鏈黴菌蛋白酶的製作方法

2023-05-10 00:38:51

專利名稱：鏈黴菌蛋白酶的製作方法
技術領域：
本發明提供了鏈黴菌絲氨酸蛋白酶。在一些實施方案中，該蛋白酶包含與野生型 鏈黴菌1AG3蛋白酶至少約80%相同的胺基酸序列。本發明還提供了分離的核酸序列，也提 供了重組核酸和含有該重組核酸的宿主細胞。此外，本發明提供了包含鏈黴菌絲氨酸蛋白 酶的清潔組合物和其他組合物。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶是多種酶類別的一個亞組，具有多種特異性和生物學功能。不論其 功能多樣性，已經對至少兩個遺傳迥異的酶家族探討了絲氨酸蛋白酶的催化機制，即枯草 桿菌蛋白酶和哺乳動物胰凝乳蛋白酶相關且同源的細菌絲氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶和 灰色鏈黴菌(S.griseus)胰蛋白酶)。這兩個絲氨酸蛋白酶家族顯示出顯著相似的催化 機制(參見例如，Kraut, Ann. Rev. Biochem. ,46 :331_358[1977])。此外，雖然一級結構不 相關，但是這兩個酶家族的三級結構均具有保守的胺基酸催化三聯體。枯草桿菌蛋白酶和 胰凝乳蛋白酶相關的絲氨酸蛋白酶均具有包含天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯體。 在枯草桿菌蛋白酶相關的蛋白酶中，從氨基端至羧基端，這些胺基酸的相對順序是天冬氨 酸_組氨酸_絲氨酸。然而，在胰凝乳蛋白酶相關的蛋白酶中，相對順序是組氨酸_天冬氨 酸-絲氨酸。對枯草桿菌蛋白酶已經進行了大量研究，主要是出於其在清潔和飼料應用中 的用途。其他工作則著眼於在各種應用中可以負面影響這些酶的功能的不良環境條件(例 如，暴露於氧化劑、螯合劑和/或極端的溫度和/或PH)。儘管如此，本領域仍然需要這樣的 酶系統，所述酶系統能夠抵抗這些不良條件，並保留或具有提高的本領域目前已知的活性。發明概述提供了分離的絲氨酸蛋白酶，以及含有所述絲氨酸蛋白酶的清潔組合物。在一 些實施方案中，蛋白酶與野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶(SEQ IDN0 9)相同，而在其他實施方 案中，蛋白酶是變體。在一些實施方案中，蛋白酶包含與野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶至少 約80%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，分離的絲氨酸蛋白酶相對於野生型鏈黴菌 1AG3蛋白酶具有至少1個胺基酸取代。在一些實施方案中，分離的絲氨酸蛋白酶相對於野 生型鏈黴菌1AG3蛋白酶具有改變的底物特異性，以及相對於野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶，具 有改變的pi、提高的活性，例如，改善的酸穩定性、熱穩定性、酪蛋白酶解、角蛋白酶解、清潔 性能和/或LAS穩定性。也提供了編碼分離的絲氨酸蛋白酶的分離的核酸。在一些實施方案中，分離的核 酸具有這樣的核苷酸序列a)在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO :8雜交；和/或b)與SEQ ID NO 8至少約70%相同。
還提供了包含分離的核酸的重組多核苷酸。在一些實施方案中，重組多核苷酸包 含有效連接的啟動子和分離的核酸。在一些實施方案中，啟動子與分離的核酸是異源的，即 它不是野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶啟動子。在一些實施方案中，啟動子是野生型鏈黴菌1AG3 蛋白酶啟動子。在其他一些實施方案中，重組核酸提供從宿主細胞分泌所述分離的絲氨酸 蛋白酶(即，含有信號序列編碼區，定位分離的絲氨酸蛋白酶的分泌)。還提供了包含重組 核酸的表達載體。本發明還提供了包含重組多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞 選自芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)、鏈黴菌屬物種(Str印tomycessp.)、麴黴屬物種 (Aspergillus sp.)和木黴菌屬物種(Trichoderma sp.)。在一些實施方案中，重組多核苷 酸存在於細胞內的表達載體中，而在其他實施方案中，存在於細胞的基因組中(即，整合到 宿主細胞的基因組中)。在一些實施方案中，宿主細胞用於產生分離的絲氨酸蛋白酶的方 法。在一些實施方案中，方法包括在適合產生分離的絲氨酸蛋白酶的條件下，培養宿主細 胞。在一些替代性的實施方案中，方法還包括回收分離的絲氨酸蛋白酶。在一些實施方案 中，蛋白酶分泌到培養基中。在一些替代性的實施方案中，方法還包括從培養基中回收蛋白 酶。還提供了包含分離的絲氨酸蛋白酶的清潔組合物。在一些實施方案中，清潔組合 物還包含表面活性劑。在一些實施方案中，表面活性劑是包含環氧乙烷部分的烷基硫酸鈉 表面活性劑。在一些實施方案中，清潔組合物包含約0. 001wt%至約0. 5wt%的分離的絲氨 酸蛋白酶。在一些實施方案中，清潔組合物包含足量的PH調節劑，提供組合物的淨pH從約 3至約5，而清潔組合物基本不含在約3至約5的pH水解的材料。在一些優選的實施方案 中，清潔組合物配製成衣物洗滌劑(laundry detergent)，和/或餐具洗滌劑(dishwashing detergent)，禾口 / 或硬表Ui青潔組合物(hard-surfacecleaning composition)。在一些實 施方案中，除對象蛋白酶以外，清潔組合物還包含至少一種其他的酶，所述其他的酶選自蛋 白酶、澱粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果膠酶、角質酶(cutinase)、氧化還原酶、半纖維素酶和 /或纖維素酶。在一些實施方案中，清潔組合物還包含至少一種穩定劑。在一些優選的實施 方案中，穩定劑是硼砂、甘油和/或競爭性抑制劑。在一些實施方案中，穩定劑使分離的絲 氨酸蛋白酶對陰離子表面活性劑穩定。以任何合適的形式提供清潔組合物，包含但不限於 固體、液體、氣體和/或凝膠。本發明的清潔組合物可用於清潔的方法。在一些實施方案中，方法包括將對象與 清潔組合物接觸來清潔對象。在一些實施方案中，方法還包括洗滌和/或漂洗對象。在示 例性的實施方案中，對象是紡織品(例如，衣物)或餐具物件(例如，碟或盤)。本發明還提供了包含分離的絲氨酸蛋白酶的動物飼料。


圖1提供了顯示1AG3基因結構的示意圖。圖 2 提供了來自 1AG3 (SEQ ID NO 2)和鏈黴菌蛋白酶(Str 印 togrisin) C (SEQ ID NO 12)的多肽序列的比對。圖3提供了成熟的(即，催化結構域)1AG3蛋白酶(SEQ ID NO 13)和鏈黴菌蛋白 酶C(SEQ ID NO 14)的比對。在該圖中，用粗體印出了活性位點胺基酸(his-asp-ser)，並通過連接線提示了特徵性的三個二硫鍵。圖 4 提供了 1AG3 蛋白酶(SEQ ID NO 2)和 ASP(SEQ ID NO 15)的比對。圖5提供了成熟的(即，催化結構域)1AG3蛋白酶(SEQ ID NO 13)和ASP(SEQ ID NO: 16)的比對。圖6提供了 PSEA4CT-1AG3表達構建體的圖譜。圖7提供了 20°C下在pH8. 2的液體洗滌劑中測試的1AG3蛋白酶的劑量反應曲線。圖8提供了在30°C下在pH6. 0的液體洗滌劑中測試的1AG3蛋白酶的劑量反應曲線。發明詳述本文提供了新蛋白酶，編碼這些酶的新遺傳材料，和獲得自鏈黴菌屬物種的蛋白 酶解性蛋白質，包含從其發展的變體蛋白質。在一些實施方案中，提供了從新描述的鏈黴菌 種種獲得的蛋白酶組合物，編碼蛋白酶的DNA，包含編碼蛋白酶的DNA的載體，用載體DNA轉 化的宿主細胞，和由宿主細胞產生的酶。本發明的一些實施方案還提供了包含從鏈黴菌屬 物種獲得的一種或多種蛋白酶的清潔組合物(例如，洗滌劑組合物)、動物飼料組合物和紡 織品和皮革處理組合物。在替代性實施方案中，本發明提供了從本文描述的野生型蛋白酶 衍生的突變(即，變體)蛋白酶。這些突變蛋白酶液可用於多種應用。鏈黴菌是革蘭氏陽性菌，分類屬於放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目 (Actinomycetales)，鏈黴菌亞目(Streptomycineae)，鏈黴菌禾鬥(Streptomycetaceae)中 的成員。生長的鏈黴菌具有廣泛分支的初生菌絲體或基內菌絲體，和豐富的氣生菌絲體， 氣生菌絲體在成熟時產生特徵性的孢子。鏈黴菌蛋白酶是從多種鏈黴菌中大量分泌的 絲氨酸蛋白酶。已經從至少9個不同的鏈黴菌屬物種中確定了鏈黴菌蛋白酶的胺基酸序 列，包含灰色鏈黴菌(Str印tomyces griseus)的鏈黴菌蛋白酶C(登錄號P52320)；來自 鏈黴菌屬物種(登錄號PC2053)的鹼性蛋白酶(EC 3.4.21.-)；來自鏈黴菌屬物種(登 錄號S34672)的鹼性絲氨酸蛋白酶I，來自變鉛青鏈黴菌(Str印tomyces lividans，登錄 號CAD4208)的絲氨酸蛋白酶；來自天藍色鏈黴菌(Str印tomyces coelicolor) A3 (2)(登 錄號NP_625129)的推定的絲氨酸蛋白酶；來自除蟲鏈黴菌(Str印tomyces avermitilis) MA_4680(登錄號NP_822175)的推定的絲氨酸蛋白酶；來自變鉛青鏈黴菌的絲氨酸蛋白酶 (登錄號CAD42809)；來自天藍色鏈黴菌A3 (2)(登錄號NP_628830)的推定的絲氨酸蛋白酶 前體。純化的天然鹼性蛋白酶具有19，000道爾頓的表觀分子量，分離自灰色鏈黴菌嗜鹼性 變種；已經描述了包含該酶的清潔組合物(參見例如，美國專利號5，646，028，引入本文作 為參考)。另一菌株分離自湖水和沉積物的樣品；該菌株在本文中命名為「菌株1AG3」。水 柱和沉積物的溫度是19-23°C，pH10. 5，水的傳導率是26. lmS cnT1。本文中描述的一些蛋白酶具有良好的穩定性和蛋白酶解活性。這些酶可用於多種 應用，包含但不限於清潔組合物、動物飼料、紡織品和皮革處理等。本發明還提供了產生這 些酶的方法。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶是純化的或相對純化的形式。在一些實施方案中，本發明還提供了適合在重組生物體中產生本發明的蛋白酶的 核苷酸序列。在一些實施方案中，重組產生提供了以可商業化的量產生蛋白酶的方法。除非另外提及，本發明的實施涉及在分子生物學、微生物學和重組DNA技術中普 遍使用的常規技術，屬於本領域技術人員的範疇。此類技術是本領域技術人員已知的，描述在多個文本和參考文獻中。本文上下文中提及的所有專利、專利申請、文章和出版物，都通 過引用清楚地合併到本文中。除非本文中另外提及，本文使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域普 遍技術人員常規理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等價的方法和材料也可用於本發 明的實施，但仍描述了示例性的方法和材料。因此，通過整體參考說明書，可以更全面的描 述下文定義的術語。此外，除非文中明確地另外指出，本文中使用的單數形式「一個」和「這 個」包含了複數含義。數值範圍包含了定義範圍的數。除非另外指出，核酸序列以從5』至 3』方向由左至右的書寫；胺基酸序列以從氨基至羧基方向由左至右的書寫。可以理解，發 明不限於所描述的特定方法、方案和試劑，本領域技術人員可以根據所使用的情況而進行 變動。除非另外指出，本發明的實施使用蛋白質純化、分子生物學、微生物學、重組DNA 技術和蛋白質測序的常規技術，其均屬於本領域技術人員的知識範圍內。此外，本文提供的標題並不限制本發明的多個方面或實施方案，其可參照說明書 整體。因此，通過整體參照說明書可以更完整的定義下文定義的術語。儘管如此，為了便於 理解發明，下文仍定義了多個術語。I.定義如本文中使用的，術語「蛋白酶」和「蛋白酶解活性」指這樣的蛋白質或肽，其顯示 出具有水解肽或具有肽鍵的底物的能力。有多種用於測量蛋白酶解活性的已知方法，且是 本領域技術人員熟知的。例如，通常通過比較測定來證實蛋白酶解的活性，所述測定分析 各蛋白酶水解商品底物的能力。可用於蛋白酶和/或蛋白酶解活性分析的示例性底物包 含但不限於，二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛膠原(Sigma C-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。使用這些底物的比色測定是本領域熟知的 (參見例如，W0 99/34011 ；和美國專利號6，376，450，均引入本文作為參考)。pNA測定(參 見例如，Del Mar等人，Anal. Biochem. ,99 316-320 [1979])也可用於確定在梯度洗脫中收 集的組分中的活性酶濃度。上述測定測量了當酶水解可溶性合成底物琥珀醯_丙氨酸_丙 氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(sAAPE-pNA)時，對硝基苯胺的釋放速率。在分光光 度計上，410nm處測量水解反應中產生黃色的速率，其與活性酶濃度成比例。此外，在280nm 處的吸光度測量值可用於確定總蛋白濃度。活性酶/總蛋白比例給出了酶的純度。如本文中使用的，術語菌株「1AG3蛋白酶」指本發明的一個實施方案的蛋白酶。如 本文所述，野生型蛋白酶分離自鏈黴菌菌株1AG3。在一些實施方案中，本發明提供了蛋白酶 的活性形式，包含256個胺基酸的多肽。在其他實施方案中，1AG3蛋白酶是1AG3ASP蛋白酶 的變體或同源物。術語「鏈黴菌蛋白酶同源物」指與源自鏈黴菌菌株1AG3的成熟蛋白酶具有基本 相同的胺基酸序列的天然存在的蛋白酶，和/或編碼此類天然存在的蛋白酶的多核苷酸序 列，並且所述蛋白酶保留了此類核酸編碼的絲氨酸蛋白酶的功能性特徵。"ASP蛋白酶」、「Asp蛋白酶」和「Asp」指在本文和PCT系列號US04/39006和 US04/39066(均通過引用全文整合到本文中)中描述的絲氨酸蛋白酶。在一些實施方案中， Asp蛋白酶是本文中獲得自纖維單胞菌菌株69B4的命名為69B4蛋白酶的蛋白酶。因此，在 一些實施方案中，術語「69B4蛋白酶」指源自纖維單胞菌菌株69B4(DSM 16035)的天然存在的成熟蛋白酶，其具有與SEQ ID NO :25基本相同的胺基酸序列。在一些替代性的實施方案 中，本發明提供了 ASP蛋白酶的一部分。術語「纖維單胞菌蛋白酶同源物」指與源自纖維單胞菌菌株69B4的成熟蛋白酶具 有基本相同的胺基酸序列的天然存在的蛋白酶，或編碼此類天然存在的蛋白酶的多核苷酸 序列，並且所述蛋白酶保留了此類核酸編碼的絲氨酸蛋白酶的功能性特徵。在一些實施方 案中，這些蛋白酶同源物被稱為「纖維單胞菌蛋白酶(cellulomonadins) 」。如本文中使用的，術語「鏈黴菌1AG3變體」、「鏈黴菌蛋白酶變體」和「1AG3蛋白酶 變體」用於指這樣的蛋白酶，所述蛋白酶與野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶相似，特別是其功能相 似，但在其胺基酸序列中具有突變，使其與野生型蛋白酶的序列不同。如本文中使用的，術語「ASP變體」、「ASP蛋白酶變體」和「69B蛋白酶變體」用於指 這樣的蛋白酶，所述蛋白酶與野生型ASP相似，特別是其功能相似，但在其胺基酸序列中具 有突變，使其與野生型蛋白酶的序列不同。如本文中使用的，「纖維單胞菌」指所有屬於纖維單胞菌屬(Cellulomonas)中的物 種，其是革蘭氏陽性菌，分類為放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)， 微球菌亞目(Micrococcineae)，纖維單胞菌科(Cellulomonadaceae)的成員。公認纖維單 胞菌屬不斷經歷著分類重組。因此，該屬意在包含已重新分類的物種。如本文中使用的，「鏈黴菌屬物種」指所有屬於「鏈黴菌屬(Str印tomyces)，， 中的物種，其是革蘭氏陽性菌，分類屬於放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目 (Actinomycetales)，鏈黴菌亞目(Streptomycineae)，鏈黴菌禾鬥(Streptomycetaceae)中 的成員。公認鏈黴菌屬不斷經歷著分類重組。因此，該屬意在包含已重新分類的物種。如本文中使用的，「芽孢桿菌(Bacillus)屬」包含所有屬於「芽孢杆 菌(Bacillus)」屬中的物種，本領域技術人員已知，包含但不限於枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B. lentus)、短 芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、嗜鹼芽孢杆 菌(B. alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌 (B. clausii)、耐鹽芽孢桿菌(B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝結芽孢杆 菌(B. coagulans)、環狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. lautus)和蘇雲金芽孢 桿菌(B.thuringiensis)。公認芽孢桿菌屬不斷經歷著分類重組。因此，該屬意在包含已 重新分類的物種，包含但不限於生物體例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)， 現名為嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)。在氧存在的條件下產 生抗性內生孢子被認為是芽孢桿菌屬的決定性特徵，但該特徵也可用於最近命名的環脂酸 芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、Aneurinibacillus、 Anoxybacillus、短芽抱桿菌屬(Brevibacillus)、Filobacillus、Gracilibacillus、喜鹽 芽孢桿菌屬(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Salibacillus、熱桿菌屬 (Thermobacillus)、解脲芽孢桿菌屬(Ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)， 以及其他生物體。術語「多核苷酸」和「核酸」在本文中可互換的使用，指任何長度的核苷酸的聚合 形式，不論是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這些術語包含但不限於，單鏈、雙鏈或三鏈的 DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜交體，或包含嘌呤和嘧啶鹼基或其他天然的、化學的、生物化學修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基的多聚體。以下是多核苷酸的非限制 性實例基因、基因片段、染色體片段、EST、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、 重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、 核酸探針和引物。在一些實施方案中，多核苷酸包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和 核苷酸類似物、尿嘧啶、其他糖和連接基團，例如氟代核糖(fluororibose)和硫代酸酯 (thioate)，以及核苷酸支鏈。在替代性實施方案中，核苷酸序列被非核苷酸組分中斷。如本文中使用的，術語「DNA構建體」和「轉化DNA」是可互換使用的，指用於向宿 主細胞或生物體中弓I入序列的DNA。可以通過PCR或本領域已知的其他合適技術在體外產 生DNA。在特定的實施方案中，DNA構建體包含目的序列(例如，輸入的(incoming)序列)。 在一些實施方案中，序列與其他元件是有效連接的，例如調控元件(如，啟動子等)。DNA構 建體還可以包含選擇性標記物。還包含側接同源盒的輸入序列。在其他實施方案中，轉化 DNA包含添加在末端的其他非同源序列(例如，填充序列(stuffer sequences)或側翼)。 在一些實施方案中，輸入序列的末端是封閉的，從而使轉化DNA形成封閉環狀。轉化序列可 以是野生型、變體或修飾的。在一些實施方案中，DNA構建體包含與宿主細胞染色體同源的 序列。在其他實施方案中，DNA構建體包含非同源的序列。一旦DNA構建體在體外裝配，則 可用於1)將異源序列插入到宿主細胞的期望靶序列中，和/或2)突變宿主細胞染色體的 區域(即，用異源序列替代內源性序列)，3)刪除靶基因；和/或向宿主引入複製性質粒。如本文中使用的，術語「表達盒」和「表達載體」指重組地或合成地產生的核酸構 建體，具有一系列特殊的核酸元件，允許特定核酸在靶細胞內的轉錄。重組表達盒可以整合 到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其他序列外，表達載 體的重組表達盒部分包含待轉錄的核酸序列和啟動子。在一些實施方案中，表達載體具有 在宿主細胞內摻入和表達異源DNA片段的能力。多種原核和真核表達載體是市售的。選擇 合適的表達載體屬於本領域技術人員的知識範圍。術語「表達盒」與「DNA構建體」及其語 法等價體可互換的使用。選擇合適的表達載體屬於本領域技術人員的知識範圍。如本文中使用的，術語「載體」指設計用於將核酸引入一種或多種細胞類型中的多 核苷酸構建體。載體包含克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒式結構(cassette)等。 在一些實施方案中，多核苷酸構建體包含編碼蛋白酶(例如，前體或成熟蛋白酶)的DNA序 列，有效連接了能夠影響DNA在合適宿主中的表達的合適的原序列(例如，分泌性的等)。如本文中使用的，術語「質粒」指作為克隆載體使用的環狀雙鏈(ds)DNA構建體， 其在一些真核細胞或原核細胞中形成染色體外自我複製的遺傳元件，或整合到宿主染色體 中。如本文中使用的，在向細胞內引入核酸序列的情況下，術語「引入」指適合將核酸 序列轉移到細胞內的任何方法。此類引入的方法包括但不限於原生質體融合、轉染、轉化、 接合和轉導(參見例如，Ferrari等人，「Genetics，」在Hardwood等人(編著)，Bacillus, Plenum Publishing Corp.，第 57-72 頁，[1989]中)。如本文中使用的，術語「轉化的」和「穩定轉化的」指這樣的細胞，所述細胞具有非 天然(異源)多核苷酸序列整合在其基因組中，或作為附加型質粒維持至少2代。如本文中使用的，術語「編碼選擇性標誌物的核苷酸序列」指這樣的核苷酸序列， 所述序列能夠在宿主細胞中表達，且選擇性標誌物的表達使含有所表達基因的細胞能夠在存在相應選擇劑或缺少關鍵營養物的條件下生長。如本文中使用的，術語「可選擇的標誌物」和「選擇性標誌物」指這樣的核酸(即， 基因)，所述核酸能夠在宿主細胞內表達，並允許便於選擇含有載體的這些宿主。此類可選 擇的標誌物的實例包含但不限於抗微生物劑。因此，術語「可選擇的標誌物」指這樣的基 因，所述基因為已攝入輸入的目的DNA或已發生其他反應的宿主細胞提供指示。一般地，可 選擇的標誌物是在宿主細胞中賦予抗微生物劑抗性或代謝優勢的基因，使含有外源DNA的 細胞與在轉化過程中未接受任何外源序列的細胞相區別。「駐留的(residing)可選擇性標 志物」是位於轉化微生物的染色體上的標誌物。駐留的可選擇標誌物編碼的基因與位於轉 化DNA構建體上的可選擇標誌物不同。選擇性標誌物是本領域技術人員熟知的。如上所 示，標誌物可以是抗微生物劑抗性標誌物(例如，ampK ；phleoE ；specE ；kanE ；eryE ；tetE ；cmpE 和 neoE ；參見例如，Guerot-Fleury, Gene, 167 :335_337[1995] ；Palmeros 等人，Gene 247 255-264 [2000]；和 Trieu-Cuot 等人，Gene，23 :331_341 [1983])。其他標誌物包含但不限 於營養缺陷型標誌物，例如色氨酸；和檢測標誌物，例如β-半乳糖苷酶。如本文中使用的，術語「啟動子」指功能是指導下遊基因轉錄的核酸序列。在一些 實施方案中，啟動子適合在其中表達靶基因的宿主細胞。啟動子和其他轉錄和翻譯調控核 酸序列(也稱為「控制序列」)對表達指定的基因是必需的。通常，轉錄和翻譯的調控序列 包含但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列， 以及增強子或激活子序列。當其置於與另一核酸序列的功能性關聯中時，核酸是「有效連接的」。例如，如果作 為參與多肽分泌的前蛋白質表達，則編碼分泌前導區(即，信號肽)的DNA與多肽DNA是有 效連接的；如果影響序列的轉錄，則啟動子或增強子與編碼序列是有效連接的；如果其位 置有利於翻譯，則核糖體結合位點與編碼序列是有效連接的。通常，「有效連接的」意指連 接的DNA序列是連續的，並且在分泌前導區的情況下，是以閱讀相(in readingphase)連續 的。然而，增強子不需要是連續的。通過在常規的限制性酶切位點連接來實現連接。如果 不存在此類位點，則根據常規操作使用合成的寡核苷酸銜接頭(adaptor)或接頭。如本文中使用的，術語「基因」指多核苷酸(例如，DNA片段)，所述多核苷酸編碼 多肽，並包含位於編碼區前後的區域，以及在各編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內含 子)。如本文中使用的，術語「同源基因」指來自不同但通常相關的物種的成對基因，所 述基因相互對應，且彼此相同或高度相似。該術語涵蓋了由於物種形成(即，新物種產生) 而不同的基因(例如，直系同源基因)，和由於基因複製而不同的基因(例如，旁系同源基 因)。如本文中使用的，術語「直系同源物」和「直系同源基因」指從共同祖先基因通過物 種形成進化而來的、但位於不同物種中的基因(即，同源基因)。一般地，直系同源物在進化 過程中保留了相同的功能。鑑別直系同源物可用於新測序基因組中基因功能的可靠預測。如本文中使用的，術語「 旁系同源物」和「旁系同源基因」指在基因組內通過複製 而相關的基因。當直系同源物在進化過程中保留相同功能的同時，旁系同源物進化了新的 功能，雖然一些功能通常是與原始功能相關的。旁系同源基因的實例包含但不限於，編碼胰 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，其都是絲氨酸蛋白酶，並共同存在於相同的物種中。如本文中使用的，「同源性」指序列相似性或同一性。該同源性是使用本領域已 知的標準技術確定的(參見例如，Smith 和 Waterman，Adv. App 1. Math.，2 482[1981]； Needleman 禾口 Wunsch, J. Mol. Biol. ,48 443 [1970] ；Pearson 禾口 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85 2444[198 8]；程序，例如 Wisconsin Genetics 軟體包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA (Genetics Computer Group, Madison, WI)；禾口 Devereux 等人，Nucl. Acid Res., 12 :387-395[1984])。如本文中使用的，「類似序列」是這樣的序列，其中基因的功能與基於鏈黴菌1AG3 蛋白酶的基因基本相同。此外，類似基因與鏈黴菌菌株1AG3蛋白酶的序列包含至少約 45 %、約 50 %、約 55 %、約 60 %、約 65 %、約 70 %、約 75 %、約 80 %、約 85 %、約 90 %、約 95%、約97%、約98%、約99%或約100%的序列同一性。可選的，類似序列與在鏈黴菌菌 株1AG3蛋白酶區中發現的基因具有70至100%的匹配(alignment)，和/或在與鏈黴菌菌 株1AG3染色體基因匹配的區域中含有至少5-10個基因。在另一些實施方案中，一種以上 上述性質適用於該序列。通過序列比對的已知方法來確定類似序列。常用的比對方法是 BLAST,但如上下文種指出的，其他方法也可用於比對序列。有用的算法的一個實例是PILEUP。PILEUP利用漸進的、成對比對，從一組相關序 列中創建多重序列比對。也可以繪製樹狀圖來顯示用於創建比對的簇狀關係。PILEUP使 用了 Feng 和 Doolittle (Feng 和 Doolittle，Mol. Evol. ,35 :351_360 [1987])的漸進比對 方法的簡化版。該方法與 Higgins 和 Sharp (Higgins 和 Sharp，CABIOS 5 151-153 [1989]) 所述的相似。有用的PILEUP參數包含預設的空位權重3. 00，預設的空位長度權重0. 10，和 加權的末端空位。有用的算法的另一個實例是BLAST算法，由Altschul等人所述(Altschul等 人，J. Mol. Biol.，215 :403_410，[1990]；和 Karlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873-5787 [1993])。特別有效的 BLAST 算法是 WU-BLAST-2 程序(參見，Altschul 等人， Meth. Enzymol.，266 :460_480 [1996])。WU-BLAST-2使用若干檢索參數，大部分設定為預設 值。可調節的參數設定為下列值重疊跨度=1，重疊分數=0.125，字符閾值(T) = 11。 HSP S和HSP S2參數是動態值，由程序本身根據特定序列的組成和檢索目的序列的特定數 據庫的組成來確定。然而，可以調整值來增加靈敏度。通過匹配的相同殘基數除以比對區 域中「較長」序列的總殘基數，來確定％胺基酸序列同一性值。「較長」序列是在比對區域中 具有最多的實際殘基的序列(忽略由WU-BLAST-2為了使比對分數最大化而引入的空位)。因此，「百分比(％ )核酸序列同一性」定義為在候選序列中與起始序列(即，目的 序列)的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。方法使用WU-BLAST-2的BLASTN模塊設 定預設參數，重疊跨度和重疊分數分別設定為1和0. 125。如本文中使用的，術語「雜交」指核酸鏈與互補鏈通過鹼基配對相連接的過程，如 本領域所已知的。如果在中度至高度嚴格雜交和洗滌條件下，兩條序列彼此特異性的雜交，則認為 核酸序列與參照核酸序列是「可選擇性雜交的」。雜交條件是基於核酸結合複合物或探針的 熔解溫度(Tm)。例如，「最大嚴格度」通常發生在約Tm-5°C (低於探針的Tm 5°C )； 「高嚴 格度」在低於Tm約5-10°C ；「中嚴格度」在低於探針的Tm約10-20°C ；而「低嚴格度」在低於Tm約20-25°C。功能性地，最大嚴格度條件可以用於鑑別與雜交探針具有嚴格一致性或 接近嚴格一致性的序列，而中度或低度嚴格雜交可用於鑑別或檢測多核苷酸序列同源物。中度和高度嚴格雜交條件是本領域熟知的。高度嚴格條件的實例包含在42°C，在 50% 甲醯胺，5X SSC, 5X Denhardt' s 溶液，0. 5% SDS 和 100 μ g/ml 變性載體 DNA 中雜交， 然後在2X SSC和0. 5% SDS中室溫洗滌2次，在IX SSC和0. 5% SDS中42°C再洗滌2次。 中度嚴格條件的實例包含在37 °C，在包含20%甲醯胺，5X SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三 鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7. 6)，5X Denhardt' s溶液，10%葡聚糖硫酸鹽和20mg/ml變性剪切 的鮭魚精子DNA的溶液中孵育過夜，然後在IXSSC中約37-50°C洗滌濾膜。本領域技術人員 知道如何調整溫度、離子強度等，如必要時調節因子例如探針長度等。如本文中使用的，「重組」包含指細胞或載體，其已通過引入異源核酸序列進行了 修飾，或所述細胞源自上述修飾的細胞。因此，例如，由於有意地人為幹預，重組細胞表達在 天然(非重組)形式的細胞中未發現的相同形式的基因，或者異常地表達、低表達或完全不 表達天然基因。「重組」、「重組的」和產生「重組」核酸通常是組裝兩個或多個核酸片段，其 中所述組裝產生嵌合基因。
在一個實施方案中，在至少1個密碼子處產生位點飽和誘變的突變DNA序列。在另 一個實施方案中，在兩個或多個密碼子處實施位點飽和誘變。在另一實施方案中，突變DNA 序列與野生型序列具有高於50%，高於55%，高於60%，高於65%，高於70%，高於75%， 高於80 %，高於85 %，高於90 %，高於95 %，或高於98 %的同源性。在替代性實施方案中， 使用任何已知的誘變程序在體內產生突變DNA，例如輻射、亞硝基胍等。然後，分離期望的 DNA序列，並用於本文提供的方法。如本文中使用的，術語「靶序列，，指宿主細胞中這樣的DNA序列，所述DNA序列編 碼供輸入序列插入宿主細胞基因組時所需的序列。在一些實施方案中，靶序列編碼功能性 野生型基因或操縱子，而在其他實施方案中，靶序列編碼功能性突變基因或操縱子，或非功 能性基因或操縱子。如本文中使用的，術語「側翼序列」指在所討論的序列上遊或下遊的任何序列(例 如，對於基因A-B-C，基因B的側翼是A和C基因序列)。在一個實施方案中，輸入序列兩側 的側翼是同源盒。在另一個實施方案中，輸入序列和同源盒包含兩側側翼是填充序列的單 位。在一些實施方案中，側翼序列僅位於一側(3』或5』)，但在一個實施方案中，位於待側翼 序列的兩側。在一些實施方案中，側翼序列僅位於一側(3』或5』)，而在其他實施方案中， 位於待側翼序列的兩側。如本文中使用的，術語「填充序列」指位於同源盒側翼的任何額外的DNA(通常是 載體序列)。然而，該術語涵蓋了任何非同源的DNA序列。不受任何理論限制，填充序列為 起始DNA攝入的細胞提供了非關鍵性的(noncritical)靶。如本文中使用的，術語「染色體整合」指這樣的過程，在所述過程中輸入序列被引 入宿主細胞的染色體中。轉化DNA的同源區與染色體同源區匹配。然後，在雙交換(即，同 源重組)中，用輸入序列取代同源盒之間的序列。在本發明的一些實施方案中，DNA構建體 的失活染色體片段的同源部分與芽孢桿菌染色體的內源(indigenous)染色體區的同源區 側翼相匹配。然後，在雙交換(即，同源重組)中，用DNA構建體刪除內源染色體區。「同源重組」意指在相同或幾乎相同的核苷酸序列的位點處，兩個DNA分子或成對染色體之間DNA片段的交換。在一個實施方案中，染色體整合是同源重組。如本文中使用的，「同源序列」意指當優化比較比對時，與另一核酸或多肽序列具 有約 100%、約 99%、約 98%、約 97%、約 96%、約 95%、約 94%、約 93%、約 92%、約 91%、 約90 %、約88 %、約85 %、約80 %、約75 %或約70 %序列同一性的核酸或多肽序列。在一些 實施方案中，同源序列具有在約85%和約100%之間的序列同一性，而在其他實施方案中， 具有在約90%和約100%之間的序列同一性，在其他實施方案中，具有在約95%和約100% 之間的序列同一性。如本文中使用的，「胺基酸」指肽或蛋白質序列或其部分。術語「蛋白質」、「肽」和 「多肽」是可互換使用的。如本文中使用的，「目的蛋白」和「目的多肽」指期望的和/或待評估的蛋白質/多 肽。在一些實施方案中，目的蛋白在胞內表達，而在其他實施方案中，其是分泌多肽。在特 定實施方案中，這些酶包含本文描述的絲氨酸蛋白酶。在一些 實施方案中，目的蛋白是與信 號肽融合的分泌多肽(即，待分泌蛋白質的氨基端延伸)。幾乎所有的分泌蛋白都使用氨基 端的蛋白質延伸，其在跨膜定位和前體蛋白質轉運中發揮關鍵作用。該延伸是在膜轉運過 程中或之後立即被信號肽酶通過蛋白酶解切除的。如本文中使用的，術語「異源蛋白質」指不天然存在於宿主細胞內的蛋白質或多 肽。異源蛋白質的實例包含酶，例如水解酶，包含蛋白酶。在一些實施方案中，編碼蛋白質 的基因是天然存在的基因，而在其他實施方案中，使用了突變的和/或合成的基因。如本文中使用的，「同源蛋白質」指宿主細胞內天然的或天然存在的蛋白質或多 肽。在一些實施方案中，細胞是革蘭氏陽性細胞，而在其他實施方案中，細胞是芽孢桿菌宿 主細胞。在替代性實施方案中，同源蛋白是其他生物體產生的天然蛋白，該其他生物體包含 但不限於大腸桿菌、鏈黴菌、木黴菌和麴黴。本公開文本還提供了通過重組DNA技術產生同 源蛋白的宿主細胞。「宿主菌株」或「宿主細胞」指用於表達載體的合適的宿主，所述載體包含本發明一 些實施方案的DNA。如果酶在細胞中表達的水平高於其在相應野生型細胞中表達的水平，則酶在宿主 細胞中是「過表達的」。「原序列，，是在信號序列和成熟蛋白酶之間，對蛋白酶分泌所必需的胺基酸序列。 切除原序列可以獲得成熟活性蛋白酶。術語「信號序列」或「信號肽」指參與成熟或前體形式的蛋白質分泌的任何核苷酸 和/或胺基酸序列。該信號序列的定義是功能性的，意在包含由蛋白質基因N末端部分編 碼的所有胺基酸序列，所述序列參與蛋白質分泌的實施。它們通常，但不是總是連接到蛋白 質的N端部分或連接到前體蛋白質的N端部分。信號序列可以是內源的或外源的。信號序 列通常可以與蛋白質(例如蛋白酶)連接，或可以來自編碼另一分泌蛋白質的基因，一個示 例性外源信號序列包含來自枯草芽孢桿菌的信號序列的前七個胺基酸殘基，與來自遲緩芽 孢桿菌(BacilluslentusATCC 21536)的枯草桿菌蛋白酶的剩餘的信號序列融合。術語「成熟」形態的蛋白質或肽指最終功能形態的蛋白質或肽。例如，成熟形態的 對象蛋白酶至少包含SEQ ID NO 9中提出的胺基酸序列。術語「前體」形態的蛋白質或肽指具有與蛋白質氨基或羧基端有效連接的原序列的成熟形態的蛋白質。前體也可以具有與原序列氨基端有效連接的「信號」序列。前體還 可以具有參與翻譯後活性的其他多核苷酸(例如，切除多核苷酸產生成熟形態的蛋白質或 肽)。「天然存在的酶」指具有與天然發現的酶相同的、未修飾的胺基酸序列的酶。天然存在的酶包含天然的酶、在特定微生物體中天然表達或發現的酶。術語「源自」和「獲得自」不僅指由或可由所討論的生物菌株產生的蛋白酶，還指由 分離自此類菌株的DNA序列編碼、且在含有此類DNA序列的宿主生物中產生的蛋白酶。此 夕卜，該術語指由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼的蛋白酶，所述蛋白酶具有所討論 的蛋白酶已鑑定的特徵。出於示例，「源自鏈黴菌的蛋白酶」指具有鏈黴菌天然產生的蛋白 酶解活性的酶，以及這樣的絲氨酸蛋白酶，所述絲氨酸蛋白酶與鏈黴菌來源產生的酶相似， 但通過使用遺傳工程技術，由轉化了編碼所述絲氨酸蛋白酶的核酸的非鏈黴菌生物產生。該定義範圍內的「衍生物」通常保留了在野生型、天然或親本形式中觀察到的特徵 性蛋白酶解活性至下述程度使該衍生物可用於與所述野生型、天然或親本形式相似的目 的。絲氨酸蛋白酶的功能性衍生物涵蓋了天然存在的、合成的或重組產生的肽或肽片段，其 具有本發明絲氨酸蛋白酶的一般特徵。術語「功能性衍生物」指這樣的核酸衍生物，其具有編碼絲氨酸蛋白酶的核酸的功 能性特徵。編碼本發明絲氨酸蛋白酶的核酸的功能性衍生物涵蓋了天然存在的、合成的或 重組產生的核酸或核酸片段，並編碼本發明的特徵性絲氨酸蛋白酶。編碼本發明絲氨酸蛋 白酶的野生型核酸包含天然存在的等位基因，以及基於本領域已知的遺傳密碼簡併性的同 源物。在兩個核酸或多肽序列的情況下，術語「相同」指當以最高對應性比對時，兩條序 列中相同的殘基，使用下列序列比較或分析算法之一進行測量。術語「優化比對」指產生最高百分比同一性分數的比對。就兩個胺基酸、多核苷酸和/或基因序列(適當地)而言，「百分比同一性」、「百分 比胺基酸序列同一性」、「百分比基因序列同一性」和/或「百分比核酸/多核苷酸序列同一 性」指當兩條序列最優比對時，兩條序列中相同殘基的百分比。因此，80%胺基酸序列同一 性意指在兩條最優比對的多肽序列中，80 %的胺基酸是相同的。因此，在兩個核酸或多肽的情況下，短語「基本相同，，指與使用標準參數的程序或 算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)的參照序列相比，多核苷酸或多肽包含至少70%序列 同一性，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%和至 少99 %序列同一性。兩條多肽基本相同的一個指標是第一條多肽與第二條是免疫交叉反應 的。一般地，由於保守胺基酸取代而相異的多肽是免疫交叉反應的。因此，例如當兩條多肽 僅由於保守取代而不同時，多肽與第二多肽是基本相同的。兩條核酸序列基本相同的另一 指標是兩個分子在嚴格條件下彼此雜交(例如，在中度至高度嚴格度的範圍)。術語「分離的」或「純化的」指從其原始環境中移出的材料(例如，如果是天然存 在的，則指天然環境)。例如，如果材料在特定組合物中存在的濃度高於或低於其在天然存 在的或在野生型生物中存在的濃度，或者與在天然存在的或野生型生物中表達後通常不存 在的組分組合，則認為所述材料是「純化的」。例如，在活動物中存在的天然存在的多核苷酸 活多肽不是分離的，但與天然系統中共存的部分或全部材料分離的相同多核苷酸或多肽則是分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分，和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物 的一部分，只要此類載體或組合物不是其天然環境的一部分，則仍然是分離的。在一些實施 方案中，例如，如果核酸或蛋白質在凝膠電泳或印跡中基本產生一條帶，則認為所述核酸或 蛋白質是純化的。當用於指代DNA序列時，術語「分離的」指已經從天然遺傳環境中移出的DNA序列， 並因此不含其他外來的或不期望的編碼序列，其存在形式適合在遺傳工程改造的蛋白質產 生系統中使用。此類分離的分子是與其天然環境分離的分子，包含cDNA和基因組克隆。本 發明的分離的DNA分子不含其常規相關的其他基因，但可以包含天然存在的5』和3』非翻 譯區，例如啟動子和終止子。相關區域的鑑定對本領域技術人員是顯而易見的(參見例如， Dynan 和 Ti jan，Nature 316 :774_78 [1985])。術語「分離的 DNA 序列」也稱為「克隆的 DNA 序列」。當用於指代蛋白質時，術語「分離的」指在其天然環境以外的條件下存在的 蛋白 質。在一種形式中，分離的蛋白質基本不含其他蛋白質，特別是其他同源蛋白質。通過 SDS-PAGE確定時，分離的蛋白質純度可高於10%，高於20%，和高於30%。通過SDS-PAGE 確定時，發明的其他方面涵蓋了更高純度形式的蛋白質(即，純度高於約40%，高於約 60 %，高於約80 %，高於約90 %，高於約95 %，高於約97 %，甚至高於約99 % )。如本文中使用的，術語「功能性測定」指提供蛋白質活性的指示的測定。在特定的 實施方案中，該術語指分析蛋白質以其常見能力發揮作用的測定系統。例如，在酶的情況 下，功能性測定涉及確定酶在催化反應時的效率。如本文中使用的，術語「靶性質」指待改變的起始基因的性質。本發明並非意在限 定任何特定的靶性質。但是，在一些實施方案中，靶性質是基因產物的穩定性(例如，對變 性、蛋白酶解或其他降解因素的抗性)，而在其他實施方案中，改變了在產生宿主中的產生 水平。實際上，起始基因的任何性質均可考慮用於本發明。如本文中使用的，術語「性質」或其語法等價物在多肽的情況下，指多肽的可以選 擇或檢測的任何特徵或屬性。這些性質包含但不限於氧化穩定性、底物特異性、催化活性、 熱穩定性、鹼穩定性、PH活性譜、對蛋白酶解降解的抗性、KM、Kcat、Kcat/KM比、蛋白質摺疊、誘 導免疫應答、結合配體的能力、結合受體的能力、分泌能力、在細胞表面展示的能力、寡聚化 的能力、信號(發放)能力、刺激細胞增殖的能力、抑制細胞增殖的能力、誘導凋亡的能力、 提供磷酸化或糖基化修飾的能力、治療疾病的能力。術語「修飾的序列，，和「修飾的基因」在本文中可互換的使用，指在天然存在的核 酸序列中包含缺失、插入或間斷的序列。在一些實施方案中，修飾的序列的表達產物是截短 的蛋白質(例如，如果修飾是刪除或間斷序列)。在一些特定的實施方案中，截短的蛋白質 保留了生物學活性。在替代性實施方案中，修飾的序列的表達產物是延長的蛋白質(例如， 在核酸序列中包含插入片段的修飾作用)。在一些實施方案中，插入片段導致截短的蛋白質 (例如，當插入片段導致形成終止密碼子時)。因此，插入片段可以導致截短的蛋白質或延 長的蛋白質作為表達產物。術語「野生型序列」或「野生型基因」在本文中可互換的使用，指宿主細胞中天然 的或天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列指作為蛋白質工程計劃起點的目的 序列。野生型序列可以編碼同源或異源的蛋白。同源蛋白是宿主細胞無需幹預即產生的蛋白質。異源蛋白是宿主細胞沒有幹預就不產生的蛋白質。如本文中使用的，術語「抗體」指免疫球蛋白。抗體包含但不限於直接得自期望產 生抗體的任何物種的免疫球蛋白。此外，本發明包含修飾的抗體。該術語還指保留與完整 抗體所結合表位的結合能力的抗體片段，並包含多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、抗獨 特型(抗ID)抗體。抗體片段包含但不限於互補決定區(CDR)、單鏈片段可變區(scFv)、重 鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)。本發明也涵蓋了多克隆抗體和單克隆抗體。在一些實施 方案中，抗體是單克隆抗體。術語「氧化穩定的」指本發明的蛋白酶處於蛋白酶解、水解、清潔或其他本發明過 程中的常見條件下(例如，暴露於或接觸漂白劑或氧化劑)一段給定時間後，保留特定量的 酶活性。在一些實施方案中，蛋白酶在接觸漂白劑或氧化劑給定時間段後，例如至少1分 鍾、3分鐘、5分鐘、8分鐘、12分鐘、16分鐘、20分鐘等，保留至少約50%、約60%、約70%, 約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%或約 99%的 蛋白酶解活性。在一些實施方案中，如實施例所述測量穩定性。術語「螯合劑穩定的」指本發明的蛋白酶處於蛋白酶解、水解、清潔或其他本發明 過程中的常見條件下(例如，暴露於或接觸螯合劑)一段給定時間後，保留特定量的酶活 性。在一些實施方案中，蛋白酶在接觸螯合劑給定時間後，例如至少10分鐘、20分鐘、40分 鍾、60分鐘、100分鐘等，保留至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約 90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的蛋白酶解活性。術語「熱穩定的」和「熱穩定」指本發明的蛋白酶處於蛋白酶解、水解、清潔或其他 本發明過程中的常見條件下(例如，暴露於改變的溫度)一段給定時間後，保留特定量的酶 活性。改變的溫度包含升高或降低的溫度。在一些實施方案中，蛋白酶在暴露於改變的溫 度一段給定時間後，例如至少60分鐘、120分鐘、180分鐘、240分鐘、300分鐘等，保留至少 約 50%、約 60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%或約99%的蛋白酶解活性。在氧化、螯合劑、熱和/或pH穩定性蛋白酶的情況下，術語「增強的穩定性」指與 其他的絲氨酸蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，隨時間流逝保留更高 的蛋白酶解活性。在氧化、螯合劑、熱和/或pH穩定性蛋白酶的情況下，術語「降低的穩定性」指與 其他的絲氨酸蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，隨時間流逝保留更低 的蛋白酶解活性。術語「清潔活性」指蛋白酶在蛋白酶解、水解、清潔或本發明的其他過程中常見條 件下獲得的清潔性能。在一些實施方案中，通過使用多種涉及酶敏感性汙漬(例如，草、 血、奶、或卵蛋白)的清潔測定來確定清潔性能，通過將汙漬置於標準洗滌條件後，進行多 種層析、分光光度或其他定量方法來確定。示例性測定包含但不限於在WO 99/34011和 U. S. Pat. 6，605，458中描述的(均引入本文作為參考)，以及實施例中包含的那些方法。術語蛋白酶的「清潔有效量」指在特定清潔組合物中實現預 期酶活性水平的上述 蛋白酶的量。此類有效量易於為本領域技術人員確定，並取決於多種因素，例如所使用的 特定蛋白酶、清潔用途、清潔組合物的特定組成，以及需要液體組合物還是乾燥組合物(例 如，顆粒狀、條形)。
如本文中使用的，術語「清潔輔助材料」意指為期望的特定類型的清潔組合物和產 品形式(例如，液體、顆粒、粉末、條形、糊狀、片劑、凝膠或泡沫組合物)而選擇的任何液體、 固體或氣體材料，所述材料與組合物中使用的蛋白酶相容。在一些實施方案中，顆粒狀組合 物是「緻密」形式的，而在其他實施方案中，液體組合物是「濃縮」形式的。在清潔活性的情況下，術語「增強的性能」指通過標準洗滌循環和/或多個洗滌循 環後的常規評估，確定對一些酶敏感性汙漬(如卵、奶、草或血)提高的或增加的清潔活性。在清潔活性的情況下，術語「降低的性能」指通過標準洗滌循環後的常規評估，確 定對一些酶敏感性汙漬(如卵、奶、草或血)降低的或減少的清潔活性。在清潔活性的情況下，術語「相當的性能」指比較的枯草桿菌蛋白酶(如，市售 蛋白酶)的至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%的清潔活 性，所述枯草桿菌蛋白酶包含但不限於0PTIMASE 蛋白酶(Genencor) 、PURAFECT 蛋白酶 (Genencor)、SAVINASE 蛋白酶(Novozymes)、BPN』-變體(參見例如，美國專利號 34，606)、 RELASE 、DURAZYME 、EVERLASE 、KANNASE 蛋白酶(Novozymes)、MAXACAL 、MAXAPEM 、 PR0PERASE 蛋白酶(Genencor ；還參見，美國專利號34，606，美國專利號5，700，676 ； 5,955, 340 ；6, 312, 936 ；6, 482, 628),和遲緩芽孢桿菌變體蛋白酶產品(例如，在WO 92/21760、WO 95/23221和/或WO 97/07770 (Henkel)中描述的)。示例性枯草桿菌蛋白 酶變體包含但不限於在等價於 BPN』 的 76、101、103、104、120、159、167、170、194、195、217、 232、235、236、245、248和/或252位的殘基位置上具有取代或缺失的對象。可以通過將本 發明的蛋白酶與上述枯草桿菌蛋白酶在多個清潔測定中進行比較，來確定清潔性能，所述 清潔測定涉及酶敏感性汙漬(如，草、血或奶)，在標準洗滌循環條件後，通過常規的分光光 度法或分析方法來測定。如本文中使用的，「低洗滌劑濃度」系統包含洗滌劑，其中洗滌水中存在低於約 SOOppm的洗滌劑組分。通常認為日本洗滌劑是低洗滌劑濃度系統，其通常在洗滌水中含有 約667ppm的洗滌劑組分。如本文中使用的，「中洗滌劑濃度」系統包含洗滌劑，其中洗滌水中存在約SOOppm 至約2000ppm的洗滌劑組分。通常認為北美洗滌劑是中洗滌劑濃度系統，其通常在洗滌水 中含有約975ppm的洗滌劑組分。巴西洗滌劑通常在洗滌水中含有約1500ppm的洗滌劑組 分。如本文中使用的，「高洗滌劑濃度」系統包含洗滌劑，其中洗滌水中存在大於約 2000ppm的洗滌劑組分。通常認為歐洲洗滌劑是高洗滌劑濃度系統，其通常在洗滌水中含有 約3000-8000ppm的洗滌劑組分。如本文中使用的，「紡織品清潔組合物」包含手洗和機洗洗滌劑組合物，包含洗衣 添加組合物和適用於浸泡和/或預處理汙損紡織品(例如，衣物、亞麻和其他紡織材料)的 組合物。如本文中使用的，「非紡織品清潔組合物」包含非紡織(即，織物(fabric))表面清 潔組合物，包含但不限於餐具洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、潔齒組合物和個人清潔組合 物。本文中，清潔組合物的「緻密」形式最好通過密度來反映，對組合物而言，通過無機 填充鹽的量來反映。無機填充鹽是粉末形態的洗滌劑組合物的常規成分。在常規的洗滌劑組合物中，填充鹽以顯著的量存在，一般為總組合物重量的17-35%。相反，在緻密組合物 中，填充鹽以不超過總組合物15 %的量存在。在一些實施方案中，填充鹽存在的量不超過組 合物重量的10%或5%。在一些實施方案中，無機填充鹽選自硫酸和鹽酸的鹼金屬鹽和鹼 土金屬鹽。示例性的填充鹽是硫酸鈉。II.絲氨酸蛋白酶和編碼絲氨酸蛋白酶的核酸本發明提供分離的多核苷酸，其編碼胺基酸序列、編碼蛋白酶。在一些實施方案中，這些多核苷酸編碼的多肽包含與SEQ ID NO :3、8和11所示的胺基酸序列至少65%氨 基酸序列同一性，至少70%胺基酸序列同一性，至少75%胺基酸序列同一性，至少80%氨 基酸序列同一性，至少85%胺基酸序列同一性，至少90%胺基酸序列同一性，至少92%氨 基酸序列同一性，至少95%胺基酸序列同一性，至少97%胺基酸序列同一性，至少98%氨 基酸序列同一性，和至少99%胺基酸序列同一性(例如，至少一部分由多核苷酸編碼的氨 基酸序列具有蛋白酶解活性，包含成熟的蛋白酶催化底物肽鍵水解)，和/或在確定的洗滌 條件下，顯示出可比較的或增強的洗滌性能。在一些實施方案中，通過比對序列，直接比較兩條分子之間的序列信息，計算兩條 比對序列之間匹配的實際數量，除以較短序列的長度，再將結果乘以100，來確定百分比同 一性(胺基酸序列、核酸序列、基因序列)。在這類分析中可以方便的使用可獲得的計算機 程序，例如上文描述的。用於確定核苷酸序列同一性的程序可獲得自Wisconsin序列分析 包，版本 8 (Genetics Computer Group, Madison, WI)，例如 BESTFIT、FASTA 和 GAP 程序，均 依賴於Smith和Waterman算法。使用產生商推薦的預設參數和上文所述Wisconsin序列 分析包中的描述，可以方便的使用這些程序。適合確定序列相似性的算法的實例是BLAST算法，其描述在Altschul等人， J. Mol. Biol.，215 =403-410(1990)中。用於實施BLAST分析的軟體是公眾可獲得的，通過 國立生物技術信息中心(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)。該算法首先涉及鑑別高評分 序列對(HSP)，通過在檢索序列中鑑別長度W的短詞，所述短詞當與資料庫序列中相同長度 的詞比對時，匹配或者滿足一些正值的閾值分數T。這些初始的鄰接詞命中(neighborhood word hits)作為尋找含有它們的更長HSP的起點起作用。分別沿著進行比對的兩條序列的 雙側方向延伸字符命中(word hits)，儘可能的可以增加累積比對分數。當出現以下情況時 終止字符命中的延伸累積比對分數從最大實際值下降了數量X ；累積比對分數成為0或負 值；或達到任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLAST程 序使用預設的字符長(W)為11，BL0SUM62評分矩陣(參見，Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))比對(B)為 50，期望值(E)為 10，M，5，N，-4，以及 比對兩條鏈。然後，BLAST算法在兩條序列之間實施相似度的統計學分析(參見例如，Karlin和 Altschul,Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787 [1993])。BLAST 算法提供的一種相似 度測量是最小總概率(smallest sumprobability) (P (N))，其提供了在兩條核苷酸或氨基 酸序列之間可以偶然發生匹配的概率的指標。例如，如果在比對的測試核酸和絲氨酸蛋白 酶核酸之間的最小總概率小於約0. 1，小於約0. 01，或小於約0. 001，則認為核酸與本發明 的絲氨酸蛋白酶核酸是相似的。在測試核酸編碼絲氨酸蛋白酶多肽的情況下，如果比對導 致最小總概率小於約0. 5 (例如，小於約0. 2)，則認為其與特定的絲氨酸蛋白酶核酸相似。
在本發明的一些實施方案中，通過BLAST和蛋白質翻譯序列工具分析序列。在一 些實施方案中，使用Basic BLAST 2. 0版。程序選擇「BlastX」，資料庫選擇「nr」。使用標
準/預設參數值。在一些實施方案中，本發明涵蓋了長度為約1389鹼基對的SEQ IDNO 1所示的多 核苷酸，其編碼本文描述的1AG3蛋白酶。在SEQ ID NO 1中，以粗體顯示起始密碼子和終 止密碼子，以下劃線顯示潛在的核糖體結合位點。在本發明的另一個實施方案中，編碼這些 胺基酸序列的多核苷酸包含1362鹼基對部分(SEQ ID NO 2的殘基1-1362)，如果表達，認 為將編碼信號序列(SEQ ID NO :2的核苷酸1-75)(即，SEQ ID NO 4)(其編碼SEQ ID NO 3 的胺基酸 1-25 (即，SEQ ID NO :5))、N-端原序列(SEQID NO 2 的殘基 76-591 (SEQ ID NO: 6)，編碼SEQ ID NO :3的胺基酸殘基26-197)(即，SEQ ID NO :7)、成熟蛋白酶序列(SEQ ID NO :2的核苷酸592-1359，其編碼SEQ ID NO :3的胺基酸殘基198-453 (SEQ ID NO :9的氨基 酸殘基1-256))。可選的，信號肽、N-端原序列和成熟絲氨酸蛋白酶序列相對於SEQ ID NO 9的 成熟蛋白酶的胺基酸殘基進行編號，即編號為1-256的(S卩，信號肽殘基-198至-173)， N-端原序列(殘基-172至-1)，成熟絲氨酸蛋白酶序列(殘基1-256)。在本發明的另一 個實施方案中，編碼具有蛋白酶解活性的胺基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID N0:2核苷酸 1-1362的部分的核苷酸序列，編碼信號肽和前體蛋白酶。在本發明的另一個實施方案中，編 碼胺基酸序列的多核苷酸包含編碼前體鏈黴菌蛋白酶(SEQ ID NO: 11)的多核苷酸(SEQ ID NO 10)的核苷酸1-1287的部分的序列。在另一個實施方案中，編碼胺基酸序列的多核苷 酸包含編碼成熟鏈黴菌蛋白酶(SEQ ID NO 9)的多核苷酸(SEQ ID NO 8)的核苷酸1-768 的序列。下文提供了這些序列SEQ ID NO=I提供了完整的1AG3核苷酸序列，其包含側翼區1 GACAGC GAGGAG ACCCCT CatgCA CCGCAG AOGOGG AGOGCT ATTOGC OGGCGC CGTGGCCTGTCG CTCCTC TGGGGA GTACGT GGOGTC TGCGCC TCGCGA TAAGCG GCOGOG GCACCG61 GATAGC OGCCCT GACGAT OGCCGC CGOGCC GGCCAC OGCCGG ACCGGC CCTCGC CCCGCCCTATCG GCGGGA CTGCTA GCGGOG GCGCGG COGGTG GCGGCC TGGCCG GGAGOG GGGOGG121 ACCGGC CCAGGA GACGGC GGCCCA GGAGAT CCCTGC OGGCAT GCTGCA GGCCAT GCAGCGTGGCCG GGTCCT CTGCCG CCGGGT CCTCTA GGGACG GCOGTA CGAOGT CCGGTA CGTOGC181 TGATCT OGGCCT CACOGA GCAGCA GGCCGA GGAGCG OGTGGC CAAOGA GTACCA AGCGGGACTAGA GCOGGA GTGGCT OGTCGT CCGGCT CCTOGC GCACOG GTTGCT CATGGT TOGCCC241 CCAGCT GGAGCC AOGGCT GCGGGC GCAATT GGCGGA CACCTT CGCOGG TTCCTG GACCAGGGTOGA CCTCGG TGCOGA OGCCOG CGTTAA COGCCT GTGGAA GOGGCC AAGGAC CTGGTC301 GGGOGA GACCGC CGAGCT GGTCGT GGCCAC CACOGA CCGCGA GCAGCT ACOGGC GCTGACCCCGCT CTGGOG GCTOGA CCAGCA CCGGTG GTGGCT GGOGCT CGTOGA TGGCOG CGACTG361 GGCGGC GGGCGT GOGGGC CACCGT GGCCGA GCACAG CCTGTC CGAGCT OGAGGC CGTGAACOGCCG CCOGCA CGCCCG GTGGCA CCGGCT CGTGTC GGACAG GCTOGA GCTCOG GCACTT421 GGAGAC ACTGGA CGAGGC OGCCGA GGAGCA CGCCAC GACCGA GGCGCC OGTGTG GTAOGTCCTCTG TGACCT GCTCCG GCGGCT CCTCGT GOGGTG CTGGCT COGOGG GCACAC CATGCA481 GGATGT CAOGAG CAACAC GGTCAT CGTGCA CGCCCA GGACGT GACGGC OGGGOG CGACTTCCTACA GTGCTC GTTGTG CCAGTA GCACGT GOGGGT CCTGCA CTGCCG GCCCGC GCTGAA
541 CGTCTC GGCCGC GGGOGT GGACCC CGCCGC GGTCCA OGTGCT GOGCTC GGACGA GCAGCCGCAGAG CCGGOG CCCGCA CCTGGG GOGGOG CCAGGT GCACGA CGCGAG CCTGCT CGTOGG601 GOGGCC TTACCA CGACCT GCGGGG TGGGGA GGCGTA CTACAT GGGCAG OGGAGG GOGCTGCGCOGG AATGGT GCTGGA OGCCCC ACCCCT COGCAT GATGTA CCCGTC GCCTCC CGCGAC
661 CTCGGT OGGCTT CTCOGT TCGCOG CGGAAC TCAGGC GGGCTT CGCGAC OGOGGG TCACTGGAGCCA GCOGAA GAGGCA AGOGGC GCCTTG AGTCCG CCOGAA GOGCTG GCGCCC AGTGAC721 CGGCCG GGTCGG CACCAC CACAOG GGGCTT CAACCA GGTGGC GCAGGG CACCTT CCAGGGGCCGGC CCAGCC GTGGTG GTGTGC CCCGAA GTTGGT CCACOG CGTCCC GTGGAA GGTCCC781 CTCCAT CTTCCC CGGGCG OGACAT GGGCTG GGTOGC GGTCAA CTCCAA CTGGAA CACCACGAGGTA GAAGGG GCCOGC GCTGTA CCCGAC CCAGCG CCAGTT GAGGTT GACCTT GTGGTG841 CCCCTT OGTCOG CGGCCA GGGGGG CGCGAA CGTGAC GGTGGC GGGTTC GCAGCA GGCTCCGGGGAA GCAGGC GCCGGT CCCCCC GOGCTT GCACTG CCACOG CCCAAG OGTCGT COGAGG901 GGTOGG CTCCTC GGTGTG CCGTTC CGGCTC CACCAC OGGCTG GCACTG OGGCAC CATCCACCAGCC GAGGAG CCACAC GGCAAG GCCGAG GTGGTG GCOGAC CGTGAC GCOGTG GTAGGT961 GCAGCA CAACAC CTCGGT GCGCTA TCCGGA GGGCAC CATCAG CGGAGT GACCAG GACCTCCGTOGT GTTGTG GAGCCA OGOGAT AGGCCT CCCGTG GTAGTC GCCTCA CTGGTC CTGGAG1021 GGTGTG OGCCGA ACCOGG TGACTC CGGCGG CGCCTA CATCTC CGGGAA CCAGGC CCAGGGCCACAC GCGGCT TGGGCC ACTGAG GCCGCC GOGGAT GTAGAG GCCCTT GGTCOG GGTCCC1081 CGTGAC CTCCGG CGGCTC GGGCAA CTGCOG CACOGG TGGCAC CACCTA CCACCA GCCGATGCACTG GAGGCC GCCGAG CCOGTT GAOGGC GTGGCC ACOGTG GTGGAT GGTGGT CGGCTA1141 CAACCC GCTGCT GGCACA GTGGAA CCTGAC CCTOGT GACCAC GGGCAA OGGCGG CGACCCGTTGGG OGACGA COGTGT CACCTT GGACTG GGAGCA CTGGTG CCCGTT GCOGCC GCTGGG1201 GGGOGA CCCCGG TGACCC GGGCGA CCCGGG TGAGCC OGGCGG CAGCTG GTCCGC CGGGACCCCGCT GGGGCC ACTGGG CCOGCT GGGCCC ACTOGG GCOGCC GTCGAC CAGGOG GCCCTG1261 CAGTTA OGOGGT CGGOGA CCGGGT GACCTA CGGOGG OGOGGA GTACCG CTGCCT GCAGGCGTCAAT GCGCCA GCCGCT GGCCCA CTGGAT GCCGCC GCGCCT CATGGC GAOGGA CGTCCG1321 CCAOGT OGCCCA GTCOGG CTGGAC GCCCCC GAACAC GCCCGC CCTCTG GCAGOG CGTGtgGGTGCA GCGGGT CAGGCC GACCTG CGGGGG CTTGTG OGGGOG GGAGAC OGTCGC GCACAC1381 a CACGA CCA(SEQ ID NO 1)TGTGCT GGT在上述序列中，推定的核糖體結合位點是下劃線的。起始和終止密碼子以粗體顯 示。下文SEQ ID NO 2提供了 1AG3蛋白酶的多核苷酸序列/1AG3蛋白酶的開放閱讀框1 ATG CACCGCA GACGCGGAGC GCTATTCGCC GGCGCCGTGG CGATAGCCGCTACGTGGCGT CTGCGCCTCG CGATAAGCGG CCGCGGCACC GCTATCGGCG51 CCTGACGATC GCCGCCGCGC CGGCCACCGC CGGACCGGCC CTCGCCCCGCGGACTGCTAG CGGCGGCGCG GCCGGTGGCG GCCTGGCCGG GAGCGGGGCG101 CACCGGCCCA GGAGACGGCG GCCCAGGAGA TCCCTGCCGG CATGCTGCAGGTGGCCGGGT CCTCTGCCGC CGGGTCCTCT AGGGACGGCC GTACGACGTC
151 GCCATGCAGC GTGATCTCGG CCTCACCGAGCAGCAGGCCG AGGAGCGCGTCGGTACGTCG CACTAGAGCC GGAGTGGCTCGTCGTCCGGC TCCTCGCGCA201 GGCCAACGAG TACCAAGCGG GCCAGCTGGAGCCACGGCTG CGGGCGCAATCCGGTTGCTC ATGGTTCGCC CGGTCGACCTCGGTGCCGAC GCCCGCGTTA251 TGGCGGACAC CTTCGCCGGT TCCTGGACCAGGGGCGAGAC CGCCGAGCTGACCGCCTGTG GAAGCGGCCA AGGACCTGGTCCCCGCTCTG GCGGCTCGAC301 GTCGTGGCCA CCACCGACCG CGAGCAGCTACCGGCGCTGA CGGCGGCGGGCAGCACCGGT GGTGGCTGGC GCTCGTCGATGGCCGCGACT GCCGCCGCCC351 CGTGCGGGCC ACCGTGGCCG AGCACAGCCTGTCCGAGCTC GAGGCCGTGAGCACGCCCGG TGGCACCGGC TCGTGTCGGACAGGCTCGAG CTCCGGCACT401 AGGAGACACT GGACGAGGCC GCCGAGGAGCACGCCACGAC CGAGGCGCCCTCCTCTGTGA CCTGCTCCGG CGGCTCCTCGTGCGGTGCTG GCTCCGCGGG451 GTGTGGTACG TGGATGTCAC GAGCAACACGGTCATCGTGC ACGCCCAGGACACACCATGC ACCTACAGTG CTCGTTGTGCCAGTAGCACG TGCGGGTCCT501 CGTGACGGCC GGGCGCGACT TCGTCTCGGCCGCGGGCGTG GACCCCGCCGGCACTGCCGG CCCGCGCTGA AGCAGAGCCGGCGCCCGCAC CTGGGGCGGC551 CGGTCCACGT GCTGCGCTCG GACGAGCAGCCGCGGCCTTA CCACGACCTGGCCAGGTGCA CGACGCGAGC CTGCTCGTCGGCGCCGGAAT GGTGCTGGAC601 CGGGGTGGGG AGGCGTACTA CATGGGCAGCGGAGGGCGCT GCTCGGTCGGGCCCCACCCC TCCGCATGAT GTACCCGTCGCCTCCCGCGA CGAGCCAGCC651 CTTCTCCGTT CGCCGCGGAA CTCAGGCGGGCTTCGCGACC GCGGGTCACTGAAGAGGCAA GCGGCGCCTT GAGTCCGCCC GAAGCGCTGG CGCCCAGTGA701 GCGGCCGGGT CGGCACCACC ACACGGGGCTTCAACCAGGT GGCGCAGGGCCGCCGGCCCA GCCGTGGTGG TGTGCCCCGAAGTTGGTCCA CCGCGTCCCG751 ACCTTCCAGG GCTCCATCTT CCCCGGGCGCGACATGGGCT GGGTCGCGGTTGGAAGGTCC CGAGGTAGAA GGGGCCCGCGCTGTACCCGA CCCAGCGCCA801 CAACTCCAAC TGGAACACCA CCCCCTTCGTCCGCGGCCAG GGGGGCGCGAGTTGAGGTTG ACCTTGTGGT GGGGGAAGCAGGCGCCGGTC CCCCCGCGCT851 ACGTGACGGT GGCGGGTTCG CAGCAGGCTCCGGTCGGCTC CTCGGTGTGCTGCACTGCCA CCGCCCAAGC GTCGTCCGAGGCCAGCCGAG GAGCCACACG901 CGTTCCGGCT CCACCACCGG CTGGCACTGCGGCACCATCC AGCAGCACAAGCAAGGCCGA GGTGGTGGCC GACCGTGACGCCGTGGTAGG TCGTCGTGTT951 CACCTCGGTG CGCTATCCGG AGGGCACCATCAGCGGAGTG ACCAGGACCTGTGGAGCCAC GCGATAGGCC TCCCGTGGTAGTCGCCTCAC TGGTCCTGGA1001 CGGTGTGCGC CGAACCCGGT GACTCCGGCGGCGCCTACAT CTCCGGGAACGCCACACGCG GCTTGGGCCA CTGAGGCCGCCGCGGATGTA GAGGCCCTTG1051 CAGGCCCAGG GCGTGACCTC CGGCGGCTCGGGCAACTGCC GCACCGGTGGGTCCGGGTCC CGCACTGGAG GCCGCCGAGCCCGTTGACGG CGTGGCCACC
1101 CACCACCTAC CACCAGCCGA TCAACCCGCT GCTGGCACAG TGGAACCTGAGTGGTGGATG GTGGTCGGCT AGTTGGGCGA CGACCGTGTC ACCTTGGACT1151 CCCTCGTGAC CACGGGCAAC GGCGGCGACC CGGGCGACCC CGGTGACCCGGGGAGCACTG GTGCCCGTTG CCGCCGCTGG GCCCGCTGGG GCCACTGGGC1201 GGCGACCCGG GTGAGCCCGG CGGCAGCTGG TCCGCCGGGA CCAGTTACGCCCGCTGGGCC CACTCGGGCC GCCGTCGACC AGGCGGCCCT GGTCAATGCG 1251 GGTCGGCGAC CGGGTGACCT ACGGCGGCGC GGAGTACCGC TGCCTGCAGGCCAGCCGCTG GCCCACTGGA TGCCGCCGCG CCTCATGGCG ACGGACGTCC1301 CCCACGTCGC CCAGTCCGGC TGGACGCCCC CGAACACGCC CGCCCTCTGGGGGTGCAGCG GGTCAGGCCG ACCTGCGGGG GCTTGTGCGG GCGGGAGACC1351 CAGCGCGTGt GA (SEQ ID NO 2)GTCGCGCACA CTSEQ ID NO 3提供了 1AG3蛋白酶的多肽序列1 MHRRRGALFA GAVAIAALTI AAAPA TAGPA LAPPPAQETA AQEIPAGMLQ51 AMQRDLGLTE QQAEERVANE YQAGQLEPRL RAQLADTFAG SffTRGETAEL101 VYATTDREQL PALTAAGVRA TVAEHSLSEL EAVKETLDEA AEEHATTEAP151 VffYVDVTSNT VIVHAQDVTA GRDFVSAAGV DPAAVHVLRS DEQPRPY HDl·201 R6GEAYYMGS GGRCSVGFSV RRGTQAGFAT A6HCGRVGTT TRGFNQVAQG251 TFQGSIFPGR OMGWVAVNSN WNTTPFVRGQ GGANVTVAGS QQAPVGSSVC301 RSGSTTGWHC GTIQQHNTSV RYPEGTISGV TRTSVCAEPG DSGGAYISGN351 QAQGVTSGGS GNCRTGGTTY HQPINPLLAQ WNLTLVTTGN GGDPGDPGDP401 GDPGEPGGSW SAGTSYAVGD RVTYGGAEYR CLQAHVAQSG WTPPNTPALW451 QRV (SEQ ID NO 3)在上文顯示的SEQ ID NO :3中，以雙下劃線顯示預測的信號肽，以單下劃線表示預 測的原序列，以粗體顯示預測的成熟鏈。SEQ ID NO 4提供了 1AG3信號序列的多核苷酸序列1 ATGCACCGCA GACGCGGAGC GCTATTCGCC GGCGCCGTGG CGATAGCCGCTACGTGGCGT CTGCGCCTCG CGATAAGCGG CCGCGGCACC GCTATCGGCG51 CCTGACGATC GCCGCCGCGC CGGCC (SEQ ID NO 4)GGACTGCTAG CGGCGGCGCG GCCGGSEQ ID NO 5 (MHRRRGALFA GAVAIAALTI AAAPA)是 SEQ IDNO :4 的信號序列的相應
多肽序列。SEQ ID NO 6提供了 1AG3N-端原序列的多核苷酸序列1 ACCGCCGGAC CGGCCCTCGC CCCGCCACCG GCCCAGGAGA CGGCGGCCCATGGCGGCCTG GCCGGGAGCG GGGCGGTGGC CGGGTCCTCT GCCGCCGGGT51 GGAGATCCCT GCCGGCATGC TGCAGGCCAT GCAGCGTGAT CTCGGCCTCACCTCTAGGGA CGGCCGTACG ACGTCCGGTA CGTCGCACTA GAGCCGGAGT101 CCGAGCAGCA GGCCGAGGAG CGCGTGGCCA ACGAGTACCA AGCGGGCCAGGGCTCGTCGT CCGGCTCCTC GCGCACCGGT TGCTCATGGT TCGCCCGGTC
151 CTGGAGCCAC GGCTGCGGGC GCAATTGGCG GACACCTTCG CCGGTTCCTGGACCTCGGTG CCGACGCCCG CGTTAACCGC CTGTGGAAGC GGCCAAGGAC201 GACCAGGGGC GAGACCGCCG AGCTGGTCGT GGCCACCACC GACCGCGAGCCTGGTCCCCG CTCTGGCGGC TCGACCAGCA CCGGTGGTGG CTGGCGCTCG251 AGCTACCGGC GCTGACGGCG GCGGGCGTGC GGGCCACCGT GGCCGAGCACTCGATGGCCG CGACTGCCGC CGCCCGCACG CCCGGTGGCA CCGGCTCGTG301 AGCCTGTCCG AGCTCGAGGC CGTGAAGGAG ACACTGGACG AGGCCGCCGATCGGACAGGC TCGAGCTCCG GCACTTCCTC TGTGACCTGC TCCGGCGGCT351 GGAGCACGCC ACGACCGAGG CGCCCGTGTG GTACGTGGAT GTCACGAGCACCTCGTGCGG TGCTGGCTCC GCGGGCACAC CATGCACCTA CAGTGCTCGT401 ACACGGTCAT CGTGCACGCC CAGGACGTGA CGGCCGGGCG CGACTTCGTCTGTGCCAGTA GCACGTGCGG GTCCTGCACT GCCGGCCCGC GCTGAAGCAG451 TCGGCCGCGG GCGTGGACCC CGCCGCGGTC CACGTGCTGC GCTCGGACGAAGCCGGCGCC CGCACCTGGG GCGGCGCCAG GTGCACGACG CGAGCCTGCT501 GCAGCCGCGG CCTTAC (SEQ ID NO 6)CGTCGGCGCC GGAATGSEQ ID NO -J提供了 SEQ ID NO 6所示的N_端原序列的相應多肽序列。1 TAGPALAPPP AQETAAQEIP AGMLQAMQRD LGLTEQQAEE RVANEYQAGQ51 LEPRLRAQLA DTFAGSffTRG ETAELVVATT DREQLPALTA AGVRATVAEH101 SLSELEAVKE TLDEAAEEHA TTEAPVffYVD VTSNTVIVHA QDVTAGRDFV151 SAAGVDPAAV HVLRSDEQPR PY (SEQ ID NO 7)SEQ ID NO 8提供了編碼成熟蛋白酶序列的多核苷酸序列1 CACGACCTGC GGGGTGGGGA GGCGTACTAC ATGGGCAGCG GAGGGCGCTGGTGCTGGACG CCCCACCCCT CCGCATGATG TACCCGTCGC CTCCCGCGAC51 CTCGGTCGGC TTCTCCGTTC GCCGCGGAAC TCAGGCGGGC TTCGCGACCGGAGCCAGCCG AAGAGGCAAG CGGCGCCTTG AGTCCGCCCG AAGCGCTGGC101 CGGGTCACTG CGGCCGGGTC GGCACCACCA CACGGGGCTT CAACCAGGTGGCCCAGTGAC GCCGGCCCAG CCGTGGTGGT GTGCCCCGAA GTTGGTCCAC151 GCGCAGGGCA CCTTCCAGGG CTCCATCTTC CCCGGGCGCG ACATGGGCTGCGCGTCCCGT GGAAGGTCCC GAGGTAGAAG GGGCCCGCGC TGTACCCGAC201 GGTCGCGGTC AACTCCAACT GGAACACCAC CCCCTTCGTC CGCGGCCAGGCCAGCGCCAG TTGAGGTTGA CCTTGTGGTG GGGGAAGCAG GCGCCGGTCC
251 GGGGCGCGAA CGTGACGGTG GCGGGTTCGC AGCAGGCTCC GGTCGGCTCCCCCCGCGCTT GCACTGCCAC CGCCCAAGCG TCGTCCGAGG CCAGCCGAGG301 TCGGTGTGCC GTTCCGGCTC CACCACCGGC TGGCACTGCG GCACCATCCAAGCCACACGG CAAGGCCGAG GTGGTGGCCG ACCGTGACGC CGTGGTAGGT351 GCAGCACAAC ACCTCGGTGC GCTATCCGGA GGGCACCATC AGCGGAGTGACGTCGTGTTG TGGAGCCACG CGATAGGCCT CCCGTGGTAG TCGCCTCACT401 CCAGGACCTC GGTGTGCGCC GAACCCGGTG ACTCCGGCGG CGCCTACATC
GGTCCTGGAG CCACACGCGG CTTGGGCCAC TGAGGCCGCC GCGGATGTAG451 TCCGGGAACC AGGCCCAGGG CGTGACCTCC GGCGGCTCGG GCAACTGCCGAGGCCCTTGG TCCGGGTCCC GCACTGGAGG CCGCCGAGCC CGTTGACGGC501 CACCGGTGGC ACCACCTACC ACCAGCCGAT CAACCCGCTG CTGGCACAGTGTGGCCACCG TGGTGGATGG TGGTCGGCTA GTTGGGCGAC GACCGTGTCA551 GGAACCTGAC CCTCGTGACC ACGGGCAACG GCGGCGACCC GGGCGACCCCCCTTGGACTG GGAGCACTGG TGCCCGTTGC CGCCGCTGGG CCCGCTGGGG 601 GGTGACCCGG GCGACCCGGG TGAGCCCGGC GGCAGCTGGT CCGCCGGGACCCACTGGGCC CGCTGGGCCC ACTCGGGCCG CCGTCGACCA GGCGGCCCTG651 CAGTTACGCG GTCGGCGACC GGGTGACCTA CGGCGGCGCG GAGTACCGCTGTCAATGCGC CAGCCGCTGG CCCACTGGAT GCCGCCGCGC CTCATGGCGA701 GCCTGCAGGC CCACGTCGCC CAGTCCGGCT GGACGCCCCC GAACACGCCCCGGACGTCCG GGTGCAGCGG GTCAGGCCGA CCTGCGGGGG CTTGTGCGGG751 GCCCTCTGGC AGCGCGTG (SEQ ID NO 8)CGGGAGACCG TCGCGCAC下文SEQ ID N0:9提供了成熟1AG3蛋白酶的胺基酸序列。在該序列中，以粗體顯
示催化三聯體。1 HDLRGGEAYY MGSGGRCSVG FSVRRGTQAG FATAG η CGRV GTTTRGFNQV51 AQGTFQGSIF PGR D MGffVAV NSNWNTTPFV RGQGGANVTV AGSQQAPVGS101 SVCRSGSTTG WHCGTIQQHN TSVRYPEGTI SGVTRTSVCA EPGD S GGAYI151 SGNQAQGVTS GGSGNCRTGG TTYHQPINPL LAQffNLTLVT TGNGGDP⑶P201 GDP⑶PGEPG GSffSAGTSYA V⑶RVTYGGA EYRCLQAHVA QSGffTPPNTP251 ALffQRV (SEQ ID NO 9)下文SEQ ID NO 10提供了 1AG3前體蛋白酶的多核苷酸序列。1 ACCGCCGGAC CGGCCCTCGC CCCGCCACCG GCCCAGGAGA CGGCGGCCCATGGCGGCCTG GCCGGGAGCG GGGCGGTGGC CGGGTCCTCT GCCGCCGGGT51 GGAGATCCCT GCCGGCATGC TGCAGGCCAT GCAGCGTGAT CTCGGCCTCACCTCTAGGGA CGGCCGTACG ACGTCCGGTA CGTCGCACTA GAGCCGGAGT101 CCGAGCAGCA GGCCGAGGAG CGCGTGGCCA ACGAGTACCA AGCGGGCCAGGGCTCGTCGT CCGGCTCCTC GCGCACCGGT TGCTCATGGT TCGCCCGGTC151 CTGGAGCCAC GGCTGCGGGC GCAATTGGCG GACACCTTCG CCGGTTCCTGGACCTCGGTG CCGACGCCCG CGTTAACCGC CTGTGGAAGC GGCCAAGGAC201 GACCAGGGGC GAGACCGCCG AGCTGGTCGT GGCCACCACC GACCGCGAGCCTGGTCCCCG CTCTGGCGGC TCGACCAGCA CCGGTGGTGG CTGGCGCTCG251 AGCTACCGGC GCTGACGGCG GCGGGCGTGC GGGCCACCGT GGCCGAGCACTCGATGGCCG CGACTGCCGC CGCCCGCACG CCCGGTGGCA CCGGCTCGTG301 AGCCTGTCCG AGCTCGAGGC CGTGAAGGAG ACACTGGACG AGGCCGCCGATCGGACAGGC TCGAGCTCCG GCACTTCCTC TGTGACCTGC TCCGGCGGCT351 GGAGCACGCC ACGACCGAGG CGCCCGTGTG GTACGTGGAT GTCACGAGCA
CCTCGTGCGG TGCTGGCTCC GCGGGCACAC CATGCACCTA CAGTGCTCGT401 ACACGGTCAT CGTGCACGCC CAGGACGTGA CGGCCGGGCG CGACTTCGTCTGTGCCAGTA GCACGTGCGG GTCCTGCACT GCCGGCCCGC GCTGAAGCAG451 TCGGCCGCGG GCGTGGACCC CGCCGCGGTC CACGTGCTGC GCTCGGACGAAGCCGGCGCC CGCACCTGGG GCGGCGCCAG GTGCACGACG CGAGCCTGCT501 GCAGCCGCGG CCTTACCACG ACCTGCGGGG TGGGGAGGCG TACTACATGGCGTCGGCGCC GGAATGGTGC TGGACGCCCC ACCCCTCCGC ATGATGTACC 551 GCAGCGGAGG GCGCTGCTCG GTCGGCTTCT CCGTTCGCCG CGGAACTCAGCGTCGCCTCC CGCGACGAGC CAGCCGAAGA GGCAAGCGGC GCCTTGAGTC601 GCGGGCTTCG CGACCGCGGG TCACTGCGGC CGGGTCGGCA CCACCACACGCGCCCGAAGC GCTGGCGCCC AGTGACGCCG GCCCAGCCGT GGTGGTGTGC651 GGGCTTCAAC CAGGTGGCGC AGGGCACCTT CCAGGGCTCC ATCTTCCCCGCCCGAAGTTG GTCCACCGCG TCCCGTGGAA GGTCCCGAGG TAGAAGGGGC701 GGCGCGACAT GGGCTGGGTC GCGGTCAACT CCAACTGGAA CACCACCCCCCCGCGCTGTA CCCGACCCAG CGCCAGTTGA GGTTGACCTT GTGGTGGGGG751 TTCGTCCGCG GCCAGGGGGG CGCGAACGTG ACGGTGGCGG GTTCGCAGCAAAGCAGGCGC CGGTCCCCCC GCGCTTGCAC TGCCACCGCC CAAGCGTCGT801 GGCTCCGGTC GGCTCCTCGG TGTGCCGTTC CGGCTCCACC ACCGGCTGGCCCGAGGCCAG CCGAGGAGCC ACACGGCAAG GCCGAGGTGG TGGCCGACCG851 ACTGCGGCAC CATCCAGCAG CACAACACCT CGGTGCGCTA TCCGGAGGGCTGACGCCGTG GTAGGTCGTC GTGTTGTGGA GCCACGCGAT AGGCCTCCCG901 ACCATCAGCG GAGTGACCAG GACCTCGGTG TGCGCCGAAC CCGGTGACTCTGGTAGTCGC CTCACTGGTC CTGGAGCCAC ACGCGGCTTG GGCCACTGAG951 CGGCGGCGCC TACATCTCCG GGAACCAGGC CCAGGGCGTG ACCTCCGGCGGCCGCCGCGG ATGTAGAGGC CCTTGGTCCG GGTCCCGCAC TGGAGGCCGC1001 GCTCGGGCAA CTGCCGCACC GGTGGCACCA CCTACCACCA GCCGATCAACCGAGCCCGTT GACGGCGTGG CCACCGTGGT GGATGGTGGT CGGCTAGTTG1051 CCGCTGCTGG CACAGTGGAA CCTGACCCTC GTGACCACGG GCAACGGCGGGGCGACGACC GTGTCACCTT GGACTGGGAG CACTGGTGCC CGTTGCCGCC1101 CGACCCGGGC GACCCCGGTG ACCCGGGCGA CCCGGGTGAG CCCGGCGGCAGCTGGGCCCG CTGGGGCCAC TGGGCCCGCT GGGCCCACTC GGGCCGCCGT1151 GCTGGTCCGC CGGGACCAGT TACGCGGTCG GCGACCGGGT GACCTACGGCCGACCAGGCG GCCCTGGTCA ATGCGCCAGC CGCTGGCCCA CTGGATGCCG1201 GGCGCGGAGT ACCGCTGCCT GCAGGCCCAC GTCGCCCAGT CCGGCTGGACCCGCGCCTCA TGGCGACGGA CGTCCGGGTG CAGCGGGTCA GGCCGACCTG1251 GCCCCCGAAC ACGCCCGCCC TCTGGCAGCG CGTGTGA(SEQ ID NO 10)CGGGGGCTTG TGCGGGCGGG AGACCGTCGC GCACACT下文SEQ ID NO 11提供了 1AG3前體蛋白酶的胺基酸序列。1 TAGPALAPPP AQETAAQEIP AGMLQAMQRD LGLTEQQAEE RVANEYQAGQ
51 LEPRLRAQLA DTFAGSffTRG ETAELVVATT DREQLPALTA AGVRATVAEH101 SLSELEAVKE TLDEAAEEHA TTEAPVffYVD VTSNTVIVHA QDVTAGRDFV151 SAAGVDPAAV HVLRSDEQPR PYHDLRGGEA YYMGSGGRCS VGFSVRRGTQ201 AGFATAGHCG RVGTTTRGFN QVAQGTFQGS IFPGRDMGffV AVNSNWNTTP251 FVRGQGGANV TVAGSQQAPV GSSVCRSGST TGffHCGTIQQ HNTSVRYPEG301 TISGVTRTSV CAEP⑶SGGA YISGNQAQGV TSGGSGNCRT GGTTYHQPIN
351 PLLAQffNLTL VTTGNGGDPG DPGDP⑶PGE PGGSffSAGTS YAV⑶RVTYG401 GAEYRCLQAH VAQSGffTPPN TPALffQRV (SEQ ID NO 11)下文SEQ ID NO 12提供了菌株1AG3的16S rRNA基因序列的部分多核苷酸序列1 GATCCTGGCT CAGGACGAAC GCTGGCGGCG TGCTTAACAC ATGCAAGTCGCTAGGACCGA GTCCTGCTTG CGACCGCCGC ACGAATTGTG TACGTTCAGC51 AACGATGAAG CCGCTTCGGT GGTGGATTAG TGGCGAACGG GTGAGTAACATTGCTACTTC GGCGAAGCCA CCACCTAATC ACCGCTTGCC CACTCATTGT101 CGTGGGCAAT CTGCCCTGCA CTCTGGGACA AGCCCGGGAA ACTGGGTCTAGCACCCGTTA GACGGGACGT GAGACCCTGT TCGGGCCCTT TGACCCAGAT151 ATACCGGATA TGACTGCTTC GGGCATCCGA GGTGGTGGAA AGCTCCGGCGTATGGCCTAT ACTGACGAAG CCCGTAGGCT CCACCACCTT TCGAGGCCGC201 GTGCAGGATG GGCCCGCGGC CTATCAGCTT GTTGGTGGGG TGATGGCCTACACGTCCTAC CCGGGCGCCG GATAGTCGAA CAACCACCCC ACTACCGGAT251 CCAAGGCGAC GACGGGTAGC CGGCCTGAGA GGGCGACCGG CCACACTGGGGGTTCCGCTG CTGCCCATCG GCCGGACTCT CCCGCTGGCC GGTGTGACCC301 ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGCTGACTCTGTG CCGGGTCTGA GGATGCCCTC CGTCGTCACC CCTTATAACG351 ACAATGGGCG CAAGCCTGAT GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCTTGTTACCCGC GTTCGGACTA CGTCGCTGCG GCGCACTCCC TACTGCCGGA401 TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAG AAGC (SEQ ID NO 12)AGCCCAACAT TTGGAGAAAG TCGTCCCTTC TTCG在其他一些實施方案中，本發明提供了編碼蛋白酶的DNA片段或部分，只要所編 碼的片段保留蛋白酶解的活性。本發明的另一個實施方案涵蓋了具有SEQ ID N0:2、8、10 或15的多核苷酸序列的至少20%的序列長度，至少30%的序列長度，至少40%的序列長 度，至少50%的序列長度，至少60%的序列長度，至少70%的序列長度，至少75%的序列長 度，至少80 %的序列長度，至少85 %的序列長度，至少90 %的序列長度，至少92 %的序列長 度，至少95 %的序列長度，至少97 %的序列長度，至少98 %的序列長度，和至少99 %的序列 長度。在一些替代性實施方案中，這些序列長度的片段或部分是序列長度的連續部分，用於 轉移重組DNA序列中的DNA序列(參見例如，美國專利號6，132，970，引入本文作為參考)。發明的另一實施方案包含本文所述的DNA片段，根據本領域已知的技術可用於獲 得部分長度的DNA片段，所述片段可用於分離或鑑別編碼本文所述鏈黴菌1AG3成熟蛋白酶 的多核苷酸，或其具有蛋白酶解活性的片段。此外，SEQ ID NO :1中提供的DNA可用於鑑別 來自其他物種(特別是鏈黴菌)的同源DNA片段，所述片段編碼蛋白酶或其具有蛋白酶解活性的部分。此外，本發明涵蓋了使用由SEQ ID N0:1，或其合適部分或片段(例如，至少約 5-20或10-15個連續核苷酸)構建的引物或探針序列，作為篩選基因組或cDNA來源的核酸 的探針或引物。在一些實施方案中，本發明提供了基於本文提出序列的期望長度的DNA探 針(即，長度通常在100至1000鹼基之間)。在一些實施方案中，將DNA片段電泳分離，從凝膠中切出，並從凝膠的瓊脂基質 中回收。在一些實施方案中，隨後標記該純化的DNA片段(例如，根據產生商的說明使用 Megaprime標記系統)，向DNA中摻入ρ32。在95°C加熱所標記的探針一段給定時間(例如， 5分鐘)，使其變性，並立即添加到膜和預雜交溶液中。雜交反應在合適條件下進行合適的 時間(例如，37°C，18小時)，伴隨輕柔振蕩或旋轉。漂洗膜(例如，在SSC/0. 3% SDS中兩 遍)，然後在合適的洗滌溶液中洗滌並輕柔攪動。期望的嚴格度是洗膜(濾膜)所用條件 的反映。在本文的一些實施方案中，「低嚴格度」條件涉及用0.2X SSC/0. 1%SDS的溶液 在20°C洗滌15分鐘，而在其他實施方案中，「中嚴格度」條件涉及另一洗滌步驟，其包括用 0. 2XSSC/0. 1% SDS的溶液在37°C洗滌30分鐘，在其他實施方案中，「高嚴格度」條件涉及 另一洗滌步驟，其包括用0. 2X SSC/0. 1 % SD S的溶液在37°C洗滌45分鐘，在其他實施方案 中，「最高嚴格度」條件涉及另一洗滌步驟，其包括用0. 2X SSC/0. 1% SDS的溶液在37°C洗 滌60分鐘。因此，本發明的多個實施方案提供了能在中、高和/或最高嚴格度條件下，與來 自本文提供的一個或多個核苷酸序列的探針雜交的多核苷酸。 在洗滌後，乾燥膜並檢測結合的探針。如果使用P32或其他放射性同位素作為標記 試劑，則通過放射自顯影檢測結合的探針。使其他探針可視化的其他技術是本領域技術人 員熟知的。結合探針的檢測表示核酸序列與本文提出的序列具有期望的同源性，因而具有 同一性，涵蓋在本發明的範圍內。因此，本發明提供了檢測編碼本發明涵蓋的蛋白酶的核酸 的方法，其包括將本文提出的部分或全部核酸序列與基因組或cDNA來源的其他核酸雜交。如上所述，在其他實施方案中，雜交條件是基於核酸結合複合體的熔解溫度(Tm)， 產生下文解釋的確定的「嚴格度」。「最大嚴格度」通常發生在約Tm-5°C (低於探針的Tm 5°C )；「高嚴格度」在低於Tm約5-10°C;「中嚴格度」在低於探針的Tm約10-20°C;而「低嚴 格度」在低於Tm約20-25°C。如本領域技術人員所知，選擇中、高和/或最高嚴格度雜交， 從而優化條件來鑑別或檢測與多核苷酸序列同源或等價的多核苷酸序列。在其他實施方案中，本發明提供了包含編碼本發明蛋白酶的多核苷酸的核酸構建 體(即，表達載體)。在其他實施方案中，本發明提供了用至少一種這類載體轉化的宿主細 胞。在其他一些實施方案中，本發明提供了還編碼信號序列(參加，SEQ IDNO 4)的 多核苷酸序列。在一些實施方案中，發明涵蓋了具有信號活性的多核苷酸，包含與SEQ ID NO 4具有至少65%序列同一性，至少70%序列同一性，至少75%序列同一性，至少(more least)80%序列同一性，至少85%序列同一性，至少90%序列同一性，至少95%序列同一 性，至少97 %序列同一性，至少98 %序列同一性，和至少99 %序列同一性的核苷酸序列。因 此，在這些實施方案中，本發明提供了具有推定的信號序列的序列，以及在中、高和/或最 高嚴格度條件下，能夠與源自SEQ ID NO :4公開的核苷酸序列的探針雜交的多核苷酸，其 中，信號序列具有與本發明的多核苷酸編碼的信號序列基本相同的信號活性。
在一些實施方案中，通過蛋白酶與起始材料以基本相同的水平分泌到發酵培養基 中來表示信號活性。例如，在一些實施方案中，本發明提供了發酵培養基的蛋白酶水平是信 號序列SEQ ID NO :4提供的發酵培養基中的分泌蛋白酶水平的至少50%，至少60%，至少 70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，或至少98 %。在一些實施方案中，通過蛋白酶活性 分析驗證分泌的蛋白酶水平，例如PNA測定(參見例如，Del Mar, [1979]，見上文)。在革 蘭氏陽性宿主細胞中確定異源或同源蛋白質分泌水平，並檢測分泌蛋白的其他方法包括使 用特異性針對蛋白質的多克隆或單克隆抗體。實例包含酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免 疫測定(RIA)和螢光激活細胞分選(FACS)，如本領域技術人員熟知的。在其他一些實施方案中，本發明提供了多核苷酸，其編碼信號肽(SEQID NO 2的 核苷酸1-75)的胺基酸序列，如SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :2的核苷酸殘基位置1_75，和/ 或SEQ ID N0:4所示。發明還涵蓋了在低、中、高嚴格度和/或最高嚴格度條件下，與SEQ ID NO :4所示核酸序列雜交的核酸序列，卻具有與序列基本相同的信號活性。本發明涵蓋 了所有此類多核苷酸。在其他一些實施方案中，本發明提供了與本文所述核苷酸序列互補 的多核苷酸。本發明的其他方面涵蓋了這樣的多肽，所述多肽具有蛋白酶解活性，並包含與SEQ ID NO :3的胺基酸序列(即，信號和前體蛋白酶)，SEQ IDNO :11(即，前體蛋白酶)和/或 SEQ ID NO :9( S卩，成熟蛋白酶)65%胺基酸序列同一性，至少70%胺基酸序列同一性，至 少75%胺基酸序列同一性，至少80%胺基酸序列同一性，至少85%胺基酸序列同一性，至 少90%胺基酸序列同一性，至少92%胺基酸序列同一性，至少95%胺基酸序列同一性，至 少97%胺基酸序列同一性，至少98%胺基酸序列同一性，和至少99%胺基酸序列同一性。 使用本領域已知的方法確定這些多肽的蛋白酶解活性，包括用於評估洗滌劑功能的那些方 法。在其他實施方案中，多肽是分離的。在本發明的其他實施方案中，多肽包含與本文提出 的胺基酸序列相同的胺基酸序列。在其他一些實施方案中，多肽與本文提出的部分胺基酸 序列是相同的。在一些實施方案中，本發明提供了具有蛋白酶解活性的分離的多核苷酸，包含長 度約453個胺基酸的胺基酸序列，如SEQ ID NO :3中提供的。在其他實施方案中，本發明涵 蓋了具有蛋白酶解活性的多肽，包含SEQ IDNO 11中提供的、長度約428個胺基酸的胺基酸 序列。在一些實施方案中，這些胺基酸序列包含信號序列(SEQ ID NO :5的胺基酸1-25)，和 前體蛋白酶(SEQ ID NO :11的胺基酸1-428)。在其他實施方案中，本發明涵蓋了包含N-端 原序列(SEQ ID NO 7的胺基酸1-172)、成熟蛋白酶序列(SEQID NO 9的胺基酸1-256)的 多肽。在其他實施方案中，本發明涵蓋了包含前體蛋白酶序列(例如，SEQ ID N0:11的氨 基酸1-428)的多肽。在其他實施方案中，本發明涵蓋了包含成熟蛋白酶序列，包含(如SEQ ID NO 9的胺基酸1-256)的多肽。
在其他實施方案中，本發明提供了包含上述胺基酸序列的多肽和/或蛋白酶，所 述多肽和/或蛋白酶來自細菌物種，包含但不限於鏈黴菌科(Str印tomycetaceae)，並通過 胺基酸序列同源性研究而鑑別的。在一些實施方案中，如果與鏈黴菌菌株1AG3蛋白酶中的 特定殘基或部分殘基同源(即，在一級或三級結構的相應位置)或類似(即，具有相同或相 似的功能進行結合、反應或化學相互作用)，則前體鏈黴菌科蛋白酶的胺基酸殘基等價於鏈 黴菌菌株1AG3的殘基。
在一些實施方案中，為了建立一級結構的同源性，直接比較前體蛋白酶的胺基酸 序列與鏈黴菌菌株1AG3成熟蛋白酶的胺基酸序列，特別是一組保守性殘基，所述殘基被認 為在所有的或大部分序列已知的鏈黴菌樣蛋白酶中是不變的。在比對保守殘基後，為了維 持匹配，允許必要的插入和刪除(即，避免由於人為刪除和插入導致保守殘基的消失)，確 定與成熟蛋白酶(SEQ ID NO 9)和鏈黴菌1AG3蛋白酶中的特定胺基酸對應的殘基。保守 殘基的比對應該保留100%的此類殘基。然而，多於約75%或低至約45%的保守殘基的匹 配也足以確定等價的殘基。然而，應該維持催化三聯體的保守性，即SEQ ID N0:9的His36/ Asp64/Serl45。例如，在一些實施方案中，比對來自鏈黴菌菌株1AG3，和上述其他鏈黴菌科物種的蛋白酶的胺基酸序列，來提供胺基酸序列之間最大程度的同源性。這些序列的比較表示在 每條序列中都含有大量的保守殘基。這些殘基是鑑別並用於建立胺基酸的等價殘基位置的 殘基，所述胺基酸是在待分析的前體或成熟鏈黴菌科蛋白酶中鑑別的。這些保守殘基用於在一種或多種鏈黴菌科蛋白酶同源物中確定鏈黴菌菌株1AG3 蛋白酶的相應胺基酸殘基。比對這些特定的胺基酸序列和鏈黴菌1AG3蛋白酶的序列，產生 保守殘基的最大同源性。通過該比對，比較其他生物(例如，鏈黴菌屬物種)觀察鏈黴菌 1AG3的序列和特定殘基位置。因此，在其他鏈黴菌科物種中可以鑑別催化三聯體的等價氨 基酸(例如，在鏈黴菌1AG3蛋白酶中)。在本發明的一些實施方案中，蛋白酶同源物包含 SEQ ID NO 9 的 His36/Asp64/Serl45 的等價物。兩條多肽基本相同的另一個指標是，第一條多肽與第二條多肽是免疫交叉反應 的。確定免疫交叉反應性的方法記載在本領域中，並描述與本文的實施例中。一般地，保守 胺基酸取代不同的多肽是免疫交叉反應的。因此，例如，當兩條多肽僅保守取代不同時，多 肽與第二多肽是基本相同的。本發明涵蓋了從多種來源獲得的蛋白酶。在一些實施方案中，蛋白酶獲得自細菌， 而在其他實施方案中，蛋白酶獲得自真菌。在本發明的其他一些方面，多核苷酸源自這樣的細菌，所述細菌的16SrRNA基因 核苷酸序列與鏈黴菌菌株1AG3的16S rRNA基因核苷酸序列(SEQ ID NO 12)具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、98% 的序列同一性。菌株1AG3表現出與鏈黴菌科的鏈黴菌屬成員最接近的16S rDNA關係。認為最 接近的親緣關係是索馬利亞鏈黴菌(Sti^ptomyces somaliensis) (DSM40738)，與鏈黴菌菌株 1AG3的16S rRNA基因核苷酸序列具有至少97%的序列同一性。在本發明的一些實施方案中，菌株69B4如美國專利申請系列號10/576，33所述， 通過引用全文整合到本文中。雖然在給定生物物種的天然存在的酶序列中可以存在突變，對於給定條件下(例 如，溫度、PH、水硬度、氧化條件、螯合條件和濃度)的底物特異性和/或蛋白酶解活性水平 等，由相同物種的生物體產生的特定類型的酶通常是基本相同的。因此，出於本發明的目 的，認為鏈黴菌的其他菌株和物種也產生本發明的鏈黴菌蛋白酶，從而為本發明的蛋白酶 提供有用的來源。實際上，如本文所示，可以認為鏈黴菌科的其他成員可用於本發明。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶解多肽是物理化學表徵的，而在其他實施方 案中，它們的特徵是基於它們的功能，在其他實施方案中，同時使用兩組性質來表徵它們。物理化學特徵利用了普遍已知的技術，例如SDS電泳、凝膠過濾、胺基酸組成、質譜(例如， MALDI-TOF-MS.LC-ES-MS/MS等)和沉降來確定蛋白質的分子量，等電聚焦來確定蛋白質的 pl，胺基酸測序來確定蛋白質的胺基酸序列，晶體學研究來確定蛋白質的三級結構，以及抗 體結合來確定蛋白質中存在的抗原性表位。在一些實施方案中，通過蛋白酶領域從業人員熟知的技術來確定功能特徵，包含 但不限於各種商業底物的水解，例如二甲基酪蛋白(「DMC」)和/或AAPF-pNA。用於功能 性表徵的技術更詳細的描述在本文提供的實施例中。在本發明的一些實施方案中，如MALDI-T0F-MS確定的蛋白酶具有約17kD至約 22kD的分子量，例如約18kD至約19kD，例如18700道爾頓至18800道爾頓，例如約18764 道爾頓。在本發明的另一方面，圖3中提出了 MALDI-T0F-MS測量的蛋白酶譜。成熟蛋白酶也表現出蛋白酶解活性(例如，對具有肽鍵的底物的水解活性)，例如 DMC。在其他實施方案中，本發明的蛋白酶在定義的條件下提供了增強的洗滌性能。雖然本 發明涵蓋了本文描述的蛋白酶1AG3，在一些實施方案中，本發明的蛋白酶與1AG3的蛋白酶 解活性相比，表現出至少 50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%, 98%或99%的蛋白酶解活性。在一些實施 方案中，與以商標SAVINASE (Novzymes)或 PURAFECT (Genencor)銷售的蛋白酶，在相同條件下的蛋白酶解活性相比，蛋白酶 表現出至少 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的蛋白酶解活性。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶在定義的條件下，與相同條件下的 1AG3相比，表現出可比較的或增強的洗滌性能。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶在定 義的條件下，與相同條件下的、以商標SAVINASE (Novzymes)或PURAFECT (Genencor)銷售的蛋白酶相比，表現出可比較的或增強的洗滌性能。在其他實施方案中，以純化的形式(即，在特定組合物中存在的濃度高於或低於 天然存在的或野生型生物體中存在的濃度)提供本發明的蛋白酶和/或編碼蛋白酶的多核 苷酸，或者，與在天然存在的或野生型生物體中表達時通常不存在的組分組合。然而，本發 明並非意在限制任意特定純度水平的蛋白酶，因為多種蛋白酶純度可用於在本發明的蛋白 酶適用的各種用途。如上所述，還提供了包含編碼本發明蛋白酶的核酸的重組多核苷酸。在一些實施 方案中，重組核酸包含表達盒，所述表達盒以有效連接包含啟動子、編碼目的蛋白酶的編碼 序列，和終止序列，其中表達盒足以在宿主細胞中產生蛋白酶。在一些實施方案中，啟動子 對編碼序列是異源的。在一些優選的實施方案中，重組多核苷酸還編碼用於指導目的蛋白酶分泌的信號 序列。在一些優選的實施方案中，重組核酸還包含可選擇的標誌物，用於從不含重組核酸的 其他細胞中選擇含有重組核酸的細胞。示例性的可選擇標誌物包含但不限於提供抗生素 抗性的可選擇標誌物(例如，對潮黴素、博來黴素、chloroamphenicol、phleomycin、卡那黴 素、鏈黴素、青黴素、四環素的抗性等)。在一些實施方案中，編碼序列是密碼子優化的，用於在所使用的宿主細胞中表達 融合蛋白。由於列舉多種細胞中各密碼子使用的密碼子使用表是本領域已知的(參見例 如，Nakamura等人，Nucl. Acids Res. ,28 292[2000])或可方便獲得的，因此，可以方便的 設計此類核酸，產生待表達的蛋白質的胺基酸序列。
在一些實施方案中，目的重組核酸存在於(例如，整合到)宿主細胞的基因組(如 核基因組)中，而在其他實施方案中，它存在於在宿主細胞中自主複製的載體(例如，噬菌 體、質粒、病毒或逆轉錄載體)中。在一些實施方案中，載體是用於在宿主細胞中表達蛋白 質的表達載體。信號序列、啟動子和終止子的選擇大部分取決於所使用的宿主細胞。如上所述，在 一些實施方案中，使用鏈黴菌宿主細胞。在一些實施方案中，信號序列是celA信號序列。 在一些實施方案中，celA信號序列是由變鉛青鏈黴菌維素酶A基因，CelA，編碼的信號序 列，如 Klu印fel 等人所述(Klu印fel 等人，Nature Biotechnol.，14 :756_759[1996])。在 使用芽孢桿菌宿主細胞的其他實施方案中，信號序列是能夠指導融合蛋白進入芽孢桿菌宿 主細胞分泌通路的任何胺基酸序列。在一些實施方案中，使用的信號序列包含野生型芽孢 桿菌細胞分泌的蛋白質的信號序列。此類信號序列包含α-澱粉酶、蛋白酶(例如，aprE 或枯草桿菌蛋白酶E)或內醯胺酶基因編碼的信號序列。示例性的信號序列包含但不 限於，來自任何合適的芽孢桿菌屬物種的α-澱粉酶基因、枯草桿菌蛋白酶基因、β-內醯 胺酶基因、中性蛋白酶基因(例如，nprT、nprS、nprM)或prsA基因編碼的信號序列，所述 芽孢桿菌屬物種包含但不限於嗜熱脂肪芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢 桿菌和解澱粉芽孢桿菌。在一個實施方案中，信號序列是由枯草芽孢桿菌的aprE基因編 碼的(參見例如，Olmos-Soto 禾口 Contreras-Flores，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,62 369-73 [2003])。其他信號序列描述在 Simonen 和 Palva(Simonen 和 Palva，Microbiol. Rev. ,57 109-137[1993])中，也是本領域已知的。 適合在芽孢桿菌和鏈黴菌宿主細胞中使用的啟動子和終止子是已知的，包含 apr (鹼性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy ( α -澱粉酶)和β -內醯胺酶基因，以及枯 草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌的麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌的α _澱粉酶基因(amyQ)、地衣 芽孢桿菌青黴素酶基因(PenP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子和終止子，以 及在WO 93/10249、WO 98/07846和WO 99/43835中描述的啟動子和終止子。可以使用本 領域已知的啟動子和終止子構建在鏈黴菌宿主細胞中使用的表達盒(參見例如，HoDwood 等 人』 Genetic Manipulation ofStreptomyces :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories [1985] ；Hopwood 等人，In Booth and Higgins ( ) Symposium of theSociety for General Microbiology, Regulation of Gene Expression, Cambridge University Press, [1986],第 251-276 頁；FornwaId 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. ,84 2130-2134[1987] ；Pulido 等人，Gene 56 :277_82 [1987] ；Dehottay 等人，Eur. J. Biochem.， 166 345-50[1987]) ；Taguchi, Gene84 279-86[1989] ；Schmitt-John 等人』 Appl. Microbiol. Biotechnol. ，36 :493-8[1992] ；Motamedi，Gene 160 :25_31[1995]；禾口 Binnie， Protein Expr. Purif.，11 :271_8[1997])。在一些實施方案中，使用 A4 啟動子(參見，WO 06/054997，提供引用整合到本文中)。鏈黴菌、芽孢桿菌、麴黴、木黴菌和其他宿主細胞中表達重組蛋白的載體系統是本 領域熟知的。可以考慮在本發明中使用任何合適的系統。III.獲得編碼本發明的鏈黴菌科(例如，鏈黴菌屬)蛋白酶的多核苷酸在一些實施方案中，通過本領域已知的標準程序獲得編碼本發明蛋白酶的核酸，例如克隆DNA (如，DNA「文庫」)、化學合成、cDNA克隆、PCR、克隆基因組DNA或其片段，或從期 望的細胞(如細菌或真菌)內純化，如本領域熟知的。實際上，合成多核苷酸的方法是本領 域熟知的(參見例如，Beaucage禾口 Caruthers,Tetrahedron Lett. ,22 :1859_1862[1981])， 包含使用自動合成儀(參見例如，Needham-VanDevanter等人，Nucl. AcidsRes.，12 6159-6168[1984])。還可以定製DNA序列，並從多個商業來源訂購。如本文中更詳細描述 的，在一些實施方案中，源自基因組DNA的核酸序列除編碼區外還含有調控區。在涉及從基因組DNA中分子克隆基因的一些實施方案中，產生DNA片段，其中一 些包含至少一部分期望的基因。在一些實施方案中，使用不同的限制性酶在特定位點切割 DNA。在一些替代性實施方案中，在存在錳的條件下使用DNA酶來使DNA片段化，或物理剪 切DNA(例如，通過超聲)。然後，通過標準技術，根據大小分離並擴增所創造的線性DNA片 段，包含但不限於瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠電泳、PCR和柱層析。—旦產生了核酸片段，可以使用任何合適的方法實現對編碼蛋白酶的特定DNA片 段的鑑別。例如，在一些實施方案中，將編碼蛋白酶解酶的1AG3基因或其特異性RNA或其 片段(例如探針或引物)分離、標記，然後用於本領域熟知的雜交測定，來檢測產生的基因 (參見例如，Benton 和 Davis，Science 196 180 [1977]；以及 Grunstein 和 Hogness，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 :3961 [1975])。在一些實施方案中，與探針具有顯著的序列相似性 的DNA片段在中至高嚴格度條件下雜交。在一些實施方案中，如本領域已知的，使用PCR實現擴增。在一些實施方案中，以 任意合適的組合使用至少約4個核苷酸到多達約60個核苷酸(即，片段)(例如，12-30個 核苷酸或約25個核苷酸)的核酸序列作為PCR引物。這些相同的片段也可以在雜交和產 物檢測方法中作為探針使用。在一些實施方案中，從cDNA或基因組文庫中分離發明的核酸構建體時，使用簡併 的寡核苷酸引物進行PCR，所述引物基於蛋白質的胺基酸序列製備，具有SEQ ID N0:3和/ 或8所示的胺基酸序列。引物可以是任何片段長度，例如長度為至少約4個、至少約5個、 至少約8個、至少約15個、至少約20個核苷酸。本申請的示例性探針使用這樣的引物，所 述引物包含與TTGWHCGT(SEQ ID NO 20)和GDSGG(SEQ ID NO 21)多核苷酸序列對應的序 列，如實施例中更詳細所述的。綜上所述，可以理解，本文提供的多核苷酸序列，和基於本文提供的多核苷酸序列 的序列，可用於從其他物種(特別是細菌)中獲得相同或同源的多核苷酸片段，其編碼的酶 具有蛋白酶1AG3表達的絲氨酸蛋白酶活性。IV.表達和回收本發明的絲氨酸蛋白酶任何用於表達和回收本發明的絲氨酸蛋白酶的合適方法均可用於本文中。實際 上，本領域技術人員了解許多方法，適合克隆具有蛋白酶解活性的鏈黴菌-來源的多肽及 其他酶(例如，具有蛋白酶解活性的第二肽，如蛋白酶、纖維素酶、甘露聚糖酶(marmanase) 或澱粉酶等)。本領域還已知多種方法，用於將編碼本發明的一種或多種酶的至少一份 (如，多份)一種或多種多核苷酸拷貝，與任何其他期望序列結合，引入宿主細胞基因或基 因組。—般而言，用於克隆基因和向所述基因引入外源蛋白 酶編碼區(包含外源編碼 區的多份拷貝)的標準方法可用於獲得鏈黴菌1AG3蛋白酶衍生物或其同源物。實際上，本說明書(包括實施例)提供了此類教導。然而，其他本領域已知的方法也是合適的(參 見例如，Sambrook等人，見上文(1989) ；Ausubel等人，見上文[1995]；以及Harwood和 CuttinR(編著),Molecular BioloRical Methods for Bacillus, " John Wiley and Sons, [1990]；以及 WO 96/34946)。在一些實施方案中，通過與合適的表達載體中的表達控制序列有效連接，並根據本領域成熟建立的技術使用所述表達載體轉化合適的宿主，來表達本發明的多核苷酸序 列。在一些實施方案中，根據本領域成熟建立的技術，從細胞培養的發酵物中分離，並使用 多種方法純化本發明DNA序列表達所產生的多肽。本領域技術人員能夠選擇最合適的分離 和純化技術。更具體地，本發明提供了構建體、編號本文所述多核苷酸的載體、用此類載體轉化 的宿主細胞，由此類宿主細胞表達的蛋白酶，表達方法和用於產生源自微生物的絲氨酸蛋 白酶的系統，特別是鏈黴菌科的成員，包含但不限於鏈黴菌屬物種。在一些實施方案中，編 碼一種或多種絲氨酸蛋白酶的一種或多種多核苷酸用於產生適合一種或多種絲氨酸蛋白 酶表達的重組宿主細胞。在一些實施方案中，表達宿主能夠以可商業化的量來產生一種或 多種蛋白酶。V.重組載體如上文所述，在一些實施方案中，本發明提供了包含上述多核苷酸的載體。在一些 實施方案中，編碼蛋白酶的本發明載體(即，構建體)是基因組來源的(例如，通過使用基 因組文庫，並使用根據標準技術的合成寡核苷酸探針雜交，篩選編碼全部或部分蛋白酶的 DNA序列來製備)。在一些實施方案中，通過從鏈黴菌菌株1AG3中分離染色體DNA，並通過 PCR方法擴增序列，來獲得編碼蛋白酶的DNA序列，如本文實施例中所述。在替代性實施方案中，通過已建立的標準方法來合成製備編碼蛋白酶的發明的核 酸構建體(參見例如，Beaucage 和 Caruthers, Tetra. Lett. 22 1859-1869[1981]；以及 Matthes等人，EMBO J.，3 :801_805 [1984])。根據亞磷醯胺法，合成寡核苷酸(例如，在自 動化DNA合成儀中)，純化、退火、連接並克隆到合適的載體中。在其他實施方案中，核酸構建體是合成的和基因組來源相混合的。在一些實施方 案中，根據標準技術，通過連接合成的片段或基因組DNA片段(當合適時)來製備構建體， 其中片段對應完整核酸構建體的不同部分。在其他實施方案中，本發明提供了包含至少1個本發明的DNA構建體的載體。在 一些實施方案中，本發明涵蓋了重組載體。可以考慮在本發明中使用任何合適的載體，包含 自主複製的載體和(瞬時或穩定地)整合到宿主細胞基因組中的載體。實際上，本領域技 術人員已知多種載體、表達盒適合用於在真菌(黴菌或酵母)、細菌、昆蟲和植物細胞中克 隆、轉化和表達。一般地，載體或盒式結構含有指導核酸轉錄和翻譯地序列，可選擇標誌物， 和允許自主複製或染色體整合的序列。在一些實施方案中，合適的載體包含基因的5』區， 其錨定轉錄起始控制因子，以及DNA片段的3』區，其控制轉錄終止。這些控制區源自與宿 主同源或異源的基因，只要所選擇的控制區能夠在宿主細胞中發揮功能。在一些實施方案中，載體是表達載體，其中編碼發明的蛋白酶的DNA序列有效 連接DNA轉錄所需的其他片段。在一些實施方案中，表達載體源自質粒或病毒DNA，而在 一些替代性實施方案中，同時含有兩類元件。示例性載體包含但不限於PSEA4C、pSEGCT、pSEACT和/或pSEA4CT，以及所有本文實施例中描述的載體。此類載體的構建描述在本文 中，方法是本領域熟知的(參見例如，美國專利號6，287，839 ；和WO 02/50245)。在一些 實施方案中，本文描述的載體PSEA4C可用於構建包含本文描述的多核苷酸的載體(例如， PSEA4CT-1AG3)。實際上，意在本文描述的所有載體都可用於本發明。
在一些實施方案中，如本領域已知的，轉錄需要的其他片段包含調控片段(例如， 啟動子、分泌片段、抑制子、整體調控子(global regulator)等)。一個實例包含在選定 的宿主細胞內表現出轉錄活性的任何DNA序列，源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質 的基因。具體地，用於細菌宿主細胞的合適啟動子的實例包含但不限於嗜熱脂肪芽孢杆 菌麥芽糖澱粉酶基因、解澱粉芽孢桿菌(BAN)的澱粉酶基因、枯草芽孢桿菌的鹼性蛋白酶 基因、克勞氏芽孢桿菌的鹼性蛋白酶基因、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的木糖苷酶 (xylosidase)基因、蘇雲金芽孢桿菌的cryIIIA和地衣芽孢桿菌的α-澱粉酶基因的啟動 子。其他啟動子包含Α4啟動子，如本文所述。其他可用於本發明的啟動子包含但不限於噬 菌體λ的Pk或P^啟動子，以及大腸桿菌的lac、trp或tac啟動子。在一些實施方案中，啟動子源自編碼蛋白酶或其片段的基因，與所述序列具有基 本相同啟動子活性。發明還涵蓋了這樣的核酸序列，所述核酸序列在中、高和/或最高嚴格 度條件下與啟動子序列雜交，或與此類啟動子具有至少約90%同源性或約95%同源性，具 有基本相同的啟動子活動。在一些實施方案中，啟動子用於促進蛋白酶和/或異源DNA序 列的表達(例如，除本發明的蛋白酶以外的另一種酶)。在其他實施方案中，載體還包含至 少一種可選擇的標誌物。
在一些實施方案中，發明的重組載體還包含使載體在宿主細胞中複製的DNA序 列。在涉及細菌宿主細胞的一些實施方案中，這些序列包含允許質粒複製的所有序列(例 如，ori和/或r印序列)。在一些特定的實施方案中，載體還包含信號序列(例如，前導區序列或原序列)， 用於指導本發明的多肽進入宿主細胞的分泌通路。在一些實施方案中，分泌信號序列與編 碼前體蛋白酶的DNA序列連接在正確的閱讀框中。根據蛋白酶是胞內表達或分泌，使用或 不使用天然多肽信號序列，或在細菌(例如芽孢桿菌)、真菌(例如木黴菌)、其他原核細胞 或真核細胞中發揮作用的信號序列，來改造發明的多核苷酸序列或表達載體。在一些實施 方案中，通過去除或部分去除信號序列來實現表達。在一些涉及從細菌細胞中分泌的實施方案中，信號肽是天然存在的信號肽，或其 功能部分，而在其他實施方案中，它是合成的肽。合適的信號肽包含但不限於源自地衣芽孢 桿菌的α-澱粉酶、克勞氏芽孢桿菌的鹼性蛋白酶和解澱粉芽孢桿菌的澱粉酶的序列。一 種信號序列是源自鏈黴菌菌株1AG3的信號肽，如本文所述。因此，在一些特定的實施方案 中，信號肽包含來自本文所述蛋白酶的信號肽。該信號可用於有利於1AG3蛋白酶和/或 異源DNA序列(例如，第二蛋白酶，如另一種野生型蛋白酶、ΒΡΝ』變體蛋白酶、GG36變體蛋 白酶、脂肪酶、纖維素酶、甘露聚糖酶等)的分泌。在一些實施方案中，由本領域已知的DNA 序列和/或胺基酸序列編碼這些第二種酶(參見例如，美國專利號6，465，235,6, 287，839、 5，965，384 和 5，795，764 ；以及 WO 98/22500,WO 92/05249,EP 0305216Β1 和 W094/25576)。 此外，可以考慮在一些實施方案中，信號肽序列還與內源序列有效連接，激活和分泌此類內 源編碼的蛋白酶。
用於分別連接編碼本發明蛋白酶的DNA序列、啟動子和/或分泌信號序列的方法， 以及將它們插入含有複製必需信息的合適載體中的方法，是本領域技術人員熟知的。如上 所示，在一些實施方案中，使用特定引物的PCR製備核酸構建體。VI.宿主細胞 如上所述，在一些實施方案中，本發明還提供了用上述載體轉化的宿主細胞。在一 些實施方案中，編碼引入宿主細胞的一種或多種本發明蛋白酶的多核苷酸是同源的，而在 其他實施方案中，多核苷酸對宿主是異源的。在一些實施方案中，多核苷酸與宿主細胞是同 源的(例如，引入了宿主細胞產生的天然蛋白酶的其他拷貝)，它與其他同源或異源的啟動 子序列有效連接。在替代性實施方案中，另一分泌信號序列和/或終止子序列可用於本發 明。因此，在一些實施方案中，多肽DNA序列包含多份拷貝的同源多肽序列、來自另一生物 體的異源多肽序列，或一種或多種合成多肽序列。實際上，本發明並非意在限制任何特定的 宿主細胞和/或載體。實際上，引入本發明的DNA構建體的宿主細胞包含能夠產生本發明鹼性蛋白酶的 任何細胞，包含但不限於細菌、真菌和更高等的真核細胞。可用於本發明的細菌宿主細胞的實例包含但不限於革蘭氏陽性細菌，例 如芽孢桿菌、鏈黴菌和木黴菌，例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、解澱粉芽孢桿菌 (B. amyIoliquefaciens)、凝結芽抱桿菌(B. coagulans)、環狀芽抱桿菌(B. circulans)、 燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、蘇雲金芽孢桿菌 (B. thuringiensis)、灰色鏈黴菌(S. griseus)、變鉛青鏈黴菌(S. Iividans)、天藍色鏈黴 菌(S. coelicolor)、除蟲鏈黴菌(S. avermitilis)和褐色高溫單孢菌(T. fusca)菌株；以 及革蘭氏陰性菌例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的成員(如，大腸桿菌)。在一些實 施方案中，宿主細胞是枯草芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和/或地衣芽孢桿菌。在其他實施 方案中，宿主細胞是變鉛青鏈黴菌的菌株(例如，TK23和/或TK21)。本發明可使用任何 用於細菌轉化的合適方法，包括但不限於原生質體轉化、使用感受態細胞等，如本領域已知 的。在一些實施方案中，美國專利號5，264，366(提供引用整合到本文中)中提供的方法 可用於本發明。對於變鉛青鏈黴菌，Fernandez-Abalos等人(參見Fernandez-Abalos等 人，Microbiol.，149 1623-1632 [2003]；還參見 Hopwood 等人，Genetic Manipulation of Streptomyces LaboratoryManual, Innis [編著]，[1985]，均引入本文作為參考)描述了 用於轉化和蛋白質表達的一種方法。當然，本文實施例中描述的方法也可用於本發明。可用於本發明的真菌宿主細胞的實例包含但不限於木黴菌屬物種和麴黴屬物 種。在一些特定的實施方案中，宿主細胞是裡氏木黴(Trichodermareesei)和/或黑麴黴 (Aspergillus niger)。在一些實施方案中，如美國專利5，364，770中所述，實施麴黴中的 轉化和表達，該美國專利引入本文作為參考。當然，本文實施例中描述的方法也可用於本發 明。在一些實施方案中，需要特定的啟動子和信號序列來提供一種或多種本發明蛋白 酶的有效轉化和表達。因此，在一些涉及使用芽孢桿菌宿主細胞的實施方案中，組合使用 aprE啟動子和已知的芽孢桿菌來源的信號序列和其他調控序列。在一些涉及在麴黴中表達的實施方案中，使用glaA啟動子。在一些涉及鏈黴菌宿主細胞的實施方案中，使用米蘇裡 遊動放線菌(Actinoplanes missouriensis)的葡萄糖異構酶(GI)啟動子，而在其他實施 方案中，使用A4啟動子。在一些涉及在細菌(例如大腸桿菌)中表達的實施方案中，蛋白酶保留在原生質 體中，通常作為不可溶的顆粒(即，包涵體)。然而，在其他實施方案中，通過細菌分泌序列 將蛋白酶導入周質空間中。在前一種情況下，細胞是裂解的，在通過稀釋變性劑使蛋白酶重 新摺疊後，回收並變性所述顆粒。在後一種情況下，通過破裂細胞(例如，通過超聲或滲透 休克)，釋放周質空間的內容物並回收蛋白酶，從周質空間中回收蛋白酶。在一些實施方案中，在允許本發明蛋白酶表達的條件下，在合適的營養培養基上 培養本發明的轉化的宿主細胞，然後從培養物中回收所獲得的蛋白酶。用於培養細胞的基 質不可任何適合宿主細胞生長的常規基質，例如含有合適添加物的基礎培養基或複雜培養 基。可以從商業供應商獲得和/或根據本領域熟知的公開配方製備合適的培養基。在一些 實施方案中，通過常規方法從培養基中回收細胞產生的蛋白酶，包含但不限於通過離心或 過濾從培養基中分離宿主細胞，通過鹽(例如，硫酸銨)、層析純化(例如，離子交換、凝膠過 濾、親和等)的方式，沉澱上清或濾液的蛋白質組分。因此，可以使用任何適合回收一種或 多種本發明蛋白酶的方法。實際上，本發明並非意在限制任何特定的純化方法。VII.絲氨酸蛋白酶的用途 如本文詳述，本發明的蛋白酶具有使其非常適用於某些用途的重要特徵。例如，與 目前使用的蛋白酶相比，本發明的蛋白酶具有增強的熱穩定性、增強的氧化穩定性和增強 的螯合劑穩定性。因此，這些蛋白酶可用於清潔組合物。實際上，在一些洗滌條件下，本發 明的蛋白酶表現出與目前使用的枯草桿菌蛋白酶相當的或增強的洗滌性能。因此，可以考 慮以多種清潔組合物的形式提供本發明的清潔和/或酶組合物。在一些實施方案中，以與 枯草桿菌蛋白酶(即，目前使用的蛋白酶)相同的方式使用本發明的蛋白酶。因此，本發明 的蛋白酶可用於多種清潔組合物，以及動物飼料應用、皮革處理(例如，軟化(bating))、蛋 白質水解和紡織品用途。鑑別的蛋白酶還可用於個人護理應用。因此，本發明的蛋白酶可用於多種工業應用，特別是在清潔、消毒、動物飼料和 紡織品/皮革工業。在一些實施方案中，一種或多種本發明的蛋白酶與洗滌劑、增潔劑 (builder)、漂白劑和其他常規成分組合，產生多種新清潔組合物，所述清潔組合物可用於 洗衣和其他清潔領域，例如衣物洗滌劑(粉末的和液體的)、洗衣預浸泡劑、全織物漂白劑、 自動餐具洗滌劑(液體和粉末的)、家用洗滌劑、特別是條形皂和液體皂應用，以及下水道 洗滌劑/疏通劑。此外，蛋白酶可用於清潔隱形眼鏡和其他物品，通過將此類材料與清潔組 合物的水溶液接觸。此外，這些天然存在的蛋白酶可用於，例如肽水解、廢物處理、紡織品應 用、醫療設備清潔、生物膜去除以及在蛋白質產生中作為融合切割酶等。這些產品的組成對 本發明不是關鍵的，只要一種或多種蛋白酶在所用環境中保持其功能。在一些實施方案中， 可以方便的製備所述組合物，通過將清潔有效量的蛋白酶或包含蛋白酶製品的酶組合物， 與本領域公知量的此類組合物的常規組分相組合。本發明的蛋白酶特別可用於清潔工業，包含但不限於洗衣和餐具洗滌劑。這些應 用將酶置於多種環境壓力下。由於本發明的蛋白酶在多種條件下的穩定性，具有比目前使 用的許多酶沒有的優勢。
實際上，在洗滌過程中，蛋白酶暴露於多種洗滌條件下，包含改變的洗滌劑配方、 洗滌水體積、洗滌水溫度和洗滌時間長度。此外，在不同地理區域使用的洗滌劑配方在洗滌 水中存在不同的相關組分濃度。例如，歐洲洗滌劑通常在洗滌水中具有約4500-5000ppm的 洗滌劑組分，而日本洗滌劑通常在洗滌水中具有約667ppm的洗滌劑組分。在北美，特別是 美國，洗滌劑通常在洗滌水中具有約975ppm的洗滌劑組分。低洗滌劑濃度系統包含洗滌劑，其中洗滌水中存在低於約SOOppm的洗滌劑組分。 通常認為日本洗滌劑是低洗滌劑濃度系統，其通常在洗滌水中含有約667ppm的洗滌劑組 分。中洗滌劑濃度系統包含洗滌劑，其中洗滌水中存在約800ppm至約2000ppm的洗滌 劑組分。通常認為北美洗滌劑是中洗滌劑濃度系統，其通常在洗滌水中含有約975ppm的洗 滌劑組分。巴西洗滌劑通常在洗滌水中含有約1500ppm的洗滌劑組分。高洗滌劑濃度系統包含洗滌劑，其中洗滌水中存在大於約2000ppm的洗滌劑組 分。通常認為歐洲洗滌劑是高洗滌劑濃度系統，其通常在洗滌水中含有約4500-5000ppm的 洗滌劑組分。拉丁美洲洗滌劑通常是高泡磷酸增潔洗滌劑，拉丁美洲使用的洗滌劑範圍可落入 中洗滌劑濃度和高洗滌劑濃度之間，因為它們在洗滌水中的洗滌劑組分範圍在1500ppm至 6000ppmo如上所述，巴西洗滌劑通常在洗滌水中含有約1500ppm的洗滌劑組分。然而，其 他高泡磷酸增潔洗滌劑地區，不限於其他拉丁美洲國家，具有高洗滌劑濃度系統，在洗滌水 中存在高達約6000ppm的洗滌劑組分。鑑於上述內容，很顯然，典型的洗滌溶液中洗滌劑組合物的濃度在世界範圍內變 動，從低於約SOOppm的洗滌劑組合物(「低洗滌劑濃度系統」)，例如日本的約667ppm，到在 約800ppm至約2000ppm之間(「中洗滌劑濃度系統」)，例如美國的約975ppm和巴西的約 1500ppm,到大於約2000ppm( 「高洗滌劑濃度系統」)，例如歐洲的約4500ppm至約5000ppm， 以及高泡磷酸增潔洗滌劑地區的約6000ppm。根據經驗確定典型洗滌溶液的濃度。例如，在美國，典型的洗衣機容納體積約 64. 4L的洗滌溶液。因此，為了獲得洗滌溶液中約975ppm的洗滌劑濃度，應該向64. 4L洗滌 溶液中添加62. 79g的洗滌劑組合物。該量是消費者利用洗滌劑提供的量杯量入洗滌水中 的典型量。在另一實例中，不同地區使用不同的洗滌溫度。日本的洗滌水的溫度通常低於歐 洲使用的溫度。例如，北美和日本的洗滌水溫度可以在10至30°C (如，約20°C )，而歐洲洗 滌水溫度一般在30至60°C (如，約40°C )。在另一實例中，不同地區通常具有不同的水硬度。水硬度一般通過每加侖混合的 Ca2+/Mg2+的格令(grain)數來描述。硬度是水中鈣(Ca2+)和鎂(Mg2+)的量的度量。美國的 多數水是硬水，但硬度值不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至 ISlppm的硬度礦物(ppm轉換成格令/美制加侖是ppm數除以17. 1等于格令/加侖)。
歐洲水硬度通常大於10. 5 (例如10. 5-20. 0)格令/加侖混合的Ca2+/Mg2+(例如， 約15格令/加侖混合的Ca27Mg2+)。北美水硬度通常大於日本水硬度，但小於歐洲水硬度。 例如，北美水硬度可以在3-10格令之間、3-8格令或約6格令。日本水硬度通常低於北美水 硬度，一般低於4，例如3格令/加侖混合的Ca27Mg2+。因此，在一些實施方案中，本發明提供了在至少一組洗滌條件下(例如，水溫、水 硬度和/或洗滌劑濃度)，表現出令人驚訝的洗滌性能的蛋白酶。在一些實施方案中，本發 明的蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶的洗滌性能是相當的。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶 表現出比枯草桿菌蛋白酶增強的洗滌性能。因此，在本發明的一些實施方案中，本文提供的 蛋白酶表現出增強的氧化穩定性、增強的熱穩定性和/或增強的螯合劑穩定性。在一些實施方案中，本發明提供了 1AG3蛋白酶，以及蛋白酶的同源物和變體。這 些蛋白酶可用於期望從紡織品或織物上清除基於蛋白質的汙漬的任何應用。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物配製成手洗和機洗的衣物洗滌劑組合 物，包含添加劑組分，以及適用於預處理汙損紡織品的組合物、漂洗時添加的紡織品軟化劑 組合物，在普通家用硬表面清潔操作以及餐具洗滌操作中使用的組合物。本領域技術人員 熟悉可用作清潔組合物的不同配方。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶在清潔組合物中 包含相當的或增強的性能(即，與其他蛋白酶相比)。在一些實施方案中，以標準方法，在使 用酶敏感汙漬(例如，卵、草、血、奶等)的多種清潔測定中，比較本發明的蛋白酶與枯草杆 菌蛋白酶，來評估清潔性能。實際上，本領域技術人員熟悉使用分光光度法和其他分析方法 在標準洗滌循環條件下評估洗滌劑的性能。可用於本發明的測定包括但不限於在WO 99/34011和美國專利號6，605，458 (參 見例如，實施例3)中描述的。在美國專利號6，605，458中，在實施例3中，在ρΗΙΟ. 5、洗滌 時間15分鐘、15°C、水硬度6° dH、IOnM酶濃度條件下，使用3. Og/Ι的洗滌劑劑量，在帶攪 棒的150ml玻璃燒杯中，使用5片紡織品片(phi 2. 5cm)和50ml來自Center for Test MaterialsHolland 的 EMPA 117 測試材料。使用 Macbeth ColorEye 7000 光度計，在 460nm 處測量測試材料的反射度「R」。本文的實施例中提供了其他方法。因此，這些方法也可用於 本發明。向常規洗滌組合物中添加本發明的蛋白酶不產生任何特殊的用途限定。換言之， 適合洗滌劑的任何溫度和PH液適合本發明的組合物，只要pH落入本文提出的範圍內，且溫 度低於所述的蛋白酶的變性溫度。此外，本發明的蛋白酶可用於(單獨的或與增潔劑和穩 定劑組合的)不包含洗滌劑的清潔組合物中。當用於清潔組合物或洗滌劑中時，還要考慮氧化穩定性。因此，在一些應用中，根據多種用途的需要，穩定性與枯草桿菌蛋白酶相比是增強的、降低的或相當的。在一些實施 方案中，需要增強的氧化穩定性。本發明的一些蛋白酶特別適用於此類應用。當用於清潔組合物或洗滌劑中時，還要考慮熱穩定性。因此，在一些應用中，根據 多種用途的需要，穩定性與枯草桿菌蛋白酶相比是增強的、降低的或相當的。在一些實施方 案中，需要增強的熱穩定性。本發明的一些蛋白酶特別適用於此類應用。當用於清潔組合物或洗滌劑中時，還要考慮螯合劑穩定性。因此，在一些應用中， 根據多種用途的需要，穩定性與枯草桿菌蛋白酶相比是增強的、降低的或相當的。在一些實 施方案中，需要增強的螯合劑穩定性。本發明的一些蛋白酶特別適用於此類應用。在本發明的一些實施方案中，提供天然存在的蛋白酶，其與枯草桿菌蛋白酶相比， 在不同的PH表現出改變的酶活性。pH活性譜是pH對酶活性的圖，如實施例所述和/或通 過本領域已知的方法來構建。在一些實施方案中，獲得具有寬譜的天然存在的蛋白酶是期 望的(即，在PH範圍內，具有比相當的枯草桿菌蛋白酶更高的活性)。在其他實施方案中， 酶在任何PH下均無顯著升高的活性，或具有較尖銳的譜的天然存在的同源物(即，在給定 PH下，具有比枯草桿菌蛋白酶增強的活性，但在其他情況下活性較低)。因此，在多個實施 方案中，本發明的蛋白 酶具有不同的PH最適度和/或範圍。本發明並非意在限制任何特定 的PH或pH範圍。在本發明的一些實施方案中，清潔組合物包含本發明的蛋白酶，其水平是佔組合 物重量的約0. 00001%至約10%的1AG3和/或本發明的其他蛋白酶，以及包含清潔輔助材 料的餘量(balance)(例如，佔組合物重量的約99. 999%至約90. 0% )。在本發明的其他方 面，本發明的清潔組合物包含1AG3和/或其他蛋白酶，水平為佔組合物重量的約0. 0001% 至約10%，約0. 001%至約5%，約0. 001%至約2%，約0. 005%至約0. 5%的69B4或本發 明的其他蛋白酶，以及包含清潔輔助材料的清潔組合物餘量(例如，以重量計約99. 9999% 至約 90. 0%，約 99. 999%至約 98%，約 99. 995%至約 99. 5% )。在一些實施方案中，清潔組合物，除本發明的蛋白酶製品外，還包含一種或多種其 他酶或酶衍生物，所述酶或酶衍生物提供清潔性能和/或織物護理益處。此類酶包含但不 限於其他蛋白酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、纖維素酶、過氧化物酶(例如，蟲漆酶)和/或甘 露聚糖酶。 任何適合在鹼性溶液中使用的其他蛋白酶都可用於本發明的組合物。合適的蛋白 酶包含動物、植物或微生物來源的。在特定的實施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些實施 方案中，包含化學的或遺傳修飾的變體。在一些實施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶、鹼性 微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的實例包含枯草桿菌蛋白酶，特別是源自 芽孢桿菌屬物種(例如，枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌和解澱粉芽孢桿菌)的蛋白酶，以及 枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、GG36、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌 蛋白酶168。其他實例包含在美國專利號RE34, 606,5, 955，340,5, 700，676,6, 312，936和 6，482，628中描述的變體蛋白酶，均引入本文作為參考。其他蛋白酶的實例包含但不限於胰 蛋白酶(例如，豬或牛來源的)，和WO 89/06270中描述的鐮孢菌(Fusarium) 蛋白酶。市售蛋白酶包含以商標名MAXATASE 、MAXACAL 、MAXAPEMtm、
OPTICLEAN 、OPTIMASE 、PROPERASE 、PURAFECT 和PURAFECT OXP(Genencor)出售的那些蛋白酶，以商標名 ALCALASE 、SAVINASE 、PRIMASE 、DURAZYM 、RELASE 和ESPERASE (Novozymes)出售的那些蛋白酶；和以商標名BLAP (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，德國)出售的蛋白酶。在W095/23221、 W092/21760，和美國專利號 5，801，039,5, 340，735,5, 500，364,5, 855，625 中描述了多種蛋 白酶。另一 BPN，變體(在本文中稱為「BPN-var 1 」和「BPN-變體1 」)描述在US RE 34,606 中。另一 GG36-變體(在本文中稱為「GG36-var 1」和「GG36-變體1」)描述在美國專利號 5，955，340和5，700，676中。其他GG36-變體描述在美國專利號6，312，936和6，482，628 中。在本發明的一個方面，本發明的清潔組合物包含其他蛋白酶，水平為佔組合物重量的 0. 00001%至10%，以及佔組合物重量的99. 999%至90. 0%的清潔輔助材料。在本發明的 其他實施方案中，本發明的清潔組合物還包含蛋白酶，水平為佔組合物重量的0. 0001%至 10%，0. 001%至5%，0. 001%至2%，0. 005%至0. 5%的69B4蛋白酶(或其同源物或變 體)，以及包含清潔輔助材料的清潔組合物餘量(例如，以重量計約99. 9999%至約90. 0%, 約 99. 999 % 至約 98 %，約 99. 995 % 至約 99. 5 % )。
此外，任何適合在鹼性溶液中使用的脂肪酶都可用於本發明。合適的脂肪酶包 含但不限於細菌或真菌來源的。本發明涵蓋了化學或遺傳修飾的變體。有用的脂肪酶的 實例包含Humicola lanuginosa脂肪酶(參見例如，EP 258068和EP 305216)、米赫根毛 黴(Rhizomucor miehei)脂肪酶(參見例如，EP 238023)、假絲酵母(Candida)脂肪酶， 例如南極假絲酵母(C. antarctica)脂肪酶(例如，南極假絲酵母脂肪酶A或B，參見例 如EP 214761)、假單胞菌(Pseudomonas)脂肪酶例如產鹼假單胞菌(P. alcaligenes)和 類產鹼假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(參見例如EP 218272)、洋蔥假單胞菌 (P. cepacia)脂肪酶(參見例如EP 331376)、斯氏假單胞菌(P. stutzeri)脂肪酶(參見例 如GB 1，372，034)、螢光假單胞菌(P. fluorescens)脂肪酶、芽孢桿菌脂肪酶(例如，枯草芽 孢桿菌脂肪酶(Dartois 等人，Biochem. Biophys. Acta 1131 253-260 [1993])；嗜熱脂肪芽 孢桿菌脂肪酶(參見例如JP 64/744992)；和短芽孢桿菌脂肪酶(參見例如W091/16422))。此外，多種克隆的脂肪酶可用於本發明的一些實施方案，包含但不限於沙門 柏乾酪青黴(Penicillium camembertii)脂肪酶(參見，Yamaguchi 等人，Gene 103 61-67 [1991])、白地黴(Geotricum candidum)脂肪酶(參見，Schimada 等人，J. Biochem.， 106 :383-388[1989])和多種根黴(Rhizopus)脂肪酶，例如德氏根黴(R. delemar)脂肪酶 (參見，Hass 等人，Gene 109 :117_113[1991])、雪白根黴(R. niveus)脂肪酶(Kugimiya 等 人，Biosci. Biotech. Biochem. 56 :716_719 [1992])和米根黴(R. oryzae)脂肪酶。其他類型的脂肪水解酶(如角質酶)也可用於本發明的一些實施方案中，包含但 不限於源自門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)的角質酶(參見WO 88/09367)，或 源自腐皮鐮孢菌(Fusarium solani pisi)的角質酶(參見WO 90/09446)。其他合適的脂肪酶包含市售脂肪酶例如M1LIPASE 、LUMAFAST 和 LIP0MAX (Genencor) ；LIPOLASE 和LIPOLASE ULTRA (Novozymes)；和 LIPASE P " Amano" (Amano PharmaceuticalCo. Ltd. , H^S ) ο在本發明的一些實施方案中，本發明的清潔組合物還包含脂肪酶，水平為佔組合物重量的0.00001%至10%，以及佔組合物重量的餘量清潔輔助材料。在本發明的其他方 面，本發明的清潔組合物還包含脂肪酶，水平為佔組合物重量的0. 0001%至10%，0. 001% 至 5%，0. 001%至 2%，0. 005%至 0. 5%。任何適合在鹼性溶液中使用的澱粉酶(α和/或β)都可用於本發明。合 適的澱粉酶包含但不限於細菌或真菌來源的。在一些實施方案中還包含了化學或 遺傳修飾的變體。可用於本發明的澱粉酶的實例包含但不限於獲得自地衣芽孢杆 菌的α-澱粉酶(參見例如，GB 1, 296, 839) 0可用於本發明的市售澱粉酶包含但 不限於 DURAMYL 、TERMAMYL 、 FUNGAMYL 、BAN 、 STAINZYME 和 NATALASE (Novozymes)，以及 RAPIDASE 和 MAXAMYL P(Genencor International)。在本發明的一些實施方案中，本發明的清潔組合物還包含澱粉酶，水平為佔組 合物重量的約0. 00001%至約10%的其他澱粉酶，以及以重量計，佔餘量的清潔輔助材 料。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物還包含澱粉酶，水平為佔組合物重量的約 0. 0001%至約 10%，約 0. 001%至約 5%，約 0. 001%至約 2%，約 0. 005%至約 0. 5%。任何適合在鹼性溶液中使用的纖維素酶都可用於本發明的一些實施方案。合適的 纖維 素酶包含但不限於細菌或真菌來源的。在一些實施方案中還包含了化學或遺傳修飾的 變體。合適的纖維素酶的實例包含但不限於Humicola insolens纖維素酶(參見例如，美 國專利號4，435，307)。特別適合的纖維素酶是有顏色護理益處的纖維素酶(參見例如，EP 0495257)。可用於本發明的市售纖維素酶包含但不限於CELLUZYME (Novozymes) 和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。在一些實施方案中，摻入的纖維素酶是成熟野生型或 變體纖維素酶的部分或片段，其中缺失了 N端部分(參見例如，美國專利號5，874，276)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物還可以包含纖維素酶，水平為佔組合物 重量的約0. 00001%至約10%的其他纖維素酶，以及以重量計，佔餘量的清潔輔助材料。 在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物還包含纖維素酶，水平為佔組合物重量的約 0. 0001%至約 10%，約 0. 001%至約 5%，約 0. 001%至約 2%，約 0. 005%至約 0. 5%。任何適合在洗滌劑組合物和/或鹼性溶液中使用的甘露聚糖酶都可用於本發 明。合適的甘露聚糖酶包含但不限於細菌或真菌來源的。在一些實施方案中還包含了化 學或遺傳修飾的變體。可用於本發明的多種甘露聚糖酶是已知的(參見例如，美國專利號 6，566，114,6, 602，842 和 6，440，991，均引入本文作為參考)。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物還可以包含甘露聚糖酶，水平為佔組合 物重量的約0. 00001%至約10%的其他甘露聚糖酶，以及以重量計，佔餘量的清潔輔助材 料。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物還包含甘露聚糖酶，水平為佔組合物重量的 約 0. 0001%至約 10%，約 0. 001%至約 5%，約 0. 001%至約 2%，約 0. 005%至約 0. 5%。在一些實施方案中，過氧化物酶與過氧化氫或其來源(例如，過碳酸鹽、過硼酸鹽 或過硫酸鹽)組合的使用。在替代性實施方案中，氧化酶與氧組合使用。兩類酶都用於「溶 液漂白」(即，當在洗滌液中同時洗滌織物時，防止紡織品染料從染色的織物轉移到其他織 物上)，與增效劑一起使用(參見例如，WO 94/12621和WO 95/01426)。合適的過氧化物酶 /氧化酶包含但不限於植物、細菌或真菌來源的。在一些實施方案中還包含了化學或遺傳修飾的變體。在一些實施方案中，本發明的清潔組合物還可以包含過氧化物酶和/或氧化酶， 其水平為佔組合物重量的約0.00001%至約10%的其他過氧化物酶和/或氧化酶，以及以 重量計，佔餘量的清潔輔助材料。在本發明的其他方面，本發明的清潔組合物還包含過氧化 物酶和/或氧化酶，水平為佔組合物重量的約0. 0001%至約10%，約0. 001%至約5%，約 0. 001%至約 2%，約 0. 005%至約 0. 5%。本文涵蓋了上述酶的混合物，特別是1AG3酶、一種或多種其他蛋白酶、至少一種 澱粉酶、至少一種脂肪酶、至少一種甘露聚糖酶，和/或至少一種纖維素酶的混合物。實際 上，本發明可以考慮使用上述酶的多種混合物。考慮蛋白酶以及一種或多種其他酶的不同水平均可獨立的達到10%，清潔組合物 的餘量為清潔輔助材料。通過考慮待清潔的表面、物品或織物，以及在使用過程中(例如， 提供洗滌洗滌劑使用)用於清潔條件的組合物的期望形態，可以方便的確定對清潔輔助材 料的具體選擇。合適的清潔輔助材料的實例包含但不限於表面活性劑、增潔劑、漂白劑、漂白活化 齊U、 漂白催化劑、其他酶、酶穩定系統、螯合劑、光學增白劑、土壤釋放聚合物、染料轉移劑、 分散劑、消泡劑、染料、香料、著色劑、填充鹽、水溶助長劑、光活化劑、螢光劑、織物調節劑、 可水解的表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗收縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、色斑、銀護 理劑、抗晦暗劑和/或抗腐蝕劑、鹼度來源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和PH控制劑(參 見例如，美國專利號 6，610，642,6, 605，458,5, 705，464,5, 710，115,5, 698，504,5, 695，679、 5，686，014和5，646，101，均引入本文作為參考)。下文詳細示例了特定清潔組合物材料的 實施方案。如果清潔輔助材料與清潔組合物中的本發明蛋白酶不相容，則使用合適的方法將 清潔輔助材料和一種或多種蛋白酶分隔(即，不彼此接觸)，直至適合組合這兩種組分時。 此類分隔方法包括本領域已知的任何合適方法(例如，軟膠囊、封裝、片劑、物理分隔等)。在一些實施方案中，組合物中包含有效量的本文提供的一種或多種蛋白酶，所述 組合物用於清潔多種需要去除蛋白質汙漬的表面。此類清潔組合物包含用於以下應用的清 潔組合物，如清潔硬表面、織物和餐具。實際上，在一些實施方案中，本發明提供了織物清潔 組合物，而在其他實施方案中，本發明提供了非織物清潔組合物。值得注意的，本發明還提 供了適合個人護理的清潔組合物，包含口腔護理(包含潔牙劑、牙膏、漱口劑等，以及潔齒 組合物)、皮膚和頭髮清潔組合物。本發明旨在涵蓋任何形式的洗滌劑組合物(即，液體、顆 粒、條形、半固體、凝膠、乳液、片劑、膠囊等)。作為示例，下文更詳細地描述了可使用本發明的蛋白酶的一些清潔組合物。在一 些實施方案中，本發明的清潔組合物配製成適合衣物機洗方法的組合物，本發明的組合物 含有至少一種表面活性劑和至少一種增潔劑化合物，以及一種或多種清潔輔助材料，所述 材料選自有機聚合化合物、漂白劑、其他酶、消泡劑、分散劑、石灰皂分散劑、土壤懸浮劑和 抗再沉積劑以及緩蝕劑。在一些實施方案中，洗衣組合物還含有軟化劑(即，作為其他的清 潔輔助材料)。本發明的組合物還可用於固體或液體形式的洗滌劑添加劑產品。此類添加劑產品 旨在補充和/或提高常規洗滌劑組合物的性能，可以在清潔過程的任何階段添加。
在一些實施方案中，配製成用於手工洗碗方法的組合物，所述組合物包含至少一 種表面活性劑和/或至少一種其他的清潔輔助材料，所述材料選自有機聚合化合物、增泡 齊 、π族金屬離子、溶劑、水溶助長劑和其他酶。在一些實施方案中，本文的衣物洗滌劑組合物的密度範圍在約400至約1200g/ 升，而在其他實施方案中，在約20°C下測量時，範圍在約500至約950g/升組合物。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶可用於多種清潔組合物，例如在美國專利號 6，605，458中提供的。因此，在一些實施方案中，包含至少一種本發明蛋白酶的組合物是致 密的顆粒狀織物清潔組合物，而在其他實施方案中，組合物是用於著色織物洗滌的顆粒狀 織物清潔組合物，在其他實施方案中，組合物是通過洗滌力提供軟化的顆粒狀織物清潔組 合物，在其他實施方案中，組合物是重役型液體織物清潔組合物。在一些實施方案中，包含至少一種本發明蛋白酶的組合物是織物清潔組合物，例 如在美國專利號6，610，642和美國專利號6，376，450中描述的。此外，本發明的蛋白酶可 用於在歐洲或日本洗滌條件下的特定用途的顆粒狀衣物洗滌劑組合物 (參見例如，美國專 利號 6，610，642)。在替代性的實施方案中，本發明提供了包含至少一種本文提供的蛋白酶的硬表面 清潔組合物。因此，在一些實施方案中，包含至少一種本發明蛋白酶的組合物是硬表面清潔 組合物(參見例如，美國專利號6，610，642,6, 376，450和6，376，450)。在其他實施方案中，本發明提供了包含至少一種本文提供的蛋白酶的洗碗組合 物。因此，在一些實施方案中，包含至少一種本發明蛋白酶的組合物是硬表面清潔組合物 (參見例如，美國專利號6，610，642和6，376，450)。在其他實施方案中，本發明提供了包含至少一種本文提供的蛋白酶的洗碗組合 物。因此，在一些實施方案中，包含至少一種本發明蛋白酶的組合物包含口腔護理組合物 (參見例如，美國專利號6，376，450和6，376，450)。化合物和清潔附加材料的配方和描述(參見例如美國專利號6，376，450、 6，605，458,6, 605，458和6，610，642，通過引用清楚地整合到本文中)。下文實施例中提出 了其他實例。另外，本發明提供了用於生產食品或動物飼料的組合物和方法，其特徵在於將本 發明蛋白酶與食品或動物飼料混合。在一些實施方案中，上述蛋白酶在加工之前作為乾燥 產品加入，而在其他實施方案中，其在加工之前或之後作為液體加入。在使用乾粉的一些實 施方案中，在乾燥載體(例如磨碎的穀粒)上將酶稀釋為液體。本發明的蛋白酶可用作動 物飼料和/或添加劑的組分(參見例如，美國專利號5，612，055,5, 314，692和5，147，642， 均引入本文作為參考)。本發明的酶飼料添加劑適於以多種方法製備。例如，在一些實施方案中，通過混合 具有適當活性的不同酶以產生酶混合物，來簡單地製備。在一些實施方案中，該酶混合物直 接與飼料混合，而在其他實施方案中，將其浸漬到基於穀物的載體材料(如，磨碎的小麥、 玉米或大豆粉)上。本發明還涵蓋了這些經過浸漬的載體，因為它們可用作酶飼料添加劑。在一些替代性實施方案中，用具有適當活性的酶同時或依次浸漬基於穀物的載體 (例如，磨碎的小麥或玉米)。例如，在一些實施方案中，磨碎的小麥載體先用木聚糖酶噴 霧，然後用蛋白酶，任選的用葡聚糖酶噴霧。本發明還涵蓋了這些經過浸漬的載體，因為它們可用作酶飼料添加劑。在一些實施方案中，這些經過浸漬的載體包含至少一種本發 明的蛋白酶。在一些實施方案中，本發明的飼料添加劑與動物飼料直接混合，而在替代性實施 方案中，其與一種或多種其他飼料添加劑混合，例如維生素飼料添加劑、礦物質飼料添加劑 和/或胺基酸飼料添加劑。然後，將所獲得的包含幾種不同類型組分的飼料添加劑以適當 的量與飼料混合。在一些實施方案中，本發明的飼料添加劑，包含基於穀物的載體，通常以約0.01 至約50g/kg飼料的量進行混合(例如，約0. 1至約10g/kg，或約lg/kg)。在替代性的實施方案中，本發明的酶飼料添加劑涉及構建以期望的相對量產生期 望的一種或多種酶的重組微生物。在一些實施方案中，通過提高編碼至少一種本發明蛋白 酶的基因的拷貝數，和/或通過使用與編碼一種或多種蛋白酶的多核苷酸有效連接的適當 的強啟動子來實現。在其他實施方案中，根據需要，重組微生物菌株缺失了一些酶活性(例 如，纖維素酶、內切葡聚糖酶等)。在其他實施方案中，本發明提供的酶飼料添加劑還包含其他酶，包含但不限於至 少一 種木聚糖酶、α-澱粉酶、葡糖澱粉酶、果膠酶、甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷 酸酶和/或脂肪酶。在一些實施方案中，在浸漬到基於穀物的載體上之前，混合具有期望活 性的酶與木聚糖酶和蛋白酶，或者可選的，將此類酶同時或依次浸漬到此類基於穀物的載 體上。然後，將載體與基於穀物的飼料混合，製備最終的飼料。在替代性實施方案中，將酶 飼料添加劑配製成單個酶活性的溶液，然後，與預製為丸狀或糊狀物的飼料材料混合。在其他實施方案中，通過摻入到第二種(即，不同的)飼料中或動物的飲用水中， 使動物飲食中包含酶飼料添加劑。因此，本發明提供的酶混合物不必須摻入基於穀物的 飼料本身，雖然此類摻入形成了本發明的特定實施方案。在一些實施方案中，木聚糖酶活 性單位/g飼料添加劑與蛋白酶活性單位/g飼料添加劑的比值是約1 0.001-1，000，約 1 0.01-100，或約1 0. 1-10。如上所述，本發明提供的酶混合物可在基於穀物的飼料的 製備中用作飼料添加劑。在一些實施方案中，基於穀物的飼料包含至少25wt%，或更多的至少35wt%的小 麥或玉米，或者這兩種穀物的組合。飼料還包含這樣的量的蛋白酶(即，至少一種本發明的 蛋白酶)，所述蛋白酶的量使包含蛋白酶的飼料中包含約100至約100，000蛋白酶活性單位 /kg飼料的量。本發明提供的基於穀物的飼料可作為用於多種非人動物的飼料，所述動物包含家 禽(例如，火雞、鵝、鴨、雞等)、家畜(例如，豬、綿羊、牛、山羊等)和伴侶動物(例如，馬、 狗、貓、兔、小鼠等)。飼料特別適用於家禽和豬，特別是肉雞。本發明還提供用於處理紡織品的組合物，其包含至少一種本發明的蛋白酶。在一 些實施方案中，至少一種本發明的蛋白酶是適用於處理絲或羊毛的組合物中的組分(參見 例如，美國再版專利號216，034、EP 134，267、美國專利號4，533，359和EP 344，259)。此外，本發明的蛋白酶可用於期望從肌醇六磷酸鹽中分離磷的多種應用。因此， 本發明還提供產生具有改良性質的羊毛或動物毛材料的方法。在一些實施方案中，這些 方法包括以下步驟預處理羊毛、羊毛纖維或動物毛材料，預處理的方法選自等離子體 (plasma)處理工藝和Delhev工藝；以及將預處理過的羊毛或動物毛材料進行蛋白水解酶(例如至少一種本發明的蛋白酶)處理，所述酶的量可以有效改善性質。在一些實施方案 中，在等離子體處理之前進行蛋白水解酶處理，而在其他實施方案中，其在等離子體處理之 後進行。在其他實施方案中，其作為單獨的步驟進行，而在其他實施方案中，其與羊毛或動 物毛材料的擦洗或染色組合進行。在其他實施方案中，在酶處理步驟中存在至少一種表面 活性劑和/或至少一種軟化劑，而在其他實施方案中，在單獨步驟中摻入一種或多種表面 活性劑和/或一種或多種軟化劑，在所述步驟中對羊毛或動物毛材料進行軟化處理。在一些實施方案中，本發明的組合物可用於防縮水羊毛纖維的方法(參見例如，JP 4-327274)。在一些實施方案中，組合物用於羊毛纖維防縮水處理的方法，通過將纖維進 行低溫等離子體處理，然後，用防縮水樹脂(例如，嵌段氨基甲酸乙酯樹脂、聚醯胺環氧氯 丙烷樹脂、乙醛酸樹脂、亞乙基脲樹脂或丙烯酸樹脂)處理，然後，用減輕重量的蛋白水解 酶處理以獲得軟化效果。在一些實施方案中，等離子體處理步驟是低溫處理(例如，電暈放 電處理)或輝光放電處理。在一些實施方案中，使用氣體進行低溫等離子體處理(例如，選自空氣、氧、氮、 氨、氦或氬的氣體)。通常使用空氣，但在一些實施方案中，也可以使用其他氣體。可以在約0. 1託至5託的壓力下進行約2秒至約300秒的低溫等離子體處理(例 如，約5秒至約100秒，或約5秒至約30秒)。如上所述，本發明可與諸如Delhey工藝方法組合使用(參見例如， DE-A-4332692)。在該工藝中，在存在可溶性鎢酸鹽的條件下，在過氧化氫水溶液中處理羊 毛，其後任選地在合成聚合物的溶液或分散體中處理，以改善羊毛的抗縮絨性質。在該方法 中，在存在約2至約60% (w/w)(例如，約8至約20% (w/w))催化劑(例如，Na2WO4)，和存 在非離子型溼潤劑的條件下，在過氧化氫(約0. 1-約35% (w/w)，例如，約2-約10% (w/ w))的水溶液中處理羊毛。可以在pH 8-11和室溫下進行處理。處理時間取決於過氧化氫 和催化劑的濃度，但可以是約2分鐘或更短。在氧化處理後，用水漂洗羊毛。為了除去殘餘 的過氧化氫，並任選地進行額外的漂白，在還原劑(例如，亞硫酸鹽、亞磷酸鹽等)的酸性溶 液中進一步處理羊毛。在一些實施方案中，酶處理步驟進行約1分鐘至約120分鐘。在一些實施方案中， 該步驟在約20°C至約60°C (例如，約30°C至約50°C )的溫度下進行。可選的，用酶的水溶 液浸泡或填充羊毛，然後在常規溫度和壓力下汽蒸定型，一般處理約30秒至約3分鐘。在 一些實施方案中，在酸性或中性或鹼性基質中進行蛋白水解酶處理，在一些實施方案中，所 述基質包含緩衝劑。在替代性的實施方案中，在存在一種或多種常規陰離子型、非離子型(例如， Dobanol ；Henkel AG)或陽離子型表面活性劑的條件下，進行酶處理步驟。有效的非離子型 表面活性劑的實例是Dobanol (Henkel AG)。在其他實施方案中，將羊毛或動物毛材料進行 超聲處理，其在蛋白水解酶處理前進行或與其同時進行。在一些實施方案中，在約50 V的溫 度下進行約5分鐘的超聲處理。在一些實施方案中，基於羊毛或動物毛材料的重量，酶處理 步驟中使用的蛋白水解酶的量在約至約之間。在一些實施方案中，為了 減少處理步驟數，在羊毛或動物毛材料的染色和/或擦洗過程中進行酶處理，簡單地通過 將蛋白酶加入染色、漂洗和/或擦洗液體中來進行酶處理。在一些實施方案中，在等離子體 處理後進行酶處理，但在其他實施方案中，以相反順序進行這兩個處理步驟。
常規用於羊毛的軟化劑通常是陽離子型軟化劑，是有機陽離子型軟化劑或基於矽 氧烷的產品，但陰離子或非離子型軟化劑也是有效的。有效的軟化劑的實例包含但不限於 聚乙烯軟化劑和矽氧烷軟化劑(即，聚二甲基矽氧烷(矽油))、H-聚矽氧烷、矽氧烷高彈 體、氨基功能的聚二甲基矽氧烷、氨基功能的矽氧烷高彈體，以及環氧功能的聚二甲基矽氧 烷，和有機陽離子型軟化劑(例如烷基季銨鹽衍生物)。在其他實施方案中，本發明提供用於處理動物生皮的組合物，其包含至少一種本 發明的蛋白酶。在一些實施方案中，本發明的蛋白酶可用於處理動物生皮的組合物，如WO 03/00865 (Insect Biotech Co.，Taejeon-Si, Korea)中所述。在其他實施方案中，本發明 提供用於將生皮和/或皮加工成皮革的方法，其包括用本發明的蛋白酶對所述生皮或皮進 行酶處理(參見例如，WO 96/11285)。在其他實施方案中，本發明提供用於將動物皮或生皮 處理成皮革的組合物，所述組合物包含至少一種本發明的蛋白酶。通常在製革廠中以醃製過或乾燥的生皮或皮的形式獲得生皮和皮。將生皮或皮加 工成皮革的方法包括若干不同的加工步驟，包括浸泡、脫毛和軟化的步驟。這些步驟構成了 溼加工，在浸灰間中進行。在涉及皮革加工的方法期間的任何時段，都可使用利用了本發明 蛋白酶的酶處理。然而，通常在溼加工的過程中(即，在浸泡、脫毛和/或軟化的過程中) 使用蛋白酶。因此，在一些實施方案中，在溼加 工階段期間進行使用了至少一種本發明蛋白 酶的酶處理。在一些實施方案中，在常規浸泡條件下(例如，pH範圍是約pH 6. 0-約11)實施 本發明的浸泡工藝。在一些實施方案中，範圍是約PH7.0-約10.0。在替代性實施方案中， 溫度範圍是約20-30°C，而在其他實施方案中，範圍是約24-28°C。在其他實施方案中，反應 時間的範圍是約2-24小時(例如，範圍是約4-16小時)。在其他實施方案中，根據需要提 供表面活性劑和/或防腐劑。軟化步驟的第二階段通常始於軟化劑的加入。在一些實施方案中，在軟化過程中 進行酶處理。在一些實施方案中，在軟化過程中，在脫灰階段之後進行酶處理。在一些實施 方案中，使用常規條件(例如，PH範圍是約pH 6.0-9.0)實施本發明的軟化工藝。在一些實 施方案中，PH範圍是約6. 0-8. 5。在其他實施方案中，溫度範圍是約20-30 °C，而在其他實施 方案中，溫度範圍是約25-28°C。在一些實施方案中，反應時間範圍是約20-90分鐘，而在其 他實施方案中，範圍是約40-80分鐘。用於產生皮革的工藝是本領域技術人員熟知的(參 見例如，WO 94/069429, WO 90/1121189、美國專利號 3，840，433、EP 505920,GB 2233665 和 美國專利號3，986，926，均通過引用整合到本文)。在其他實施方案中，本發明提供了包含至少一種本發明蛋白酶的軟化劑。軟化劑 是一種試劑或含酶製劑，其包含在浸灰間工藝(特別是在皮革產生的軟化工藝中使用)中 使用的化學活性成分。在一些實施方案中，本發明提供了包含蛋白酶和適當賦形劑的軟化 齊U。在一些實施方案中，試劑包含但不限於本領域已知的和已使用的化學品(例如，稀釋 劑、軟化劑、脫灰劑和載體)。在一些實施方案中，根據本領域已知的製備包含至少一種本發 明蛋白酶的軟化劑(參見例如，GB-A2250289、W096/11285和EP0784703)。在一些實施方案中，本發明的軟化劑含有約0. 00005至約0. Olg活性蛋白酶/g軟 化劑，而在其他實施方案中，軟化劑含有約0. 0002至約0. 004g活性蛋白酶/g軟化劑。因此，本發明的蛋白酶可用於多種應用和情況中。
具體實施例方式以下的實施例更詳細地描述了本發明，但其並非意在以任何方式限制本發明的範 圍。附圖應認為是本發明說明書和描述的完整部分。本文引用的所有參考文獻均特別併入 本文作為參考。提供以下實施例以用於說明而非限制本發明。在下文公開的實驗內容中使用以下縮寫PI(蛋白酶抑制劑)；ppm(百萬分之 一)；M(摩爾/升)；mM(毫摩爾/升)；μΜ(微摩爾/升)；ηΜ(納摩爾/升)；mol (摩 爾)；mmol (毫摩爾)；μ mol (微摩爾)；nmol (納摩爾)；gm(克)；mg(毫克)；yg(微 克)；Pg(皮克)；L(升)；ml和mL(微升)；μ 和1^(微升)；cm(釐米)；mm(毫米)； ym(微米)；nm(納米)；U(單位)；V(伏特)；麗(分子量)；sec(秒)；min(分鐘)；h 和hr (小時)；V (攝氏度)；QS(有效量)；ND(未進行)；NA(不適用)；rpm(每分鐘轉 數)；H20(水)；dH20(去離子水)；HCI (鹽酸)；aa(胺基酸)；bp(鹼基對)；kb(千鹼基 對)；kD (千道爾頓)；cDNA(拷貝或互補DNA) ；DNA(脫氧核糖核酸)；ssDNA(單鏈DNA)； dsDNA(雙鏈DNA) ；dNTP(脫氧核糖核苷酸三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2 (氯化鎂)； NaCl (氯化鈉)；w/v (重量/體積)；ν/ν (體積/體積)；g (重力)；OD (光密度)；Dulbecco 磷酸緩衝液(DPBS) ；S0C(2%細菌用胰蛋白腖、0.5%細菌用酵母提取物、IOmM NaCl, 2. 5mM KCl) ；Terrific 培養液(TB;12g/l 細菌用胰蛋白腖、24g/l 甘油、2. 31g/l KH2PO4 和 12. 54g/l K2HPO4) ；OD28tl (280nm 處的光密度) ；OD6tltl (600nm 處的光密度)；A405 (405nm ^h 的吸光度)；Vmax(酶催化反應的最高起始速率)；PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)；PBS(磷 酸緩衝鹽水[150mM NaClUOmM 磷酸鈉緩衝液，pH 7.21]) ；PBST(PBS+0. 25%TWEEN 20) ；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶鏈式反應)；RT-PCR(逆轉錄PCR) ；SDS(十二烷基硫 酸鈉)；Tris (三(羥甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N_[2_乙磺酸])； HBS(HEPES緩衝鹽水)；SDS (十二烷基硫酸鈉)；Tris-HCI (三[羥甲基]氨基甲烷-鹽酸 鹽)；Tricine(N-[三-(羥甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-環己基氨基)乙磺酸)； TAPS(3-{[三-(羥甲基)-甲基]-氨基}_丙磺酸)；CAPS(3-(環己基氨基)-丙磺酸； DMSO (二甲亞碸)；DTT(1，4-二硫代-DL-蘇糖醇)；SA (芥子酸(s，5-二甲氧基-4-羥基 肉桂酸))；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(還原型穀胱甘肽)；GSSG(氧化型穀胱甘肽)； TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居裡)；mCi(毫居裡)；μ Ci (微居裡)；HPLC(高壓液相層 析)；RP-HPLC(反向高壓液相層析)；TLC(薄層層析)；MALDI-T0F(基質輔助的雷射解吸/ 電離飛行時間)；Ts (甲苯磺醯基)；Bn (苄基)；Ph (苯基)；Ms (甲磺醯基)；Et (乙基)， Me (甲基)；Taq (棲熱水生菌(Thermus aquaticus) DNA 聚合酶)；Klenow (DNA 聚合酶 I 大 (Klenow)片段)；rpm (每分鐘轉數)；EGTA (乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N，，N，-四 乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla( β-內醯胺酶或氨苄青黴素抗性基因)；HDL(高密度 液體)；MJ Research (MJ Research，Reno，NV) ；Infors (InforsAG，Bottmingen-Basel，瑞 士)；Baseclear (Baseclear BV, Inc. ,Leiden, the Netherlands) ；PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) ；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan，San Jose, CA) ；Argo(Argo Bio Analytica，Morris Plains，NJ) ；Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach, 德 國)；Pall (Pall Corp.，East Hills， NY) ；Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA) ；MolecularStructure (Molecular Structure Corp.，Woodlands, TX) ；Accelrys(Accelrys, Inc.， San Diego, CA) ；ChemicalComputing(Chemical Computing Corp.，Montreal，力口拿大)； NewBrunswick (New Brunswick Scientific，Co.，Edison，NJ) ；CFT (Center forTest Materials，Vlaardingeng，the Netherlands) ；Procter & Gamble(Procter & Gamble， Inc.，Cincinnati，OH) ；GE Healthcare (GE Healthcare，Chalfont St.Giles, United Kingdom) ；DNA2. O(DNA2. O, Menlo Park, CA) ；OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) ；Megazyme(Megazymelnternational Ireland Ltd. ， Bray Business Park， Bray, Co.，Wicklow,愛爾蘭)；Finnzymes(Finnzymes Oy, Espoo，芬蘭)；Kelco (CP Kelco， Wilmington, DE) ；Corning(Corning Life Sciences，Corning，NY) ； (NEN(NEN Life Science Products, Boston, MA) ；Pharma AS (Pharma AS，Oslo，挪威)；Dynal (Dynal, Oslo, 挪威)；Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX) ；ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ；Gibco/BRL (Gibco/BRL，Grand Island，NY) ；Sigma (Sigma Chemical Co.，St.Louis, MO) ；Pharmacia (Pharmacia Biotech，Piscataway, NJ)； NCBI(National Center for Biotechnology Information) ；Applied Biosystems(Applied Biosystems, Foster City, CA) ；BD Biosciences 禾口 / 或 Clontech(BDBiosciences CLONTECH Laboratories， Palo Alto, CA) ；OperonTechnologies(Operon Technologies， Inc. ， Alameda, CA) ；MWG Biotech(MWG Biotech, High Point, NC) ；Oligos Etc(01igos Etc. Inc，Wilsonville, OR) ；Bachem(Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia， PA) ；Difco (DifcoLaboratories，Detroit，MI) ；Mediatech(Mediatech，Herndon，VA ； SantaCruz(Santa Cruz Biotechnology, Inc. ， Santa Cruz, CA) ；Oxoid(Oxoid Inc.， Ogdensburg，NY) ；Worthington (Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ) ；GIBCO BRL 或 Gibco BRL(Life Technologies， Inc. ， Gaithersburg， MD) ；Millipore(Millipore， Billerica，MA) ；Bio-Rad(Bio-Rad，Hercules，CA) ；Invitrogen (Invitrogen Corp.， San Diego, CA) ；NEB(New England Biolabs， Beverly, MA) ；Sigma(Sigma Chemical Co.， St.Louis, MO) ；Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford，IL) ；Takara(TakaraBio Inc. Otsu,日本)；Roche (Hoffmann-La Roche，Basel，瑞士)；EMScience (EM Science， Gibbstown, NJ) ；Qiagen (Qiagen，Inc.，Valencia, CA) ；Biodesign(Biodesign Intl.， Saco, 緬 因 州)；Aptagen (Aptagen，Inc.，Herndon, VA) ；Sorvall (Sorvan brand， from Kendro Laboratory Products， Asheville， NC) ；Molecular Devices(Molecular Devices, Corp.，Sunnyvale, CA) ；R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis，MN)； Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla，CA) ；Marsh(Marsh Biosciences， Rochester，NY) ；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments，Winooski, VT) ；(Biacore (Biacore， Inc. ,Piscataway, NJ) ；PeproTech(PeproTech，Rocky Hill, NJ) ；SynPep(SynPep，Dublin， CA) ；New Objective(New Objective brand ；Scientific Instrument Services, Inc.， Ringoes，NJ) ；Waters (Waters, Inc.，Milford，MA) ；Matrix Science (Matrix Science， Boston, MA) ；Dionex(Dionex, Corp. ,Sunnyvale,CA) ；Monsanto(Monsanto Co.,St.Louis, MO) ；Wintershall (Wintershall AG，Kassel，德國)；BASF(BASF Co.，FlorhamPark, NJ)； Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp.，Salt Lake City, UT) ；Enichem (Enichem Iberica，Barcelona，西班牙)；Fluka Chemie AG (FIuka Chemie AG，Buchs,瑞士)；Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft,荷蘭)；Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI) ；ServiceXS (Service XS,荷蘭)禾口 Microsoft (Microsoft, Inc. , Redmond, WA)。 在下文一些實施例中，提供了多種洗滌劑配方。下表提供了這些洗滌劑中使用的 一些組分的定義。洗滌劑定義
LAS直鏈cn_13烷基苯磺酸鈉
TAS動物脂烷基硫酸鈉
CxyASclx-cly烷基硫酸鈉
CxyEz與平均z摩爾的環氧乙烷縮合的以clx-cly為主的直鏈伯醇
CxyAEzS與平均z摩爾的環氧乙烷縮合的clx-cly烷基硫酸鈉。實施
例中指出了附加的分子
Nonionic混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇(例如Plurafac LF404)，其
為醇類，具有平均乙氧基化程度為3. 8，且平均丙氧基化程度為
4. 5.
QASR2. N+ (CH3)2 (C2H40H)，其中 R2 = C12-C14
Silicate無定形矽酸鈉(Si02 Na20比值=1. 6-3. 2 1)
Metasilicate矽醛鈉(Si02 Na20 比值=1. 0)
Zeolite A式 Na12 (A102Si02) 12. 27H20 的水合矽酸鋁
SKS-6式5 -Na2Si205的矽酸鹽層狀結晶
Sulfate無水硫酸鈉
STPP三磷酸鈉
MA/AA4 1丙烯酸/馬來酸的隨機共聚體，平均分子量為約
70，000-80，000
AA聚丙烯酸鈉聚合物，平均分子量為4，500
Polycarboxylate包含MW範圍在2，000-80，000的羧酸化單體(例如，丙烯酸、
mh馬來酸和甲基丙烯酸)混合物的共聚體，例如可從BASF商則
的Sokolan，其為丙烯酸的共聚物，MW4, 500
BB13-(3，4-二氫異喹啉鐺)丙烷磺酸鹽
BB21-(3,4- 二氫異喹啉鐺)-癸烷-2-硫酸鹽
PB1單水合過硼酸鈉
PB4標準通式NaB03. 4H20的四水合過硼酸鈉
過碳酸鹽標準通式2Na2C03. 3H202的過碳酸鈉
TAED四醯乙二胺
NOBS鈉鹽形式的壬醯基氧基苯磺酸鹽
DTPA二乙三胺五乙酸
HEDP1，1_羥基亞乙基二膦酸
DETPMPMonsanto以商標名Dequest 2060銷售的二乙基三胺五(亞甲基)
EDDS
二胺5-戊二胺；
DETBCHD氯化物，
PAAC
石蠟
石蠟烴磺酸鹽
醛糖氧化酶
半乳糖氧化酶
蛋白酶
中，
澱粉酶
Fungamyl 禾口 Duramyl
脂肪酶
纖維素酶
果膠裂合酶
PVP
PVN0
PVPVI
增白劑1
矽樹脂消泡劑
消泡劑
膦酸鹽鈉鹽形式的乙二胺-N，N' - 二琥珀酸(S，S)異構體 二甲基氨丙基胺；1，6_己二胺；1，3_丙二胺；2-甲基-1，
1,3-戊二胺；1-甲基-二氨基丙烷 5，12-二乙基-1，5，8，12_四氮雜雙環[6,6,2]鯨蠟烷，二
Mn(II)鹽 五胺乙酸鈷(III)鹽
ffintershall以商標名Winog 70出售的石蠟油
-些氫原子被磺酸基替換了的石蠟油或蠟 Novozymes A/S以商標名Aldose Oxidase出售的氧化酶 來自Sigma的半乳糖氧化酶 :Novo Nordisk A/S 以商標名 Savinas、Alcalase、Everlase 出售 的蛋白酶解酶，以及下列來自Genencor International, Inc的 「蛋白酶A」，描述在US RE 34，606的圖1A、IB和7中，以 及11欄11-37行中；「蛋白酶B」，描述在US5，955，340和 US5, 700，676的圖1A、1B和5中，以及表1中；「蛋白酶C」， 描述在 US6, 312，936 和 US 6，482，628 的圖 1-3 [SEQ ID NO 3]
和25欄12行中；「蛋白酶D」是W0 99/20723中描述的變體 101G/103A/104I/159D/232V/236H/245R/248D/252K(BPN，編 號)
:Genencor以商標名Purafect Ox Am出售的澱粉分解酶，描
述在 TO 94/18314、W096/05295 中；Natalase 、Termamyl 、 丨，均可購自Novozymes A/S
:Novozymes A/S 以商標名 Lipolase Lipolase Ultra 出售的禾口
Gist-Brocades以商標名Lipomax出售的脂肪水解酶 :Novozymes A/S 以商標名 Carezyme、Celluzyme 禾口 / 或 Endolase
出售的溶細胞酶(Cellulytic enzyme) 可購自 Novozymes A/S 的Pectaway 禾口pectawash 聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量為60，000 聚乙烯吡啶-N-氧化物，平均分子量為50，000. 乙烯基咪唑和乙烯吡咯烷酮的共聚物，平均分子量為20，000. 4,4' -二(2-磺酸基苯乙烯基)-聯苯二鈉 聚二甲基矽氧烷泡沫控制劑，具有矽氧烷-氧化烯共聚物作為分 散劑，所述泡沫控制劑與所述分散劑的比例為10 1至100 1 在顆粒形式中含12%矽氧烷/ 二氧化矽，18%硬脂醇，70%澱粉
srp 1陰離子封端的聚酯
peg x聚乙二醇，具有分子量X PVPK60 乙烯吡咯烷酮均聚物(平均 mw 160，000) __ -jr^-Jeffamine ED-2001 來自 Huntsman 的封端聚乙~■日於
Isachem AS來自Enichem的支鏈醇烷基磺酸酯
mme peg (2000)來自Fluka Chemie AG的單甲基醚聚乙二醇(MW 2000)
DC3225C矽氧烷消泡劑，矽油和二氧化矽的混合物，來自Dow Corning
TEPAE四亞乙基五胺乙氧基化物
BTA苯並三唑.
甜菜鹼(ch3) 3n+ch2coct
糖工業級D-葡萄糖或食品級糖
CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖胺
TPKFAC12-C14 去頭全切割脂肪酸(topped whole cut fatty acids)
粘土水合的矽酸鋁，通式為Al203Si02 xH20。類型高嶺土、蒙脫
土、凹凸棒土、伊利石、斑脫土、埃洛石
pH以在水中稀釋的溶液在20°C測量
實施例1
微生物菌株的分離和培養
在該實施例中，描述了鏈黴菌1AG3的分離和培養。所使用的分離培養基是具有利
福平選擇壓力的鹼性土壤提取瓊脂。如下製備土壤提取培養基土壤提取培養基的製備溶液A 將1kg花園土懸浮在1升水中，在120°C高壓滅菌20分鐘。冷卻至室溫，將懸浮液 傾倒在玻璃纖維濾器上，獲得澄清的濾液。用200ml和100ml軟化水洗滌土壤滯留物兩遍。 添加足量的水至體積為1升。溶液B NaCl 80g/LNa2C03 20g/L混合併在120°C滅菌20分鐘。利福平儲液將50mg/ml利福平(Sigma R3501)溶解在DMS0中，通過20 y m膜過濾滅菌。首先，將20g瓊脂添加到500ml溶液A中，在120°C滅菌溶液20分鐘。然後，將 500ml溶液A與500ml溶液B混合，並冷卻至60°C。然後，添加利福平，產生終濃度為50 u g/ ml。然後，將瓊脂混合物傾倒到Petri平板中，並儲存在4°C封閉的聚乙烯袋中，直到接種生 物。將湖水沉積物和水與溶液B按1 1的比例混合，並充分振蕩。在沉澱後，將系列 稀釋的上清倒在土壤提取瓊脂上，PH 10且含有利福平。將平板置於30°C下，在裝有溼紙 巾的緊閉塑料盒中孵育數周，從而維持溼度並防止蒸發。通過立體顯微鏡周期性檢查平板。 挑取在這些檢查中觀察到的絲狀克隆，並接種在新鮮培養基上。
實施例2通過16S rRNA測序鑑別1AG3菌株在該實施例中，描述了通過16S rRNA測序鑑別鏈黴菌菌株1AG3所進行的實驗。如 下所述，通過PCR獲得含有16S rRNA基因的前500個鹼基對的染色體DNA片段。確定片段 的核苷酸序列。合成和測序使用相同的引物。引物33385，_G(A/T)A TTA CCG CGG C (G/T) G CTG-3，(SEQ ID NO 22)35725，-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，(SEQ ID NO 21)PCR 方案反應混合物含有 10iiL Pwo 緩衝液(Boehringer Mannheim)、80. 5 ii L 去離子 水、2 ii L dNTP (各 lOmM)、1 P L 的各種引物(10 y g/ y L)、0. 5 y L Pwo 聚合酶(5U/ u L) (Boehringer Mannheim),置於 500 u 1 Eppendorf 管中。PCR的條件是在95°C，45秒，然後在55 °C，45秒，然後在72°C，2分鐘進行25個 循環。通過瓊脂糖凝膠電泳，然後利用產生商的試劑盒說明書，使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)從凝膠中切出並分離，純化PCR片段。本文鑑別的鏈黴菌菌株 1AG3的部分16S rRNA基因具有下列序列1 GATCCTGGCT CAGGACGAAC GCTGGCGGCG TGCTTAACAC ATGCAAGTCG51 AACGATGAAG CCGCTTCGGT GGTGGATTAG TGGCGAACGG GTGAGTAACA101 CGTGGGCAAT CTGCCCTGCA CTCTGGGACA AGCCCGGGAA ACTGGGTCTA151 ATACCGGATA TGACTGCTTC GGGCATCCGA GGTGGTGGAA AGCTCCGGCG201 GTGCAGGATG GGCCCGCGGC CTATCAGCTT GTTGGTGGGG TGATGGCCTA251 CCAAGGCGAC GACGGGTAGC CGGCCTGAGA GGGCGACCGG CCACACTGGG301 ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGC351 ACAATGGGCG CAAGCCTGAT GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT401 TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAG AAGC (SEQ ID NO 12)GenBank的Blastn檢索揭示，與菌株1AG3最接近的物種是索馬利亞鏈黴菌，在 434bp的重疊區具有97%同一性，提示菌株1AG3最可能是鏈黴菌屬物種。實施例3鑑別存在於嗜鹼性鏈黴菌(alkaliphilic Streptomyces)菌株1AG3中的新蛋白 酶的部分基因序列在該實施例中，描述了用於鑑別鏈黴菌1AG3蛋白酶基因序列的部分序列的方法 和組合物。使用簡併引物Str印tomycProt_FW和Str印tomycProt_RV，在天然分離的鏈黴 菌1AG3的染色體DNA上實施PCR。PCR獲得的DNA片段編碼新蛋白酶，與稱為「鏈黴菌蛋白 酶」的蛋白質相似。PCR方法使用下列簡併的引物對Str印tomycProt_FW 5，-CGCTGYTCWTSGGCTTC-3，(SEQ ID NO 13)StreptomycProt_RV 5，-GCAGTYGCCNNNGCCGCCGGASGT-3，(SEQ ID NO 14)在熱循環儀上實施PCR，根據產生商的說明(退火溫度為50攝氏度)，使用高 保真 Platinum Taq 聚合酶(Invitrogen)。如 Kieser 等人(Kieser 等人，PracticalStreptomyces Genetics,The John Innes Foundation, Norwich,United Kingdom[2000]) 所述，分離鏈黴菌菌株1AG3的基因組DNA，在PCR中作為模板DNA使用。PCR獲得的PCR片 段長約400bp，DNA測序(ServiceXS)揭示該PCR片段的DNA序列編碼了與其他絲氨酸蛋白 酶相似的蛋白質。下文顯示了該1AG3蛋白酶的部分核苷酸序列。在該序列中，簡併的FW 引物的序列用下劃線表示。由於在運行結尾時較低的序列信息質量(如N的數量所示)，未 發現RV引物(通過N的數字表示)。1 CGCTGTTCGC TGGGCTTCCC CGTTCGCCGC GGAACTCAGG CGGGCTTCGC GACCGCGGGT61 CACTGCGGCC GGGTCGGCAC CACCACACGG GGCTTCAACC AGGTGGCGCA GGGCACCTTC121 CAGGGCTCCA TCTTCCCCGG GCGCGACATG GGCTGGGTCG CGGTCAACTC CAACTGGAAC181 ACCACCCCCT TCGTCCGCGG CCAGGGGGGC GCGAACGTGA CGGTGGCGGG TTCGCAGCAG241 GCTCCGGTCG GCTCCTCGGT GTGCCGTTCC GGCTCCACCA CCGGCTGGCA CTGCGGCACC301 ATCCAGCAGC ACAACACCTC GGTGCGCTAT CCGGAGGGCC ACCATCAGCG GAGTGACCAC361 GACCTCGGTG TGCGCCGAAC CNTAGTGACT CCGGCGGCGC CTACATCTTT GGGAACCACN421 GCCCAGGGGC GTNTANGTCC CNTCCACCNA AGGCCANNTG CCA(SEQ ID NO 15)下列序列是1AG3蛋白酶的部分(翻譯的)胺基酸序列RCSLGFPVRR GTQAGFATAG HCGRVGTTTR GFNQVAQGTF QGSIFPGRDMGWVAVNSNWN TTPFVRGQGG ANVTVAGSQQ APVGSSVCRS GSTTGWHCGTIQQHNTSVRY PEG(SEQ ID NO 16)Blastn檢索揭示，來自天藍色鏈黴菌(Str印tomyces coelicolor)的蛋白質鏈黴 菌蛋白酶C與來自多個鏈黴菌屬物種和其他微生物體的其他鏈黴菌蛋白酶和絲氨酸蛋白 酶之間的相似性。實施例4對1AG3蛋白酶的完整基因和蛋白質序列的說明在該實施例中，描述了用於說明完整的1AG3蛋白酶基因和蛋白質序列所進行的 實驗。在這些實驗中，在新鏈黴菌菌株1AG3的染色體DNA上實施反向PCR實驗，從嗜鹼性 鏈黴菌菌株1AG3中分離並克隆全長的1AG3蛋白酶基因。基於實施例3描述的鏈黴菌菌株 1AG3蛋白酶基因的約400bp片段的DNA序列，設計新的DNA弓丨物lAG3prot_RV 5，-GCGAAGCCCGCCTGAGTTCCGCGGCGAACG-3，(SEQ ID NO 18)lAG3prot_Fff 5，-GTGCCGTTCCGCCTCCACCACCGGCTGGCAC-3，(SEQ ID NO 17)用限制性酶六 &1、83111111、8881111、恥111、恥1~1、叱01、他61、卩￥111、5&11或 Sstll 消 化嗜鹼性鏈黴菌菌株1AG3的染色體DNA，根據產生商的說明，使用Qiagen PCR純化試劑盒 (Qiagen，貨號28106)純化，並用T4DNA連接酶(Invitrogen)自身連接。使用Qiagen PCR 純化試劑盒(Qiagen)純化連接混合物，並用引物lAG3prot_RV和lAG3prot_FW對用Ncol、 Narl.BssHII或Sail消化的DNA片段實施PCR，然後自身連接，獲得約0. 6和2. 5kb之間的 PCR產物。根據產生商的說明，在熱循環儀上用高保真Platinum Taq聚合酶(Invitrogen) 實施PCR(退火溫度為55°C，35個循環)。DNA測序分析(BaseClear，荷蘭)揭示，DNA片段 覆蓋了來自灰色鏈黴菌(Str印tomyces griseus)的鏈黴菌蛋白酶樣蛋白酶基因的主體部 分。在相同的PCR產物上，使用引物lAG3-up 1(5，-GTGGTGGCCACGACCAGCTCGGCGGTCTC-3『 ；SEQ ID NO 27)和 lAG3_up2 (5，-TGGTCCAGGAACCGGCGAAGGTGTC ；SEQ IDNO :28)，通過其他序列分析反應(BaseClear)獲得完整的 1AG3蛋白酶基因序列。用這些引物進行序列分析，導致鑑別了 1362bp的完整的1AG3蛋白 酶基因序列。下文提供了所述序列。1 GACAGC GAGGAG ACCCCT C ATG CA CCGCAG ACGCGG AGCGCT ATTCGC CGGCGC CGTGGCCTGTCG CTCCTC TGGGGA GTACGT GGCGTC TGCGCC TCGCGA TAAGCG GCCGCG GCACCG61 GATAGC CGCCCT GACGAT CGCCGC CGCGCC
GGCC AC CGCCGG ACCGGC CCTCGC CCCGCCCTATCG GCGGGA CTGCTA GCGGCG GCGCGG
CCGG :TG GCGGCC TGGCCG GGAGCC- GGGCGG
ACCGGC CCAGGA GACGGC^6GCCCA_GGAGAT CCCTGC CGGCAT GCTGCA GGCCAT GCAGCG U TGGCCG GGTCCT CTGCC^CrifcGGGf CCTCTA GGGACG GCCGTA CGACGT CCGGTA CGTCGC
TGATCT CGGCCT CACCGA GCAGCA GGCCGA GGAGCG CGTGGC CAACGA GTACCA AGCGGG 丄8 丄 ACTAGA GCCGGA GTGGCT CGTCGT CCGGCT CCTCGC GCACCG GTTGCT CATGGT TCGCCC
.CCAGCT GGAGCC ACGGCT GCGGGC GCAATT GGCGGA CACCTT CGCCGG TTCCTG GACCAG 丄 GGTCGA CCTCGG TGCCGA CGCCCG CGTTAA CCGCCT GTGGAA. GCGGCC AAGGAC CTGGTC
GGGCGA GACCGC CGAGCT GGTCGT GGCCAC CACCGA CCGCGA GCAGCT ACCGGC GCTGAC 州丄 CCCGCT CTGGCG GCTCGA CCAGCA CCGGTG GTGGCT GGCGCT CGTCGA TGGCCG CGACTG
GGCGGC GGGCGT GCGGGC CACCGT GGCCGA GCACAG CCTGTC CGAGCT CGAGGC CGTGAA 北丄 CCGCCG CCCG.CA __C.G.g_gSg..g!gg_gA—g_gJggg.IL—SSLI巨Ig——GGACAG GCT CGA_GCTCCC- G_CACTT
A91 GGAGAC ACTGGA CGAGGC CGCCGA GGAGCA CGCCAC GACCGA GGCGCC CGTGTG GTACGT 4」丄 CCTCTG TGACCT GCTCCG GCGGCT CCTCGT GCGGTG CTGGCT CCGCGG GCACAC CATGCA
GGATGT CACGAG CAACAC GGTCAT CGTGCA CGCCCA GGACGT GACGGC C6GGCG CGACTT 481 CCTACA GTGCTC GTTGTG CCAGTA GCACGT GCGGgT_ CCTGCA CTGCCG GCCCGC GCTGAA
.CGTCTC GGCCGC GGGCGT GGACCC CGCCGC GGTCCA CGTGCT GCGCTC GGACGA GCAGCC 丄 GCAGAG CCGGCG CCCGCA CCTGGG GCGGCG CCAGGT GCACGA CGCGAG CCTGCT CGTCGG
601 GCGGCC TTACi CA CGACCT GCGGGG TGGGGA GGCGTA CTACAT GGGCAG CGGAGG
CGCCGG AATG GT GCTGGA CGCCCC ACCCCT CCGCAT GATGTA CCCGTC GCCTCC CGCGAC 661 CTCGGT CGGCTT CTCCGT TCGCCG CGGAAC TCAGGC GGGCTT CGCGAC CGCGGG
GAGCCA GCCGAA GAGGCA AGCGGC GCCTTG AGTCCG CCCGAA GCGCTG GCGCCC
721 CGGCCG GGTCGG CACCAC CACACG GGGCTT CAACCA GGTGGC GCAGGG CACCTT
GCCGGC CCAGCC GTGGTG GTGTGC CCCGAA GTTGGT CCACCG CGTCCC GTGGAA
781 CTCCAT CTTCCC CGGGCG CGACAT GGGCTG GGTCGC GGTCAA CTCCAA CTGGAA
GAGGTA GAAGGG GCCCGC GCTGTA CCCGAC CCAGCG CCAGTT GAGGTT GACCTT
841 CCCCTT CGTCCG CGGCCA GGGGGG CGCGAA CGTGAC GGTGGC GGGTTC GCAGCA
54
GCGCTG TCACTG AGTGAC CCAGGG GGTCCC CACCAC GTGGTGGGCTCC
GGGGAAGCAGGCGCCGGTCCCCCCGCGCTTGCACTGCCACCGCCCAAGCGTCGTCCGAGG
901GGTCGGCTCCTCGGTGTGCCGTTCCGGCTCCACCACCGGCTGGCACTGCGGCACCATCCA
CCAGCCGAGGAGCCACACGGCAAGGCCGAGGTGGTGGCCGACCGTGACGCCGTGGTAGGT
961GCAGCACAACACCTCGGTGCGCTATCCGGAGGGCACCATCAGCGGAGTGACCAGGACCTC
CGTCGTGTTGTGGAGCCACGCGATAGGCCTCCCGTGGTAGTCGCCTCACTGGTCCTGGAG
1021GGTGTGCGCCGAACCCGGTGACTCCGGCGGCGCCTACATCTCCGGGAACCAGGCCCAGGG
CCACACGCGGCTTGGGCCACTGAGGCCGCCGCGGATGTAGAGGCCCTTGGTCCGGGTCCC
1081CGTGACCTCCGGCGGCTCGGGCAACTGCCGCACCGGTGGCACCACCTACCACCAGCCGAT
GCACTGGAGGCCGCCGAGCCCGTTGACGGCGTGGCCACCGTGGTGGATGGTGGTCGGCTA
1141CAACCCGCTGCTGGCACAGTGGAACCTGACCCTCGTGACCACGGGCAACGGCGGCGACCC
GTTGGGCGACGACCGTGTCACCTTGGACTGGGAGCACTGGTGCCCGTTGCCGCCGCTGGG
1201GGGCGACCCCGGTGACCCGGGCGACCCGGGTGAGCCCGGCGGCAGCTGGTCCGCCGGGAC
CCCGCTGGGGCCACTGGGCCCGCTGGGCCCACTCGGGCCGCCGTCGACCAGGCGGCCCTG
1261CAGTTACGCGGTCGGCGACCGGGTGACCTACGGCGGCGCGGAGTACCGCTGCCTGCAGGC
GTCAATGCGCCAGCCGCTGGCCCACTGGATGCCGCCGCGCCTCATGGCGACGGACGTCCG
1321CCACGTCGCCCAGTCCGGCTGGACGCCCCCGAACACGCCCGCCCTCTGGCAGCGCGTG tg
GGTGCAGCGGGTCAGGCCGACCTGCGGGGGCTTGTGCGGGCGGGAGACCGTCGC
GCACAC1381 aCACGA CCA (SEQ ID NO 1)TGTGCT GGT在上述序列中，核糖體結合位點用下劃線表示，起始和終止密碼子以粗體印刷， (預測的)信號序列以斜體表示，(預測的)N-端原序列是雙下劃線的，而成熟的蛋白酶鏈序列用波浪線進行下劃線。 1 MHRRRGALFA GAVAIAALTI AAAPA TAGPA LAPPPAQETA AQEIPAGMLQ51 AMQRDLGLTE QQAEERVANE YQAGQLEPRL RAQLADTFAG SffTRGETAEL101 VYATTDREQL PALTAAGYRA TVAEHSLSEL EAVKETLDEA AEEHATTEAP151 VffYVDVTSNT VIVHAQDYTA GRDFYSAAGY DPAAVHVLRS DEQPRPYHDL201 RGGEAYYMGS GGRCSVGFSV RRGTQAGFAT AGHCGRVGTT TRGFNQVAQG251 TFQGSIFPGR DMGWVAVNSN WNTTPFVRGQ GGANVTVAGS QQAPVGSSVC301 RSGSTTGWHC GTIQQHNTSV RYPEGTISGV TRTSVCAEPG DSGGAYISGN351 QAQGVTSGGS GNCRTGGTTY HQPINPLLAQ WNLTLVTTGN G⑶PGDP⑶P401 GDPGEPGGSff SAGTSYAVGD RVTYGGAEYR CLQAHVAQSG WTPPNTPALff451 QRV(SEQ ID NO 3)在上述序列中，用雙下劃線表示信號序列(預測)，而用下劃線表示原序列(預 測)，用粗體顯示成熟的鏈。使用LC-MS方法，如本領域已知地確定1AG3蛋白酶的分子量(MW)。ASP同源物 1AG3的測量MW是21261Da(通過LC-MS，參見下文的色譜和光譜)。該MW與1AG3序列 [49-256]相匹配(計算 MW21250Da)。實施例51AG3蛋白酶基因在變鉛青鏈黴菌中的克隆和表達在該實施例中，描述了 1AG3蛋白酶的克隆和表達。因此，該實施例描述了這樣 的質粒，所述質粒包含編碼具有蛋白酶解活性的多肽的多核苷酸，以及使用此類載體轉化 變鉛青鏈黴菌宿主細胞。本文中使用的轉化方法是本領域已知的(參見例如，美國專利號 6，287，839和W0 02/50245，引入本文作為參考)。這些實驗中使用的載體(S卩，質粒)包含編碼本發明蛋白酶的多核苷酸，其獲自嗜 鹼性鏈黴菌菌株1AG3。該質粒用於轉化變鉛青鏈黴菌。在本文中，最終的質粒載體被稱為 「PSEA4CT-1AG3」。與前述載體相似，pSEA4CT_lAG3的構建使用了 pSEA4CT質粒載體(見上 文)。黑麴黴(「A4」)調控序列與編碼鏈黴菌1AG3蛋白酶(1AG3)的結構基因連接，用於 驅動蛋白酶的表達。通過本領域已知的PCR技術，構建包含鏈黴菌CelA信號序列、1AG3原 序列和1AG3成熟蛋白酶序列的DNA片段，如Nhel-BamHI片段。用於克隆pSEA4CT中的鏈 黴菌1AG3蛋白酶(1AG3)的多核苷酸引物是基於SEQ ID NO 1的。正向引物和反向引物顯 示如下pSEA4C-lAG3-Fw 5，-GACTGCGCTAGCCGGCCCCCCGGCACAGGCCACCGCCGGACCGGCCCTCGCCCCGCCACCG-3』 (SEQ ID NO 29)pSEA4C-lAG3-Rv 5，-GCTCGCGGATCCCCATTGTCACACGCGCTGCCAGAGGGCGGGCGTGTTC-3，(SEQID NO 30)根據產生商的說明，在熱循環儀上用高保真Platinum Taq聚合酶(Invitrogen) 實施PCR(退火溫度為55°C，28個循環)。用限制性酶BamHI和Nhel消化獲得的PCR片段， 用限制性酶BamHI和Xbal消化pSEA4CT質粒。使用Qiagen PCR純化試劑盒(Qiagen，貨號28106)純化消化的1AG3PCR和質粒DNA片段。根據產生商的說明，使用T4DNA連接酶試劑 盒(Invitrogen)將1AG3蛋白酶片段克隆到pSEA4CT質粒中，獲得質粒pSEA4CT_lAG3的產
生。 利用前述實施例中描述的原生質體方法，用質粒PSEA4CT-1AG3轉化宿主變鉛青 鏈黴菌TK23 (即，使用Hopwood等人的方法，見上文)。擴增轉化的培養物，來提高三種在TS *培養基中的發酵培養物。TS *培養基的組成 是(g/L)胰蛋白腖(Difco)16，大豆蛋白腖(Difco)4，酪蛋白酶解產物(Merck) 20，K2HP0410， 葡萄糖 15，Basildon 去泡劑 0.6，pH 7.0。孵育條件30°C，250rpm(Infors HT)。在不同 的時間點，移出發酵液的樣品供分析。出於該實驗的目的，使用脫脂乳方法來驗證成功的克 隆。在該測試中，將30 y L的搖瓶上清移至脫脂乳瓊脂平板上打的孔中，並在37°C孵育。在孵育過夜後，目測孵育的平板，出現清澈區(環)表示蛋白酶解酶的表達。出 於該實驗的目的，還檢測了樣品的蛋白酶活性和分子量(SDS-PAGE)。在發酵末期，通過 SDS-PAGE觀察到全長的蛋白酶。如下檢測發酵液的樣品收集10 y L的稀釋上清，並添加至 190 u L AAPE 底物溶液中(濃度 lmg/ml，0. 1M Tris/0. 005%TWEEN -80，pH 8. 6)。監控由於對硝基苯胺的釋放而造成410nm處的吸光度增加的速率(25°C )。下表 (5. 1)顯示了 3個克隆的測定結果。 結果清楚地顯示，變鉛青鏈黴菌中表達由來自鏈黴菌屬物種1AG3的多核苷酸編 碼的、具有蛋白酶解活性的多肽實施例61AG3蛋白酶與其他蛋白酶的關係在該實施例中，描述了用於確定1AG3蛋白酶和其他蛋白酶的關係的方法。在 Swissprot中，對1AG3多肽(SEQ ID NO 3)序列的BLASTP檢索揭示，來自灰色鏈黴菌的 鏈黴菌蛋白酶C(SGPC) (SEQ ID NO :23)是已知最接近的同源物，具有59. 7%的同一性和 68.0%的相似性，如圖2中提供的比對所示。當僅比較成熟的(即，催化結構域)蛋白酶序 列時，如圖3所示，1AG3蛋白酶(SEQ ID NO :9)和SGPC(SEQ ID NO :24)的同一性提高到 74. 2%，相似性提高到80. 1%。在該圖中，活性位點胺基酸his-asp-ser表示為粗體，而用 連線表示特徵性的3個二硫鍵。1AG3蛋白酶和纖維單胞菌(Cellul0m0naS)69B4(ASP)蛋白酶是直系同源物。然 而，1AG3蛋白酶(SEQ ID NO 3)和ASP蛋白酶(SEQ IDN0 25)的序列比對揭示它們的同一 性低至39.6%，相似性為49.6%，如圖4所示。當僅比較蛋白酶的成熟(催化)部分時，則 1AG3蛋白酶(SEQID N0 9)和SGPC(SEQ ID NO 26)的同一性提高到44. 1%，相似性提高到53. 1%，如圖5所示。因此，結果表示1AG3與ASP具有高於50%的同源性。此外，應注 意1AG3具有比ASP更大的分子量(約21kD)。此外，確定1AG3具有比ASP低的pi。實施例71AG3蛋白酶在液體洗滌劑中的微樣品(microswatch)性能在該實施例中，使用BMI-微樣品(Blood，Milk，Int)測試來確定1AG3蛋白酶的洗 滌性能。確定清潔活性iJffil 胃II (Innova 4330 Incubator,New Brunswick Scientific Co.,Edison, NJ，USA)分別在20°C和30°C進行微樣品測試。從CFT獲得Blood-Milk-Ink樣品(EMPA 116)，並通過在室溫下暴露於0. 3%過氧 化氫中30分鐘進行預處理，然後乾燥。從乾燥的樣品中切出6. 5mm直徑的圓，垂直地置於 96孔微平板(MTP)中，每孔一個。例如，從實施例5描述的轉化培養物中獲得蛋白酶樣品，在lOmMNaCl，0.005% Tween 80 (聚氧乙烯山梨糖醇酐羧酸酯)[Sigma P-1754]中稀釋，獲得5_60 y g/ml (蛋白 質)的期望濃度用於測定。洗滌劑溶液在1升去離子水中製備1.6g不含漂白劑和酶的液體洗滌劑，從儲液添加鈣和鎂， 獲得最終水硬度值為6格令/加侖(S卩，北美條件)。用4N NaOH將洗滌劑溶液I調節至 pH 6. 0，用5mM Hepes和4N NaOH將洗滌劑溶液II調節至pH 8. 2。測試方法將孵育箱設定為期望溫度20°C為低溫(洗滌劑溶液II)條件，30°C為低pH(洗 滌劑溶液I)條件。如上所述，將預處理和預切出的微樣品置於96孔MTP的每個孔中。向 MTP的每個孔加入190 yl的各洗滌劑溶液，每孔含有一片微樣品。然後，向每個孔中加入 10 u 1預稀釋的酶溶液，獲得終濃度0. 25-3. 0 u g/ml (提供總體積為200 yl/孔)。然後， 封閉MTP，防止滲漏，置於孵育箱/振蕩器的支架上，設定為20°C (低溫洗滌劑溶液II)或 30 °C (低pH洗滌劑溶液I)和350rpm，允許振蕩1小時。在孵育後，從每個孔移出100 yl反 應液，並置於新鮮微平板中(Costar 9017, Corning Incorporated，NY，USA)。在Microplate Reader (SpectraMax 340,Molecular Devices)上讀取各等分樣品在405nm處的吸光度，並 與空白對照相比較(即，含有微樣品和洗滌劑但不含酶樣品的孔)。計算BMI洗滌性能相對空白值校正所獲得的吸光度(在缺少酶的條件下孵育微樣品獲得)。使用獲 得的吸光度作為對水解活性的度量。如圖7和8所示，劑量反應曲線的結果將405nm處的吸光度描述為1AG3蛋白酶濃 度(孔中的ppm蛋白質)的函數。實施例8液體織物清潔組合物該實施例提供了用於與本發明結合使用的液體織物清潔組合物。可認為這些組合 物在日本機洗條件下，以及對於涉及清潔精細和/或精緻織物的應用特別有效。表8-1提 供了合適的組合物。然而，其並非意在將本發明限制為該特定的配方，因為其他多種配方可用於本發明。
表8-1.液體織物清潔組合物 實施例9液體洗碗組合物該實施例提供了用於與本發明結合使用的液體洗碗組合物。可認為這些組合物在 日本洗碗洗滌條件下特別有效。表9-1提供了合適的組合物。然而，其並非意在將本發明 限制為該特定的配方，因為其他多種配方可用於本發明。
實施例10液體織物清潔組合物本發明的蛋白酶在清潔組合物中特別有效。例如，可認為根據發明製備的液體織 物清潔組合物在日本機洗條件下特別有效。在一些實施方案中，這些組合物包含下列在表 10-1中顯示的組分。除非另外指出，該表和後續實施例的表格中的「蛋白酶」是本文提供的 1AG3蛋白酶。 實施例11顆粒狀織物清潔組合物在該實施例中，提供了多種可用於本發明的顆粒狀織物清潔組合物。下列表格提
供了合適的組合物。然而，其並非意在將本發明限制為這些特定的配方，因為其他多種配方
可用於本發明。
_表11-2.顆粒狀織物^潔組合物_ 認為下列衣物洗滌劑組合物在歐洲機洗條件下特別有效。
實施例12洗滌劑配方
在該實施例中，提供了多種使用1AG3和/或1AG3變體的洗滌劑配方。可以理解， 本節提供的測試方法必定可用於確定本發明參數的不同值。在示例的洗滌劑組合物中，通過純化酶佔總組合物的重量比來表示酶水平，除非 另外提示，通過佔總組合物的重量比來表示洗滌劑的成分。下表(表12-1)提供了製備的液體衣物洗滌劑組合物。
#添加至產物，以調節產物的淨pH至約4. 2⑴和約3. 8 (II)。下表(12-2)提供了製備的手洗液體洗滌劑組合物。
這些組合物的PH是約8至約11。表12-3提供了製備的液體自動餐具洗滌劑組合物。
表12-4提供了以顆粒狀或片劑形式製備的洗衣組合物。
女香料、染料、增白劑/SRPl/羧甲基纖維素鈉/光漂白劑/MgS04/PVPVI/消泡劑/ 高分子PEG/粘土。表12-5提供了製備的液體衣物洗滌劑配方。
表12-6提供了製備的緻密高密度餐具洗滌劑。
*增白劑/染料/SRP1/羧甲基纖維素鈉/光漂白劑/MgS04/PVPVI/消泡劑/高 分子PEG/粘土。上述組合物的pH從約9. 6至約11.3。表12-7提供了本發明的片劑洗滌劑組合物，所述片劑是使用標準12頭旋轉式壓 機，在13KN/cm2的壓力下，壓縮顆粒狀餐具洗滌劑組合物製備的
__表12 了 7.片卞洗條劑組合物 ___ *增白劑/SRPl/羧甲基纖維素鈉/光漂白劑/MgS04/PVPVI/消泡劑/高分子PEG/ 粘土。這些組合物的pH從約10至約11. 5。這些組合物的片劑重量從約20克至約30克。表12-8提供了製備的本發明的液體硬表面清潔洗滌劑組合物。
這些組合物的pH從約7. 4至約9. 5。當然，可以理解，對上述實施方案可以進行多種改變和修飾。因此，上述詳細的說
明旨在根據下列權利要求進行理解，包含其所有等價形式，其意在定義本發明的範圍。實施例13包含1AG3的動物飼料本發明還提供了包含aAG3和/或1AG3變體的動物飼料組合物。在該實施例中，
提供了適合家禽的一種此類飼料。然而，其並非意在將本發明限於該特定的配方，因為本發
明的蛋白酶可用於多種其他飼料配方。其還意在說明本發明的飼料適合施與任何動物，包
含但不限於家畜(例如，牛、豬、羊等)，以及伴侶動物(例如，狗、貓、馬、嚙齒類等)。下表提供了搗碎的、基於玉米的開食飼料(starter feed)配方，其適於施與達3周齡的小火雞
(turkey poult)。
在一些實施方案中，該飼料配方添加了各種濃度的本發明蛋白酶(例如，2，000單 位 /kg，4，000 單位 /kg，和 6，000 單位 /kg)。本說明書中提及的所有專利和出版物是發明所屬領域的技術人員的水平指標。所 有專利和出版物都引入本文作為參考，就像每個出版物都具體並單獨引入本文作為參考。 然而，任何出版物的引用都不認為是承認其是本發明的現有技術。已描述了本發明的示例性實施方案，可以對最接近的實施方案進行多種修飾，這 對本領域普通技術人員是顯而易見的，並且此類修飾旨在落入本發明的範圍內。本領域技術人員可以容易的理解，本發明很適於實施所提及的目標並獲得所述結 果和優勢，以及其他本文內在的屬性。本文描述的組合物和方法是代表性的，並非意在限制 本發明的範圍。在不脫離發明的範圍和精神的條件下，可以對本文公開的發明進行多種取 代和修飾，這對本領域技術人員是顯而易見的。本文說明性描述的發明可以適當地在缺少本文未具體公開的任何要素或限制的 情況下實施。所使用的術語和表述用於描述而非限制，這些術語和表述的使用並不旨在排 除所述特徵的任何等同物或其部分，而是應該認識到，在要求保護的本發明範圍內可以有 多種修改。因此，應該理解，儘管通過優選實施方案和任選特徵具體公開了本發明，但本領 域技術人員可應用本文所公開概念的修飾和變體，這些修飾和變體均認為落入所附權利要 求書所限定的本發明範圍之內。本文已經寬泛並一般性地描述了發明。落入一般性公開範圍內的任何較小種類和 亞類也都構成發明的一部分。這包含對本發明的一般性描述，其前提或反面限制為從該類 中去除任何主題，無論所去除的內容是否在本文中具體描述。
權利要求
分離的絲氨酸蛋白酶，其包含與SEQ ID NO9的野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶至少約80％相同的胺基酸序列。
2.權利要求1的分離的絲氨酸蛋白酶，其中所述分離的絲氨酸蛋白酶包含與所述野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶至少約95%相同的胺基酸序列。
3.權利要求1的分離的絲氨酸蛋白酶，其中所述分離的絲氨酸蛋白酶包含所述野生型 鏈黴菌1AG3蛋白酶的胺基酸序列。
4.權利要求1的分離的絲氨酸蛋白酶，其中相對於所述野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶，所 述分離的絲氨酸蛋白酶包含至少1個胺基酸取代。
5.分離的核酸，其編碼權利要求1的分離的絲氨酸蛋白酶的。
6.權利要求5的分離的核酸，其中所述核酸具有如下核苷酸序列a)在嚴格雜交條件 下與SEQ ID NO 8雜交；和/或b)與SEQ ID NO 8至少約70%相同。
7.重組多核苷酸，其包含有效連接的啟動子和權利要求6的分離的核酸。
8.權利要求7的重組多核苷酸，其中所述重組多核苷酸提供從宿主細胞分泌所述分離 的絲氨酸蛋白酶。
9.表達載體，其包含權利要求7的重組多核苷酸。
10.宿主細胞，其包含權利要求7的重組多核苷酸。
11.權利要求10的宿主細胞，其中所述宿主選自芽孢桿菌屬物種(Bacillussp.)、 鏈黴菌屬物種(Str印tomyces sp.)、麴黴屬物種(Aspergillussp.)和木黴菌屬物種 (Trichoderma sp.)。
12.權利要求10的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸存在於所述宿主細胞的基因組中。
13.產生分離的絲氨酸蛋白酶的方法，其包括在適合產生所述分離的絲氨酸蛋白酶的條件下培養權利要求10的宿主細胞。
14.權利要求13的方法，其還包括回收所述分離的絲氨酸蛋白酶。
15.清潔組合物，其包含權利要求1的分離的絲氨酸蛋白酶。
16.權利要求15的清潔組合物，其中所述清潔組合物還包含表面活性劑。
17.權利要求16的清潔組合物，其中所述表面活性劑是包含環氧乙烷部分的烷基硫酸 鈉表面活性劑。
18.權利要求15的清潔組合物，所述組合物包含約0.001襯％至約0. 5wt%的所述分離 的絲氨酸蛋白酶。
19.權利要求15的清潔組合物，其中所述組合物包含足量的PH調節劑，以提供具有淨 PH從約3至約5的所述組合物，所述組合物基本不含在約3至約5的pH水解的材料。
20.權利要求15的清潔組合物，其中所述清潔組合物配製成衣物洗滌劑。
21.權利要求15的清潔組合物，其中所述清潔組合物配製成餐具洗滌劑。
22.權利要求15的清潔組合物，其還包含選自蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果 膠酶、角質酶、氧化還原酶、半纖維素酶和纖維素酶的其他酶。
23.權利要求15的清潔組合物，其還包含穩定劑。
24.權利要求23的清潔組合物，其中所述穩定劑選自硼砂、甘油和競爭性抑制劑。
25.權利要求24的清潔組合物，其中所述競爭性抑制劑使所述分離的絲氨酸蛋白酶對陰離子表面活性劑穩定。
26.權利要求15的清潔組合物，其中所述清潔組合物是固體組合物。
27.權利要求18的清潔組合物，其中所述清潔組合物是液體組合物。
28.清潔的方法，所述方法包括步驟在適合清潔所述對象的條件下，將對象與權利要求15的清潔組合物接觸。
29.權利要求28的方法，其中所述方法還包括洗滌和/或漂洗所述對象。
30.權利要求28的方法，其中所述對象是織物。
31.權利要求28的方法，其中所述對象是餐具。
32.動物飼料，其包含權利要求1的分離的絲氨酸蛋白酶。
全文摘要
本發明提供了鏈黴菌絲氨酸蛋白酶。在一些實施方案中，該蛋白酶包含與野生型鏈黴菌1AG3蛋白酶至少約80％相同的胺基酸序列。本發明還提供了分離的核酸序列，也提供了重組核酸和含有該重組核酸的宿主細胞。此外，本發明提供了包含鏈黴菌絲氨酸蛋白酶的清潔組合物和其他組合物。
文檔編號A23K1/165GK101842480SQ200880114395
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月24日 優先權日2007年10月30日
發明者B·E·瓊斯, C·萊夫朗, M·科爾克曼 申請人:丹尼斯科美國公司