抗菌肽葛佬素的基因構建、製備方法及用途的製作方法
2023-05-24 19:19:16 2
專利名稱：抗菌肽葛佬素的基因構建、製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及葛佬素的cDNA序列、通過葛佬素的cDNA序列製備葛佬素cDNA的方法，通過葛佬素的cDNA序列製備重組抗菌肽葛佬素的方法，屬基因工程領域。
革蘭氏陰性(G-)桿菌膿毒症和休克是導致臨床病人死亡的主要原因之一，尋找有效的治療措施一直是臨床醫學關注的焦點。
存在於G-桿菌外膜上的內毒素(Lipopolysaccharide，LPS)目前認為是G-桿菌引起膿毒症的主要原因。近年的研究表明LPS在全身性炎症反應症候群(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和代償性抗炎症症候群(Compensatory anti-inflammatory responsesyndrome，CARS)中起著重要作用，LPS在體內可直接刺激機體單核-吞噬細胞系統分泌包括TNF-α、I1-1和IL-6等細胞因子，這些因子的過度釋放導致機體多器官衰竭甚至死亡。
葛佬素(Gloverin)是存在於蠶蛹中的一種分子量為13.8KD的帶正電荷的陽性蛋白質，它含有130個胺基酸，具有殺滅G-桿菌及中和內毒素的作用。其最大的特點為其具有高度的穩定性，在100℃下10分鐘及強酸強鹼的嚴酷情況下仍可保持活性，克服了蛋白類藥物不穩定和不易保存的缺點。
針對葛佬素的報告僅有一篇，其重點是從蠶蛹中直接分離純化葛佬素的方法以及對其進行生物活性的初步研究，尚未見到有關葛佬素cDNA序列的研究報告。
葛佬素具有殺菌及中和內毒素作用，但從蠶蛹中直接分離純化葛佬素的數量非常有限，遠遠不能滿足臨床和實驗室的要求，因此獲取能夠滿足科研及臨床應用的大量的葛佬素必須依賴現代基因工程的方法獲得---即製備重組的葛佬素。而獲得重組葛佬素的基礎是必須知道葛佬素的cDNA序列，但由於葛佬素cDNA的序列目前尚未見報告。因此獲得葛佬素cDNA至關重要。
本發明的目的即為公開葛佬素的cDNA。
本發明的另一目的在於根據葛佬素cDNA序列，採用化學合成法及聚合酶鏈式反應合成得到葛佬素的cDNA，為採用基因工程的方法製備重組的葛佬素奠定基礎。
本發明的再一目的在於採用基因工程的方法製備具有生物學活性的抗菌肽葛佬素，用於可殺滅G-桿菌及中和內毒素。
為了實現上述目的，本發明採用的技術方案為對同種已知蛋白質Attacin A cDNA中胺基酸密碼子的出現頻度進行分析，採用出現頻度高的密碼子帶入葛佬素蛋白質序列中進行葛佬素的cDNA序列設計，採用化學合成法及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行葛佬素的cDNA的合成構建；另外，本發明利用葛佬素的cDNA，採用基因工程的方法製備抗菌肽葛佬素，並測定了所得抗菌肽葛佬素的活性。
Attacin A為來自蠶蛹的抗菌抗內毒素的蛋白質，其cDNA和葛佬素蛋白質序列已在文獻中公開發表，見Kang，D.，Lundstrom，A.andSteiner，H.Trichoplusia ni attacin A，a differentially displayedinsect gene coding for an antibacterial protein.Gene 1996，174(2)，245-249和Axen，A.，Carlsson，A.，Engstrom，A.and Bennich，H.Gloverin，an antibacterial protein from the immune hemolymph ofHyalophora pupae.Eur.J.Biochem.1997；247(2)，614-619。
獲得蛋白質cDNA的方法有兩種一是採用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)從組織中擴增獲得，該方法的優點在於適合序列較長的蛋白質和序列未知的蛋白質，缺點為實驗過程複雜，實驗要求高，花費大；二是採用化學合成法根據已知蛋白質的胺基酸序列合成得到，該方法的優勢在於實驗簡單、快速，實驗要求低，花費少，適用於序列短的、胺基酸序列已知的蛋白質的cDNA構建。
獲取葛佬素的cDNA的方法有兩種，可以採用RT-PCR法從組織中擴增獲得葛佬素的cDNA，也可以採用化學合成的方法合成寡核苷酸引物後採用PCR重疊延伸法擴增獲取目的基因。RT-PCR法包括在內毒素刺激蠶蛹後，抽提蠶蛹細胞總RNA；以總RNA為模板，採用Oligo dT和隨機引物進行RT-PCR獲取cDNA；以cDNA為模板，採用1對葛佬素引物，採用PCR方法獲取葛佬素全長cDNA，進行序列測定、鑑定。採用化學合成的方法合成，即以單核苷酸為原料，由自動化的儀器自行完成寡核苷酸引物的合成，採用PCR重疊延伸法擴增獲取目的基因。
本發明中所構建的葛佬素的cDNA序列即採用化學合成法合成寡核苷酸引物，採用PCR重疊延伸法擴增獲取目的基因。
採用DNA序列測序的方法，可以鑑定所得到的DNA即為設計的序列。
具體地說，由於Attacin A是來自蠶蛹的抗菌蛋白質，其cDNA序列已知且與葛佬素的cDNA為同種族的已知蛋白質。本發明中，首先對同種族已知蛋白質Attacin A cDNA序列中胺基酸各種密碼子的出現頻度進行分析，結果發現Attacin A cDNA中出現頻度高的密碼子，採用出現頻度高的密碼子，如苯丙氨酸Phe採用的密碼子為TTC，亮氨酸採用的密碼子為TTG進行葛佬素的cDNA序列構建，通過6條寡核苷酸引物，採用PCR重疊延伸法得到目的基因，即葛佬素的cDNA。將PCR產物即目的基因與克隆載體pUC T載體相連，經測序鑑定表明該序列與設計的完全一致；將目的基因，即葛佬素的cDNA與組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列連接後，克隆入真核細胞載體，將此真核細胞載體轉染真核細胞，真核細胞表達葛佬素，得到本發明的葛佬素並測定了其活性。
本發明的重組抗菌肽葛佬素可以用於治療內毒素血症、膿毒症等疾病。
本發明的優點在於採用對同種族已知蛋白質cDNA序列中胺基酸各種密碼子的出現頻度進行分析，即可對僅知道蛋白質胺基酸序列的葛佬素的cDNA序列進行構建，不需進行繁瑣的RT-PCR，用PCR重疊延伸法製備葛佬素的cDNA，進一步通過基因重組的方法製備抗菌肽葛佬素，其過程簡單，花費少，時間短，效率高。
下面結合附圖和具體實施例詳細描述本發明。
圖1.葛佬素的蛋白質序列；圖2.Attacin A cDNA序列；圖3. 6條寡核苷酸引物；圖4.設計併合成的葛佬素基因；圖5.本發明合成的葛佬素的cDNA的儀器測序結果；圖6.是圖5的葛佬素的cDNA的序列表示；圖7.葛佬素的cDNA與克隆載體pUC T載體相連，提取質粒進行Hind III和Aat II雙酶切鑑定；圖8.是產物3載體片段的電泳圖；以下是本發明的具體實施例，所述的實施例是用於描述辦發明，而不是限制本發明。
實施例1.對同種族已知蛋白質Attacin A cDNA序列中胺基酸各種密碼子，附圖2的出現頻度進行分析，結果見表1；附圖1為葛佬素的蛋白質序列。表1.編碼Attacin A胺基酸密碼子的出現頻度胺基酸 密碼子出現頻度Phe(苯丙氨酸) TTT＝8；TTC＝9；Leu(亮氨酸)TTA＝3；TTG＝9；CTT＝4；CTC＝3；CTA＝1；CTG＝3Ile(異亮氨酸) ATT＝1；ATC＝2；ATA＝0Met(蛋氨酸)ATG＝8；Val(纈氨酸)GTT＝5；GTC＝9；GTA＝8；GTG＝3Ser(絲氨酸)AGT＝7Pro(脯氨酸)CCT＝5；CCC＝4；CCA＝4；CCG＝0Thr(蘇氨酸)ACT＝3；ACC＝5；ACA＝2；ACG＝1Ala(丙氨酸)GCT＝6；GCC＝5；GCA＝4；GCG＝2Tyr(酪氨酸)TAT＝3；TAC＝4His(組氨酸)CAT＝1；CAC＝2Gln(穀氨醯胺) CAA＝4；CAG＝2Asn(天冬醯胺) AAT＝12；AAC＝0Lys(賴氨酸)AAA＝5；AAG＝9Asp(天冬氨酸) GAT＝5；GAC＝10Glu(穀氨酸)GAA＝8；GAG＝3Cys(半胱氨酸) TGT＝0；TGC＝0Trp(色氨酸)TGG＝2Arg(精氨酸)CGT＝4；CGC＝2；CGA＝0；CGG＝1；AGA＝1；AGG＝3Gly(甘氨酸)GGT＝7；GGC＝10；GGA＝8；GGG＝1Stop(終止密碼子) TAG＝12.採用出現頻度高的密碼子，表2，如苯丙氨酸Phe採用TTC進行葛佬素的cDNA序列構建，得到附圖4所示的葛佬素的cDNA；表2.構建葛佬素cDNA使用的密碼子胺基酸 使用的密碼子Phe(苯丙氨酸)TTCLeu(亮氨酸) TTGIle(異亮氨酸)ATCMet(蛋氨酸) ATGVal(纈氨酸) AGTSer(絲氨酸) TCTPro脯氨酸CCTThr(蘇氨酸) ACCAla(丙氨酸) GCTTyr(酪氨酸) TATHis(組氨酸) CACGln(穀氨醯胺)CAAAsn(天冬醯胺)AATLys(賴氨酸) AAGAsp(天冬氨酸)GACGlu(穀氨酸) GAATrp(色氨酸) TGGArg(精氨酸) CGTGly(甘氨酸) GGAStop(終止密碼子) TAG3.根據附圖3所示的6條寡核苷酸引物，採用PCR重疊延伸法合成得到附圖4所示的目的基因，即葛佬素的cDNA；具體方法是(1)在PCR反應體系加入寡核苷酸引物2和4、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環後，加入寡核苷酸引物1和5，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環，純化PCR反應產物(PCR產物1)；(2)在PCR反應體系加入寡核苷酸引物3和5、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，4個循環後，加入寡核苷酸引物2和6，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30個循環後，純化PCR反應產物(PCR產物2)；(3)在PCR反應體系加入dNTP、pfu Taq酶、前述PCR產物1和PCR產物2，進行94℃PCR反應預變性4分鐘後，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環後；加入寡核苷酸引物1和6，進行PCR反應預變性4分鐘後，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環後，純化PCR反應產物。
4.將PCR產物即目的基因與克隆載體pUC T載體相連，提取質粒進行Hind III和Aat II雙酶切鑑定完全正確；見附圖7，其中APCR標記物，從下到上237bp，377bp，515bp，697bp，994bp，1543bp；B，C，D，E，F不同克隆質粒/Hind III+Aat II雙酶切。
5.重組抗菌肽葛佬素的製備將目的基因與組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列連接後，克隆入真核細胞載體；具體步驟如下第一步、設計2條引物，5』端引物含有限制性內切酶Hind III位點，3』端引物含有限制性內切酶Aat II位點。5』端引物5』CCCAAGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGG 3。
3』端引物5』TCTCGACGTCTCTGGCTCCTCTTCTG 3』。以含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的質粒pMM5065為模板，採用PCR方法擴增組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGT CTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGA GACGTCGAGA，純化PCR產物，採用Hind III和Aat II雙酶切PCR產物，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後再次純化，得到產物1，表示如下5』端AGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAA ATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGAGACGT 3』端；第二步、對含有葛佬素基因的克隆載體pUC T載體進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後，純化約400bp的DNA片段得到產物25』端CACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGA GGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAG 3』端)；第三步、對含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的真核表達載體，質粒pCDS I進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後，純化約8000bp的DNA片段，得到產物3，為載體片段，見附圖8所示的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中雙酶切結果圖中A為λDNA/HindIII+EcoRI分子量標準，B為pCDS I/HindIII+Sal I；第四步、將產物1與產物2在T4DNA連接酶的作用下16℃連接4小時後，加入產物3再連接12小時；第五步、採用CaCl2法，將第四步的連接產物轉化大腸桿菌JM109，對在100μg/ml氨苄青黴素平板上生長的克隆，提取質粒進行Hind III和Sal I雙酶切鑑定，對酶切產物含有530bp片段的質粒再次進行測序鑑定，經測序鑑定表明該序列與所構建的完全一致；大量抽取該質粒，得到抗菌肽葛佬素。
6.採用脂質體轉染的方法轉染COS-7細胞，在轉染後72小時收集細胞上清測定其殺滅大腸桿菌J5菌及中和內毒素的能力。結果表明COS-7細胞轉染上清具有殺滅大腸桿菌J5菌及中和內毒素的能力，而質粒空載體轉染COS-7細胞轉染上清則不具有殺滅大腸桿菌J5菌及中和內毒素的能力。
本發明的重組抗菌肽葛佬素可以用於治療內毒素血症、G-桿菌感染以及膿毒症、肝硬化等疾病。也可以與其他的藥物復配成組合物用於治療內毒素血症、G-桿菌感染以及膿毒症、肝硬化等疾病。
本發明的重組抗菌肽葛佬素可以輔以藥用上可以接受的任何載體或稀釋劑用於治療內毒素血症、G-桿菌感染以及膿毒症、肝硬化等疾病。
本發明的重組抗菌肽葛佬素或其組合物可以製成片劑、膠囊、注射液或其他的製劑形式。
本發明的重組抗菌肽葛佬素或其組合物可以以口服、口含、噴霧、靜脈或肌肉注射的方式給藥。
權利要求
1.抗菌肽葛佬素的cDNA，序列結構為5』-GACGTCACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGAGGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAGTCGAC-3』。
2.權利要求1所述抗菌肽葛佬素的cDNA的合成方法，包括a.對同種族已知蛋白質Attacin A cDNA序列中胺基酸各種密碼子的出現頻度進行分析，採用出現頻度高的密碼子進行葛佬素的cDNA序列構建，所用密碼子為苯丙氨酸Phe採用TTC，亮氨酸Leu採用TTG，異亮氨酸Ile採用ATC，蛋氨酸Met採用ATG，纈氨酸Val採用AGT，絲氨酸Ser採用TCT，脯氨酸Pro採用CCT，蘇氨酸Thr採用ACC，丙氨酸Ala採用GCT，酪氨酸Tyr採用TAT，組氨酸His採用CAC，穀氨醯胺Gln採用CAA，天冬醯胺Asn採用AAT，賴氨酸Lys採用AAG，天冬氨酸Asp採用GAC，穀氨酸Glu採用GAA，色氨酸Trp採用TGG，精氨酸Arg採用CGT，甘氨酸Gly採用GGA，終止密碼子採用TAG；b.根據如下的6條寡核苷酸引物，採用化學合成及PCR重疊延伸法合成得到葛佬素的cDNA；1).5』-GACGTCACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCT-3』2).5』-GAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAAC-3』3).5』-AAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAG-3』4).5』-GTACCCTTGACCTTCGAACTTACCTCAGTCGTGTTGAAGAATTGTTGCTTGAATCCAGCCTTACCGAACAAACCGTC-3』5).5』-ACCAGAAGCAGACAAGTTTGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGGTCTACCACCGATTTGCTTAGAGATGTCCAAAGCAGCGTTAGC-3』6).5』-GTCGACTCAGAAGTCGTGTTGGAATTGAGCGTGAACACCAACGTCTGGCTTACCTCTACCCATAGTAGACAAAGAACCACC-3』。
3.根據權利要求2所述抗菌肽葛佬素的cDNA的合成方法，其中PCR重疊延伸法包括(1)在PCR反應體系加入寡核苷酸引物2和4、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環後，加入寡核苷酸引物1和5，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環，純化PCR反應產物(PCR產物1)；(2)在PCR反應體系加入寡核苷酸引物3和5、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，4個循環後，加入寡核苷酸引物2和6，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30個循環後，純化PCR反應產物(PCR產物2)；(3)在PCR反應體系加入dNTP、pfu Taq酶、前述PCR產物1和PCR產物2，進行94℃PCR反應預變性4分鐘後，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環後；加入寡核苷酸引物1和6，進行PCR反應預變性4分鐘後，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環後，純化PCR反應產物。
4.抗菌肽葛佬素的基因，表達如下1 TGATTACGCC AGCTTGCATG CCTGCAGGTC GACTCTAGAC TCGAGGGATC 5051 CAGATCTCCA GTCTTGACGT CACTTGGGAC AAGAACATCG GTAACGGTAA 100101 GGTTTTCGGT ACTTTGGGTC AAAACGACGA CGGTTTGTTC GGTAAGGCTG 150151 GTTTCAAGCA ACAATTCTTC AACGACGACA GAGGTAAGTT CGAAGGTCAA 200201 GCCTACGGTA CTAGAGTTTT GGGTCCAGCT GGTGGTACTA CTAACTTCGG 250251 TGGTAGATTG GACTGGTCTG ACAAGAACGC TAACGCTGCT TTGGACATCT 300301 CTAAGCAAAT CGGTGGTAGA CCAAACTTGT CTGCTTCTGG TGCTGGTGTT 350351 TGGGACTTCG ACAAGAACAC TAGATTGTCT GCTGGTGGTT CTTTGTCTAC 400401 TATGGGTAGA GGTAAGCCAG ACGTTGGTGT TCACGCTCAA TTCCAACACG 450451 ACTTCTGAGT CGACAGACCT GGTCTGCAGG CGGCCGCCCA TGGGATATCA 500501 TCGATCATAT GTCGCCCTAT AGTGAGTCGT ATTACGGTAC CGAGCTCGAA 550551 TTCACTGGCC GTCGTTTTAC AACGTCCGTG ACTGGGAAAA CCCTGGCGTT 600601 ACCCAACTTA ATCNCCTTGC ANNACATCCN NCTTTCGCCA GCTGGCGTAA 650651 TAACCAAAAA GCCCGNACCG ATCNCCTTTC CAACAGTTGC NCAGNCTGAA 700701 TGGCGAATGG CGCCTGATGC CGGTATTTTT TTCTTACNCA TCTGNGCGGT 750751 ATTTCACACC GGATATGGNG CACTNTTAAN CAATTTGGTN TTGATGCCCG 800801 ATAGTTAAGC CAGNCCCGAA NCCCGNCAAA ACCNGTTGAC CCCCCTTGAC 850851 GGGCTTGTTT GTTCCGCATT CNCTTANCAA ACAANTTNNG ACCTTTCGGG 900901 ACTTNTT950。
5.權利要求4所述重組抗菌肽葛佬素的製備方法，包括將目的基因葛佬素cDNA與組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列連接後，克隆入真核細胞載體；具體步驟如下1)通過2條引物，5』端引物含有限制性內切酶Hind III位點，3』端引物含有限制性內切酶Aat II位點；5』端引物5』CCCAAGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGG 3；3』端引物5』TCTCGACGTCTCTGGCTCCTCTTCTG 3』；以含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的質粒pMM5065為模板，採用PCR方法擴增組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGT CTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGA GACGTCGAGA，純化PCR產物，採用Hind III和Aat II雙酶切PCR產物，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後再次純化，得到產物1，表示如下5』端AGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAA ATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGAGACGT 3』端；2)對含有葛佬素基因的克隆載體pUC T載體進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後，純化約400bp的DNA片段得到產物25』端CACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGA GGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAG 3』端)；3)對含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的真核表達載體，質粒pCDS I進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後，純化約8000bp的DNA片段，得到產物3，為載體片段；4)將產物1與產物2在T4DNA連接酶的作用下16℃連接4小時後，加入產物3再連接12小時；5)採用CaCl2法，將第四步的連接產物轉化大腸桿菌JM109，對在100μg/ml氨苄青黴素平板上生長的克隆，提取質粒進行Hind III和Sal I雙酶切鑑定，對酶切產物含有530bp片段的質粒再次進行測序鑑定，經測序鑑定表明該序列與所構建的完全一致；大量抽取該質粒，得到抗菌肽葛佬素。
6.權利要求3所述抗菌肽葛佬素用於治療內毒素血症。
7.權利要求3所述抗菌肽葛佬素用於治療G-桿菌感染以及膿毒症。
8.權利要求3所述抗菌肽葛佬素用於治療肝硬化。
全文摘要
本發明公開了葛佬素的cDNA序列,葛佬素cDNA的製備方法以及重組抗菌肽葛佬素的製備方法;通過對同種已知蛋白質Attacin A cDNA中胺基酸密碼子的出現頻度進行分析,採用出現頻度高的密碼子帶入葛佬素蛋白質序列中進行葛佬素的cDNA序列構建,用化學合成法及聚合酶鏈式反應進行目的基因的合成,另外,採用基因重組法製備抗菌肽葛佬素,並測定了其活性。本發明的製備過程簡單,花費少,時間短,效率高。
文檔編號C07K14/435GK1381465SQ01110740
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月18日 優先權日2001年4月18日
發明者鄭江, 周紅 申請人:鄭江, 周紅