數目上均有顯著降低。這一顯著增加的胚胎和細胞的存活在臨床上是相關的。
(ii)用PFT-α處理配子體外製備精子進行受精導致p53合成的增加(見實施例1B；圖1A)。而且，通過IVF產生胚胎導致生成的胚胎中p53合成顯著增加(實施例1B；圖1B)。設計本實驗，以確定在體外受精過程中對精子和卵母細胞進行處理是否導致它們的受精率及隨後所生成胚胎的發育改善。
之前說明了PFT-α製備、IVF和胚胎培養。該研究使用F1C57BI6jx CBAj)雄性和雌性。在其獲能過程中及體外受精過程中向精子中加入PFT-α。
向卵母細胞加入精子4-5小時後，將卵母細胞洗去精子和PFT-α。考查它們存在2個原核，作為成功受精的證據。將成功受精的卵母細胞置於10μl修飾HTF培養基中培養，每10μL滴中1個合子。將它們培養120小時，記錄形成形態正常的胚泡的比例。將胚泡固定在2％多聚甲醛中，並用5G Hoechst染劑/ml染色。染色對核進行標記，用於對每一胚泡進行細胞計數。
記錄PFT-α劑量對受精卵母細胞的比例、發育成形態學胚泡的合子比例和每個胚泡中的細胞數目的影響，其分別示於圖4A、B和C。使用SPSS統計程序包評價PFT-α劑量的影響。使用二元對數回歸分析(binary logistic regression analysis)評價受精率和發育率，同時使用一般線性模型評價通過單變量分析評價細胞數目。
圖4A表明在存在PFT-α的情況下受精率有依賴劑量的增加(P＜0.01)。在受精的卵母細胞中，發育至胚泡階段的合子比例有進一步依賴劑量的增加(圖4B)(P＜0.05)。在發育至胚泡階段的胚胎中，每個胚胎中存在的細胞平均數目有依賴劑量的顯著增加(P＜0.05，圖4C)。
結果說明，在受精之前或受精過程中進行降低配子中p53表達的處理導致了受精的改善和隨後胚胎發育的改善。
實施例4(B)siRNA抑制作為使用小分子抑制劑暫時抑制p53的替代方法，研究了用p53特異性siRNA對細胞進行瞬時處理抑制p53表達的能力。使用設計成針對小鼠p53的siRNA或者對照的無義siRNA序列的寡核苷酸，二者均獲自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。用含3mg聚乙烯吡咯烷酮/mlPVP(Sigma)的siMHTF培養基(102mM NaCl、4.6mM KCl、0.20mMMgSO4、0.4mM KH2PO4、21.4mM乳酸鈉、1mM穀氨醯胺、0.33mM丙酮酸鈉、2.78mM葡萄糖、2.0mM CaCl2、25mM NaHCO3，pH7.35；285mOsm/l)將siRNA寡核苷酸製備為90nM。所有培養基均用0.1μm的濾器滅菌。然後在存在25％(v/v)oligofectamine(Invitrogen)的情況下用siRNA分子轉染細胞。在siMHTF中製備oligofectamine，輕輕混合，在室溫下保溫5-10分鐘。向3μl 25％ oligofectamine中加入17ul siRNA，輕輕混合，並在室溫下保溫15-20分鐘。然後將其用siMHTF稀釋至100μL，得到的最終寡核苷酸濃度為15nM。
從F1(C57BL6x CBA/i)小鼠中收集胚胎。用PMSG和HCG(5I.U.)使雌性超數排卵。交配10小時後收集合子，在37℃下在5％CO2的氣氛中在modHTF培養基加青黴素和酚紅(pH7.35；285mOsm/l)中培養96小時。
在37℃下在5％CO2的氣氛中將胚胎用p53siRNA或對照siRNA培育。然後徹底清洗胚胎，將其置於傳統培養物中，分析所生成胚胎的發育和p53表達。
將胚胎洗滌3次(洗滌培養基含0.1％PBS、0.1％吐溫-20和0.2％疊氮化鈉的PBS)，並在室溫下在PBS PH 7.4中用新鮮的2％多聚甲醛(Sigma)固定1小時，進行p53染色。在室溫下將胚胎在含2％BSA、0.3％吐溫-20的PBS中在存在2％多聚甲醛的情況下滲透30分鐘，洗滌之後在2％BSA和30％山羊血清(Sigma)中阻斷1-3小時。在4℃下將p53抗原在含2％BSA的PBS中用新製備的1∶50綿羊多克隆抗人類p53抗體(Oncogene Research Porducts)染色過夜，然後在室溫下用結合抗-綿羊FITC的抗體(Sigma)染色1小時。染色在Nikon表面螢光顯微鏡下可見。
圖5顯示，即使對發育中的胚胎單次應用p53 siRNA也會導致對p53表達的顯著減量調節，以及它的主要作用部位核中p53染色的喪失。
用p53 siRNA或對照siRNA處理合子4小時後，在標準條件下體外培養之後，在生成的胚泡中觀察到更少的p53染色。而且，用p53siRNA處理生成的胚泡每個胚胎中的細胞數目顯著更多——平均增加12.5％(P＜0.05)(數據未顯示)。使用oligofectamine或對照siRNA對於胚胎發育至胚泡階段沒有有害影響。
這些結果表明通過PFT-α或者基因缺失以外的方式抑制p53表達活性也能夠改善胚胎發育。
實施例5用PFT-α處理牛精子對胚胎生存力的影響實施例4論述了p53暫時抑制對小鼠胚胎生存力的有利影響。如下文所述，接下來進行實驗以研究用PFT-α處理牛精子對牛胚胎生存力的影響。
所有的胚胎操作在39℃下進行，除了卵母細胞的收穫和激活是在室溫下進行。除非另外指出，所有的過程均在4-孔Nunc板中在補充有HEPES(TCM-H TCM-199；GibcoTMBRL/Life Technologies，Melbourne，Victoria，澳大利亞)且無礦物油覆蓋的組織培養基199(TCM-199)中進行。
從2個不同的當地屠宰場收集牛卵巢，在30-35℃下運輸至實驗室，以39℃的生理鹽水(0.9％ NaCl；Baxter Healthcare Pty.，Ltd.，NSW，澳大利亞)洗滌。
使用18-gauge針抽吸卵巢腔卵泡，並收集至含30IU ml-1肝素(Pharmacia Upjohn Pty，Ltd.，，Perth，WA，澳大利亞)和2％γ-輻射胎兒牛血清(FBS；JRH Bioscience Pty，Ltd.，Melbourne，Victoria，澳大利亞)的TCM-H中。從卵泡液中收集表現出均勻胞質並且被至少3層緊密的丘細胞圍繞的丘卵母細胞複合體(COC)。COC分50組在600μL補充有5μg ml-1LH(Lutropin-V，Bioniche Animal Health，A/Asia Pty.Ltd.，Armidale，Victoria，澳大利亞)、1μg ml-1β-雌二醇、100IU/100μgml-1青黴素/鏈黴素和10％ FBS的TCM-199(GibcoTMBRL/LifeTechnologies，Melbourne，Victoria，澳大利亞)中在39℃下在空氣中5％CO2的氣氛中在無油層的情況下培育和成熟18-22小時。
將取自原種公牛的冷凍/解凍精液梯度放置於珀可上，並在600xg下離心20分鐘。除去頂層，測定沉澱的精子濃度和活力。以0.3至3μM之間的濃度向精子製劑種加入PFT-α製劑，培育1小時。然後在39℃下在5％CO2的氣氛中向補充有肝素(0.5mg ml-1)、亞牛磺酸(1.65μgml-1)、腎上腺素(0.27μg ml-1)和青黴素(4.5μg ml-1)的Bovine VitroFert(CookAustralia，Brisbane，QLD，澳大利亞)培養基中的COC(1×106精子ml-1)中加入精子24小時。
24小時的精子-卵共培育之後，通過在15ml離心管(Becton-Dickinson Labware，NJ，USA)中渦流90秒，從假定的合子中除去丘細胞。在轉移至含Bovine Vitro Cleave(CookAustralia)的4-孔Nunc板(NuncTM，Roskilde，丹麥)中之前，在5％O2；5％CO2和90％N2的氣氛中將裸露的胚胎在補充有5％FBS的TCM-H中洗滌5天。第5天將胚胎轉移至補充有4％活性炭處理過的牛血清、4％從含成纖維細胞生長因子-4(FGF-4)的胚胎癌細胞獲得的上清液和20μgml-1肝素的Bovine Vitro Cleave(CookAustralia)培養基中。
體外成熟和受精在2個不同的地方使用不同的卵母細胞源由不同的操作人員進行。
第7天測定胚泡的比例(第0天＝受精)。結果如圖6所示。結果表明，與對照相比，精子的PFT-α處理對生成的胚胎發育成形態學胚泡的比例有顯著的正面效果。該效果的發生不依賴於過程地點和操作人員。這些結果與用p53抑制劑處理小鼠胚胎得到的結果一致，從而表明了本發明的方法和組合物的廣泛應用性。
實施例6ART降低胚胎響應PAF的能力哺乳動物胚胎表達PAF受體，該受體的激活則引起胚胎細胞內鈣濃度的瞬時增加(Emerson等人，2000，Journal of Biological Chemistry275，21905-21913；Lu等人，2003，Biology of Reproduction 69，106-116)。
將小鼠胚胎與外源PAF一起培育，測定細胞內Ca2+濃度，如Emerson等人(2000)所述。所測的胚胎為(i)在生殖道中受精並從生殖道中新鮮收集的胚胎(新鮮)；(ii)通過IVF和體外培養產生的胚胎(IVF)；和(iii)在生殖道中受精並體外培養的胚胎(ISF)。圖7說明，與新鮮和ISF胚胎相比，2-細胞IVF胚胎響應於外源加入PAF的比例大大減少。這一信號傳導降低與胚胎體外發育差相關。
實施例7胚胎與PAF和PFT-α在體外共培養為了驗證p53的增量調節可能是提供外源營養因子實現的益處有限的原因這一假設，進行如下處理後監控體外培養的小鼠胚胎的發育(i)通過合成的小分子p53抑制劑PFT-α來抑制p53；(ii)將細胞暴露於外源PAF；或(iii)(i)和(ii)的組合。PFT-α的製備如上文所述。PAF(1-o-十六基/十八基-2-乙醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼；PAF十六基和十八基同種型的近似等摩爾混合物，Sigma Chemical Company)作為氯仿中10mg/ml的儲備溶液在-20℃下保存。將數等份置於無菌矽化玻璃管中，並在N2下乾燥。加入含3mg BSA/ml的修飾HTF將PAF溶解，之後劇烈渦流3分鐘，然後在37℃下輕輕混合1小時。然後通過以修飾HTF連續稀釋達到期望的PAF濃度。
通過5IU妊娠雌馬血清促性腺激素，之後48小時後通過5IU人絨毛膜促性腺激素，使雌性超數排卵。將它們與成熟雄性一起放置過夜。妊娠第一天在～1300h採集合子。合子分別以10μl滴在修飾HTFM培養基中培養96小時。在含0、10nM PAF、10μM PFT-α或PAF+PFT-α的培養基中評測胚胎發育成形態正常胚泡的比例、每個胚泡中的細胞數目和每個胚泡中凋亡細胞的數目。
如圖8所示，使用PFT-α和PAF單獨處理均導致細胞生存力增加，如通過成功發育至胚泡階段的胚胎比例所評測，而與單獨處理相比，PFT-α和PAF結合處理則導致發育顯著的進一步改善(P＜0.05)。每個胚胎中存在的細胞數目也觀察到這一效應，結合處理比單獨處理具有顯著更多的細胞(P＜0.05)。
實施例8與IGF-II和PFT-α結合處理對體外胚胎發育的影響早期胚胎的正常發育需要自分泌和旁分泌(可能和內分泌)營養因子的作用。這些因子發揮作用以誘導胚胎的正常存活和增殖，並降低細胞周期敗育和凋亡的發生率。
自分泌營養因子的一個例子是PAF，如上文實施例6中所述，胚胎的體外培養包括胚胎響應PAF的能力。還有許多其它潛在的營養因子，其例子包括胰島素樣生長因子-I(IGF-I)和-II(IGF-II)、轉化生長因子-α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。當前發明人之前已經顯示，IGF-I和IGF-II被早期胚胎的表達由於IVF和培養而受到損害(Stojanov等人，1999，Molecular Human Reproduction5116-124；Stojanov和O』Neil，2001，Biology of Reproduction 64696-705)。將IGF-I和IGF-II在體外應用於胚胎對細胞發育有著有益的影響(O』Neil，1997，Biology of Reproduction 56229-237)。
如實施例7中所述，當PAF處理與PFT-α相結合時，對發育中的胚胎具有加和的益處。由於有許多營養因子作用於胚胎，發明人考查了營養因子和p53抑制之間的加和益處是否是普遍的原理。因此，在同時存在或者不存在PFT-α的情況下分析IGF-II對胚胎發育的影響。
所用的IGF-II是人重組胰島素樣生長因子-II(在大腸桿菌中表達)(Sigma Chemical Co.)，用最小體積為0.1M的乙酸進行重組，並立刻用修飾HTF稀釋至50μg/ml的濃度。將各等份在-70℃下冷凍。一經解凍，用修飾HTF連續稀釋各個等份。
如上文所述製備並培養從F1雜交通過IVF產生的合子，每10μl滴的培養基1個胚胎。合子分別以10μl滴在修飾的HTFM培養基中培養96小時。在含10ng/ml IGF-II、1μM PFT-α或IGF-II+PFT-α的培養基中評測胚胎發育成形態正常胚泡的比例、每個胚泡中的細胞數目和每個胚泡中凋亡細胞的數目。結果如表1所示。
表1

實施例9p53基因型對配子和胚胎生存力的作用通過評價從p53+/-小鼠中收集的配子和胚胎的受精能力和發育，研究p53基因型對配子和胚胎生存力的作用。
胚胎、配子和胚胎收集如之前的實施例中所述。
將雌性與野生型(p53+/+)或雜合(p53+/-)雄性交配。交配後12小時，衝刷生殖道，評價受精卵的比例。圖9A的結果顯示，與p53+/+雄性相比，與p53+/-雄性交配之後的受精發生率顯著地(P＜0.001)更高。實驗重複4次。通過IVF受精之後實現了類似的受精率提高(數據未顯示)。
分析每個所生成的合子的基因型，以確定受精率提高是否歸因於無p53精子的受精能力更強。圖9B顯示通過IVF或ISF受精之後，p53+/+合子的比例出乎意料地大於p53+/-，這表明缺少p53的小鼠產生的精子比野生型動物的精子具有更強的受精能力。這些結果表明，在精子發生的重要階段中或者精子成熟的過程中降低雄性中p53表達的作用或製劑提高了精子的受精能力。
另外研究了p53基因型對排卵誘導後雌性釋放卵母細胞數目的影響。圖9C顯示僅有1個功能性p53基因的雌性在排卵誘導後釋放出顯著更多的卵母細胞。這些結果表明，在卵泡發育和排卵過程中降低雌性中p53表達的作用或製劑提高了排卵率。
為了評價具有不同劑量p53基因的胚胎的生存力和發育潛力，進行p53+/-X p53+/-交配，在合子階段從生殖道中收集胚胎並在體外96小時內評價其發育，或者在交配4天後從生殖道中收集胚泡。評價每個胚胎的發育階段和形態，然後通過PCR對各個胚胎進行基因型擴增。下文表2所示的結果表明，降低p53基因劑量與從合子階段收集的胚胎發育潛力提高之間有強烈的關聯(A)，但是當從生殖道中新鮮收集胚胎時這種關聯便不再存在(B)。這些結果表明，降低早期胚胎中p53表達或活性的處理將具有增強其體外發育的作用。
表2-來自p53+/-x p53+/-雜交的基因型。(A)第1天收集合子胚胎並在體外培養96小時或者(B)第4天收集胚泡

·P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與預計的孟德爾分離相比。
·在基因型擴增之前除去胚胎的透明帶，以確保不存在粘附的母體細胞或精子。98％的胚胎得以成功的基因型擴增。
為了評價降低p53表達是否還導致這種胚胎的胎兒生存力提高，通過使p53+/-X p53+/-親代交配產生胚胎。96小時或24小時收集胚胎，產生胚泡。將生成的胚泡轉移到第3天假孕雌性的子宮中。胚胎轉移9天後檢查假孕母體妊娠，評價存活胎兒的數目和基因型。下文表3中的結果表明，延長胚胎的體外培養降低了它們形成存活胎兒的能力，但是在p53基因劑量的存在和基因形成存活胎兒的可能性之間有強烈的負相關性。當細胞僅培養很短一段時間時這一關聯便不再存在。
因此，這些結果表明，p53基因的缺乏有助於保護胚胎不受體外培養的有害影響，這表明在其培養或操作過程中降低胚胎內p53表達的作用或製劑對胚胎的發育和生存力具有有益的影響。
表3

*通過形成的胎兒總數乘以轉移胚胎基因型的相對推測頻率來計算估計胎兒成活率。
實施例10體外培養基根據本文提供的本發明最佳實施方式，以下概述了具體的典型培養基。下文應當理解為僅僅是適當培養基的說明性例子，而絕非限定本發明的範圍。
適當培養基是含101.6mM NaCl、4.69mM KCl、0.2mM MgSO4、0.37mM KH2PO4、21.4mM乳酸鈉、2.78mM葡萄糖、2.04mM CaCl2、25mM NaHCO3、0.33mM丙酮酸鈉、0.11mmol/L EDTA和1mmol/L穀氨醯胺的修飾HTF培養基，pH7.4，其補充有3mg血清白蛋白/ml，補充有10μM PFT-α，並任選地補充有10nM PAF。
實施例11組合物根據本文提供的本發明最佳實施方式，以下概述了具體的典型組合物。下文應當理解為僅僅是組合物的說明性例子，而絕非限定本發明的範圍。
實施例11(A)-膠囊組合物可以通過向標準2-片式硬明膠膠中裝入50mg粉末形式的適當抑制劑，其任選地包括50mg營養因子、100mg乳糖、35mg滑石粉和10mg硬脂酸鈉，製備膠囊形式的口服給藥用組合物。
實施例11(B)-可注射腸胃外組合物可以通過將1wt％的各適當的抑制劑，任選地和適當營養因子在體積10％的丙二醇和水中混合，製備注射給藥用組合物。通過過濾將溶液滅菌。
實施例11(C)-腸胃外給藥用組合物肌肉注射用組合物可以製備成含有1ml無菌緩衝水和1mg各適當抑制劑，任選地，含有適當營養因子。
類似地，靜脈注入用組合物可以包括250ml無菌林格氏溶液和5mg各適當的抑制劑，任選地可以包括適當營養因子。
實施例11(D)-局部霜劑劑組合物以下概述了典型的局部霜劑輸送組合物適當抑制劑 1.0g(適當營養因子1.0g)Polawax GP20025.0g無水羊毛脂 3.0g白蜂蠟 4.5g羥苯甲酸甲酯 0.1g去離子無菌水100.0g將polawax、蜂蠟和羊毛脂一起在60℃下加熱，加入羥苯甲酸甲酯溶液，使用告訴攪拌實現均化。然後使溫度降至50℃。然後加入p53抑制劑，任選地可加入營養因子，並分散於各處，在低速攪拌下使組合物冷卻。
實施例11(E)-陰道給藥用凝膠組合物典型的陰道輸送凝膠組合物包括將1.0g適當抑制劑，任選地和適當營養因子一起與水溶性生物粘合性聚合物和pH緩衝物質在純淨水中混合。向上述溶液中加入凝膠化溫度低的瓊脂至100.0g，同時進行連續輕柔的攪拌，直至形成均一混合物。
權利要求
1.一種提高胚胎生存力的方法，所述方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的抑制劑是以下的一種或多種的抑制劑p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中所述的抑制劑選自小分子抑制劑、核酸基抑制劑、肽基抑制劑及其任意組合。
5.根據權利要求1-4中任意一項的方法，其中將所述的至少一種抑制劑加入到含胚胎和/或配子的培養基中作為補充。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的方法，其中給予p53或p53相關途徑的兩種或多種抑制劑。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述的兩種或多種抑制劑是不同分子的抑制劑。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的分子選自p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
9.一種提高胚胎生存力的方法，所述方法包括將至少一種p53抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的p53抑制劑選自小分子抑制劑、核酸基抑制劑、肽基抑制劑及其任意組合。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述的p53抑制劑是小分子抑制劑。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述的小分子抑制劑是p53抑制素(PFT-α)或其衍生物或類似物。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述的抑制劑是p53特異性反義分子。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述的反義分子是p53-特異性siRNA。
15.根據權利要求9-14中任意一項所述的方法，其中給予兩種或多種所述的p53抑制劑。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述的兩種或多種抑制劑是小分子抑制劑和p53特異性siRNA。
17.一種提高胚胎生存力的方法，所述方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述的促生長劑是營養因子或其類似物或衍生物。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述的營養因子選自血小板活化因子(PAF)、胰島素樣生長因子-I(EGF-I)和-II(IGF-II)、轉化生長因子-α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的營養因子是PAF或其類似物或衍生物。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述的營養因子是IGF-II或其類似物或衍生物。
22.根據權利要求17-21中任意一項所述的方法，其中所述的抑制劑是以下的一種或多種的抑制劑p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
23.一種提高胚胎生存力的方法，所述方法包括將至少一種p53抑制劑和至少一種促生長劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述的至少一種p53抑制劑是PFT-α，所述的至少一種促生長劑是PAF或其類似物或衍生物。
25.根據權利要求23所述的方法，其中所述的至少一種p53抑制劑是PFT-α，所述的至少一種促生長劑是IGF-II或其類似物或衍生物。
26.根據權利要求23所述的方法，其中所述的至少一種p53抑制劑是p53特異性siRNA，所述的至少一種促生長劑是PAF或其類似物或衍生物。
27.根據權利要求23所述的方法，其中所述的至少一種p53抑制劑是p53特異性siRNA，所述的至少一種促生長劑是IGF-II或其類似物或衍生物。
28.根據權利要求16-27中任意一項所述的方法，其中將所述的至少一種抑制劑和所述的至少一種促生長劑加入到含胚胎和/或配子的培養基中作為補充。
29.根據權利要求1-28中任意一項所述的方法，其中所述的胚胎在雌性動物的生殖道中受精。
30.根據權利要求1-28中任意一項所述的方法，其中所述的胚胎通過輔助生殖技術產生。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述的輔助生殖技術是體外受精。
32.根據權利要求1-31中任意一項所述的方法，其中所述的胚胎用於胚胎幹細胞、克隆胚胎、胚胎嵌合體、基因修飾細胞系和基因修飾生物體的產生。
33.根據權利要求1-32中任意一項所述的方法，其中所述的胚胎是冷藏的。
34.根據權利要求1-33中任意一項所述的方法，其中所述的動物選自人、非人靈長類動物、羊、牛、犬、貓科動物、豬、馬和鼠科動物。
35.根據權利要求34的所述方法，其中所述的動物是人和牛。
36.一種提高胚胎生存力的組合物，所述的組合物包含至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
37.一種提高胚胎生存力的組合物，所述的組合物包含至少一種p53抑制劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
38.一種提高胚胎生存力的組合物，所述的組合物包含至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
39.一種提高胚胎生存力的組合物，所述的組合物包含至少一種p53抑制劑和至少一種促生長劑，及一種或多種藥物可接受的載體。
40.一種提高胚胎生存力的方法，所述方法包括將有效量的根據權利要求36-39中任意一項的組合物給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
41.一種卵母細胞體外受精的方法，所述方法包括以下步驟(a)從雌性動物中採集至少一個卵母細胞；(b)將卵母細胞在體外與精子培育，產生至少一個胚胎；及(c)在適當的胚胎培養基中培養所述胚胎，其中用有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑對雌性動物、採集的卵母細胞(或多個卵母細胞)、精子、從中分離精子的雄性動物和/或培養的胚胎中的至少一種進行處理。
42.根據權利要求41所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
43.一種卵母細胞體外受精的方法，所述方法包括以下步驟(a)從雌性動物中採集至少一個卵母細胞；(b)將卵母細胞在體外與精子培育，產生至少一個胚胎；及(c)在適當的胚胎培養基中培養胚胎，其中用有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑對雌性動物、採集的卵母細胞(或多個卵母細胞)、精子、從中分離精子的雄性動物和/或培養的胚胎中的至少一種進行處理。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
45.根據權利要求41-44中任意一項所述的方法，其進一步包括以下步驟(d)將胚胎轉移到雌性動物的生殖道中。
46.一種用作體外配子或胚胎生長培養基的組合物，所述的組合物包含有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑，及一種或多種適當的鹽和/或營養物。
47.一種用作體外配子或胚胎生長培養基的組合物，所述的組合物包含有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑和至少一種促生長劑，及一種或多種適當的鹽和/或營養物。
48.根據權利要求46或47所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
49.一種防止胚胎中細胞凋亡的方法，所述方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
50.根據權利要求49所述的方法，其進一步包括給予有效量的至少一種促生長劑。
51.根據權利要求49或50所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
52.一種提高輔助生殖技術導致的妊娠率的方法，其中所述方法包括暫時抑制p53或p53相關途徑的表達或活性。
53.根據權利要求52所述的方法，其中所述表達或活性的暫時抑制可以通過將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種體外培養的胚胎、分離的卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
54.一種提高經受體外受精的雌性動物妊娠率的方法，所述方法包括以下步驟(a)從雌性動物中採集至少一個卵母細胞；(b)將卵母細胞在體外與精子培育，產生至少一個胚胎；(c)在適當的胚胎培養基中培養胚胎；及(d)將胚胎轉移到雌性動物的生殖道中，其中用有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑對雌性動物、採集的卵母細胞、精子、從中分離精子的雄性動物和/或培養的胚胎中的至少一種進行處理。
55.根據權利要求54所述的方法，其進一步包括給予有效量的至少一種促生長劑。
56.根據權利要求54或55所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
57.一種提高雌性動物排卵率的方法，所述方法包括將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予雄性動物。
58.根據權利要求56所述的方法，其進一步包括給予有效量的至少一種促生長劑和/或誘排卵劑。
59.根據權利要求57或58所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
60.一種提高精子受精能力的方法，所述方法包括將有效量的至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予雄性動物或分離的精子。
61.根據權利要求60所述的方法，其進一步包括給予有效量的至少一種促生長劑。
62.根據權利要求60或61所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
63.一種鑑別提高胚胎生存力的製劑的方法，所述方法包括使細胞、細胞提取物或胚胎與候選製劑接觸，確認該製劑是否導致p53或p53相關途徑組分的表達或活性的暫時抑制，從而確認所述製劑是否能夠提高胚胎生存力。
64.一種提高胚胎生存力的方法，所述方法包括將有效量的至少一種經權利要求63的方法鑑別的製劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
65.一種保護胚胎不受遺傳或後天缺陷正選擇壓力的方法，所述方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
66.根據權利要求65所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
67.一種防止或降低發育中的胚胎中p53失功能突變累積的方法，所述方法包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
68.根據權利要求68所述的方法，其中所述的抑制劑是p53抑制劑。
全文摘要
本發明提供一種提高胚胎生存力的方法，其包括將至少一種p53或p53相關途徑的抑制劑給予以下的一種或多種胚胎、卵母細胞、精子、雌性動物或雄性動物。
文檔編號A61B17/42GK1871341SQ200480030820
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月20日 優先權日2003年8月20日
發明者C·奧尼爾 申請人:雪梨北方和中部海岸區醫療服務系統