少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept及其cDNA和應用的製作方法

2023-05-21 06:56:41

少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept及其cDNA和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及少棘蜈蚣抗腫瘤多肽scolopept及其cDNA和重組應用，屬於生物基因工程領域。少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept具有SEQ ID NO.1的胺基酸序列，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。其克隆方法如下：根據從少棘蜈蚣毒液中分離純化的抑瘤肽scolopept胺基酸序列設計兼併引物；從少棘蜈蚣毒腺提取總RNA；通過RT-PCR方法，一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMDPmd18-T載體，挑取陽性克隆進行測序。所述少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept的cDNA可通過現有基因工程方法，生產重組scolopept，開發新型抗癌藥物。
【專利說明】少棘暢蟻抑瘤化scolopept及其cDNA和應用

【技術領域】
[0001] 本發明設及生物基因工程領域，具體設及少棘蚊蟻抑腫瘤膚cDNA及其克隆、表達 技術。

【背景技術】
[0002] 目前癌症治療一般採用化學療法和放射療法，可W有效清除殘留腫瘤細胞，防止 腫瘤的復發與轉移，但其本身存在嚴重的毒副作用，在殺傷腫瘤細胞的同時，對人體正常細 胞傷害較大，並且可能使祀細胞產生不敏感性和耐藥性。而一些多膚類作用於腫瘤細胞的 機制不同，可W特異性殺傷腫瘤細胞，對正常細胞無毒副作用或作用較小，而且未發現耐藥 性。所W尋找作用於腫瘤細胞不同祀點的膚類，開發新一代抗癌藥物，是目前癌症治療研究 的熱點。
[0003] 到目前為止，國外已有36種多膚類抗癌藥物上市，我國臨床上利用尿酸多膚治療 乳腺癌，胸腺五膚輔助治療急性白血病、晚期非小細胞肺癌和腎癌等，胸腺膚a 1治療非霍 奇金淋己瘤、晚期非小細胞肺癌和白血病等多種癌症，但後兩者藥物主要是作為免疫增強 劑使用，並非專口抑制腫瘤細胞增殖或者促進其調亡的祀向性藥物。
[0004] 本發明從少棘蚊蟻毒液中分離純化出一種抑制腫瘤細胞增殖並促進其調亡的多 膚，命名為抑瘤膚scolop巧t，並測定其胺基酸序列。檢索SWISS-PROT、TrEMBL、PIR、MIPS 和ExPASy等國際蛋白質一級序列資料庫，均未收錄此膚序列；檢索GenBank、EM化和孤BJ 等S大核酸序列資料庫可知，少棘蚊蟻抑瘤膚scolopept的cDNA全長序列未被克隆，關於 少棘蚊蟻抑制腫瘤膚基因研究在國內外尚屬空白。


【發明內容】

[0005] 本發明提供一種從少棘蚊蟻毒腺提取的抑瘤膚，並提供少棘蚊蟻抑瘤膚 scolopept的cDNA的克隆方法及重組技術。
[0006] 本發明從少棘蚊蟻毒液中純化所得抑瘤膚scolopept,它具有SEQ ID NO. 1所示的 胺基酸序列；從少棘蚊蟻毒腺中克隆到scolop巧t cDNA，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。
[0007] 本發明少棘蚊蟻抑瘤膚scolopept的純化分離方法如下；
[0008] 電刺激蚊蟻獲得毒液粗品，用VIVASPIN 0. 5ml CONCENTRATOR VIVASCIENCE〇3etter life science by design, Sartorius AG，Germany)濃縮並截留 3, 000-5, 000化的多膚及蛋白組分；陰離子交換層析，收集21. 436min峰；凝膠過濾層析，收 集 17. 221min 峰；反相 HPLC，只見一個峰 21. 920min，凍幹保存；MALDI-TOF-MS 炬RUKER 公 司，REFLEXTM III)測定分子量為3016D ;E血an降解和串聯質譜結合測定胺基酸序列（島 津PPSQ-31A蛋白自動測序儀）。
[0009] 本發明少棘蚊蟻抑瘤膚scolop巧t的cDNA的克隆方法如下；
[0010] (1)根據純化所得scolopept胺基酸序列設計引物：
[OCm]正義寡核巧酸兼併引物 pSCOl ;5' -AAA(/G)ATT(/C/A)CTAAAA(/G)CTATTT(/C) CAT(/C)ATGAGAGGTGTT-3'
[0012] 反義寡核巧酸兼併引物 pSC02 ;5' -ATGACCC(/T)CTTAGAGTC(/T)TTAGAC(/T) CTCATCTTCTTAGT-3^
[0013] (2)從少棘蚊蟻毒腺提取總RNA。
[0014] (3)應用上述引物pSCOl和pSC02,進行RT-PCR擴增，擴增產物克隆入pMDlS-T載 體，挑取陽性克隆進行鹼基序列測定。
[0015] (4)根據測序結果，分析胺基酸序列，序列與scolopept匹配的克隆作為特異性擴 增的模板。
[0016] 妨根據上述模板的cDNA序列，設計含有SUMO酶切位點的首尾引物；
[0017] SCI ;5' -TAAGATACTAAAACTATTTCA-3'(斜體部分為 Stu I 酶切位點）
[0018] SC2 ;5' -CCCAAGCTTTCAATGACCTCTT-3'(斜體部分為 Hind III酶切位點）
[0019] PCR擴增SUMO-scolopept cDNA序列，克隆入PMD18-T載體，挑取陽性克隆進行鹼 基序列測定。
[0020] 上述SUMO-scolopept cDNA的克隆方法具體操作如下；
[0021] (1)根據純化所得scolopept胺基酸序列，設計克隆的正義寡核巧酸兼併引物 pSCOl ;5 ' -AAA (/G) ATT (/C/A) CTAAAA (/G) CTATTT (/〇 CAT (/〇 ATGAGAGGTGTT-3 ' 和反義寡核 巧酸兼併引物 pSC02 ; 5 ' -ATGACCC (/T) CTTAGAGTC (/T) TTAGAC (/T)
[0022] CTCATCTTCTTAGT-3> ;
[002引 似利用RNA抽提試劑TRIzoUinvitrogen公司），按照操作手冊，提取少棘蚊蟻 毒腺總RNA。
[0024] (3)應用RT-PCR方法，應用上述引物pSCOl和PSC02為特異性引物，擴增出cDNA的 序列，克隆入PMD18-T載體，並對其鹼基序列進行測定。RT-PCR的反應條件為；W總RNA為 模板，在50 y 1反應體系中，加入5 X RT-PCR反應緩衝液10 y 1、25mM M拆〇42 y 1、lOmMdNTP 混合物lyl、20uM的上下遊引物各2. 5yl、AMV逆轉錄酶（Takara公司）lyl、TflDNA聚 合酶lyl及RNA模板2yl，補水至50yl。RT-PCR循環參數為；50°C 30min反轉錄反應， 94°C 2min 變性，30 個 PCR 循環（94°C變性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 Imin)，最後 72°C解 育lOmin。RT-PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離後，用膠回收試劑盒回收基因片段， 置4°C保存。
[0025] (4)根據測序結果，分析胺基酸序列，與從少棘蚊蟻毒液中分離純化的scolopept 胺基酸序列匹配的克隆作為特異性擴增的模板。
[0026] (5)根據上述模板的cDNA序列，設計含有SUMO酶切位點的首尾引物；SCI ;
[0027] 5' -TAAGATACTAAAACTATTTCA-3'(斜體部分為 Stu I 酶切位點）和 SC2 ;
[0028] 5' -CCCAAGCTTTCAATGACCTCTT-3'(斜體部分為 Hind III酶切位點），PCR 擴增
[0029] SUMO-scolopept cDNA序列，反應條件為；W上述scolop巧t克隆為模板，在50 反應體系中，加入10XPCR反應緩衝液5yl、25mM MgS〇42yl、10mM dNTP混合物4yl、20yM 的上下遊引物各2yl、P化DM聚合酶0. 5yl及模板2yl，補水至50yl。PCR循環參數 為；50°C 30min反轉錄反應，94°C 5min變性，30個PCR循環巧4°C變性30s，50°C退火30s， 72°C延伸20s)，最後72°C解育7min。克隆入PMD18-T載體，挑取陽性克隆進行鹼基序列測 定，並構建SUMO-scolopept重組質粒，轉化大腸桿菌化21。
[0030] 對該基因的進一步研究表明：該基因的重組融合蛋白具有抑制白血病細胞K562 和肝癌細胞化pG2增殖，促進該些細胞調亡的高活性功能，並且對於正常組織細胞無毒副 作用。
[0031] 本發明還公開了少棘蚊蟻抑瘤膚scolopept或其cDNA在製備治療白血病和肝癌 的藥物中的應用。
[0032] 上述少棘蚊蟻抑瘤膚scolop巧t的cDNA的重組應用，通過現有基因工程方法，生 產重組抑瘤膚，可W開發新型抗癌藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1(a)是少棘蚊蟻抑瘤膚scolop巧t全長cDNA鹼基序列，全長cDNA共72bp ;化） 是少棘蚊蟻抑瘤膚scolopept胺基酸序列，共25Aa。
[0034] 圖 2 是 MALDI-TOF-MS 測定抑瘤膚 scolopept 分子量為 3016D。
[0035] 圖3是融合蛋白SUMO-scolopept經過誘導表達純化後，使用SUMO特異性蛋白酶 進行切割，Tricine/SDS - PAGE檢測，獲得3邸scolopept和SUMO標籤，經Ni柱層析，純化 得到SUMO-scolopept重組蛋白。（a)是SUMO蛋白酶酶切融合蛋白；化）是親和層析獲得重 組目的scolop巧to
[0036] 圖4是使用MIT細胞活性檢測方法對本發明克隆的基因表達產物對白血病細胞 K562和肝癌細胞化pG2作用結果。實驗中，scolopept對兩種細胞都表現出濃度依賴抑制 增殖作用，scolopept處理K562細胞，IC50為25 y M ;在HepG2細胞中，IC50為50 y M。
[0037] 圖5是流式檢測scolopept對K562和化pG2細胞調亡的作用。使用流式細胞儀檢 測J scolopept抑制細胞增殖的方式，通過Annexin V和艦化丙晚（PI)雙染髮現，scolopept 是通過調亡作用抑制細胞增殖的。40 uM scolopept可W明顯的引起21.4%的K562細胞 調亡。在化pG2細胞中，存在相似作用。
[003引圖6所示scolop巧t的溶血作用及對肝、腎及血管內皮細胞的毒性作用。在實驗 用量範圍內，無溶血性，當scolopept濃度加大至遠高於IC50的120 yM時，出現30%溶血。 用scolopept對原代小鼠肝細胞、人胚腎細胞肥K293進行MTT實驗，在120 y M時對原代小 鼠肝細胞僅有20%的殺傷率；對人胚腎細胞肥K293也僅有18%，說明對肝和腎僅有很小 的毒副作用。scolopept具有選擇性殺傷腫瘤細胞的作用，其作用於正常細胞的濃度要遠 小於其作用於惡性腫瘤細胞的濃度。加入scolopept後，人廝靜脈內皮細胞（HUVECs)存活 率的變化。scolopept在40 y M時對內皮細胞造成74%的殺傷率，與對照相比，有顯著性差 異（P<0. 05)，說明scolop巧t能夠抑制血管生成，並且隨著濃度的增加，抑制效果越明顯， scolopept通過抑制血管內皮細胞的增殖，減少對腫瘤細胞的血液供給，從而達到抑瘤的目 的。

【具體實施方式】
[0039] 本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理 解的含義。
[0040] 下面結合具體的製備實施例和應用實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發 明。應理解，該些實施例只是為了舉例說明本發明，而非W任何方式限制本發明的範圍。
[0041] 在W下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用到的引物，均在首次出現時標明，其後所用相同引物，均W首次標明的內容相同。
[0042] 實施例1 ;
[004引 少棘蚊蟻（Scolopen化a subspinipes mutilans)，人工飼養。
[0044] 電刺激蚊蟻獲得毒液粗品，用VIVASPIN 0. 5ml CONCENTRATOR VIVASCIENCE〇3etter life science by design, Sartorius AG，Germany)濃縮並截留 3, 000-5, 000化的多膚及蛋白組分，此組分依次進行柱層析分離：陰離子交換層析，收集 21. 436min峰；凝膠過濾層析，收集17. 221min峰；反相HPLC，獲得一個峰21. 920min，凍幹 保存；MALDI-TOF-MS炬RUKER公司，R邸LEXTM III)測定分子量為3016D(圖2) ;E血an降解 和串聯質譜結合測定胺基酸序列（島津PPSQ-31A蛋白自動測序儀）；該多膚的胺基酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，將該多膚命名為抑瘤膚scolop巧t (圖1化)）。
[0045] 實施例2 ;
[0046] 克隆抑瘤膚scolopept的cDNA序列；
[0047] (1)引物設計；根據實施例1純化所得scolopept胺基酸序列，設計克隆的 正義寡核巧酸兼併引物 pSCOl ;5 ' -AAA (/G) ATT (/C/A) CTAAAA (/G) CTATTT (/〇 CAT (/〇 ATGAGAGGTGTT-3'（SEQ ID NO. 3)和反義寡核巧酸兼併引物 pSC02 ;5' -ATGACCC(/T) CTTAGAGTC(/T)TTAGAC(/T)CTCATCTTCTTAGT-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0048] 似提取總RNA ;利用RNA抽提試劑TRIzoUinvitrogen公司）按照操作手冊提取 出約少棘蚊蟻毒腺的總RNA，並通過甲醒變性瓊脂糖凝膠電泳鑑定其質量和純度，紫外分光 光度計測定其濃度。
[0049] (3)應用RT-PCR方法，W上述pSCOl和PSC02為特異性引物，擴增出少棘蚊蟻抑瘤 膚scolopept cDNA序列，克隆入pMDlS-T載體（Takara公司），並對其鹼基序列進行測定。 RT-PCR的反應條件為；W總RNA為模板，在50 y 1反應體系中，加入5 X RT-PCR反應緩衝液 10 y l、25mM MgS〇42 y l、10mM dNTP 混合物 1 y 1、20 y M 的上下遊引物各 2. 5 y 1、AMV逆轉錄 酶（Takara公司）1 y 1、Tf IDNA聚合酶1 y 1及RNA模板2 y 1，補水至50 y 1。RT-PCR循環 參數為；50°C 30min反轉錄反應，94°C 2min變性，30個PCR循環（94°C變性30s，53°C退火 30s，72°C延伸Imin)，最後72°C解育lOmin。RT-PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離 後，用膠回收試劑盒回收基因片段，置4°C保存。
[0化0] (4)根據挑選不同克隆測序結果，分析胺基酸序列，與從毒腺中分離純化的天然 scolopept胺基酸相匹配的克隆即為本發明所得scolop巧t cDNA序列，如SEQ ID NO. 2(圖 1(a)) 〇
[0化1] 實施例3 ;原核表達抑瘤膚scolopept ;
[0化2] (1)可溶性SUMO-scolopept重組載體的構建；
[0化3] W上述得到的scolop巧t cDNA作為特異性擴增的模板。根據上述模板的cDNA序 列，設計含有 SUMO 酶切位點的首尾引物；SCI ;5' -TAAGATACTAAAACTATTTCA-3' (SEQ ID NO. 5)(斜體部分為 Stu I 酶切位點）和 SC2 ;5' -CCCAAGCTTTCAATGACCTCTT-3' (SEQ ID NO. 6)(斜體部分為化nd III酶切位點）。PCR擴增SUMO-scolopept cDNA序列，反應條件為； W上述scolop巧t克隆為模板，在50 y 1反應體系中，加入10XPCR反應緩衝液5 y l、25mM MgS〇42yl、10mM dNTP混合物4yl、20yM的上下遊引物各2yl、Pfu DM聚合酶0.5yl及 模板2y 1，補水至50y 1。PCR循環參數為；50°C 30min反轉錄反應，94°C 5min變性，30個 PCR循環（94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸20s)，最後72°C解育7min。克隆入pMDlS-T 載體，挑取陽性克隆進行鹼基序列測定。
[0054] 將pSUMO的空質粒菌D冊a接種於3mL液體LB中（含卡納黴素終濃度為50ug/ mL)，37°C振蕩，並過夜培養；用AxyGEN質粒提取試劑盒，提取並純化pSUMO質粒；StuI和 Hindlll分別雙酶切PCR產物和pSUMO ;載體去磯酸化和目的基因磯酸化；反應體系於37°C 水浴30nim之後，70°C水浴lOmin滅活。反應後，1%瓊脂糖膠電泳檢測，確定連接比例；在 16°C水浴條件下連接過夜。
[0化5] (2)在大腸桿菌中的誘導表達：
[0056] 取100 y L感受態細胞畑5 a、10 y L的上述連接產物混合，在冰上放置30min後， 42°C水浴90s，快速放冰上5min，加入900 y L LB培養基（經37°C預熱的），振蕩培養1小 時後，離屯、、濃縮至lOOyL左右，塗布於固體LB平板上（50yg/ml卡那黴素），37°C倒置培 養16小時。將菌落PCR鑑定為陽性克隆的SUMO-scolop巧t/D冊a菌株進行測序。
[0化7] 將測序正確的SUMO-scolopept重組質粒0. 5 y 1加入100 y 1的大腸桿菌化21感 受態細胞，輕輕混勻後，在冰上靜置30min。化21感受態細胞在42°C熱激90S後，立即於冰 上2min。加入37°C預熱的LB培養基890 y 1，37°C搖比。8000巧m離屯、Imin，吸取800 y 1 的上清液，其他一起混勻。吸取混懸液200 y 1於平板上，均勻塗布，置於37°C培養箱16h。 挑取單菌落，溶於3ml LB，再加入3yl 50mg/ml的卡納抗生素後，37°C培養4-8小時，進行 菌落PCR W確定陽性克隆。
[0化引 （3)重組目的蛋白SUMO-scolopept的Ni+親和純化；
[0化9] 將IPTG誘導含有目的重組蛋白的大腸桿菌培養液。於12000g室溫離屯、lOmin， 棄上清。取沉澱，用20ml平衡液1 (0. 5M化C1，20mM Tris，20mM咪挫）重懸，冰上超聲破 碎（工作10s，暫停10s，共99次）表達菌體，4°C，13,000 Xg，20min離屯、超聲破碎液後，棄 沉澱，收集上清，待過鑲柱。簡要過程是；3體積binding buffer平衡鑲柱，洗脫液1 (0. 5M 化C1，20mM Tris，lOOmM 咪挫）洗脫，接著洗脫液 2 (0. 5M 化C1，20mM Tris，250mM 咪挫）洗 脫。用20mM Tris(p服.0)透析蛋白液，-70°C保存。
[0060] 將上述純化後的SUMO-scolopept蛋白與SUMO蛋白酶W l:l〇〇(v/v)比例加入 1. 5ml的離屯、管，30°C的水浴鍋中水浴1小時；將酶切混合物按照W上純化步驟，再進行一 次Ni柱親和層析，收集流出液；W SDS-PAGE及毛細管電泳分析純度並W紫外分光光度計檢 測蛋白濃度，如圖3所示，純化得到純度達95%的活性目的蛋白。
[0061] (4)對腫瘤細胞增殖的抑制作用和促進調亡作用實驗
[0062] 在含10%胎牛血清的1640培養基中培養K562細胞，含10%胎牛DMEM培養基中 培養化pG2細胞；細胞達到80%飽和度時，收集細胞，用1 %血清培養基稀釋到105濃度， 種96孔板，0. 2ml/孔；化後，加入不同濃度的scolop巧t，於37°C培養24小時。每孔加 入20 y LMTT巧mg/ml)，繼續培養化，1000巧m離屯、lOmin ;小屯、棄掉上清，每孔加入150M1 DMS0,振蕩，直到紫色結晶充分溶解；用酶聯免疫檢測儀在490nm下檢測個孔的吸光值。實 驗結果如圖4所示，scolopept對兩種細胞都表現出濃度依賴抑制增殖作用，scolopept處 理K562細胞，IC50為25 y M ;在化pG2細胞中，IC50為50 y M。
[006引通過Annexin V和艦化丙晚（PI)雙染髮現，scolopept是通過調亡作用抑制細胞 增殖的。如圖5,40yM scolopept可W明顯的引起21.4%的K562細胞調亡。在化pG2細 胞中，存在相似作用。
[0064] (5)對人體正常細胞和血管內皮細胞增殖的影響
[00化]如圖6所示，在實驗用量範圍內，scolopept無溶血性，當濃度加大至遠高於IC50 的120^1時，出現30%溶血。用8(：〇1〇口6口*對原代小鼠肝細胞、人胚腎細胞肥1(293進行 MIT實驗，在120 y M時對原代小鼠肝細胞僅有20 %的殺傷率；對人胚腎細胞肥K293也僅有 18%，說明對肝和腎僅有很小的毒副作用。scolopept在40 y M時對內皮細胞造成74%的 殺傷率，與對照相比，有顯著性差異（P<〇. 05)，說明scolopept能夠通過抑制血管內皮細胞 的增殖，減少對腫瘤細胞的血液供給，從而達到抑瘤的目的。
[0066] 實施例4 ;
[0067] 將實施例2獲得的蚊蟻抑瘤膚scolopept的cDNA通過現有基因工程方法，生產重 組scolop巧t，作為抗癌藥物開發利用。
[0068] 按照本發明的方法可W通過現有基因工程技術，修飾蚊蟻抑瘤膚scolopept基因 並用於所述研究和生成。
【權利要求】
1.少棘蜈蟻抑瘤肽scolopept，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 2?少棘蜈蚣抑瘤肽scolop印t的cDNA，其特徵在於，是SEQ ID NO. 1所示的序列。
3.權利要求1所述的少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept在製備治療白血病及肝癌的藥物中的 應用。 4?權利要求2所述少棘蜈蟻抑瘤肽scolopept的cDNA的重組應用，其特徵在於，通過 基因工程方法生產重組少棘蜈蚣抑瘤肽scolop印t，用於製備治療白血病及肝癌的多肽類 藥物。
【文檔編號】C12N15/12GK104447972SQ201410666057
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】任文華, 張雙全 申請人:南京師範大學