將核酸和/或蛋白質轉導至腸黏膜的方法及其製劑的製作方法

2023-08-07 17:13:56

專利名稱：將核酸和/或蛋白質轉導至腸黏膜的方法及其製劑的製作方法
技術領域：
本研究與細菌學、免疫學以及基因治療領域相關；總的來說，本發明是通過基因修飾的正常微生物群將異源核酸轉導至生物體內。特別是本發明涉及將異源核酸轉導至腸黏膜的製劑和有關方法，是利用基因修飾的微生物直接輸送轉化異源核酸，或是輸送至少表達一種異源核酸的基因修飾的微生物。本發明所用微生物包括細菌、細菌融合體及酵母菌。所用異源核酸可以編碼免疫保護性抗原決定簇(抗原)或其它基因治療成分。
參考文獻 參考了本申請內以圓括號所標示的各種出版物或專利文獻，以說明本發明所屬領域的目前發展狀況。我們通過參考這些出版物或專利文獻的每一部分而使之成為一體，所引用的全部科學出版文獻均列於文中或本說明之末。
背景技術：
疾病通常是由有缺陷的或者受損傷的基因或者暴露於傳染性病原而引起。由缺陷基因引起的疾病例子包括各種不同形式的癌症，例如結腸和肺癌、血友病或低密度脂蛋白(LDL)受體缺乏症。感染性疾病通常是由致病微生物引起，致病微生物包括細菌、真菌、寄生蟲、病毒以及某些情況下的感染性缺陷蛋白質即prions。
現代基因治療技術具有很大的潛力，無論是對這些由缺陷基因引起的疾病還是由傳染性病原引起的疾病都能提供強有效的治療和/或預防方法。基因治療或基因替代治療包括提供一種含有異源核酸的宿主，該異源核酸用來替代缺陷基因或者是編碼產生源自傳染性病原或腫瘤的免疫保護性抗原決定簇。在以後的應用實例中，編碼免疫保護性抗原決定簇的異源核酸可以被用來轉化宿主細胞，或者在基因轉輸媒介(載體)表面表達和/或從基因傳輸媒介分泌出去。
導入異源核酸的載體包括病毒性和非病毒性載體。儘管病毒轉導系統被認為是把基因轉至細胞的最有效的媒介，但是由於它具有激發炎症反應或對這些轉導載體的免疫反應的危險，其應用還是受到限制。Forbes，S.J.，綜述文獻胃腸疾病和肝臟疾病中的基因治療，Aliment Pharmacol.Ther.11823-826(1997).病毒載體的例子包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體以及腺病毒相關病毒載體。與其它病毒載體相比，腺病毒載體有以下優點它們能夠感染較寬範圍的細胞，而不象逆轉錄病毒載體那樣局限於正在複製的細胞。但是腺病毒載體可以激活機體的免疫系統，因此如果機體生命未受到威脅，初始劑量或重複強化誘導很少起作用。見Forbes，S.J.，supra。
也可以使用同各種轉染劑配製在一起的質粒來完成異源核酸的轉導。最基本的轉染劑是鹽溶液，將鹽溶液中的質粒DNA注射進入肌肉，並且已經證實它被轉導進入肌肉細胞。其它的例子包括脂質體、PEG與各種聚合體。但是，目前通用的體內基因轉導模式和免疫接種技術在很大程度上依賴於肌肉、皮膚、靜脈、腹膜以及其它身體部位的注射。
免疫治療劑和預防疫苗是最有希望的疾病預防領域之一。免疫治療劑通常被認為是有助於抑制和殺死病原體或腫瘤的合成製劑，並且是在疾病發生之後給予機體。預防疫苗是用來防止腫瘤感染的，並且在疾病發生之前給予機體。然而，免疫治療劑和預防疫苗二者都必須被製成能夠激發機體產生特異性免疫反應的製劑，才能發揮作用。
人體至少存在兩個免疫系統「外周」或「全身」免疫系統與「黏膜」免疫系統(Ogra等.，1994)；這兩系統獨立但同時發揮作用，且可能通過特定的淋巴細胞調節器而相互作用，產生有效的免疫反應。決定哪一免疫系統首先發生反應的因素就是個體後天獲得和通過各種淋巴組織處理病理性抗原的方式。
依靠淋巴細胞相關細胞通過血液、組織與淋巴腺持續運動才能產生有效的免疫反應(Anderson與Shaw，1996)。淋巴細胞轉移到脾與淋巴結等二級淋巴器官以及所謂Peyer’s斑的特異化黏膜組織來抗擊分別通過血液、淋巴腺以及黏膜而入侵的周圍環境中的抗原。抗原在什麼地方以及被哪些細胞提呈給這些中繼(中間)淋巴腺細胞極大地影響免疫反應的結果—激活T細胞或B細胞轉化成特異性抗體形成細胞及其後的記憶反應與效應淋巴細胞。
淋巴腺內的抗原被濾過、捕獲、處理與提呈，此時淋巴腺不注意淋巴結內固有的抗原提呈細胞；由淋巴結進行的這種抗原提呈主要產生「外周」免疫、適當的B細胞轉化成特異性的IgG或IgM抗體。血液中的抗原在脾內特定的血液/組織界面處被提呈，這也主要激發「外周」免疫；然而，由於脾臟同時含有抗原提呈細胞與來自其它各種組織的活化T-細胞與B-細胞，這樣兩系統間的對話就有可能誘發外周免疫或黏膜免疫或者同時產生兩種免疫反應。腸腔器官(如呼吸道與胃腸道)內腔中的抗原被稱作「M」細胞的特異性內皮細胞完整吞噬(非破壞性吞噬)，並且跨細胞轉移到Peyer’s斑內的淋巴細胞，在這裡發生的抗原提呈反應主要激發「黏膜」免疫反應，並且釋放特異性IgA抗體到黏膜分泌物中去。
鼻腔、喉嚨、肺以及腸腔中的腔隙是與外界相連通的，這樣就將這些組織暴露在環境中有毒或致病的危險因素之下。呼吸道、胃腸道以及泌尿生殖道的黏膜表面是由一層覆蓋有黏液的上皮細胞組成，通過墊圈樣的細胞間緊密連接將細胞與細胞連接在一起，這樣就起到了保護作用。面對富含微生物的環境，黏膜表面提供了一個細胞屏障，這是病原體與宿主之間的第一個接觸界面，因而它們在預防感染性疾病方面是至關重要的。
雖然作用相似，但是體內不同黏膜表面的上皮襯層具有很大的不同。復層鱗狀上皮襯在口腔、咽、食道、尿道與陰道黏膜表面，而胃腸道的黏膜表面是由單層簡單的上皮細胞排列而就。這些黏膜表面總面積超過了400m2。在腸道內，小腸和大腸的上皮細胞裝備良好，足以面對這樣一個富含病原體的外部環境。儘管這一廣大的細胞屏障由纖細的單層細胞組成，這些細胞活躍地從事食物消化以及營養成分吸收工作，但是它通常能夠排除潛在性的有害與抗原性物質。
在腸道黏膜上皮襯層中，有少量的淋巴組織構成系統的黏膜淋巴濾泡-相關上皮(FAE)組織。儘管大分子物質和微生物不能通過襯於腸道的上皮組織入侵，但是在象位於腸道的Peyer’s斑這樣的黏膜誘導點中，淋巴FAE包含微褶皺或M細胞，微褶皺或M細胞可以轉運抗原及微生物以進行抗原攝取；M細胞存在於簡單上皮內的情形僅僅見於有組織的淋巴濾泡。因而在富含M細胞的FAE位點內，存在特化上皮與抗原提呈細胞及淋巴細胞之間高度進化了的協同作用。通過活躍的跨上皮細胞小泡轉運，M細胞把來自內腔的大分子物質、顆粒以及微生物經由其細胞質直接轉運到上皮內的黏膜淋巴濾泡和機體有組織的黏膜淋巴組織，該淋巴組織能夠處理抗原並且激發能夠引起分泌免疫的黏膜免疫反應，分泌性免疫反應使得腸道和肺黏膜表面浸浴在保護性抗體之中。
所以M細胞提供了用以進行小泡轉運的局部、功能性通道。M細胞位於淋巴濾泡(FAE)的上方，通過及時將外源性物質和微生物暴露於吞噬細胞和抗原提呈細胞，從而減少了經由上皮屏障轉運這些物質的固有危險。M細胞朝向內腔的頂部表面不同於周圍的其它細胞它們缺乏典型的刷狀緣，而有不定的微絨毛或具有龐大微絨毛內吞區域的微褶皺。M細胞的基部內陷形成了自身獨一無二的特徵，這是上皮內的「口袋」或空間，它們既縮短了跨細胞囊泡從細胞頂部到基側部所必須通過的距離，同時又為B細胞和CD4T細胞之類的淋巴細胞、巨噬細胞以及樹枝狀細胞的聚集提供了入塢位點。M細胞也有延伸到潛在淋巴組織的基本的推移活動，它們在這裡與淋巴細胞或/和抗原提呈細胞直接接觸，這好象是對M細胞轉運後的細胞提呈發揮作用。
胃腸外免疫是疫苗接種的最常用途徑。它通常引起外周急性免疫反應，產生保護性IgM/IgG抗體與細胞介導的外周免疫反應。急性反應很快就會減輕消退，但是它留下了被稱為「記憶」細胞的崗哨，這類崗哨細胞時刻保持警覺，一旦真正的病原體返回入侵機體，它們就會釋放作為防護者的全部力量。儘管它們很有效，但是經過注射接種的疫苗最初繞過了黏膜，通常不能刺激黏膜淋巴組織產生保護性IgA抗體，因而不能激發黏膜免疫反應。
這樣就出現了一個問題，因為許多經由全身循環傳播擴散的危險物質，最初是通過鼻、口及其它開口器官進入身體，越過黏膜感染機體。因此，它們所遇到的第一道防衛結構就是那些襯於氣道、消化道與生殖道內的黏膜，這些黏膜組成了體內最大的病原體-屏障。抗擊這些致病物的保護作用需要一種這樣的疫苗，它不僅誘導外周免疫反應，而且能誘導黏膜免疫反應。如上所述，當黏膜免疫反應發動時，它就產生迅速進入這些通道腔內的IgA抗體，抑制它們發現的任何病原體；有效的黏膜免疫反應也激活全身性反應，此時循環的免疫系統細胞幫助消滅遠處的入侵者。
「標準預」疫苗接種的另一個併發症是傳統的疫苗有這樣一個危險疫苗微生物不知何故會反跳獲得生命力，引發它們本欲預防的疾病。
因為有這種併發症，人們正在尋求用以替代傳統疫苗接種方式的其它途徑來進行免疫。其中一種方法就是應用DNA疫苗，此時給予一種攜帶著來自病原生物體的一個DNA片段的質粒，誘導機體產生抗擊各種病原體的保護反應，這些病原微生物包括B型肝炎病毒、單純皰疹病毒、HIV、瘧疾與流感病毒。
目前正在研究開發的DNA疫苗也帶來一些問題。首先疫苗的轉導十分複雜，需要將基因或cDNA與適當的表達載體融合成一體，然後轉入適當的蛋白合成生物體(例如，大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母或者其它細菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞)中去，生產獲得感興趣基因的多重拷貝。然後分離DNA並使之進入另一表達系統、轉導到宿主體內，此時在內源性或外源性啟動子的控制下恰當地進行基因轉錄和翻譯；使用多重表達載體(包括，但不局限於噬菌體、粘粒、病毒以及質粒載體)是十分昂貴的，難於製備且很難接種給藥。而且，為有效地將疫苗導入宿主體內，需要共同注入病毒元件，這就帶來了輸進有活力的重組逆轉錄病毒群系的危險。
誘導免疫防護反應的另一種途徑是接種亞單位疫苗製劑，該製劑主要是由從病原體基因分離的具有抗原性的蛋白質組成。這些蛋白質自身無法引起感染，但是可以誘導產生全身性的而不是黏膜局部的抗體與CTL，而且生產、純化和保存這些疫苗均十分昂貴。
與傳統的疫苗接種方式有關的另一個問題是疫苗在人類宿主體內的生理學變化可能會引發新的疾病。新出現的病原體可能對抗體具有抗性，或(通過基因重組而使其)對抗宿主防禦反應的能力更加強大。就如已經充分證實的流感病毒那樣，重組事件或者缺乏與病原體的接觸均會引起人群相應免疫性的缺乏；就流感病毒而言，重組事件提高了感染速度，新出現的病原體有時會引發全國流行。
因此，儘管在疾病預防與免疫接種方面取得了很大的進展，但是新的及重新出現的感染性疾病正在打亂這一平衡狀態而利於寄生物的生存；全身性免疫固然很重要，但是仍需要繼續開發黏膜疫苗以有效的抗擊這些新的疾病威脅。為此，目前正在發展口服疫苗；它們能夠較好地同時激發「黏膜」和「外周」免疫，比普遍使用的胃腸外轉導系統具有更高的效價比、且更為方便。目前正在開發的口服疫苗有傾向集中在發展和使用改良的致病生物體，如沙門氏菌屬，作為口服免疫的抗原載體(Stocker，美國專利號4,837,151，沙門氏菌幾個菌株的營養缺陷型變種；Clements等，美國專利號5,079,165，沙門氏菌的無毒力菌株；Charles等，美國專利號5,547,664，活的減毒沙門氏菌)。即使這些病原體已經被減毒，但它們仍然具有可能恢復其致病性而對宿主動物造成危害的危險。
考慮到胃腸外接種疫苗、尤其是涉及DNA或亞單位疫苗時的固有問題，本發明人正在研究開發新穎的製劑，以及應用非致病性乳酸菌(LAB)作為生產和轉導治療性分子(如，抗原)的活載體的方法。總體來說，LAB尤其是乳酸桿菌種所具有的某些特性使得它們成為用於口服免疫接種的最具有吸引力的侯選者。這些特性包括佐劑活性、黏膜黏附特性、低的自身免疫原性，且被認為是安全的(GRAS)。它們已經出現在腸道內生菌群中，且在商業上被用來生產酸奶酪、營養乳和其它食品及其益生的應用。人們應用食用LAB已經有很長時間了，且通常認為它們是安全的，這代表著它們用作治療性載體的潛在重要優勢。本發明人目前正在研究，LAB用作活疫苗載體的一個特別重組體是乳酸桿菌。乳酸桿菌種在哺乳動物胃腸道內普遍存在，並且能夠定向地黏附於黏膜受體，這使得它們成為用作疫苗載體的非常有用的生物體，這樣接種的宿主可以對抗寬範圍的病原體。
就普通意義上的乳酸菌而言，已經有幾個程序用以產生LAB轉化子。Leer等人(WO095/35389)介紹了一種將核酸注入微生物的方法，包括象乳酸桿菌與Bifidobacterium之類的微生物；Leer等人的方法是以在轉化過程開始之前進行有限自分解為基礎。已經公開發表的PCT申請PCT/NL96/00409揭示了篩選非致病性細菌黏附於特異性黏膜受體的能力的方法，特別是篩選乳酸桿菌與Bifidobacterium屬LAB；同時也揭示了一種表達載體，它由一個表達啟動子序列，一種核酸序列和容許核糖體識別與翻譯性能的序列組成。這一參考文獻表明乳酸桿菌的不同種系可以被轉化，以表達包括致病性細菌蛋白在內的的異源基因產物。
此外，已經應用口服重組L.lactis誘發了對所表達抗原的局部IgA和/或血清IgG抗體反應。Wells等，Mol.Microbiol.81155-1162，1993。另外，Casas等人(美國專利號6,100,388)研究表明可以用異源DNA轉化L.reuteri，在細胞表面表達外源性蛋白質或將之分泌；而EP 1084709A1揭示L.plantarum同樣可以被轉化，在細胞內或細胞表面表達抗原片段。相關文獻參見U.S.Pat.Nos.5,149,532及6,100,388。
所有這些參考文獻均表明在接種疫苗時可以使用某些種屬的細菌。但是他們所介紹的方法都很費時、昂貴、效率低。另外，就目前所使用的方法而言，對於用來轉導抗原的每一特異性種屬可能需要不同的表達系統。通常需要研製開發適當的啟動子、增強子以及可選擇性標誌等；可能需要進行幾種不同的轉化來確定可行系統，以保證體內和體外適當的表達水平；所有這些程序均需增加很多時間與經費。現在所需要的就是在經濟可行的、安全可靠的食物級微生物中，用一個人們已知的、經濟可行的表達系統來表達異源蛋白質成分，從而達到疾病預防和治療的目的。
發明概要 本發明一般適用於應用遺傳改良的微生物進行體內異源核酸的轉導。特別是，本發明包括進行異源核酸轉導的製劑及相關方法，應用遺傳改良微生物直接轉導轉化異源核酸，或者是遺傳改良微生物表達至少一種異源核酸。本發明中的遺傳改良微生物包括細菌、細菌融合體與酵母菌。異源核酸可以編碼適於基因治療應用的免疫保護性抗原決定簇(抗原)或其它蛋白質，基因治療包括基因替代和/或基因增加。
本發明的一個實施方案中，提供了一種免疫原性製劑(或免疫原性組合物)(immunogenic composition)，它是由至少表達一種異源核酸的遺傳改良微生物組成。這種遺傳改良微生物包括，但不局限於細菌、細菌融合體、酵母菌以及酵母-細菌融合體。異源核酸可以編碼免疫保護性抗原決定簇(抗原)，後者是疾病預防性或治療性或者兼具這兩種功能。
本發明的又一個實施方案中，抗原被表達在遺傳改良微生物表面。
本發明的再一個實施方案中，抗原同時被分泌與表達在遺傳改良微生物表面。當表達本發明的遺傳改良微生物的抗原與腸黏膜中免疫細胞接觸時，就激發針對抗原的免疫反應。
本發明再一個實施方案是，本發明提供了把DNA轉導至哺乳動物細胞的製劑和相關方法，這是利用來自自然界生物體或者來自人體「微生物」群體的細菌和酵母菌進行轉導的。本發明還證實了，可以通過口服攝取把攜帶著DNA載體，如具有哺乳動物表達系統的質粒，的改良微生物細菌培養物引入至腸道。
當把本發明的製劑經過口服給予機體時，其靶細胞就是腸道細胞，例如，M-細胞、K-細胞以及其它任何襯於機體腸道的細胞或者是上皮細胞層下面的細胞，但是並不僅限於腸細胞。本發明的一個實施方案，遺傳改良微生物攜帶有一個與可誘導啟動子聯合發揮作用的自溶解基因，該可誘導啟動子可以被如下因素誘導，例如pH降低、乳糖、溫度、厭氧性環境或其它任何合適的誘導物或誘導條件。當自溶解蛋白對細菌細胞發揮作用時，細菌細胞可能在胃腸道內破裂並且釋放質粒，這最好發生在腸腔內。質粒最好是一種高拷貝的質粒，例如，基於pUC18的質粒或「逃亡」質粒。
本發明又一個實施方案為，可以以原生質體的形式供應本發明的遺傳改良微生物機體，例如沒有細胞壁的細菌細胞。在原生質體沿胃腸道向下運行時，周圍的低滲環境會在細菌細胞內產生較大的滲透壓，致使細胞突然破裂並且釋放質粒。
本發明還有一個實施方案，本發明的遺傳改良微生物可以在攝取之前用裂解病毒進行處理，這些裂解病毒包括但不局限於噬菌體，例如φadh、φLC3、mv4、M13、T4、φ29、Cp-1、Cp-7和Cp-9噬菌體。在微生物細胞沿著胃腸道向下運行時，噬菌體可以開始它們的細胞溶解周期，溶解微生物細胞釋放質粒。
由於細菌體積小、所釋放的DNA量很大，體內的腸道細胞就將DNA攝入細胞內並且表達蛋白質。腸道細胞之所以能夠攝入DNA，是因為有質粒的聯合作用，例如與細胞膜碎片聯合，後者就象脂質體在脂質體轉染中起到DNA載體的作用一樣而發揮載體的作用。腸道細胞也可以通過細胞內吞或胞飲作用攝取裸露的DNA。
而且，因為腸道細胞中的M-細胞通常參與大分子物質的小泡轉運，所以細菌所釋放的DNA可以被M-攝取。因為M-細胞定位於淋巴濾泡相關上皮組織(FAE)中，後者含有大量的免疫細胞例如B細胞與T細胞，所以能夠產生所預期的針對質粒所表達蛋白質的黏膜和/或外周免疫反應。就轉導治療性基因而言，如轉導胰島素、幹擾素、生長激素、因子VIII和因子IX以及其它任何治療性目的蛋白，M-細胞口袋可以發揮作為治療性分泌蛋白質進入血流的通路作用。再一方面，DNA的蛋白質編碼區域可以通過基因工程進行設計，並且可以拼接到容許蛋白質分泌的信號序列肽的下遊，從而使該蛋白質能被細胞分泌。
本發明的遺傳改良微生物有機體可以被製備為多種形式，例如乾粉的形式，攝取之前需要重新配製或者被裝在膠囊中，或者被混入食物如牛奶、酸奶酪、冰淇淋。
附圖簡要說明

圖1顯示的是表達在酵母菌細胞表面的綠色(未成熟)螢光蛋白(GFP)，已經根據本發明的規則對酵母菌進行了轉化。
圖2是以圖解的形式說明用流感病毒疫苗口服接種的老鼠與對照組的血清學結果，該流感病毒疫苗使用了GPD質粒。
圖3也是以圖解的形式說明用GPD質粒的流感病毒疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖4圖示的是用GPD質粒的輪狀病毒VP7疫苗口服接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖5表明用GPD質粒的輪狀病毒VP7疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖6是以圖解的形式說明用pYD質粒的流感病毒疫苗口服接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖7也是以圖解的形式說明用pYD質粒的流感病毒疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖8表明用pYD質粒的輪狀病毒VP7疫苗口服接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖9表明用pYD質粒的輪狀病毒VP7疫苗皮下接種老鼠與對照組的血清學結果。
圖10則是用圖解的形式來說明用pYD質粒的流感病毒疫苗經鼻腔內接種老鼠與對照組的血清學結果。
定義 與本發明中生物學分子相關的各種術語均有詳細的技術說明與要求；在提出本發明之前，首先闡明下文中將要用到的術語的定義，對理解全文是很有幫助的。
「抗原」或「抗原性片段」，「免疫保護性抗原決定簇」或「抗原決定簇」是指能夠在受試對象(如，動物或哺乳動物)體內引起細胞或體液免疫的完整蛋白質或肽類或者是其中部分成份，他們也必須與由相應蛋白免疫的動物所產生的抗體發生反應。而且，在這裡所用於說明本發明的術語「抗原」、「抗原性片段」或「抗原決定簇」包括對與抗體發生特異性交互反應起決定性作用的任何分子。抗原性或抗原決定簇的決定因素通常是由具有化學活性的表面分子(如，胺基酸或糖側鏈)集團組成，並且具有特異性的三維空間結構特徵以及特異性的電荷特徵。可用於本發明的抗原或抗原決定簇的範例包括，但不局限於病毒、細菌、原生動物、微生物性以及腫瘤抗原。
「抗原性或治療性元件」可以包括，例如抗原性或治療性DNA、cDNA、RNA以及反義多聚核酸序列。
「編碼序列」或「編碼區域」是指具有在序列表達產生基因產物時所必需的序列信息的核酸分子。
與哺乳動物體「兼容」是指協調的、共同生存的能力，例如還可以被用於沒有免疫學反應的輸血和器官移植。
術語「接觸」用於細胞時，是說明通過微生物轉導媒介把抗原或治療性基因、蛋白或反義序列、和/或附屬元件轉導至靶細胞的過程，或者直接把它們放置於靶細胞附近的過程。
「治療劑的轉導」可以通過許多不同的方式進行說明解釋。比如使用口服轉導方式，是說給予藥丸配方，或者給予按著允許口服或類似途徑給藥而設計的製劑。這樣的方法為那些精通發藥技術的人們所熟知，但是更為可取的製劑包括如下藥學配方，由抗原性或治療性基因、蛋白質或可以與微生物轉導媒介(如，乳酸桿菌、酵母菌等)聯合轉導的反義多聚核苷酸序列等組成。這樣的製劑中，基因可以以如下形式存在DNA片段、質粒、粘粒或能夠在細胞(尤其是LAB-大腸桿菌融合體細胞)中表達目的蛋白質的重組載體等形式。可以根據藥理學上能夠接受的酸乳等級，將這些製劑設計為體內給藥方式。
「表達盒」術語是指至少包含一個編碼序列的核苷酸序列，該編碼序列必須同時伴有指導轉錄起始和終止的序列元件。一個表達盒可能含有附加序列，包括但不局限於如下元件啟動子、加強子以及參與轉錄後或翻譯後加工處理過程的序列。
核酸結構的「異源」區域是在一個大分子中的核酸分子的可以明確確認的一個(或多個)核酸分子片段，在自然界中尚未發現它與此大分子有關聯。因而當異源區域編碼哺乳動物的基因時，該基因通常被DNA側麵包繞，此DNA在源生物基因組中不會包圍該哺乳動物基因組的DNA。另一個例子中，異源區域就是在自然界中沒有發現的包含編碼序列的一個結構(比如cDNA，其中基因組編碼序列包含內含子或具有不同於天然基因的密碼子的合成序列)。根據這裡的定義，等位基因的變異或自然發生的基因突變事件並不產生DNA的異源區。就蛋白質而言，「異源」可以被理解為這樣一種蛋白質，其中至少有一部分在給定宿主細胞染色體DNA中不被正常編碼。異源蛋白質的範例包括由細菌與真核微生物產生的雜交或融合蛋白、由原核宿主產生的真核蛋白以及類似蛋白質。
「異源核酸」是一種從不同於其產生種屬的其它屬種所獲得的DNA、cDNA或任何形式的RNA多聚核苷酸序列或其雜交形式，以及構成多肽、肽片段的胺基酸序列，或蛋白質。異源核酸序列也可以包括源於同一種屬的意欲被取代或增加的核酸序列以及內生性核酸序列。這在包括基因替代在內的基因治療應用方面特別有用。
這裡所使用的「免疫原性製劑」(immunogenic composition)術語是本發明的一個實施方案，它提供了一種以便於誘導產生免疫反應的方式接觸動物的抗原。免疫反應可以是體液免疫或細胞免疫或者同時發生，免疫原或其一個片段或亞單位。典型的抗原包括但不局限於腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲抗原、真菌抗原和細菌抗原。例如可被編碼的細菌性抗原包括但不能因此而局限於下列抗原分枝桿菌屬麻風抗原，分枝桿菌屬肺結核抗原，斑疹傷寒桿菌抗原，衣原體抗原，Coxiella抗原，瘧疾孢子體與裂殖子蛋白(例如，來自瘧原蟲berghei孢子體的周孢子體蛋白)，白喉類毒素，破傷風類毒素，梭菌抗原，利什曼蟲抗原，沙門氏菌屬抗原，大腸桿菌抗原，李斯特菌抗原，包柔氏螺旋體菌抗原(包括OspA和OspB抗原)，Franciscella抗原，耶爾森氏菌屬抗原，分枝桿菌屬africanum抗原，分枝桿菌屬細胞內抗原，分枝桿菌屬avium抗原，志賀氏菌抗原，淋球菌抗原，葡萄球菌、Helicobacter、peudomona、密螺旋體抗原，血吸蟲(裂體蟲)抗原，絲蟲屬抗原，百日咳抗原，葡萄球菌抗原，炭疽毒素、百日咳毒素、梭菌屬，血友病菌抗原，沙門氏菌屬，鏈球菌抗原(包括生膿原S.的M蛋白及肺炎球菌抗原，如鏈球菌肺炎抗原)。
可被編碼的病毒性抗原可以包括但不能因此而局限於下列抗原腮腺炎病毒抗原，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、HBV抗原，狂犬病抗原，腦灰質炎病毒抗原，裂谷熱病毒抗原，登革熱病毒抗原，麻疹病毒抗原，輪狀病毒抗原，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原(包括gag、pol與env蛋白以及HIV env的gp120和gp160)，呼吸合胞體病毒(RSV)抗原，皰疹病毒抗原，副流感病毒抗原，風疹病毒抗原，蛇毒抗原，人類腫瘤抗原，Vibrio霍亂抗原，以及來自HCV、HAV、HPV、TB、皰疹、風疹、流行性感冒、腮腺炎、小兒麻痺症(急性脊髓灰白質炎)、輪狀病毒、瘧原蟲表面糖蛋白、細小病毒、EB病毒、痘病毒、狂犬病病毒、肺炎等的抗原，象CEA之類的癌抗原和其它相似的抗原性片段。
「乳酸菌」或「LAB」通常是指發酵碳水化合物產生乳酸作為終末產物的一個革蘭氏陽性細菌家族。乳酸菌生長在口腔與消化道，被用來製造發酵食品如朝鮮泡菜、酸奶酪等。眾所周知，它們能夠產生各種抗菌化合物如有機酸、過氧化氫、聯乙醯與細菌素，它們利用碳水化合物作為能源物質產生乳酸和抑制有害細菌生長的抗菌物質，因而對維持腸內健康狀態發揮重要的作用。乳酸菌包括鏈球菌、腸球菌、乳酸球菌、乳酸桿菌和Bifidobacterium等菌屬。這些乳酸-產生細菌的典型範例包括嗜熱鏈球菌、乳酸腸球菌、durans腸球菌、乳酸球菌、乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌、酪蛋白乳酸桿菌以及plantarum乳酸桿菌。
「乳酸桿菌」是指乳酸桿菌種的具有下列細菌學特徵的乳酸細菌革蘭氏陽性、杆棒狀、無活動力、過氧化氫酶陰性、兼性厭氧、最適生長溫度為30°--40°C、15℃ 時不生長以及形成DL-乳酸。
這裡所使用的「微生物」包括，細菌、酵母菌、細菌-細菌融合體與細菌-酵母菌融合體。
術語「改良」通常是指通過基本或基礎的變化而使給定的生物體或系統呈現出新的傾向性、新的結構或新的終末形式的過程。一個方面，「改良的微生物體」是指已經用編碼抗原性或治療性多肽的表達載體轉換過的微生物體，因而「改良微生物」在其表面表達或/和分泌抗原性或治療性多肽。
術語「核酸結構」或「DNA結構」有時被用來指代編碼序列或者是與適當的調節序列聯合發揮作用並且被插入到載體進行細胞轉化的序列。這一術語可以同術語「轉化DNA」交替使用。這樣的核酸結構可以包括一個興趣基因產物的編碼序列，連同一個選擇性標誌基因和/或一個報告基因。「DNA結構」也用來代指異源區域，特別是指為進行細胞轉化組建而成的區域。
「運作上相聯繫」或「運作插入」意思是表達編碼序列所必需的調節序列被安置在核酸分子中相對於編碼序列的適當位置，以使編碼序列能夠表達。這一定義有時也被用指在表達載體中排列其它轉錄控制元件(如，增強子)。
「質粒」或「質粒載體」是一種能夠通過轉化而被引進或轉染到細菌或酵母菌細胞中去的環狀DNA分子，質粒就可以在細胞內自動複製。質粒載體通常包含一個為宿主自身固有的或非宿主自有的RNA聚合酶所識別的啟動子序列、一個運作上與啟動子序列相聯繫的異源核酸以及一個通過與外因子感應而提高拷貝數量的複製原點組成，其中啟動子控制著目的基因的表達。質粒複製原點是很重要的，因為它們決定質粒拷貝數量進而影響質粒產量。能夠以高拷貝數量進行複製的質粒可以大大提高固定容量培養基上的質粒產量(Suzuki等，Genetic Analysis，p.404，(1989)。包含在質粒載體中的啟動子序列，控制著目的基因的表達，可以是能夠在特定宿主中驅動基因表達的任何啟動子序列，例如，可以使用能夠被來自T7，T3，SP6以及其它類似的LacZ等的RNA聚合酶所識別的啟動子序列。可用於此目的的啟動子包括但不局限於下列序列lac、tip、tac、gal、ara以及P.sub.L啟動子等，當使用埃希氏菌屬大腸桿菌時，只要達到上述目的即可使用(Fitzwater等.，Embo J.73289-3297(1988)；Uhlin等，Mol.Gen.Genet.165167-179(1979))。此外，質粒載體可以含有抗藥基因用作選擇性標誌。
「多聚核苷酸」通常是指任何多聚核糖核酸或多聚脫氧核糖核酸，可以是未加修飾的RNA或DNA，也可以是修飾的RNA或DNA。「多聚核苷酸」，對單鏈與雙鏈DNA或RNA沒有限制，包括DNA或RNA，它們是單鏈區域和雙鏈區域的混合物以及由上述混合物形成的雜交分子。多聚核苷酸也包括含有一個或更多修飾鹼基的多種DNA或RNA以及為了穩定性或其它原因而將主鏈骨架修飾的多種DNA或RNA。「修飾鹼基」包括，例如，tritylated鹼基與稀有鹼基(如，次黃嘌呤核苷)。DNA與RNA都經過了許許多多的修飾，因而「多聚核苷酸」擁有象在自然界中發現的那樣典型的經過化學修飾、酶學修飾或代謝修飾過的多聚核苷酸形式，以及具有病毒和細胞特徵的DNA和RNA化學形式。「多聚核苷酸」也擁有相對短的多聚核苷酸，通常是指寡核苷酸。
「多肽」是指任何由兩個或更多胺基酸通過肽鍵或經過修飾的肽鍵(如，肽等排體)相互連接而成的肽或蛋白質。「多肽」既指短鏈又指長鏈，短鏈通常是指肽、寡肽或寡聚物，而長鏈常指蛋白質。多肽可以包括胺基酸而不是基因編碼的胺基酸。「多肽」包括經過修飾了的胺基酸序列，這種修飾是由自然過程(如，翻譯後加工處理過程)或者經過化學修飾技術來完成的，後者在工業工藝中為人們所熟知。在基本課本與更為詳細的專論，以及大部頭的研究專著中均對這些修飾做了詳細解釋。
修飾可以發生在多肽的任何位置，包括肽鏈骨架、胺基酸側鏈與氨基末端或羧基末端。在給定多肽中，如果同一類型的修飾可生在幾個位點或相同或不同水平，則會更為人們所賞識。一種給定的多肽也可以含有多種類型的修飾；多肽可因為泛醌化而產生分枝，它們可以是有分枝或無分枝的循環。循環的、分枝化的以及分枝循環的多肽可以是由於翻譯後自然加工處理過程所致，也可以是由合成方式所引起。
術語「啟動子」、「啟動子區域」或「啟動子序列」通常是指基因的轉錄調節區域，它們可以在編碼區的5』或3』旁、或者在編碼區內或者在內含子中。典型的啟動子是一個能夠與細胞內RNA聚合酶結合併且發動下遊(3』方向)編碼序列進行轉錄的DNA調節區域。典型的5』啟動子序列3』末端緊鄰轉錄啟始位點，並且其5』端向上遊方向延伸，包含起始可以探測到的、高於本底水平的轉錄所需要的最小數量的鹼基或元件。啟動子序列內部是一個轉錄啟始位點(用核酸酶S1可以地定位)以及與RNA聚合酶結合的蛋白結合區域(一致序列)。
術語「報告基因」是指編碼可以通過標準方法直接或間接地探測得到其產物的基因。
「酵母」通常是指釀酒酵母、貝克酵母菌種的一個酵母菌株，是一種可以以單倍體或雙倍體形式生存的單細胞微生物，通過子細胞發芽的方式來進行繁殖。由於釀酒基因組的遺傳操縱簡便，這就使得它在以了解真核細胞基本生物學現象為目的的研究中具有極高的應用價值。酵母基因組已經被全部測序，並且擁有大量關於這一生物體的生物學、遺傳學與分子生物學的可獲得信息。此外，它是在酵母菌中表達可構建和可誘導的異源蛋白質的經濟可行並為人們所熟知的、獨具特色的工具，這就使得酵母菌成為表達和純化宿主的治療性重組蛋白質的有用工具。此外，酵母菌被廣泛地應用於人們日常消費的烘焙食品、維生素以及酒精飲料發酵的製造業中，這就是被食品與藥品管理局(FDA)冠以「通常被認為是人們消費安全的」(GRAS)稱號的慈善酵母菌的原因。
除了廣泛地應用於食品和飲料製造業，酵母菌還是寄居在人類體內的自然微生物中的一部分。已經從健康個體口腔與直腸黏膜表面分離出了釀酒酵母菌株(見Xu，J.，C.M.Boyd，Livingston，W.Meyer，J.F.Madden，and T.G.Mitchell.1999.定居於婦女體內的致病性酵母菌種類與基因型的差別及相似性.JClin.Microbiol.373835-3843.)。
與條件致病性微生物酵母菌種不同，例如白色假絲酵母菌可以引起免疫功能受損患者發生致命性感染，釀酒酵母寄居菌極少與這種破壞健康的效應有關聯。另外，已經證明如果把活的酵母菌給予健康個體與動物模型並不能引起酵母菌定居與致病性(見Maejima，K.，K.Shimoda，C.Morita，T.Fujiwara和T.Kitamura.1980.給小鼠和獼猴口服及靜脈注射釀酒酵母菌MC16後細菌的定居與致病性，Jpn.J Med.Sci.Biol.33271-276。參見Pecquet，S.，D.Guillaumin，C.Tancrede，and A.Andremont.1991.釀酒酵母菌在人類志願者腸道中的排除動力學及其在無菌小鼠體內對微生物移植的抵抗效應，Appl.Environ.Microbiol.573049-3051)。依據本發明的原則，適於應用的無限制性酵母菌屬的例子包括下組酵母菌釀酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus以及S.kluyveri。
「選擇性標誌基因」這一術語是指編碼一種產物的基因，該產物在得到表達時則賦予被轉化細胞一種可被選擇的表現型，如抗生素抗性。
關於「有效治療量」，「有效治療量」是指多聚核苷酸、反義多聚核苷酸或蛋白質或者它們的片段的計量，當將該計量的上述物質同細菌融合體載體一起給予生物體時，它們能夠在生物體內有效產生預期效應(如，提高或降低M-細胞介導的免疫反應)。
「轉錄與翻譯」控制序列是DNA調節序列，例如啟動子、增強子、多聚腺苷化信號、終止子以及宿主細胞內為表達編碼序列而提供的類似元件。
將包括DNA表達結構在內的治療性配方轉導至細胞(如，大腸桿菌細胞)的許多方法已經為該領域技術人員所熟知。當把外源性或異源DNA或基因引導入細胞時，該細胞即被這樣的DNA「轉化」或「轉染」或「轉化」。轉化DNA可以整合入細胞基因組，也可以不整合。例如，在原核生物、細菌和酵母菌細胞中，轉化DNA可以維持在游離元件(如，質粒)上也可以被結合在宿主DNA特異性的限制位點。在這裡所使用的「轉化」是用來說明用病毒介導的轉導系統，如腺病毒、AAV、逆轉錄病毒或質粒轉導基因轉換方法，將DNA轉導至細胞的過程。這裡所使用的「轉染」是用來說明使用非病毒介導的方式，這些方法包括磷酸鈣-或-葡聚糖介導的轉染、電擊孔法、玻璃發射打靶法及其它類似的方法將基因元件傳輸和導入細胞的過程。這些方法為本領域的技術人員所熟知，根據本次公開的資料，精確的製劑與實施操作方法就更為明顯了。
「載體」就是象質粒、噬菌體或者粘粒這樣的複製子，另外一個核酸片段可以被插入進去並使該片段得以複製或表達。
發明詳述 身體不同部位的微生物濃度變化很大。例如，口腔黏膜與牙齒表面具有很高濃度的細菌，它們同唾液及咀嚼的食物一起由此進入食道、然後到達胃中，食物在胃中與胃液混合呈流質狀。胃液的酸性能夠有效地破壞與其接觸的大部分細菌。食物在胃內停留大約4小時左右，就被逐漸釋放進入小腸；小腸的近端部分也因為從胃內進入的酸而呈酸性；此外，分泌進入小腸近端部分的膽汁酸也破壞細菌，這樣就使得此處的細菌水平相對的低。由於酸性下降、膽汁酸被衝淡稀釋，小腸末端部分的細菌水平就升高了。數米長的小腸內布滿了密度很高的微絨毛，這些微絨毛極大地提高了黏膜的固有表面積，結果是如果我們把小腸鋪開來的話，它就會覆蓋一個網球場的面積。巨大的表面積使得食物分解以及其後的營養成分吸收能夠有效進行，營養成分是通過黏膜被吸收進入血流的。大部分的系統免疫組織與小腸有關係，且可以在黏膜上皮細胞之下直接發現它們。
乳酸菌(「LAB」)與酵母菌具有的某些特性使得它們成為把DNA轉導至腸道細胞的最具有吸引力的侯選者。它們已經出現在腸道內生微生物群中，並且在商業上被用來生產酸奶酪、營養乳和其它食品及其前生命期的應用，它們通常被認為是安全(GRAS)的。它們也具有黏膜黏附特性，且自身免疫原性低。LAB和酵母菌在哺乳動物胃腸道內普遍存在，並且能夠定向地黏附於黏膜受體，這使得它們成為把DNA和抗原轉導至腸細胞內的非常有用的載體生物。
也可以在胃內和小腸的近端部分發現LAB，是因為LAB的耐算性相對較好；這使得它們成為把DNA和抗原通過胃轉導進入腸的一個理想載體。有5個主要的乳酸桿菌屬，包括鏈球菌、腸球菌、乳酸球菌、乳酸桿菌和Bifidobacterium。這些乳酸-產生細菌的典型例子包括嗜熱鏈球菌、faecalis腸球菌、durans腸球菌、lactis乳酸球菌、lactis乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、bulgaricus乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌、casei乳酸桿菌、plantarum乳酸桿菌、L.gasseri、L.jenseni、L.crispatus、L.paracasei、L.rhamnosus、L.agilis、L.salivarius、L.pseudoplantarum、L.buchneri以及L.reuteri。例如，rhamnosus乳酸桿菌GG(ATCC 53103)或者更為簡單地稱為乳酸桿菌GG或LGG是從健康人類的腸道菌群中分離出來的前生命期株。乳酸桿菌對健康人類的益生效應已經被廣泛地研究，並且在科學期刊中有文獻證明。依據本發明的一個方面，所有這些種和屬的細菌都可被用作DNA轉導載體。
大腸桿菌是自然生長在哺乳動物腸道內的又一菌種。例如，coli K-細胞生產製造機體血液凝固所需要的維生素K。由於大腸桿菌細菌已經被廣泛地研究，是現代基因工程中廣為應用的菌種，所以改良和操縱大腸桿菌的方法與技術已為業內人士所周知。正因如此，依據本發明的一個方面，改良的大腸桿菌也可以被用作將DNA轉導至腸細胞的載體。
酵母菌是通常發現於食物中的真核細胞的真菌，因此經常定居在人類的部分腸道。象Saccharomyces種這樣的酵母菌通常被認為是安全的，因此根據本發明的規範，它們是可用的理想侯選者。Saccharomyces菌種包括如下種類S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus、S.cerevisiae與S.kluyveri。釀酒酵母菌株為現代麵包師所用的酵母，且已經在傳統的酵母粉中發現S.kluyveri，因此按照本發明的規範，這些菌種理想地適合於修飾改良。
為了這次公開的目的，所有在哺乳動物體內發現的自然發生的細菌或酵母菌都被稱為「微生物」。
依據本發明的一個方面，包括細菌(如，LAB、coli)和酵母菌的微生物都可以用、包含哺乳動物表達系統、能表達興趣蛋白質的質粒DNA進行轉化。在本發明的一個實施方案中，所用細菌是嗜酸乳酸桿菌；而在另一個實施方案中，所用微生物是酵母菌。這樣就可以將改良微生物的培養物通過口服攝取給予動物或人類。在微生物沿著胃腸道運行過程中，微生物細胞被觸發而引起細胞溶解，並且在腸道內釋放質粒。通過給予加大量的微生物，同時使用高拷貝的質粒，這樣質粒DNA就可以被腸道細胞攝取並被在細胞內表達。
應用質粒轉化大腸桿菌已為本領域內所熟知，在這裡不需要進一步的解釋。可以應用Leer等人描述的方法，以有限的自分解方式對LAB進行轉化，我們通過參考該文獻(WO095/35389)全文而使之呈為一體。根據下列文獻中所公開的方法和技術，也可以對各種興趣LAB進行轉化，這些文獻在這裡被呈為一體，就象在這裡全面提出一樣。已經公開發表的PCT申請PCT/NL96/00409揭示了篩選非致病性細菌黏附於特異性黏膜受體的能力的方法，特別是篩選乳酸桿菌與Bifidobacterium屬LAB；同時也揭示了一種載體，它由一個表達啟動子序列(一種核酸序列)和容許核糖體識別與翻譯性能的序列組成。這一參考文獻表明乳酸桿菌的不同種系可以被轉化，以致表達包括致病性細菌蛋白的異源基因產物。PCT/NL95/00135說明了一種用於乳酸桿菌的多拷貝載體，它所包含的5』非翻譯核酸序列至少組成了核糖體識別與RNA穩定所需要的最小序列，緊隨該序列之後的是翻譯起始密碼子。而且，已經應用口服重組體L.lactis來誘導針對表達抗原反應的局部IgA和/或血清IgG抗體(Wells等人，Antonie van Leeuwenhoek 199670317-330)。此外，Casas等人在U.S.Patent No.6,100,388中說明可以應用異源DNA轉化L.reuteri，並且可以在細胞表面表達外源性蛋白質或者將其分泌；而EP1084709 A1揭示plantarum乳酸桿菌也可以被轉化，在細胞內或在細胞表面表達抗原片段。
酵母菌的轉化方法也已為本領域所熟知。例如，2002年10月25日歸檔的懸而未決的美國專利申請系列號10/280,769中附加了詳細的資料。再見ChristineGuthrie和Gerald Fink編著的《酵母菌遺傳學、分子與細胞生物學的指導》(2002)。這是酶學系列叢書中關於方法學的兩本。350卷和351卷，Academic Press出版，通過參考其全部而在這裡呈為一體。
除了上述參考文獻所揭示的載體以外，適合於LAB的其它質粒包括，例如pFXL03、pWV01、pGKV210及pVA838。來自乳酸桿菌和乳酸球菌的某些質粒也可以從DSMZ、Braunschweig和Germany獲得。其它的都在專著中進行了說明。例如，適合於酪蛋白乳酸桿菌的質粒載體在許多文獻中都又說明，包括Maassen C.等人的「口服疾病預防策略的手段表達破傷風毒素片段C的酪蛋白乳酸桿菌重組體疫苗接種或多發性硬化症中口服耐量感應的髓磷脂蛋白」Vaccine 17(17)2117-28(1999)。此外，適合於Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis的質粒載體在Geoffrey M.等人「應用綠色螢光蛋白標記乳酸菌以開發活疫苗載體」(Applied and Environmental Microbiology 66(1)383(2000))有說明解釋；Piard J.等人在「各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細胞壁」Journal ofBacteriology179(9)3068-72(1997)中對適於lactis乳酸球菌、酵素乳酸桿菌與sake乳酸桿菌的質粒載體進行了說明。有些質粒載體適合於寬範圍的乳酸桿菌種，如pPSC20和pPSC22，在Cocconcelli P.等人的文章「單鏈DNA質粒、載體結構和嗜熱硬脂桿菌α-澱粉酶在乳酸桿菌內的克隆」Res Microbiol 142(6)643-52(1991)中都得到了說明。也可以應用穿梭載體，它們是能夠在乳酸桿菌和大腸桿菌兩種細菌內表達的質粒；大腸桿菌/LAB穿梭載體在Maassen C.等人.，Vaccine，同上，中得到說明。因為操縱大腸桿菌的方法和技術很具特色，穿梭載體具有方便大腸桿菌基因改良及其後乳酸桿菌轉化工作的優勢。大腸桿菌E的載體和質粒已經為人們所熟知，並且具有豐富的可得資源，包括商業性資源。
質粒可以包含選擇性標誌基因或者包含報告基因，它們使確定哪些細菌含有預期質粒DNA的工作更為容易。可能的選擇性標誌基因是抗生素抗性基因，如卡拉黴素抗性基因，、四環素抗性基因和氨苄青黴素抗性基因或者是酶突變或酶缺陷，這種酶突變或缺陷能夠影響細菌代謝或合成某些營養成分的能力。β-半乳糖基因和編碼綠色螢光蛋白(GFP)的基因屬於報告基因的例子。相反，如果質粒沒有包含選擇性標誌基因或報告基因，則質粒DNA需要用多種方法如使用質粒DNA作探針的斑點印跡技術，才能被探測得到。
如果想應用的話，也可以使用在LAB和大腸桿菌細菌中進行原核表達的啟動子，這些啟動子在專著中均有說明解釋。例如，已為人們研究透徹的plantarum乳酸桿菌和lactis乳酸球菌兩種細菌的、並且已被證明對其它LAB中的表達也很有用的一種啟動子就是來自lactis乳酸球菌的尼生素可誘導的nisA啟動子(deRuyter P.等，「食品級尼生素誘導lactis乳酸桿菌的控制表達系統」Applied andEnvironmental Microbiology.623662-67(1996))。Kleerebezem M.，「乳酸菌的控制基因表達系統乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp可轉化的尼生素誘導表達盒」Applied and Environmental Microbiology 63(11)4581-84(1997)。L.plantarum ldhL啟動子也被成功地應用於L.plantarum。L.casei表達系統的啟動子包括來自L.casei的組成性乳酸脫氫酶啟動子與來自L.amylovorus的可調控澱粉酶啟動子(Maassen，等，Vaccine 17(17)2117-28(1999))。乳酸球菌啟動子P59已經被應用在各種lactis乳酸球菌和乳酸桿菌細菌中(Piard J.等，「各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細胞壁」Journal of Bacteriology 179(9)3068-72(1997))。此外，質粒可以含有均與編碼抗原序列聯合運作的多重啟動子。
本發明的一個實施方案中，DNA結構可以是一個質粒，它至少編碼一個適當的預期細菌宿主的複製原點、一個可選擇性標誌基因和/或一個報告基因、一個啟動子，該啟動子與編碼抗原或治療性元件的異源核苷酸序列聯合發揮作用，而被編碼的抗原或治療性元件融合到表面結合或分泌信號序列。該結構也可以包含其它適當的元件，例如轉錄起始序列、錨定或分泌信號序列和轉錄終止序列。
用於LAB的質粒可以包括上述文獻中所揭示的已經存在的LAB質粒的修飾改良。特別是通過重組體DNA技術，對質粒載體進行修飾使其包含一個真核表達增強子和啟動子，例如CMV啟動子、RSV啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子或其它能夠在哺乳動物細胞內表達蛋白質的任何合適的啟動子。這種修飾也可以包括引入啟動子的5』非翻譯區域，例如用以加強哺乳動物細胞內表達的CMV啟動子的內含子A。而且，組成多聚腺苷酸(poly A)尾和多聚腺苷化信號的3』非翻譯區也可被包括在質粒中，目的是正確地加工處理質粒所表達的mRNA分子。在不需要在LAB中表達蛋白質的某些情況下，可以把除了複製原點序列和選擇性標誌之外的原核表達系統剔除。
這樣就可以應用真核表達的改良質粒來表達任何興趣蛋白質；這些蛋白質的例子包括報告蛋白質(例如，綠色螢光蛋白質(GFP)、螢光素酶、鹼性磷酸酯酶、CAT等)、治療性蛋白質(例如，胰島素、生長激素、幹擾素、促紅細胞生成素、filgastrim、細胞因子、白細胞介素、人類白蛋白、activase、維生素合成或乳糖消化酶(乳糖分解酶)、VIII因子和IX因子、完整抗體、抗體片段、抗生素、激素、信息素以及象降鈣素之類的其它小分子)。為提高機體對免疫原性蛋白質的免疫原反應，抗原可以與白細胞介素-2共表達，二者在分離的載體內或者在同一個載體不同表達盒內，或者通過雙順反子表達的IRES序列。例如見，Chow Y.H.等，(1997)「應用B型肝炎表面抗原和白細胞介素-2共表達質粒改進B型肝炎病毒DNA疫苗」，J.Virology，Vol.71，No.1，169-178。
為把所翻譯的蛋白質分泌到細胞外環境中去，可以將適當的分泌信號合併到目的多肽中去。這些信號可以是多肽內生性的，或者是異源信號。因而，可以應用分泌信號來使終末蛋白質的傳輸更容易進行。分泌肽的編碼序列與蛋白質編碼序列的5』末端聯合發揮作用，這一雜交核酸分子被嵌入到選定質粒中去，該質粒是為將來在所選宿主細胞內進行蛋白表達而設計的。被特異性設計為表達和分泌外源性蛋白質的質粒可以從許多商業途徑購買得到，例如可以從Invitrogen公司買到pSecTag2載體。因為腸道細胞是有極性的，所以也可以應用適當的頂部靶向或基側部靶向的信號序列。
此外，也可以應用重組DNA技術對質粒載體進行改良修飾，以包含一個病毒複製原點，如源自Epstein-Barr病毒的oriP/EBNA-1蛋白。Huertas D.等，「源自游離基因oriP-EBNAI-YACs的人類CFTR基因在鼠細胞內的表達」HumanMolecular Genetics，2000，Vol.9，No.4，617-629。具備了病毒複製原點，質粒就可以在哺乳動物細胞內以穩定的游離基因形式存在，這是因為它與內源性DNA一起複製並且通過粘著於宿主染色體而分離。這樣就使得質粒能夠生存較長的時間，從而使特定的蛋白質長時間表達。
本發明的一個實施方案，就如上面所述，可以通過用溶菌酶處理細菌而製備原生質體而得到改良微生物，就象在下面要討論的範例I中例證的那樣。原生質體培養物就可以通過口服攝取；在原生質體通過胃並進入腸道內的過程中，滲透壓和/或膽汁鹽觸發原生質體突然破裂並釋放質粒DNA。為提高原生質體經受住胃內的胃酸作用的機會，必須應用各種載體與緩衝物對原生質體進行配方設計，保護它在胃內免受胃酸的侵蝕。例如，經常用在抗酸劑中的NaHCO3可以被用作設計原生質體的緩衝劑，此時原生質體被設計為可用於口服的等滲溶液中。其它的例子包括將原生質體配製在凝膠體中，如瓊脂糖凝膠、白明膠等。
又一個實施方案，細菌溶解是通過細菌培養物與噬菌體一起感染而發生的。噬菌體的例子包括，但不局限於φadh、φLC3、mv4、M13、T4、φ29、Cp-1、Cp-7與Cp-9。在攝取細菌培養物之前，細菌細胞必須為足夠數量的噬菌體感染。由於在細菌感染與細菌溶解之間有一個時間滯後差，這就有了足夠的時間讓細菌細胞在溶解發生之前向下運行進入腸道。可選擇的另一種方法是，噬菌體在首次感染數小時或數天之後才被引入。在這後一種實施方案中，細菌培養物的首次感染是允許細菌移植於腸道，並且大量增殖；然後在給予第一培養物數小時或數天之後給予被噬菌體感染的第二種細菌培養物；當噬菌體在腸道內溶解細胞時，噬菌體顆粒可以進一步感染腸黏膜中的細菌細胞，這就極大地提高了腸道內的質粒DNA。
本發明的再一個實施方案，可以通過基因工程設計改變LAB，使它能夠在可誘導的啟動子控制下表達自體溶解基因。通過使用可誘導的啟動子，自體溶解基因就可以在適當的時間、在胃腸道內適當的位置被觸發、表達，進一步溶解細菌細胞。自體溶解基因的例子包括，但不局限於AcmA(Buist G.等，(1997)「通過誘導自身的主要自溶素AcmA過度形成而引起的lactis乳酸球菌自身溶解」Appl.Environ.Microbiol，632722-2728)、holin與細胞溶解酶(Henrich B.等，(1995)「乳酸球菌gasseri噬菌體φadh自溶基因的一級結構和泛函分析」J.Bacteriology，Vol.177，No.3，723-732)，通過參考文獻而使它們在這裡呈為一體。
在機體腸道內發生細菌自溶解更為可取，這樣就會使得腸道細胞可以攝取質粒。用於自溶解基因的可誘導啟動子的例子包括，但不局限於pH可誘導啟動子，這在頒布給Kullen等人的U.S.Patent No.6,242,194中有詳細說明，也在這裡通過參考文獻而使之呈為一體，就象在這裡完全提出的一樣；乳糖可誘導啟動子，例如，用於大腸桿菌質粒的啟動子(如，源自Stratagene的pBluescript)或乳酸桿菌的內生性乳糖啟動子；厭氧生長期誘導的啟動子，例如醇脫氫酶啟動子(adhE)，這在AristarkhovA等人的「埃希氏大腸桿菌體內產生醇脫氫酶的adhE轉錄抄本的翻譯需要核糖核酸酶III的分裂」J.Bacteriology，Vol.178，No.14，4327-4332。就乳糖而言，誘導自溶解基因需要在攝取細菌培養物之後攝入乳糖，如給予牛奶或酸奶酪；可以在攝取細菌培養物數小時甚至數天之後再給予乳糖，以使LAB重組體於腸道內進一步在數量上增殖。在adhE啟動子存在的情況下，該啟動子在腸道內被誘導是由於腸道內的厭氧條件所致。
自溶解基因和可誘導啟動子，二者一起被稱為表達盒，可能是在用於細菌轉化的質粒的一部分。另一方面，自溶解基因表達盒可能更適合於整合進入所使用的LAB染色體DNA中。可以通過自溶解基因表達盒兩側的側翼DNA序列來完成進入染色體的整合，表達盒兩側的側翼DNA序列與染色體內靶序列是同源的。由側翼DNA序列和自溶解基因組成的整個結構就可以被用來轉化微生物。通過同源重組，自溶解基因就可以整合進入LAB的基因組(染色體組)。通過同源重組修飾改良細菌種屬的上述方法，已經被廣泛地應用於大腸桿菌細胞，並且同樣可以被應用於LAB。
編碼抗原或治療性元件以及表面結合啟動子區域的核苷酸序列，可以用多種方法進行準備。可以從任何自然資源中分離獲得這些序列，或者利用已經為人們所熟知的DNA合成技術通過人工合成而獲得這些序列。這些序列就可以被整合進入質粒，然後利用此質粒轉化所選定的細菌宿主。最近，分子生物學在重組體蛋白質生產方面的進展使得在微生物體外表面表達蛋白質成為可能，這是利用一種被稱為「細胞表面展示」的技術來完成的。編碼表面結合啟動子區域的序列需要與抗原序列融合，這樣就使得改良的乳酸桿菌生物體能夠在自身表面表達抗原。這種表面結合啟動子區域的例子是那些用在PCT/NL96/00135所說明的結構中的區域，以及Dieye Y.等在「乳酸菌蛋白靶向系統的設計」中所說明的那些區域，Journal of Bacteriology，183(14)；4157-66(2001)。
被研究的首批表面表達系統之一是George P.Smith在20世紀80年代中期開發的，他能夠表達與絲狀噬菌體pIII融合的肽或小分子蛋白質(見Smith G.P.，Science，2281315-1317，1985)。從那時開始，人們已經研究了微生物體內表達和分泌異源蛋白質的各種系統，以開發新的、比較好的細胞表面展示與分泌系統，可以通過該系統將興趣蛋白質表達在微生物機體表面或將其分泌。目前，發明人正在利用內生性表面蛋白作為表面錨定主體，研究細菌和酵母菌在細胞表面穩定表達蛋白質和多肽方面的應用。
細菌，特別是象大腸桿菌這樣的革蘭氏陰性細菌，具有獨特且複雜的細胞包膜結構，它可能是由內層細胞膜、外周細胞質與外層細胞膜組成；因此，要想把外源性蛋白質有效地轉運到細胞膜表面，需要一個表面錨定主體。所以為了表達外源性肽或蛋白質，適當的細菌表面蛋白質必需與外源性興趣蛋白質在基因水平上融合，並且所表達的融合蛋白必須通過內層細胞膜和外層細胞膜到達細菌表面，並被錨定在細菌表面。
考慮到這些因素，一個表面錨定主體需要具有幾個關鍵性特徵。首先，要被用作錨定主體的表面蛋白需要具有一個足夠的分泌信號序列基序來支持外源性蛋白質通過細胞內層細胞膜的轉運；第二，也需要一個將外源性蛋白質錨定到細胞表面的靶信號；此外，完整的融合主體不僅需要具有調節提供各種大小的外源性蛋白質或肽類的能力，而且要具有能夠大量地表達這些物質的能力。
已經被研究開發的細胞表面展示系統基本上有三組C-末端融合、N-末端融合與夾心融合(三明治融合)。首先，如果天然的表面蛋白在其N-末端內具有一個不連續的定位信號，則可以使用一個C-末端融合基序把外源性肽融合到那一功能性部分的C-末端；例如，在大腸桿菌中開發的Lpp-OmpA基序就是利用C-末端融合系統(見Georgiou G.等人，Protein Eng.，9239-247，1996)。第二，已經開發了一個N-末端融合基序，它含有一個C-末端分類信號將外源性蛋白質導航到細胞壁；已經開發N-末端融合基序的細菌範例包括金黃色葡萄球菌蛋白A(見Gunneriusson等，J.Bacteriol.，1781341-1346，1996)、金黃色葡萄球菌fibronectin結合蛋白B(見Strauss A.等，Mol.Microbiol.，21491-500，1996)以及鏈球菌生膿原絲狀M蛋白(見Pozzi G.等，Infect.Immun.，601902-1907，1992.)。但是，如果表面蛋白不含有這樣的錨定區域，則需要裝配整個結構；為此開發了夾心-融合系統，外源性興趣蛋白質被插入到表面蛋白主體；使用這一系統的幾個例子包括大腸桿菌PhoE(見Agterberg M.等，Gene，8837-45，1990)、FimH(見Pallesen L.等，Microbiology，『1412839-2848，1995)以及PapA(見Steidler L.等，J.Bacteriol.，1757639-7643，1993)。利用這些機制，掌握該領域普通技術的人們就能夠修飾改良給定細菌(如，鏈球菌和乳酸球菌)的特定表達系統從而達到本發明的目的，也就是表達、分泌和/或細胞表面展示各種抗原性和/或治療性元件。
為了把所翻譯的蛋白質分泌到細胞外環境中去，可以將適當的分泌信號整合到目的多肽中；這些信號可以是多肽內生性的，也可以是異源信號。因此可以使用分泌信號而使終末蛋白質的傳遞更為容易。分泌肽的編碼序列與蛋白質編碼序列的5』末端聯合運作，這一雜交的核酸分子被插入到所選擇的適合於在所選宿主細胞內表達蛋白質的質粒中。可以從許多商業途徑得到質粒，特別是為表達和分泌外源性蛋白質而設計的質粒。例如，如果想應用大腸桿菌的表達系統來表達和分泌蛋白質，通常使用的質粒包括pTrcPPA(Pharmacia)、pPROK-C和pKK233-2(Clontech)以及pNH8a、pNH16a、pcDNAII和pAX(Stratagene)或其它質粒。其它的分泌信號系統是Dieye Y.等人在「乳酸菌蛋白靶系統的設計」Journal ofBacteriology183(14)；4157-66(2001)中解釋說明的那些系統，例如，來自鏈球菌致熱原的M6前蛋白；以及Ravn P.等人在「TnINuc的研究進展及其在分離Lactis乳酸球菌的新穎分泌信號中的應用」Gene242347-356(2000)中提出的那些系統，如被信號肽酶I或信號肽酶II所識別的SP13、SP10、SP307與SP310。
因而，本發明在一個方面實施方案了在宿主生物體內生產異源蛋白質的方法，通過宿主的分泌途徑加工處理蛋白質。分泌是通過用包含一個DNA結構的質粒對宿主生物體(如，大腸桿菌)進行轉化而實現的，該DNA結構含有與編碼分泌信號肽的DNA序列聯合運作的轉錄啟動子，比如BAR1 C-末端區域的那一部分，或者能夠導航異源蛋白質或多肽輸出的金黃色葡萄球菌蛋白A。
已經說明的、應用在大腸桿菌中的其它各種分泌系統的例子包括美國專利號4,336,336(1979年1月12日歸檔)，歐洲專利申請發表號184,169(1986年6月11日發表)、177,343(1986年4月9日發表)以及121,352(1984年10月10日發表)，Oka T.等(1985)、Gray G.L.等(1985)、Ghrayeb J.等(1984)與Silhavy T.等(1983)。這些系統大部分是應用如下發現某些細菌蛋白質在正常情況下被細胞輸出到非細胞質區域，而一個出現在這些細菌蛋白氨基NH2-末端上的短(15-30)的胺基酸序列，對以相似的方法將異源蛋白質轉運到非細胞質區域是非常有用的。這些短的胺基酸序列通常被稱為「信號序列」，因為它們發出信號將蛋白質從細胞質中轉運到非細胞質區域。在革蘭氏陰性細菌中，這樣的非細胞質區域包括內層細胞膜、周質間隙、細胞壁和外層細胞膜。在剛剛早於或者在蛋白質轉運出細胞質的過程中，信號序列去除的典型方式是通過某點上肽切割，這樣就將成熟的蛋白質留在了預期的非細胞質區域。信號序列點特異性的去除，在這裡也指信號序列精確的加工處理過程，如果希望正確的蛋白質被轉運到預期的非細胞質區域，這是一首選的事情。
因此，本發明在這方面同通過與大腸桿菌細菌融合而被改良的嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌生物體有關，所使用的大腸桿菌包含一個編碼異源核酸的質粒，該異源核酸與能夠在改良的宿主細菌體內驅動基因元件表達的啟動子聯合發揮作用。依據本發明的一個獨特實施方案，異源核酸是編碼抗原的多聚核苷酸序列，該抗原可以被分泌或者出現在細菌的細胞表面；無論是哪種情況，編碼異源核酸的質粒都將包含適當的分泌或錨定序列信息，而這些信息是分泌或向細胞表面轉運與表達所必需的。據此，在融合體內所產生的蛋白質或肽片段構成了能夠在與機體的免疫相關細胞接觸時誘發免疫反應的抗原。
在蛋白質被分泌時，預期的相關免疫細胞是分泌IgA抗體的細胞，但是也很有可能出現下面的情況分泌的抗原性片段被Peyer’s斑內的M細胞吞噬，抗原性蛋白質或片段在這種情況下可能與M細胞口袋內的各種成分接觸，包括CTL、B細胞、巨噬細胞和樹枝狀細胞，因此誘導黏膜免疫反應。當蛋白質或抗原性片段被錨定並呈現在融合體細胞表面時，抗原性片段可以直接與M細胞表面細胞膜接觸，因而直接與M細胞的各種成分相互作用，直接誘發黏膜免疫反應。
根據本發明的另一個獨特實施方案，異源核酸是編碼治療性蛋白質或肽片段的多聚核苷酸序列，這些蛋白質或肽片段或者被分泌或者被展示在細菌細胞表面。無論是哪種情況，編碼異源基因元件的質粒都將包含適當的分泌或錨定序列信息，而這些序列信息是分泌或向細胞表面轉運與表達所需要的。根據這一實施方案，融合體內所產生的蛋白質或肽片段組成了治療劑，這樣在異源核酸得以表達時它就產生減輕和/或糾正疾病狀態所必需的蛋白質或蛋白片段。特別是，異源核酸編碼一種能夠被分泌到呼吸道內腔中去的蛋白質例如胰島素，這就是為什麼當蛋白質被分泌時它能夠被吸收並且減輕、糾正疾病狀態，如糖尿病。
根據上面的簡要論述，依據本發明的規範，也可以應用由細菌-細菌組成的融合體。可以將具有適當表達系統的幾種不同的細菌與非致病性鏈球菌或乳酸球菌細菌融合而產生預期的改良LAB生物體。本發明中可取的一方面，鏈球菌或乳酸球菌細菌與大腸埃希氏菌(coli)融合；通常用於分子克隆技術的幾種不同的coli菌種是HB101、C600、DH1、DH10B、DH5、α5與β10。優先選擇上述菌種，是因為可以很容易地得到它們生產和表達異源核酸所需要的表達系統，這些表達系統都已經被詳細地說明並且可以通過商業渠道獲得。
本發明中，一個菌種的細菌與不同菌種的細菌相融合。具有已經報導的表達系統的兩個獨特菌種是嗜酸乳酸球菌和枯草桿菌。Cocconcelli PS.等，「單鏈DNA質粒、載體結構和嗜熱硬脂桿菌α-澱粉酶在乳酸桿菌內的克隆」Research inMicrobiolog；y 142(6)643-52(1991)和Kleerebezem M.等「乳酸菌的控制基因表達系統乳酸球菌、Leuconostoc以及spp.乳酸桿菌可轉化的尼生素誘導表達盒」Applied and Environmental Microbiology63(11)4581-84(1997)。
一個方面，本發明的表達系統含有一個DNA結構，至少由一個編碼目的抗原或治療性基因的核酸序列組成，它發揮作用時與可以指導細菌宿主體內異源序列表達的啟動子相關聯。編碼抗原性或治療性片段的多聚核苷酸可能包含編碼成熟多肽或其一個片段的編碼序列，該序列獨自發揮作用，或者是在閱讀框內編碼成熟多肽或其一個片段的編碼序列與其它編碼序列共同作用，如編碼複製原點、錨定點、引導或分泌序列、前蛋白(或副蛋白)或其它融合肽片段的序列。比如，可以編碼標誌序列，後者使得我們更容易選擇融合多肽。多聚核苷酸也可以包含非編碼5』與3』序列，如轉錄的非翻譯序列、拼接與多聚腺苷化信號、核糖體結合位點以及穩定mRNA的序列。
另一方面，LAB(如嗜熱或lactis菌種)與大腸桿菌融合，該融合方法可以使嗜熱或lactis細菌表達由大腸桿菌相關DNA編碼的抗原性或治療性蛋白質或多肽。更有價值的是，抗原性多肽可以被表達在LAB-大腸桿菌融合體表面，而治療性蛋白質則可以被分泌。因而，含有編碼錨定、分泌、引導胺基酸序列的附加多聚核苷酸序列或增加體內產物穩定性的附加序列通常是很有利的，。這樣所產生的由多肽片段構成的蛋白質要麼被表達在LAB-大腸桿菌融合體細胞表面、要麼被分泌，並由此引起免疫或者治療反應。
典型的多肽片段包括，例如編碼能夠被機體的各種免疫起動細胞特別是M細胞、IgA和IgG細胞所識別的抗原決定簇的那些片段，它們在動物體內尤其在人類體內具有抗原性或免疫原性。特定序列或片段的不同變異體也構成了本發明的一部分；首選的變異體是那些將其保守胺基酸替換者；其它可選擇的片段包括具有生物學活性的治療性片段，它們調節生物學活性，包括相似的或者加強的活性、降低不需要的活性。這些多肽片段保留抗原或治療劑的生物學活性，包括抗原性活性。
本發明獨特的一方面是，它與包含一種或多種抗原性或治療性多聚核苷酸的大腸桿菌起源的載體以及宿主嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌細胞有關，宿主嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌細胞是通過與大腸桿菌細胞載體融合由遺傳工程設計生產的，本發明還與由宿主LAB-大腸桿菌融合體細胞編碼的抗原性或治療性多肽的生產與表達有關。具有適當表達系統的合適的大腸桿菌細胞可以通過多種商業渠道購買得到或者由遺傳工程設計生產而得，並且與本發明的抗原性或治療性多聚核苷酸的表達系統或表達系統的一部分合成一體。
將多聚核苷酸引進大腸桿菌細胞可以通過許多標準實驗室操作手冊(如Davis等，分子生物學的基本方法(1986)以及Sambrook等，分子克隆法實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))中所介紹的方法來完成，例如磷酸鈣轉染法、DEAF-葡聚糖介導的轉染法、顯微注射法、脂質陽離子介導的轉染法、電穿孔法、轉換、擦痕裝載法、彈道導入或感染。用以與大腸桿菌細胞融合併且在體內生產抗原性和治療性蛋白質和/或多肽的合適的LAB宿主代表性範例包括嗜熱鏈球菌或lactis乳酸球菌以及乳酸桿菌細胞如acidophilus、brevis、casei、delbrueckii、fermentum或plantarum。
更為獨特的是本發明所使用的重組大腸桿菌載體，已經被以正向或反向插入了由DNA、cDNA或RNA序列組成的抗原性或/和治療性結構。所插入的結構進一步組成調節序列，比如包括與遺傳序列關聯運作的啟動子，這一方面更有實用價值。很大數量的合適的質粒和啟動子為業內人士所熟知，和/或如下所述，並且可以從商業渠道獲得。
因此本發明還體現一個方面，DNA結構可以是一個質粒，它至少編碼一個適當的預期細菌宿主的複製原點、一個可選擇性標誌基因和/或一個報告基因、一個啟動子，該啟動子與編碼抗原或治療性元件的異源核苷酸序列關聯運作，而被編碼的抗原或治療性元件融合到表面結合啟動子或錨定點區域。該結構也可以包含其它適當的元件，例如轉錄起始序列、分泌信號序列和轉錄終止序列。根據它們在宿主細菌體內複製的能力而生產或製造質粒。當表達系統來自大腸桿菌時，啟動子與核苷酸序列可以被克隆進入其中的質粒載體包括，例如pUC18、pUC19、pBR322及pBluescript。適合於LAB的適當質粒包括，例如pFXL03，pWV01，pGKV210和pVA838。來自乳酸桿菌和乳酸球菌的某些質粒可以從DSMZ，Braunschweig，Germany處購的。其它的質粒在專著中都有說明。例如，適合於酪蛋白乳酸桿菌的質粒載體在許多文獻中都又說明，包括Maassen C.等人的「口服疾病預防策略的手段表達破傷風毒素片段C的酪蛋白乳酸桿菌重組體疫苗接種或多發性硬化症中口服耐量感應的髓磷脂蛋白」Vaccine 17(17)2117-28(1999)。此外，適合於Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis的質粒載體在Geoffrey M.等人「識別正在開發的活疫苗載體乳酸菌種的綠色螢光蛋白的應用」(Applied andEnvironmental Microbiology 66(1)383(2000))有說明解釋；Piard J.等人在「各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細胞壁」Journal of Bacteriology179(9)3068-72(1997)中對適於lactis乳酸球菌、酵素乳酸桿菌與sake乳酸桿菌的質粒載體進行了說明。有些質粒載體適合於寬範圍的乳酸桿菌種，如pPSC20和pPSC22，在Cocconcelli P.等人的文章「單鏈DNA質粒、載體結構和嗜熱硬脂桿菌α-澱粉酶在乳酸桿菌內的克隆」Research in Microbiolog；y142(6)643-52(1991)中都得到了說明。也可以應用穿梭載體，它們是能夠在用以產生融合體的雙親細菌中表達的質粒；這種情況下，適當的穿梭載體要含有來自兩個融合菌種的複製原點；適用於LAB的適當穿梭載體包括pFXL03、pWV01、pGKV210、pVA838和pNZ123。此外，大腸桿菌/LAB穿梭載體在Maassen C.等人.，Vaccine，同上和Bringel等人的「來自乳酸桿菌plantarum CCM 1904的pLP1質粒在乳酸桿菌中的特性、克隆、加工與分布及其在穿梭載體構建中的應用」Plasmid，22(3)193-202(1989)中得到說明。
質粒可以包含選擇性標誌基因或報告基因，它們使我們更容易確定那些細菌包含有預期質粒DNA。可能的選擇性標誌基因是抗生素抗性標誌，如卡拉黴素抗性基因，、四環素抗性基因和氨苄青黴素抗性基因；β-半乳糖苷酶基因和編碼綠色螢光蛋白(GFP)的基因就是報告基因的例子。相反，如果質粒沒有包含選擇性標誌或報告基因，則質粒DNA只能以不同的方法檢測，如使用質粒DNA作為探針的斑點印跡法。
需要根據宿主細菌及要表達的抗原來選擇啟動子。可以使用於大腸桿菌表達系統的啟動子包括λ-PR、PL與Trp以及T3、T7、gpt、SP6和lacZ啟動子或乳糖操縱子。文獻中已經說明了各種乳酸桿菌和乳酸球菌細菌的啟動子。例如，已為人們研究透徹的plantarum乳酸桿菌和lactis乳酸球菌兩種細菌的、並且已被證明對其它LAB中的表達也有用的一種啟動子就是來自lactis乳酸球菌的尼生素可誘導的nisA啟動子(參見deRuyter P.等人的.，「食品級尼生素誘導嗜酸乳酸桿菌的控制表達系統」Applied and Environmental Microbiology.623662-67(1996)；Kleerebezem M.，「乳酸菌的控制基因表達系統乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp可轉化的尼生素誘導表達盒」Applied and EnvironmentalMicrobiology63(11)4581-84(1997))。L.plantarum ldhL啟動子也被成功地應用於L.plantarum。L.casei表達系統的啟動子包括來自L.casei的結構性乳酸脫氫酶啟動子與來自L.amylovorus的可調控澱粉酶啟動子(Maassen，等，Vaccine17(17)2117-28(1999))。乳酸球菌啟動子P59已經被應用在各種lactis乳酸球菌和乳酸桿菌細菌中(Piard J.等，「各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細胞壁」Journalof Bacteriology 179(9)3068-72(1997))。此外，質粒可以含有均與編碼抗原序列聯合運作的多重啟動子序列。這樣載體中的每一個啟動子都與用來製造該融合體的雙親細菌中的至少一個相兼容，並且如上所述，質粒可以包括多重複制原點，如來自每一雙親細菌種的複製原點。
在抗原性多肽要被表達時，通常情況下，如果能使多肽產生並被展示於細胞表面，這種情況是首選的。最近，分子生物學在重組體蛋白質產物方面的進展使得在微生物體外表面表達蛋白質成為可能，這是利用一種被稱為「細胞表面展示」的技術來完成的。編碼表面結合啟動子區域的序列需要與抗原序列融合，這樣就使得改良的乳酸桿菌生物體能夠在自身表面表達抗原。這種表面結合啟動子區域的例子是那些用在PCT/NL96/00135所說明的結構中的區域，以及Dieye Y.等在「乳酸菌蛋白靶向系統的設計」中所說明的那些區域，Journal of Bacteriology，183(14)；4157-66(2001)。
釀酒酵母菌是一種被認為與人類表達系統兼容的酵母，因為它具有與人類表達系統如此的相似性，如細胞周期、染色體結構和RNA拼接。本發明人已經選定方向來研究一種利用該酵母的表達系統，由於該酵母菌具有進行翻譯後修飾的能力，例如，對所產生的蛋白質進行乙醯化作用、磷酸化作用以及糖基化作用修飾，它們的作用方式與哺乳動物細胞的作用方式相當相似。因此，人們希望利用釀酒酵母菌作為在動物體內表達外源性蛋白質的宿主，產生與其自然形式更為接近的基因產物，就象動物細胞產生的蛋白質一樣。因為就其培養方式而言，釀酒酵母菌與其它的酵母和細菌具有很多相似之處，關於其它微生物的應用知識以及用來操縱它們的微生物學方法和DNA重組技術，都可以很容易地被用來在使用釀酒酵母菌的表達系統內生產外源性蛋白質。
已經在釀酒酵母在內的酵母內生產出了各種蛋白質，尤其是被用作藥物的那些蛋白質，其安全性已經被廣泛認識(Marten Seo，第7章，生產rDNA的表達系統和程序，Hatch等編著，ACS Symp.Ser.，477(1991))。來自酵母菌的生產和分泌預期蛋白質的表達和分泌載體質粒包含有一個轉錄啟動序列(啟動子)、編碼分泌信號肽的DNA、編碼目的蛋白質的結構基因和轉錄終止子，如果有必要的話，還可以含有一個報告基因。如果想要使蛋白質或肽片段被展示在酵母融合體的細胞表面，蛋白質或肽片段的編碼序列就必須分別在5′和3′末端同分泌信號序列和合適的錨定序列融合。
這類載體的轉錄啟動序列(啟動子)，已被應用者有GAPDH、MF.α-1啟動子或PGK(Loison等，Korean Patent Laid-open Publication Nos.88-7727 and88-700234；Bio/Technol.，6，72(1988))、GAPDH、雜交因子-α.(MF.α.-1)、PH05(Meyhack等，Korean Patent Laid-open Publication Nos.86-381 and 87-6185；工業微生物的遺傳學和分子生物學，Hershberger等人編著，American Society ofMicrobiology出版，pp.311-312(1989))以及GAL啟動子序列(Johnston，Microbiol.Rev.，51，458-476(1987))，例如，在培養介質中由半乳糖誘導而成的GAL1。
關於分泌信號，目前用於異源性蛋白質分泌的來自酵母菌的分泌信號肽包括轉化酶信號肽(U.S.Pat.No.5,010,003)、酸性磷酸酯酶信號肽(U.S.Pat.No.5,013,652)、雜交因子-α.的prepro引導肽(ppL)(U.S.Pat.No.4,588,684)。在這些各種各樣的分泌信號肽中，ppL的應用最為廣泛。就細胞壁錨定序列而言，可以被融合(與酵母菌分泌信號相關聯)到抗原上以實現在細胞壁上的細胞表面展示的各種序列包括Gas1p的羧基末端部分(編碼最後252個胺基酸的序列)或Yap3p的羧基末端部分(編碼最後35個胺基酸的序列)。詳細資料請參閱de Sampaio G.等，「釀酒酵母菌中GPI錨定點的組成必作用細胞壁靶向」MolecularMicrobiology34(2)247-56(1999)；也可參見Van Der Vaart等「發揮異源蛋白質細胞表面表達錨定點作用的釀酒酵母菌細胞壁蛋白的比較」Applied andEnvironmental Microbiology63(2)615-620(1997)。
因此，本發明的一個獨特實施方案是，它同通過與大腸桿菌細菌融合而被改良的酵母菌生物體有關，所使用的大腸桿菌包含一個編碼異源基因元件的質粒，該異源基因元件與能夠在改良的宿主酵母菌體內驅動基因元件表達的啟動子聯合發揮作用。可以使用能夠被RNA聚合酶II所利用的各種啟動子，這些啟動子是可以誘導的例如GAL、GAL10、PH05及相似者，或者它們是組成性的例如ADH1、TPI、PGK及類似者。而且，可以被使用的各種載體包括，但不局限於PBM150、PYEP51、PLGSD5、YEP62、PAAH5及類似物；此外，編碼異源基因元件的質粒也可以包含選擇性標記，例如URA3、LEU2、HIS3、TRPI及其類似物。
根據這一獨特實施方案，異源基因元件是編碼抗原的多聚核苷酸序列，所產生的抗原或者被分泌，或者被展示在細菌的細胞表面。無論是哪種情況，編碼異源基因元件的質粒都將包含分泌或向細胞表面轉運與表達所需要的適當的分泌或錨定序列信息。據此，在融合體內所產生的蛋白質或肽片段構成了能夠在與機體的免疫相關細胞接觸時誘發免疫反應的抗原。
根據本發明的另一個獨特實施方案，異源基因元件是編碼治療性蛋白質或肽片段的多聚核苷酸序列，這些蛋白質或肽片段或者被分泌或者被顯示在細菌細胞表面。無論是哪種情況，編碼異源基因元件的質粒都將包含分泌或向細胞表面轉運與表達所需要的適當的分泌或錨定序列信息。根據這一實施方案，融合體內所產生的蛋白質或肽片段組成了治療劑，這樣在異源核酸得以表達時它就產生減輕和/或糾正疾病狀態所必需的蛋白質或蛋白片段。特別是，異源基因元件編碼一種能夠被分泌到腸道黏膜內腔中去的蛋白質例如胰島素，這就是為什麼當蛋白質被分泌時它能夠被吸收並且減輕、糾正疾病狀態，如糖尿病。
本發明的一個實施方案，重組LAB、融合體及酵母菌可以被導航至M-細胞，例如與腸黏膜內Peyer’s有關的那些M-細胞。在黏膜上皮襯層中，有少量的淋巴組織構成系統的黏膜淋巴濾泡-相關上皮(FAE)組織。儘管大分子物質和微生物不能通過襯於腸道黏膜的上皮組織入侵，但是在象位於腸道內的Peyer’s斑這樣的黏膜誘導點中，淋巴FAE包含微褶皺或M細胞，微褶皺或M細胞可以轉運抗原及微生物以進行抗原攝取；簡單上皮內的M細胞僅僅發生於機體系統的淋巴濾泡。因而在富含M細胞的FAE位點內，存在著專化上皮與抗原提呈細胞及淋巴細胞之間的高度進化(強化)了的協作(協同作用)。通過活躍的跨上皮細胞的小泡轉運，M細胞把來自內腔的大分子物質、顆粒以及微生物經由其細胞質直接轉運到上皮內的黏膜淋巴濾泡和機體的系統黏膜淋巴組織，該淋巴組織能夠處理抗原並且激發能夠引起分泌免疫的黏膜免疫反應，分泌性免疫反應使得腸道黏膜和肺臟黏膜表面浸浴在保護性抗體之中。所以，這些淋巴組織也是抗原、細胞、抗體以及存在於淋巴系統內、最後出現在血液中的其它任何蛋白質進入機體循環的通路。
所以M細胞提供了上皮屏障內用以進行小泡轉運的局部、功能性通道(口穴)。M細胞直接局限於淋巴濾泡(FAE)位點，通過及時將這些物質暴露於吞噬細胞和抗原提呈細胞，從而減少了通過上皮屏障轉運外源性物質和微生物的固有危險。M細胞朝向內腔的頂部表面不同於周圍的其它細胞它們缺乏典型的刷狀緣，而有不定的微絨毛，或擁有有龐大微絨毛內吞區域的微褶皺。M細胞的基部內陷形成了自身特徵，這是上皮內的「口袋」或空間，它們既縮短了跨細胞囊泡從細胞頂部到基側部所必須通過的距離，同時又為B細胞和CD4T細胞之類的淋巴細胞、巨噬細胞以及樹枝狀細胞的聚集提供了入塢位點。M細胞也有延伸到潛在淋巴組織的基本的推移活動，它們在這裡與淋巴細胞或/和抗原提呈細胞直接接觸，這好象是對M細胞轉運後的抗原提呈起到一定的作用。
M細胞以幾種不同的跨細胞方式參與如下過程外源性物質轉運到細胞漿管、囊泡以及位於M細胞頂部胞漿中的大的多囊泡體中去，及其後通過細胞外分泌作用將這些物質釋放到口袋中去的過程。粘附性病毒與高分子物質是通過粘附性細胞內吞作用而被攝取的，這種細胞內吞作用是由籠合包被的凹陷與囊泡進行的；而非黏附性物質的攝取是經過液相細胞內吞作用完成的，液相細胞內吞作用的囊泡是以包被或非包被的形式存在。大的黏附性顆粒與細菌觸發吞噬作用，這包括細胞處理過程的延伸以及膜下肌動蛋白網的重組。
M細胞引導完整的大分子物質由屏障一邊向另一邊轉運的能力包括膜性小泡的定向運動。儘管這種轉運在M細胞中的分子機制尚未明確，但是我們可以有把握地推測M細胞介導的膜性轉運依賴於極化上皮細胞所具有的特徵即極化的組織結構和信號傳導網絡來完成的。跨上皮小泡轉運是內吞物質的主要途徑，這使得M細胞在上皮細胞中獨具特色。研究表明在M細胞頂部表面形成的內吞小泡首先將其內容物轉移到頂部細胞漿中的內涵體，內涵體酸化其內含物且包含有蛋白酶。
B細胞是M細胞口袋中的主要成分之一，口袋中的B細胞表達IgM而不表達IgG或IgA，提示存在記憶B細胞或/和原始B細胞在此發生分化。記憶表現型的存在提示口袋中的細胞自身就已經為重新暴露於入侵抗原做好了準備；研究表明轉移到M細胞口袋中去的B淋巴母細胞可以反覆暴露於抗原，延伸擴展免疫反應並且使之多樣化。但是緊鄰在FAE下面中，也會存在大量的其它B淋巴母細胞、輔助T細胞以及抗原提呈細胞，這就足以觸發免疫反應的發生。
穿越M細胞的腔內抗原被直接轉運到抗原處理細胞與抗原提呈細胞，緊接著遷移到定位於黏膜相關淋巴組織(MALT)中的潛在淋巴濾泡中抗原特異性淋巴細胞，MALT誘導細胞進一步增殖分化；因而，抗原與微生物通過M細胞的過程是黏膜免疫反應發生過程中至關重要的一步。該過程引起產生IgA的B細胞增殖分化，其中部分IgA-形成B細胞運動到脈管系統然後返回到黏膜表面，有效地激發了特異性的黏膜免疫反應。
黏膜免疫系統是由功能專一化的局部誘導位點(系統的黏膜相關淋巴組織，或O-MALT)和分布廣泛的效應位點(瀰漫性黏膜相關淋巴組織，或D-MALT)組成的，上皮屏障隔把它們均同黏膜表面抗原隔開。誘導黏膜免疫反應的第一步就是將抗原轉運通過上皮屏障。在誘導位點中處理和提呈抗原之後，定向IgA的抗原特異性B淋巴母細胞局部增殖分化並通過血流遷移到局部和遠處的黏膜及分泌腺組織；它們在這裡主要分化成產生IgA聚合體的漿細胞，漿細胞是D-MALT的重要組分，並且通過受體介導的跨細胞作用轉運通過上皮細胞進入腺體與黏膜分泌物中去 所以，黏膜免疫反應構成了機體防禦經黏膜轉運的病原體(如流行性感冒病毒)的第一道防線，並且對長期保護作用也是非常重要的。機體對抗病原體的黏膜防禦包括兩類先天屏障，即黏液、上皮組織以及先天性免疫機制之類的先天性屏障，以及適應性宿主免疫反應，後者在黏膜表面主要是由CD4+T細胞、分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)以及抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)組成。在健康的環境中，M細胞轉運以及由此引起的抗菌性S-IgA的分泌，都限制了黏膜疾病的強度與持續時間，並能防止再感染。
通過將改良微生物導航至腸道襯層，就使得來自真核質粒的抗原性蛋白質表達並被提呈給M-口袋內的免疫細胞。任何治療性蛋白質，如胰島素、生長激素、幹擾素等，都可以以相似的方式被表達並通過M-口袋分泌進入淋巴組織，進而進入血液循環。儘管M-細胞是首選的靶向細胞，但是質粒DNA也可以被轉導至腸道內的其它細胞，例如K-細胞和其它的快速分裂細胞。事實上，人們已經證實因子VIII和因子IX的表達，例如在快速分離的上皮細胞內首先在基側部方向(例如，遠離內腔並朝向底層的毛細血管和淋巴腺)分泌因子VIII和因子IX。因此人們可以預測，在M-細胞、K-細胞和其它腸道細胞內的分泌性治療蛋白質的表達會引起這些蛋白質出現在血流和循環中。見Lozier JN，「作為血友病基因治療靶子的腸道上皮細胞」Hum Gene Ther(1997)Aug 10；8(12)1481-90。為了進一步提高蛋白質向基側部分泌的靶向作用，可以使用靶向信號序列，例如，來自皰疹性口炎病毒糖類蛋白G的基側部特異性11胺基酸信號序列。Thomas與Roth，「來自皰疹性口炎病毒的糖類蛋白G細胞質區域內的基側部靶向信號一級結構序列與細胞內多種靶向主體相似，但有不同的靶向活性」J.Biol.Chem.，Vol.269，No.22，15732-15739(1994). 另一方面，某些蛋白質(例如，尼生素)被優先分泌到管腔內，這在自然情況下僅僅發生在乳酸桿菌表達的細菌素；這種情況下可以應用頂部表面特異性的信號序列。例如，來自Thy-1的glycosylphosphatidylinositol(GPI)附加序列可以與興趣蛋白質融合，以將特定的蛋白質導航至腸道黏膜細胞頂層。例如，已經證實GPI附加序列可以在培養物中引起極化腸道Caca-2細胞內所表達的蛋白質向頂部方向的轉運高於基側部方向轉運2.5倍。見Soole K.等，「極化的腎臟MDCK細胞和腸道Caco-2細胞內所表達的glycosylphosphatidylinositol錨定細菌蛋白的上皮分類」Journal of Cell Science，108，369-377(1995)，通過參考文獻而使之在此呈為一體。
M-細胞的靶向作用可以用多種方法來完成，包括使用與M-細胞表面複合物結合的複合物。這樣的複合物包括多肽(例如，M-細胞受體或表面抗原)、碳水化合物和glycoconjugates。M-細胞靶向作用可能包含與M-細胞特異結合的複合物，以及特異地結合到與M-細胞相關的組織細胞的複合物，例如腸道黏膜的上皮細胞。
與M-細胞結合的複合物的一個實例是由打靶M-細胞的細菌和病毒所產生的黏附素，例如耶爾森氏菌種和沙門氏菌typhi種。(Clark M.A.等，「M-細胞表面β1 integrin的表達及侵襲素介導的耶爾森氏菌假結核向鼠Peyer’s斑內M-細胞的靶向作用」Infect Immun.661237-43(1998)；Baumler A.等，「lpf fimbrial操縱子介導的Samonella typhirium與鼠Peyer’s斑的黏附作用」Proc.Natl.Acad.Sci.USA93279-83(1996).這樣的細菌性與病毒性黏附素是介導M-細胞結合的蛋白質。呼腸孤病毒的δ-1蛋白也已經被用來打靶M-細胞。Wu Y.等，「M-細胞靶向的DNA疫苗」Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)9318-23(2001)。
特異性地結合到M細胞的另一種複合物是植物血凝素。攜帶脂質體到M細胞的植物血凝素的M細胞靶向作用，可以使用各種類型的植物血凝素，在U.S.Patent No.6,060,082中均作了說明，在這裡通過參考文獻而使之呈為一體。
特異性結合到M細胞表面蛋白質如受體或表面抗原的抗體，也可以被用來打靶M細胞。可以用多種已經為業內人士所熟知的方法生產針對這樣的表面蛋白的抗體，使用完整的興趣蛋白質(蛋白前體或加工後的蛋白質)或蛋白質的一部分。此外，也可以應用靶向M-細胞的呼腸孤病毒δ蛋白。Wu Y.等，「M-細胞靶向的DNA疫苗」Proc.Natl Acad.Sci.USA98(16)9318-23(2001)。
上面所說的M細胞靶向複合物可以被整合進入改良微生物的細胞壁中；這可以通過把M細胞靶向複合物添加到正在重建細胞壁的原生質體來實現。首先是，將M細胞靶向複合物與被設計作為細胞膜錨定點的脂質結合。這樣的功能化脂質可以從Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)購買得到。
另一種方法，質粒可以編碼一種M細胞靶向多肽。一個實施方案是，包含要表達的抗原或治療性蛋白質編碼序列的質粒也含有M細胞靶向多肽的序列；此時，M細胞靶向多肽序列可以被附加到抗原序列上去。也可選擇的方法是，M細胞靶向多肽序列可以由DNA片段來編碼，此DNA片段是經過同源重組產生並且被整合到微生物的基因組中，這與上面所述的把自溶解基因整合到染色組中的方法相似。
下面的實例是說明根據本發明開展工作所要用到的方法和製劑。這些實例僅僅是為了說明問題，而不要認為是限制本發明的適用範疇。雖然這些實例可能是用最為首選的嗜酸乳酸桿菌種來說明的，但是根據本發明的規範，其它的乳酸桿菌種、LAB與大腸桿菌也是適用的。
在這次公開的資料中提到但沒進行詳細說明的有關微生物學、分子生物學以及細胞培養基的方法，均已經在科學文獻中有了詳細的報導。這些方法是本領域技術人員力所能及的。
實施例一 嗜酸乳酸桿菌原生質體的形成 乳酸桿菌細胞在MRS肉湯(Difco)、37℃環境中培養3小時至過夜。然後將細胞在2000xg條件下離心30分鐘，用含有溶菌酶(20μg/ml)的高滲溶液(0.01MTris氫氯化物[pH 7.5]，0.3-0.5M甘露醇)衝洗細胞並使之重新懸浮，室溫環境中孵育5-15分鐘。在適當的再生介質或者是與合適的載體(如，酸奶酪)混合，或者是配有蔗糖與適當緩衝劑的高滲溶液中，所形成的原生質體逐漸覆蓋於平皿上。必須將原生質體維持在含有蔗糖而不含甘露醇的高滲溶液中，直至再生出細胞壁，以防止滲透壓所引起的自溶解。
實施例二 具有可誘導自溶基因的乳酸桿菌種的產生 含有自溶解基因的表達盒可能與乳糖啟動子關聯運作；自溶解基因的例子就象上面所公開的那樣，包括AcmA、holin或細胞溶解酶；乳糖啟動子的例子有細菌Plac啟動子或pH依賴啟動子。關於Plac啟動子，例如，它可以通過在源自Stratagene克隆系統的pBluescript內克隆自溶解基因而獲得。
來自乳酸桿菌染色體DNA的靶DNA序列，例如，可以通過產生源自乳酸桿菌生物體的基因文庫而獲得。可以通過適當的限制酶並且插入一定數量的源自乳酸桿菌文庫的基因克隆，使攜帶有自溶解基因表達盒的pBluescript線性化。最好選擇所要使用的克隆包含有參與某些營養物質或胺基酸(如，色氨酸、酪氨酸等)代謝途徑的一些生化酶，並且pBluescript的插入破壞特定代謝途徑中的特定的生化酶。
這樣就可以利用上面所討論的轉化規程中的任一方案，使所產生的改良染色體DNA克隆返過來轉化進入乳酸桿菌。當這一改良染色體DNA克隆存在於細胞時，它可以與內源性染色體DNA發生同源重組，結果使自溶解基因整合進入乳酸桿菌基因組。可以通過pBluescript質粒所賦予的抗生素抗性，或者伴有在某些營養成分中細胞生長能力的缺失來選擇突變種，細胞生長能力的缺失是由於這些營養成分的代謝途徑已經被打亂而中斷。我們應該注意到，突變乳酸桿菌具有能夠驅動自溶解基因表達的Plac啟動子，應該在無乳糖的培養基中培養與繁殖這種突變異體。這種突變乳酸桿菌可以被很容易地培養在含有葡萄糖的介質中。
除了自溶解基因之外，可以將任何數量的基因引進並且整合到乳酸桿菌基因組，以產生特定目的的突變體。
實施例三 攜帶GFP表達盒細菌的M-細胞靶向作用體外模型 最初為了檢測重組體LAB打靶M-細胞轉導質粒DNA的能力，可以使用擁有不同分化M-細胞的腸道細胞體外模型，正如Kerneis S.等人說明的那樣「人類腸道Peyer’s斑淋巴細胞向轉輸細菌的M-細胞的轉化」Science，277(5328)949(1997)，在此通過參考文獻而使其呈為一體。簡要的說，通過Peyer’s斑淋巴細胞與不同分化的人類腸道細胞系Caco-2.3x 105 Caco-2細胞共同培養而建立的濾泡相關上皮(FAE)和M-細胞，最初可以在6.5mm過濾器(3 micrometer pore Transwellfilters，COSTAR，Cambridge，MA)的較低面過夜培養。然後將過濾器轉移至Transwell裝置，使上皮細胞朝向孔板的較低室。上皮細胞就可以被培養至其完全分化(14天)。可以從PPs of BALB/c小鼠分離淋巴細胞，通過FACS對淋巴細胞進行分離與分類，所使用的抗體是針對鼠B220(CD45)的單克隆抗體和針對鼠CD3T細胞的單克隆抗體。分離之後，將淋巴細胞(106)加至朝向Caco-2細胞基側部一邊的上層室。培養兩天以後，淋巴細胞最有可能已經積聚在上皮內口袋內，該上皮內口袋與在體內觀察到的M-細胞口袋相似；Caco-2細胞最有可能已經被轉化成具有M-細胞表現型的細胞。因此，可以應用這一體外模型進行實驗，評價將重組體LAB導航至M-細胞的條件。
應用這一體外模型，把按照範例I所準備的原生質體培養物，或者是把如上所述的具有靶向複合物的重組體LAB與M-細胞一起在體外孵育。原生質體或重組體LAB就可以攜帶具備CMV啟動子的質粒，該啟動子與GFP聯合運作。可以使用螢光顯微鏡監測M-細胞內GFP的表達。
還可選用的另一種方法就是利用分泌性鹼性磷酸酯酶作為報告基因，例如，可以從市場購買得到的Clontech Laboratories(Palo Alto，CA)生產的pSEAP2-Basic載體。可以利用製造商提供的方法規程，從培養基中化驗分析分泌性鹼性磷酸酯酶。而且，可以通過修飾pSEAP2載體，使得靶信號肽序列既可用於鹼性磷酸酯酶的頂部靶向，也可用於鹼性磷酸酯酶的基側部靶向。這樣就可以依據靶分泌是頂部方向還是10基側部方向，在Transwell的上層室或下層室中分析鹼性磷酸酯酶的活性。
可以理解的是，特定的實驗並未被限制於應用報告基因，也可以使用其它任何興趣蛋白質的ELISA方法或免疫組織化學的方法來確定DNA是否引入M-細胞。
然而在另一個例子中，提高數量的具有GFP基因的質粒DNA也可以與體外M-細胞模型共同孵育，分析M-細胞對裸露質粒DNA的攝取情況。此外，重組體LAB或原生質體的溶解產物也可以與體外模型共同孵育，分析使用GFP的質粒DNA的攝取情況。
實施例四 分泌性鹼性磷酸酯酶的體外分析 根據關於M-細胞攝取DNA所需要的細菌、原生質體或DNA的濃度數據，就可以象所說明的那樣精確地計算出所需原生質體或重組體LAB的適當濃度，然後將它們通過口服攝取的方式給予動物或人類。如果要使用分泌性鹼性磷酸酯酶，則需要採集動物或人類的血清，應用Clontech’s Great EscAPETM SEAPChemiluminescence Detection試劑盒(Cat.#K2041-1)及其操作規程分析動物或人類血清的SEAP活性，通過參考文獻將該試劑盒的資料在這裡呈為一體。Clontech’spSEAP-2載體所表達的SEAP酶是熱穩定的。這樣，要確定與內源性鹼性磷酸酯酶活性相反的SEAP活性水平，就要求在加入化學發光酶底物之前通過將標本在65℃加熱30分鐘而滅活內源性鹼性磷酸酯酶。
可使用的另一種方法是，如果預期蛋白質是胰島素，則可以將具有適當胰島素表達盒的重組體LAB給予適當的糖尿病動物模型或給予糖尿病患者。這樣就可以依據動物或人類血流中的葡萄糖與胰島素水平來監測治療效果，而檢測血流中葡萄糖和胰島素水平的方法已為業內人士所熟知。
如果預期的蛋白質是一種抗原，則可以採集動物或人類的血清樣本，分析與被引入的抗原發生結合反應的抗體。
實施例五 高拷貝質粒 為了提高質粒DNA實際上進入上皮襯層中細胞的機會，首選的方法應該是使用高拷貝的質粒來轉化細菌。高拷貝質粒的例子包括具有突變複製原點的質粒，例如pUC 18載體，其阻遏物與複製原點的結合更鬆弛。可以在LAB質粒載體的複製原點上製造相似的突變異，以提高質粒的拷貝數量。可以應用已為人們所熟知的PCR反應技術產生的隨機突變來引起這種突變異。可以設計側翼包圍複製原點的引物，然後使用象Taq聚合酶這樣的非校對性聚合酶，最好在含錳緩衝液中進行反應，而不用鎂緩衝液。這樣，變異的PCR片段就可以取代原來的複製原點，並且被轉化進入細菌。然後可以應用高選擇性壓力(例如，培養介質中的高抗生素)來選擇高拷貝的LAB質粒。
可以選擇的另一種方法是使用「逃跑」質粒，提高高拷貝質粒的數量。「逃跑」質粒是在大腸桿菌中發現與開發生產的一類最通用質粒中的一部分。它們是以IncFII質粒RI為基礎，其中有一個反義RNA(CopA RNA)序列消極地控制著速率限制複製的蛋白質的形成。質粒的拷貝數量是由CopA RNA形成速率與RepAmRNA形成速率之間的平衡來決定的；後者形成速率略有提高就會極大地消減CopA RNA的形成速率，這是由於會聚性轉錄所致，會聚性轉錄引起(逃跑複製)拷貝數量控制的全部喪失，結果引起大量的DNA擴增，質粒的拷貝數量可以達到每個基因組中存在1000拷貝。因為這一擴增發生在蛋白質合成時，所以由所克隆基因編碼的蛋白質也能夠被擴增，並且可佔總蛋白量的10-50％。見Nordstrom K與Uhlin BE的「逃跑複製質粒細菌體內產生大量克隆基因所編碼蛋白質的工具」Biotechnology(NY)1992 Jun；10(6)661-6。
目前可以獲得的「逃跑」質粒，可以被修飾以載有適合於哺乳動物表達的表達盒。根據上面所介紹的方法，就可以利用非致病性大腸桿菌細胞、並將細胞溶解，把改良的「逃跑」質粒傳輸到胃腸道中來。也可以為DNA轉導中所使用的乳酸桿菌和乳酸球菌設計開發「逃跑」質粒。
實施例六 改良乳酸球菌生物體的生產細菌的選擇和質粒DNA的克隆 可以通過乳酸球菌與包含重組體質粒的第二細菌融合，形成改良的乳酸球菌生物體。在本實例中，lactis乳酸球菌(ATCC#7962)與大腸桿菌HB101(ATCC#33694)發生融合。
大腸桿菌HB101含有一個編碼GFPuv的重組體質粒pSYG3，GFPuv是為細菌表達而經過最優化設計的一種GFP突變異體(Crameri A.等，「經DNAshuffling(洗牌)法分子演變改良綠色螢光蛋白」Nat.Biotechnol.14315-19(1996))。GFPuv已經被最優化設計，它在受到UV光線(360-400nm)激發時產生最大的螢光性；並且可以利用如下引物從pBAD-GFPuv(Clontech，Palo Alto，CA)對其進行擴增CAT GCA TGC CAT GGC TAG CAA AGG AGA AGA AC以及CCG GGT ACCGAG CTC GAA TTC(SEQ.ID.NO 1)(Geoffroy M.等人，「識別正在開發的活疫苗載體乳酸菌種的綠色螢光蛋白的應用」(應用與環境微生物學66(1)383-91(2000)). 由pUC19構建PSYG3，PSYG3含有源自pBR322的複製原點、卡那黴素抗性基因和一個同編碼GFPuv核酸序列聯合運作的T7啟動子序列，其中GFPuv與表面結合啟動子區域融合。表面結合啟動子區域可以是來自乳酸球菌Usp45蛋白前體的信號肽的編碼序列，與源自鏈球菌生膿原的M6蛋白前體的細胞壁錨定點區域的序列，同時還有必需的轉錄終止子，其中細胞壁錨定點區域。信號肽序列是從GFPuv序列起始向上遊方向延伸，而細胞壁錨定點區域是從GFPuv序列開始向下遊方向延伸。詳細資料請參閱Deite Y.等人，「乳酸菌蛋白靶向系統的設計」Journal of Bacteriology183(14)4157-66(2001)。質粒的克隆、用質粒對大腸桿菌細胞進行轉化、以及選擇包含質粒的克隆等都可以用掌握本領域普通技術的人員所熟知的程序來完成，具體程序參見以下文獻Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，第三版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York)(2001)以及Ausubel等人的，《分子生物學通用規程》(Wiley，New York)(2001)。
質粒也可以包含其它的DNA序列，例如與表面結合啟動子區域及T7啟動子聯合發生作用的呼腸孤病毒的σ1蛋白的編碼序列，正如以上所說明的那樣。這類蛋白的表達可以完成M-靶向作用。
埃希氏大腸桿菌與乳酸球菌原生質體的形成 兩細菌種的原生質體都可以通過下列方法形成。lactis乳酸球菌要在MRS培養基(Difco)、26℃環境中生長到指數生長期，而擁有pSYG3的大腸桿菌HB 101要在LB培養基、37℃環境中培養到指數生長期之後。然後將氯黴素加到大腸桿菌培養物中，選擇性地增殖pSYG3 16小時。將培養物在2000xg離心30分鐘，用含有溶菌酶(20ug/ml)的高滲溶液(0.01 M Tris氫氯化物[pH 7.5]，0.3-0.5M甘露醇)衝洗所產生的細胞顆粒，並且用該溶液使之重新懸浮起來，在室溫條件下孵育5-15分鐘。把所產生的部分原生質體用適當的再生培養基(MRS或LB)輕輕地覆蓋在平皿上，觀測到菌落形成確保原生質體能夠再生形成細胞壁。原生質體必須保持在含有蔗糖而不含甘露醇的高滲溶液中，直到它們再生了細胞壁以防止滲透壓引起的細菌細胞溶解。
大腸桿菌與lactis乳酸球菌原生質體的融合 要融合原生質體，把保持在上述高滲溶液中的大腸桿菌原生質體1×109-10×1010添加到0.5-1ml保養在同一高滲溶液的L.lactis原生質體1×109-10×109中。向混合物中加入0.5ml-1.5ml的20％-70％PVA或PEG，輕輕搖動溶液使之充分混勻。混合物在室溫條件下孵育1-30分鐘，用相差顯微鏡監測原生質體的聚集與融合。當細胞生長到達指數生長期時，用上述高滲溶液將原生質體衝洗3次，並且用3-7ml此溶液稀釋。取少量所形成的溶液(0.5-2ml)覆蓋在含有卡那黴素的MRS瓊脂上，26C孵育。
MRS瓊脂適用於L.lactis和改良L.lactis在基本培養基上複製，和/或用對抗LAB的抗血清進行ELISA試驗。LAB的種鑑定也可在西紅柿瓊脂平皿上進行，用卡那黴素選擇包含pSYG3的細菌。這樣所產生的微生物菌落就是擁有pSYG3的改良嗜酸乳酸菌的融合體。還可選用的方法是，由於GFP也是一種報告基因，可以根據紫外線照射下的綠色螢光來選擇含有pSYG3菌落。
實施例七 改良乳酸球菌生物體的表現型特徵鑑定 需要進行各種試驗才能證實是否已經產生了預期的改良乳酸桿菌生物體。單個的菌落必須是1)取自上述選擇性培養平皿；2)在MRS肉湯中培養；3)移植於含有卡那黴素的MRS瓊脂上。步驟1-3要重複5次，以獲得純化的群體。
確定改良乳酸桿菌生物體生理特性的試驗，要根據API ZYM和API 20A生化試驗系統中的操作程序來進行。雙親細菌的特性已經由Holt等人在《Bergey’s細菌鑑定手冊》第九版(Williams Wilkins，Baltimore，MD)(1994)中提出，它是對所要說明和培養的細菌進行鑑定的綜合性指導手冊。
根據上述選擇性要求，改良的乳酸球菌生物體應該具備與乳酸球菌種相應的表現型。因而改良細菌細胞應該是球形、革蘭氏染色陽性，在液體培養基中細胞成對或以短鏈的形式出現，需要合成培養基才能生長，代謝應是發酵性、且產生L(+)-乳酸、而不產生氣體，而且細菌應是過氧化氫酶陰性、氧化酶陰性的。
改良的乳酸球菌生物體不應該具有與埃希氏菌種相應的表現型。上面對乳酸桿菌進行的某些試驗也說明改良的乳酸桿菌生物體不是埃希氏菌，因為埃希氏菌細胞還原硝酸鹽、革蘭氏染色陰性、過氧化氫酶陽性。
實施例八 改良乳酸球菌生物體的基因型特徵鑑定 應用斑點印跡技術來確定改良的乳酸球菌生物體是否具有預期的基因型。根據標準程序提取染色體DNA，見Saito與Miura。按照Sambrook《分子克隆實驗室手冊》中說明的方法準備質粒DNA、進行Southern雜交。
將源自雙親細菌的染色體DNA和質粒DNA用作探針。如果用大腸桿菌染色體DNA來探測lactis乳酸球菌的染色體DNA或者以L.lactis染色體DNA為探針探測大腸桿菌染色體DNA，則會看到很低的同源性。相反，L.lactis和大腸桿菌的染色體DNA探針與改良乳酸球菌染色體DNA共享50％或更大的同源性，因為融合體應該含有來自雙親細菌的染色體DNA。本領域的技術人員也應該意識到這種情況的重要性如果雙親細菌更為緊密的相關，因此它們具有高度同源的染色體DNA，正如本發明的某些實施方案中可能發生的情況那樣；發生在雙親細菌染色體DNA間的雜交程度與發生在親代與融合體染色體DNA間的雜交程度之間的差異就比本範例中所述的變化小許多。在這種情況下，我們更可以依靠Southern雜交鑑定質粒DNA，從而來說明融合體基因型的特徵。
實施例九 確定抗原在改良乳酸球菌生物體Ex Vivo表達的實驗分析GFP螢光的探測 根據已知的程序，可以用幾種不同的方法來檢測GFP螢光在改良乳酸球菌生物體內的表達。如上文所述，可以在UV照射下給改良乳酸球菌生物體的培養平皿進行照相，從而鑑別表達GFP的菌落。此外，可以利用表面螢光顯微鏡來觀察懸浮於PBS中的改良乳酸球菌細胞內的GFP產物，可以使用合適的膠片拍攝觀察結果。最後，還可以通過製備改良乳酸球菌細胞的溶解產物、並使用螢光計分析其螢光性，來檢測GFP的表達。
對總蛋白抽提物和細胞碎片進行Western斑點印跡分析定位GFP的表達 對總蛋白抽提物和細胞的各種碎片進行Western斑點印跡分析，來檢測GFPuv的表達，表明GFP正被導航至細胞膜。根據人們早已熟知的程序準備總蛋白抽提物，這些程序在多種文獻中提出，如Ausubel等人的《通用分子生物學規程》。細胞碎片的準備要根據Piard，J.-C.等人在.「各種乳酸菌錨定鏈球菌生膿原M6蛋白的細胞壁」中提出的方法進行。簡要地說就是，將2nil指數期培養物在4C、4,300g條件下微量離心5分鐘。所產生的細胞顆粒與上層清液被分離開來且被濃縮。用三氯乙酸(TCA)把上清液中的蛋白質沉澱下來。將細胞顆粒重新懸浮在TES中，用溶菌酶處理，把所產生的原生質體低速離心沉澱。上清液中就包含著由細胞壁釋放的、並且可以被TCA沉澱的蛋白質。那麼，我們就可以應用Dieye Y.等人在「乳酸菌靶向蛋白系統的設計」Journal of Bacteriology 183(14)4157-66中提出的方法，把蛋白質從原生質體顆粒中抽提出來。
這樣就可以使用Western斑點印跡方法來分析總蛋白或細胞碎片樣本用兔抗GFP抗血清(Invitrogen)作為第一抗體，辣根過氧化物酶共價連接的抗兔抗血清(Sigma)作第二抗體，進行檢測。以已知量的重組體GFPuv(Clontech)作為對照標準，可以通過掃描標準品泳道與實驗組泳道的信號來評估Western印跡上的GFPuv含量。Sambrook等人在《分子克隆實驗室手冊》中詳細說明了Western印跡技術。
實施例十 HBsAg抗原與IL-2基因的轉導 HBV表面抗原基因Pre-S2和S可以通過PCR技術從質粒pEco63(ATCC31518)擴增獲得；鼠IL-2基因片段可以通過PCR技術從質粒pMUT-1(ATCC37553)獲取。把這兩種基因安置在融合一體的Lac-Z啟動子之下或者安置在位於pUC18中獨立的T7啟動子之下。這些基因也可以在穿梭載體中克隆。僅包含pre-S2/S基因的質粒被稱作pPS2S，同時包含pre-S2/S和IL-2兩種基因的質粒稱為pPS2S/IL2(Chow et al.J Vir.Jan 1997169-178)。這兩種基因也可以被克隆至另一個穿梭載體，形成融合基因或受獨立啟動子調控。DNA就被轉化進入大腸桿菌DH5和/或HB 101，質粒DNA就在大腸桿菌培養物內增殖。按照上述方法將指數生長期的大腸桿菌製成原生質體並且與lactis乳酸球菌融合。融合體將選擇性地生長在LAB MRC培養平皿和西紅柿汁平皿和/或合成培養基平皿中(Broach等，Gene，8(1979)121-133.)。通過卡那黴素以及下述的轉基因產物分析來選擇表達質粒。
用AUSZYME(Abbott Lab)單克隆抗體試劑盒來分析融合體肉湯培養基或細胞沉澱中的HBsAg蛋白。細胞內蛋白質被Ten-Brock ground bead高速勻漿器所釋放；用Triton X-100處理、釋放膜結合蛋白質。抗原產物應該佔細胞總蛋白的3％。應用增殖擴散分析(Chow等)和使用抗-IL-2抗體的ELISA(Pharmigen)分析法來測定IL-2的活性。
用1-10×109cfu的LAB，最多可使用三劑對BALB/c和C57b1/6鼠進行免疫。從第二天開始通過斷尾取血法採集血清。使用本領域內已知的血清學分析法和/或本說明中介紹的方法來檢測HbsAg抗體。
實施例十一 以pYD1為基礎的質粒的構建 pYD1是從Invitrogen購買的半乳糖可誘導的表達載體，它指導蛋白質表達在酵母細胞壁上。興趣抗原VP7、HA和NA是利用表1所列出的引物通過PCR擴增而得。所得到的PCR產物被克隆到pYD1的BamHI/EcoRI(VP7)或BamHI/XbaI(NA and HA)位點。
實施例十二 pGPD-DSPLY及其衍生物的構建 pGPD-DSPLY是許多蛋白質在細胞壁上組成性表達的靶向載體。表1列出了構建pGPD-DSPLY及其衍生物所使用的PCR引物的名稱與序列。pGPD-DSPLY包含一些序列，這些序列編碼酵母-配對因子的引導序列以及釀酒酵母菌α-凝集素的細胞壁錨定區域(C-末端350個胺基酸)。首先，編碼由兩個胺基酸(Gly and Ala)間隔緊隨其後的α-引導肽的序列是利用BamLALPHAfwd和EcoLALPHArev作為引物經PCR從酵母菌染色體(strain S288C)擴增，並且被克隆進入p426GPD的BamHI和EcoRI位點(Mumberg等人，1995，不同遺傳背景下異源蛋白質控制表達的酵母載體，Gene 156119-122)，進而構建pSecY。然後，編碼α-凝集素細胞壁錨定區域的序列是利用寡聚核苷酸Agglfwd和Agglrev作為引物經過PCR技術從酵母染色體DNA(strain S288C)擴增，並且被克隆進入p426GPD的ClaI/XhoI位點，這樣獲得了pGPDAnch。pGPD-DSPLY是通過將含有α-凝集素序列的EcoRI/XhoI片段亞克隆至pSecY同一位點構建而成。
抗原NA、VP7(pNADSPLY，pVP7DSPLY)表面展示的載體是經過下面的程序而製備的NA和VP7編碼序列是分別利用引物對NAnewfwd/Nanewrev和VP7newfwd/VP7newrev經過PCR技術從這些基因的克隆拷貝擴增而得，並且將α-凝集素的上遊序列克隆到pGPDAnch的EcoRI/HindIII位點，得到pNAAnch和pVP7Anch。然後，把源自pNAAnch和pVP7Anch的EcoRI/XhoI片段亞克隆進入到pSecY的同一位點分別得到pNADSPLY和pVP7DSPLY。為了證實抗原是否正確定位到細胞壁上了，pGFPDSPLY是基本按照上面所述的方法構建的；GFP編碼序列是使用sgGFPfwd和sgGFPrev作為引物從質粒pQB125-fPA(Qbiogene)經過PCR擴增而得。
構建HA表面展示載體pHADSPLY，是通過將PCR-擴增的HA序列克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位點來完成的。由於在HA編碼序列中存在EcoRI位點，使用了一個粘性末端PCR策略(Zheng G.，粘性末端PCR亞克隆的新方法.1998，Biotechniques，25206-208)來使克隆更容易進行。首先，使用引物對HAfwd1/Hanewrev和HAfwd2/Hanewrev來進行兩個獨立的HA擴增反應。經過DpnI(去除背景質粒)和HindIII消化處理之後，把相同摩爾的兩種PCR產物混合、加熱變性，並冷卻至室溫，然後克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位點。
為了便於抗原的免疫學檢測，將編碼各種抗原決定基片段(His6和HA)的序列克隆至pNADSPLY的EcoRI位點和pVP7DSPLY載體，該載體把抗原決定基片段定位於抗原編碼序列和細胞壁錨定序列之間。用於這些構建工作的寡聚核苷酸都列在表1中。
實施例十三 乳酸桿菌表面展示載體的準備 表達目的抗原的基因被克隆至表面展示載體pSC111AE的SfiI/AscI位點。這種構建過程的結果就是，VP7、HA、NA與GFP被從N-末端融合至澱粉酶基因的分泌信號，以及由C-末端融合到prtp蛋白酶的細胞壁錨定區域。融合蛋白質的表達是由具有基本活性的Xyl啟動子驅動的。表1列出了用於各種抗原PCR擴增的寡聚核苷酸序列。
表1.構建表面展示表達載體所需要寡聚核苷酸的SEQ ID NO編號

實施例十四 酵母細胞表面蛋白質的表達 基於pYD1的表達 用pYD1或基於pYD1的表達載體進行轉化的EBY 100酵母在含有2％葡萄糖的YNB-CAA培養基中，於30℃環境中過夜培養。通過離心、並將細胞重新懸浮於含有2％半乳糖到OD600值為0.5～1的YNB-CAA培養基中。將細胞培養在20～25℃的環境中，按照適當的時間間隔收集標本，通過免疫螢光染色法來檢測細胞表面蛋白質的表達。
基於pGPD-DSPLY的表達用pGDP-DSPLY或其衍生物進行轉化的W303-1A細胞在不含尿嘧啶的合成培養基中，於30℃環境中培養至對數中期。收集細胞，並根據下述方法分析蛋白質的表達。
實施例十五 檢測展示於酵母細胞表面的抗原 通過免疫螢光染色法標記完整的細胞，然後在共聚焦顯微鏡下檢測酵母細胞表面抗原的表達。酵母菌的培養至指數生長期後，加入1/10培養基體積的甲醛以固定培養物，搖動培養物繼續孵育1小時。用PBS把固定的細胞衝洗3次，並且在室溫(RT)環境中同抗-GFP單克隆抗體一起孵育1.5小時；用PBS衝洗後，使用與羅丹明共價連接的第二抗體把細胞在RT環境中孵育1小時；用PBS衝洗細胞，，並將標本滴於顯微鏡載玻片上，在共焦顯微鏡下觀察細胞。就如圖1所示的那樣，GFP被表達在酵母細胞表面，以GFP-相關螢光性的細胞分布方式來顯示。此外，應用免疫螢光檢驗法分析表達表面展示-GFP的酵母細胞，也探測到了相似的GFP分布方式。
實施例十六 用重組體酵母菌進行動物免疫的程序 用在自身細胞表面表達VP7、HA或NA的酵母菌經口服、鼻內或皮下途徑對6周齡的雌性Balb/c鼠進行接種；強化接種是每2周進行一次。用表達表面展示抗原的酵母菌，或用包含空載體的酵母菌對鼠進行接種。使用了三種不同的接種方法口服、鼻內或皮下接種。每一實驗所使用的老鼠的數量列在表2中。第一次接種之前與此後的每2周採集一次血液標本。8周後將鼠處死，收集氣管、肺及腸道的衝洗液。使用ELISA法檢測血液及組織樣本中的抗原特異性的IgG和IgA抗體。
A.準備疫苗 半乳糖可誘導的表達(pYD1)，把表達病毒抗原VP7、HA或NA的酵母細胞以及包含空載體的酵母細胞培養在YNB-CAA培養基上，用2％半乳糖誘導表達。組成性表達(pGPD-DSPLY)，酵母細胞在不含尿嘧啶的合成培養基上培養至對數中期；在對數中期收集細胞，用PBS衝洗細胞、並用PBS將細胞懸浮達到5×109/ml的濃度。
B.疫苗接種口服0.1ml(5×108)/只鼠鼻腔內 0.02ml(1×108)/只鼠皮下0.1ml(5×108)+0.1ml佐劑/只鼠(第一次皮下接種使用完全福氏佐劑，強化接種使用不完全福氏佐劑)。第一次接種在0周，強化接種分別在2、4、6周進行，每次都使用相同數量的細胞。
實施例十七 抗體反應的測定 從眼眶採集血液標本(～0.1ml)，通過離心分離血清，-20℃保存。將肺和腸道從死動物屍體上剝離，用PBS衝洗。把組織衝洗液收集到Eppendorf試管中，進行離心，將上清液保存在-20℃。
用ELISA法檢測標本，檢測抗原特異性的抗體存在與否。把病毒抗原VP7、HA或NA包被在96孔板上。封閉非特異性結合位點之後，用PBS稀釋血清、肺或腸道的衝洗液標本並加入每一反應孔。使用辣根過氧化物酶標記的第二抗體(抗-IgG或抗-IgA)檢測抗原-抗體複合物。
下面的表3、4、5及表6表示的是來自每一免疫接種方案的原始數據。表3表明應用pGPD的酵母菌流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度(濃度)。表4表明應用pGPD的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度。表5表示的是應用pYD1的酵母菌流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度(濃度)。表6表示的是應用pYD1的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度(濃度)。
圖2-10是以圖解的形式說明表3-6所表示的數據。就如我們所見到的那樣，與質粒對照組比較時，本發明中的每一免疫原性製劑都成功地誘發了實驗動物體內的免疫反應。
表2.每一實驗組中的動物數量

注ApYD1系統；BpGPD-DSPLY系統表3.使用pGPD的酵母流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度


SQ皮下表4.使用pGPD的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度

N/A意思是未能得到酵母菌流感疫苗的血清抗體滴度表5.使用pYD1的酵母菌流感疫苗接種鼠的血清抗體滴度


SQ皮下表6.使用pYD1的酵母菌輪狀病毒疫苗接種鼠的血清抗體滴度

給藥和輸送 可以將本發明的改良微生物傳輸到腸道黏膜，以把抗原和異源核酸轉導給危難之中的動物。可以用廣泛的製藥學上可以接受的賦形劑配製本發明中的免疫原性製劑和基因轉導製劑。用於治療目的、製藥學上可以接受的載體已經在製藥學領域為人們所熟知，並可參見相關文獻，例如，《雷明頓藥物科學》(A.P.Gennaro編著；Mack，1985)。一套接種方案由如下步驟組成在1～6天內進行一次或多次的「初始」接種，緊隨其後的12～24天內的一次或多次強化接種，以及在30～36天內進行一次或多次的選擇性強化接種。單獨一次初始接種，再於該時間期限內進行一次單獨的強化接種，這在一般情況下是足以達到目的的。
就其本身而言，可以根據已知的任何一種方式對改良微生物的培養物進行配方設計，例如，用於動物口服接種的活細菌形式的配方設計或配製品、用於益生菌接種的配製品，治療胃腸功能紊亂。配製品也可以是這樣一種形式適合於通過攝取、或經由管子或導管接種到胃或腸道黏膜的形式。依據本發明，改良微生物的培養物可以是一種適合於口服接種的形式，它可以是固體、半固體或液體的形式，這包括但不局限於細菌的溶液和/或懸浮液。配製品也可以是一種腸溶性包被製劑的形式；合適的膠囊封裝用化合物包括但不局限於聚氨基葡萄糖、麥芽糖糊精、脂質、寡聚糖與多聚糖；這種封裝也可以提高細菌培養物的貨架壽命。此外，如果需要的話，本發明也可以設計為並被用作栓劑的形式，用於直腸或陰道接種；氣溶膠或吸入劑用於氣管支氣管內接種；以及其它類似的形式。這類配方的配製品為精於製藥學技術的人們所熟知。對所用劑量和接種方式都可以進行調整以取得最佳功效，並且依賴於精通醫學技術的人們能夠意識到的因素。
改良微生物的培養物也可以被準備為粉末的形式，如冰凍乾粉，它需要在使用之前重新配製，例如用合適的液體溶解；或者是固體或液體配製品的形式，與固體、半固體或液體食物混合後進行接種。它們也可以是發酵配製製品的形式，例如酸奶酪或乾酪。正因如此，改良微生物的培養物可以包含一種或多種製藥學上可以接受的載體/賦形劑，例如水。改良微生物培養物也可以包含一種或多種佐劑，包括適合於口服接種的免疫佐劑，只要它們與細菌宿主或酵母菌宿主兼容，並且不妨礙它的預期免疫原特性；例如，可以使用生理性pH的無菌鹽水或磷酸鹽緩衝液。防腐劑、穩定劑、染料甚至調味劑都可以被用於藥物製品中；例如，可以把苯甲酸鈉、山梨酸以及p-羧基苯酸酯作為防腐劑加入；也可以使用抗氧化劑(硬化防止劑)與懸浮劑。
進行接種的首選途徑就是口服攝取細菌培養物。生物學製劑的配方設計最好包括改良微生物的發酵製品與奶製品，例如，以酸奶酪配製品的形式進行口服接種，這樣就可以按日常習慣攝入酸奶酪而接種。因而在另一個實施方案中，本發明旨在提供一種新穎的藥物製劑，它包括改良微生物和生物學上可以接受的載體，如酸奶酪，其中改良微生物能夠編碼治療和/或預防疾病所需要的有效計量的DNA、cDNA、RNA或蛋白質。關於溶菌酶處理的原生質體，在口服攝入之前，也可以把原生質體培養物與非毒性的、製藥學上可以接受的載體物質(如，酸奶酪)輕輕地混合。
給予特定病人的改良微生物的有效劑量依賴於多種因素，其中部分因素會因病人不同而不同。一位合格的臨床醫生應該能夠確定要給予患者的抗原性或治療性製劑的有效劑量，以產生恰當的免疫或治療反應。製劑的劑量依賴於治療類型、接種途徑、抗原或治療劑的性質以及引起治療效應的合適的吸收速率等。利用LD50動物數據以及可以得到的經由腸道黏膜攝取和/或吸收的其它信息，臨床醫生可以根據給藥途徑來確定個體的最大安全劑量；利用平時的經驗，合格的臨床醫生也能夠在常規的臨床實踐中把特定的治療性製劑的用量最優化設計。
這裡所介紹的用於胃腸道內細菌轉導和細胞溶解的所有方法，都能夠以相似的方式應用於大腸桿菌細菌，該細菌也是身體細菌群落的一個自然組成部分。也可以從腸道黏膜選擇或分離大腸桿菌的非致病性菌種。表達質粒和載體及其在大腸桿菌中的轉化在此之前已被清楚闡明，因此上面所介紹的修飾改良也可以通過常規的重組體技術來實現。
一旦根據本發明的規則正確地合成了微生物製劑，本發明的微生物製劑可以被用來有效地誘發免疫反應，並且向一個廣泛的動物腸黏膜提供異源核酸，這些動物包括但不局限於靈長類、山羊、牛、馬、鳥、魚、豬、小鼠、大鼠、貓及狗。
除非是特別的指明，所有表示成分的量與特性的數據如分子質量、反應條件以及在規範與聲明中所使用的這類指標都要這樣理解已經用術語「關於」在所有情況下都作了修正。相應地，除非是指向對立面，在下列規範與附加聲明中所用到的數字參量都是近似值，這些數值可以根據本發明所尋求的預期特性而變化。最後，且並非試圖將等價物學說的應用限制於本聲明的範疇，對每一數字參量都應該至少依據所報導的有意義數字(有效數據)的數值、並且運用普通的捨入技巧進行解析分析。儘管用以闡明本發明主要範圍的數字範圍和參數是近似值，但是在特定的實例中，我們儘可能地提出精確數據。然而，任何數值都不可避免地含有某些誤差，這可能是由它們各自的實驗測定中產生的標準偏差所引起。
在描述本發明的上下文中(特別是在下列聲明中的上下文中)所使用的術語「a」、「an」、「the」以及相似的指代物，除非在這裡不同地指明或者同上下文明顯相牴觸，都必須對其進行分析以同時含蓋單數和複數，。在這裡複述數值範圍，僅僅是為了在個別提及該範圍內每一獨立數值時提供一個速記方法。除非是在這裡不同地指明，每一單獨的數值都與該規範說明呈為一體，好象是在這裡個別地複述它一樣。這裡所說明的所有方法都可以根據任何合適的順序進行，除非是這裡不同地指明或者是明顯地與上下文相矛盾。使用這裡所提供的任何與所有的例子，或者使用可效仿性語言(例如，「such as」)僅僅是為了更好地闡明本發明，而不是對發明的適用範圍加以限制，否則就予以聲明。本說明中的任何語言都不應被這樣理解為暗示任何發明實施必須的非聲明要素。
對這裡所公開的可選擇要素或者發明的具體實施方案進行分類，都不應被理解為限制。每一組成員可能被單獨地提及與聲明，或者同組內其它成員或這裡發現的其它要素一起被聲明提及。可以預見得到會有這樣一種情況一個組內的一個或多個成員可能被包括在內，或者是因為合適的時間和/或專利權限問題而被從組中剔除。當發生這樣的包含或剔除時，此時的說明是包括修正後的組別，以執行在附加聲明中使用的所有Markush組別的已成文說明。
在這裡說明了本發明的首選實施方案，包括本發明人所知道的應用本發明的最好模式。當然，該領域普通技術人員會通過閱讀說明書明白對那些優選實施方案的變化。本發明人希望有經驗的技術人員正確處理這樣的變化，並且希望以其它不同的方式運用本發明，而不僅僅使用本申請特定說明的方法。因此，本發明包括了所有所附的，法律上適用的權利要求中限定的發明主題的全部修飾與等同替換。而且，本發明包括了在所有可能的變異範圍內對上面所說明的因素可作的任何結合，除非是本申請不同地說明或者明顯地與上下文相牴觸。
而且，大量的專利文獻與公開發表的文獻作為參考貫穿於本說明書的始末。對上述所引用的每一參考文獻與公開發表的文獻通過參考其全文而使之獨立地成為一體。
作為結束語，應該理解本申請所公開的發明實施方案是例證本發明的法則原理；可採用的其它修正也在本發明的範圍內；因而，通過舉例的方式，而不是通過限制的方式，本發明可根據這種原則採用替換性說明。因此，本發明並不僅僅限制在上述顯示說明的內容。
序列表110聖必健公司120將核酸和/或蛋白質轉導至腸黏膜的方法及其製劑13021823.1116032170PatentIn version 3.1210121121212DNA213人工序列220
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223寡核苷酸40030aaggcgcgcc gatgcatatt ctgcactgc292103121140212DNA213人工序列220
223寡核苷酸40031taggcccagc cggccgccca ttcaattcaa actggaagtc402103221128212DNA213人工序列220
223寡核苷酸40032aaggcgcgcc cttgtcaatg gtgaatgg 28
權利要求
1.一種在動物體內誘導免疫反應的方法包括，向實驗動物提供一種按口服接種配方設計的免疫原性製劑，其中所述的免疫原性製劑包括具有表達載體的微生物體，而所述的表達載體含有編碼抗原的異源核酸。
2.根據權利要求1所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的微生物體是指酵母菌或細菌。
3.根據權利要求1所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的抗原選自腫瘤、細菌、病毒、寄生蟲與真菌。
4.根據權利要求3所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的病毒選自流行性感冒、肝炎、HIV和輪狀病毒。
5.根據權利要求2所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的酵母菌選自釀酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis.、S.servazzii、S.unisporus與S.kluyveri。
6.根據權利要求2所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的細菌包括雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、durans腸球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳桿菌、乾酪乳桿菌及植物乳桿菌。
7.根據權利要求1所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的口服配方製劑選自粉劑、凍乾粉劑、液體配製品、半固體的酸乳與乾酪。
8.一種動物體內誘導免疫反應的方法，包括提供一種按口服接種配方設計的轉化酵母菌，其中所述的酵母菌含有編碼抗原的異源核酸，而抗原被表達在所用酵母菌表面上。
9.根據權利要求8所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的酵母菌是指釀酒酵母菌。
10.根據權利要求8所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的抗原源自病毒。
11.一種在動物體內誘導免疫反應的方法，包括提供一種按口服接種配方設計的轉化釀酒酵母菌，其中所述的轉化釀酒酵母菌含有編碼來自甲型流行性感冒病毒的免疫保護性抗原決定簇的異源核酸。
12.根據權利要求11所述的在動物體內誘導免疫反應的方法，其中所述的免疫保護性抗原決定簇是流感HA或NA。
13.一種免疫原性製劑，包括具有表達載體的微生物體口服配方，其中所述的表達載體含有編碼抗原的異源核酸。
14.根據權利要求13所述的免疫原性製劑，其中所述的微生物體是酵母菌或細菌。
15.根據權利要求13所述的免疫原性製劑，其中所述的抗原選自腫瘤、細菌、病毒、寄生蟲和真菌。
16.根據權利要求15所述的免疫原性製劑，其中所述的病毒選自流感、肝炎、HIV和輪狀病毒。
17.根據權利要求14所述的免疫原性製劑，其中所述的酵母菌選自釀酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus與S.kluyveri。
18.根據權利要求14所述的免疫原性製劑，其中所述的細菌包括雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、durans腸球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳桿菌、乾酪乳桿菌及植物乳桿菌。
19.根據權利要求13免疫原性製劑的組成，口服接種配方選散劑、凍乾粉、液體配製品、半固體的酸乳及乾酪。
20.一種免疫原性製劑，包括轉化酵母菌口服配方，其中所述的酵母菌含有編碼抗原的異源核酸，而抗原被表達在所用酵母菌表面。
21.根據權利要求20所述的免疫原性製劑，其中所述的酵母菌是釀酒酵母菌。
22.根據權利要求20所述的免疫原性製劑，其中所述的抗原源自病毒。
23.一種免疫原性製劑，包括轉化釀酒酵母菌的口服配方，其中所述的轉化釀酒酵母菌含有編碼來自流感A的免疫保護性抗原決定簇的異源核酸。
24.根據權利要求23所述的免疫原性製劑，其中所述的免疫保護性抗原決定簇是流感病毒HA或NA。
全文摘要
本發明提供了利用基因修飾的微生物進行體內異源核酸輸送的方法和製劑，特別是提供了將異源核酸轉導至動物腸道黏膜的製劑和相關方法。尤其是，利用基因修飾的正常微生物群直接轉導轉化異源核酸，或者是提供至少表達一種異源核酸的基因修飾的微生物。典型的正常微生物群包括細菌、細菌融合體與酵母菌。異源核酸可以編碼免疫保護性抗原決定簇(抗原)或其它基因治療蛋白。
文檔編號A61K38/19GK1642579SQ03807298
公開日2005年7月20日 申請日期2003年1月27日 優先權日2002年1月31日
發明者陳巍, 傅曉麗, 雪莉·諾萊尼, 張智清 申請人:聖必健公司