快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法與流程

2023-04-24 05:52:26

本發明涉及檢測領域，具體地，涉及一種快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法。

背景技術：

常用的小分子化合物的檢測方法，包括化學顯色法、免疫層析檢測法、高效液相色譜檢測法(HPLC)和氣質聯用色譜檢測法(GC/MS)法等。其中，化學顯色法需要大量檢測樣品，而且靈敏度及精密度均不高；後兩者有較高的靈敏度及精密度，但檢測要求高，難以推廣。

免疫層析檢測法(Immunochromatographic test)是80年代興起的一項快速檢測技術。經過多年的發展，此項技術已經廣泛應用於臨床診斷，毒品檢測和食品安全等領域。在免疫層析方法中，將小分子物質的完全抗原固定於硝酸纖維膜上的檢測區(固相抗原)，待檢樣品溶液中的小分子物質(游離抗原)與固相抗原競爭結合膠體金或彩色乳膠微球標記的抗小分子物質的單克隆抗體(標記抗體)。如果待檢樣品中含有的小分子物質，將抑制標記抗體與固定抗原的結合，抑制在硝酸纖維素膜的檢測區形成色帶。測定後檢測區如果形成色帶，則結果為陰性，待測樣品不含待測小分子物質；反之，不形成色帶，則結果為陽性，檢測樣品含有待測小分子物質。由於膠體金或彩色乳膠微球標記檢測是通過肉眼來判別結果，目前以膠體金或彩色微球標記的檢測方法只能作為一種定性或半定量的檢測。

螢光定量免疫層析技術，是免疫螢光技術(Immunofluorescence technique)和傳統免疫層析技術相結合發展創新的一種定量檢測技術。該技術以螢光微球作為標記，通過檢測螢光信號實現了檢測結果的定量。

但是，由於免疫層析檢測的材料中硝酸纖維膜等均會在激發光作用下發出不同程度的螢光，同時檢測樣本如血液、尿樣及唾液等均含有蛋白、核酸、糖類均具有螢光效應，因此而導致檢測的背景較高，影響檢測結果的準確性。為克服上述問題，有研究者開發了時間分辨螢光免疫層析技術，以消除樣本中的熒 光物質、激發光和膜本身對檢測的幹擾。

然而，雖然時間分辨螢光免疫層析有助於提高檢測的準確性，但是由於種種原因，在定量檢測時仍會出現較大的偏差和波動，導致檢測結果無法滿足實際需要。尤其是對於小分子化合物(如苯丙胺、嗎啡等毒品)，定量檢測結果的準確性一方面與遏制毒品的行動密切相關，也是對於罪犯的量刑的重要參考因素。

因此，本領域迫切需要開發快速、定量、且準確(偏差小)的檢測小分子化合物的新方法。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法。

在本發明的第一方面，提供了一種用於檢測小分子化合物的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)測試條，所述測試條包括背襯以及位於背襯上的樣品墊、反應膜和吸收墊，其中所述反應膜上設置有檢測區和質控區；以及

(b)第一容器，以及位於所述第一容器內且與所述測試條獨立設置(或放置)的抗體複合物，其中所述抗體複合物包含螢光乳膠微粒以及特異性針對小分子化合物的抗體，所述特異性針對小分子化合物的抗體偶聯於所述螢光乳膠微粒；

其中，所述的檢測區固定有所述小分子化合物的完全抗原。

在另一優選例中，在所述的測試條上，所述樣品墊和反應膜是直接相鄰或相接觸的。

在另一優選例中，按樣品的液體流動方向，所述的測試條上依次包括樣品墊、反應膜、和吸收墊。

在另一優選例中，所述測試條由樣品墊、反應膜、吸收墊、和背襯構成。

在另一優選例中，所述的抗體複合物位於獨立的包裝或容器內。

在另一優選例中，所述的測試條不設有結合區。

在另一優選例中，所述的測試條在未使用時，不含有用於特異性與所述小分子化合物結合的抗體或所述抗體複合物。

在另一優選例中，所述的第一容器為獨立的且封閉的包裝或試劑杯。

在另一優選例中，所述的第一容器中還含有

在另一優選例中，所述小分子化合物的分子量為1-1000Da，較佳地為5-800Da，更佳地為10-500Da。

在另一優選例中，所述的小分子化合物為苯丙胺。

在另一優選例中，所述螢光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系金屬螯合物包被的乳膠微粒。

在另一優選例中，所述質控區包含第二抗體，所述第二抗體特異性結合於特異性針對小分子化合物的抗體。

在另一優選例中，所述的第二抗體為多抗或抗血清。

在另一優選例中，所述的特異性針對小分子化合物的抗體為鼠抗體，而所述的第二抗體為兔抗鼠IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體。

在另一優選例中，所述的特異性針對小分子化合物的抗體為兔抗體，而所述的第二抗體為羊抗兔IgG抗體。

在另一優選例中，所述的小分子化合物的完全抗原為小分子化合物與載體蛋白的偶聯物。

在另一優選例中，所述的載體蛋白包括BSA蛋白。

在本發明的第二方面，提供了一種檢測小分子化合物的方法，包括步驟：

(1)將待測物樣品與一抗體複合物進行混合，獲得第一處理混合物，其中所述抗體複合物包含螢光乳膠微粒以及特異性針對小分子化合物的抗體，並且所述特異性針對小分子化合物的抗體偶聯於所述螢光乳膠微粒；

(2)將所述的第一處理混合物加至一測試條的樣品墊，其中，所述測試條包括背襯以及位於背襯上的樣品墊、反應膜和吸收墊，其中所述反應膜上設置有檢測區和質控區；所述的檢測區固定有所述小分子化合物的完全抗原；

(3)採用時間分辨螢光免疫層析方法測量所述測試片的檢測區的螢光強度及質控區的螢光強度，從而確定小分子化合物是否存在，和/或確定為小分子化合物的含量。

在另一優選例中，所述的小分子化合物包括苯丙胺。

在另一優選例中，所述的樣品包括水溶液、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、淚液或唾液。

在另一優選例中，在步驟(3)中，將測試區的螢光強度與質控區的螢光強度的比值，和標準曲線進行比較，從而確定小分子化合物的含量。

在另一優選例中，所述螢光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系金屬螯合物包被的乳膠微粒。

在本發明的第三方面，提供了一種定量檢測待測物的螢光測量裝置，所述的裝置包括：

(a)本發明第一方面所述的試劑盒；和

(b)用於檢測螢光強度的檢測器。

應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了本發明的一種實施例中免疫層析試紙條(板)的結構示意圖，

其中，各標識如下：1為樣品墊，3為檢測區，4為反應膜，5為質控區(對照區)，6為吸收墊，7為背襯。

具體實施方式

本發明人經過廣泛而深入的研究，通過大量篩選和摸索，發現首次意外地發現了一種新的快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法。實驗表明，檢測時先將待測樣品和獨立放置的螢光乳膠微粒-抗體偶聯物混合，再將該混合物加至測試條，並通過時間分辨螢光免疫層析方法進行檢測，可以顯著提高檢測的靈敏度、特異性和穩定性，在此基礎上完成了本發明。

具體而言，本發明人經過研究發現，現有的層析檢測條的結構對於定量檢測結果的波動(或偏差)造成較大的影響。一個主要的影響因素是結合墊部分(或結合區)。如果將偶聯抗體的乳膠微粒包被在結合墊上，進行乾燥。檢測時乳膠從結合墊上釋放就成為影響檢測準確性的關鍵因素之一。此外，乳膠微粒釋放的程度、釋放的快慢和/或結合墊的材質，都可能是導致定量測定結果波動性大的因素。本發明人還發現，在對結合墊進行處理時，結合墊的處理方式以及乳膠的乾燥程度也難以保持一致，且固定或位於所述結合墊的檢測抗體(如螢光乳膠微粒標記的抗體偶聯物)的性質易發生變化，導致長期穩定性下降，從而導致檢測結果的波動性大。

此外，發明人的實驗結果還表明，在檢測區(或檢測線)直接設置苯丙胺等小分子化合物(標準品)時，也會導致檢測結果的波動性大。

為此，申請人優化了檢測試劑的結構，一方面省略了結合墊，另一方面在質控區(或質控線)設置第二抗體(如針對螢光乳膠微粒標記的抗體偶聯物的第二抗體)，並在檢測區(或檢測線)涉及所述小分子化合物的完全抗原，這樣不僅可以顯著提高檢測結果的準確性，減少偏差，而且所述檢測試劑即使長期存放(≥2年)仍可保持穩定，並具有較高的準確性和靈敏度。

術語

苯丙胺

如本文所用，「苯丙胺」包括苯丙胺及其類似物，苯丙胺又稱苯基乙丙胺、α-甲基苯乙胺、外語音譯為安非他明，分子式為C9H13N，相對分子量135.21。苯丙胺是一系列對中樞神經系統具有顯著興奮作用的合成藥物(統稱苯丙胺類)的原型。苯丙胺可引起諸多不良反應，最常見的是過度興奮，有不安、失眠、震顫、緊張和煩躁等症狀。對苯丙胺的軀體耐受性出現的非常快，所以長期服用者必須越服用越多。這些服用者當藥力消失時出現「垮掉」的感覺，表現為深度抑鬱。服用大劑量苯丙胺後最嚴重的後果就是一種毒性神經病，其症狀類似類偏執型精神分裂症。苯丙胺的濫用常和巴比妥藥物及酒精的濫用一同發生。

免疫層析技術

免疫層析技術(Immunochromatography)是20世紀80年代末90年代初建立的一種快速檢測技術。由於免疫層析技術不須進行結合標記物與自由標記物的分離，因而操作簡單、快速，非常適合現場檢測之用。

時間分辨螢光免疫分析

時間分辨螢光免疫分析(Time resolved fluoro immunoassay,TRFIA)是20世紀80年代初在傳統螢光免疫分析的基礎上創立的一種新型非放射性標記免疫分析技術，是目前最靈敏的微量分析技術。

測試條上檢測區域的檢測信號的獲取，將測試條上的檢測信號傳遞過來的光信號，通過光學聚光裝置、分光裝置，和光學光路整形等，得到615nm±10nm 左右的螢光光斑，將此螢光光斑傳遞到光學傳感器光電倍增管，獲得測試條上檢測區域的檢測光信號。通過控制信號讀取時間為10微秒到400微秒，得到一個扣除螢光本底的檢測信號。通過光電信號轉換，將光信號轉換為電信號傳送給計算控制部件處理，最終完成檢測。

與傳統的螢光素標記不同，它所用的示蹤物是具有獨特螢光特性的鑭系元素及其螯合物，可有效排除樣品自然螢光的幹擾，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好和無放射性汙染等特點，靈敏度高達10-19，較放射免疫分析(RIA)高出3個數量級。在臨床免疫檢驗和科學研究中的應用越來越廣泛。

時間分辨螢光免疫層析技術

時間分辨螢光免疫層析技術是基於免疫層析技術的時間分辨螢光分析技術，是在時間分辨螢光免疫分析儀的基礎上，將時間分辨螢光免疫分析和免疫層析技術相結合，省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，試劑穩定性好，操作簡單，檢測速度快，靈敏度高，可廣泛應用於現場定量檢測，也可作為POCT(Point of Care Test，床邊診斷或即時檢測)分析儀。

鑭系元素

目前，己有5種鑭系元素被用於TRFIA，其中常用的有Eu、Tb和Sm，而Eu(銪元素)又是在標記抗原抗體中應用最廣的元素。鑭系元素在游離狀態下，螢光信號很微弱，僅僅是分子間共振能級的能量傳遞，無輻射躍遷回基態發射螢光的機率很小，但其螯合物在紫外光源的激發下能發射螢光。與傳統的螢光素標記物相比，鑭系元素具有較寬的激發光譜帶和較窄的發射光譜帶，螢光持續時間長，且螢光光譜的Stocks位移較大，利用光譜分辨技術和時間分辨技術可有效排除激發光和非特異性螢光的幹擾。

乳膠微粒

如本文所用，術語「乳膠微粒」、「乳膠微球」可以互換使用；「螢光微球」、「螢光微粒」、「螢光乳膠」、「螢光乳膠微粒」、「螢光乳膠微球」可以互換使用。

在醫學診斷領域，從最早的乳膠凝集試驗發展到今天複雜的多元化檢測。以乳膠微粒作為抗原抗體的標記物，主要是由於乳膠微粒本身的特性，它可以 進行多種形式表面功能化修飾，密度改變和特殊屬性的改變(比如：顏色改變、螢光或磁性等)，使得乳膠成為檢測中的一個重要部分。

乳膠微球的直徑一般為100-300nm，最佳地為150-200nm。

在本發明中，優選的時間分辨螢光乳膠微粒是具有發射波長在610-620nm的螢光乳膠微粒，以便於檢測。一種優選的乳膠微粒是含鑭系元素的螢光乳膠微粒，較佳地，含有銪螯合物。可用於本發明的乳膠微球沒有特別限制，可以選用市售的或用常規方法製備的乳膠微球。

採用內部含銪的乳膠微粒，即結合銪螯合物的螢光微粒。該結合銪螯合物的螢光微粒，在紫外光激發下，發出610-620nm的紅色螢光，可以用來作為抗體標記。

抗體複合物

如本文所用「抗體複合物」、「螢光乳膠微粒-抗體偶聯物」和「螢光微粒標記抗體」可互換使用。

本發明中，經螢光乳膠微粒標記的抗體為單/多克隆抗體。經標記後，抗體被偶聯於螢光乳膠微粒。當然，也可視為乳膠微粒被偶聯於抗體。

較佳地，抗體共價偶聯於螢光乳膠微粒。

更佳地，將抗體偶聯於螢光乳膠微粒是將抗體通過螢光乳膠微粒表面活化的羧基、羥基或醛基而共價偶聯於螢光乳膠微粒。

其中，所述螢光乳膠微球的直徑為100-300nm，較佳地為150-200nm。

此外，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為為1:2～1:50，較佳地為1:5～1:25。

更佳地，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為1：8～12。

檢測試劑盒

本發明提供了一種可用於檢測飲用水、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、淚液、唾液等樣本中特定小分子化合物的檢測試劑盒。

所述試劑盒包括：

(a)測試條，所述測試條包括背襯以及位於背襯上的樣品墊、反應膜和吸收墊，其中所述反應膜上設置有檢測區和質控區；以及

(b)第一容器，以及位於所述第一容器內且與所述測試條獨立設置(或放 置)的抗體複合物，其中所述抗體複合物包含螢光乳膠微粒以及特異性針對小分子化合物的抗體，所述特異性針對小分子化合物的抗體偶聯於所述螢光乳膠微粒；

其中，所述的檢測區固定有所述小分子化合物的完全抗原；

較佳地，所述特異性針對小分子化合物的抗體採用含銪的螢光乳膠微粒標記。

一種優選的測試條是利用側流原理的免疫層析側流片或免疫層析試紙條。

在本發明中，術語「測流片」、「試紙片」、「試紙條」、「試紙板」、「層析條」、「測試條」具有相同的含義，可以互換使用。

本發明優選的免疫層析側流片(或測試條)的結構如圖1所示，其中包括：樣品墊1，檢測區(或檢測線)3，反應膜4，對照區(或質控區、對照線、質控線)5，吸收墊6，背襯7。

其中，背襯7的長度與測試條相同。

樣品墊1位於測試條的一端，吸收墊6位於測試條的另一端。

檢測區3(也稱檢測線)位於樣品墊1和吸收墊6之間，通常檢測區3設置在反應膜4上，通過所述反應膜連接樣品墊1和吸水墊6。優選地，所述反應膜4上還設置有質控區5(也稱質控線)，質控區5位於檢測區3和吸收墊6之間。

其中，所述檢測區固定有小分子化合物的完全抗原，所述質控區固定有羊抗鼠IgG，通過對兩個區域的螢光信號分別加以分析，獲得檢測物的定量指標。

測試條的製造方法，優選地，分別將樣品墊1、反應膜4、吸收墊6通過粘合劑粘貼於背襯7上，即得所述測試條。

在本發明中，所述測試條的各組成元件(或組件)可選用本領域已有的材料製成。

背襯7可以用任何穩定的、無孔的材料製成，其強度應足以支承材料和粘於其上的各組成元件。因為許多測定用水作為擴散介質，因此背襯7較佳地是基本上不透水的。在一個優選例中，背襯7是用聚合物膜製成的，更佳地是用聚氯乙烯膜製成的(如PVC膠板)。

樣品墊1可用任何吸收性材料製成。可使用的材料例子包括：纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚碸。

反應膜4可以用任何材料製成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內部發生流體的毛細管作用。反應膜4應有足夠的孔隙度，從而允許塗有抗體或抗原的顆粒移動。反應膜4還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤溼(例如，對於水性液體具有親水性，對於有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用於水性液體。可用於製造反應膜4的材料例子包括但不限於：聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚碸(polyethersulfone)。在一個優選例中，反應膜4是用硝酸纖維素膜製成的。

吸收墊6可以用任何能吸收作為樣品和緩衝液的液體的材料製成。吸收墊6的吸收能力應足夠大，以便吸收添加至測試條的液體。適用於吸收墊6的材料的例子包括纖維素和吸水濾紙。

為了便於理解本發明，給出本發明試劑盒的檢測原理。應理解，本發明的保護範圍並不受該原理的影響或限制。

本發明採用競爭法免疫層析的原理，將小分子物質的完全抗原固定於硝酸纖維膜上的檢測區(固相抗原)。預混合待測樣本和獨立放置的螢光乳膠微粒-抗體偶聯物，將該混合物加至測試條的樣品墊，如果樣本中不含有特定的小分子化合物，所述螢光乳膠微粒-抗體偶聯物將沿反應膜(如硝酸纖維膜)向前流動，到達檢測線位置時，螢光微粒標記抗體被固定在反應膜上的小分子與載體蛋白偶聯物捕獲，通過365nm紫外光的激發，在檢測區T線位置形成紅色的615nm螢光條帶。如果待檢樣品中含有一定濃度的小分子物質，將會抑制螢光微粒標記抗體與固定抗原的結合，在硝酸纖維素膜的檢測區的螢光條帶將會減弱。螢光條帶的強弱與待檢樣品中含有的小分子物質的濃度呈一定的線性關係，通過光電倍增管採集螢光信號進行計數，從而計算出待檢樣品中含有的小分子物質的濃度。本發明在反應膜(如硝酸纖維膜)的質控區設置羊抗鼠IgG多抗，無論待檢樣品中是否含有待測小分子化合物，螢光微粒標記抗體總能與質控區的羊抗鼠IgG多抗結合形成一條螢光質控帶，該螢光條帶是判定層析過程是否正常和檢測板是否失效的標準，同時也作為定量分析中控制批間差的計算指標。

檢測裝置

本發明的檢測裝置可以包括：測試條、檢測器、光源、光導纖維和計算機。還可以包括一份檢測方法的使用說明。其中測試條的工作原理如上所述，任何可用於檢測螢光強度的時間分辨螢光分析方法均可用於本發明的檢測裝置。

本發明的主要優點包括：

(a)本發明的試劑盒穩定性好，靈敏度和準確性高。

(b)本發明的試劑盒特異性好。

(c)本發明的試劑盒可以用於多種樣品的檢測。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。

材料

抗苯丙胺單克隆抗體和苯丙胺完全抗原以及羊抗鼠IgG多克隆抗體購自上海八通生物科技有限公司；含銪的乳膠微粒(Carboxylate-Modified Dyed Microparticles，Fluoro-MAX,PART NO:93470520010150)粒徑為0.199nm，購自於ThermoFisher Scientific公司。EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)、NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)和小牛血清白蛋白(BSA)均為Sigma公司產品；硝酸纖維素膜為Millipore公司產品，孔徑為8μm；玻璃纖維膜為Millipore公司產品；苯丙胺對照品為中檢所國家麻醉品實驗室提供；時間分辨螢光定量檢測儀由上海伊思柏生物科技有限公司提供。

實施例1

螢光乳膠微粒-抗體偶聯物的製備

取1％螢光乳膠微球250μL加1000μL 0.05M 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)(ph6.0)混勻。15000rpm離心20分鐘，棄上清液，用1000μL 0.05M MES重懸，超聲(50W，工作時間1秒，間隔時間1秒)後15000rpm離心20分鐘。 棄上清液，用0.05M MES稀釋至500μL，超聲。加入38.5μL的NHS(10mg/ml)和5μL EDC(15mg/ml)混勻後反應15分鐘。加入0.15mg的苯丙胺單克隆抗體混勻。搖床上避光室溫下反應2小時。加入25μL 0.1M乙醇胺反應30分鐘以封閉微球表面未結合羧基。13000rpm離心10分鐘後棄上清，用500μL酪蛋白封閉液反應1小時。15000rpm離心10分鐘，收集標記的螢光乳膠微球用酪蛋白封閉液稀釋至250μL，超聲後2-8℃保存。

實施例2

冷凍乾燥的螢光乳膠微粒-抗體偶聯物的製備

將標記上抗體的螢光乳膠微粒溶液與冷凍乾燥處理液(Borax0.1M、BSA1％、S172％、蔗糖5％、海藻糖5％)混合，將混合溶液加入96孔板中25μL/孔，放入-80℃冰箱冷凍30分鐘。將冷凍後的96孔板放入預先開啟並已經降溫至-35℃的真空冷凍乾燥機中，分段升溫並進行真空乾燥，2小時30分鐘後取出，用真空包裝機將冷凍乾燥後的乳膠微粒進行真空包裝，包裝後放置於2-8℃保存。

實施例3

樣品墊的封閉處理

樣品墊採用玻璃纖維，為減少檢測中的非特異性結合和增加穩定性，用表面活性劑和聚合物對樣品墊進行封閉處理。具體地，用含有0.2％Tween 20和0.5％PVA的pH 8.0，0.1M Tris緩衝液水溶液浸泡吸水濾紙，37℃烘16小時。

實施例4

免疫層析測試條的製備

在硝酸纖維素膜上用點膜機分別劃檢測線和質控線，檢測線為苯丙胺-BSA(完全抗原)(0.8mg/mL)，質控線(C線)為純化後的羊抗鼠IgG多抗(1.0mg/mL)，37℃乾燥後18-24小時。依次將硝酸纖維薄膜和樣品墊粘貼於PVC支持材料上。用切條機切成4mm的試劑條，置於塑料盒內，加樣孔對準檢測條樣品墊位置，壓緊後組裝成檢測試劑盒，加入乾燥劑密封保存。

進行檢測時，樣品中的苯丙胺與固定在硝酸纖維膜上的苯丙胺-BSA競爭結合螢光乳膠微粒-抗體偶聯物，檢測區(T)的螢光強弱與樣品中的苯丙胺含量相 關，通過時間分辨定量檢測儀閱讀觀察窗檢測區(T)位置的螢光條帶的螢光值，通過不同濃度的標準品可以得出螢光值和苯丙胺濃度的相關曲線和計算公式，由此可以準確地對樣品中的苯丙胺進行定量。

實施例5

標準曲線的製備

從密封袋中取出冷凍乾燥的螢光微粒抗體偶聯物，用移液槍加100μL不同濃度的苯丙胺標準品於孔內，用移液槍將溶液吹打混勻，取50μL滴入加樣孔內，10分鐘後加入100μL衝洗液，再等待5分鐘，將試劑板插入檢測儀中讀取螢光值。根據不同濃度的苯丙胺標準品和螢光值，通過四參數法製備標準曲線。

結果顯示，通過四參數擬合的回歸方程為：Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，且R2＜0.99。

實施例6

樣品檢測方法

方法同實施例5所述方法，將100μL待測樣品與螢光微粒抗體偶聯物混合後進行檢測，獲得螢光值，通過標準曲線的計算公式，計算樣本中苯丙胺的含量。

實施例7

特異性分析

特異性測試,對提供的多種常見毒品、毒物和藥物，在一定的濃度範圍內進行交叉實驗。

a)選擇的毒品、毒物和藥物標準品對照物如下表所示：

註：K為千

b)以無毒品的凍融尿作為陰性對照，檢測各交叉幹擾物(標準品)對陰性樣品的幹擾，即在陰性樣品檢測時有陽性反應，表現為儀器讀數反應為T線讀數下降(相對於陰性對照儀器讀數)。

c)通過實驗確定無交叉反應的各標準品濃度，獲得可用於評估的可能發生交叉反應的濃度。

d)獲得用於評估的發生交叉反應的濃度大於檢測限濃度100倍以上，則可認定為滿足特異性測試要求。

結果如下表所示：本發明試劑盒僅與苯丙胺類樣品發生反應，與其他物質沒有交叉反應，具有很強的特異性。

實施例8

穩定性分析

將檢測試劑盒密封后置於烘箱45℃溫度下破壞性試驗一個月。方法同實施例5所述方法，分別用破壞性處理的試劑盒與未烘烤過的試劑盒，對含不同濃度苯丙胺的樣本及陰性樣本進行測試。

結果表明，45℃破壞性處理一個月的試劑盒與未烘烤過的試劑盒檢測結果一致(偏差≤±2％)。表明該檢測試劑盒具有良好的穩定性。

實施例9

靈敏度分析

方法同實施例5中的方法，分別檢測濃度為2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的苯丙胺樣品，每個檢測濃度重複檢測5次。計算檢測結果的標準差(SD值)、平均值(AVG值)和變異係數(CV值)，其中，CV值應在10％以內，則可認為滿足靈敏度測試要求。

結果如下表所示：本發明的苯丙胺測試條的靈敏度約為2.0ng/ml。檢測的CV<10％。

實施例10

準確性分析

方法同實施例5中的方法，同本發明試劑盒對10例實際案例樣本進行檢測，檢測數據與GC-MS的結果進行比較，符合率均大於95％。結果表明，本發明的檢測試劑盒具有很高的準確性。

實施例11

檢測速度測試

將準備好的測試條(卡)插入檢測儀器，開始測試並計時，測試完成得到測試讀數，停止計時，得到計時時間，計時時間在10分鐘內則可認定為滿足測試要求。

實驗結果：檢測時間均小於5分鐘，檢測速度符合現場檢測和快速檢測的要求。

對比例C1

測試條C1的製備和性能測試

1.製備

測試條C1的結構與本發明測試條類似，其區別在於，測試條C1包括一結合墊，所述結合墊位於樣品墊1和吸收墊6之間，在樣品墊1的近端和吸收墊6的遠端，臨近樣品墊1。並且，所述結合墊上包含抗體複合物，所述抗體複合物包含螢光乳膠微粒以及小分子化合物抗體，所述小分子化合物抗體偶聯於所述螢光乳膠微粒。

2.準確性

採用該測試條C1，對於實施例10中的實際案例樣本進行檢測，檢測數據與GC-MS的結果進行比較，符合率僅為70％。這表明，檢測條C1的準確性不高，不適合準確性要求高的定量檢測應用。

3.穩定性

方法同實施例8，對該測試條C1進行穩定性測試。

結果表明，45℃破壞性處理一個月的試劑盒與未烘烤過的試劑盒檢測結果發生了一定程度的偏差(偏差度≥10％)，此外，45℃破壞性處理二個月後，偏差度進一步上升到≥20％。這表明，測試條C1的長期穩定性較差。

4.靈敏度

方法同實施例9，對該測試條C1進行靈敏度測試。

結果表明，該測試條C1的靈敏度為約10ng/ml，雖然可以滿足一般需要，但是靈敏度遠低於本發明測試條。

對比例C2

測試條C1的製備和性能測試

在對比例C2中，測試條C2的結構與本發明測試條類似，其區別在於，檢測區設有苯丙胺小分子化合物，而不設置苯丙胺完全抗原。

方法同實施例9，對該測試條C2進行靈敏度測試。

結果表明，該測試條C2的靈敏度為大於20ng/ml，靈敏度遠低於本發明測試條。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。