利用抗－vegf抗體的治療的製作方法

2023-04-23 01:08:56

專利名稱：利用抗－vegf抗體的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及人疾病以及病理狀態的治療。更具體地，本發明涉及癌症的抗血管生成療法，其單獨使用或與其它抗癌療法聯用。
背景技術：
癌症仍然是導致人類死亡的頭號威脅之一。在美國，癌症的每年新發患者為近1,300,000，並且是僅次於心臟病的第二號致死原因，在所有死亡中約佔1/4。還預測，癌症會在5年內超過心血管疾病稱為頭號致死原因。實體瘤導致大部分死亡。儘管在具體癌症的醫學治療中有明顯的進展，所有癌症的總體5年生存率在過去的20年中僅僅提高了約10％。癌症，或惡性腫瘤，以不受控制的方式轉移並快速生長，導致及時檢出和治療非常困難。此外，癌症可通過自體內的幾乎任何組織中一個或一些正常細胞的惡性轉化而在體內的任何組織中形成，每種具有特定組織來源的癌症都彼此不同。
目前治療癌症的方法的選擇性相對較低。手術取出疾病組織；放療導致實體瘤體積減小；化療殺死快速分裂的細胞。具體地，化療導致多種副作用，一些情況下非常嚴重以至於限制了給予的劑量，並因此使得可能有效的藥物不能得以應用。此外，癌症通常對化療藥物產生抵抗。
因此，非常需要特異性且更為有效的癌症療法。
血管生成是重要的細胞事件，其中血管內皮細胞增殖，去除多餘細胞，並重組而從現存血管網絡形成新血管。存在有力的證據表明血供的發展對於正常和病理增生過程是必不可少的(Folkman and Klagsbrun(1987)Science 235442-447)。氧氣和養料的遞送，以及分解產物的去除，代表多細胞有機體中出現的大多數生長過程中的限速步驟。因此，通常推定血管間隔(vascularcompartment)是必須的，其不僅對於胚胎形成中的器官發育和分化如此，對於成人傷口癒合以及生殖功能而言也是。
血管生成也見於多種疾病的發病機理，包括但不限於，腫瘤，增生性視網膜疾病，老年性黃斑退變，類風溼性關節炎(RA)，和銀屑病。血管生成對於大多數原發腫瘤以及其隨後的轉移而言是必不可少的。腫瘤可通過簡單擴散到1-2mm的大小而吸收足夠的養分和氧氣，在這樣的情況下，它們的進一步生長需要血供的建立。該過程被認為涉及鄰近宿主成熟脈管系統的募集以啟動新生血管毛細管的出芽，其向腫瘤基質生長並隨後穿透到其中。此外，腫瘤血管生成涉及循環內皮細胞前體細胞從骨髓的募集以促進新生血管化Kerbel(2000)Carcinogenesis 21505-515；Lynden et al.(2001)Nat.Med.71194-1201。
儘管新生血管的誘導被認為是腫瘤血管生成的主要方式，最近的數據表明一些腫瘤可通過共選擇(co-opt)現存宿主血管而生長。共選擇的脈管系統隨後退化，導致腫瘤退化，其最終可被低氧誘導的腫瘤邊緣血管生成逆轉。Holash et al.(1999)Science 2841994-1998。
考慮到血管生成的明顯生理和病理重要性，進行了許多工作以說明能調節該過程的因素。據提示血管生成過程由促血管生成分子和抗血管生成分子之間的平衡調節，並在多種疾病具體是癌症中所述平衡可移動。Carmeliet andJain(2000)Nature 407249-257。
血管內皮細胞生長因子(VEGF)(也稱為VEGF-A或血管通透性因子(vascular permeability factor)(VPF)，已經被報導為正常和異常血管生成中的關鍵調節物。Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.184-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77527-543。與其它導致血管形成過程的生長因子相比，VEGF的獨特性在於其對血管系統中內皮細胞的高特異性。Carmelietet al.(1996)Nature 380435-439；Ferrara et al.(1996)Nature 380439-442。此外，VEGF是雌性生殖道中周期性(cyclical)血管增殖以及骨生長和軟骨形成中所需的。Ferrara et al.(1998)Nature Med.4336-340；Gerber etal.(1999)Nature Med.5623-628。
除了是血管生成和脈管形成中的血管生成因子，VEGF作為多效生長因子，顯示在其它生理過程中的多種生物效應，諸如內皮細胞存活，血管通透性和血管舒張，單核細胞趨化以及鈣內流。Ferrara and Davis-Smyth(1997)，supra。此外，最近的研究報導VEGF對一些非內皮細胞類型具有促有絲分裂效應，諸如對視網膜色素細胞，胰腺導管細胞以及雪旺細胞(Schwann cell)。Guerrin et al.(1995)J.Cell Physiol.164385-394；Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126125-132；Sondell et al.(1999)J.Neurosci.195731-5740。
實質性證據還表明VEGF在涉及病理性血管增生的疾病或病症的進展中的重要作用。VEGF mRNA由所檢測的大多數人腫瘤細胞過表達(Berkmanet al.J Clin Invest 91153-159(1993)；Brownet dl.Human Pathol..2686-91(1995)；Brownet al.Cancer Res.534727-4735(1993)；Mattern etal.Brit.J.Cancer.73931-934(1996)；和Dvorak et al.Am J.Pat101.1461029-1039(1995))。此外，眼液體中VEGF的濃度與糖尿病以及其它缺血相關性視網膜病患者中血管的活躍增殖的存在高度相關(Aiello etal.N.Engl.J.Med.3311480-1487(1994))。此外，最近的研究證實了AMD患者中脈絡膜新生血管膜中VEGF的定位(Lopez etal.Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37855-868(1996))。
由於其在促進腫瘤生長中的重要作用，VEGF提供了治療介入的有吸引力的靶。實際上，多種治療靶的目的在於阻斷VEGF或其受體信號系統，所述治療靶目前正被開發用於治療腫瘤疾病。Rosen(2000)Oncologist 520-27；Ellis et al.(2000)Oncologist 511-15；Kerbel(2001)J.Clin.Oncol.1945S-51S。目前，單克隆抗體的VEGF/VEGF受體阻斷作用以及酪氨酸激酶抑制劑對受體信號的抑制作用是最好的研究方法。VEGFR-1核酶，VEGF毒素偶聯物以及可溶性VEGF受體也正被研究。
抗-VEGF抗體″Bevacizumab(BV)″，也稱為″rhuMAb VEGF″或″AvastinTM″，是重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，其根據Presta et al.(1997)Cancer Res.574593-4599所述製備。其包含突變的人IgGl框架區以及鼠抗-hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗原結合互補決定區，後者可阻斷人VEGF與其受體的結合。Bevacizumab的大約93％的胺基酸序列，包括大部分框架區，源自人IgGl，該序列的大約7％源自鼠抗體A4.6.1。Bevacizumab的分子量約149,000道爾頓並且是糖基化的。Bevacizumab正在臨床研究用於治療各種癌症，一些早期試驗已經顯示有希望的結果。Kerbel(2001)J.Clin.Oncol.1945S-51S；De Vore et al.(2000)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19485a；Johnson et al.(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20315a；Kabbinavar et al.(2003)J.Clin.Oncol.2160-65。

發明內容
本發明涉及利用抗-VEGF抗體治療疾病和病理狀態的方法。具體地，本發明提供了治療癌症的有效方法，其部分基於將抗VEGF抗體加入標準化療導致癌症患者的統計學顯著性以及臨床有意義的改善這一出人意料的結果。
因此，一方面，本發明提供治療人類患者中的癌症的方法，包括給藥患者有效量的抗VEGF抗體以及抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑。
可通過本發明治療的癌症包括，但不限於，癌症，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤，白血病或淋巴組織惡性疾病。癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，神經母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌以及各種頭和頸的癌症，以及B淋巴細胞瘤(包括低級/濾泡樣非何杰金氏淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；小淋巴細胞性(SL)NHL；中級/濾泡樣NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞NHL(high grade immunoblastic NHL)；高級淋巴母細胞NHL；高級小無裂細胞NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；bulky disease NHL；外套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS-相關的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓細胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；和移植後淋巴組織增生疾病(PTLD)，以及母斑細胞病相關性異常血管增生(abnormal vascular proliferation associatedwith phakomatoses)，水腫(諸如與腦腫瘤相關的)，和Meigs綜合症(Meigs′syndrome)。優選，所述癌症選自以下疾病乳腺癌，結腸直腸癌，直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎細胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波奇肉瘤(kaposi’s sarcoma)，類癌樣癌(carcinoidcarcinoma)，頭和頸部癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤(mesothelioma)以及多發性骨髓瘤。更優選，所述癌症為結腸直腸癌。可由本發明治療的癌性疾病包括轉移癌。本發明的方法具體適於治療血管化的腫瘤。
任何具有抗癌活性的化療劑可根據本發明使用。優選，所述化療劑選自以下物質組成的組烷化劑，抗代謝物，葉酸類似物，嘧啶類似物，嘌呤類似物以及相關抑制劑，長春花鹼類，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬醯胺酶，拓撲異構酶抑制劑，幹擾素，鉑配位複合物(platinum cooridnationcomplexes)，大黃素(anthracenedione)取代的脲，甲基肼衍生物，腎上腺皮質抑制劑，腎上腺皮質類固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，和促性腺激素-釋放激素類似物。更優選，所述化療劑選自以下物質組成的組5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲醯四氫葉酸(leucovorin)(LV)，伊立替康(irenotecan)，奧沙利鉑(oxaliplatin)，卡培他濱(capecitabine)，紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(doxetaxel)。兩種或更多抗癌劑可以以雞尾酒方式同抗-VEGF抗體聯用給藥。一種優選的聯合化療是基於5-氟尿嘧啶，包含5-FU和一或多種其它化療劑。適宜的聯用化療劑量方案是本領域已知的並在例如Saltz et al.(1999)Proc ASCO 18233a and Douillard et al.(2000)Lancet3551041-7中描述。
一方面，本發明提供了延長患有癌症的人類患者的生存期的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效延長所述生存期。
另一方面，本發明提供延長人類癌症患者的無進展生存期(progressionfree survival)的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效延長人類患者的無進展生存期。
此外，本發明提供治療一組人類癌症患者的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效增加所述患者組中的反應率。
另一方面，本發明提供延長人類癌症患者的反應時間(duration ofresponse)的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效延長反應時間。
本發明還提供治療易患或診斷為患有結腸直腸癌的人類患者的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體。所述結腸直腸癌是轉移癌。所述抗-VEGF抗體可進一步與標準結腸直腸癌化療諸如Saltz et al.(1999)所述的Saltz(5-FU/LV/伊立替康(irinotecan))方案聯合。
一個優選實施方案中，本發明提供治療患有轉移性結腸直腸癌的人類患者或人類患者的組的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥導致被治療患者的統計學顯著且臨床有意義的改善，所述改善通過生存期，無進展生存期，反應率(responserate)以及反應時間來測定。優選，所述抗腫瘤組合物是基於5-氟尿嘧啶的組合方案。更優選，所述組合方案包含5-FU+甲醯四氫葉酸，5-FU+甲醯四氫葉酸+伊立替康(IFL)，或5-FU+甲醯四氫葉酸+奧沙利鉑(FOLFOX)。
本發明提供製品，其包含容器、組合物以及包裝插頁，所述組合物包含在容器內，該組合物含有抗-VEGF抗體，所述包裝插頁指示該組合物的使用者將所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物給藥癌症患者。
本發明還提供用於治療人類患者中的癌症的試劑盒，其包含含有抗-VEGF抗體組合物的藥物包，以及利用所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物治療患者中的癌症的說明。
附圖簡述

圖1顯示生存的Kaplan-Meier評估。存活時間中值(median duration ofsurvial)(由點狀虛線表示)在給予伊立替康，氟尿嘧啶，和甲醯四氫葉酸(IFL)加上bevacizumab的組中為20.3月，而給予IFL+安慰劑的組中為15.6月，相應的死亡危險率為0.66(P＜0.001)。
圖2顯示無進展生存的Kaplan-Meier評估。無進展存活時間中值(由點狀虛線表示)在給予伊立替康，氟尿嘧啶，和甲醯四氫葉酸(IFL)加上bevacizumab的組中為10.6月，而給予IFL+安慰劑的組中為6.2月，相應的死亡危險率為0.54(P＜0.001)。
圖3A-3C提供了利用基線特徵對不同患者亞組存活時間的分析。
圖4顯示生存的Kaplan-Meier評估，其比較了給藥5-FU/LV+安慰劑的組相對於給藥5-FU/LV+bevacizumab(BV)的組。
圖5顯示無進展生存的Kaplan-Meier評估，其比較了給藥5-FU/LV+安慰劑的組相對於給藥5-FU/LV+bevacizumab(BV)的組。
具體實施方案1.定義術語″VEGF″和″VEGF-A″可互換使用，指165個胺基酸的血管內皮生長因子，以及相關的121-，189-，和206-胺基酸的血管內皮細胞生長因子(其由Leung et al.Science，2461306(1989)，和Houck et al.Mol.Endocrin.，51806(1991)描述)，以及其天然等位基因變體和加工的形式。術語″VEGF″也用於指含有165胺基酸的人血管內皮細胞生長因子的胺基酸8-109或1-109的多肽的截短形式。對任何這樣形式的VEGF可在本文中鑑定，例如通過″VEGF(8-109)，″″VEGF(1-109)″或″VEGF165″。「截短的」天然VEGF的胺基酸位置根據天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的胺基酸位置17也是天然VEGF中的位置17(蛋氨酸)。截短的天然VEGF與天然VEGF相比具有對KDR以及Flt-1受體的結合親合力。
″抗-VEGF抗體″是與VEGF以足夠的親和力以及特異性結合的抗體。優選，本發明的抗-VEGF抗體可用作治療劑靶向並幹擾其中涉及VEGF活性的疾病或病症。抗-VEGF抗體通常不與其它VEGF同系物諸如VEGF-B或VEGF-C結合，也不與其它生長因子諸如P1GF，PDGF或bFGF結合。優選的抗-VEGF抗體是單克隆抗體，其與雜交瘤ATCC HB 10709產生的單克隆抗-VEGF抗體A4.6.1結合相同的表位。更優選，所述抗-VEGF抗體是重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，其根據Presta et al.(1997)Cancer Res.574593-4599製備，包括但不限於已知為bevacizumab(BV；AvastinTM)的抗體。
術語「VEGF拮抗劑」是指任何能中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾VEGF活性包括其與一或多種VEGF受體的結合的分子。VEGF拮抗劑包括抗-VEGF抗體和其抗原結合片段，受體分子以及衍生物，該VEGF拮抗劑與VEGF特異性結合，由此隔離了(sequestering)其與一或多種受體、抗-VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑的結合。
在本說明書以及權利要求中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號根據Kabatetal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)所述的EU index進行，所述文獻包含在本文作為參考。「Kabat中的EU index」指人IgGl EU抗體的殘基編號。
「天然序列」包括具有與自然界衍生的多肽相同的胺基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可以從自然界分離或者通過重組和/或合成手段製備。術語「天然序列」多肽具體包括所述多肽的天然截短形式或分泌形式(如，胞外區序列)，天然變體形式(如，旁路剪接形式)以及天然存在的等位變體。
多肽「變體」指生物活性分子，其與天然序列多肽具有至少約80％的胺基酸序列同一性。所述變體包括，例如在所述多肽N或C末端加入、缺失了一或多個胺基酸殘基的多肽。通常，變體與天然序列多肽具有至少約80％胺基酸序列同一性，更優選至少約90％胺基酸序列同一性，更優選至少約95％胺基酸序列同一性。
術語「抗體」是指最廣意義上的抗體，具體包括人、非-人(例如鼠)和人源化的單克隆抗體(包括全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體(multivalent antibody)多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段(參照以下說明)，只要它們顯示所需的生物學活性。
除非另有說明，本文術語「多價抗體」表示含有三個或更多抗原結合位點的抗體。所述多價抗體優選被改造成包含三個或更多抗原結合位點並通常不是天然序列IgM或IgA抗體。
″抗體片段″包括完整抗體的僅僅一部分，通常包括完整抗體的抗原結合位點並由此保持與抗原結合的能力。本發明抗體片段的實例包括(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1區；(ii)Fab′片段，其為在CH1區C末端具有一或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1區；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1區以及位於CH1區C末端的一或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單個臂的VL和VH區；(vi)dAb片段(Wardet al.，Nature 341，544-546(1989))，其由VH區組成；(vii)分離的CDR區；(viii)F(ab′)2片段，其為包含兩個由鉸鏈區二硫橋連接的兩個Fab′片段的二價片段(例如單鏈Fv；scFv)(Bird etal.，Science 242423-426(1988)；和Huston etal.，PNAS(USA)855879-5883(1988))；(x)具有兩個抗原結合位點的″二價抗體(diabodies)″，包括在相同多肽鏈中與輕鏈可變區(VL)連接的重鏈可變區(VH)(見，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger etal.，PYOC.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))；(xi)″線性抗體″，其包含一對串聯的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata et al.Protein Eng.8(10)1057-1062(1995)；和US Patent No.5,641,870)。
本文術語「單克隆抗體」是指自一群基本同質的(homogeneous)抗體群獲得的抗體，即除了少量可能天然存在的突變以外，包含在該群中的各個抗體完全相同。單克隆抗體針對單個抗原高度特異。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑相反，每種單克隆抗體針對抗原的單個決定簇。修飾詞「單克隆」不解釋為需通過任何特殊方法產生抗體。例如，根據本發明應用的單克隆抗體可通過Kohler等(Nature，256495(1975))首先描述的雜交瘤法，或者重組DNA法製備(例如見美國專利4816567)。還可用例如Clackson等(Nature，352624-628(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.，222581-597(1991))所述的技術從噬菌體抗體文庫中分離「單克隆抗體」。
本文中單克隆抗體具體包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自具體物種或屬於具體抗體種類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，但所述鏈的剩餘部分的序列與源自另一個物種或屬於另一個抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學活性)的相應序列相同或同源(美國專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。
「人源化」非人(例如鼠)抗體是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。大多數場合，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，但其中受體的超變區殘基被具有所需特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的超變區殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基由相應的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區的全部，其中超變環的全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的相應部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還任選包括至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人的免疫球蛋白恆定區。詳見Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
「人抗體」是具有相應於人產生的抗體的胺基酸序列的抗體和/或使用本文公開的任何一種製備人抗體的技術製備的抗體。人抗體的定義明確排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。使用各種本領域已知的技術可產生人抗體。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughan等Nature Biotechnology 14309-314(1996)Sheets等PNAS(USA)956157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991))。也可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物製造人抗體，該轉基因動物可以是例如內源性免疫球蛋白基因被部分或完全滅活的小鼠。攻擊後觀察人抗體的產生，其與在人中所見的情形在各方面均十分相似，包括基因重排，組裝，和抗體庫。該方法在例如美國專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科學出版物中描述Marks等，Bio/Technology 10779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。可選地，可通過將產生針對目的抗原的抗體的人B淋巴細胞(此種B淋巴細胞可自個體回收或在體外被免疫)永生化製備人抗體。見例如，Cole等，單克隆抗體和癌症治療，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；和美國專利5,750,373。
「親和力成熟」的抗體是其中的一個或多個CDRs發生一種或多種改變並導致較不具有這些改變的親本抗體該抗體對抗原的親和力提高。優選親和性成熟的抗體對目的抗原具有納摩爾甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟抗體可由已知的方法產生。Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)通過VH和VL區域改組描述了親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機突變的描述見Barbas等，Proc Nat.Acad.Sci，美國，913809-3813(1994)；Schier等，Gene，169147-155(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)3310-9(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)。
「分離的」抗體是指從其天然環境成份中鑑定和分離和/或回收的抗體。其天然環境的汙染成份是可能干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，且可能包括酶，激素，和其它蛋白類或非蛋白類溶質。在優選的實施方案中，該多肽可純化成(1)按勞裡(Lowry)方法測定的抗體重量超過95％，且最優選重量超過99％，(2)其純化程度足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列，或(3)在還原型或非還原型條件下進行SDS-PAGE並使用考馬斯藍或者，優選銀染測定具有同質性。分離的抗體包括在重組細胞內的原位多肽，因為該抗體天然環境中的至少一種成份不存在。然而，一般來說，分離的抗體由至少一個純化步驟製備。
抗體的″功能性抗原結合位點″是能夠結合靶抗原的位點。所速抗原結合位點的抗原結合親和力不必與所述抗原結合位點所來源的親代抗體一樣強，但結合抗原的能力必須可利用多種已知評價抗體與抗原的結合的方法中的任意一種來測定。此外，本文所述多價抗體的每個抗原結合位點的抗原結合親和力在量上不必相同。對於本文的多聚體抗體，功能性抗原結合位點的數目可利用以下實施例2所述的超速離心分析來評估。根據該分析法，靶抗原與多聚體抗體的以不同比例組合，並且所述複合體的平均分子量在推定存在不同數目的功能性結合位點存在的條件下測定。這些理論值與所得實際試驗值相比以評估功能性結合位點的數目。
具有指定抗體的「生物性質」的抗體是具有使得所指定的抗體與結合相同抗原的其它抗體區別開來的一或多種生物性質的抗體。
為篩選結合與位於目的抗體結合的抗原上的表位的抗體，可進行常規交叉-阻斷(cross-blocking)試驗，諸如Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中所述。
「激動劑抗體″是結合併活化受體的抗體。通常拮抗劑抗體的受體活化能力在質上至少與所述受體的天然激動劑配體相似(並且可以在量上基本相似)。激動劑抗體的實例是與TNF受體超家族中的受體結合併誘導表達TNF受體的細胞的凋亡的激動劑抗體。測定凋亡的誘導的試驗的描述見W098/51793和W099/37684，均包含在此作為參考。
「疾病」是可從利用所述抗體的治療中受益的任何疾病。這包括慢性和急性疾病和病症，包括使得哺乳動物易患所述疾病的病理性狀態。本發明治療的疾病的非限制性實例包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴組織惡性疾病；神經元，神經膠質，星形細胞，下丘腦以及其它腺體，巨噬細胞，上皮細胞，基質以及囊胚腔(blastocoelic)的疾病；以及炎性，血管生成性以及免疫性疾病。
術語「治療有效量」指可有效治療哺乳動物中的疾病或病症的藥物量。對於癌症，藥物有效量可減少癌細胞數量；減小腫瘤體積；抑制(即減慢到一定程度並優選停止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即減慢到一定程度並優選停止)腫瘤轉移；在一定程度抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上緩解一或多種與癌症相關的症狀。藥物可以阻止已存在的腫瘤細胞的生長或殺死這些腫瘤細胞，所述藥物可以是細胞抑制劑或細胞毒性劑。對於癌症治療，體內效力可例如通過評估存活期，疾病進展時間(TTP)，反應率(RR)，反應時間，和/或生活質量來測定。
「治療」指治療性療法和防病或預防措施。需要治療的包括那些已患該病或那些需預防該病的人。
術語「癌症」和「癌性」是指或者描述哺乳動物中一般特徵在於細胞生長不受調控的生理學狀態。癌症的例子包括，但不限於，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤，白血病或淋巴組織惡性疾病。癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，神經母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌，各種類型的頭和頸癌，以及B-細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡樣非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞性(SL)NHL；中級/濾泡樣NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小無裂細胞NHL；bulky disease NHL；外套細胞淋巴瘤；AIDS-相關的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性成髓細胞白血病；移植後淋巴組織增生疾病(PTLD)，母斑細胞病相關性異常血管增生，水腫(諸如與腦腫瘤相關的)，以及Meigs症候群。
本文術語「哺乳動物宿主」指任何相容的移植物的受體。「相容」是指將接受供出的移植物的哺乳動物宿主。優選，所述宿主是人。如果移植物供體和所述受體都是人，優選他們的II型HLA抗原匹配以改善組織相容性。
本文所用術語「細胞毒作用製劑」是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)，化療劑和毒素例如小分子毒素或細菌，真菌，植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
術語″抗腫瘤組合物″指用於治療癌症的組合物，其包含至少一種能夠抑制或預防腫瘤生長或功能，和/或導致腫瘤細胞破壞的活性治療劑。適合包含在用來治療癌症的抗腫瘤組合物中的治療劑包括，但不限於，化療劑、放射活性同位素，毒素，細胞因子諸如幹擾素，以及靶向細胞因子的拮抗劑，與腫瘤細胞相關的細胞因子受體或抗原。例如，用於本發明的治療劑可以是諸如抗-HER2抗體和抗-CD20抗體，或小分子酪氨酸激酶抑制劑諸如VEGF受體抑制劑和EGF受體抑制劑。優選所述治療劑是化療劑。
「化療劑」是在癌的治療中使用的化學化合物。化療製劑實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXANTM環膦醯胺(cyclosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷醯胺，三亞乙基硫代磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙醯(acetogenins)(具體是bullatacin和bullatacinone)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)，卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；cryptophycins(具體是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷醯胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環磷醯胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素諸如enediyne抗生素(例如calicheamicin，具體是calicheamicin gammalI和calicheamicin omegaIl(見，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸鹽(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；esperamicin；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團和相關色素蛋白enediyne抗生素生色團)，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin)，authramycin，氮絲氨酸(azaserine)，博萊黴素(bleomycin)，放線菌素C(cactinomycin)，carabicin，去甲柔紅黴素(carminomycin)，嗜癌黴素(carzinophilin)，chromomycinis，更生黴素(dactinomycin)，柔紅黴素，地託比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代-多柔比星，氰基嗎啉代-多柔比星，2-pyrrolino-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿黴素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發波黴素(marcellomycin)，絲裂黴素諸如絲裂黴素C，黴酚酸，諾加黴素(nogalamycin)，橄欖黴素(olivomycin)，培洛黴素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤黴素，三鐵阿黴素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin)；鏈脲黴素(streptozocin)，殺結核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，淨司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷；雄激素類如卡普睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；elliptinium acetate；epothilone；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登素類(maytansinoids)諸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米託胍腙(mitoguazone)；米託蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；nitracrine；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；多糖複合體(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；單端孢黴烯(trichothecene)(具體是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；烏拉坦(urethan)；長春鹼醯胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)，ABRAXANETM無克列莫佛(Cremophor-free)，紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒配製劑(albumin-engineered nanoparticleformulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和TAXOTERE多西紫杉醇(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；chloranbucil；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑配位複合物(platinum coordination complexes)如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春花鹼；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米託蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼；NAVELBINE長春瑞賓(vinorelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；irinotecan(例如CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸類(retinoids)諸如維甲酸；capecitabine；以及上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。
此定義還包括能調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素製劑，如抗雌激素製劑和選擇性雌激素受體調節物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和FARESTON·託瑞米芬(FARESTON·toremifene)；芳香酶抑制物(aromatase inhibitor)，其抑制芳香酶，該酶調節腎上腺中的雌激素生成，諸如，例如4(5)-咪唑，氨魯米特(aminoglutethimide)，MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，AROMASIN依西美坦(exemestane)，formestanie，法倔唑(fadrozole)，RIVISOR伏氯唑(vorozole)，FEMARA來曲唑(letrozole)，和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素製劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，具體是抑制異常細胞增生所涉及的信號途徑中的基因表達的那些反義寡核苷酸，諸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras；核糖酶諸如VEGF表達抑制劑(例如，ANGIOZYME核糖酶)和HER2表達抑制劑；疫苗諸如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN疫苗，LEUVECTIN疫苗，和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓撲異構酶1抑制物；ABARELIXrmRH；和上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。
本文中「生長抑制劑」是指在體內或體外抑制細胞(例如癌症細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期惡性細胞百分比的藥物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期(在除S期以外的階段)進展的藥物，例如誘導G1停滯和M期停滯的藥物。經典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新鹼和長春花鹼)，TAXOL，美登木素生物鹼和topo II抑制劑如阿黴素、柔紅菌素、依託泊甙和博來黴素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強的松、達卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見「癌症的分子基礎」Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為「細胞周期調節，腫瘤和抗腫瘤藥物」的文章(WB SaundersPhiladephia，1995)，尤其見第13頁。
術語「細胞因子」是一般性術語，指由一個細胞群釋放的對另一個細胞群起細胞間介質作用的蛋白。此種細胞因子的實例是淋巴細胞因子，單核細胞因子和傳統的多肽激素。這些細胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺醯人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；上皮生長因子，肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒氏管抑制物質(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductivefactors)；幹擾素如幹擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本文所用術語「前體藥物」指藥物學活性物質的前體或衍生物形式，其較親本藥物對癌細胞的細胞毒作用小並能被酶活化或轉化成更具活性的親本形式。見例如Wilman「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」Biochemical SocietyTransanctions，14，pp.357-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，「ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，」Directed DrugDelivery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，人a Press(1985)。本發明的前體藥物包括但不限於，含磷酸鹽前體藥物，含硫代磷酸脂前體藥物，含硫酸鹽前體藥物，含肽前體藥物，D胺基酸修飾的前體藥物，糖基化前體藥物，含β內醯胺的前體藥物，任選取代的含苯氧基乙醯胺的前體藥物或任選取代的含苯基乙醯胺的前體藥物，可被轉化成更具活性的細胞毒性游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可被衍生為本發明所用前提藥物形式的細胞毒作用藥物的實例包括，但不限於，上述那些化療劑。
術語「靜脈內輸注」指將在長於大約5分鐘的時間，優選大約30-90分鐘內將藥物導入動物或人類患者的靜脈，但根據本發明，靜脈內輸注給藥可選持續10小時或10小時以下。
「靜脈內藥團(intravenous bolus)」或「靜脈內推注(intravenous push)」指給藥到動物或人類的靜脈，使得機體在大約15分鐘或以下，優選5分鐘或以下的時間內接受到所述藥物。
「皮下給藥」指通過自藥物容器的相對緩慢、持續的釋放，將藥物導入動物或人類患者的皮膚下，優選在皮膚和皮下組織之間的囊袋(pocket)中。所述囊袋可通過將皮膚捏起或拉開使其離開皮下組織而產生。
術語「皮下輸注」指通過自藥物容器的相對緩慢、持續的釋放，將藥物導入動物或人類患者的皮膚下，優選在皮膚和皮下組織之間的囊袋(pocket)中，所述釋放持續一段時間，包括但不限於30分鐘或以下，或90分鐘或以下。可選，所述輸注可通過將藥物遞送泵植入所述動物或人類患者的皮下來進行，其中所述泵遞送預定量的藥物一段預定的時間，諸如30分鐘，90分鐘，或治療方案長度所跨越的時間。
術語「皮下藥團(subcutaneous bolus)」指在動物或人類患者的皮膚下給藥，其中所述藥團遞送優選小於約15分鐘，更優選小於5分鐘，最優選小於60秒。給藥優選在皮膚和皮下組織之間的囊袋中，所述囊袋可通過將皮膚捏起或拉開使其離開皮下組織而產生。
「血管生成因子「是刺激血管發育的生長因子。本文優選的血管生成因子是血管內皮生長因子(VEGF)。
本文術語「標記」指可檢測的化合物或組合物，其與所述多肽直接或間接偶聯。所述標記自身是可檢測的(例如放射同位素標記或螢光標記)或，對於酶標記，可催化可檢測底物化合物或組合物的化學改變。
「分離的」核酸分子是一種從通常與該多肽核酸天然來源相關的至少一種混合核酸分子中鑑定並分離的核酸分子。分離的核酸分子不同於其天然發現的形式。因此分離的核酸分子可從天然細胞中的該核酸分子區別出來。然而，分離的核酸分子包括包含於通常表達該多肽的細胞中的核酸分子，在該細胞中核酸分子位於與天然細胞不同的染色體位置。
術語「調控序列」指特定宿主有機體中可操作地連接的編碼序列的表達所需的DNA序列。適合原核生物的調控序列，例如，包括啟動子，可選地包括操縱子序列，和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子，多腺苷化信號和增強子。
當與另一核酸序列發生功能關聯時，核酸是「可操作地連接的」。例如，前序列或分泌性前導序列如果被表達為參與多肽分泌的前蛋白，其可操作地連接該多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，其可操作地連接於該序列；或如果核糖體結合位點位於可促進翻譯的位置，其可操作地連接編碼序列。通常，「可操作地連接於」的意思是被連接的DNA序列是相鄰的，並且如果是分泌性前導序列，應是相鄰的並且處於閱讀框中。然而，增強子則不一定是相鄰的。通過在方便的限制位點接合而實現連接。如果此種位點不存在，合成的寡核苷酸連接物或連頭的使用符合常規的作法。
本文術語「細胞」，「細胞系」，和「細胞培養」可互換使用並且所有此種名稱包括其子代。因此，術語「轉化體」和「轉化後細胞」包括原代處理細胞及其衍生的培養物，而不考慮傳代的次數。由於有意和無意的突變，也可理解所有子代的DNA含量均不是恰好相同的。具有與原始轉化後細胞中篩選到的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變體子代也包括在內。儘管命名截然不同，從上下文來看這一點是清楚的。
II.抗-VEGF抗體的製備抗體製備(i)VEGF抗原製備並鑑定抗體的方法是本領域已知的。下文描述了製備本發明所用抗-VEGF抗體的示例性技術。用於製備抗體的VEGF抗原可以是，例如VEGF165分子以及VEGF的其它同種型或者其含有所需表位的片段。用於生成本發明抗-VEGF抗體的其它VEGF的形式對於本領域技術人員而言是顯而易見的。
人VEGF通過首先利用牛VEGF cDNA作為雜交探針篩選自人細胞製備的cDNA文庫來獲得。Leung et al.(1989)Science，2461306。由此鑑定的一種cDNA編碼與牛VEGF具有超過95％同源性的165個胺基酸的蛋白質；該165個胺基酸的蛋白質通常稱為人VEGF(hVEGF)或VEGF165。人VEGF的有絲分裂原活性通過在哺乳動物宿主細胞中表達人VEGF cDNA得以證實。通過由人VEGF cDNA轉染的細胞調節的培養基促進毛細血管內皮細胞的增殖，而對照細胞不能。Leung et al.(1989)Science，supra。
儘管血管內皮細胞生長因子可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，濾泡細胞中相對低的蛋白濃度以及回收VEGF的高成本(就人力以及花費而言)在商業上沒有應用價值。因此，需要進行其它努力以通過重組DNA技術克隆並表達VEGF。(見例如，Ferrara(1995)LaboratoryInvestigation 72615-618，所述參考文獻包含在此作為參考)。
VEGF在多種組織中作為多元同二聚體形式表達(每單體121，145，165，189，和206個胺基酸)，其是可選RNA剪接的結果。VEGF121是可溶有絲分裂原，並不結合肝素；較長形式的VEGF而漸離的親合力結合肝素。較長形式的VEGF可通過纖溶酶裂解其羧基末端以釋放VEGF的可擴散形式。纖溶酶裂解後鑑定的羧基末端肽的胺基酸序列是Arg110-Ala111。氨基末端「核心」蛋白VEGF(1-110)作為同源二聚體分離，與完整VEGF165同源二聚體相比，其與中和型單克隆抗體(諸如稱為4.6.1和3.2E3.1.1的抗體)以及VEGF受體的可溶形式以相似的親和力結合。
數種在結構上與VEGF相關的分子最近已經被鑑定，包括胎盤生長因子(PIGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E。Ferrara and Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，supra；Ogawa et al.(1998)J.Biological Chem.27331273-31281；Meyer etal.(1999)EMBO J.，18363-374。受體酪氨酸激酶，Flt-4(VEGFR-3)，已經被鑑定為VEGF-C和VEGF-D的受體。Joukov et al.(1996)EMBO.J.151751；Lee et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA931988-1992；Achen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95548-553。最近顯示VEGF-C參與淋巴血管生成的調節。Jeltsch et al.(1997)Science 2761423-1425。
已經鑑定了兩種VEGF受體，Flt-1(也稱為VEGFR-1)和KDR(也稱為VEGFR-2)。Shibuya et al.(1990)Oncogene 8519-527；de Vries et al.(1992)Science 255989-991；Terman et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.1871579-1586。Neuropilin-1為選擇性VEGF受體，其能夠結合肝素結合型VEGF同種型(Soker et al.(1998)Cell 92735-45)。Flt-I和KDR都屬於受體酪氨酸激酶(RTK)家族。RTK包括跨膜受體大家族，具有多種生物活性。目前，至少19種不同的PTK亞家族已經得以鑑定。酪氨酸激酶(RTK)家族包括對於多種細胞類型的生長以及分化而言重要的受體(Yarden and Ullrich(1988)Ann.Rev.Biochem.57433-478；Ullrich and Schlessinger(1990)Cell 61243-254)。RTK的內在功能在與配體結合時被活化，其導致受體以及多種細胞基質的磷酸化，由此產生多種細胞反應(Ullrich Schlessinger(1990)Cell61203-212)。因此，受體酪氨酸激酶介導的信號轉導由與特定生長因子(配體)的細胞外相互作用而啟動，通常隨後導致受體二聚體化，刺激內在蛋白酪氨酸激酶活性以及受體的反式磷酸化。細胞內信號轉導分子的結合位點由此產生，並導致形成具有胞漿信號分子譜的複合體，其可促進適當的細胞反應(例如細胞分裂，分化，代謝效應，細胞外微環境中的改變)。見Schlessingerand Ullrich(1992)Neuron 91-20。結構上，Flt-1和KDR在細胞外結構域中有7個免疫球蛋白樣結構域，一個跨膜結構域，被激酶插入區中斷的共有酪氨酸激酶序列。Matthews et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA889026-9030；Terman et al.(1991)Oncogene 61677-1683。
(ii)多克隆抗體多克隆抗體優選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑而產生。將所述相關抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來醯亞氨苯甲醯基硫代琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，進行偶聯是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內注射該溶液。1個月後，多位點皮內注射起始量的1/5-1/10的肽或偶聯物與弗氏完全佐劑來加強免疫。7-14天後，對動物採血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優選給動物加強注射相同抗原的偶聯物，但也可以是偶聯至不同蛋白和/或通過不同的交聯劑偶聯的偶聯物。偶聯物還可以是重組細胞培養物產生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑(aggregating agent)增強免疫反應。
(iii)單克隆抗體單克隆抗體可用Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤法製備或通過重組DNA法(美國專利4,816,567)製備。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，例如倉鼠，來激發產生或能產生特異結合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細胞。可選地，所述淋巴細胞可被體外免疫。免疫後，淋巴細胞可被分離並隨後使用適宜的融合劑例如聚乙二醇與骨髓瘤細胞系融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體Principles and Practice，59-103頁(Academic Press，1986))。
由此製備的雜交瘤細胞被接種於適宜的培養基並在其中生長，該培養基優選包含一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的選擇培養基通常包括次黃嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(HAT培養基)這些抑制HGPRT-缺陷細胞生長的物質。
優選骨髓瘤細胞為那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩定的高水平產生抗體、並對如HAT培養基敏感的骨髓瘤細胞系。在眾多這樣的細胞系中，優選的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute CellDistreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，和由美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653細胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系可用於產生人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur等，單克隆抗體的製備技術和應用(Marcel Dekker，Inc.，New York紐約，(1987))51-63頁]。
可在含有生長的雜交瘤細胞的培養基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產生。優選地，雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉澱或通過體外結合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
一旦鑑定出產生具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞，這些細胞克隆可通過有限稀釋進行亞克隆，並通過標準方法(Goding，單克隆 抗體Principles and Practice，59-103頁(Academic Press，1986))使其生長。適合此目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，通過例如將細胞注射入小鼠中，可以使雜交瘤細胞以動物腹水腫瘤的形式在體內生長。
上述亞克隆所分泌的單克隆抗體可用經典抗體純化方法如，例如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析等從培養基，腹水或血清中分離。
使用傳統方法(例如通過使用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)可輕易分離並測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細胞是此DNA的優選來源。一旦分離出該DNA，可以將它置入表達載體中，該載體隨後被轉染至宿主細胞中例如大腸桿菌細胞，猴COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不另外生成抗體蛋白的骨髓瘤細胞，從而在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。抗體的重組生產將在下文詳述。
在進一步的實施方案中，可從使用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)描述的技術產生的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離小鼠和人抗體。隨後的文章描述了通過鏈改組產生高親和性(納米級)人抗體(Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及將組合感染(combinational infection)和體內重組作為策略構建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行選擇。
也可採用以下方法對DNA進行修飾例如，以人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列代替同源小鼠序列(美國專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851(1984))，或將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的完整或部分編碼序列共價結合。
通常，上述非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體的恆定區，或它們可取代抗體的一個抗原結合位點的可變區以產生嵌合二價抗體，該抗體包含兩個特異於不同抗原的抗原結合位點。
(iv)人源化抗體和人抗體人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入它的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常稱為「引進的」殘基，它們通常來自「引進的」可變區。人源化過程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))的方法，通過用嚙齒類CDRs或CDR序列替換人抗體的對應序列來進行。因此，這樣的「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區的很少一部分被非人物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些CDR殘基且可能有部分FR殘基被齧齒動物抗體中類似位點的殘基取代。
選擇人源化抗體製備所用的人輕鏈和重鏈可變區，對於降低抗原性非常重要。根據所謂的「最適」方法，針對已知人可變區序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體的可變區序列。隨後將與嚙齒類最接近的人序列作為人框架區(FR)用於人源化抗體(Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法是使用從輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區。同樣的框架區可被用於幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化後保留了對抗原的高親合力和其它有利的生物特性。為達到此目的，根據優選方法，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性(conceptual)人源化產物來製備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技術人員所熟悉的。還有用於描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的電腦程式。通過觀察這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。通過這種方法，可從受體序列和引進序列中選出FR殘基並組合，從而得到所需抗體性質，如對靶抗原的親合力增加。總之，超變區殘基直接並且最主要涉及對抗原結合的影響。
可選的，可以製備轉基因動物(如小鼠)，它經過免疫能在缺乏內源性免疫球蛋白生成的情況下產生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列(array)轉移到此胚系突變小鼠中，將導致在抗原攻擊的情況下產生人抗體。見例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，733(1993)；和Duchosal等，Nature355258(1992)。人抗體也可來自噬菌體展示文庫(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech 14309(1996))。
(v)抗體片段已開發了生成抗體片段的多種技術。傳統上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學和生物物理學方法雜誌(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學，22981(1985))。但現在可直接通過重組宿主細胞產生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab』-SH片段，並經化學連接形成F(ab』)2片段(Carter等，生物/技術10163-167(1992))。依據另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養中分離F(ab』)2片段。其它產生抗體片段的技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185。
(v)多特異抗體多特異抗體對至少兩種不同的抗原具有結合特異性。儘管此種分子通常只結合兩種抗原(即雙特異抗體，BsAbs)，具有附加特異性的抗體例如三特異抗體也包含在文中所用的術語中。BsAbs的實例包括具有針對腫瘤抗原的一條臂和針對細胞毒作用觸發分子(cytotoxic trigger molecule)的另一條臂的那些抗體，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗-惡性B-細胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-腎細胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-結腸癌)，抗-CD3/抗-黑色素細胞刺激激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神經細胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相關抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一條臂特異地結合腫瘤抗原而另一條臂結合毒素的BsAbs例如抗-皂草素(saporin)/抗-Id-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A鏈，抗-幹擾素-α(IFN-α)/抗-雜交瘤獨特型，抗-CEA/抗-長春花鹼；轉化酶活化的前體藥物的BsAbs例如抗-CD30/抗-鹼性磷酸酶(催化磷酸絲裂黴素前藥物向絲裂黴素醇的轉化)；可用作纖維蛋白溶解劑的例如抗-纖維蛋白/抗-組織纖溶酶原激活物(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；將免疫複合物靶向細胞表面受體的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(例如FcγRI，FcγRII或FcγRIII)；用於治療感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-cell受體CD3複合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；體外或體內檢測腫瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗-hapten；作為疫苗佐劑的BsAbs；和作為診斷工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長抑素/抗-物質P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特異抗體的實例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。雙特異抗體可被製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab』)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體的綜述見Segal等J.Immunol.Methods 2481-6(2001)。
製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上，全長雙特異性抗體的重組製備是基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein and Cuello，Nature，305537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機搭配，這些雜交瘤(quadroma)產生10種不同抗體分子的潛在的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常複雜，且產量很低。類似的方法見WO93/08829(1993年5月13日公開)和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據不同的方法，可將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。該融合優選與至少包含鉸鏈區、CH2及CH3區部分的免疫球蛋白重鏈恆定區融合。優選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恆定區(CH1)出現在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構建的實施方案中，能夠較靈活地調整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現這種不對稱結構有利於從非必要免疫球蛋白鏈的組合中分離出所需雙特異性化合物，因為只在該雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開於1994年3月3日公開的WO94/04690中。製備雙特異性抗體的進一步細節可以參見，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。根據W096/27011所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養中獲得的異二聚體的百分比最大。優選的界面包括抗體恆定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源於第一抗體分子界面上的一條或多條小的胺基酸側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補「溝」可通過將胺基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種機制，其使異二聚體的產量比不想要的終產物如同二聚體高。
雙特異性抗體包括交聯抗體或「異源偶聯的」抗體。例如，可使異源偶聯物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯，使另一抗體與生物素偶聯。有觀點認為，這類抗體可用於將免疫細胞導向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用於治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。異源偶聯抗體可通過任何適當的交聯方法製備。適當的交聯製劑和多種交聯技術為本領域已知，可在美國專利4676980號中獲得。
從抗體片段製備雙特異性抗體的技術已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學連接製備。Brennan等，科學22981(1985)中描述了將完整抗體經蛋白水解製備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基複合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩定相鄰的巰基，並阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalaby等，實驗醫學雜誌，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學偶聯形成雙特異性抗體。如此製備的雙特異性抗體能與過表達VEGF受體的細胞和正常人T細胞結合，還能引發人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。
直接從重組細胞培養中製備並分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈製備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學雜誌，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區被還原成單體，然後被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用於製備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學院學報，906444-6448(1993))描述的「二價抗體」技術提供了另一種製備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此外還報導了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來製備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學雜誌，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可製備三特異性抗體。Tutt等，免疫學雜誌，14760(1991)。
(vii)效應物功能改造也可預期修飾拮抗劑的效應物功能(effector function)，如以此增強拮抗劑的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)。這可以通過在抗體拮抗劑FC區引入一或多個胺基酸取代而獲得。此外，可在FC區引入半胱氨酸殘基，使得在此區形成鏈間二硫鍵。由此產生的同型二聚體抗體可提高內在化能力和/或增強補體介導的細胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實驗醫學雜誌1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學雜誌1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌症研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯劑製備。或者，可通過工程改造產生具有雙FC區並因此具有增強的補體裂解效應及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設計(抗-Cancer drug design)3219-230(1989)。
(viii)免疫偶聯物本發明還涉及包含偶聯於細胞毒藥劑的本文所述抗體的免疫偶聯物，所述細胞毒藥劑諸如化療劑，毒素(例如細菌，真菌，植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射偶聯物)。
可用於產生所述免疫偶聯物的化療劑已經在上文描述。可以應用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米託菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚黴素、依諾黴素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用於製備放射偶聯物抗體。實例包括212Bi，131I，131In，90y和186Re。
抗體和細胞毒作用製劑的偶聯物可通過多種雙功能蛋白偶聯劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯劑如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯，亞胺基硫烷(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯)，活性酯類(如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛)，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 2381098(1987)所述製備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯至抗體的偶聯劑之一。見WO94/11026。
在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預靶向中應用的「受體」(如鏈黴親和素)偶聯，將該抗體-受體偶聯物給予患者，之後用清除劑(clearing agent)除去循環中未結合的偶聯物，再給予已偶聯了細胞毒作用製劑(如放射性核苷酸)的「配體」(如抗生物素蛋白)。
(ix)免疫脂質體本發明公開的抗體也被配製成免疫脂質體。含有所述抗體的脂質體通過本領域已知方法製備，諸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，774030(1980)；以及美國專利4,485,045和4,544,545中所述。具有延長的循環時間的脂質體在美國專利5,013,556中公開。
特別有用的脂質體可利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物經反相蒸發法產生。通過使脂質體在擠壓之下穿過指定孔徑大小的濾膜，可獲得具有所需直徑的脂質體。本發明抗體的Fab』片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所述，經二硫鍵交換反應與脂質體偶聯。可任選在所述脂質體中包含一種化療藥物。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
(x)抗體依賴酶介導的前體藥物的治療(ADEPT)通過將抗體偶聯於前體藥物活化酶，本發明的抗體也可用於ADEPT，該酶將前體藥物(例如肽基化療劑，見WO81/01145)轉化成活性抗癌藥物。參見，例如，WO 88/和美國專利4,975,278。
用於ADEPT的免疫結合物的酶組分包括任何能夠對前體藥物起作用，將它轉化成更加有活性的細胞毒作用形式的酶。
可用於本發明的方法的酶包括，但不限於，鹼性磷酸酶，用於將含有磷酸鹽的前體藥物轉化成游離藥物；芳香硫酸酯酶，用於將含有硫酸鹽的前體藥物轉化成游離藥物；胞嘧啶脫氨酶，用於將含有無毒的5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，用於將含肽的前體藥物轉化成游離藥物；D-丙醯胺羧肽酶，用於轉化含有D-胺基酸取代物的前體藥物；碳水化合物-切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神經醯氨酶，用於將糖基化的前體藥物轉化成游離藥物；β-內醯胺酶，用於將β-內醯胺衍生的藥物轉化為游離藥物；和青黴素醯胺酶，例如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶，用於將由苯氧乙醯基或苯乙醯基自其氨氮衍生的藥物分別轉化成游離藥物。可選地，具有酶活性的抗體(本領域也稱「抗體酶(abzyme)」)可用將本發明的前體藥物轉化成游離活性藥物(參見，例如，Massey，Nature 328457-458(1987))。可如本文所述方法製備抗體-抗體酶偶聯物，從而將抗體酶遞送到腫瘤細胞群。
通過本領域已知的技術，本發明的酶可與抗體共價偶聯，例如使用上述的異雙功能交聯劑。可選地，使用本領域技術人員熟悉的重組DNA技術構建融合蛋白，該融合蛋白至少包含本文抗體的抗原結合區，並連接於本發明的酶的至少一個功能活化部分。(見，例如，Neuberger等，Nature，312604-608(1984))。
(xi)抗體-拯救受體結合表位融合物在本發明具體實施方案中，例如需要利用抗體片段而不是完整抗體來促進腫瘤穿透。在這種情況下，需要修飾所述抗體片段以增加其血清半壽期。這可通過例如將拯救受體結合表位摻入所述抗體片段(例如通過突變抗體片段中的適宜區域或將所述表位摻入將融合於所述抗體任意末端或中間的肽標記中，例如通過DNA或肽合成)來實現拯救受體結合表位優選構成這樣的區域，其中任何來自Fc區的一或兩個環的一個或多個殘基被轉移到抗體片段的類似的位置。甚至更優選，來自Fc區的一或兩個環的3個或多個殘基被轉移。更優選，所述表位從Fc區(例如IgG的Fc區)的CH2區取出，並轉移到CH1，CH3，或VH區，或超過一個所述的抗體的所述區。可選，所述表位從Fc區的CH2區取出，並轉移到所述抗體片段的CL區和/或VL區。
(xii)抗體的其它共價修飾抗體的共價修飾包含在本發明範圍內。如果可能，它們可通過化學合成或對所述抗體的酶促或化學裂解來製備。對所述抗體的其它類型的共價修飾通過使被靶向的抗體胺基酸殘基與有機衍生反應劑反應來導入分子，所述有機衍生化劑可與選定的側鏈或N或C末端殘基反應。
半胱氨醯殘基最經常與α-滷代乙酸鹽(酯)(以及相應的胺)諸如氯代乙酸或氯代乙醯胺反應，以產生羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨醯殘基也通過與溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸，氯乙醯基磷酸酯，N-烷基馬來醯亞胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，對氯汞基苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯並-2-氧雜-1，3-二唑反應衍生化。
組氨醯殘基經過與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反應衍生化，因為該試劑對組氨酸側鏈具有相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴化物也是有用的；反應優選在0.1M二甲胂酸鈉中在pH 6.0進行。
賴氨醯和氨基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應。與這些試劑的衍生化具有使賴氨醯殘基的電荷逆轉的效應。衍生含α-氨基的殘基的其他合適試劑包括亞氨酸酯(imidoesters)，例如甲基吡啶亞醯胺(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氫化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉氨酶催化的與乙醛酸的反應。
精氨醯殘基通過與苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-環己二酮和茚三酮的一種或幾種常規試劑反應進行修飾。精氨酸殘基的衍生化需要在鹼性條件下進行反應，因為胍官能團具有高pKa。另外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸ε-氨基反應。
酪氨醯殘基的具體修飾可通過通過與芳香重氮基化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記導入酪氨醯殘基來進行。最常見，N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成O-乙醯基酪氨醯種類以及3-硝基衍生物。酪氨醯殘基利用125I或131I來碘化，從而製備標記的蛋白質用於放射免疫分析。
通過與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應可選擇性修飾羧基側鏈基團(天冬氨醯或穀氨醯)，其中R和R′是不同的烷基基團，例如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。另外，天冬氨醯和穀氨醯殘基通過與銨離子反應轉變成天冬醯胺醯基和穀氨醯胺醯基。
穀氨醯胺醯基以及天冬醯胺醯基通常被脫去醯胺基分別形成相應的穀氨醯殘基以及天冬胺醯殘基。這些殘基在中性或鹼性條件下脫去醯胺基。這些殘基脫去醯胺基後的形式在本發明的範圍內。
其它修飾包括脯氨酸以及賴氨酸的羥化，絲氨醯或蘇氨醯殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸以及組氨酸側鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的醯化，以及任何C末端羧基的醯胺化。
其它共價修飾類型包括將配糖以化學或酶促方式偶聯於抗體。這些方法的優勢在於它們不需要在宿主細胞中產生抗體，所述宿主細胞具有對N-或O-連接的糖基化的糖基化能力。根據所用的偶聯模式，所述糖可連接於(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如半胱氨酸的游離巰基，(d)游離羥基，諸如絲氨酸、蘇氨酸和羥脯氨酸的游離羥基，(e)芳香殘基，諸如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的芳香殘基，和(f)穀氨醯胺的醯胺基。這些方法在1987年9月11日公開的WO 87/05330，以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
去除任何存在於抗體上的碳水化合物部分可通過化學和酶方法實現。化學去糖基化需要將所述抗體暴露於化合物三氟甲磺酸或等價化合物。該處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺和N-乙醯半乳糖胺)之外的大多數或所有糖的裂解，而保持所述抗體完整。化學去糖化由Hakimuddin，etal.Arch.Biochem.Biopliys.25952(1987)和Edge et al.Anal.Biochem.，118131(1981)描述。抗體上碳水化合物部分的酶促裂解可通過利用多種內糖苷酶以及外糖苷酶進行，如Thotakuraet al.Metla.Enzymol.138350(1987)所述。
另一種抗體共價修飾類型包括將所述抗體連接於多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。
B.載體，宿主細胞和重組方法本發明所述抗-VEGF抗體可利用輕易可得的技術和材料重組製備。
為進行糖蛋白的重組生產，分離編碼它的核酸並把核酸插入可複製的載體中進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼糖蛋白的DNA易於利用傳統方法分離和測序(例如，通過使用能夠與編碼糖蛋白的基因特異結合的寡核苷酸探針)。可利用許多載體。載體的組分通常包括，但不限於，以下物質中的一種或多種信號序列，複製起點，一個或多個標記基因，增強子，啟動子，和轉錄終止序列。
(i)信號序列成分本發明的糖蛋白不僅可直接被重組生產，也可以作為與異源多肽的融合蛋白被生產，該異源多肽優選是信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位點的其它多肽。選定的異源信號序列優選是可由宿主細胞識別和加工(即，由信號肽酶切割)的序列。對於不識別和加工天然多肽信號序列的原核細胞，信號序列由以下原核信號序列取代，例如選自鹼性磷酸酶，青黴素酶，1pp，或熱穩定腸毒素II前導序列。對於酵母分泌物，天然信號序列可由例如酵母轉化酶前導序列，α因子前導序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)α-因子前導序列)，或酸性磷酸酶前導序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖澱粉酶前導序列，或WO 90/13646中所述的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列，例如，單純皰疹gD信號。
在閱讀框架中，此種前體區的DNA連接於編碼所述抗體的DNA。
(ii)複製成分的起點表達載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細胞中複製的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨立於宿主染色體DNA而複製的序列，包括複製起點或自我複製序列。這樣的序列在各種細菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質粒pBR322的複製起點適合大多數革蘭氏陰性細菌，2μ質粒起點適合酵母菌，多種病毒起點(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中的克隆載體。複製組分的起點一般不是哺乳動物表達載體所必需的(SV40起點的使用通常僅僅是由於其包含早期啟動子)。
(iii)選擇基因成分表達載體和克隆載體應該包含選擇基因，也稱選擇標記。該基因編碼使經過轉化的宿主細胞在選擇性培養基中存活或生長所必需的蛋白。沒有被包含該選擇基因的載體轉化的宿主細胞在所述選擇性培養基中不能存活。典型的選擇基因編碼具有以下性質的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(如氨苄青黴素，新黴素，氨甲蝶呤或四環素)的抗性，(b)彌補營養缺陷，或(c)提供複合培養基不能供給的關鍵營養物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個實例是利用藥物限制宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉化的細胞產生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環境中存活。這種顯性選擇可以採用的藥物有新黴素，黴酚酸和潮黴素。
適合於哺乳動物細胞的另一例選擇標記是允許鑑定能攝取多肽核酸的細胞的那些標記，如DHFR或胸苷激酶，金屬硫蛋白-I和-II，優選靈長類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。
例如，用DHFR選擇基因轉化的細胞首先通過將所有轉化體培養在包含氨甲蝶呤(Mtx，為DHFR的一種競爭型拮抗劑)的培養基中來進行鑑定。當採用野生型DHFR時，合適的宿主細胞包括DHFR活性有缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，宿主細胞(尤其包含內源DHFR的野生型宿主)被編碼Bv8的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標記如氨基糖苷3』-磷酸轉移酶(APH)轉化或共轉化以後，可以通過在含有針對該選擇標記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那黴素，新黴素或G418)的培養基中培養細胞來進行選擇。參見美國專利4,965,199。
適用於酵母的合適選擇基因是存在於酵母質粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。Trp1基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了選擇標記(Jones，Genetics，8512(1977))。此後，酵母宿主細胞基因組中trp1損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長而檢測轉化的有效環境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由攜帶Leu2基因的已知質粒來補充。
此外，源自1.6μm環狀質粒pKD1的載體可以用於轉化克魯維酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12185(1987)。可選地，Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)報導了一種用於在乳克魯維酵母(K.lactis)中大規模製備重組小牛凝乳酶的表達系統。已公開由克魯維酵母的工業生產菌株產生分泌重組人血清白蛋白的穩定的多拷貝表達載體。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(iv)啟動子成分表達載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識別的啟動子，它與多肽核酸可操作相連。適用於原核宿主的啟動子，包括phoA啟動子，β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統，鹼性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統，和雜化啟動子如tac啟動子。然而，也可以使用其它已知的細菌啟動子。適用於細菌系統的啟動子還包含與編碼多肽的DNA可操作相連的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
真核生物的啟動子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉錄起始點上遊約25-30個鹼基處具有AT-富集區。很多基因在其轉錄起始點上遊70-80個鹼基處有另一種序列CNCAAT，其中x可以是任何核苷酸。大多數真核基因的3』端是AATAAA序列，它可以作為一種信號用於將poly-A尾添加到編碼序列3』端。所有這些序列都適合於插入真核表達載體中。
適用於酵母宿主的啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動子，即那些還具有由生長條件控制轉錄的優點的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進一步描述了適用於酵母表達系統的載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子聯合使用也是有利的。
在哺乳動物宿主細胞中，從載體轉錄抗體可以受啟動子調控，所述啟動子例如來自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，來自熱休克蛋白的啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為還包含SV40病毒複製起點的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。美國專利4,419,446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來表達DNA的系統。美國專利4,601,978中敘述了對這個系統的改進。另見Reyes等，Nature，297598-601(1982)中關於在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人β幹擾素cDNA。可選地，可將勞氏肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。
(v)增強子成分編碼本發明多肽的DNA在高等真核生物中的轉錄常常通過將增強子序列插入載體中來增加。目前已知很多哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其複製起始點晚期側(late side)的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其複製起始點晚期側的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。也可參見Yaniv，Nature，29717-18(1982)所述用於活化真核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5』或3』位置，但優選位於啟動子的5』位置。
(vi)轉錄終止成分用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉錄終止和穩定mRNA所必需的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5』(偶爾為3』)非翻譯區。這些區域包含轉錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯區中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有用的轉錄終止元件是牛生長激素多腺苷化區。見WO94/11026和其中公開的表達載體。
(vii)宿主細胞的選擇和轉化克隆或表達本文所述載體中DNA的適宜宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適於此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌杆屬(Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈黴菌(Streptomyces)。優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌x1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些實例是用於說明，並非限制。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合於抗體編碼載體的克隆或表達的宿主。釀酒酵母或常見的麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個其它屬、種和株已有商品供應，並且可以用於本發明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol.，28265-278(1988))；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢黴；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomycesoccidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢黴屬、青黴屬、Tolypocladium以及麴黴屬宿主如構巢麴黴和黑麴黴。
適合於表達糖基化多肽的宿主細胞來自多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。目前已經從下述宿主中鑑定了大量的杆狀病毒株和變體以及相應的許可型昆蟲宿主細胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾(Bombyx mori)等。用於轉染的各種病毒株公眾可以獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾(Autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，並且這些病毒可以在此用作本發明的病毒，尤其是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和菸草等的植物細胞培養物也可以用作宿主。
然而，關注最多的是脊椎動物細胞，而且在培養(組織培養)中繁殖脊椎動物細胞已經成為常規方法。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293細胞或經過再克隆以便能在懸浮培養物中生長的293細胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；小鼠骨髓瘤細胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10169(1992))和SP2/0細胞(例如SP2/0-Ag 14細胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤細胞，例如YB2/0細胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌細胞系(HepG2)。
利用上述表達或克隆載體轉化宿主細胞以進行抗體製備並培養在經改進的常規營養培養基中，所述培養基適於誘導啟動子，選擇轉化體，或擴增編碼所需序列的基因。
(viii)培養宿主細胞可在多種培養基中培養用於生產本發明多肽的宿主細胞。作為商品提供的培養基例如Ham’s F10(Sigma)，Minimal Essential Medium((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM)，Sigma)適宜培養宿主細胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)，美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re.30,985中所述的任何培養基可用作宿主細胞的培養基。在需要時均可向這些培養基的任何一種補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素，轉鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(例如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩衝液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)，微量元素(定義為無機化合物，通常終濃度在微摩爾範圍內)，和葡萄糖或對等的能源。也可包括本領域熟練技術人員所知的適當濃度的任何其它必需添加劑。培養條件，例如溫度，pH，等是此前選擇用於表達的宿主細胞的條件，並且是本領域普通熟練技術人員顯而易見的。培養條件諸如溫度，pH等，是被選用於表達的宿主細胞的那些條件，並且是本領域技術人員所已知的。
(ix)抗體的純化使用重組技術時，抗體可在細胞內，壁膜間隙產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體在細胞內產生，第一步需要去除宿主細胞或裂解片段的粒狀殘骸，例如，通過離心或超濾作用。Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分離抗體的方法，該抗體被分泌到大腸桿菌的壁膜間隙。簡言之，細胞懸濁液(paste)在乙酸鈉(pH 3.5)，EDTA，和苯基甲基磺醯氟化物(phenylmethylsulfonylfluoride)(PMSF)存在下，經過約30分鐘解凍。通過離心可去除細胞碎片。如果抗體被分泌到培養基中，通常首先使用作為商品提供的蛋白濃縮濾紙(例如，Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit)濃縮來自該表達系統的上清液。在此前的任何步驟中，可使用蛋白酶抑制物例如PMSF抑制蛋白溶解，以及使用抗生素防止外來汙染物的生長。
由細胞製備的糖蛋白組合物可使用如下方法純化例如，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析，優選親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴於存在於糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用於純化基於人(γ1，γ2，或γ4重鏈的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G用於所有小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBO J.515671575(1986))。親和配體附著的基質通常是瓊脂糖，但也可用其它基質。物理穩定的基質例如孔徑被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用瓊脂糖獲得更快的流率而且加工時間更短。對於含有CH3區的抗體，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用於純化。根據待回收的抗體，也可利用其它蛋白純化技術例如；在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉澱；反相HPLC；在矽石(silica)上層析，在肝素SEPHAROSETM上層析，在陽離子或陰離子-交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)上層析；聚焦層析；SDS-PAGE；硫酸銨沉澱。
任何初步純化步驟後，包含抗-VEGF抗體以及汙染物的混合物可接受利用洗脫緩衝液在pH約2.5-4.5的條件下的低pH疏水反應層析，其優選在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)條件下進行。
III.藥物配製劑可以通過將具有所需純度的抗體與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成凍幹製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、巖藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優選凍幹的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。
本發明的配製劑也可含有被治療具體指徵所需的一種以上的活性化合物，優選活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，合意地進一步在一種配製劑中包含與EGFR，VEGF(例如，與VEGF上不同表位結合的抗體)，BEGFR或ErbB2結合的抗體(例如Herceptin)。可選或此外，所述組合物包含細胞毒劑，細胞因子，生長抑制劑和/或小分子VEGFR拮抗劑。所述分子是與以有效用於目的意圖的量組合存在。
該活性成分也可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，分別在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或在粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。這些技術公開於Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
用於體內給藥的本發明化合物必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919，EP 58,481)，L-穀氨酸與γ乙基-L-穀氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠囊化抗體長時間停留在體內時，它們可能由於暴露在37℃潮溼環境中而變性或凝聚，導致損失生物活性，且免疫原性可能會改變。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍幹、控制溼度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
IV.抗-VEGF抗體的治療用途根據本發明，抗-VEGF抗體可用於治療各種以病理性血管生成為特徵的腫瘤和非腫瘤疾病。可接受治療的非腫瘤疾病包括類風溼性關節炎，銀屑病，動脈粥樣硬化，糖尿病以及其它增生性視網膜病，包括早產兒視網膜病，晶狀體後纖維組織形成，新生血管性青光眼，與年齡相關的黃斑退行性改變，甲狀腺增生(包括Grave病)，角膜以及其它組織移植，慢性炎症，肺炎症，腎病症候群，先兆子癇，腹水，心包積液(諸如與心包炎相關的心包積液)，以及胸膜積液。
本發明的抗體優選用於治療其中血管生成在腫瘤生長中起重要作用的腫瘤，包括癌症和良性腫瘤。將被治療的癌症的實例包括，但不限於，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，神經母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌以及各種頭和頸的癌症，以及B淋巴細胞瘤(包括低級/濾泡樣非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞性(SL)NHL；中級/濾泡樣NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小無裂細胞NHL；bulkydisease NHL；外套細胞淋巴瘤；AIDS-相關的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性成髓細胞白血病；和移植後淋巴組織增生疾病(PTLD)以及母斑細胞病相關性異常血管增生，水腫(諸如與腦腫瘤相關的水腫)，和Meigs綜合症。優選，可用本發明抗體治療的癌症選自以下疾病組成的組乳腺癌，結腸直腸癌，直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎細胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波奇肉瘤，類癌樣癌，頭和頸部癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤以及多發性骨髓瘤。更優選，本發明的方法用於治療人類患者的結腸直腸癌。
本發明包括抗血管生成治療，新癌症治療策略，其目標在於抑制提供養料支持腫瘤生長的腫瘤血管的發育。因為血管生成參與原發性腫瘤生長以及轉移，本發明提供的抗血管生成療法能夠抑制原發位點的腫瘤生長以及防止腫瘤向繼發位點的轉移，由此允許通過其它療法攻擊腫瘤。
聯合療法當用於治療諸如腫瘤的各種疾病時，本發明的抗體可與其它適於相同或類似疾病的治療劑聯用。當用於治療癌症時，本發明的抗體可與常規癌症療法諸如手術、放療、化療或其組合聯用。
在一些方面中，用於與本發明抗體聯用的癌症治療的其它治療劑包括其它抗血管生成藥劑。許多抗血管生成藥劑已經被鑑定並且是本領域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所述的。優選，本發明的抗-VEGF抗體與其它VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑聯用，諸如VEGF變體，可溶性VEGF受體片段，能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體(aptamer)，中和型抗-VEGFR抗體，VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制劑以及其任意組合。可選或此外，兩或多種抗-VEGF抗體可共同給藥患者。
一些其它方面中，用於與本發明抗體聯用的腫瘤療法的其它治療劑包括其它參與腫瘤生長的因子的拮抗劑，所述因子諸如EGFR，ErbB2(也已知為Her2)ErbB3，ErbB4，或TNF。有時，將一或多種細胞因子給藥所述患者也是有益的。在優選實施方案中，VEGF抗體與生長抑制劑聯合給藥。例如，所述生長抑制劑可先給藥，然後給藥VEGF抗體。然而，也考慮同時給藥或首先給藥VEGF抗體。生長抑制劑的適宜劑量是目前所用的那些，並且可由於生長抑制劑與抗VEGF抗體的聯合作用(協同作用)而用量減少。
化療劑在具體的方面，本發明提供通過將有效量的抗VEGF抗體以及一或多種化療劑給藥易患或被診斷患有癌症的患者來治療癌症的方法。多種化療劑可與本發明的方法聯用。所涉及化療劑的示例性以及非限制性列表在本發明的「定義」這一標題下提供。
本領域技術人員應理解，化療劑的適宜劑量通常大致為臨床治療中所用的劑量，其中所述化療劑單獨給藥或與其它化療劑聯用給藥。劑量的變化很可能根據被治療的疾病而出現。給予所述治療的醫師將能夠確定個體患者的適宜劑量。
僅作為舉例，本發明給出了用於轉移性結腸直腸癌的標準化療。
一個優選實施方案中，本發明的方法用於治療結腸直腸癌包括轉移性結腸直腸癌。結腸直腸癌是美國癌症死亡率中的第三位的常見原因。估計在美國，1999年診斷大約129,000的新髮結腸直腸癌病例，並且結腸直腸癌導致56,000人死亡，Landis et al.，Cancer J Clin.498-31(1999)。大約70％的結腸直腸癌患者顯示可通過手術切除治癒的疾病，August et al.，Cancer MetastasisRev 3303-24(1984)。然而，佔30％的進展期或轉移癌症的患者以及佔20％的切除後復發患者的預後較差。轉移疾病患者的中值存活期為12-14個月，Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project，J Clin Oncol 10896-903(1992)。
美國的轉移性結腸直腸癌標準療法目前是利用5-氟尿嘧啶(5-FU)加5-FU的生化調節物甲醯四氫葉酸，Advanced Colorectal Cancer Meta-AnalysisProject，J Clin Oncol 10896-903(1992)；Moertel N Engl J Med 3301136-42(1994)。5-FU/甲醯四氫葉酸的組合使得結腸直腸腫瘤偶然的暫時縮小，但與單獨的5-FU相比沒有顯示延長生存期(Advanced Colorectal CancerMeta-Analysis Project，J Clin Oncol 10896-903(1992))，而且5-FU與無效治療加上最佳的支持性看護相比沒有顯示延長生存期，Ansfield et al.Cancer3934-40(1977)。5-FU/甲醯四氫葉酸對於生存期益處的缺乏可能部分由於不適當的臨床試驗範圍。在大型隨機化試驗中，患者接受輔助化療來治療可切除的結腸直腸癌，5-FU/甲醯四氫葉酸與lomustine(MeCCNU)，長春新鹼，和5-FU相比顯示可延長生存期(MOF；Wolmark et al.J Clin Oncol 111879-87(1993)。
在美國，5-FU/甲醯四氫葉酸化療通常根據兩種方案之一給藥MayoClinic和Roswell Park方案。Mayo Clinic方案由長期(intensive course)5-FU加低劑量甲醯四氫葉酸(425mg/m25-FU加20mg/m2甲醯四氫葉酸，每天經靜脈[IV]推注給藥持續5天，每隔4到5周重複所述治療)組成，Buroker et al.J Clin Oncol 1214-20(1994)。Roswell Park方案每周5-FU加高劑量甲醯四氫葉酸(500-600mg/m 25-FU通過IV推注給藥加上500mg/m2甲醯四氫葉酸，後者每周一次輸液2小時給藥並持續6周，上述治療每8周重複一次)，Petrelli et al.，J Clin Oncol 71419-26(1989)。臨床試驗比較了Mayo Clinic和Roswell Park方案，沒有顯示其效力有差異，但是效力不足，Buroker et al.，JClin Oncol 1214-20(1994)；Poon et al.，J Clin Oncol 71407-18(1989)。兩種方案的毒性圖譜不同，Mayo Clinic方案導致更多的白細胞減少而Roswell Park方案導致更頻繁的腹瀉。接受任意方案的新近被診斷為轉移性結腸直腸癌的患者可預期4-5個月的疾病進展中值時間以及12-14個月的中值生存期，Petrelli et al.，J Clin Oncol 71419-26(1989)；Advanced Colorectal CancerMeta-Analysis Project，J Clin Oncol 10896-903(1992)；Buroker et al.，J ClinOncol 1214-20(1994)；Cocconi et al.，J Clin Oncol 162943-52(1998)。
最近，轉移性結腸直腸癌的新第一線療法出現。兩個隨機化臨床療法，每個均使用近400名患者，評估了伊立替康與5-FU/甲醯四氫葉酸的聯用，Saltz et al.，Proc ASCO 18233a(1999)；Douillard et al.，Lancet 3551041-7(2000)。在兩項研究中都顯示，與單獨的5-FU或甲醯四氫葉酸相比，伊立替康/5-FU/甲醯四氫葉酸的聯用導致統計學顯著的生存期延長(分別為2.2和3.3月)，疾病進展時間延長以及反應率增加。伊立替康的益處的代價在於毒性增加將伊立替康加入5-FU/甲醯四氫葉酸與單獨的5-FU或甲醯四氫葉酸相比，National Cancer Institute Common Toxicity Criteria(NCI-CTC)3級/4腹瀉，3級/4嘔吐，4級白細胞減少，以及無力的發病率增加。還有證據顯示單劑伊立替康在二線背景中延長存活期，Cunningham et al.，Lancet3521413-18(1998)；Rougier et al.，Lancet 3521407-12(1998)。兩項隨機研究證實伊立替康延長在5-FU治療後進展的患者的生存期。一項研究將伊立替康與最佳支持性護理比較，並顯示存活期延長2.8-月；另一項研究將伊立替康與輸注的5-FU比較，並顯示生存期延長2.2-月。伊立替康在一線和二線背景中對生存期是否有更多影響沒有以良好控制的方式研究。
劑量和給藥本發明的抗體和化療劑可根據已知方法給藥人類患者，諸如作為藥團(bolus)經靜脈內給藥，或通過一段時間內的連續輸注給藥，經肌內、腹膜內、腦脊液內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。靜脈內或皮下給藥所述抗體是優選的。
一個實施方案中，本發明的治療涉及聯合給藥抗VEGF抗體以及一或多種化療劑。本發明涉及給藥不同化療劑的組合。聯合給藥包括利用不同配製劑或單一藥物配製劑的聯合給藥，以及以任何順序的連續給藥，其中優選存在兩種(或所有)活性藥劑同時顯示它們的生物活性的一段時間。所述化療劑的製備和配製方案可根據生產商說明進行或由有經驗的醫師根據經驗確定。化療的製備和劑量方案也在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams Wilkins，Baltimore，MD(1992)中描述。所述化療劑可在所述抗體給藥之前或以後，或可同時給藥。
為預防或治療疾病，抗體的適宜劑量將有賴於將要治療的疾病類型，如上所述，疾病的嚴重度以及病程，所述抗體是否為預防或治療目的給藥，以前的治療，患者的臨床病史以及對抗體的反應，以及主治醫師的判斷。所述抗體一次性或在一系列治療中適宜地給藥患者。在聯合治療方案中，本發明的組合物以治療有效量或協同作用量給藥。如本文所用，治療有效量使得抗VEGF抗體以及一或多種其它治療劑的聯合給藥或本發明的組合物的給藥導致靶疾病或病症的緩解或抑制。治療協同作用量為抗VEGF抗體與一或多種其它治療劑協同作用或顯著降低或消除與具體疾病相關的病症或症狀所必須的量。
根據疾病的類型以及嚴重度，約1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體是給藥患者的初始候選劑量，其可例如通過一或多次分開的給藥或連續輸注來給予。常規日劑量範圍為約1μg/kg到約100mg/kg或更高，依上述因素而不同。對於在數天或更長時間內的重複給藥，根據病情，所述治療持續直到出現對疾病症狀的所需的抑制。然而，其它劑量方案也可使用。在一個優選方面，本發明的抗體每2-3周給藥，劑量範圍為約5mg/kg到約15mg/kg。更優選，所述劑量方案與化療方案聯用作為轉移的結腸直腸癌的一線療法。在一些方面，所述化療方案涉及常規高劑量間歇給藥。在一些其它方面，所述化療劑以較小且更為頻繁的劑量而沒有預定的間隔來給藥(「節拍化療(metronomic chemotherapy)」)。本發明治療的進展容易通過常規技術和實驗來監測。
適宜劑量的其它信息在以下實施例中提供。
治療效力本發明治療的主要優勢是在人患者中產生明顯的抗癌效果但不導致明顯的毒性或副作用的能力，使得所述患者從整體治療獲益。本發明治療的效力可通過通常用於評估癌症治療的各個終點(endpoint)來測定，包括但不限於，腫瘤退化，腫瘤重量或大小減小，進展時間，生存期，無進展生存期，總體反應率，反應時間以及生活質量。由於本發明的抗血管生成劑靶向腫瘤血管系統而不必要是腫瘤細胞本身，它們代表抗癌藥物的獨特類型，並因此可需要獨特的方法以及對藥物的臨床反應的定義。例如，2維分析中超過50％的腫瘤縮小是宣布反應的標準分離點(cut-off)。然而，測定抗血管生成療法的效力的新方法應採用，包括例如，測定血管生成的血漿或尿標誌物以及通過放射顯像測定反應。
一個實施方案中，本發明可用於延長易患或被診斷患有癌症的人類患者的生存期。生存期定義為首次給予藥物到死亡的時間。一個優選方面，本發明的抗VEGF抗體與一或多種化療劑聯合給藥人類患者，由此該患者的生存期與單獨給藥化療相比得以有效延長。例如，用抗VEGF抗體聯合至少兩種，優選三種化療劑的化療劑組合治療的患者組的中值生存期為至少約2個月，優選約2-5個月，超過單獨用相同的化療劑組合治療的患者組，所述延長在統計學上具有顯著性。生存期可通過治療組相對於對照組的分層危險率(stratified hazard ratio)(HR)來測定，其代表治療過程中患者死亡的危險性。優選，當與單獨的化療劑相比時，抗VEGF抗體與一或多種化療劑的聯用治療明顯降低死亡率至少約30％(即分層HR(stratified HR)約0.70)，優選至少約35％(即分層HR約0.65)。
一個實施方案中，本發明提供增加易患或被診斷患有癌症的人類患者的無進展生存期的方法。疾病進展的時間定義為給予藥物到疾病進展的時間。一個優選實施方案中，與單獨的化療治療相比，本發明利用抗VEGF抗體以及一或多種化療劑的聯合治療明顯增加無進展存活期至少約2個月，優選至少約2-約5個月。
另一實施方案中，本發明的治療顯著增加易患或被診斷患有癌症的人類患者組中的反應率，所述患者用多種療法治療。反應率定義為對所述治療有反應的被治療患者的百分比。一方面，與單獨的化療治療相比，本發明利用抗VEGF抗體以及一或多種化療劑的聯合治療顯著增加被治療患者組中的反應率，所述增加具有低於0.005的Chi-square p-值。
一方面，本發明提供增加易患或被診斷患有癌症的人類患者或人類患者組中的反應時間(duration of response)。反應時間定義為初次反應到疾病進展的時間。在本發明利用抗VEGF抗體以及一或多種化療劑的聯合治療中，獲得並優選反應時間增加至少2個月，所述增加具有統計學顯著性。
治療安全性本發明提供有效治療癌症而對被治療人類受試者沒有明顯副作用的方法。本發明治療的臨床效果在一定程度上是出人意料的，被認為與抗血管生成療法相關的數個不利事件在根據本發明的治療過程中沒有觀察到。例如，以前的臨床研究提示利用抗VEGF抗體的治療可導致血栓(一些情況中會致死)，高血壓，蛋白尿和鼻衄(出血)。然而，與單獨的化療相比，本發明利用抗VEGF抗體以及包含至少兩種優選三種化療劑的化療劑組合的聯合治療不顯著增加這些不利事件的發生率。因此，本發明的治療出人意料地包含可接受水平的副反應，同時具有明顯提高的抗癌效力。
V.製品本發明另一實施方案涉及一種製品，其包含可用於治療上述疾病的材料。所述製品優選包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療所述疾病並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑是抗VEGF抗體。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療所選的疾病。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如警告所述組合物不與蒽環類抗生素類型的化療劑例如阿黴素，或表柔比星聯用，或指示所述組合物的使用者將抗VEGF抗體組合物以及抗腫瘤組合物給藥患者。
保藏材料以下雜交瘤細胞系已經根據布達佩斯條約保藏在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，Manassas，VA，USA抗體名稱 ATCC No. 保藏日期A4.6.1ATCC HB-107091991-3-29
以下實施例僅僅意在舉例說明本發明的實踐而不是限制。本發明所引用的所有專利以及科學文獻的全文都包含在本文作為參考。
VI.實施例實施例1.在一線轉移性結腸直腸癌中將抗-VEGF抗體加入藥團伊立替康/氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸(IFL)進行多中心、III期、隨機化、主動控制的試驗(multicenter，Phase III，randomized，active-controlled trial)以評估將bevacizumab加入轉移性結腸直腸癌的標準一線化學療法的情況下，bevacizumab的有效性和安全性。該試驗收入900多名組織學確定的、之前沒有進行治療的、二維可檢測的轉移結腸直腸癌患者。
方法和材料抗-VEGF抗體bevacizumab抗-VEGF抗體「Bevacizumab (BV)」也已知為「rhuMAb VEGF」或「AvastinTM」，是重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，其根據Presta et al.(1997)Cancer Res.574593-4599製備。它包含突變的人IgG1框架區以及小鼠抗-hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗原結合性互補決定區，所述抗體阻斷人VEGF與其受體的結合。美國專利6,582,959；WO 98/45331。bevacizumab大約93％的胺基酸序列(包括大部分框架區)來自人IgG1，並且該序列的約7％來自鼠抗體A4.6.1。Bevacizumab的分子量約為149,000道爾頓並且是糖基化的。
多肽的特性以及糖基化位點可從胺基酸組成以及肽圖譜推定。所述分子的大小以及電荷特性和臨床所用批次(lot)的純度通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳非凝膠篩選(capillary electrophoresis non-gelsieving)，等電聚焦，以及離子交換和大小排阻層析證明。bevacizumab的活性通過結合酶聯免疫吸附測定或重組人VEGF的激酶受體實驗來定量。
Bevacizumab利用遺傳改造的中國倉鼠卵巢細胞系通過重組DNA技術製備。所述蛋白通過常規柱層析和過濾方法從細胞培養基純化。根據美國藥品和食品監督條例，檢測最終產物的質量，特性，安全性，純度，效力，強度以及賦形劑/化學組成。Bevacizumab的純度＞95％。Bevacizumab呈清至輕度乳白色，無菌液體，可用於胃腸外給藥。
患者選擇符合條件的患者患有組織學上證實的轉移性結腸直腸癌，以及二維可測定的疾病。其它包含標準包括至少18歲，美國東部腫瘤協作組EasternCooperative Oncology Group(ECOG)體力狀態(performance status)為0或1(Oken et al.(1982)Am.J.Clin.Oncol.5649-55)，預期壽命超過3個月，以及書面告知的同意。適當的血液、肝以及腎功能(包括不超過500mg蛋白每天的尿排除率)也是所需的。
排除標準包括以前對轉移疾病的化療或生物治療(在進入研究前輔助使用或使對放射敏感而使用氟代嘧啶(fluoropyrimidine)加或不加甲醯四氫葉酸或左旋咪唑(levamizole)12個月以上是允許的)，研究治療開始前14天內接受放療，研究治療開始前28天內的進行大手術，臨床明顯的心血管疾病，臨床可檢測的腹水，妊娠或泌乳，阿司匹林的規律使用(超過每天325mg)或其它非類固醇抗炎藥的規律使用，先前存在的出血因素或凝血病(coagulopathy)或需要全劑抗凝，以及已知的中樞神經系統轉移。
研究設計符合條件的患者接受治療，所述治療利用被涉及用於實現組間總體平衡的動態隨機化算法；隨機化根據研究中心、基線ECOG體力狀態(0 vs.1)，原發疾病位點(結腸vs.直腸)，以及轉移病灶數目(一個vs.一個以上)進行分層(stratify)。開始，患者以1∶1∶1的比例隨機分配來接受IFL加安慰劑，IFL加bevacizumab，或氟尿嘧啶和甲醯四氫葉酸加bevacizumab(表1)，每種治療持續直到疾病進展或不可接受的副作用出現或持續最長96周。
表1.一線治療方案*


*在bevacizumab加入伊立替康，氟尿嘧啶和甲醯四氫葉酸的方案的安全性得到證實後，利用氟尿嘧啶，甲醯四氫葉酸和bevacizumab的治療停止。313名患者隨機化之後進行證實。所有藥物經靜脈內給藥。
300名患者隨機化後，進行中期分析(interim analysis)，此時非盲性、獨立數據監測委員會來評價IFL加bevacizumab的安全性，所述評價基於所有可得的安全性信息，包括每組的死亡數，但缺乏與腫瘤反應相關的信息。如果數據監測委員會發現沒有由於將bevacizumab加入IFL導致的不適當的不利事件，停止將患者加入將接受氟尿嘧啶以及甲醯四氫葉酸加bevacizumab的組，其它患者以1∶1隨機分組以接受IFL加安慰劑或IFL加bevacizumab。然而，如果數據監測委員會的結論是IFL加bevacizumab的安全性狀況不能被接受，該治療停止，患者以1∶1隨機分組來接受氟尿嘧啶和甲醯四氫葉酸加bevacizumab的組合或IFL加安慰劑。
腫瘤反應和進展利用Response Evaluation Criteria in Solid Tumors.Therasse et al.(2000)J.Natl.Cancer Inst.92205-16確定。在疾病進展時間，所述治療分組公開並對患者提供二線治療。接受含bevacizumab的治療的組中的患者可選擇在該二線治療中繼續接受bevacizumab。在給予IFL加安慰劑的組中不允許交叉。接受含bevacizumab治療並且在96周的研究期末沒有進展性疾病的徵兆的患者可繼續在分開的延期研究中接受bevacizumab。接受bevacizumab的組中，具有證實的完全反應或不可接受的化療副反應的患者將停止化療並接受單獨的bevacizumab。
Bevacizumab(或安慰劑)與化療同時給藥。如果患者體重在研究過程中改變至少10％，Bevacizumab以及化療的劑量可重新計算。伊立替康和氟尿嘧啶(根據包裝插頁)′°的標準循環內和循環間劑量改變在具有治療相關不利事件的患者中是允許的。甲醯四氫葉酸和bevacizumab的劑量沒有改變。
在生存和隨後的治療的分析中，所有患者均被隨診直至死亡，失去隨診或研究終止。
評估在基線評估以後，腫瘤狀況在研究的前24周每6周評估一次，然後在治療餘下的時間內每12周評估一次。所有完全和部分反應(complete andpartial responses)需要在它們首次被注意後的至少4周得到證實。
安全性基於不利事件的報告、實驗室檢測結果，以及生命體徵測定來評估。不利事件根據Common Toxicity Criteria of the National Cancer Institute，version 2分類，其中1級表示輕微不利事件，2級為中度不利事件，3級為嚴重不利事件，4級為威脅生命的不利事件。預先規定的安全性衡量標準包括以下事件的發生率所有不利事件，所有嚴重不利事件，以及與bevacizumab相關的不利事件-高血壓，血栓形成，3級或4級的出血，以及蛋白尿-以及3級或4級的腹瀉，以及不同實驗值與生命體徵自基線的改變。
為監測IFL加安慰劑以及IFL加bevacizumab方案的安全性，監測研究過程中的死亡、嚴重副反應、3級或4級的腹瀉、自任何來源的3級或4級的出血，以及血栓形成的發生率，所述監測通過非盲性方式由數據安全性監測委員會進行，持續到募集完成或效力的中期分析時間(time of the interimanalysis of efficacy)，以先到的那個為準。
統計學分析主要結果檢測指標(primary outcome measure)是總體生存期；生存的測定不涉及隨後的治療。然而，組間沒有交叉。採用生存分析技術諸如Kaplan-Meier方法，對數-秩檢驗，以及Cox正比危害模型(Cox proportionalhazards model)。次要結果檢測指標(secondary autcome measure)是無進展生存期，目標反應率(objective response rate)(完全和部分反應)，反應時間以及生活質量。
對於在分析時存活的患者，生存時的數據在最後的接觸時間得以檢查。無進展生存期(progression-free survival)定義為在研究過程中，從隨機化到進展或死亡的時間，在研究中死亡定義為最後劑量的bevacizumab或化療之後30天之內出現的任何死亡。對於在最後分析時沒有疾病進展的患者，無進展生存的數據在腫瘤狀況的最後評估或如果在基線以後沒有進行其它評估的情況下於第0天接受審查。沒有適當隨診數據的患者被分類為沒有反應。
為檢測到與對照相比，給予IFL加bevacizumab的組中的死亡危險率為0.75，需要大約385例死亡。所有計算利用對數秩檢驗進行並涉及對效力的雙側P值，α值0.05，統計強度(statistical power)為80％，以及一次效力中期分析(interim analysis of efficacy)。
中期分析可以以非盲性方式進行。安全性的中期分析在將大約100名患者隨機分配到各組之後進行。安全性和效力的第二中期分析在出現193例死亡(所需事件一半的數目)之後進行。
效力分析根據意圖-治療(intention-to-treat)原則進行。安全性分析包括所有接受至少一個劑量的研究藥物的患者。
結果患者的特徵在約20個月的時間中，923名患者在美國、澳大利亞和紐西蘭的164個位置接受隨機化。在313名患者被隨機分配到三個組之一中(100名分配到IFL加安慰劑組，103名分配到IFL加bevacizumab組，110名分配到氟尿嘧啶，甲醯四氫葉酸，和bevacizumab)之後，停止向給予氟尿嘧啶，甲醯四氫葉酸和bevacizumab的組的分配(該組中的結果沒有報導)。該步驟是對安全性的首次正式中期分析之後，所述方案所需的，所述分析的結果是IFL加bevacizumab的方案具有可接受的安全性以及向該組的分配可以繼續。
總體生存的主要終點的意圖-治療分析在給予IFL加安慰劑的組中包括411名患者，在IFL加bevacizumab的組中包括402名患者。表2顯示所選的人口統計學以及基線特徵，其在組間很好地平衡。每個組中相似數目的患者以前經過結腸直腸癌的手術或接受放療或輔助化療。
治療治療的中值時程(median duration)在IFL加安慰劑的組中為27.6周，在給予IFL加bevacizumab的組中為40.4周。計劃的給予伊立替康劑量的百分比在兩組中類似(在給予IFL加安慰劑的組中為78％，在給予IFL加bevacizumab的組中為73％)。
在數據停止的當天，IFL加安慰劑組中的33名患者以及IFL加bevacizumab組中的71名患者仍然接受分配給他們的初始治療。可影響生存的二線療法諸如奧沙利鉑或轉移切除術的利用比率在兩個組之間很好地平衡。在兩個組中，大約50％的患者接受一些二線療法形式；所有患者的25％接受奧沙利鉑以及少於2％的患者接受轉移切除術。
表2.所選人口統計學以及基線特徵*特徵IFL加安慰劑 IFL加Bevacizumab性別(％)(N＝411) (N＝402)男性60 59女性40 41平均年齡(YR)59.2 59.5種族(％)白人80 79黑人11 12其它99中心位置(％)美國99 99澳大利亞或紐西蘭＜1 ＜1ECOG體力狀態(％)0 55 581 44 412 ＜1 ＜1中心類型(％)結腸81 77直腸19 23轉移位點數目(％)1 39 37＞1 61 63
以前的癌症治療(％)輔助化療 2824放療 1415轉移性疾病的中值持續時間(mo) 4 4*組間沒有明顯差異。IFL表示伊立替康，氟尿嘧啶，和甲醯四氫葉酸，ECOG表示美國東部腫瘤協作組。
效力給予IFL加bevacizumab的組的總體生存持續時間中值(median durationof everall duration)以及主要終點(primary endpoint)明顯長於IFL加安慰劑組(20.3月vs.15.6月)，其對應死亡風險率為0.66(P＜0.001)(表3和圖1)，或在bevacizumab組死亡風險降低34％。IFL加bevacizumab組的一年生存率為74.3％，IFL加安慰劑組中為63.4％(P＜0.001)。接受奧沙利鉑二線治療的患者亞組中，IFL加bevacizumab組的總體生存中值持續時間為25.1個月而IFL加安慰劑組的為22.2個月。
將bevacizumab加入IFL與無進展生存持續時間中值的增加相關(10.6月vs.6.2月；與IFL加安慰劑組相比，進展危險率0.54；P＜0.001)；反應率(44.8％vs.34.8％；P＝0.004)；反應持續時間中值(10.4月vs.7.1月；進展危險率，0.62；P＝0.001)(表3)。圖2顯示無進展生存的Kaplan-Meier估計值。治療效果在預先規定的亞組之間是一致的，包括根據以下因素定義的那些年齡，性別，種族，ECOG體力狀態，原發腫瘤位置，以前有或無的輔助治療，轉移性疾病持續時間，轉移病灶數目，自診斷結腸直腸癌起的年數，以前有或無放療，基線腫瘤負荷，血清白蛋白濃度，鹼性磷酸酶以及乳酸脫氫酶。
表3.效力分析*

*IFL表示伊立替康，氟尿嘧啶和甲醯四氫葉酸。
安全性表4表示所規定治療過程中所選3或4級的不利事件的發生率，而沒有對中值治療持續時間的調整(IFL加安慰劑組中為27.6周，IFL加bevacizumab組中為40.4周)。任何3或4級不利事件的發生率在接受IFL加bevacizumab的患者中比接受IFL加安慰劑的患者中高大約10個百分點，主要是由於3級高血壓(需要治療)的發生率增加，以及4級腹瀉和白細胞減少的發生率少量增加。然而，導致住院或研究治療停止或60天中任何原因導致的死亡率的不利事件的發生率沒有明顯變化。
表4.所選不利事件*

*沒有為伊立替康，氟尿嘧啶，和甲醯四氫葉酸(IFL)加安慰劑組與IFL加bevacizumab組的治療中值持續時間的差異(27.6周vs.40.4周)而校準數據。
**P＜0.01。僅僅接受至少一次研究-藥物治療的患者包含在內。
階段1和2的試驗鑑定了出血，血栓栓塞，蛋白尿以及高血壓作為可能的bevacizumab相關的副作用。然而，在本研究中，與IFL加安慰劑組相比，IFL加bevacizumab組中僅有高血壓的發病率明確增加。所有高血壓發作都可利用標準口服抗高血壓藥劑(例如鈣通道阻斷劑，血管緊張素轉化酶抑制劑以及利尿劑)控制。在bevacizumab組中，沒有與高血壓相關的bevacizumab療法中止、高血壓危象或死亡。
在兩組中，2級或3蛋白尿(沒有4級蛋白尿的發作或腎炎症候群)以及任何原因導致的3級或4級出血發生率是相似的，儘管所有3例4級出血都在IFL加bevacizumab組中。所有靜脈以及動脈血栓形成事件的發生率在IFL加bevacizumab組中為19.4％，在IFL加安慰劑中為16.2％(P＝0.26)。
胃腸穿孔出現在6例接受IFL加bevacizumab的患者中(1.5％)。一名患者直接死於該事件，而其它5名恢復(其中3名能夠重新開始治療而沒有隨後的併發症)。患有穿孔的6名患者中，3名被證實對IFL加bevacizumab有完全或部分反應。除外研究治療以外可能與胃腸穿孔相關的因素是在兩名患者中前兩個月當中的結腸手術以及一名患者中的消化性潰瘍疾病。
該階段III研究的結果直接支持抗血管生成藥可廣泛適用於癌症治療的結論。將bevacizumab這種抗-VEGF抗體加入IFL化療顯示有臨床意義以及統計學顯著的癌症患者中的改善，所述改善通過例如總體生存率，無進展生存，反應率以及反應持續時間來測定。bevacizumab導致的生存中值持續時間4.7月的延長與在結腸直腸癌治療的其它任何3階段試驗中觀察到的一樣多或更多。Goldberg et al.(2004)J.Clin.Oncol.2223-30。儘管該試驗過程中，奧沙利鉑二線療法的可用性(availability)有限，Bevacizumab治療的人群中20.3月的中值生存期還是出現了。
與單獨的IFL相比，IFL加bevacizumab的方案使得無進展生存時間從中值6.2月增加到10.6月，總體反應率從34.8％增加到44.8％，反應中值持續時間從7.1月增加到10.4月。這些改善在臨床上有意義。不能預測利用IFL加bevacizumab導致的反應率絕對增加10％與該數量級的存活的增長相關。該觀察提示，bevacizumab的主要機制是抑制腫瘤生長，而不是細胞減少。
該臨床益處伴隨治療副反應的相對適度的增加，其可輕易控制。在3級和4級不利效應的總體發生率中大約10％的絕對增加，主要由於需要治療的高血壓，腹瀉以及白細胞減少所致。將bevacizumab加入IFL沒有明顯增加任何原因所致的60天死亡率，住院以及治療的中止。
以前的階段1和2臨床實驗提示，利用單獨的bevacizumab或聯用化療導致血栓形成、出血、蛋白尿以及高血壓發病率增加。Kabbinavar et al.(2003)J.Clin.Oncol.2160-65；Yang et al.(2003)New Engl.J.Med.349427-34。除了高血壓以外，與IFL加安慰劑組中這些副反應的發生率相比，沒有發現所述副反應的增加，因此，顯示了隨機化的、安慰劑對照研究對安全性以及效力評估的重要性。一種新出現的潛在副反應是胃腸穿孔。該併發症並不常見並且有各種臨床表現。嚴重腸道併發症，具體是在患有中性粒細胞減少的患者中的嚴重腸道併發症，在IFL以及其它結腸直腸癌化療方案中有報導，並且在一個系列中，在超過2％用基於氟尿嘧啶的方案治療的患者中有瘻的報導。Saltz et al.(2000)New Engl.J.Med.343905-914；Rothenberg et al.(2001)J.Clin.Oncol.193801-7；Tebbutt et al.(2003)Gut 52568-73。在給予IFL加安慰劑的組中沒有所述事件出現，而在IFL加bevacizumab組中觀察到6個病例(1.5％)，有時在整體腫瘤反應的背景中。儘管這6名患者中有3名能夠重新開始治療而沒有隨後的併發症，一名患者死亡，兩名由於該併發症而永遠停止所述治療。
雖然以前的動物研究和早期階段的臨床試驗提示利用抗血管生成治療來治療癌症，本研究首次顯示利用抗血管生成抑制劑，諸如抗-VEGF抗體，確實能產生對癌症患者統計學顯著且臨床有意義的益處。
實施例2.在一線轉移結腸直腸癌中將Bevacizumab加入藥團5-FU/甲醯四氫葉酸該隨機的，階段II試驗比較了bevacizumab加5-氟尿嘧啶與甲醯四氫葉酸(5-FU/LV)相對於安慰劑加5-FU/LV在患者中作為一線治療的情況，所述患者被認為是一線伊立替康的非最佳候選者。
患者和方法患者合格條件組織學上被確認的、以前未被治療的、可測定轉移結腸直腸癌患者是合格的，條件是，如果研究人員判斷他們不是一線含伊立替康療法的最佳候選人並具有以下特徵中至少一個年齡超過65，ECOG PS 1或2，血清白蛋白等於或低於3.5g/dL，或之前對腹部或骨盆的放療。如果患者經過大手術(major surgical procedures)或開放性活檢，或在研究開始前28天之內經歷過明顯的外傷性損傷；研究過程中預期需要大手術；目前正使用或最近使用過治療性抗凝劑(除非導管開放所需)，溶栓治療或利用阿司匹林的長期每日治療(≥325mg/天)或非類固醇抗-炎藥物治療；具有嚴重的，非癒合傷口，潰瘍，或骨折；具有CNS轉移病史或證據；懷孕或哺乳；或在基線時具有蛋白尿或臨床明顯的腎功能障礙，則該患者被排除。所有患者提供其參與的書面同意書。
研究設計和治療相互作用性聲音反應系統用於隨機將合格的患者分配到2個治療組中1個中5-FU/LV加安慰劑或5-FU/LV加bevacizumab。利用動態隨機算法實現總體以及以下類別中每個組內的平衡研究中心，基線ECOG體力狀態(baseline ECOG performance status)(0vs.≥1)，原發疾病位點(結腸vs.直腸)，以及轉移病灶數目(1vs.＞1)。5-FU/LV療法，包括LV 500mg/m2、超過2小時以及5-FU 500mg/m2作為藥團(bolus)中途通過LV輸注(Roswell Parkregimen；Petrelli et al.(1989)J.Clin.Oncol.71419-1426)，在每個8周的循環中在前6周每周給藥一次。化療持續到研究結束(96周)或疾病進展。Bevacizumab 5mg/kg或安慰劑每2周給藥。Bevacizumab組中被證實完全反應或經歷不可接受的化療毒性的患者被允許停止5-FU/LV並持續接受單獨的bevacizumab作為一線療法。疾病進展時，患者對其接受的治療並非盲性，並可接受研究人員慎重決定的任何二線治療。只有被隨機分配到bevacizumab組的患者可接受bevacizumab作為二線治療的成分。結束該研究後，每4個月隨診患者任何隨後的治療以及存活情況，直到死亡，失隨診，或研究終止。
研究評估在基線以及每個8周的循環完成時，利用適宜的放射顯像技術(通常為螺旋CT掃描)評估患者的腫瘤狀態。腫瘤反應或進展通過研究人員以及獨立放射設備(independent radiology facility)(IRF)測定，利用實體瘤反應評估標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)。Therasse et al.(2000)。IRF評估在不了解治療方案或研究人員的評估的情況下進行。此外，患者完成結腸直腸癌患者中的結腸直腸癌症治療的功能評估(Functional Assessment ofCancer Therapy-Colorectal)(FACT-C)，4版，一種評估生活質量(quality oflife)(QOL)的可信方案，在基線以及每次治療循環以前直到疾病進展。Wardet al.(1999)Qual.LifeRes.8181-195。
安全性從不利事件，實驗室檢驗結果，以及生命體徵測定的報告評估。不利事件以及異常實驗室結果利用National Cancer Institute Common ToxicityCriteria(NCI-CTC)，Version 2分類。預先規定的安全性測定包括四項特別感興趣的不利事件(高血壓，蛋白尿，血栓形成以及出血)，其基於對bevacizumab的以前的臨床試驗的發現。
統計學分析主要結果指標(primary outcome measure)是總體生存期。次要結果指標包括無進展生存，目標反應率(完全和部分)，反應持續時間，以及FACT-C QOL評分的變化。生存期定義為從隨機化開始到死亡的時間。對於在分析時存活的患者，生存期在最後接觸那一天接受審查。無進展生存定義為從隨機化到疾病進展較早期或在研究中死亡的時間，所謂研究中的死亡定義為在最後劑量的研究藥物或化療的30天內任何原因所致的死亡。對於在分析時沒有疾病進展的存活患者，無進展生存在其最後的腫瘤評估中檢查，或如果沒有進行基線後評估(postbaseline assessment)，在第1天(研究治療的第一天)接受檢查。在目的反應分析中，沒有腫瘤評估的患者分類為無反應者。疾病進展和反應分析基於IRF評估。生活質量改變作為QOL達到惡化的時間(TDQ)來分析，定義為從隨機(randomization)化到結腸癌特異性FACT-C輔助(subscale)得分(colon-cancer specific FACT-C subscale score)(CCS)最早出現自基線降低≥3個點，疾病進展或研究中的死亡的時間。也測定TOI-C(CCS總和，身體和功能健康)以及總FACT-C的TDQ，其分別為相對於基線下降7和9個點。
為檢測到5-FU/LV/bevacizumab組相對於5-FU/LV/安慰劑組的死亡危險率為0.61，需要大約133例死亡。雙尾對數秩和檢驗的0.05顯著性水平80％置信區間以及兩次中期分析(interim analyses)在計算中推定。中期分析通過非盲性獨立Data Monitoring Committee(DMC)進行。安全性中期分析在44例死亡之後進行，並在89例死亡之後進行第二次安全和效力中期分析。所述中間效力分析由正式組順序停止規則(formal group sequential stoppingrule)基於O』Brien-Fleming耗費函數(spending function)來控制。Kaplan-Meier法用於估計每個治療組的中值生存，無進展生存，以及反應持續時間。Bevacizumab組相對於安慰劑組的危險率利用分層Cox成比例危險模型(stratified Cox proportional hazards model)測定。雙側分層對數秩和檢驗(stratified log rank test)用於比較這兩組。分層分析(Stratified analyses)包括基線ECOG體力狀態(base line ECOG performance status)，原發疾病位點，以及轉移位點數目。目的反應率通過Chi-squared檢驗來檢驗。作為解釋性分析，Cox正比危險模型用於估計危險因素對治療效果在生存與無進展生存期的影響。效力分析對於意欲-治療人群(intent-to-treat population)進行，該人群定義為所有被隨機化的患者。安全性分析包括所有接受至少一劑研究藥物的患者。
結果患者特徵在23月中，209名患者在美國和澳大利亞/紐西蘭的60個位置隨機化。為對主要終點(primary endpoint)(總體生存)的意圖-治療分析，在5-FU/LV/安慰劑組有105名患者，在5-FU/LV/bevacizumab組有104名患者。所選人口統計學以及基線特徵類似於實施例1中所述，並在治療組間合理平衡。基線低血清白蛋白(≤3.5g/dL)在bevacizumab組中比在安慰劑組中少見。
治療治療的中值持續時間在5-FU/LV/安慰劑組為23周，在5-FU/LV/bevacizumab組為31周，在治療過程中5-FU劑量強度(計劃5-FU劑量與實際接受量的百分比)在兩組中相似(92％vs.84％)。至截止日(the dateof date cut-off)，5-FU/LV/安慰劑組中的1名患者以及5-FU/LV/bevacizumab組中的7名患者保持所給予的初始治療。隨後的治療(其影響生存)用於兩組中大約50％的患者，但5-FU/LV/安慰劑組中更多患者用活性劑伊立替康和奧沙利鉑。
效力總體生存，主要終點，在5-FU/LV/bevacizumab組(中值，16.6月)中長於5-FU/LV/安慰劑組(中值，12.9月)，表明顯著性的趨勢。死亡危險率估計為0.79(95％CI，0.56至1.10；P＝0.16；表5和圖4)。將bevacizumab加入5-FU/LV與中值無進展生存(9.2vs.5.5月；危險率＝0.50；95％CI，0.34至0.73；P＝0.0002，表5和圖4)，反應率(26.0％vs.15.2％，P＝0.055)，和反應期中值(9.2月vs.6.8月；危險率＝0.42；95％CI，0.15至1.17；P＝0.088)的增加相關。對於對治療的總體生存效果的進一步分析通過基線特徵顯示具有低基線血清白蛋白(≤3.5g/dL)的患者顯示產生明顯的生存益處(危險率＝0.46；95％CI，0.29至0.74；P＝0.001)。
表5.效力分析總結

5-FU/LV＝5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸Bevacizumab治療對生活質量沒有有害影響，TDQ結果提示可能的有益效果。CCS得分測定的中值TDQ在5-FU/LV/安慰劑組中為3.0月，在5-FU/LV/bevacizumab組中為3.1月(危險率＝0.79，P＝0.188)。安慰劑治療和bevacizumab治療的患者的中值TDQ如第二(secondary)TDQ所測定的為2.3和3.2個月(TOI-C；危險率＝0.71，P＝0.048)以及2.6和3.6個月(總FACT-C；危險率＝0.66，P＝0.016)。
安全性共204名接受至少一種研究藥物劑量的患者(104名患者5-FU/LV/安慰劑和100名患者5-FU/LV/bevacizumab)包含安全性人群。觀察到接受bevacizumab的患者的總體3級和4級毒性的16％增加(71％相對於87％)。導致死亡或研究中止的不利事件在兩組中相似，所述不利事件已知與5-FU/LV相關(具體地，腹瀉和白細胞減少)。兩名患者，都在5-FU/LV/bevacizumab組，經歷的腸穿孔事件。這些事件在治療110天以及338天出現，均被認為與手術探查的結腸憩室相關。一名患者死於該併發症。以前的臨床試驗提示出血，血栓性拴塞，蛋白尿，以及高血壓作為可能的bevacizumab相關的毒性；然而，在該研究中，在靜脈血栓形成，大於或等於3級的出血，或臨床顯著的(大於或等於3級)的蛋白尿沒有增加。動脈血栓形成事件(心肌梗塞，卒中，或外周動脈血栓形成事件)在5-FU/LV/bevacizumab組中出現在10名患者中，而在5-FU/LV/安慰劑組中出現在5名患者中。
5-FU/LV/安慰劑組的60天所有原因導致的死亡率比5-FU/LV/bevacizumab組高(13.5％vs.5.0％)。兩組中由於疾病進展導致的死亡在第一個60天之內是相似的(5.8％vs.4.0％)。在5-FU/LV/安慰劑組，第一個60天內不是由於疾病進展導致的死亡是由於以下原因心力衰竭(1)，膿毒症(3)，腹瀉(2)，呼吸衰竭(1)，以及肺栓塞(1)。在5-FU/LV/bevacizumab組，不歸因於疾病進展的單個早期死亡歸因於心肌梗塞。
該臨床研究的結果進一步證實，人源化抗VEGF單克隆抗體bevacizumab，在加入轉移性結腸直腸癌的一線化療時提供重要的臨床益處。當於單獨的5-FU/LV比較時，加入bevacizumab延長中值生存期3.7個月，延長無進展生存3.7個月，延長反應持續時間2.4個月，增加反應率11％。
這些結果應當在研究人群的背景下來看。具體選出的是對一線含伊立替康療法反應不良的候選患者，其反應不良可能是低獲益或高治療相關毒性可能性的結果。對關鍵性(pivotal)伊立替康試驗的仔細分析顯示，該試劑的臨床益處限於這樣的患者，其具有正常ECOG體力狀態(PS＝0).21，22。高齡，以前接受過骨盆放療，體力狀態受損，以及低血清白蛋白均被報導增加伊立替康相關毒性。23-27名具有這些特徵的患者需要其它治療選擇。以前進行了對較小的隨機化II期試驗的回顧性子集分析，在CRC中評估bevacizumab和5-FU/LV，並發現bevacizumab對具有基線PS 1或2(中值生存，6.3個月vs.15.2個月)的患者亞組，年齡≥65的亞組(11.2個月vs.17.7個月)，以及血清白蛋白＜3.5的亞組(8.1個月對14.1個月)提供了實質上的治療效果。這些結果鼓勵我們設計目前的試驗，具體包括預後不良研究人群以及利用所述試驗來檢測對生存的顯著治療效果。我們非常成功地錄入了與同時進行的關鍵性IFL/安慰劑相對於IFL/bevacizumab試驗的人群不同的人群。與該關鍵性試驗相比，目前的試驗中的患者具有更高的中值年齡(72vs.61歲)並且基本上更多的患者具有＞0的體力狀態(72％vs.43％)和≤3.5mg/dL的白蛋白(46％vs.33％)。
儘管是這樣的高危險研究人群，卻顯示對5-FU/LV/bevacizumab方案的很好的耐受。所述bevacizumab相關的不利事件3級高血壓在5-FU/LV/bevacizumab組佔16％，在5-FU/LV/安慰劑組中佔3％。沒有出現4級高血壓。任何級的蛋白尿在5-FU/LV/bevacizumab組38％相對於5-FU/LV/安慰劑組的19％；然而，bevacizumab組中僅有一名患者出現3級蛋白尿，而沒有4級蛋白尿的病例。在bevacizumab治療的患者中，沒有3和4級出血或靜脈血栓事件增加。動脈血栓事件發病率不平衡10％見於5-FU/LV/bevacizumab組，而4.8％見於5-FU-/LV安慰劑組。類似的不平衡見於關鍵性(pivotal)bevacizumab試驗中(1.0％見於IFL/安慰劑組，3.3％見於IFL/bevacizumab組)。本研究中所包含人群的年齡越大，導致該不利事件總體發生率越高，然而兩項研究中的不平衡值得注意。需要大的、觀察性安全試驗進一步確定這些以及與bevacizumab治療相關的其它不常出現的不利事件的發生率以及潛在危險因素。
總之，這些數據證實，bevacizumab與藥團5-FU/LV聯用為患有以前未經治療的轉移性結腸直腸癌的患者提供了實質性臨床益處，所述患者是含伊立替康療法的不佳候選者。與關鍵性試驗(pivotal trial)結果相結合，這些數據加強了基於bevacizumab的，含5-FU/LV-療法應當被認為是轉移性結腸直腸癌初始治療的標準選擇的證據。
權利要求
1.治療人患者中的癌症的方法，包括將有效量的抗-VEGF抗體以及抗腫瘤組合物給予患者，所述抗腫瘤組合物包含至少一種化療劑。
2.權利要求1的方法，其中所述癌症選自乳腺癌，結腸直腸癌，直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金淋巴瘤(NHL)，腎細胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波奇肉瘤，類癌樣癌，頭和頸部癌症，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤以及多發性骨髓瘤組成的組。
3.權利要求1的方法，其中所述癌症是轉移的。
4.權利要求1的方法，其中所述患者以前未接受治療。
5.權利要求1的方法，其中所述化療劑選自以下物質組成的組烷化劑，抗代謝物，葉酸類似物，嘧啶類似物，嘌呤類似物以及相關抑制劑，長春花鹼類，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬醯胺酶，拓撲異構酶抑制劑，幹擾素，鉑配位複合物，大黃素取代的脲，甲基肼衍生物，腎上腺皮質抑制劑，腎上腺皮質類固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，以及促性腺激素-釋放激素類似物。
6.權利要求5的方法，其中所述化療劑選自以下物質組成的組；5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲醯四氫葉酸，伊立替康，奧沙利鉑，卡培他濱，紫杉醇和多西紫杉醇。
7.權利要求1的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含至少兩種化療劑的組合。
8.權利要求7的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU和甲醯四氫葉酸.
9.權利要求7的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU，甲醯四氫葉酸和伊立替康。
10.權利要求1的方法，其中一旦完成利用抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的治療，所述患者接受利用至少一種化療劑的進一步化療。
11.權利要求10的方法，其中用於進一步化療的化療劑選自5-FU，甲醯四氫葉酸，伊立替康，奧沙利鉑，卡培他濱，紫杉醇和多西紫杉醇組成的組。
12.權利要求11的方法，其中所述化療劑是奧沙利鉑。
13.權利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體與單克隆抗-VEGF抗體A4.6.1結合同一表位，所述A4.6.1由雜交瘤ATCC HB 10709產生。
14.權利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人抗體。
15.權利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化抗體。
16.權利要求15的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化A4.6.1抗體或其片段。
17.權利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體經靜脈輸注給藥。
18.權利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗體以大約5mg/kg每2-3周給藥患者。
19.權利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效延長人類患者的生存期。
20.權利要求19的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述人類患者的生存期增加至少約2個月。
21.權利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效延長人類患者的無進展生存期。
22.權利要求21的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述患者的無進展生存期增加至少約2個月。
23.權利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效提高人類患者組中的反應率。
24.權利要求23的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述人類患者組中的反應率明顯增加，其Chi-square p-值小於0.005。
25.權利要求1的方法，由此所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物的聯合給藥有效延長所述人類患者的反應時間。
26.權利要求25的方法，其中與單用所述抗腫瘤組合物治療的患者相比，所述患者的反應時間增加至少約2個月。
27.治療易患或診斷為患有結腸直腸癌的人類患者的方法，包括給藥所述患者治療有效量的抗-VEGF抗體。
28.權利要求27的方法，其中所述結腸直腸癌是轉移癌。
29.權利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體與單克隆抗-VEGF抗體A4.6.1結合同一表位，所述A4.6.1由雜交瘤ATCC HB 10709產生。
30.權利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人抗體。
31.權利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化抗體。
32.權利要求31的方法，其中所述抗-VEGF抗體是人源化A4.6.1抗體或其片段。
33.權利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體經靜脈輸注給藥。
34.權利要求27的方法，其中所述抗-VEGF抗體以大約5mg/kg每2-3周給藥患者。
35.權利要求27的方法，還包括給藥所述患者一或多種化療劑。
36.權利要求35的方法，其中所述化療劑選自以下物質組成的組烷化劑，抗代謝物，葉酸類似物，嘧啶類似物，嘌呤類似物以及相關抑制劑，長春花鹼類，epipodopyyllotoxins，抗生素，L-天冬醯胺酶，拓撲異構酶抑制劑，幹擾素，鉑配位複合體，大黃素取代的脲，甲基肼衍生物，腎上腺皮質抑制劑，腎上腺皮質類固醇，孕激素，雌激素，抗雌激素，雄激素，抗雄激素，和促性腺激素-釋放激素類似物.
37.權利要求35的方法，其中所述化療劑選自以下物質組成的組5-氟尿嘧啶，甲醯四氫葉酸，伊立替康，奧沙利鉑，卡培他濱，紫杉醇和多西紫杉醇。
38.治療患有轉移性結腸直腸癌的人類患者或人類患者的組的方法，包括給藥所述患者有效量的抗-VEGF抗體組合物和抗腫瘤組合物，其中所述抗腫瘤組合物包含基於氟尿嘧啶的化療劑組合，由此聯合給藥所述抗-VEGF抗體和所述抗腫瘤組合物導致被治療患者中統計學顯著性以及臨床有意義的改善，所述改善通過存活時間，無進展存活，反應率以及反應時間測定。
39.權利要求38的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU，甲醯四氫葉酸和伊立替康。
40.權利要求39的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含具有500mg/m25-FU，20mg/m2甲醯四氫葉酸和125mg/m2伊立替康的方案，並以每周給藥持續4周然後停止給藥2周的為期6周的反覆性循環來給藥患者，並且其中所述抗-VEGF抗體以5mg/kg每隔一周給藥患者。
41.權利要求38的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU和甲醯四氫葉酸。
42.權利要求41的方法，其中5-FU和甲醯四氫葉酸以為期8周的反覆循環、每個循環500mg/m2給藥患者，所述循環包括每周給藥持續4周然後停止給藥2周，並且其中所述抗-VEGF抗體以5mg/kg每隔一周給藥患者。
43.權利要求41的方法，其用於被認為不是一線伊立替康治療的最佳候選患者的人類患者。
44.權利要求38的方法，其中所述抗腫瘤組合物包含5-FU，甲醯四氫葉酸和奧沙利鉑。
45.製品，其包含容器，所述容器內包含含有抗-VEGF抗體的組合物以及包裝插頁，所述包裝插頁指示該組合物的使用者將所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物給藥癌症患者。
46.治療人類患者中的癌症的試劑盒，其包含含有抗-VEGF抗體組合物的藥物包，以及利用所述抗-VEGF抗體組合物和包含至少一種化療劑的抗腫瘤組合物治療患者中的癌症的說明。
全文摘要
本發明總體涉及利用抗－VEGF抗體治療疾病以及病理狀況。更具體地，本發明涉及治療利用抗－VEGF抗體易患或診斷為患有癌症的患者，優選與一或多種其它抗腫瘤治療劑聯用。
文檔編號A61K31/7072GK1829741SQ200480021966
公開日2006年9月6日 申請日期2004年5月28日 優先權日2003年5月30日
發明者格溫德林·法伊夫, 埃裡克·霍姆格倫, 羅伯特·D·馬斯, 威廉·諾沃特尼 申請人:健泰科生物技術公司