使用結合元件用於分析的裝置和方法

2023-08-07 08:11:26 3

專利名稱：使用結合元件用於分析的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及分析方法，例如多核苷酸的分析方法。 相關申請
本申請涉及2005年5月6日提交的國際專利申請 PCT/EP2005/004923的美國繼續申請，該國際專利申請指定為美國並要 求了 2004年5月6日提交的德國專利申請DE 10 2004 022 263的優先 權，美國繼續申請No. US 11/593,021題為"用於檢測分子相互作用的 方法和裝置"並於2006年11月6日提交，每個這些申請在此以其全 文引為參考。
背景技術：
生物樣品中病原體的存在可以通過分析樣品中與病原體的存在有 關的多核苷酸來確定。細菌，黴菌和病毒是可以在相關多核苷酸的分 析的基礎上確定的病原體的例子。
EP 0 637 999公開了通過進行多核苷酸聚合反應在樣品中擴增預 先選定的多核苷酸的裝置。該裝置包括顯微製造限定出樣品入口的基 體，以及從入口延伸出的中等尺度的流動系統。中等尺度的流動系統 包括多核苷酸聚合反應室，它與入口流體連通，入口提供用於預先選 定的多核苷酸的聚合和擴增所需的試劑。裝置可用於在反應室(PCR室)中執行聚合酶鏈反應(PCR) 。 PCR室被提供樣品多核苷酸，聚 合酶，核苷三磷酸，引物和聚合酶鏈反應所需的其它試劑，裝置被提 供有用於對反應室內含物的溫度進行溫度控制的工具，以將溫度控制 到使雙鏈多核苷酸去雜交，使引物退火，以及使多核苷酸聚合和擴增 的溫度。
但是，使常規的微流體裝置適合地協調各種不同的任務，可能是 困難的。
發明簡述
對於能夠以簡單的方式進行樣品分析的裝置和方法存在著需求。
一方面，裝置包括剛性的基體，至少部分覆蓋著基體的撓性覆蓋 元件，在基體中形成的第一結構，該結構適於容納液體並適於釋放一 種或多種細胞，孢子或病毒的內含物，內含物中包含有靶分子(例如 結構或室或孔中乾燥的緩衝液)，在基體中形成的第二結構(它可以 與第一結構不同)，該結構適於容納液體並含有至少一個結合元件， 該結合元件適於捕獲靶分子並用於測定表明靶分子的存在和/或量的 值，微流體網路，將至少第一結構和第二結構相互連通，還包括致動 器元件，適於通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關閉一部分微流 體網路，來實現第一結構和第二結構之間的流體流動。
另一方面，裝置包括有適於容納液體的結構，其中結構包括至少 一個結合元件，並與微流體網路流體連通，以及控制單元，適於控制 流體流過微流體網路，由此使得靶分子被捕獲在至少一個結合元件上， 適於控制結構中靶分子的擴增，並適於控制表明靶分子的存在和/或量 並捕獲在至少一個結合元件上的化合物的檢測。
另一方面，方法包括將液體容納在含有至少一個結合元件並與微 流體網路流體連通的結構中，控制流體流過微流體網路，由此使得靶分子被捕獲在至少一個結合元件上，在結構中擴增靶分子，以及檢測 能夠表明靶分子的存在和/或量並捕獲在至少一個結合元件上的化合 物。
另一方面，裝置包括有適於容納液體的結構，其中結構包括有適 於捕獲第一化合物的第一結合元件，並包括有適於捕獲表明第一化合 物的存在和/或量的第二化合物(可以與第一化合物不同)的第二結合 元件(可以與第一結合元件不同)。
另一方面，可以提供裝置，其中樣品在控制單元的控制下被指導 通過微流體裝置，由此使得可以執行預定的分析任務。在裝置中，可 以提供能夠執行幾個或所有在分析過程中所需的固相結合過程的中心 孔/中心結構(也可以被稱為第二孔或第二結構)。在結構(可以白稱 為中心孔)中，捕獲樣品的耙分子(出於純化或分離的目的)，擴增 耙分子(例如通過聚合酶鏈反應PCR)，以及執行允許獲得與靶分子 的存在/不存在或甚至量有關的信息的(例如光學)檢測步驟，是可能 的。
因此，可以提供強有力的，全自動的生物化學分析系統，允許以 快速準確的方式，並且不需要過多的人力，獲得生物化學或醫學結果。 例如，使用這樣的裝置，可以定性或定量的方式在患者的全血樣品中 檢測與HIV感染有關的核酸。
接下來，將進一步解釋裝置和方法的示例性實施方案。在中心孔 中被檢測的化合物可以是靶分子。為此，可以在中心孔中提供特定的 結合元件(例如與捕獲靶分子所需的結合元件不同的結合元件)。靶 分子可以與結合元件結合。靶分子可以是例如源自於游離的或與細胞
相關的病毒例如HIV的核酸，包括源自於游離病毒的RNA，源自於細 胞相關病毒的RNA，前病毒DNA，反轉錄的病毒DNA (即病毒複製 的"中間體")，以及源自於前病毒DNA的轉錄本(即通過宿主DNA基因組的轉錄獲得的RNA分子)。
或者，可以提供特定的化合物例如報告化合物，它們可以與例如
PCR產物，RNA或DNA結合。在這種方案中，報告化合物可以是被 檢測的，從而允許間接地獲得與樣品中靶分子的存在和/或量有關的信 息的化合物。
至少一個結合元件可以適於捕獲靶分子。例如，至少一個結合元 件可以包括能夠捕獲複合物包括靶分子，例如全病毒核酸的標記的珠 子。
至少一個結合元件可以適於捕獲表明靶分子的存在和/或量的化 合物。因此，不僅可以直接檢測單獨的個體耙分子，而且還可能間接 地檢測耙分子，例如通過檢測捕獲在結合元件上的報告化合物。
至少一個捕獲元件可以包括適於捕獲靶分子的第一結合元件，並 可以包括適於捕獲指示靶分子的存在和/或量的報告化合物的第二結合 元件(可以不同於第一結合元件)。因此，可以提供兩種不同種類的 化合物， 一種特異性用於在裂解後捕獲靶分子，例如含有特異性針對 靶多核苷酸的區域的結合部分以及錨定基團的捕獲分子；另一種用於 檢測目的，例如能夠與靶多核苷酸形成複合物的報告化合物，其中復 合物與靶多核苷酸形成的複合物抑制了報告化合物被第二結合元件的 捕獲。換句話說，捕獲可以與檢測在功能上去偶聯。例如，第一結合 元件可以是被構成為與含有捕獲分子和靶分子的複合物結合，例如通 過與捕獲分子的錨定基團結合的珠子，而第二結合元件可以是能夠捕 獲報告化合物的中心孔的表面。作為第二結合元件的中心孔的表面可 以包含一種或多種不同的報告化合物特異性捕獲分子，每種都能夠捕 獲表面上的報告化合物。
結構，即發生各種不同固相結合過程的中心元件，可以是孔。"孔"可以是在基體上形成並提供可以在其中進行各種分析過程的樣品室的 缺口或凹陷。這樣的孔可以是圓柱形結構或罐形穴，其體積在微升到 毫升的量級上。
微流體網路可以包含通道或大量相互連通的通道。"通道"可以 是指長度明顯大於寬度和高度的流體結構(例如基本上一維的結構)， 從而為液體能夠沿著它運輸提供了通路。可以提供單一通道，或者幾 個通道可以被相互連通而形成通道系統。這樣的通道系統可以允許液 體在該系統的分支處從一個通道流到另一個通道。可以將一個或多個 孔整合在這樣的通道系統中。
除了上述的結構例如"中心"結構之外，微流體網路可以包含至 少一個另外的結構。換句話說，除了通道和中心孔之外，可以提供其 它的微流體元件，例如其它的通道和/或其它的孔。因此，可以提供孔 和通道的複雜的系統。
至少一種其它的結構(例如裂解結構或裂解孔)可以適於釋放一 種或多種細胞，孢子或病毒的內含物，內含物包括靶分子。因此，這 樣的其它結構可以是指裂解室，生物化合物例如細胞在其中被迫釋放 出它們的內含物，用於後續的分析。裂解室可以包括含有執行這樣的 釋放內含物的任務的生化試劑的結構，從而提供運輸到中心孔中的修 飾的樣品。就此而言，裂解室可以含有裂解試劑，例如離液序列高的 鹽，或含有一種或多種裂解細胞膜和/或病毒衣殼的去汙劑的試劑。可 選地或此外，另外的結構例如裂解室可以適於加熱樣品以便破壞細胞 膜和/或病毒衣殼(例如通過使用或包含下面描述的溫度控制單元和/或 溫度調節單元)。
至少一個另外的結構也可以包括能夠與靶分子形成複合物的捕獲 探針。因此，在存在帶有錨定基團的捕獲分子的情況下裂解樣品是可 能的。至少一個另外的結構(例如含有PCR試劑的孔)可以包括至少一 種促進靶分子的擴增的基體。換句話說，可以提供另外的孔，其中含 有促進擴增所需的生化試劑。儘管PCR試劑可以包含在另外的結構中，
但事實上PCR擴增步驟可以在另一個位置執行，例如在中心孔中。正
如將在下面更詳細解釋的，在某些情況下，將樣品從中心孔通過包含 擴增物質的孔再運輸返回到中心孔，同時避免樣品材料的損失，可能
是有利的。促進擴增的物質可以是PCR所需的物質(例如酶，引物， 緩衝液等)，將在下面詳細描述。
至少一個另外的結構也可以是孔。因此，可以提供通過微流體網 路連通的多個孔。但是，在孔之外其它的結構例如通道中進行裂解和/ 或提供擴增材料，也是可能的。
裝置可以包含基體，可以在其上和/或其中形成結構。因此，裝置 的流體容納部件可以整體整合在基體中。可選地，結構可以在基體上 形成，例如印刷上或點上。可以與撓性覆蓋元件適合地協同使用的剛 性基體材料的例子是聚碳酸酯，聚丙烯，聚苯乙烯，PET， PMMA，聚 乙烯，丙烯酸玻璃，PU， PEEK,， PVC，玻璃，等等。
具體來說，基體可以是剛性的，使得它可以與至少部分覆蓋著基 體的撓性覆蓋元件以非常有效的方式協同使用。具體來說，撓性覆蓋 元件可以覆蓋剛性基體，致動器可以將覆蓋元件壓向基體，以選擇性 關閉通道(用於執行閥功能等)。
按照示例性實施方案，基體可以具有第一表面以及與第一表面相 對的第二表面。結構可以提供在基體的第一表面(特別是第一主表面) 上和/或中。另外的結構可以提供在基體的第二表面(特別是第二主表 面)上和/或中。可以提供流體連通結構，特別是透過基體的貫穿孔和/ 或基體表面部分中的溝槽，將第一表面與第二表面連通。這樣的流體連通結構可以布置在第一和第二表面之間，並且可以被構造為在結構 與另外的結構之間提供流體連通。在這樣的實施方案中，可以對基體 的兩個相對的主表面進行加工，從而形成微流體結構。這些結構可以 通過含有沿著基體的表面形成的通道的連通結構連通，也可以直接穿 過基體。因此，可以提供其中基體的兩個主表面部分都可以以非常有 效的方式使用的裝置，因為該基體的兩個主表面都可以被加工以提供 液體運輸任務。可選地，這樣的基體可以在一個或兩個側面上用(特 別是撓性的)覆蓋元件覆蓋，以允許有效地控制流體流過兩個表面上 的流體結構，例如通過致動器作用於一個或兩個主表面上的撓性部分。 因此，中心基體可以在兩個側面上提供有流體結構。具體來說，這可 以允許製造由三個層形成的盒，這三個層是基體以及兩個至少部分撓 性的覆蓋元件。這樣的三層結構可以具有(例如撓性的)底部元件和 (例如撓性的)覆蓋元件，中間夾心有用於容納微流體結構的中間層 (例如是剛性的)。底部元件和/或覆蓋元件可以完全覆蓋中心基體， 也可以僅僅是部分覆蓋，例如在需要覆蓋功能作為基礎進行基於致動 器的控制的部位(參見例如圖21)。
除了基體之外，裝置可以包括至少一個另外的基體，其中在另外 的基體上和/或中可以提供另外的結構。基體和另外的基體可以適於彼 此之間可以連接，或可以固定，或可以裝配，或可以可逆地或可拆卸 地安裝，使得在基體與另外的基體連接或固定或裝配或安裝的操作狀 態下，結構與另外的結構可以變得流體連通。在這樣的實施方案中， 可以提供模塊式構造，其中裝置可以通過將幾個可以彼此可撓性連接 的模塊合併起來而形成。相應的盒可以通過模塊式構造組形成，其中 每個模塊可以具有下面的性質，並可以與其它協同形成的模塊組合使 用
-它包括具有至少兩個流體通路的室； -室包括剛性的部件和有彈性的部件；
-至少一個流體通路可以通過彈性部件的移動而關閉，並可以實 現室的內含物的混合。至少一個結合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程中，多 個固相結合過程發生在至少一個結合元件上。術語"固相結合過程" 可以具體包括在功能化/結合元件上任何種類的錨定和雜交等。在本文 中，"結合元件或支持元件"可以包括任何物質，被構造為與捕獲分 子的錨定基團結合的表面或功能化元件，和/或被構造為捕獲多核苷酸 的表面。固相結合過程可以包括任何其中被分析或檢測的分子與固相 表面特異性結合的步驟，也就是說，被分析或檢測的分子不在溶液中 結合，而是結合在固體表面上。
至少一個結合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程中，所 有固相結合過程都發生在至少一個結合元件上。換句話說，在這樣的 實施方案中，沒有固相結合過程發生在中心孔/結構之外的其它孔上。 這可以允許在單個孔中進行所有固相結合過程，使得微型高效的裝置 成為可能。至少一個結合元件可以被改造，以便在靶分子的分析過程 中，恰好兩個固相結合過程發生在至少一個結合元件上。這兩個固相 結合過程可以涉及從多組分樣品中捕獲耙分子，以及檢測指示靶分子 的存在或不存在或量的化合物。在所述實施方案中，這兩個步驟在單 個孔中進行，允許協同使用孔的供應物執行這兩個任務。將這兩個任 務合併在一個孔中，可以保持液體流動路徑短，保持裝置小，並保持 分析時間短。
在某些實施方案中，至少一個結合元件可以被改造，以便在靶分 子的分析過程中，恰好三個固相結合過程發生在至少一個結合元件上。 這三個固相結合過程可以涉及從多組分樣品中捕獲靶分子，捕獲來自 於靶核酸的反轉錄的核酸，以及檢測指示靶分子的存在或不存在或量 的化合物。在所述實施方案中，這三個步驟在單個孔中進行，允許協 同使用孔的供應物執行所有這些任務。將這三個任務合併在一個孔中， 可以保持液體流動路徑短，保持裝置小，並保持分析時間短。可選地，至少一個結合元件可以被改造，以便在樣品中靶分子的 分析過程中，恰好一個固相結合過程發生在至少一個結合元件上。當 全部生化分析或實驗只包括單個固相結合過程，例如僅僅是為了樣品 純化進行預先觀察而不是為了檢測時，這樣的實施方案可能是特別有 利的。
位於至少一個結合元件附近的裝置的至少一部分可以透過波長範
圍在大約lnm到大約10pm之間的電磁輻射，以便能夠對表明靶分子 的存在和/或量並捕獲在至少一個結合元件上的化合物進行基於電磁輻 射的檢測。在這種實施方案中，基體的特別是靠近中心孔的部分可以 透過用於檢測目的的電磁輻射，特別是在近紅外，可見光和/或紫外波 長範圍中的電磁輻射。因此，在中心孔中，在電磁輻射的基礎上進行 檢測(例如基於螢光的檢測)是可能的。當裝置位於至少一個結合元 件附近的部分可以透過波長範圍在大約400 nm到大約800 nm之間的 電磁輻射時，能夠進行化合物的光學檢測。
裝置可以包括溫度操縱單元或可以與溫度操縱單元相連，該溫度 操縱單元適於操縱位於結構中的液體的溫度。這樣的溫度操縱單元可
以包括加熱和/或冷卻元件，允許將樣品帶到特定的溫度，或執行特定 的溫度組合形式或順序。
溫度操縱單元可以被改造，以按照執行聚合酶鏈反應(PCR)的 溫度順序操縱位於結構中的液體的溫度。這樣的聚合酶鏈反應可能需 要溫度循環，例如大約95。C，大約55。C和大約72°C。該順序可以執行 特定的預定時間間隔，並且可以重複預定的循環數。
至少一個結合元件可以被構造為與捕獲分子的錨定基團結合。具 體來說，至少一個結合元件可以被構造為捕獲多核苷酸。
至少一個結合元件可以包括選自捕獲分子(例如布置在結構的表面上(例如固定在孔中)的報告化合物特異性捕獲分子)，布置在粒 子上(例如珠子上)的捕獲分子，布置在結構的多孔表面(例如多孔 玻璃結構)上的捕獲分子中的至少一個，以及一種或多種不同的捕獲 分子(例如布置在結構的表面上不同位置的報告化合物特異性捕獲分 子(例如不同種類的捕獲分子以陣列似的方式固定在孔中，例如在關 於競爭性分析的文本中))。在某些實施方案中，至少一個結合元件 也可以包括用於捕獲錨定基團例如生物素的捕獲分子。
結構可以具有大約1 到大約1 mL之間的體積，特別是大約20 )iL到大約300 pL之間。例如，可以提供具有大約100pL體積的孔。
基體可以具有成形成以接受插管，為裝置供應液體的溝槽。在這 樣的實施方案中，對於用戶來說操縱裝置可能是非常容易的，因為只 需要將用於樣品供應的插管放置在溝槽中，與微流體通道系統適合地 匹配和協作，從而允許進行容易的分析，甚至即使是沒有特別的經驗 或訓練過的用戶也可以進行。
基體可以在結構附近具有窗口部分，可以透過波長範圍在大約1 nm到大約10pm之間的電磁輻射(也就是說近紅外，可見光或紫外輻 射)，特別是波長範圍在基本上400 nm到基本上800 nm之間的電磁 輻射(具體來說是可見光輻射)，從而允許流過(更準確來說到達) 結構或微流體網路的液體的彎月液面的基於電磁輻射的檢測。在這樣 的實施方案中，基體的透光的窗口部分可以通過輻射檢測器檢測。當 泵抽通過微流體網路或結構的流體的彎月液面通過窗口部分時，通過 窗口部分的傳播性質可以特徵性的方式急劇改變，從而在輻射檢測器 上產生表明彎月液面已經到達裝置中的特定位置的信號。該信號可用 於觸發目的，或作為致動器的控制信號，因為致動器的協同移動和/或 溫度操縱單元的控制可以適合按照被泵抽通過裝置的樣品的當前位置 來產生。例如，通過採取這樣的措施，當發生溢流時，可以檢測到預 定體積的水或緩衝液已經被泵抽進入裝置中。結構和另外的結構構成的至少一個可以包括兩個流體開口。這樣 的流體開口可以是流體入口和流體出口 。
覆蓋元件可以是撓性的覆蓋元件。特別是與剛性基體配合時，覆 蓋元件和基體可以形成在三維空間上密封的通道，可以通過作用於覆 蓋元件上的致動器適合地控制。當覆蓋元件的特定位置在外部力量的 影響下至少部分可變形時，通過打開或關閉結構或微流體網路選擇性 地使液體能夠或不能流動，是可能的。除此之外，使用這樣的覆蓋元 件，沿著結構運輸液體是可能的。
特別是當提供了致動器元件並將其改造成被致動時能夠使覆蓋元 件變形時，可以提供整合有混合，泵抽和/或閥功能的高性能晶片實驗
室(lab-on-chip)。
任何一個結構可以含有一種或多種具有生物學，生物化學和/或化 學活性的物質。因此，當這樣的物質，可以包括捕獲分子，報告化合 物特異性捕獲分子，可檢測標記物，裂解試劑和PCR試劑，以乾燥的 形式，特別是冷凍乾燥的形式存在於孔中時，提供用戶只需要用液體
(例如水，緩衝液和樣品)進行填充就可以進行全自動分析的裝置， 是可能的。當必需的生化成分被提供在不同的孔中時，用戶可以簡單 地基於儲存在控制單元中的順序來開始實驗，並可以將水或緩衝液提 供給不同的輸入室。其餘部分將由全自動裝置來執行。
通道可以具有大約50 pm到大約1 mm之間，特別是大約100 pm 到大約300 pm之間的寬度(即是在基體的表面平面中垂直於流體流動 方向上的維度)。例如，通道的寬度可以是大約200 pm。通道的高度
(在垂直於基體的表面平面並垂直於流體流動方向的方向上的維度) 可以在大約20 pm到大約300 pm，特別是大約50pm到大約200 之 間的範圍內。例如，通道的高度可以是大約100 pm。與此相比，通道的長度可以遠遠大於寬度和高度，例如可以大於lmm，具體來說可以 大於lcm，或甚至可以是幾釐米。
結構可以包括適合用作液體的運輸介質的材料。例如，材料可以 包含固體材料，凝膠材料，液體材料中的至少一種及其組合。因此， 結構可以是凹陷，或可以由用作液體的載體的材料而形成。
覆蓋元件可以包括撓性的膜或撓性的密封件。這樣的撓性膜或撓 性密封件可以由例如乳膠這樣的材料製成，從而使得覆蓋元件可以在 機械力(例如由致動器元件產生的)的影響下撓性地變形。
裝置可以包括適合於被致動以使得覆蓋元件變形的致動器元件， 從而控制結構和/或微流體網路中液體的流體流動性質。這樣的致動器 元件可以在控制單元的控制之下，可以具有多個協同作用於撓性覆蓋 元件上的銷針(pin)或型板，從而選擇性打開或關閉通道，出於泵抽 或混合目的暫時減小通道或孔的體積，等等。
具體來說，致動器元件可以被改造適於控制沿著通道的直線部分 的液體的流體流動性質。當流體沿著直線通道流動時，當該通道在特 定部分被關閉時，垂直布置的致動器元件可以有效地使流體不能流動。
致動器元件可以被改造以用作閥，用作流體混合器，和/或用作流 體泵。
更具體來說，致動器元件可以包括多個被改造適合於被協同致動 使得覆蓋元件變形的致動器元件，從而按照控制單元確定的流體流動 方案控制液體的流體流動性質。因此，當用戶選擇了包括通過各種不 同通道運輸流體和樣品的特定的實驗或分析方法時，控制單元簡單地 控制致動器元件的各個型板，提供撓性覆蓋元件的這種可逆的壓縮， 從而完全自動地執行分析。控制單元可以被改造適於控制致動器元件將覆蓋元件變形的方 式，使得靶分子被捕獲在至少一個結合元件上，使得靶分子在結構中 被擴增，並使得指示靶分子的存在和/或量並捕獲在至少一個結合元件 上的化合物被檢測。因此，控制單元可以是裝置的中央調節器，協調 各個不同部件的功能。
致動器元件可以包括一個或多個銷針，它們被構造為往復地，例 如交替在向前和向後方向上移動。通過在向前方向上移動銷針，可以 通過在通道中將撓性覆蓋元件壓向基體而關閉該通道。當銷針向後移 動時，通道可以被再次打開，允許流體流動。在某些實施方案中，一 個或多個銷針可以具有至少部分彈性的尖端。
致動器元件還可以被提供成可在垂直於基體的主表面的方向上移 動。通過在垂直於平面基體的方向上往復移動，有效地打開和關閉成 為可能。特別是，致動器元件可以被提供成可移動的，以選擇性關閉 至少一部分結構，使得液體不能通過結構進行運輸。在另一種操作模 式下，致動器元件可以被移動，以選擇性打開至少一部分結構，使得 液體能夠運輸通過結構。
致動器元件可以改造成垂直於基體的主表面往復移動，來選擇性 地使液體能夠或不能流動流體通過結構。使用往復的致動器可以允許 流體可逆地和選擇性地能夠或不能流動，允許非常靈活地操作裝置， 並允許多次使用裝置(與其中通道被不可逆關閉以執行單向閥功能的 方法相反)。
致動器元件可以適於在垂直於基體的主表面的方向上往復移動， 以將液體泵抽通過結構。因此，通過致動器元件控制結構的體積或高 度是可能的。致動器元件還可以選擇性關閉結構。關閉結構可以在閥 功能，混合功能或泵抽功能的背景下進行。但是，在檢測階段使用這樣的致動器也是可能的，因為出於檢測的目壓縮結構和/或結合元件以 增加被檢測的靶分子的局部濃度，和/或除去背景信號，是可能的。這 可以允許增加準確性。
可以提供驅動單元以機械驅動致動器元件，其中驅動單元可以通 過控制單元控制。這樣的驅動單元可以包括氣動驅動機構，液力驅動 機構或電磁驅動機構。
至少一個結合元件可以包括三維的介質，例如粒子，珠子或多孔 基質。三維介質可以布置和構造為可以通過移動致動器元件可逆地壓 縮。通過採取這樣的措施，有可能進行非常準確的檢測，因為被檢測 的分子的局部濃度，可以通過將其上已經結合有指示靶分子的存在或 量的化合物或複合物的三維介質(例如珠子)進行壓縮來選擇性增加。
裝置可以適於生物傳感器分析裝置，微流體盒或晶片實驗室。因 此，在小規模上，各種不同的生化功能可以被合併，以進行完整的生 化實驗。
可以提供溫度傳感器，並被改造適於感應運輸通過裝置的液體的 溫度。溫度傳感器可以整合在基體中，從而感應流過微流體網路的液 體的溫度。可選地，溫度傳感器可以布置在致動器元件上，例如在型 板類致動器的尖端上，以便當將覆蓋元件壓向基體時，致動器可以同 時測量流體的局部溫度。
裝置可以包括適於操作液體的溫度的溫度操縱單元，它優選布置 在致動器元件上。這樣的溫度操縱單元也可以整合在基體中，例如以 電熱絲的形式整合在基體中，並加熱孔中的樣品。或者，這樣的溫度 操縱單元可以是外部裝置，例如外部電磁輻射源，其中電磁輻射(例 如來自雷射器)可以被導入孔中，導致使用電磁輻射作為能量源加熱 孔中的流體。此外可選地，溫度操縱單元可以不包括或不僅僅包括加熱元件，還可以包括冷卻元件。對於這樣的實施方案來說，可以不費
力地使用珀耳帖致冷器(Peltier cooler)。
可以提供溫度操縱單元並改造為適於操作液體的溫度，其中溫度 操縱單元可以包含第一加熱元件和第二加熱元件，結構被布置在第一
加熱元件和第二加熱元件之間。通過提供這樣的兩個加熱板， 一個是 連續的板，另一個是環形板，可以在使裝置仍然能夠使用基於電磁輻 射的檢測器操作的情況下進行加熱，因為環形板中的凹陷可以使電磁 輻射被導入到中心孔中，並允許通過凹陷和第二加熱元件檢測螢光輻 射。
可以提供溫度調控單元，並被改造為適於調控結構中液體的溫度。 這樣的調控實體可以包括測量實際溫度，以及在該測量的基礎上進行 加熱和/或冷卻行為，從而將溫度調節到所需的值。
可以提供檢測單元並被改造為適於檢測結構中指示靶分子的存在 和/或量，並捕獲在至少一個結合元件上的化合物。這樣的檢測單元可 以包括光學檢測單元，特別是螢光檢測單元。
基體和覆蓋元件可以是分別的元件，它們彼此相連。或者，基體 和覆蓋元件可以由不同材料製成。
可以提供運輸單元，並被改造為適於運輸液體通過結構和/或微流 體網路。這樣的運輸單元可以包括泵，特別是壓縮空氣泵，液壓泵， 蠕動泵和真空泵中的一個。此外，裝置可以被改造，使得在正常使用
時，重力促使液體以所需的方式流過裝置。因此，在運輸單元不活動 時，液體可以直接按所需方向流動。但是，當運輸單元打開時，運輸 單元的影響可以超過重力的影響，從而允許選擇性地起始與重力相反 方向的流體流動。因此，重力與特定運輸單元的組合可能是非常有利 的，可以允許節能運作。運輸單元可以被改造適於通過驅動結構和/或微流體網路中的氣 泡來運輸液體。通過將氣泡移動通過裝置，可以支持或促進液體運輸 通過裝置。
至少一個過濾器，特別是至少一個熔融玻璃過濾器，可以布置在 結構上(也就是說在中心孔的入口和/或出口處)，可以被改造適於防 止布置在結構中的至少一個結合元件(例如珠子)從結構中被洗出。 在流體流動的影響下，機械力可以作用在結構中的珠子或其它結合元 件上。但是，當在結構的入口和/或出口處提供熔融玻璃過濾器，即由 燒結材料製成的多孔過濾元件時，可以安全地阻止珠子被洗出中心室。 熔融玻璃過濾器可以被提供為環形形狀，允許被插入到裝置中相應形 狀的環形溝槽中。
至少一個結合元件可以包括表面功能化。術語"表面功能化"可 以是指表面被加工處理成可以進行特定的結合功能這個事實。在這樣 的實施方案中，結合元件可以是孔的表面的一部分，或連接或結合到 孔的表面上。
基體和覆蓋元件可以彼此直接接觸。或者，基體可以不與覆蓋元 件直接接觸。各種不同的幾何構型都可能實現。
基體的位於結構附近的一部分可以透過波長範圍在大約400 nm 到大約800 nm之間的電磁輻射，從而允許在結構中進行光學檢測。因 此，可見光可用於檢測目的。這樣的檢測可以在光吸收，光反射或熒 光的產生的基礎上進行，例如使用與被檢測的分子或複合物結合的熒 光標記物。
至少一個結合元件可以被改造，使得在靶分子的分析過程中，至 少兩個固相結合過程發生在至少一個結合元件的恰好一個上。換句話說，同一個結合元件可用於多個固相結合過程。例如，帶有結合基團 的珠子可用於將靶分子捕獲出樣品，並且隨後可用於捕獲化合物例如 被擴增的和標記的靶分子，作為後續檢測的基礎。或者，至少一個結合元件可以被改造，使得在靶分子的分析過程 中，至少兩個固相結合過程發生在不同的至少一個結合元件上。在這 樣的構造中，例如一方面從樣品捕獲分子，另一方面檢測表明靶分子 的成分，是使用兩種不同的結合元件來捕獲的。例如，可以提供珠子 用於將靶分子捕獲出樣品。另一方面，可以在競爭性分析的情況下使 用捕獲分子，例如固定在孔中的報告化合物特異性捕獲分子，以捕獲 表明樣品中靶分子的存在或量的成分，例如報告化合物。另一種情況下，方法包括了形成複合物，每種複合物含有靶核酸 和捕獲分子，其中每個捕獲分子含有特異性針對靶核酸的區域的結合 部分，以及錨定基團；將複合物與結合元件相接觸，結合元件被構造 為與捕獲分子的錨定基團結合，從而將複合物結合在結合元件上；對 一或多種耙核酸進行擴增；將擴增的靶核酸捕獲在相應的結合元件上； 以及測定表明被捕獲的靶分子的存在和/或量的值。一或多種靶核酸可以是單鏈或雙鏈核酸。方法還可以包括在將一或多種靶核酸進行擴增之前將靶核酸進行 反轉錄。方法還可以包括將捕獲的被擴增的靶核酸從結合元件上釋放，並 重複將一或多種靶核酸進行擴增和將擴增的靶核酸捕獲在相應的結合 元件上的步驟。在這樣的實施方案中，從結合元件上釋放被捕獲的擴 增的靶核酸，以及重複將一或多種靶核酸進行擴增和將擴增的靶核酸 捕獲在相應的結合元件上的步驟的循環，可以進行至少10次或至少20 次。表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值可以在至少一個循環後 測定，例如在每個從結合元件上釋放被捕獲的擴增的靶核酸，以及重 復將一或多種靶核酸進行擴增和將擴增的靶核酸捕獲在相應的結合元 件上的步驟的循環之後。結合元件可以包括一個或多個能夠捕獲靶核酸的捕獲分子。在這 樣的實施方案中，靶核酸被一個或多個捕獲分子捕獲到相應的結合元 件上。結合元件還可以包含粒子。形成包含有靶核酸和捕獲分子的複合物的步驟的進行，可以與將 複合物與結合元件相接觸的步驟在空間上分開。方法還可以包括對靶核酸進行標記。在例如將一或多種靶核酸進 行擴增之前或期間，和/或在將擴增的靶核酸捕獲到相應的結合元件上 之前，可以通過加入一個或多個可檢測的標記物對靶核酸進行標記。 一個或多個可檢測的標記物可以是螢光標記物。表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測定，可以包括對獲得 的一個或多個指示值進行時間依賴性的監測。方法還可以包括在形成包含有耙核酸和捕獲分子的複合物之前， 提供一或多種靶核酸。提供一或多種靶核酸的步驟可以包括從生物學 材料上釋放耙核酸。在這樣的實施方案中，生物學材料可以選自一種 或多種原核細胞， 一種或多種真核細胞， 一種或多種紅細胞，以及一 種或多種病毒粒子，以及它們的混合物。此外，從生物學材料中釋放 耙核酸可以包括將生物學材料與裂解試劑相接觸。提供一或多種靶核酸可以包括提供含有一或多種靶核酸的樣品， 其中樣品可以選自全血，血漿，血清，尿液，痰液，唾液和腦脊髓液。提供一或多種靶核酸可以與含有靶分子和捕獲分子的複合物的接 觸步驟，對一或多種靶核酸進行擴增的步驟，將擴增的靶核酸捕獲到 相應的結合元件上的步驟，以及測定表明捕獲的靶核酸的存在和/或量 的值的步驟，在空間上分開進行。
方法還可以包括將一或多種靶核酸與並存的材料分離開。
在其它的實施方案中，示例性實施方案的方法在上面描述的裝置 中進行。例如，方法可以在裝置中進行，該裝置包括剛性基體；至少 部分覆蓋了基體的撓性覆蓋元件；在基體中形成的第一結構，被改造 為適於容納液體，並被改造為適於釋放一種或多種細胞，孢子或病毒 的內含物，內含物中包含有靶分子，例如靶核酸；在基體上形成的第 二結構，被改造為適於容納液體並包括至少一個結合元件，該結合元 件被改造為適於捕獲靶分子並被改造為適於測定表明靶分子的存在和/ 或量的值；微流體網路，將至少第一結構和第二結構相互連通；以及 致動器單元，被改造為適於通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關
閉一部分微流體網路，來實現第一結構和第二結構之間的流體流動。 此外，方法可以在裝置中進行，該裝置包括被改造為適於容納液體的 結構，其中結構包括至少一個結合元件，並與微流體網路流體連通； 以及控制單元，被改造為適於控制流體流過微流體網路的方式，使得 靶分子例如靶核酸被捕獲在至少一個結合元件上，被改造為適於控制 結構中的靶分子的擴增，並被改造為適於控制被捕獲在至少一個結合 元件上的化合物的檢測。
裝置可以包括被改造為適於容納液體的第一結構。在這樣的實施 方案中，包括靶核酸和捕獲分子的複合物在第一結構中形成。
此外，裝置可以包括第二結構，它被構造用於檢測一或多種靶核 酸，含有覆蓋著第二孔的覆蓋元件，以及適於被驅動使得覆蓋元件變形的致動器單元。在這樣的實施方案中，表明被捕獲的靶核酸的存在 和/或量的值的測定，可以在第二結構中進行。
此外，將一或多種靶核酸進行擴增和/或將擴增的靶核酸捕獲在相 應的結合元件上，也可以在第二結構中進行。
使用被致動的致動器使得覆蓋元件變形，可以進行表明被捕獲的 靶核酸的存在和/或量的值的測定。覆蓋元件可以被變形，使得檢測孔 的體積減小。在這樣的實施方案中，在測定表明被捕獲的耙核酸的存 在和/或量的值之後，第二孔的體積可以被重新增加。
按照本發明的另一個示例性實施方案，提供了方法，該方法包括 提供一定量報告化合物；第一結合元件被構造為與捕獲分子的錨定基 團結合；第二結合元件能夠捕獲報告化合物； 一定量的耙核酸能夠與 報告化合物形成複合物；與報告化合物形成複合物抑制了報告化合物 被第二結合元件的捕獲； 一定量的捕獲分子，其中每個捕獲分子含有 特異性針對靶核酸的區域的結合部分以及錨定基團；形成包含有靶核 酸和捕獲分子的複合物；將複合物與第一結合元件相接觸，將複合物 結合到第一結合元件上；從第一結合元件上釋放出至少一部分量的靶 核酸；形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸的複合物； 將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結 合元件上；以及測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在 和/或量的值。
報告化合物可以含有一種或多種可檢測標記。 一種或多種可檢測 標記可以是螢光標記。此外，報告化合物可以是寡核苷酸。
方法還可以包括根據表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的 存在和/或量的值，來確定表明靶核酸的存在和/或量的值。方法還可以包括在測定了表明捕獲在第二結合元件上的報告化合 物的存在和/或量的值之後，將剩餘部分量的報告化合物從第二結合元 件上釋放出來；形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸 的複合物；將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕 獲在第二結合元件上；以及測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化 合物的存在和/或量的值。在這樣的實施方案中，釋放，形成複合物， 捕獲和測定的步驟可以進行額外的N次，其中N是大於或等於1的整 數，例如N^5， N^10或N上20。
此外， 一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合 物的步驟，以及將沒有與耙核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合 物捕獲在第二結合元件上的步驟，可以伴隨進行。
方法還可以包括將靶核酸進行擴增。在這樣的實施方案中，靶核 酸的擴增可以在形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸 的複合物的步驟之前開始。
表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，可 以在一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步 驟，以及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲 在第二結合元件上的步驟達到化學平衡之前進行測定。具體來說，表
明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，可以在一 部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步驟，以 及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二 結合元件上的步驟開始後1秒到120秒時進行測定。
方法還可以包括在將靶核酸進行擴增之前對它們進行反轉錄。
第二結合元件可以包括能夠將報告化合物捕獲在第二結合元件上 的一種或多種不同的報告化合物特異性捕獲分子。捕獲分子可以是寡核苷酸。不同的報告化合物特異性捕獲分子可以布置在相應的第二結 合元件的不同位置上。此外，報告化合物可以通過與報告化合物特異 性捕獲分子形成複合物而捕獲在第二結合元件上。報告化合物能夠與 靶核酸形成複合物的相互作用位點的至少一部分，也能夠與報告化合 物特異性捕獲分子形成複合物。報告化合物特異性捕獲分子和靶核酸 可以競爭與報告化合物形成複合物。
擴增可以包括變性雙鏈核酸的步驟。雙鏈核酸可以包括報告化合 物與靶核酸的複合物，報告化合物與報告化合物特異性捕獲分子的復 合物，雙鏈的報告化合物和雙鏈的靶核酸。
擴增還可以包括將引物分子退火到靶核酸的步驟。在該實施方案 中，退火步驟可以與一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸 形成複合物的步驟，和/或將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的 報告化合物捕獲在第二結合元件上的步驟相伴進行。
擴增可以是循環式的擴增，例如PCR。 PCR的進行可以包括使用 具有外切核酸酶活性的聚合酶。循環式擴增可以包括至少IO個循環或
至少20個循環。
表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，可 以在至少一個循環後進行測定，例如在循環式擴增的每個循環後。此 外，表明靶核酸的存在和/或量的值，可以在每次表明捕獲在第二結合 元件上的報告化合物的存在和/或量的值被測定之後進行測定。
表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的 測定，可以包括指示值的時間依賴性監測。
此外，表明靶核酸的存在和/或量的值，可以根據將表明報告化合 物的存在和/或量的值與表明靶核酸的存在和/或量的值相關聯的校正曲線來確定。
方法也可以在上述的裝置中進行。例如，方法可以在裝置中進行， 該裝置包括剛性基體；至少部分覆蓋了基體的撓性覆蓋元件；在基體
中形成的第一結構，適於容納液體，並適於釋放一種或多種細胞，孢
子或病毒的內含物，內含物中包含靶核酸；在基體上形成的第二結構， 適於容納液體並含有至少一個結合元件，該結合元件適於捕獲靶核酸 並適於測定表明靶核酸的存在和/或量的值；微流體網路，將至少第一 結構和第二結構相互連通；以及致動器單元，適於通過將撓性覆蓋元 件壓向基體以選擇性關閉一部分微流體網路，來實現第一結構和第二 結構之間的流體流動。方法也可以在裝置中進行，該裝置包括適於容 納液體的的結構，其中結構包括至少一個結合元件，並與微流體網路 流體連通；以及控制單元，適於控制流體流過微流體網路，使得靶核 酸被捕獲在至少一個結合元件上，適於控制結構中的靶分子的擴增， 並適於控制被捕獲在至少一個結合元件上的化合物的檢測。
裝置還可以包含適於容納液體的第一結構。在這樣的實施方案中， 含有靶核酸和捕獲分子的複合物的形成在第一結構中進行。
此外，裝置可以包含適於容納液體的第二結構，在第二結構中可 以提供第一以及可選的第二結合元件。在這樣的實施方案中，形成含 有靶核酸和捕獲分子的複合物；將複合物與第一結合元件相接觸，以 將複合物結合到第一結合元件上；從第一結合元件上釋放至少一部分 量的靶核酸；形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸的 複合物；將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲 在第二結合元件上；以及測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化合 物的存在和/或量的值，在第二結構例如中心孔中進行。
提供一或多種靶核酸可以包括提供含有一或多種靶核酸的樣品。 樣品可以是體積為1 )LiL到50nL的液體樣品。此外，樣品可以是液體全血樣品。
在另一方面，方法包括擴增至少一種靶多核苷酸以形成雙鏈擴增 子，將擴增子與被構造為能夠選擇性結合擴增子的表面相接觸，使擴 增子通過錨定基團結合到表面上，可選地測定擴增子的存在。方法還 可以包括在可選的檢測步驟後將擴增子從表面上釋放，將釋放出的擴 增子進行另外至少一輪擴增循環，將獲得的擴增子與表面相接觸，使 擴增子通過錨定基團結合到表面上，可選地測定擴增子的存在。方法 還可以包括進行釋放，進行擴增循環，接觸和可選的測定的步驟N次，
其中N是大於或等於1的整數。特別是N^5，更特別是N^10，更特別 是N^20。
方法還可以包括在擴增步驟之前，提供耙多核苷酸，形成含有從 病原體釋放出的耙多核苷酸和至少一個捕獲分子的複合物，每個捕獲
分子含有特異性針對靶多核苷酸的區域的結合部分和錨定基團，以及 將複合物與表面相接觸，表面被構造為非選擇性地與捕獲分子的錨定 基團結合，從而將複合物與表面非選擇性地結合。在這樣的方法中， 提供多核苷酸可以包括釋放一種或多種細胞，孢子或病毒的內含物， 內含物中包含靶多核苷酸。釋放的步驟可以包括將含有一種或多種細 胞，孢子或病毒的樣品與裂解試劑和捕獲分子相接觸。將樣品與裂解 試劑和捕獲分子相接觸的步驟可以包括將樣品與冷凍乾燥形式的裂解 試劑和捕獲分子相接觸。 在這樣的方法中，提供靶多核苷酸的步驟可以包括提供相伴的材 料，方法還可以包括分離表面結合的複合物和相伴的材料。在這樣的 方法中，相伴的材料可以包括多核苷酸從中釋放出來的至少一種細胞， 孢子或病毒的內含物。表面可以是粒子的表面。
在另一方面，方法包括提供一或多種靶多核苷酸，形成含有靶多 核苷酸和至少一種捕獲分子的複合物，每個捕獲分子含有特異性針對靶多核苷酸的區域的結合部分和錨定基團，以及將複合物與表面相接 觸，表面被構造為非選擇性地與捕獲分子的錨定基團結合，從而將復 合物與表面非選擇性地結合。在這樣的方法中，提供的步驟可以包括 釋放一種或多種細胞，孢子或病毒的內含物，內含物中包含多核苷酸。 方法還可以包括將表面結合的複合物與從一種或多種細胞，孢子或病 毒釋放出的其它內含物分離開來。
在另一方面，方法包括形成含有一定量報告化合物，能夠捕獲報 告化合物的結合元件，以及一定量能夠與報告化合物形成複合物的靶 核酸的物質的組合物，與報告化合物形成複合物抑制了結合元件對報 告化合物的捕獲；形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核 酸的複合物；將沒有與靶核酸複合的剩餘部分量的報告化合物捕獲在 結合元件上；以及測定捕獲在結合元件上的表明報告化合物的存在和/ 或量的值。
換句話說，方法可以包括允許一部分量的報告化合物與至少一部 分量的靶核酸形成複合物，並允許沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部 分量的報告化合物被捕獲在結合元件上。
方法可以在選自生物傳感器分析裝置，微流體盒和晶片實驗室的 裝置中進行。
在某些實施方案中，方法還包括在表明捕獲在結合元件上的報告 化合物的存在和/或量的值的基礎上測定表明耙核酸的存在和/或量的 值。表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的測定， 可以包括指示值的時間依賴性的監測。在具體的實施方案中，表明靶 核酸的存在和/或量的值，是根據將表明報告化合物的存在和/或量的值 與表明靶核酸的存在和/或量的值相關聯的校正曲線來確定的。
在其它實施方案中，方法還包括在將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物，將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘 部分量的報告化合物捕獲在結合元件上，以及測定表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值的步驟之後，從結合元件上釋放 剩餘部分量的報告化合物。
釋放，形成複合物，捕獲以及確定表明靶核酸的存在和/或量的值 的步驟，可以進行另外的N次，其中N是大於或等於1的整數。在具
體的實施方案中，N^5， 210或^20。
方法在形成複合物的步驟之前，還可以包括將至少一部分量的 報告化合物捕獲在結合元件上；測定表明捕獲在結合元件上的報告化 合物的存在和/或量的值；以及從結合元件上釋放捕獲的報告化合物。
在某些實施方案中，將一部分量的報告化合物與至少一部分量的 耙核酸形成複合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部 分量的報告化合物捕獲在結合元件上的步驟，可以相伴進行。
在其它實施方案中，方法包括對靶核酸進行擴增。靶核酸的擴增 可以在將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物 的步驟之前開始。
表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，可以在 將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步 驟，以及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲 在結合元件上的步驟達到化學平衡之前進行測定。在某些實施方案中， 指示值在一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物 的步驟，以及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物 捕獲在結合元件上的步驟開始後1秒到120秒時進行測定。
報告化合物可以包含一種或多種可檢測的標記。在具體的實施方案中， 一種或多種可檢測的標記是螢光標記。在其它具體實施方案中， 報告化合物是寡核苷酸。
在它實施方案中，方法還包括在將靶核酸進行擴增之前，對它們 進行反轉錄。
在其它實施方案中，形成物質的組合物的步驟包括形成物質的組 合物，該物質包括一定量的第一報告化合物， 一定量的能夠與第一報 告化合物形成複合物的第一靶核酸，與第一報告化合物形成複合物抑 制了結合元件對第一報告化合物的捕獲， 一定量的第二報告化合物， 以及一定量的能夠與第二報告化合物形成複合物的第二靶核酸，與第 二報告化合物形成複合物抑制了結合元件對第二報告化合物的捕獲。
在方法中使用的結合元件可以包含一種或多種能夠將報告化合物 捕獲在結合元件上的不同的捕獲分子。捕獲分子也可以被稱為報告化 合物特異性捕獲分子。在具體的實施方案中，捕獲分子是寡核苷酸。 不同的捕獲分子也可以布置在相應的結合元件的不同位置上。
報告化合物可以通過與捕獲分子形成複合物而捕獲在結合元件 上。在具體的實施方案中，報告化合物上的至少一部分能夠與靶核酸 形成複合物的相互作用位點，也能夠與捕獲分子形成複合物。在其它 具體的實施方案中，捕獲分子和靶核酸競爭與報告化合物形成複合物。
在其它實施方案中，擴增包括變性雙鏈核酸的步驟。雙鏈核酸可 以包括報告化合物與靶核酸的複合物，報告化合物與捕獲分子的複合 物，雙鏈報告化合物以及雙鏈靶核酸。
擴增也可以包括將引物分子退火到靶核酸的步驟。退火步驟可以 與一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步 驟，和/或將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結合元件上的步驟相伴進行。
擴增可以是循環式的擴增。在具體的實施方案中，循環式的擴增 是PCR。循環式擴增可以包含至少IO個循環或至少20個循環。在其
它實施方案中，進行PCR包括了使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。
表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，可以在 循環式擴增的至少一個循環後進行測定。在具體的實施方案中，該值 在循環式擴增的每個循環後測定。在其它實施方案中，表明靶核酸的 存在和/或量的值，在每次表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在 和/或量的值被測定之後進行測定。
可以提供被成形用於執行任何一個上述方法的裝置。
從下面的描述，圖和權利要求書中，其它的方面，目標和優點將 變得顯而易見。


圖中的說明是綱要性的。在不同的圖中，相似的或同樣的元件被 提供有同樣的附圖標記。
圖la是多核苷酸分析方法的流程圖。
圖lb是可用於執行圖la的方法的檢測系統的視圖。
圖lc是圖lb的檢測系統的視圖，其中檢測系統被顯示為進行圖
la的方法的檢測步驟時的致動狀態。 圖ld顯示了與粒子結合的擴增子。 圖le顯示了與粒子結合的擴增子。 圖2顯示了適於圖lb和lc的檢測系統中的分析裝置。 圖3是圖2的分析裝置，與用於操作裝置的型板致動器一起顯示。 圖4顯示了使用新鮮的或冷凍乾燥的裂解緩衝液進行的分析的結
果(RT-PCR產物曲線和凝膠電泳)，其中裂解緩衝液可以作為冷凍乾燥的丸粒儲存而不喪失功能。
圖5顯示了用於從血液裂解混合物中捕獲寡核苷酸(即HIVRNA) 的鏈親和素瓊脂糖漿液的量的影響，其中使用200 pL， 100pL或5(HtL 鏈親和素瓊脂糖漿液進行的分析的結果表明，50pL懸浮液的結合能力 就足以捕獲基本上所有的RNA分子。
圖6顯示了用於從血液裂解混合物中捕獲寡核苷酸(即HIVRNA) 的鏈親和素瓊脂糖懸浮液的量的影響，其中使用10 (iL和7^iL鏈親和 素瓊脂糖懸浮液進行的分析的結果表明，10pL懸浮液的結合能力就足 以捕獲基本上所有的RNA分子。
圖7顯示了溫育時間對被分析的多核苷酸和捕獲探針之間複合物 的形成(即雜交)的影響，其中在溫育時間2分鐘後，絕大部分的多 核苷酸不能被回收到，而溫育IO分鐘後，在上清液中不能檢測到RNA。
圖8顯示了溫育時間對被分析的多核苷酸和捕獲探針之間複合物 的形成(即雜交)的影響。
圖9顯示了溫育時間對捕獲步驟(即複合物的生物素錨定基團與 鏈親和素瓊脂糖粒子的結合)的影響，其中顯示出5分鐘的溫育時間 就足以捕獲所有的多核苷酸分子(即在上清液中不能檢測到RNA分 子)。
圖10顯示了使用新鮮的或儲存了幾小時或7天的冷凍乾燥的鏈親 和素瓊脂糖粒子進行的分析的結果(RT-PCR產物曲線)，其中鏈親和 素瓊脂糖粒子可以被冷凍乾燥並復溶而不喪失功能。
圖11顯示了使用新鮮的或冷凍乾燥的清洗緩衝液進行的分析的 結果(RT-PCR產物曲線)，其中清洗緩衝液可以被冷凍乾燥並復溶而 不喪失功能。
圖12顯示了進行的用於顯示鏈親和素瓊脂糖粒子與RT-PCR的相 容性的試驗的結果(RT-PCR產物曲線和瓊脂糖凝膠電泳)，其中lO)iL 鏈親和素瓊脂糖粒子懸浮液可以用於RT-PCR擴增而不損失擴增效能。
圖13顯示了按照示例性實施方案的分析方法的特異性，其中結果 (RT-PCR產物曲線和瓊脂糖凝膠電泳)顯示，HIVRNA不與鏈親和 素瓊脂糖粒子非特異性結合(即在不存在捕獲探針的情況下)，在裂解過程中同時釋放的人類血細胞的任何RNA也不被捕獲/擴增。
圖14顯示了在鏈親和素瓊脂糖粒子上檢測擴增子的螢光圖像，其
中生物素標記的擴增子被捕獲在鏈親和素瓊脂糖粒子上，在螢光標記 的探針與被捕獲的擴增子雜交後被可視化。
圖15說明了瓊脂糖凝膠電泳顯示出，捕獲在鏈親和素瓊脂糖粒子 上的多核苷酸(即HIVRNA)可以直接用作擴增的模板而不需要其它 的處理步驟(即洗脫，稀釋或濃縮)。
圖16顯示了鏈親和素瓊脂糖粒子的相應的螢光圖像，其中與陰性 探針相比，在陽性探針中檢測到了更多的螢光鏈親和素瓊脂糖粒子。
圖17概要說明了裝置。
圖18描繪了裝置的前側面。
圖19圖示了圖18的裝置的後側面。
圖20圖示了裝置的主視圖。
圖21描繪了裝置的橫截面圖。
圖22示意說明了用於檢測多核苷酸的競爭性方法。
圖23顯示了用於測定樣品中人類I型脊髓灰質炎病毒DNA的競 爭性分析方法的結果。
圖24顯示了用於測定樣品中HIV gag/envPCR產物的量的基於陣 列的競爭性分析方法的原理以及結果。
圖25說明了在圖24中顯示的分析的過程中的不同的步驟。
圖26示意說明了用於檢測多核苷酸的競爭性方法。
圖27顯示了用於測定樣品中HIV B亞型和HIV 02亞型的量的競 爭性分析的結果。
圖28顯示了用於測定樣品中不同量的HIVB亞型的競爭性分析的 結果。
發明詳述
生物學樣品的分析可以包括測定一種或多種多核苷酸(例如 DNA， RNA， mRNA或rRNA)是否存在於樣品中。例如，人們可以 分析樣品，以確定表明特定病原體的存在的多核苷酸是否存在。在一個實施方案中，用於分析的方法包括形成複合物，每個複合物含有靶核酸和捕獲分子，其中每個捕獲分子含有特異性針對靶核酸的區域的結合部分和錨定基團；將複合物與結合元件接觸，結合元件被構造為與捕獲分子的錨定基團結合，以將複合物結合到結合元件上；
對一或多種靶核酸進行擴增；將擴增的靶核酸捕獲大相應的結合元件上；以及對表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值進行測定。
術語耙核酸可以是指可以通過方法檢測的核酸分子(即能夠與捕獲分子形成複合物的靶核酸；參見下文)。這樣的核酸分子的例子包括天然存在的核酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及人工設計的核酸，例如核酸類似物例如尤其是肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)，它們是化學合成的或通過重組基因技術產生的(參見例如Sambrook， J.等(1989)《分子克隆實驗指南》(第二版)
(Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.) ， Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，在此以其全文引為參考)。天然存在的核酸的具體的例子包括DNA序列例如基因組DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA， mRNA或rRNA分子，或其反向互補的核酸序列。這樣的核酸可以是任何長度的，既可以是單鏈的也可以是雙鏈的分子。典型情況下，靶核酸的長度為10到10,000個核苷酸，例如20到2,000個核苷酸，30到1,000個核苷酸或50到500個核苷酸。在本文中使用的術語"核苷酸"應該被理解為是指核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸(即RNA和DNA分子)。
靶核酸可以是與病毒感染有關的核酸。與病毒感染有關的核酸是指任何存在於被分析的，已經被一種或多種病毒感染的液體樣品中的病毒來源的核酸分子(即其核苷酸序列與病毒基因組中相應的序列一致或互補)。感染從中獲得液體樣品的宿主的病毒，可以是DNA病毒(即具有DNA基因組的病毒)或RNA病毒(即具有RNA基因組的病毒)(綜述在例如Blichen-Osmond, C. (2003).《病毒的分類學與分類》，在《臨床微生物學手冊》(第八版)第二巻中，(Taxonomy andClassification of Viruses. In: Manual of Clinical Microbiology,她ed., vol.2) ， p. 1217-1226, ASM Press, Washington DC，以其全文引為參考)。DNA病毒的例子包括尤其是乳多空病毒科(Papovaviridae)(例如乳頭瘤病毒)，腺病毒科(Adenoviridae)(例如腺病毒)和皰疹病毒科
(Herpesviridae)(例如Epstein-Barr病毒，細胞肥大病毒)的病毒。RNA病毒的例子包括尤其是小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰質炎病毒，鼻病毒)，黃病毒科(Flaviviridae)(例如C型肝炎病毒)，纖絲病毒科(Filoviridae)(例如馬爾堡病毒，伊波拉病毒)和逆轉錄病毒科(Retroviridae)(例如人類免疫缺陷病毒(HIV))的病毒。在某些實施方案中，被檢測的核酸與逆轉錄病毒科的成員引起的感染相關，特別是它們與HIV感染相關。本文中使用的術語"HIV"是指HIV-1和HIV-2，以及從其衍生的任何亞型。
因為許多DNA病毒以及逆轉錄病毒(值得注意的是逆轉錄病毒的複製以便需要將RNA病毒基因組反轉錄成DNA)可以潛伏的前病毒形式將它們的遺傳信息整合到宿主細胞的基因組中，因此術語"與病毒感染有關的核酸"不僅僅是指源自於游離的和細胞相關的病毒的核酸，而且還包括了整合在宿主基因組中的前病毒DNA分子，反轉錄的病毒DNA分子(即病毒複製的"中間體")，以及源自於前病毒DNA的轉錄本(即通過宿主DNA基因組的轉錄獲得的RNA分子)。
典型情況下，靶核酸不以分離的形式，而是以懷疑含有一種或多種靶核酸的樣品的形式用於本發明的方法。術語"一種或多種"是指一種或多種不同類型的核酸，例如具有不同核苷酸序列的分子和/或從不同的來源傳下來的分子(例如從感染宿主細胞的不同病原體衍生的核酸)。
術語樣品是指任何被分析的，並且被懷疑含有一種或多種被檢測的靶核酸的液體。因此，樣品可以包括溶解在水或適合的緩衝液(例如Tris/EDTA)中的純化的核酸製備物，以及各種不同的生物學樣品。 可以使用該發明進行分析的液體樣品的例子包括尤其是有機和無機化 學物溶液，飲用水，汙水，人類和非人類的體液例如全血，血漿，血 清，尿液，痰液，唾液或腦脊髓液，來自動物，植物或組織培養物的 細胞提取液，原核和真核細胞懸浮液，噬菌體製備液等。
全血可以是指含有其所有組分的血液。換句話說，全血包括血細 胞例如紅細胞，白細胞和血小板，以及血細胞懸浮在其中的血漿。
樣品還可以包含一種或多種其它試劑，例如稀釋劑，溶劑或緩衝 液，它們可能來自於樣品在進行本發明的方法之前進行的可選的純化 和/或步驟。但是，在某些實施方案中，被分析的樣品是未處理的樣品， 例如未處理的全血樣品。術語未處理的可以表示在樣品收集(例如從 患者抽取血液)之後和將其進行本發明的方法之前，沒有發生進一步 的樣品加工(例如分級方法，乾燥/復溶等)。
被分析的流體樣品的體積可以在lpL到50iiL的範圍內，典型情 況下在lpL到45nL，或lpL到40jxL，或lpL至U 30pL，或lpL到25jxL， 或lliL到20pL，或lpL到15pL的範圍內。在具體的實施方案中，流 體樣品的體積在lpL到10pL的範圍內。全血樣品也可以使用超過5(HiL 的樣品體積進行分析。
捕獲分子是指顯示出特異性結合行為和/或特徵性的反應性的分 子，使其適合於與靶核酸形成複合物。典型情況下使用核酸作為捕獲 分子。可以用作捕獲分子的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脫氧 核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸類似物例如尤其是 肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)。天然存在的核酸的具體的例子包 括DNA序列例如基因組DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如 hnRNA， mRNA或rRNA分子，或其反向互補的核酸序列。這樣的核 酸可以是任何長度的，既可以是單鏈的也可以是雙鏈的分子。典型情況下，核酸捕獲分子是長度為10到150個核苷酸，例如20到100個 核苷酸或30到70個核苷酸的單鏈寡核苷酸。在具體的實施方案中， 捕獲分子可以在PCR中用作引物，以擴增在給定的流體樣品中存在的 任何目標靶核酸。
在某些實施方案中，捕獲分子可以包括至少一個特異性序列區域 (即上面所指的結合部分)，它與靶核酸(例如與病毒感染有關的核 酸)的序列區域互補，從而允許捕獲分子與被檢測的核酸之間的鹼基 配對。典型情況下，特異性結合區域長度為至少20個核苷酸，例如至 少30個核苷酸或至少40個核苷酸。具體來說，捕獲分子的結合區域 的核苷酸序列與靶核酸的相應核苷酸序列互補。
在導入被分析的流體樣品之前，可以在一個或多個上面描述的裝 置的適於容納液體的至少一個結構中提供捕獲分子(例如以冷凍乾燥 的或乾燥的形式)。或者，捕獲分子可以與樣品一起(例如相伴地) 或在樣品已經導入後導入到裝置中。
可以使用一種或多種捕獲分子。換句話說，可以使用一種或多種 不同類型的捕獲分子，例如一種或多種具有不同核苷酸序列的核酸分 子。相伴使用的一種以上的捕獲分子也可以被稱為"文庫"。這樣的 文庫包含至少兩種不同的分子，但是也可以包含許多種不同的分子， 例如至少不同的5種，至少不同的10種，至少不同的30種等。文庫 也可以陣列元件或任何其它空間布置的形式存在。
在某些實施方案中，在裝置中進行的分析還包括將含有被檢測的 靶核酸和捕獲分子的複合物與裝置的結合元件相接觸，結合元件被構 造為與捕獲分子的錨定基團結合，以便將複合物與結合元件結合。
術語結合元件或支持元件是指捕獲分子(因此還有含有這些捕獲 分子的任何複合物)可以經過捕獲分子的錨定基團通過共價的或非共價的相互作用連接到其上的任何基質。這樣的基質的例子包括尤其是 陣列元件的基質或合成的粒子，例如磁性珠子(例如順磁性聚苯乙烯
珠子，也被稱為Dynabeads )和乳膠珠子，以及多孔的表面例如CPG 等。依賴於捕獲分子的類型，錨定基團的類型以及目標應用，在每種 情況下可能有各種不同的連接。例如，在捕獲分子的錨定基團可以是 生物素基團的情況下，它可以與連接到結合元件上的親和素或鏈親和 素基團偶聯。或者，捕獲分子可以含有一段腺苷殘基(例如10個腺苷 殘基)，它將與結合在結合元件上的一段相應的胸苷殘基相互作用。 具體的含有錨定基團的偶聯試劑可以從不同的供應商商購，在本技術 領域是公知的(參見例如Sambrook, J.等，同上；Ausubel, F. M.等， 同上；以及Lottspeich, F.和ZorbasH.，同上)。
在導入被分析的流體樣品之前，結合元件可以被提供在裝置的一 個或多個結構中。結合元件可以被提供在與捕獲分子相同的結構中， 或在至少一個不同的結構中。典型情況下，形成捕獲分子與靶核酸的 複合物的步驟與將複合物與結合元件相接觸的步驟，在空間上分開進 行，即在裝置的不同結構或孔或反應室中進行。例如，形成捕獲分子 與靶核酸的複合物的步驟可以在裂解孔中進行，將複合物與結合元件 相接觸的步驟在中心孔中進行，如圖17中描繪的。在這樣的實施方案 中，捕獲分子和結合元件通常被提供在適於容納液體的不同的結構中。 除了在加入樣品前在裝置中提供結合元件之外，結合元件也可以與樣 品一起(即相伴地)或在樣品已經導入之後導入到裝置中。
在具體實施方案中，方法還包括將靶核酸進行擴增，也就是說， 在對它們進行進一步分析之前增加它們在樣品中存在的量，以便於進 一步的檢測。典型情況下，靶核酸的擴增通過循環式擴增來進行。循 環式擴增可以包含等於或大於2的任何數量的擴增循環。通常情況下， 循環式擴增反應包含至少10個或至少20個循環。
示例性的循環式擴增是聚合酶鏈反應(PCR) 。 PCR是分子生物學中已建立的標準方法，被詳細描述在例如Sambrook等，同上；和 Ausubel, F.M.等，同上中。典型情況下，通過使用熱穩定的DNA聚 合酶，PCR被用於擴增雙鏈DNA分子。在某些實施方案中，在循環式 擴增中使用的DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，特別是5'—3'核酸外 切酶活性。這樣的DNA聚合酶的例子包括尤其是Taq DNA聚合酶或 TthDNA聚合酶(可以從多個供應商商購)。
當靶核酸是RNA分子時，在對靶核酸進行擴增之前可以對它們進 行反轉錄(即是從相應的RNA分子產生DNA分子)。反轉錄是分子 生物學中的另一種標準方法，也描述在例如Sambrook等，同上；和 Ausubel, F.M.等，同上中。
對於核酸擴增來說，裝置可以包含一個或多個溫度控制單元和/或 溫度調控單元，用於控制和/或調控反應室中的溫度。這樣的溫度控制 單元和/或溫度調控單元可以包含一個或多個分離的加熱和/或冷卻元 件，它們可以與裝置的一個或多個反應室直接接觸。典型情況下，一 個或多個加熱和/或冷卻元件由導熱材料製成。這樣的導熱材料的例子 包括尤其是矽，陶瓷材料例如氧化鋁陶瓷，和/或金屬例如高級別鋼， 鋁，銅或黃銅。適合的溫度控制單元和/或溫度調控單元的示例性描述 也可以在國際專利申請WO 01/02094中發現，以其全文引為參考。
例如，在適合於容納液體的結構中控制/調控溫度，也可以通過使 用由導電材料製成的室來完成。室體可以是至少部分圍繞著裝置的至 少一種結構或反應室的固體物體。結構至少部分可以是室體的完整的 部件(即由與室體相同的材料製成)。導電材料的例子包括導電的合 成材料，例如具有5到30%碳纖維的聚醯胺，具有5到30%碳纖維的 聚碳酸酯，具有2到20%不鏽鋼纖維的聚醯胺，以及具有5到40%碳 纖維的聚苯硫醚。此外，室體可以被設計成含有增大和縮小的部分， 允許對反應室或相應的表面進行特異性加熱。結構中溫度的測量可以通過本技術領域公知的各種方法來進行， 例如通過使用整合的阻抗傳感器，半導體傳感器，光波導傳感器，多 色染料或液晶。此外，反應室中的溫度可以使用室體中整合的溫度傳 感器，高溫計或紅外傳感器來測定，或通過測量參數，例如發生檢測 的表面的折射率或樣品的pH值，的溫度依賴性變化來測定，例如通過 測量pH敏感性指示劑的顏色變化。
通常情況下，擴增例如PCR包含三個基本步驟一一變性，引物的 退火和引物的延伸，它們以循環的方式重複地進行。但是，擴增還可 以分別在第一次"真正的"擴增循環之前包含最初的變性步驟，和/或 在完成最後的擴增循環之後包含最後的延伸步驟。在某些實施方案中， 靶核酸的擴增包括(至少)變性雙鏈核酸的步驟，和/或在靶核酸上退
火和延伸引物分子的組合步驟(即"兩步PCR")。
典型情況下，變性步驟包括將被分析的樣品加熱到94-95°C的溫 度， 一般為0.5秒到5分鐘，從而導致雙鏈核酸模板解鏈。將被分析的 樣品進行這樣的變性步驟，導致(即允許)樣品中的雙鏈核酸，包括 雙鏈靶核酸和捕獲分子與耙核酸的複合物(結合到結合元件上)，同 時變性，後者導致靶核酸從結合元件上釋放。
典型情況下，退火步驟包括將被分析的樣品冷卻到40-65°C的溫 度， 一般為1秒到5分鐘，以允許引物分子與變性的核酸模板鏈的結 合(即雜交/鹼基配對)。使用的反應溫度依賴於被退火的引物分子的 化學和/或物理性質，例如它們的核苷酸序列組成，熔點溫度，它們發 生分子內摺疊(例如形成雙鏈髮夾或轉角結構)的傾向等。在某些實 施方案中，被分析的樣品進行這樣的退火步驟，導致(即允許)雙鏈 耙分子的重新結合，以及靶核酸與捕獲分子的複合物的形成，後者導 致將靶核酸捕獲或重新捕獲在結合元件上。因此，在某些實施方案中， 退火步驟和通過與捕獲分子形成複合物將靶核酸捕獲在結合元件上的 步驟相伴進行。最後，典型的延伸步驟包括使用DNA聚合酶對雜交的引物分子進
行延伸以產生DNA模板鏈的全長的拷貝。擴增的DNA片段的長度由 使用的引物對的5'末端確定。典型情況下，延伸步驟在70-72°C下進行 1秒到10分鐘。在某些實施方案中，將被分析的樣品進行這樣的延伸 步驟，可以通過允許在退火步驟中已經形成的引物與靶核酸的複合物 延伸，產生任選摻入了隨後可以被檢測的可檢測的標記物的雙鏈的被 擴增的核酸片段，從而導致了被分析的靶核酸的複製。
在具體的實施方案中，方法還包括將典型情況下通過將被分析的 樣品進行PCR而被擴增的靶核酸捕獲到相應的結合元件上(即將靶核 酸固定在其上)。正如上面已經描述的，靶核酸可以通過與通過錨定 基團仍然結合在結合元件上的捕獲分子形成複合物而捕獲在相應的結
方法還可以包括將捕獲的被擴增的靶核酸從結合元件上釋放，以 及重複將一種或多種靶核酸進行擴增和將擴增的靶核酸捕獲在相應的 結合元件上的步驟。釋放可以包括從結合元件上分開或解開靶核酸。 這可以通過例如裂解任何共價鍵來酶法實現，或者在靶核酸是通過核 酸捕獲分子經互補鹼基配對而結合到結合元件上的情況下，通過增加 分析發生在其中的結構中的溫度，從而導致核酸鏈的分離(即變性) 來完成。
在這樣的實施方案中，從結合元件上釋放捕獲的被擴增的靶核酸， 以及重複將一種或多種靶核酸進行擴增和將擴增的靶核酸捕獲在相應 的結合元件上的步驟的循環，而可以被進行至少5次，至少10次，至 少20次，至少30次，至少50次或至少IOO次。測定表明被捕獲的靶 核酸的存在和/或量的值的步驟，可以在至少一個循環後進行，例如在 每個從結合元件上釋放捕獲的被擴增的靶核酸，以及重複將一種或多 種靶核酸進行擴增和將擴增的靶核酸捕獲在相應的結合元件上的步驟的循環後進行。
形成含有靶核酸和捕獲分子的複合物，其中每個捕獲分子含有特 異性針對耙核酸的區域的結合部分和錨定基團的步驟，可以與將複合 物與結合元件相接觸的步驟在空間上分開進行，其中結合元件被構造
為與捕獲分子的錨定基團結合，從而將複合物結合到結合元件上。在 這樣的實施方案中，方法在含有至少兩個適於容納液體的結構的裝置 中進行。至少兩個結構可以例如與微流體網路流體連通。例如，方法
可以在圖18和19中顯示的裝置500中進行。含有靶核酸和捕獲分子 的複合物可以在第一結構502中形成。然後可以將複合物轉移到第二 結構512中，複合物在其中與上述的被構造為與捕獲分子的錨定基團 結合的結合元件相接觸。
表明被捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測定，可以包括檢測/ 測定允許對捕獲(或重新捕獲)在結合元件上的靶核酸進行定性和/或 定量測量的參數，例如電導性，氧化還原電勢，光吸收，螢光強度或 生物發光。可以只測定這些參數中的一種，但是相伴或相繼測定一種 以上的參數(例如電導性和由適當的標記物引起的螢光信號的強度) 也是可能的。
為了進行檢測反應，可以將耙核酸用一種或多種可檢測的標記物 進行標記。可檢測的標記物可以是任何包含一種或多種適合的化學物 質或酶的化合物或基團，可以在化學，物理或酶反應中直接或間接產 生可檢測的化合物或信號。因此，通過能夠與目標報告化合物形成相 互作用，這樣的標記物可能是該報告化合物的檢測所必需的，或將促 進該報告化合物的檢測。在本文中使用時，該術語應該被理解為包括 了可檢測標記物本身(也被稱為"標記")，以及任何與一種或多種 這樣的可檢測標記結合的化合物。此外，幹擾標記物產生可檢測信號 的基團(例如在淬滅劑與螢光團彼此緊鄰時"劫持"螢光團的激發產 生的發射的淬滅劑)也可以屬於可檢測標記物。可檢測標記物可以被整合或連接到靶核酸上，例如以修飾的和/或標記的核糖核苷酸，脫氧 核糖核苷酸或雙脫氧核糖核苷酸的形式。
標記可以通過本技術領域熟知的方法來完成(參見例如Sambrook, J.等，同上；以及Lottspeich, F.和Zorbas H.，同上)。標記物可以選 自尤其是螢光標記物，酶標記物，有色標記物，生色標記物，發光標 記物，放射活性標記物，半抗原，生物素，金屬複合物，金屬和膠體 金。所有這些類型的標記物在本技術領域中是公知的。由這樣的標記 物介導的物理反應的例子是在輻射或激發後發射螢光或磷光，或當使 用放射活性標記物時發射X-射線。鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶，(3-半乳糖苷酶和P-內醯胺酶是酶標記物的例子，它們催化產色反應產物 的形成。在具體的實施方案中，可檢測的標記物是螢光標記物。大量 的螢光標記物在本技術領域中是公知的，可以從不同的供應商商購(參 見例如《手冊螢光探針和標記技術指南》(第10版)(The Handbook -A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed.)， (2006),《分子探針》 (Molecular Probes ) ， Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA，在此以其全文引為參考)。
為了檢測這樣的標記物，可以使用適合於測定表明捕獲在支持元 件上的報告化合物的存在和/或量的值的檢測系統。檢測系統可以與裝 置500相連。典型情況下，檢測系統位於一個第二結構512對面，任 選位於發生檢測的特定表面區域的對面。合適的檢測系統的選擇取決 於若干參數，例如用於檢測的標記物的類型，所進行分析的種類。多 種光學和非光學檢測系統是本領域公知的。可以與方法使用的通常意 義的檢測系統參見例如，Lottspeich F.,和Zorbas H.,同上中。
典型情況下，檢測系統是光學檢測系統。在某些實施方案中，方 法的進行包括簡單的檢測系統，它可以基於參數例如螢光，光吸收， 共振轉移等的測量。在其它實施方案中，檢測系統是基於用螢光團標記的光譜激發的 核酸的螢光強度的比較。螢光是特定分子當被產生特徵性吸收和發射 行為的特定波長的光激發時，發射出它們自己的光的能力。具體來說， 螢光信號的定量檢測是通過修改過的螢光顯微鏡方法來進行的(綜述
參見例如Lichtman， J.W.和Conchello, J.A. (2005) Nature Methods 2, 910-919; Zimm飄ann， T. (2005) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95, 245-265，以其全文引為參考)。由此，從光吸收和光發射產生的信號 分別被一個或多個濾光片和/或堇青石分離，並成像在適當的檢測器上。 數據分析通過數字圖像處理方法來進行。圖像加工可以使用本技術領 域眾所周知的幾種軟體包來實現(例如精確數字圖像處理軟體 (Mathematica Digital Image Processing) ， EIKONA， 或Image-PRO) 另一種適合於這種目的的軟體是Iconoclust軟體(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany)。
適合的檢測系統可以基於測定螢光信號的經典方法，例如外螢光 或暗視野螢光顯微術(綜述在例如Lakowicz, J.R. (1999)的《螢光光譜 學原理》(第二版)(Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed.)， Plenum Publishing Corp., NY，中，以其全文引為參考)。
另一種可以使用的光學檢測系統是共聚焦螢光顯微術，其中通過 點光源將物體在透鏡的聚焦平面中照亮。重要的是，點光源，物體和 點光檢測器位於光學共軛的平面上。這樣的共聚焦系統的例子在例如 Diaspro, A. (2002)《共聚焦和二光子顯微術基礎，應用和進展》
(Confocal and 2-photon-microscopy: Foundations, Applications and Advances) ， Wiley-Liss， Hobroken， NJ,中有詳細的描述，以其全文引 為參考。螢光-光學系統通常是不帶自動聚焦的螢光顯微鏡，例如具有 固定焦距的螢光顯微鏡。
其它也可以使用的螢光檢測方法包括尤其是全內部螢光顯微術 (參見例如Axelrod,D. (1999)的《具有逐漸消失的照明的表面螢光顯微術》 (Surface fluorescence microscopy with evanescent illumination)， 在Lacey， A.主編的《生物學中的光學顯微術》(Light Microscopy in Biology, Oxford University Press, New York, 399-423)中)，螢光壽命 成像顯微術(參見例如Dowling, K.等，(1999) J. Mod. Optics 46, 199-209)，螢光共振能量轉移(FRET;參見例如Periasamy, A. (2001) J. Biomed. Optics 6， 287-291)，生物發光共振能量轉移(BRET;參見 例如Wilson, T.禾口 Hastings, J.W. (1998) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 197-230)，以及螢光關聯光譜術(參見例如Hess, S. T.等，(2002) Biochemistry 41， 697-705);上述每個文獻以其全文引為參考。
在具體實施方案中，檢測使用FRET或BRET進行，它們是基於 螢光或生物發光淬滅劑對的相應形成。FRET的應用也描述在例如Liu, B.等，(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 589-593;禾卩Szollosi， J. 等，(2002) J. Biotechnol. 82, 251-266中。BRET的應用被詳細描述在例 如Prinz，A.等，(2006) Chembiochem. 1， 1007-1012;和Xu， Y,等，(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156，中；上述每個文獻以其全文引 為參考。
一個或多個表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測定，可以包 括對一個或多個獲得的指示值進行時間依賴性的監測(即重複地進行 測定/檢測步驟並監測指示值的隨時間的過程)。
提供靶核酸的步驟可以包括從包含在樣品中的生物學材料釋放靶 核酸。為此，可以將樣品加熱以破壞細胞膜和/或病毒殼體(例如通過 使用下面描述的溫度控制單元和/或溫度調控單元)。在某些實施方案 中，該釋放步驟包括將流體樣品與裂解試劑相接觸，裂解試劑例如含 有一種或多種分解細胞膜和/或病毒殼體的去汙劑的試劑。這樣的裂解 試劑在本技術領域中是眾所周知的(參見例如Sambrook， J.等，(1989) 《分子克隆實驗指南》(第二版)，Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY)，並可從許多供應商商購。
方法還可以包括從相伴的材料中分離該一種或多種靶核酸。
靶核酸的提供，可以與將含有靶核酸和捕獲分子的複合物與結合 元件相接觸，將靶核酸進行擴增，將擴增的靶核酸捕獲在相應的結合 元件上，以及測定表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的步驟，在空 間上分開進行。例如，靶核酸可以提供在與含有靶核酸和捕獲分子的 複合物在其中形成的相同的結構502中。
在另一個實施方案中，方法在下面描述的裝置中進行。例如，裝 置可以含有第一孔502，含有靶核酸和捕獲分子的複合物形成在第一孔 502中。此外，裝置可以含有第二孔512，表明捕獲的靶核酸的存在和 /或量的值的測定可以在被成形用於檢測一種或多種靶核酸的第二孔 512中進行。第二孔512可以包含覆蓋著第二孔的覆蓋元件，以及適於 被致動以使覆蓋元件變形的致動器。此外，將一種或多種核酸進行擴 增和/或將擴增的靶核酸重新捕獲到相應的結合元件上，也可以在第二 孔512中進行。
表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值的測定，可以使用被致動以 使覆蓋元件變形的致動器來進行。在這樣的實施方案中，覆蓋元件可 以變形，使得檢測孔512的體積減小。此外，在表明捕獲的靶核酸的 存在和/或量的值被測定後，第二孔的體積可以被重新增加。
根據另一個實施方案，提供了方法，包括
a)提供一定量報告化合物；第一結合元件被成形成與捕獲分子的 錨定基團結合；第二結合元件能夠捕獲報告化合物； 一定量的靶核酸 能夠與報告化合物形成複合物；與報告化合物形成複合物抑制了報告 化合物被第二結合元件的捕獲； 一定量的捕獲分子，其中每個捕獲分 子含有特異性針對靶核酸的區域的結合部分和錨定基團；b)形成複合物，每個複合物含有靶核酸和捕獲分子； C)將複合物與第一結合元件相接觸，以將複合物結合到第一結合 元件上；
d) 從第一結合元件上釋放出至少一部分量的靶核酸；
e) 形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸的複合
物；
f) 將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在 第二結合元件上；以及
g) 測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量 的值。
報告分子或報告化合物可以是任何能夠與一種或多種靶核酸形成 複合物，並且可以被捕獲在支持元件例如第二結合元件上的分子，其 中與靶核酸形成複合物抑制了報告化合物捕獲在支持元件例如第二結 合元件上。術語"能夠形成複合物"可以是指報告分子和靶核酸之間 的任何相互作用。換句話說，該術語表示，可以通過報告分子中包含 的介導與靶的相互作用的共同的或不同的結合區域來實現的分子之間 的彼此結合(例如通過互補核苷酸序列之間的Watson-Crick鹼基配對)。
典型情況下，相互作用是可逆的。類似地，被捕獲在支持元件上或被 捕獲在第二結合元件上，包括了報告分子與給定支持元件的任何直接 或間接的(例如通過捕獲分子，參見下文)相互作用。該相互作用一 般來說也是可逆的。
一般來說，報告分子可以是長度為10到100個核苷酸，例如15 到50個核苷酸，15到40個核苷酸或20到30個核苷酸的核酸分子(即 上面描述的RNA或DNA分子)。通常情況下，報告分子是單鏈核酸 分子(即寡核苷酸)。報告化合物被構造為使得這樣的報告分子與被 檢測的靶核酸的結合抑制了報告分子被捕獲在第二結合元件上。核酸 報告分子可以包括至少一個特異性結合區域(在本文中也稱為"相互 作用位點")，該區域不僅能夠與靶核酸相互作用(例如通過結合到耙核酸的至少部分互補的序列區域上，從而例如允許報告分子與被檢
測的靶核酸之間的Watson-Crick鹼基配對)，而且能夠被捕獲在第二 結合元件上。典型情況下，報告分子中包含的特異性結合區域長度為 至少12個核苷酸，例如至少15個核苷酸，至少18個核苷酸或至少22 個核苷酸。在具體的實施方案中，報告分子的結合部分的核苷酸序列 與靶核酸的相應核苷酸序列互補。
可以使用一種或多種報告分子；換句話說，可以使用一種或多種 不同類型的報告分子，例如一種或多種具有不同核苷酸序列的核酸分 子。
第一結合元件可以是上面描述的結合元件。例如，第一結合元件 可以是指任何固體基質，捕獲分子，以及因此含有這樣的捕獲分子的 任何複合物，可以通過捕獲分子的錨定基團通過共價或非共價相互作 用結合到其上。這樣的基質的例子包括尤其是合成的粒子例如磁性珠 子(例如順磁性聚苯乙烯珠子，也被稱為Dynabeads )和乳膠珠子。
第二結合元件可以是上面描述的結合元件。例如，第二結合元件 是指任何固體基質，報告分子可以直接(例如通過報告分子中包含的 錨定基團)捕獲在其上，或以間接的方式通過一個或多個能夠通過共 價或非共價相互作用將報告分子捕獲到第二結合元件上的報告化合物 特異性捕獲分子捕獲在其上。可以使用的第二結合元件的例子包括尤 其是陣列元件的基體(例如顯微鏡載玻片，晶片或陶瓷材料)。
報告化合物特異性捕獲分子可以是任何包含在(例如連接或固定 在)第二結合元件上的，顯示出特異性結合性質和/或特徵性反應性的 分子，這使得它適合於與報告分子形成複合物(即與報告分子結合)。 典型情況下使用核酸作為捕獲分子。可以用作報告化合物特異性捕獲 分子的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)，以及核酸類似物例如尤其是肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)。天然存在的核酸的具體的例子包括DNA序列例如基因 組DNA或cDNA分子，以及RNA序列例如hnRNA， mRNA或rRNA 分子，或其反向互補的核酸序列。這樣的核酸可以是任何長度的，既 可以是單鏈的也可以是雙鏈的分子。典型情況下，報告化合物特異性 捕獲分子是長度為10到100個核苷酸，例如15到50個核苷酸或20 到30個核苷酸的單鏈寡核苷酸。
報告化合物特異性捕獲分子可以包含至少一個特異性序列區域 (即結合區域)，它被構造為與報告分子結合，例如與報告分子的互 補序列區域通過報告化合物特異性捕獲分子和被檢測的核酸之間的鹼 基配對發生相互作用。典型情況下，特異性結合區域的長度為至少12 個核苷酸，例如至少15個核苷酸，至少18個核苷酸或至少22個核苷 酸。在具體的實施方案中，報告化合物特異性捕獲分子的結合區域的 核苷酸序列與報告分子的相應的核苷酸序列互補。
在某些實施方案中，報告化合物的至少一部分能夠與靶核酸形成 複合物的相互作用位點，也能夠與報告化合物特異性捕獲分子形成復 合物。換句話說，報告化合物特異性捕獲分子與靶核酸競爭與報告化 合物形成複合物，即是包含在報告化合物特異性捕獲分子和靶核酸中 的相應結合區域識別報告分子的同樣的或至少相似的對應序列。本文 中使用的術語"相似的序列"是指序列之間的差異僅僅是一個或多個 單核苷酸誤配(即核苷酸的非互補配對)或一個或幾多個單核苷酸添 加，插入或缺失(即附加的或缺少的核苷酸殘基)。因此，包含在報 告化合物特異性捕獲分子和靶核酸中的相應結合區域至少是部分同一 的。本文中使用的術語"部分同一的"是指序列之間的差異僅僅是如 上所述的一個或多個單核苷酸，或序列具有重疊的結合位點，即序列 共有一部分共同的核苷酸序列，但是在序列區域的至少一個其它部分 中不同。但是，包含在報告化合物特異性捕獲分子和靶核酸中的相應 結合區域識別報告分子的不同的，非重疊的(例如相鄰的)序列，但 是報告化合物特異性捕獲分子或靶核酸與報告分子的結合在空間上幹擾另一個分子與報告分子的結合，也是可能的。
可以使用一種或多種報告化合物特異性捕獲分子；換句話說，可 以使用一種或多種不同類型的報告化合物特異性捕獲分子，例如一種 或多種具有不同核苷酸序列的核酸分子。 一種以上的報告化合物特異
性捕獲分子的相伴使用也被稱為文庫。這樣的文庫包含至少兩種不同 的分子，但是也可以包含許多種不同的分子，例如至少不同的10種，
至少不同的20種，至少不同的50種等。文庫也可以布置在相應的第
二結合元件的不同位置上。例如，它們可以以陣列或任何其它空間布 置的形式存在。
陣列(或微陣列)可以是結合元件，例如第二結合元件(也被稱 為基體)上捕獲分子，例如報告化合物特異性捕獲分子的確定的空間 布置(布局)，其中陣列中每個分子的位置被獨立地確定。典型情況 下，微陣列含有確定的位點或預定的區域(也被稱為陣列元件或點)， 它們可以特定的樣式布置，其中每個陣列元件一般只包含一種捕獲分 子。捕獲分子例如報告化合物特異性捕獲分子在支持物例如第二結合 元件上的布置，可以通過共價或非共價相互作用來產生。但是，捕獲 分子也可以直接固定在用於執行方法的裝置的反應室中(參見下文)。
典型情況下，靶核酸不是以分離的形式用於本發明的方法，而是 以懷疑含有一種或多種靶核酸的樣品的形式， 一種或多種靶核酸即是 一種或多種不同類型的核酸，例如具有不同的核苷酸序列的分子和/或 從不同來源傳下來的分子(例如源自於感染宿主細胞的不同病原體的 核酸)。
在某些實施方案中，方法還包括根據表明捕獲在第二結合元件上 的報告化合物的存在和/或量的值來確定表明靶核酸的存在和/或量的 值。也就是說，可以根據在靶核酸/報告分子複合物形成之前存在的報 告化合物的存在和/或量與該複合物形成之後被捕獲在第二結合元件上的報告化合物的量之間的差別，來計算特定樣品中存在的一種或多種 靶核酸的存在和/或量。
為了形成檢測反應，報告化合物可以包含一種或多種如上所述的 可檢測標記物。在具體的實施方案中，可檢測標記物是螢光標記物。 大量的英冠給標記物在本技術領域中是公知的，並且可以從不同的供 應商商購(參見例如《手冊螢光探針和標記技術指南》(第10版)
(The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed.) (2006)，《分子探針》，(Molecular Probes)， Invitrogen Corporation, Carsbad, CA， USA )。
為了檢測這樣的標記物，用於進行方法的裝置還可以包含適合於 測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的檢 測系統。例如，可以使用如上所述的適合於測定表明捕獲在結合元件 上的靶核酸的存在和/或量的值的檢測系統。
在某些實施方案中，方法還包括在一部分量的報告化合物與至少 一部分量的靶核酸形成複合物的步驟之後，從第二結合元件上釋放出 剩餘部分量的報告化合物，將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量 的報告化合物捕獲在第二結合元件上，以及測定表明捕獲在第二結合 元件上的報告化合物的存在和/或量的值。
在其它實施方案中，釋放，形成複合物，捕獲和測定的步驟可以 被重複額外的N次，其中N是大於或等於1的整數。換句話說，方法 以循環的方式進行。在具體的實施方案中，整數N是25， S10或^20。
此外， 一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合 物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合 物捕獲在第二結合元件上的步驟，可以相伴進行。在具體的實施方案中，方法還包括將靶核酸進行擴增，也就是說， 在將它們進行進一步分析之前增加它們在樣品中存在的量，以促進進 一步的檢測。典型情況下，耙核酸的擴增通過循環式擴增來實現。循 環式擴增可以包含任何等於或大於2的數量的擴增循環。通常情況下， 循環式擴增反應包含至少10個或至少20個循環。
示例性的循環式擴增是如上所述的聚合酶鏈反應(PCR)。典型
情況下，通過使用熱穩定的DNA聚合酶，PCR被用於擴增雙鏈DNA 分子。在某些實施方案中，在循環式擴增中使用的DNA聚合酶具有核 酸外切酶活性，特別是5'—3'核酸外切酶活性。這樣的DNA聚合酶的 例子包括尤其是T叫DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(可以從多個供應 商商購)。利用該5'—3'核酸外切酶活性，DNA聚合酶可以核裂解性 地攻擊與靶核酸結合的報告分子的標記的5'-末端，導致該報告分子的 逐漸降解。結果，捕獲在第二結合元件上的報告化合物的量在每個擴 增反應的循環期間又降低。任選地，使用的DNA聚合酶也可以表現出 3'—5'核酸外切酶活性("校對活性")，用於除去已經在特定序列位
置加入到新生DNA鏈中的不正確的核苷酸。這樣的具有兩種核酸外切 酶活性的DNA聚合酶的例子包括尤其是Pwo DNA聚合酶和Pfu DNA 聚合酶(兩種酶也可以從不同的供應商商購)。
如果耙核酸是RNA分子，方法還可以包括在對靶核酸進行擴增之 前如上所述對它們進行反轉錄。
靶核酸的擴增可以在一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶 核酸形成複合物的步驟之前開始。也就是說，將靶核酸進行擴增，同 時允許報告化合物與耙核酸形成複合物，並且沒有與靶核酸形成複合 物的報告化合物被重新捕獲在第二結合元件上。
對於核酸擴增來說，在圖18和19中顯示的裝置500可用於執行 方法，該裝置還包含了一種或多種如上所述的溫度控制單元和/或溫度調控單元，用於控制和/或調控結構或反應室，例如中心孔502中的溫 度。反應室中的溫度的測量可以按照上面的描述來進行。
在進行分析的過程中，表明靶核酸的存在和/或量的值的檢測/測定 可以只進行一次，也可以進行一次以上。在單個分析過程中進行了一 個以上檢測步驟的情況下，在某些實施方案中可以計算獲得的結果的 平均值。在一個或多個檢測循環中獲得的數據可以使用本技術領域的 專業人員已知的適合的計算機軟體來分析和進行數學處理，以確定尤 其是一種或多種靶核酸的存在，長度或序列，和/或計算它/它們的量。
在某些實施方案中，特別是如果報告化合物超過靶核酸的量，表 明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的測定，在 一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸的複合物的形成，和 沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物在第二結合元件 上的捕獲達到平衡之前進行。例如，測定/檢測步驟在擴增反應的退火 步驟期間進行。但是，在退火步驟完成之後(即延伸步驟期間或完成 之後)進行測定/檢測，也是可能的。
在其它實施方案中，表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的 存在和/或量的值的測定，在一部分量的報告化合物與至少一部分量的 靶核酸形成複合物的步驟和將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量
的報告化合物捕獲在第二結合元件上的步驟之後1秒到120秒內進行 (例如1， 5， 10， 15， 20， 30， 60或120秒)。
在其它實施方案中，表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的 存在和/或量的值的測定，在包含了變性，退火和延伸步驟的循環式擴 增的至少一個循環後進行，例如在退火步驟期間或完成之後進行。在 具體的實施方案中，該值的測定在每個循環式擴增的循環之後進行。 在其它具體實施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值的測定，在每
次表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值被測定之後進行。
在某些實施方案中，表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的 存在和/或量的值的測定，包括了對指示值的時間依賴性的監測(即重 復地執行測定/檢測步驟，並監測指示值隨時間的過程)。
在其它實施方案中，表明靶核酸的存在和/或量的值，是根據將表 明報告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸的存在和/或量的值相 關聯的校正曲線來測定的。
方法可以在上述的裝置中進行，該裝置含有適於容納液體的結構， 其中結構含有至少一個結合元件，並與微流體網路流體連通；控制單 元，適於控制流體流過微流體網路，以便耙分子被捕獲在至少一個結 合元件上，適於控制靶分子在結構中的擴增，並適於控制捕獲在至少 一個結合元件上的化合物的檢測。例如，方法可以在裝置中進行，該 裝置含有剛性基體；至少部分覆蓋基體的撓性覆蓋元件；在基體中形 成的第一結構，適於容納液體並適於釋放一種或多種細胞，孢子或病 毒的內含物，內含物中包含靶分子；在基體中形成的第二結構，適於 容納液體，並含有至少一個結合元件，適於捕獲靶分子並用於測定表 明靶分子的存在和/或量的值；微流體網路，至少將第一結構和第二結 構相互連通；以及致動器單元，適於通過將撓性覆蓋元件壓向基體以 選擇性關閉一部分微流體網路，來實現第一結構和第二結構之間的流 體流動。
例如，可以使用包含了第一孔502的裝置500。在這樣的實施方 案中，形成含有靶核酸和捕獲分子的複合物的步驟在第一孔中進行。
裝置500可以包含第二孔512。在這樣的實施方案中，第一結合 元件和第二結合元件被提供在第二孔中，並且將複合物與第一結合元 件相接觸以將複合物結合在第一結合元件上的步驟，從第一結合元件上釋放至少一部分量的靶核酸的步驟，形成一部分量的報告化合物與 至少一部分量的靶核酸的複合物的步驟，將沒有與靶核酸形成複合物 的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結合元件上的步驟，以及測定 表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的步驟， 在第二孔中進行。
按照被發明的另一個示例性實施方案，方法包括 -形成物質的組合物，該物質包含 一定量的報告化合物，
能夠結合報告化合物的結合元件，以及 一定量的能夠與報告化合物結合的靶核酸，
靶核酸與報告化合物的結合抑制了報告化合物與結合元件的結
合，
-將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸結合； -將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物結合在 結合元件上；以及
-測定表明結合在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值。
在第一步中，方法可以包括形成物質的組合物，該物質包含一定 量的報告化合物，結合元件和一定量的靶核苷酸。本文使用的術語"形 成組合物"是指上述成分的任何組合或混合。這可以通過將成分同時 地，相繼地或分別地導入到適合用於進行該方法的分析裝置的一個或 多個反應室中來實現。可選地，在將混合物導入裝置中之前，將單獨 的成分進行混合，也是可能的。
正如前面已經描述的，方法還可以使用一種以上的報告化合物和 一種以上的靶核苷酸來進行。因此，在某些實施方案中，形成物質的
組合物的步驟包括形成含有下列成分的物質的組合物 -一定量的第一報告化合物，
-一定量的能夠與第一報告化合物形成複合物的第一靶核酸，與第一報告化合物形成複合物抑制了第一報告化合物被結合元件的捕獲， -一定量的第二報告化合物，以及
-一定量的能夠與第二報告化合物形成複合物的第二靶核酸，與第 二報告化合物形成複合物抑制了第二報告化合物被結合元件的捕獲。
裝置可以是任何適合於通過被發明的方法分析樣品的儀器設備。 用於本方法的典型的裝置描述在本文中。這樣的裝置的示例性實施方 案描述在圖17到19中。其它適合於進行本方法的裝置描述在歐洲專
利申請EP 06 122 695和國際專利申請WO 2007/051861中，每個專利 申請在此以其全文引為參考。
在某些實施方案中，反應室可以包含兩個或多個子室。這可以通 過提供帶有一個或多個分區或洞的第一表面和/或第二表面來實現，這 些表面用作兩個或多個子室之間的側壁。
在其他實施方案中，用於本方法的裝置包括了一個以上反應室， 以在不同的反應室中平行地執行一個樣品的多個分析，或以連續的方 式執行分析的不同步驟。就此而言，反應室可以彼此之間流體連通。 流體連通包含了單個反應室之間的任何相互連通，可以是直接地，也 可以是間接地通過其它的方式例如共同的樣品導入通道，填充單元， 加工單元等。但是，本文中使用的該術語不必需意味著在導入樣品後， 反應室彼此之間永久地流體連通。反應室也可能是暫時流體連通的， 例如通過位於反應室之間的連接處的單向或雙向閥來實現。
在形成了物質的組合物之後，方法可以包括將一部分量的報告化 合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步驟。換句話說，可以允 許報告化合物與靶核酸結合，例如通過報告化合物和靶核酸的互補核 苷酸序列的鹼基配對形成雙鏈核酸分子。 一部分量的報告化合物與至 少一部分量的存在的靶核酸形成複合物的事實，表明在分析開始時存 在的報告化合物的總濃度可能超過存在的耙核酸的總濃度。隨後，可以將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘量的報告化合物， 通過上面描述的報告分子中包含的一個或多個結合區域捕獲(即結合) 到結合元件上(直接地，或結合到連接在結合元件上的捕獲分子上)。 因為靶核酸與報告分子的複合物的形成抑制了報告分子在結合元件上 的捕獲，與執行形成靶核酸/報告分子複合物的步驟之前存在的量相比， 靶核酸/報告分子複合物的形成減少了可以被捕獲在結合元件上的報告 分子的量。
最後，方法可以包括測定表明捕獲在結合元件上的報告化合物的 存在和/或量的值。表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量 的值的測定，包括檢測/測定允許對捕獲(或重新捕獲)在結合元件上 的報告分子進行定性和/或定量測定的參數，例如電導性，氧化還原電 勢，光吸收，螢光強度或生物發光。可以只測定這些參數中的一種， 但是相伴地或相繼地測定一種以上的參數(例如電導性和由適合的標 記物產生的螢光信號的強度)，也是可能的。
為了執行檢測反應，報告化合物可以包含一種或多種如上所述的 可檢測標記物，例如螢光標記物。可檢測標記物可以整合或連接到報 告分子上，例如以修飾的和/或標記的核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或 雙脫氧核糖核苷酸的形式。
為了檢測這樣的標記物，用於執行方法的裝置還可以含有如上所 述適合於測定表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值 的檢測系統，例如光學檢測系統。檢測系統可以與反應室相連。典型 情況下，檢測系統位於至少一個反應室之一的對面，可選地位於發生 檢測的特定表面區域的對面。
在某些實施方案中，方法還包括在將一部分量的報告化合物與至 少一部分量的靶核酸形成複合物，將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結合元件上，以及測定表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值的步驟之後，將剩餘部分量的報 告化合物從結合元件上釋放出來。本文使用的術語"釋放"，是指從 結合元件上分開或解開報告分子。這可以通過例如裂解任何共價鍵來 酶法實現，或者在核酸報告分子是通過核酸捕獲分子經互補鹼基配對 而結合到結合元件上的情況下，通過增加分析發生在其中的反應室中 的溫度，從而導致核酸鏈的分離(即變性)來完成。
在其它實施方案中，釋放，形成複合物，捕獲和測定的步驟可以 被重複額外的N次，其中N是大於或等於1的整數。換句話說，方法
以循環的方式進行。在具體的實施方案中，整數N是S5， S10或^20。
在某些實施方案中，在形成複合物的步驟之前，方法還包括將至
少一部分量的報告化合物捕獲在結合元件上；測定表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值；以及從結合元件上釋放被捕獲 的報告化合物。因此，進行這些附加的步驟能夠測定在允許報告化合 物與靶核酸之間形成複合物之前，最初存在的報告化合物的量。將獲 得的值與將沒有與靶核酸形成複合物的部分量的報告化合物捕獲在結 合元件上之後測定到的值進行比較，提供了對樣品中存在的靶核酸的 存在和/或量的測定。
在具體的實施方案中，方法還包括對靶核酸進行擴增，也就是說， 在將它們進行進一步分析之前增加它們在樣品中存在的量，以便於進 一步的檢測。典型情況下，靶核酸的擴增通過循環式擴增的方式來實 現。循環式擴增可以包含任何等於或大於2的數量的擴增循環。通常， 循環式擴增反應包括至少10個或至少20個循環。示例性的循環式擴 增是如上所述的聚合酶鏈反應(PCR)。
在進行分析期間，表明靶核酸的存在和/或量的值的檢測/測定，可 以只進行一次，也可以進行一次以上。在單一分析過程中進行一個以上檢測步驟的情況下，計算獲得的結果的平均值。在一個或多個檢測 循環中獲得的數據，可以使用本技術領域的專業人員所熟知的適合的 計算機軟體進行分析和數學處理，以確定尤其是一種或多種靶核酸的 存在，長度或序列，和/或計算它/它們的量。
參考圖la，用於測定分子靶的方法100包含了裂解步驟102 (用
於在存在帶有錨定基團的捕獲分子的情況下裂解樣品，例如全血)，
複合物形成步驟110 (用於形成HIV核酸和帶有錨定基團的捕獲探針 的複合物，例如雜交)，捕獲步驟114 (用於通過錨定基團將複合物捕 獲在固相基質上)，清洗步驟118 (用於除去所有未結合的物質，例如 核酸，蛋白，低分子量汙染物等)，擴增步驟120 (用於擴增和標記捕 獲的核酸)和檢測步驟126 (用於檢測擴增子)。按照方法IOO，多核 苷酸從樣品的一種或多種靶病原體中釋放。被釋放的與靶病原體有關 的多核苷酸被捕獲在表面上。將被捕獲的多核苷酸與樣品中的相伴物 質(例如擴增抑制劑)分離開來。分離出的捕獲的多核苷酸被擴增以 形成擴增子。通過檢測擴增子確定多核苷酸的存在。因為擴增的多核 苷酸與靶病原體有關， 一種或多種靶病原體的存在和/或身份可以被確 定(例如定性地和/或定量地)。在示例性的實施方案中，方法100包 括了根據血液樣品中存在的一種或多種病毒的測定來測定病毒載量。 下面，將討論方法100的各個不同的步驟。
在裂解步驟102中，多核苷酸106從血液樣品104中存在的病原 體中釋放。可以按照所需方法將多核苷酸從靶病原體中釋放(例如熱 的，化學的，機械的方法，或通過它們的組合)。在示例性實施方案 中，通過將樣品104與含有裂解樣品中的病原體的物質的裂解液體相 組合來釋放多核苷酸。能夠裂解病原體的液體的例子可以在Boom R., Sol C. J. , Salimans M.M.， Jansen C. L. , Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J., Rapid And Simple Method For Purification Of Nucleic Acids,(用於純化核酸的快速和簡單的方法)J. Clin. Microbiol. 1990 Mar;28(3):495-503,中發現，在此引為參考。示例性的裂解液體含有一種或多種變性劑(例如硫氰酸胍(GuSCN)(例如大約4.57M) ) ， pH緩衝劑(例如Tris-HCl (例如 pH6.4， 45mM)，螯合劑(例如EDTA20mM)，以及去汙劑(例如 Triton X-100， 1.2% (w/v)和/或皂苷(例如0.2%))，鹽(例如MgCl2(例如75 mM)和/或ZnCl2 (例如1 mM))。裂解步驟102典型情況下包括形成含有被釋放的多核苷酸106， 樣品104的伴隨物(例如細胞成分，擴增抑制劑，蛋白和其它物質) 以及捕獲分子108i的混合物。每個捕獲分子108i含有多核苷酸結合部 分109i和生物素錨定基團111。每個多核苷酸結合部分109i是與多核 苷酸106的不同區域互補的(例如特異性針對它的)多核苷酸序列。 例如，捕獲分子108a含有與多核苷酸106的靶區域113互補的結合部 分109a，捕獲分子108b含有與多核苷酸106的不同的靶區域115互補 的結合部分109b。典型情況下，對於每個被測定的多核苷酸，使用至 少一種(例如兩種或以上，三種或以上，四種或以上)不同的捕獲分 子。在某些實施方案中，多核苷酸106在存在捕獲分子108i的情況下 從靶病原體中釋放。這可以通過例如將樣品104基本上同時與捕獲分 子108i和裂解液體成分進行組合來完成。樣品104可以與捕獲分子108i 組合，裂解液體成分可以與捕獲分子108i組合，裂解液體成分在液體 狀態或乾燥(例如冷凍乾燥)狀態下。在可選的實施方案中，多核苷酸從樣品104的病原體中釋放，獲 得的混合物與捕獲分子108i組合。例如，可以將樣品104和除了捕獲 分子108i之外的裂解液體成分組合，並允許溫育一段時間，然後再將 溫育過的混合物與捕獲分子108i組合。在示例性的實施方案中，多核苷酸106是HIV-RNA，捕獲分子108i的結合部分109i與其區域互補。現在轉到複合物形成步驟110，將一種或多種捕獲分子108i與多 核苷酸106組合(例如與其雜交)，以形成複合物112。複合物形成步 驟110可以通過例如允許被釋放的多核苷酸106在存在捕獲分子108i 的情況下溫育一段足以形成複合物112的時間來進行。在某些實施方 案中，溫育時間為至少大約60秒(例如至少大約120秒，至少大約360 秒)。在某些實施方案中，溫育時間為大約600秒或以下(例如大約 480秒或以下，大約420秒或以下)。在示例性的實施方案中，溫育時 間是大約5分鐘。對於每個被測定的多核苷酸來說，捕獲分子108i的總濃度典型情 況下足以捕獲複合物112中的大部分(例如至少60%，至少75%，至 少90%，基本上全部)多核苷酸。在某些實施方案中， 一種或多種(例 如大部分或全部)捕獲分子108i的每種的濃度是至少大約O.lpM (例 如至少大約0.25pM，至少大約0.5pM)。 一種或多種(例如大部分或 全部)捕獲分子的每種中的濃度，在典型情況下是大約2 ^M或以下(例 如大約1.5pM或以下，大約lpM或以下)。在示例性的實施方案中， 一種或多種(例如大部分或全部)捕獲分子的每種的濃度是大約0.625 (iM。轉到捕獲步驟114，將複合物112和捕獲粒子117組合以形成復 合物119。每個捕獲複合物119含有一個或多個複合物112和捕獲粒子 117。複合物112典型情況下非選擇性地結合到粒子117上。每個捕獲 粒子117含有鏈親和素捕獲表面116。捕獲粒子117通過捕獲分子108i 的一個或多個生物素錨定基團111與鏈親和素捕獲表面116之間的相 互作用捕獲每個複合物112。示例性的捕獲粒子117包括直徑為大約 34 pM的鏈親和素瓊脂糖珠子(Amersham)，該珠子用diH20預先清 洗以除去乙醇。每次分析使用大約10,000到20,000顆珠子，相當於每 10 全血大約3 nmol生物素的結合能力。典型情況下，捕獲步驟114在將樣品104與多核苷酸106和捕獲分子108i溫育一段足以形成複合物112的時間後開始。例如，樣品104可以在存在裂解液體和捕獲分子108i的情況下溫育，然後將獲得的混合物與捕獲粒子117組合。
典型情況下，捕獲分子108i和粒子117的總濃度，足以定量捕獲與樣品104中的一種或多種靶病原體中的每種有關的一種或多種選定的多核苷酸106中的每種。因此，對於每種被測定的多核苷酸106來說，基本上所有(例如至少75%，至少90%,至少95%,至少97.5%或基本上所有)的多核苷酸被捕獲分子108i和粒子117捕獲。
轉向清洗步驟118，將捕獲複合物119與沒有被粒子117捕獲的相伴的物質(例如核酸，蛋白，細胞成分，裂解試劑等)分離開。在某些實施方案中，使用具有小得足以阻止複合物119通過，但大得足以允許沒有被粒子117捕獲的物質通過的孔徑的過濾器，對捕獲複合物119進行過濾。
捕獲複合物119可以用清洗液體清洗，以增加與相伴的物質的分離。在某些實施方案中，使用了兩種或以上不同的清洗液體。在某些實施方案中，第一清洗液體含有去汙劑以除去通過疏水相互作用粘附到粒子上的低分子量物質，蛋白和其它細胞成分，第二清洗液體用於除去去汙劑，否則可能干擾隨後的擴增過程。示例性的第一清洗液體包含0.15 MLiCl， 0.1% SDS (因為SDS是PCR抑制劑，它可以在PCR步驟前被除去)，10mMTris-HClpH8.0和1 mMEDTA。示例性的第二清洗液體包含0.15 MLiCl， 10 mM Tris-HCl pH 8.0， 1 mM EDTA。適合的清洗液體被描述在例如美國專利申請公開No. 20040215011A1中，以其全文引為參考。
轉向擴增步驟120，使用探針122對多核苷酸106進行擴增。典型情況下，擴增是PCR擴增。在示例性的實施方案中，多核苷酸106
是RNA，擴增是RT-PCR。在某些實施方案中，病原體是HIV。
參考圖ld，在某些實施方案中，擴增步驟120產生了擴增子130。 在雜交條件(例如溫度)下，擴增子130被固定在粒子117的鏈親和 素表面116上的捕獲探針分子108a， 108b和108c捕獲。將擴增子用熒 光標記試劑125標記，該試劑中含有光學標記物124(例如螢光標記物) 和與擴增子130的區域互補的多核苷酸部分129。
參考圖le，在可選的實施方案中，每個探針122包含光學標記物 124 (例如螢光標記物)。其它的探針108j包含與擴增子130的區域互 補的多核苷酸部分109j,並且還帶有生物素錨定基團111。將探針分子 108j捕獲到粒子117的鏈親和素表面116上。擴增步驟124產生了直 接標記的擴增子130，每個擴增子含有標記物124。將擴增子130用固 定在粒子117的鏈親和素表面116上的探針分子108j捕獲。探針108j 的結合部分109j可以與用於捕獲步驟114的探針108i的相同或不同。 探針108.j和/或珠子117可以與多核苷酸106以及其它用於進行擴增步 驟120的成分混合。
在檢測步驟126中，擴增子130被檢測(例如通過標記物111的 螢光檢測)。檢測步驟126可以用捕獲在粒子117的鏈親和素表面116 上的擴增子130來進行。可以進行檢測步驟126，而不用首先將擴增子 與不含探針122的液體組合。例如，可以使用在減小了表面的距離後 在第一和第二表面之間存在的捕獲的擴增子130來進行檢測步驟126。 這種用於進行檢測步驟126的方法的實施方案接下來參考圖lb和圖lc 進行討論。
參考圖lb和圖lc，用於進行方法IOO的至少檢測步驟126的系統 200，含有微流體盒202，檢測系統210，型板致動器212，以及與檢測 系統210和致動器212相連的處理器218。盒202包含了第一基體206和第二基體208，它們一起限定了檢 測室204。第一基體206典型情況下對於用於激發和檢測來自擴增子 130的標記物124的螢光的光的波長來說是透光的(例如透明的)。第 一基體206可以由例如聚合物，玻璃或矽石形成。第二基體208由可 彎曲的或撓性的材料(例如彈性聚合物)形成。第一基體206 —般不 如第二基體208撓性。
致動器212含有型板214和被成形用於驅動型板朝向和遠離第二 基體208的型板驅動器236。型板致動器236可以由例如壓縮空氣，電 磁鐵，壓電式裝置或其它適合的致動裝置致動。如圖lc中所示，當被 致動朝向第二基體208的壁238時，型板214減少了第一基體206的 內壁232與第二基體208的內壁234之間的距離"d"。在圖lc的減少 的距離狀態下，至少某些帶有被捕獲的擴增子130的捕獲粒子117保 留在表面232和234之間。相反，大部分圍繞著粒子117的液體從表 面232和234之間被移走。
檢測系統210被構造為在圖lc的減少的距離狀態下檢測盒202中 擴增子130的存在。檢測系統210包含光源246 (例如雷射器)，成像 檢測器240以及光學系統242。在使用中，光源246照亮存在於基體 206和208的內表面232和234之間的物質。從擴增子130的標記物 124發射的螢光250被檢測。被檢測到的螢光250指示擴增子130的存 在。處理器218接收來自檢測系統210的指示了被檢測的螢光的信號。 處理器218可以測定擴增子130的存在，因此也能夠測定樣品104中 相應病原體的存在。
一般來說，保留在內表面232和234之間的液體發射出與擴增子 130的存在無關的背景螢光252。背景螢光252的強度通常與保留在內 表面232和234之間的液體的量成比例。但是，來自擴增子130的標 記物124的標記物螢光250的強度，在空間上位於粒子117的附近。成像檢測器240接收和檢測標記物螢光250和背景螢光252。但是，因 為在圖lc的減少的距離狀態下液體從內表面232和234之間被移走， 因此與圖lb的未減少的狀態下相比，標記物螢光252相對於背景螢光 250的信噪比較高。
方法100的示例性實施方案可以如下進行。從個體獲得大約5到 10pL的毛細血管血液(例如指尖，耳垂)。將血樣與大約90pL含有 裂解成分和捕獲分子108i的裂解緩衝液組合。將得到的混合物在21°C 攪拌溫育大約5分鐘。將溫育過的混合物與對應於3 nmol生物素結合 能力的相當於大約l(HiL漿液的量的粒子117 (即作為在20%乙醇中的 粒子漿液購買的粒子)組合。將含有粒子的混合物在21。C攪拌溫育大 約5分鐘。溫育後，通過用型板致動器系統350操作盒300來除去上 清液。將粒子用第一清洗緩衝液清洗(例如每次用50pL體積清洗，共 3次)，然後用第二清洗緩衝液清洗(例如每次用50pL體積清洗，共 3次)。清洗後，除去上清液。將清洗過的粒子與擴增介質組合，並進 行qRT-PCR擴增，以檢測(例如定量)被捕獲的多核苷酸106。
參考圖14，檢測了來自擴增子130的螢光(例如，使用儀器的減 少的距離模式，例如圖lb和圖lc中顯示的)。擴增子130可以在擴增 的多個不同加熱和冷卻循環的每個循環之後進行檢測。通過這種方式， 可以及時跟蹤擴增子濃度的增加。典型情況下，擴增子在結合到粒子 117上時被檢測到。
儘管在描述方法100時包含了從病原體釋放多核苷酸的步驟，但 方法IOO可以包含其它用於提供多核苷酸的步驟。在某些實施方案中， 多核苷酸從非病原性細胞(例如植物，人類，動物等)釋放。在某些 實施方案中，多核苷酸是基因表達分析的產物。在某些實施方案中， 多核苷酸的提供不需要釋放步驟，和/或提供為已經從細胞或其它生物 學樣品中釋放出來的多核苷酸。接下來，將討論典型情況下能夠進行方法100的大多數(例如所 有)步驟的分析系統和微流體盒的實施方案。
參考圖2，微流體盒300含有第一基體301，第二基體303和微流 體網路305。第一和第二基體301和303可以具有與對盒202的基體 206和208所描述的相似的性質。
微流體網路305被構造為接受樣品和各種不同的試劑材料，允許 對這些材料進行操作(例如混合，運輸和溫育)，以便於表明一種或 多種靶病原體的存在的擴增子的檢測。
微流體網路305包含了樣品入口 302，它通過通道304與裂解室 306相連，裂解室通過通道308和接頭307與檢測室332相連；第一液 體入口 310通過通道312與第一試劑室314相連，該第一試劑室通過 通道316與接頭307相連；第二液體入口 318通過通道319與第二試 劑室320相連，該第二試劑室通過通道322與接頭307相連；第三液 體入口 324通過通道326與擴增標記試劑室328相連，該擴增標記試 劑室通過通道330與接頭307相連。接頭307通過廢物通道336與廢 物室334相連。檢測室332通過廢物通道340與廢物室334相連，廢 物通道含有過濾器，其大小可以阻止粒子317通過，但是允許在方法 100的清洗步驟118中描述的未捕獲的物質通過。
典型情況下，試劑室306， 314， 320， 328含有用於進行方法100 所述的步驟的冷凍乾燥的試劑(例如作為丸粒)。在使用中，液體(例 如水，緩衝液，水性溶劑或其它液體)被導入到相應室的入口中。液 體使冷凍乾燥的試劑溶解，形成了液體。在示例性的實施方案中，裂 解室306含有促進耙病原體的裂解的冷凍乾燥的試劑和對應於病原體 的多核苷酸的捕獲分子308i。典型情況下，反應室306的冷凍乾燥的 試劑用樣品(例如全血樣品)單獨溶解，或與加入的液體組合起來溶 解。在示例性實施方案中，室314含有冷凍乾燥的試劑，當與導入到入口 310的液體組合時形成了清洗液體(例如第一清洗液體(緩衝液))。
示例性實施方案中，室320含有冷凍乾燥的試劑，當與導入到入口318
的液體組合時形成了清洗液體(例如第二清洗液體(緩衝液))。在
示例性實施方案中，室328含有冷凍乾燥的試劑，當與導入到入口324 的液體組合時形成了擴增混合物(例如第二清洗液體(緩衝液))。
典型情況下，在使用裝置300之前，粒子116被放置在室306的 網路305的下遊中。例如，在使用前粒子116可以放置在檢測室332 中。粒子U6可以通過下面討論的型板的適合的致動，用來自室306， 314， 320， 328的液體清洗。
參考圖3，顯示了微流體盒300以及用於操作盒300的型板致動 系統350。致動器系統300含有致動器基部352和多個型板354i。每個 型板354i用與型板驅動器236相似的相應的型板驅動器來致動。在使 用中，盒300隨著撓性基體303定位，面對著致動器基部352和型板 354i。每個型板354i在空間上對應於微流體網路305的不同位置。例 如，型板354d對應於廢物通道336。當致動時，型板354d壓迫覆蓋在 通道336上的基體303，從而阻塞了通道336，並阻止流體沿著它們通 過。
因此，第二基體303或覆蓋元件的撓性性質，確保了當型板施加 機械力在撓性的第二基體303的指定部分上時，它可以可逆的方式變 形。換句話說，如果需要可逆的閥作用，第二基體303的變形是可逆 的，使得當型板354i施加的力量被除去時，第二基體303返回到其初 始的位置，使得流體可以再次沿著相應的通道336通過。
與此相反，第一基體301的剛性性質是指第一基體301的材料被 構造為使得一旦通過型板354i施加力到第一基體301上，第一基體301 不會發生對閥的功能有影響的變形。因此，第二基體303提供了撓性， 而第一基體301提供了穩定性。其它型板類似地對應於網路305的其它通道。型板354a和354c 分別對應於廢物通道340和接頭307。型板354a和354c的致動封閉了 檢測室332，允許進行多個加熱和冷卻的循環而不顯著損失其中的液 體。過濾器341允許用來自室306， 314， 320和328的液體清洗室332 中的粒子116而不損失粒子。還有其它的型板，分別對應於室306，314， 320， 328和332。這些型板的重複致動可用於攪拌室中的物質(例如 液體)，以便於混合(例如樣品和試劑的混合)。沿著通道順序地致 動型板可用於沿著通道移動液體。可以通過例如致動相應的型板操作 室的上遊，下遊和上方，來清空室中的內含物。
在一個實施方案中，基體是足夠可逆的，使得在重複的型板致動 和移除後(例如至少10次致動和移除，或至少50次致動和移除)， 基體返回到其原始位置，使得微流體網路位於特定型板下的部分可以 被重複地阻塞和重新打開。
盒300可以如下操作。將一定量(例如大約5-10jiL之間)的樣品 (例如全血)和任選量(例如大約5到50pL之間)的液體(例如水) 通過入口 302導入到室306的網路305中。將一定量(例如大約20到 200 pL之間)的液體通過相應的入口導入到室314， 320和328中。分 別導入的樣品和任選的液體使室306， 314， 320和328中存在的冷凍 乾燥試劑復溶。對應於每個室的型板被致動，攪拌其中的液體試劑混 合物，以促進混合。在裂解室306中，裂解緩衝液從病原體釋放多核 苷酸106 (例如像在裂解步驟102中那樣)。將釋放的多核苷酸與捕獲 分子108i組合以形成複合物112 (例如像在複合物形成步驟110中那 樣)。
將室306中的裂解混合物移到檢測室332中，並與粒子116混合 和溫育，形成了捕獲複合物119 (例如，像在捕獲步驟114中那樣)。 室332中的混合物可以例如使用型板進行攪拌。在捕獲步驟114溫育結束時，使用操作盒300的型板致動系統350將液體/上清液從檢測室 332移除到廢物室334中。
在從廢物室332除去液體/上清液後，將清洗液體從室314和320 通過室332移動，以便將複合物119與相伴的物質分離開(例如，像 在清洗步驟118中那樣)。在清洗過程中可以通過型板354b對室332 進行攪拌。
在室332中將相伴物質與複合物119分離後，將擴增試劑從室328 移動到檢測室332，對得到的內含物進行多次PCR循環(例如，像在 擴增步驟120中那樣)。
在一個或多個擴增循環的每個循環後，致動型板354b以減小檢測 室332的相對的內表面之間的距離。複合物119，如果存在的話，保持 捕獲在內表面之間，而其他內含物則相對被除去，如同在圖lc中對於 裝置200討論的那樣。檢測一般使用螢光檢測系統進行(例如像對裝 置200描述的那樣)。典型情況下，對複合物112的擴增子130進行 檢測，擴增子處於雜交狀態並結合到粒子117，類似於複合物119(例 如，像在檢測步驟126中那樣)。在每個循環之後，擴增子130的群 體數量增加。從捕獲複合物119產生的螢光強度也隨之增加。可以監 測螢光強度隨著循環數的增加，以確定可以對擴增子130進行定量的 閾值循環。因為多核苷酸106的捕獲是定量進行的(例如，像在捕獲 步驟114中那樣)，因此擴增子130的定量檢測允許對樣品中存在的 多核苷酸106的量進行定量測定。因此，在例如病原體是病毒(例如 HIV)的情況下，樣品(例如全血)中的病毒載量可以被測定。
盒300還可以包括含有多個固定化的多核苷酸的陣列，每個多核 苷酸對應於不同病原體亞型的多核苷酸序列。在檢測步驟126之後， 進行擴增子130的雜交以確定病原體亞型。在示例性的實施方案中， 陣列含有被構造為以確定HIV的亞型的多核苷酸。儘管描述的盒300的操作包含了添加液體試劑，但液體試劑也可
以儲存在盒上，例如在透明包裝(blisterpack)中，並在使用時釋放。
適合於光學測定標記物124的存在的系統的其它例子被描述在下 列每個申請中2005年1月6日提交的國際專利申請 PCT/EP2005/004923的美國連續申請，該國際專利申請指定美國並要求 了 2004年1月6日提交的德國專利申請DE 10 2004 022 263的優先權， 以及2006年11月6日提交的專利申請號No. US 11/593,021的美國連 續申請，每個這些申請以其全文引為參考。
接下來，參考圖4到圖16，將對按照示例性實施方案的分析過程 中的各種不同步驟進行解釋。
圖4圖示了裂解室。
圖5到圖10圖示了 RNA複合物在固相基質上的捕獲。
圖11圖示了清洗。
圖12和圖13圖示了擴增。
圖14到圖16圖示了檢測。
圖17a圖示了示例性的系統400，用於執行至少從樣品捕獲靶，擴 增靶和檢測一個或多個表明樣品中靶的存在的值的步驟。
圖17b圖示了示例性的系統400，用於執行至少從樣品捕獲耙， 擴增靶和在操作狀態下檢測一個或多個表明樣品中靶的存在的值的步 驟。圖17c圖示了在圖17a和17b中描繪的閥單元435的示例性實施方案。
圖17d圖示了在圖17c中描繪的閥2的示例性實施方案。
參考圖17a和b，示例性的系統400包含了微流體盒401，檢測系 統455，用於加熱至少一部分盒的系統451，致動器元件441-444和致 動器437-440，閥單元435，壓縮機431，液體儲存器461和處理器471。
盒401包含了基體402和第一覆蓋元件403，它們共同限定了第 一和第二孔408和407。第一覆蓋元件403是至少部分撓性的，允許覆 蓋元件被可逆地壓向基體402。盒還含有第二覆蓋元件，與基體402 — 起限定了通道410， 411和412。在某些實施方案中，第二覆蓋元件也 是至少部分撓性的。通道和孔通過洞413， 414， 415， 416相互連通， 以形成微流體網路。
在各種不同的實施方案中，基體402可以是由任何適合的材料， 例如塑料，玻璃，金屬或半導體製成的物理體。它可以是任何基本上 平面的(即二維的)或非平面的(即三維的)表面。這樣的三維物體 的例子是具有腔或洞的物理體，包括含有流體通路(例如通道)的反 應室(其中可以發生生物，化學或生物化學反應)。
第一孔408，也可以被稱為裂解孔，適於容納流體，並用於釋放 細胞，孢子或病毒的內含物，內含物中含有通過系統400分析的靶分 子。例如，第一孔408可以適於通過包含上述的裂解試劑409來釋放 細胞，孢子或病毒的內含物。裂解試劑409可以以乾燥的形式提供。
第二孔407也可以被稱為中心孔，適於容納流體，並含有粒子406 作為第一結合元件，粒子適於捕獲與捕獲分子複合的靶，並任選地含
1有第二結合元件417，適於捕獲報告分子。第二孔407還含有過濾元件
405，以阻止粒子406通過，但允許氣體，液體和溶解在液體中的物質 通過。孔407和408經過洞415和414通過通道411相互連通。
更通常來說，第一或第二孔408， 407可以是任何結構，即任何可 以用作載體以接受樣品或物質的物理實體。特別是，這樣的結構可以 包含凹陷例如溝槽，孔或通道，或者也可以包括其中可以容納物質， 並通過它可以移動物質的材料，例如凝膠。
在各種不同的實施方案中，結合元件含有被成形成結合具有特定 構型的分子的部件。這樣的結合元件可以是也可以不是固定在表面上 的分子。結合能力也可以直接來自於表面構型(例如多孔的表面結構)。 將結合元件提供作或提供在三維元件例如珠子或多孔支持物上，也是 可能的。然後這樣的三維元件的表面，或結合到三維元件例如粒子的 表面上的分子，可以用作結合元件。對不同分子敏感的不同結合元件， 也可以布置(例如以類似矩陣的方式)在結構的表面上。結合元件的 例子在上面與本文公開的各種不同方法一起進行了描述。
裂解孔408和中心孔407的體積可以是100 pL。在示例性實施方 案中，通道410-412的寬度是200 )im，通道410-412的高度是100 pm。
在各種不同的實施方案中，這樣的微流體網路可以包含一個或多 個通道和/或孔，它們可以彼此相互連通。例如，這樣的微流體網路的 各種不同通道可以是分叉的或分支的，從而允許沿著預定的路徑通過 微流體網路運輸液體(未顯示)。
系統400還可以包含致動器系統，它含有由氣動致動器437， 438， 439， 440驅動的致動器元件441， 442， 443和444，以及閥單元435， 壓縮機431和壓縮空氣儲存器433。壓縮機431可以經常調整壓縮空氣 儲存器433中的預定壓力。每個致動器元件441， 442， 443， 444由相應的致動器致動。在使 用中，盒401用至少部分撓性的覆蓋元件403定位到面對致動器和致 動器元件。每個致動器元件在空間上對應於盒401的微流體網路的不 同位置。例如，致動器元件442對應於洞414，它經過通道411和洞 415通向孔407。當致動時，致動器元件442壓縮覆蓋在洞414上的至 少部分撓性的蓋子403，從而阻塞了洞414，防止流體沿著它通過。其 它致動器元件類似對應於其它結構。例如，致動器元件443和444分 別對應於洞415和416。致動器元件415和416的致動密封了第二孔 407，允許例如進行多個加熱和冷卻循環，而不明顯損失其中的液體。
對於致動器元件442的示例性的致動來說，控制單元發送信號到 閥單元。閥單元打開通向致動器438的氣動接頭436，從而對致動器 438施加壓力。因此，致動器元件442移動出來，壓縮覆蓋著洞414的 至少部分撓性的蓋子403。為了釋放致動器元件，控制單元發送相應的 信號到閥單元。閥單元關閉通向致動器438的氣動接頭，從而將致動 器元件442移動回來，釋放了覆蓋著洞414的至少部分撓性的蓋子403。
致動器元件可以適於使第一撓性的蓋子403彈性變形，以執行各 種不同的任務。例如，如上所述，致動器元件442適於壓縮覆蓋著洞 414的至少部分撓性的蓋子403，從而阻塞洞414，並阻止流體沿著它 流過，而致動器元件441適於通過重複地壓住和釋放覆蓋著孔408的 第一撓性蓋子來將液體在孔408中移動。
在一個實施方案中，致動器元件可以是能夠通過機械力選擇性打 開或關閉微流體網路的每個單獨的結構的元件。例如，這樣的致動器 元件可以是銷針或型板，它們可以壓向撓性的覆蓋元件，將後者壓到 基體的表面上，從而選擇性地打開或關閉通道。
在某些實施方案中，致動器元件441， 442， 443和444的尖端由彈性材料製成，例如矽酮，樹膠等。致動器元件442， 443和444的直 徑可以是洞414， 415和416的直徑的1.5倍。洞414， 415和416的典 型的直徑是0.5mm。
如上所述，提供了與致動器437-440相連的氣動閥單元435。閥單 元435從控制單元471接收驅動信號。因此，控制單元471控制致動 器元件441-444的操作。
提供了控制單元471例如微處理器，適於控制流體樣品的分析， 使得流體樣品的靶分子被捕獲在結合元件406上。控制單元471還控 制中心孔407中的耙分子的擴增。此外，控制單元471控制表明靶分 子的存在和/或量，並捕獲在結合元件417上的化合物的檢測。在靶分 子分析的過程中，所有固相結合過程發生在中心孔407的結合元件406 上。特別是，沒有固相結合過程發生在裂解孔408中。
在實施方案中，控制單元可以是能夠控制裝置的一種或多種其它 部件的功能，並且能夠具體協調每個部件的功能的電子部件。在控制 單元中，編碼或算法可以被儲存或被用戶定義在軟體，硬體，或混合 形式(即包括軟體和硬體部件)中，使得能夠進行特定的分析，實驗 或測定。具體來說，這樣的控制單元可以包含具有處理能力(任選地 還具有儲存能力)並被構造為以執行特定的實驗方案的處理器。具體 來說，這樣的控制單元可以是微處理器或CPU (中央處理器)。
中心孔407中流體的溫度可以被溫度操縱單元操縱，溫度操縱單 元含有氣動冷卻器453，溫度傳感器(未顯示)，以及布置在基體402 的上表面附近的加熱板451和具有中央凹陷459的第二環形加熱板451 以允許中心孔407中的分子的光學檢測。在某些實施方案中，加熱板 包含了用於調整加熱板和/或第二孔的溫度的溫度傳感器。控制單元471 可以控制板451的溫度分布，從而操作中心結構407中液體的溫度(例 如在分析過程中按照溫度順序執行聚合酶鏈反應，以擴增靶分子)。
1具體來說，溫度操縱單元451具有將位於中心孔407中的液體的溫度 升高到高達95。C的能力。
在基體402和覆蓋元件404之間，提供了流體界面418，以允許 通過通道410和洞413將液體例如水或緩衝液或氣體例如空氣插入到 微流體系統中。還可以提供另一個界面482，允許將樣品481插入到微 流體系統中。
在某些實施方案中，基體402至少部分是透光的，從而允許對中 心孔407中的成分迸行基於光輻照的檢測，這將在下面解釋。
含有光源(未顯示)例如雷射二極體的檢測系統455適於產生電 磁輻射光束，通過第二加熱元件451中的凹陷459入射中心室407。在 該室407中存在螢光標記的情況下，產生了次級電磁光束，可以通過 第二加熱元件451中的凹陷459傳播，並可以被檢測系統455中的檢 測器(未顯示)例如發光二極體檢測。檢測系統455的表明靶分子的 濃度的檢測信號可以通過控制單元界面456提供給控制單元471，用於 進一步處理。因此，正如可以從圖17中看到的，控制單元471也協調 檢測系統455的功能。
在某些實施方案中，在檢測過程中，檢測致動器457壓縮中心孔， 以減小撓性的覆蓋元件403與404之間或撓性的覆蓋元件403和404 與基體402之間的距離，從而從檢測區中排出含有沒有結合到結合元 件406或417之一上的物質的液體。
提供了液體供給461，以將液體例如水或緩衝液泵過由孔408和 407，貫穿孔413， 414， 415， 416和通道410， 411和412形成的微流
體網路。
液體通過裝置400的運輸也可以通過用負壓(未顯示)吸吮液體來進行。可以提供光學傳感器464，用於按照下面的解釋控制室408中 的液位。如果孔408用來自液體供給461的液體進行填充，控制單元 471通過界面446發送相應的信號到閥單元435。閥單元通過氣動接頭 463打開閥，將壓力施加在液體供給461上，從而將液體從液體供給 461通過液體接頭462，通道410和洞413壓入孔408。
當光學傳感器464檢測到表明孔408中液體的存在的信號時，傳 感器發送信號通過界面465到達控制單元471。然後控制單元471發送 信號到闊單元435。閥單元關閉閥，從而停止了液體供給461上的壓力， 進而停止了孔408外部的液體的移動。
也可以提供其它的光學傳感器，以控制其它結構例如通道(410， 411和412，傳感器未顯示)或孔(407，傳感器未顯示)中的液位。
在各種不同的實施方案中，樣品481可以包含任何固體，液體或 氣態物質或其組合。例如，物質可以是液體或懸浮液，更具體來說是 生物學物質(例如血液，特別是全血)。這樣的物質可以包括蛋白， 多肽，核酸，脂類，碳水化合物，病毒，細菌等。在實施方案中，樣 品是可能含有靶的物質的組合物。
正如可以從圖17看出的那樣，控制單元471還通過界面447控制 泵431。可以提供壓縮空氣儲存器433，以將泵抽過程與氣動冷卻器453 的致動器437-440的性能和檢測致動器457相協調。
系統400還包含用戶界面單元472，它也可以被稱為輸入/輸出裝 置。通過用戶界面單元472，用戶可以定義系統400所運行的實驗。換 句話說，用戶界面472可以使用戶對系統400進行編程，以便執行具 體的分析。這樣的用戶界面472可以包含具有顯示單元例如LCD，等 離子體裝置或陰極射線管的圖形用戶界面(GUI)。此外，在用戶界面 472上可以提供輸入元件，例如鍵盤，操縱杆，按鈕，軌跡球或甚至聲音識別系統的麥克風。用戶界面472與控制單元通過數據連線連接。
參考圖17c和d，在某些實施方案中，閥單元435含有多個(n) 單閥(2)。每個閥由含有通道(2.3)的轉子(2.1)和定子(2.2)構 成，二者用4條彈簧連續安裝和固定，以施加恆定的壓力。每個閥有4 個洞(a， b， c， d) ， a與通氣設備相連，b與壓縮機相連，c與氣動 致動器相連，d與致動器的通氣位點相連。
載體(3)與放置在管內部的球形螺釘相連。管(6)中的導槽使 得載體可以移動。驅動軸(5)的旋轉移動將導致球形螺釘和相連的載 體在X軸方向運動。這使得載體能夠運動到每個閥(2)的位置。載體 將鎖在轉子(2.1)中。
管(6)的90。的運動將導致載體(3)和轉子(2.1)的90。的運動。 轉子和轉子盤中的袋將打開或關閉閥接頭(a， b和c， d; d， a和b， c)。
下面，參考圖18和圖19，將對按照另一個示例性實施方案的裝 置500進行解釋。圖18顯示了裝置500的前視圖，圖19顯示了後視 圖。裝置500含有在基體402中形成的溝槽501，用於插入套管(未顯 示)，通過它可以將樣品供應到裝置500中。提供了裂解室502，其中 裂解所需的物質可以以乾燥的形式儲存。中心孔512用於執行操作裝 置500所需的所有固相結合過程。提供了其它的孔504， 506， 508和 510，在其中提供了乾燥形式的各種其它物質，可用於清洗步驟，PCR 步驟等。提供了廢物室514作為孔，分析所不再需要的液體可以被運 輸到其中。
儘管在圖18和圖19中沒有顯示，但在廢物室514中可以提供液 體吸附性物質，可以吸收進入廢物室514的流體。通過採取這種措施， 可以確保防止不需要的液體從廢物室514回流到裝置500的其它部分 中，從而避免任何汙染。例如，可膨脹的聚合物(也可以用於尿布中)
1可用於這樣的目的。
正如可以從圖18具體看到的，提供了多個流體連接埠 520,524， 521， 525， 540， 542， 544， 545， 548， 578， 580， 558， 562， 564， 560， 561， 552， 550， 516， 554, 530， 528， 532和526，用於連接不 同的通道，它們將在下面解釋。
正如可以從圖19看到的，顯示了其它的流體連接埠 541， 560， 566， 519， 512。此外，預見到多個通道538， 522， 518， 527， 529， 536， 572， 574， 576， 539， 562， 570， 546， 556， 568和534，連接 各個流體連接埠 520， 524， 521， 525， 540， 542， 544， 545， 548， 578， 580， 558， 562， 564， 560， 561， 552， 550， 516， 554， 530， 528， 532， 526， 541， 560， 566， 519和孔502， 504， 506， 508， 510 和512。此外，顯示了流體入口 593，通過它可以將流體例如水注射到 裝置500中。通過流體出口 594，可以從裝置500中排出流體(例如排 出空氣以降低壓力)。還顯示了流體入/出口 597。
顯示了可以被遮光板擋住的第一窗口部分598和可以被遮光板擋 住的第二窗口部分599,當裝置500中的流體柱的彎月液面通過與遮光 板相關的透明窗口部分598， 599時，可以用於進行光學檢測。當一個 遮光板檢測到對應於窗口部分598,599的室之一充滿了液體或溢流後， 這可以被光學檢測到，並可以用於產生控制控制單元(在圖18和圖19 中沒有顯示)的控制信號，以相應地控制裝置500的操作。
當插管的第一部分被插入到溝槽501中時，插管的第二部分可以 插入到患者中，以從患者獲取血樣，並將全血樣品直接注射到裝置500中。
儘管沒有顯示在圖18和圖19中，但任何一個流體連接埠 520， 524， 521， 525， 540， 542， 544， 545， 548， 578， 580， 558， 562，564， 560， 561， 552， 550， 516， 554， 530， 528， 532， 526， 541， 560， 566， 519可以被能夠被致動器銷針(在圖18和圖19中沒有顯示) 壓縮的撓性元件覆蓋，使得銷針可用於選擇性打開或關閉任何單獨的 一個流體連接埠 520， 524， 521， 525， 540， 542， 544， 545， 548， 578， 580， 558， 562， 564， 560， 561， 552， 550， 516， 554， 530， 528， 532， 526， 541， 560， 566， 519,從而實現閥的功能。
儘管沒有顯示在圖18和圖19中，孔502， 504， 506， 508， 510 和512中任何一個可以被能夠被致動器銷針(在圖18和圖19中沒有 顯示)壓縮的撓性元件覆蓋，使得銷針可用於選擇性地壓在孔502， 504， 506， 508， 510和512上，從而用作混合器或泵。
正如可以從圖18看到的那樣，形成中心孔512的部件587是模壓 的塑料元件，可以被插入到基體402的溝槽585， 583中。該塑料元件 587可以從兩側形成圖案或構成，以便可以形成部件590， 591， 578， 548， 580， 558等。
下面，將對在裝置500中，特別是基於中心孔512進行的分析進 行解釋，這種分析可以允許以快速的方式，例如在1小時之內，執行 HIV載量的測定。
珠子可以提供在中心室512中。這些珠子可以構造為從以前裂解 的樣品捕獲靶分子(例如HIVRNA)。例如，珠子可以被構造為與捕 獲分子的錨定基團結合，以結合含有靶多核苷酸和捕獲分子的複合物， 其中捕獲分子含有特異性針對靶多核苷酸的區域的結合部分和錨定基 團。
附圖標記541表示與壓縮空氣的連接(參見圖19中的箭頭)，以 便壓縮空氣可以通過元件538， 518， 516，並進入孔502。因此，使用 壓縮空氣泵抽空孔502是可能的。在通過溝槽501提供的血樣應該用水稀釋的情況下，該水可以通過流體入口 593提供。
在一個實施方案中，全血樣品(或其它樣品)可以被運輸到孔502 中，用於例如裂解。血液可以被吸入到裝置500中，通過首先壓縮喲 室，將血液施加入到毛細管中，將毛細管與裂解室502相接觸，然後 釋放裂解室502，從而將血液吸入到裝置500中。
為此，將上述的相應的裂解試劑以乾燥的形式提供在裂解孔502 中。裂解孔還可以含有包含錨定基團和特異性針對靶多核苷酸的區域 的結合部分的捕獲分子。然後，將現在可以包含含有耙多核苷酸和捕 獲分子的複合物的樣品通過部件554和556 (通過壓縮空氣)運輸到部 件558。在這種情況下，部件552被相應的致動器關閉。經過部件558， 580，樣品可以被運輸到中心孔512中。為此，中心孔512的溝槽591 和590可以裝備有過濾器，例如熔融玻璃過濾器(沒有顯示在圖18和 圖19中)，以阻止在流體流動力的影響下，中心孔502中的珠子從該 孔502中被除去。因此，經過溝槽591和590中的過濾器或熔融玻璃 過濾器，被裂解的樣品可以通過部件576運輸到中心孔512中。
在中心孔512中，可以提供第一結合元件例如珠子或功能化表面， 以便靶或含有靶多核苷酸和捕獲分子的複合物可以結合在中心室512 的固相捕獲結構上。可以進行溫育，以便珠子與樣品材料適當地混合。
空氣流將液體(即被裂解的樣品的未被捕獲的成分)從中心孔512 經過部件558， 560， 561壓到廢物514中。因此，許多沒有被中心孔 512中的珠子捕獲的樣品的成分被運輸到廢物室514中。因此，只有靶 保留在中心孔512中，而全血樣品的剩餘部分現在在廢物514中。因 此，中心孔512現在收容有珠子以及含有捕獲探針和耙的複合物。
然後，可以對中心孔512進行清洗，其中以固體形式提供在清洗 孔504中的清洗緩衝液的成分被用於產生清洗緩衝液。這樣的清洗步驟可能是有利的，因為在捕獲步驟後，某些不純物質仍然可能存在於室502中，特別是在使用全血樣品時，或樣品通過插入到溝槽501中的插管提供時。
清洗緩衝液可以在空氣壓力的作用下經部件541， 540， 542， 546，548， 578， 591， 574， 512被泵抽。
正如上面已經指出的那樣，清洗緩衝液被製備在清洗孔504中。在清洗孔504中，用於這種清洗緩衝液的鹽可以以乾燥的形式存在。為了製備清洗緩衝液，水可以從部件566經過部件564， 562， 570， 552(當部件554關閉時)，527 (當部件532, 525， 530關閉時)運輸，以便水被提供到部件521 (開放)。水可以被泵抽到清洗孔504中，直到與部件520相連的透明窗口被水充滿，這可以由通過部件520旁的透明窗口附近的遮光板檢測彎月液面來檢測。 一旦收到相應的檢測信號，水的供應可以被終止。
然後，致動器(未顯示)可以上下往復地壓縮覆蓋在清洗孔504上的撓性覆蓋元件，以進行混合，溶解提供在其中的鹽。
然後通過對各個閥進行相應的控制並通過提供壓縮空氣，清空充滿水的通道，使得水可以被泵抽到廢物室514中。
然後可以將在清洗孔504中製備的清洗緩衝液壓入中心孔512，使得可以在中心孔512中進行清洗程序。在清洗之後，可以將清洗溶液泵入到廢物室514中。
接下來，可以進行反轉錄，將靶RNA轉化成相應的DNA。這樣的步驟在檢測反轉錄病毒例如HIV的情況下是特別需要的，在其它情況下，例如當檢測DNA病毒時，則不是必須的。為了執行這樣的反轉錄，可以將反轉錄所需的成分例如引物，酶和緩衝液從反轉錄孔508泵抽到中心孔512中。
任選的，反轉錄孔508中的成分還可以含有另一套其它的捕獲分 子，可以具有捕獲在反轉錄過程中在中心孔512中產生的DNA分子的 特異性能力。
因為在反轉錄後，靶DNA沒有保留在室512的珠子上，因此將溶 液運輸到廢物容器514中將減小樣品的量。為此，現在將樣品從中心 孔512泵到PCR孔510中，在該樣品中可以溶解PCR鹽，其中PCR 孔510中的PCR緩衝液可以含有聚合酶，能夠與靶多核苷酸形成複合 物的報告分子，引物和/或緩衝液。或者，反轉錄緩衝液含有針對合成 的DNA鏈的捕獲分子，這些鏈的捕獲以與最初捕獲HIV核酸相同的方 式進行。然後，可以將樣品泵回到中心孔512中。
但是，真正的PCR擴增然後在中心孔512中進行。為此，通過執 行溫度循環在中心孔512中進行PCR，也就是說，重複例如40次95°C 5秒和60。C10秒的步驟。在另一個實施方案中，溫度循環包含3種或 以上不同的溫度，例如可以進行包括30個循環的95。C20秒，55°C30 秒和72。C30秒。但是，其它的PCR循環方案也可以在中心孔中進行。
在某些實施方案中，為了調節中心孔512中的溫度，可以在中心 孔512的上方和下方提供兩個加熱板。在另一個實施方案中，兩個加 熱孔中的一個可以是連續的，另一個可以具有凹陷，以允許隨後進行 光學檢測。在某些實施方案中，如上所述，檢測可以在擴增過程中發生。
例如，在第一實施方案中，可以在中心孔512中進行捕獲分子的 競爭性分析。因此，在該實施方案中，第一結合元件例如珠子被用於 捕獲含有耙核酸和捕獲分子的複合物，第二結合元件含有固定在中心 孔512中的報告化合物特異性捕獲分子的陣列，被用於檢測。競爭性分析包括將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合 物，這些複合物的形成抑制了報告化合物被固定在中心孔512中的報 告化合物特異性捕獲分子的陣列捕獲。固定在中心孔512中的報告化 合物特異性捕獲分子能夠捕獲至少剩餘部分量的沒有與靶多核苷酸復
合的報告化合物。通過在孔512中提供不同類型的報告化合物特異性 捕獲分子的陣列用於檢測，辨別不同類型的HIV病毒，例如1型HIV 和2型HIV，是可能的，甚至辨別HIV病毒的不同亞型也是可能的。
在第二個實施方案中，使用與已經用於捕獲步驟並用於檢測的結 合元件相同的結合元件，例如珠子，也是可能的。在該實施方案中， 通過錨定基團連接到珠子上的捕獲寡核苷酸可以與被擴增的靶DNA的 複合物雜交，該擴增的靶DNA本身可以含有螢光標記物。
被捕獲的報告化合物或被捕獲的靶分子可以通過光學檢測進行檢 測，例如使用如上所述的螢光標記物。具體來說，可以操作具有光源 (未顯示)和光檢測器(未顯示)的光學系統，以便測量PCR過程中 信號的時間依賴性，這使得可以推導出HIV的病毒載量。換句話說， 可以獲得並評估螢光信號的時間依賴性。
下面，參考圖20，將對按照示例性實施方案的裝置600進行解釋。
圖20的實施方案類似於圖18， 19的實施方案，因此相應的部件 用同樣的附圖標記來表示。為了簡單明了起見，在圖20中，通道和流 體埠沒有用附圖標記來表示。對於相應的解釋，參考圖18和圖19。
圖20顯示了與孔504相關的窗口部分602和與孔506有關的窗口 部分694，它們能夠用於彎月液面檢測，因此能夠用於溢流檢測，並以 此作為基礎確定作用在孔504， 506上和作用在各種不同流體連接埠 上的控制致動器的控制信號。標出了重力矢量g的方向，以顯示在某些實施方案中裝置600可
以被操作的位置。在這些實施方案中，裝置600的操作是基於重力和 通過壓縮空氣接頭606和供水接頭608提供的液體運輸力的組合。此 外，提供了通氣接頭610和通氣接頭612，以對相應的流體結構進行通 氣。
圖20示意性顯示了部分613，它可以作為圖20的整體解決方案 的可選方案，提供為單獨的模塊，可以與其它模塊組合起來，形成用 戶定義的裝置，在該裝置中各種不同模塊被裝配在一起。
下面，殘開圖21，將對按照另一個示例性實施方案的裝置700進 行解釋。
裝置700含有剛性基體704，其中形成了第一貫通洞709和第二 貫通洞707。在基體704的第一主表面上形成了第一孔720和第二孔 708。在基體704的相反的主表面上，形成了通道706。通道706與孔 720和708分別通過洞709和707流體連通。
在剛性基體704的上表面上，形成了第一撓性覆蓋元件708，並 附著在剛性基體704上。在基體704的下表面上形成了第二覆蓋元件， 並層壓在剛性基體704上。
正如可以從圖21進一步看出的那樣，提供了第一致動器元件701 和第二致動器元件702，第一致動器元件701適於壓在覆蓋元件720的 第一部分上，以選擇性關閉貫穿洞通道709或整個孔720。通過相應的 方式，第二致動器元件702可以選擇性打開或關閉孔708和/或貫穿洞 707。因此，可以控制流體流過通道706進入一個或兩個孔720或708。
圖22顯示了本發明的示例性競爭性分析的示意圖。標記的核酸報 告分子(顯示為灰色曲線)通過核酸捕獲分子(顯示為黑色曲線)連接到結合元件(這裡舉例為珠子)上。被檢測的靶核酸以雙鏈形式(兩 條鏈被顯示為淺灰色/黑色曲線)存在於樣品中。對樣品進行(循環擴 增反應的)變性步驟，允許靶核酸的鏈解離，報告分子從結合元件上 釋放。在隨後的退火步驟中，允許一部分量的報告分子與至少一部分 量的靶核酸形成複合物，其中由於捕獲分子和核酸靶競爭與報告分子 的結合，耙核酸/報告分子複合物的形成抑制了報告分子被捕獲在結合 元件上的能力。允許沒有與靶核酸複合的剩餘部分量的報告化合物重 新捕獲在結合元件上。在這個階段，表明捕獲在結合元件上的報告化 合物的存在和/或量的值，以及在其基礎上的表明靶核酸的存在和/或量 的值，通過檢測報告分子中包含的標記物產生的信號而被測定。在退 火步驟之後或同時，進行擴增反應的延伸步驟。然後，可以對樣品進 行另一個擴增循環。
圖23顯示了使用本發明的示例性競爭性分析測定樣品中人類脊
髓灰質炎病毒1 DNA (稱為"EV"，是指"腸道病毒DNA")的量的 結果與使用同樣的耙進行的標準Taq-man分析的比較。對各含有104 個DNA拷貝的兩個樣品進行了平行的分析第一樣品(圖表中的標記
"探針")被進行PCR擴增，使用Rotor-Gene 6000實時旋轉PCR分 析儀(Corbett Life Sciences, Sydney, Australia)按照製造商的說明書進 行。使用的PCR引物導致擴增了 150 bp的DNA片段。片段的檢測使 用了所謂的Taqmar^探針來完成，它分別在其5'末端含有6-羰基-螢光 素(FAM)標記，在其3，末端含有6-羰基四甲基羅丹明-琥珀醯亞胺酯
(TAMRA)標記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)。總共 進行了 50個PCR循環。第二樣品("競爭性分析")還包含了與Taqman 探針具有相同的核苷酸序列，但是在其3，末端含有CY3羰花青標記
(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA， USA)代替了 FAM/TAMRA標 記的報告分子，並使用本發明的一個實施方案的裝置進行擴增。在擴 增過程中檢測到的獲得的螢光信號顯示在圖中。
圖24圖示了原理並顯示了本發明的用於在樣品中測量HIV
1gag/env PCR產物的量的示例性的基於陣列的競爭性分析的結果。圖 24A圖示了分析的原理(也參見圖22)。開始時，沒有擴增的PCR產 物即靶核酸存在。螢光標記的核酸報告分子被結合到捕獲在陣列的基 體上的報告化合物特異性探針上。如果沒有PCR產物產生，在每一輪 擴增反應後，與報告化合物特異性探針雜交的報告分子的量保持恆定， 因此測定到的螢光信號也保持恆定。如果PCR產物被合成，在每一個 PCR循環後，與報告化合物特異性探針雜交的報告分子的量減少了， 因此測定到的螢光信號也降低了。圖24B顯示了用於測定151 bp的 HIV1 gag/env PCR產物的量的基於陣列的競爭性分析的結果。將不同 量的片段(相對於104-106個拷貝)以及在其5'末端含有CY3羰花青標 記 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA ) 的報告分子 ("anti—cdso29—5'CY3") —起進行了 36個循環的PCR擴增。兩種不 同類型的探針分子， 一種是非特異性的("ara—54986—NH2")， 一種 是報告化合物特異性的("Cdso29_NH2")，以圖25A中顯示的布置 被捕獲在陣列基體上，並布置在使用的分析裝置的反應室中。使用 Iconoclust軟體(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena， Germany)觀lj 定了CT值("閾值"，即對指數擴增階段的開始的度量，其中螢光以 及因此DNA的量以線性方式增加)，並與針對用於產生校正曲線的相 應DNA濃度進行作圖(圖24C)。在所有使用了受體特異性探針的樣 品中，隨著PCR循環數量的增加，觀察到了螢光強度的逐漸的降低。 相反，在使用非特異探針的樣品中，沒有觀察到螢光(圖24B)。
圖25描繪了 PCR擴增的不同階段時在圖24中顯示的分析中使用 的陣列。陣列基體上不同點的布置圖示在圖25A中。黑色圓圈表示使 用了特異性探針(參見圖24)來捕獲報告分子的點(四個平行樣品)， 而白色圓圈表示使用了非特異性探針來捕獲報告分子的點(四個平行 樣品)。灰色圓圈代表陽性對照，其中螢光標記被點樣在陣列基體上。 圖25B分別顯示了在擴增循環1， 12， 18和21後獲取的陣列(對應於 圖24B中的10S個DNA拷貝-樣品)的照片。在通過特異性探針分子捕 獲在陣列上的樣品中，在PCR擴增過程中可以觀察到螢光信號強度的降低。
圖26A-D表示了本發明用於檢測多核苷酸的競爭性方法的示例性 實施方案的圖解說明。如圖26A所示，開始時沒有擴增的PCR產物即 靶核酸存在。標記的核酸報告分子(顯示為黑色曲線，並被稱為靶/探 針特異性報告分子)被結合到捕獲在陣列的基體上的報告化合物特異 性探針上。信號對應於標記的內部對照分子(顯示為淺灰色曲線)， 它被結合到捕獲在陣列的基體上的內部對照特異性探針上。如圖26B 所示，如果PCR進入指數期早期，報告分子不僅與捕獲在基體上的報 告分子特異性探針結合，而且與PCR產物的報告分子特異性區域結合。 因此，如果PCR產物被合成，與捕獲在基體上的報告分子特異性探針 雜交的報告分子的量將減少，因此測定到的信號將降低。當PCR在指 數期時信號明顯降低(參見圖26C)。當PCR達到平臺期時，捕獲在 基體上的報告分子特異性探針的信號保持低水平(參見圖26D)。
圖27顯示了本發明的用於測定樣品中HIV亞型B和HIV亞型02 的量的競爭性分析的示例性實施方案的結果。在圖27A的實驗中，樣 品中只存在HIV亞型B。可以看到，對應於特異性針對HIV亞型02
(HIVsub02)的標記的核酸報告分子的信號保持恆定，而對應於特異 性針對HIV亞型B (HIV sub B)的標記的核酸報告分子的信號在經過 大約13個PCR循環後顯著降低了 (參見圖26)。在圖27B的實驗中， 樣品中只存在HIV亞型02。可以看到，對應於特異性針對HIV亞型B
(HIVsubB)的標記的核酸報告分子的信號保持恆定，而對應於特異 性針對HIV亞型02 (HIV sub 02)的標記的核酸報告分子的信號在經 過大約25個PCR循環後顯著降低了 (參見圖26)。
圖28顯示了本發明的用於測定樣品中HIV亞型B的不同量的競 爭性分析的示例性實施方案的結果。如果樣品中存在1(^個拷貝的HIV， 對應於特異性針對HIV亞型B (HIVsubB)的標記的核酸報告分子的 信號在經過大約13個PCR循環後顯著降低(參見圖28A)。如果樣品中只存在104個HIV拷貝，對應於特異性針對HIV亞型B (HIV sub B) 的標記的核酸報告分子的信號在經過大約19個PCR循環後顯著降低 (參見圖28B)。從圖28可以明顯看出，在信號降低前所需的PCR循 環的數量是可檢測的，這允許對被分析的樣品中存在的靶核酸的量作 出結論。
下面的實施例對本發明進行了進一步的描述，它們的目的僅僅是 圖示本發明的具體實施方案，而不以任何方式對本發明的範圍構成限 制。
實施例
實施例1:用於測定人類脊髓灰質炎病毒1 DNA的競爭性分析 所進行的競爭性分析的原理示意顯示在圖22中。將人類脊髓灰質 炎病毒1分離株TCDC01-861的DNA (GenBank登記號AF538843)克 隆在適當的表達載體(pCR 2.1-TOPO , Clontech, Inc. Palo Alto, CA, USA)中，用作DNA模板(在本文中也稱為"EV"(腸道病毒)DNA)。
對兩個各含有1(^個DNA拷貝的樣品進行了平行的分析第一樣 品使用Rotor-Gene 6000實時旋轉PCR分析儀(Corbett Life Sciences, Sydney, Australia)按照製造商的說明書進行了 PCR擴增。
第二樣品還包含了與Taqmai^探針具有相同的核苷酸序列，但是 在其3'末端含有CY3羰花青標記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)代替了 FAM/TAMRA標記的報告分子，並使用分析裝置在反應 室中直接進行擴增，其中陣列被放置在可加熱的基部表面上。
使用了下面的PCR引物 正向PCR引物
pr_for_EV_02: 5'-CAAACCAGTGATTGGCCTGTCGTAACG-3' (對應於AF538843的492-518位核苷酸)反向PCR引物
pr—rev—EV一Ol: 5'-TTCACCGGATGGCCAATCCAATTCG-3' (對應於AF538843的617-641位核苷酸)
因此，PCR導致了 150bp的DNA片段的擴增。按照製造商的說 明書，PCR樣品含有200 nM (終濃度)的每種PCR引物，以及 EnzymMix 禾口 Ultrasense RT-PCR試齊U盒 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA， USA)的反應緩衝液。
此外，為了檢測擴增的PCR片段，使用Rotor-Gene 6000實時旋 轉PCR分析儀，相應的PCR樣品含有100 nM (終濃度)的雙重標記 的所謂Taqmai^探針，它分別在其5'末端含有6-羰基-螢光素(FAM) 標記(即螢光團)，在其3，末端含有6-羰基四甲基羅丹明-琥珀醯亞胺 酯(TAMRA)標記(即淬滅劑)(兩種標記都是從Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA購買的)。探針具有下面的序列 HP_EV2—001: FAM-5'-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3'-TAMRA
(對應於AF538843的536-561位核苷酸)
為了進行競爭性分析，PCR樣品還含有20 nM (終濃度)的報告 分子，它與Taqma滻探針具有相同的核苷酸序列，但是具有不同的標 記，具體為在其3'末端含有CY3羰花青標記(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA):
EV2_02CY3: 5'-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3'-CY3 (對應於AF538843的536-561位核苷酸)
按照下面的溫度模式進行了實時PCR: 94。C2分鐘，然後進行50 個循環的94°C 5秒，62°C 30秒和72°C 30秒。
在PCR過程中兩個反應的螢光信號都顯示在圖23中。實施例2:用於測定HIV1 gag/env DNA的基於陣列的競爭性分析 進行的競爭性分析的原理示意顯示在圖24A中。將合成的HIV1 gag/env融合構建物的DNA (EMBL登記號A06258)克隆到表達載體 pCR 2.1-TOPO (Clontech, Inc. Palo Alto, CA, USA)的EcoRI內切核 酸酶限制性位點中，用作DNA模板。
此外，使用了下面的PCR引物 正向PCR引物
cdia: 5'-TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3'
(對應於A06258的214-232位核苷酸) 反向PCR引物
cdis: 5'國ATCAAGCAGCCATGCAAATGTT-3' (對應於A06258的384-405位核苷酸)
因此，PCR導致了 151 bp的DNA片段的擴增，它具有下面的序 列5'-ATC AAG CAG CCA TGC AAA TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA GAT TGC ATC CAG TCC ATG GAG GGC CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA TAG CAG GAA CTA CTA GTA CCC TTC A-3'。
PCR在分析裝置的反應室中直接進行，其中陣列被放置在可加熱 的基部表面上。PCR樣品含有200 nM (終濃度)每種PCR引物，以及 EnzymMix 禾口 Ultrasense RT-PCR試齊!j盒 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA， USA)的反應緩衝液。為了產生校正曲線，使用了對應 於O， 104， 105，和16個DNA拷貝的不同量的DNA模板(在1 n中) (每種濃度進行四份實驗)。
為了進行競爭性分析，PCR樣品還含有10 nM (終濃度)的報告 分子，它在其5'末端具有CY3羰花青標記(Invitrogen Corporation,Carlsbad, CA, USA): anti—cdso29一5'CY3:
CY3-5'-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGT-3' (與下面描述的cdso29—NH2探針分子互補)
按照下面的溫度模式進行了 PCR: 95。C30秒，然後進行36個循 環的95°C 5秒，50°C 30秒和72°C 30秒。
在每個循環中，在退火步驟結束時，使用位於分析裝置的頂表面 對面的光學檢測系統和Iconoclust軟體包(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany)，測定了報告分子與兩種類型的探針的相互作 用。在數據獲取過程中曝光時間是2.5秒。
兩種不同類型的探針分子以圖25A中顯示的布置方式被捕獲在陣 列基體上。單獨的螢光標記物被用作陽性對照。使用了下面的探針
非特異性探針 ara—54986—NH2: 5'-ACCAGCTTTGAACCCAACAC匿3'
受體特異性探針
cdso29—NH2: 5'-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGA-3'
使用Iconoclust軟體(Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Germany)確定了CT值("閾值")，作為指數擴增期開始的度量， 在指數擴增期中螢光以及因此DNA的量以線性方式增加，並與針對使 用的相應的DNA濃度進行作圖，產生了校正曲線(圖24C)。測定 到的平均CT值如下在104個DNA拷貝的樣品中是22.0;在105個 DNA拷貝的樣品中是18.5;在1(^個DNA拷貝的樣品中是15.0。
在所有使用了受體特異性探針的樣品中，隨著PCR循環數量的增 加，觀察到了螢光強度的逐漸的降低。相反，在使用非特異探針的樣 品中，沒有觀察到螢光(圖24B)。
1陣列基體上不同點的布置示意圖示在圖25A中。黑色圓圈表示使
用了特異性探針(參見圖24)來捕獲報告分子的點(四個平行樣品)，
而白色圓圈表示使用了非特異性探針來捕獲報告分子的點(四個平行 樣品)。灰色圓圈代表陽性對照，其中螢光標記被點樣在陣列基體上。
圖25B分別顯示了在擴增循環1， 12， 18和21後獲取的陣列(對 應於圖24B中的1S個DNA拷貝的樣品)的照片。在通過特異性探針 分子捕獲在陣列上的樣品中，在PCR擴增過程中可以觀察到螢光信號 強度的逐漸降低，這反過來對應於被擴增的PCR產物的量的相伴的增 加，可以通過與相應的校正曲線進行比較來定量。
應該注意的是，術語"包含"不排除其它的要素或特徵，並且單 數的表達方式不排除複數形式。與不同的實施方案相關聯描述的要素 也可以組合起來。
還應該注意，權利要求書中的附圖標記不講被解釋為對權利要求 的範圍的限制。
權利要求
1.裝置，包括(a)剛性的基體；(b)至少部分覆蓋著基體的撓性覆蓋元件；(c)在基體中形成的第一結構，適於容納液體並適於釋放一種或多種細胞，孢子或病毒的內含物，所述內含物中含有靶分子；(d)在基體中形成的第二結構，適於容納液體並含有至少一個結合元件，該結合元件適於捕獲靶分子並用於測定表明靶分子的存在和/或量的值；(e)將至少第一結構和第二結構相互連通的微流體網路；(f)致動器單元，適於通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關閉一部分微流體網路，來實現第一結構和第二結構之間的流體流動。
2. 裝置，包括(a) 適於容納液體的結構，其中該結構包括至少一個結合元件，並 與微流體網路流體連通；(b) 控制單元，適於控制流體流過微流體網路，由此使得靶分子被 捕獲在至少一個結合元件上，適於控制該結構中靶分子的擴增，並適 於控制捕獲在至少一個結合元件上的化合物的檢測。
3. 權利要求2的裝置，其中化合物是靶分子。
4. 權利要求2的裝置，其中化合物是表明靶分子的存在和/或量的 報告化合物。
5. 權利要求1到4任一項的裝置，其中至少一個結合元件適於捕 獲耙分子。
6. 權利要求1到5任一項的裝置，其中至少一個結合元件適於捕獲表明耙分子的存在和/或量的報告化合物。
7. 權利要求1到6任一項的裝置，其中至少一個結合元件包括適 於捕獲耙分子的第一結合元件，以及適於捕獲表明靶分子的存在和/或 量的報告化合物的第二結合元件。
8. 權利要求1到7任一項的裝置，其中結構是孔。
9. 權利要求1到8任一項的裝置，其中微流體網路包括通道或大量相互連通的通道。
10. 權利要求1到9任一項的裝置，其中微流體網路包括至少一 個另外的結構。
11. 權利要求10的裝置，其中至少一個另外的結構適於釋放一種 或多種細胞，孢子或病毒的內含物，所述內含物中含有靶分子。
12. 權利要求10或11的裝置，其中至少一個另外的結構包括能 夠與靶分子形成複合物的捕獲探針。
13. 權利要求10到12任一項的裝置，其中至少一個另外的結構 包括至少一種促進靶分子的擴增的物質。
14. 權利要求10到13任一項的裝置，其中至少一個另外的結構 是孔。
15. 權利要求1到14任一項的裝置，包括基體，其中在基體上和 /或中提供有結構。
16. 權利要求15的裝置，其中基體是剛性基體。
17. 權利要求15或16的裝置，包括至少部分覆蓋基體的覆蓋元件。
18. 權利要求15到17任一項的裝置，其中基體具有第一表面以 及與第一表面相對的第二表面；其中所述結構被提供在基體的第一表面上和/或中； 包括另外的結構，提供在基體的第二表面上和/或中； 包括連通結構，布置在第一和第二表面之間，並被構造為提供該 連通結構與另外的結構的流體連通。
19. 權利要求18的裝置，其中連通結構是基體中的貫穿洞，或基 體的第一表面中和第二表面中的溝槽。
20. 權利要求15到19任一項的裝置，包括另外的基體，其中另 外的結構被提供在另外的基體上和/或中；其中基體和另外的基體適於 彼此連通，由此使得在基體與另外的基體相連的操作狀態下，結構和 另外的結構是流體連通的。
21. 權利要求1到20任一項的裝置，其中至少一個結合元件被改 造，以便在靶分子的分析過程中，多個固相結合過程發生在至少一個 結合元件上。
22. 權利要求1到21任一項的裝置，其中至少一個結合元件被改 造，以便在靶分子的分析過程中，恰好兩個固相結合過程發生在至少 一個結合元件上。
23. 權利要求1到19任一項的裝置，其中至少一個結合元件被改 造，以便在靶分子的分析過程中，恰好一個固相結合過程發生在至少 一個結合元件上。
24. 權利要求1到23任一項的裝置，其中位於至少一個結合元件 附近的裝置的至少一部分透過波長範圍在大約lnm到大約10pm之間 的電磁輻射，以便允許對表明靶分子的存在和/或量並捕獲在至少一個 結合元件上的化合物進行基於電磁輻射的檢測。
25. 權利要求2到24或97任一項的裝置，其中控制單元是處理 器，特別是微處理器和中央處理器中的一種。
26. 權利要求1到25任一項的裝置，包括至少一個過濾器，特別 是至少一個熔融玻璃過濾器，其布置在結構上，並適於阻止布置在結 構中的至少一個結合元件，特別是珠子，從結構中被除去。
27. 權利要求1到26任一項的裝置，其中至少一個結合元件包括 表面功能化。
28. 權利要求1到27任一項的裝置，其中至少一個結合元件包括 以下捕獲分子中的至少一種布置在結構的表面上的捕獲分子，布置 在粒子上的捕獲分子，布置在結構的多孔表面上的捕獲分子，以及布 置在結構的表面上不同位置的一種或多種不同的捕獲分子。
29. 權利要求1到28任一項的裝置，其中結構的體積在1^L到lmL 的範圍內，特別是在2(HiL到300^iL的範圍內。
30. 權利要求15到29任一項的裝置，其中基體具有被構造為用 於接受插管，為裝置供應液體的溝槽。
31. 權利要求15到30任一項的裝置，其中基體在結構附近具有 窗口部分，透過波長範圍在大約lnm到大約10pm之間，特別是波長 範圍在400 nm到800 nm之間的電磁輻射，從而允許對流過結構或微流體網路的液體的彎月液面進行基於電磁輻射的檢測。
32. 權利要求10到31任一項的裝置，其中結構和另外的結構中 的至少一個包括兩個流體開口 。
33. 權利要求1到32任一項的裝置，其中至少一個結合元件被構 造為與捕獲分子的錨定基團結合。
34. 權利要求1到33任一項的裝置，其中至少一個結合元件被成 形來捕獲多核苷酸。
35. 權利要求17到34任一項的裝置，其中覆蓋元件是撓性的覆 蓋元件。
36. 權利要求17到35任一項的裝置，其中覆蓋元件被構造為至 少部分可變形。
37. 權利要求17到36任一項的裝置，其中覆蓋元件被構造為至 少部分可變形，以便通過打開或關閉結構或微流體網路選擇性地使液 體能夠或不能流動。
38. 權利要求17到37任一項的裝置，其中覆蓋元件被構造為至 少部分可變形，以便沿著結構或沿著微流體網路運輸液體。
39. 權利要求38的裝置，還包括(a) 覆蓋著結構的部分覆蓋元件；以及(b) 適於被致動以使覆蓋元件變形的致動器單元。
40. 權利要求1到39任一項的裝置，其中結構含有一種或多種具 有生物學，生物化學和/或化學活性的物質。
41. 權利要求40的裝置，其中一種或多種物質包括捕獲分子，可 檢測標記和試劑中的至少一種。
42. 權利要求40或41的裝置，其中一種或多種物質以乾燥的形 式，特別是冷凍乾燥的形式存在。
43. 權利要求9到42任一項的裝置，其中通道的寬度在50pm到 lmm的範圍內，特別是在100nm到300 pm的範圍內。
44. 權利要求9到43任一項的裝置，其中通道的高度在20pm到 300 pm的範圍內，特別是在50 pm到200 (im的範圍內。
45. 權利要求1到44任一項的裝置，其中結構包含適合用作液體 的運輸介質的材料。
46. 權利要求45的裝置，其中材料包括固體材料，凝膠材料，液 體材料及其組合中的至少一種。
47. 權利要求17到46任一項的裝置，其中覆蓋元件包括撓性的 膜或撓性的密封件。
48. 權利要求17到47任一項的裝置，包括適合於被致動以使得覆蓋元件變形的致動器單元，從而控制結構和/或微流體網路中液體的 流體流動特性。
49. 權利要求48的裝置，其中致動器單元適於控制液體沿著通道 的直線部分的流體流動特性。
50. 權利要求48或49的裝置，其中致動器單元可以被改造，以用作閥，流體混合器和流體泵中的至少一種。
51. 權利要求48到50任一項的裝置，其中致動器單元包括多個適合於被協同致動使得覆蓋元件變形的致動器元件，從而按照由控制 單元限定的流體流動方案控制液體的流體流動特性。
52. 權利要求48到51任一項的裝置，其中控制單元適於控制致 動器單元使覆蓋元件變形，由此使得靶分子被捕獲在至少一個結合元 件上，使得靶分子在結構中被擴增，並使得指示靶分子的存在和/或量 並捕獲在至少一個結合元件上的化合物被檢測。
53. 權利要求48到52任一項的裝置，其中致動器單元包括被構 造為往復式的銷針。
54. 權利要求48到53任一項的裝置，其中致動器單元被提供為 可在垂直於基體的主表面的方向上移動。
55. 權利要求48到54任一項的裝置， 可移動的，以選擇性關閉至少一部分結構， 構。
56. 權利要求48到55任一項的裝置， 可移動的，以選擇性打開至少一部分結構， 構。其中致動器單元被提供為 使得液體不能運輸通過結其中致動器單元被提供成 使得液體能夠運輸通過結
57. 權利要求48到56任一項的裝置，其中致動器單元適於垂直 於基體的主表面往復移動，選擇性地使液體能夠或不能流體流動通過 結構。
58. 權利要求48到57任一項的裝置，其中致動器單元適於垂直於基體的主表面往復移動，以將液體泵抽通過結構。
59. 權利要求48到58任一項的裝置，其中致動器單元適於控制 結構的體積或高度。
60. 權利要求48到59任一項的裝置，其中致動器單元適於選擇 性關閉結構。
61. 權利要求48到60任一項的裝置，包括適於機械驅動致動器 單元的驅動單元，驅動單元能被控制單元控制。
62. 權利要求61的裝置，其中驅動單元包括氣動驅動機構，液力 驅動機構和電磁驅動機構中的至少一種。
63. 權利要求1到62任一項的裝置，其中至少一個結合元件含有 三維的介質。
64. 權利要求63的裝置，其中三維介質選自粒子和多孔基質中的 至少一種。
65. 權利要求63或64的裝置，其中三維介質被布置和構造為可 以通過移動致動器單元可逆地壓縮。
66. 權利要求1到65任一項的裝置，適於作為生物傳感器分析裝 置，微流體盒和晶片實驗室中的至少一種。
67. 權利要求1到66任一項的裝置，包括適於感應液體的溫度的 溫度傳感器，並優選布置在致動器單元上。
68. 權利要求1到67任一項的裝置，包括適於操縱液體的溫度的溫度操縱單元，並優選布置在致動器單元上。
69. 權利要求68的裝置，其中溫度操縱單元適於按照進行聚合酶鏈反應的溫度順序操縱位於結構中的液體的溫度。
70. 權利要求68或69的裝置，其中溫度操縱單元適於將位於結 構中的液體的溫度升高到高達95°C。
71. 權利要求68到70任一項的裝置，其中溫度操縱單元包括加 熱元件和冷卻元件中的至少一種。
72. 權利要求1到71任一項的裝置，包括適於操縱液體的溫度的 溫度操縱單元，其中溫度操縱單元包括第一加熱元件和第二加熱元件， 其中結構被布置在第一加熱元件和第二加熱元件之間。
73. 權利要求72的裝置，其中第一加熱元件是連續的板，第二加 熱元件是環形板。
74. 權利要求1到73任一項的裝置，包括適於調控結構中的液體 的溫度的溫度調控單元。
75. 權利要求15到74任一項的裝置，其中基體含有透光的材料。
76. 權利要求1到75任一項的裝置，包括適於在結構中檢測捕獲 在至少一個結合元件上的化合物的檢測單元。
77. 權利要求76的裝置，其中檢測單元含有光學檢測單元，特別 是螢光檢測單元。
78. 權利要求1到77任一項的裝置，其中微流體網路含有多個相互連通的通道。
79. 權利要求17到78任一項的裝置，其中基體和覆蓋元件是彼此相連的分開的部件。
80. 權利要求17到79任一項的裝置，其中基體和覆蓋元件由不 同的材料製成。
81. 權利要求1到80任一項的裝置，包括適於將液體運輸通過結 構和/或微流體網路的運輸單元。
82. 權利要求81的裝置，其中運輸單元包括泵，特別是壓縮空氣 泵，液壓泵，蠕動泵和真空泵中的一種。
83. 權利要求81的裝置，其中運輸單元適於通過驅動結構和/或微 流體網路中的氣泡來運輸液體。
84. 權利要求17到83任一項的裝置，其中基體和覆蓋元件直接 接觸。
85. 權利要求17到84任一項的裝置，其中基體不與覆蓋元件直 接接觸。
86. 權利要求15到85任一項的裝置，其中位於結構附近的基體 的一部分透過波長範圍在400 nm到800 nm之間的電磁輻射，從而允 許在結構中進行光學檢測。
87. 權利要求1到86任一項的裝置，其中至少一個結合元件被改 造，使得在靶分子的分析過程中，至少兩個固相結合過程恰好發生在 至少一個結合元件中的一個上。
88. 權利要求1到86任一項的裝置，其中至少一個結合元件被改 造，使得在靶分子的分析過程中，至少兩個固相結合過程發生在不同 的至少一個結合元件上。
89. 權利要求2到88任一項的裝置，包括裂解結構，其含有裂解 試劑和能夠與靶分子形成複合物的捕獲探針；其中控制單元適於控制液體流向裂解結構，以便液體的一種或多 種細胞，孢子或病毒的內含物被釋放，內含物中含有靶分子，並與捕 獲探針形成複合物。
90. 權利要求89的裝置，其中控制單元適於控制複合物從裂解結 構流體流動到結構中，以便複合物被捕獲在結構中的至少一個結合元 件上。
91. 權利要求90的裝置，包括與結構流體連通的廢物室； 其中控制單元適於控制流體流過微流體網路，由此使得結構中沒有被捕獲在至少一個結合元件上的成分被運輸到廢物室中。
92. 權利要求91的裝置，包含含有清洗試劑的清洗結構； 其中控制單元適於控制清洗試劑從清洗結構流體流動到結構中，以便在結構中進行清洗過程。
93. 權利要求92的裝置，包括含有反轉錄試劑的反轉錄結構； 其中控制單元適於控制反轉錄試劑從反轉錄結構流體流動到結構中，以便在結構中進行反轉錄過程。
94. 權利要求93的裝置，包括含有擴增試劑的擴增結構； 其中控制單元適於控制液體從結構流體流動到擴增結構中，並適於控制液體和擴增試劑從擴增結構流體流回到結構中。
95. 權利要求94的裝置，其中控制單元適於通過使用擴增試劑和 通過向結構施加溫度順序來控制結構中的擴增。
96. 權利要求95的裝置，其中控制單元適於控制捕獲在至少一個 結合元件上的被擴增的化合物的檢測。
97. 權利要求1的裝置，包括控制單元，適於控制流體流過微流 體網路，由此使得靶分子被捕獲在至少一個結合元件上，適於控制第 二結構中靶分子的擴增，並適於控制捕獲在至少一個結合元件上的化 合物的檢測。
98. 權利要求97的裝置，其中控制單元適於控制致動器單元，以 控制流體流過微流體網路。
99. 裝置，包括適於容納液體的結構，其中該結構包括適於捕獲 第一化合物的第一結合元件，以及適於捕獲表明第一化合物的存在和/ 或量的第二化合物的第二結合元件。
100. 方法，包括(a) 在包括至少一個結合元件並與微流體網路流體連通的結構中 容納液體；(b) 控制流體流過微流體網路，由此使得靶分子被捕獲在至少一個 結合元件上，(c) 在結構中擴增靶分子，以及(d) 檢測表明靶分子的存在和/或量，並捕獲在至少一個結合元件 上的化合物。
101. 方法，包括(a)形成每個含有靶核酸和捕獲分子的複合物，其中每個捕獲分子含有特異性針對靶核酸的區域的結合部分和錨定基團；(b)將複合物與結合元件相接觸，結合元件被構造為與捕獲分子的錨定基團結合，從而將複合物結合在結合元件上； (C)對一種或多種靶核酸進行擴增；(d) 將擴增的靶核酸捕獲在相應的結合元件上；以及(e) 測定一或多個表明捕獲的靶核酸的存在和/或量的值。
102. 權利要求101的方法，其中一種或多種靶核酸是單鏈核酸。
103. 權利要求102的方法，還包括在進行步驟(c)之前對靶核酸進 行反轉錄。
104. 權利要求101到103任一項的方法，還包括從結合元件釋放 捕獲的被擴增的靶核酸以及重複步驟(c)和(d)。
105. 權利要求104的方法，其中從結合元件釋放捕獲的被擴增的 靶核酸以及重複步驟(c)和(d)的循環被進行至少10次。
106. 權利要求105的方法，其中從結合元件釋放捕獲的被擴增的 靶核酸以及重複步驟(c)和(d)的循環被進行至少20次。
107. 權利要求104到106的方法，其中步驟(e)在至少一個從結合 元件釋放捕獲的被擴增的靶核酸以及重複步驟(c)和(d)的循環後進行。
108. 權利要求107的方法，其中步驟(e)在每個從結合元件釋放捕 獲的被擴增的靶核酸以及重複步驟(c)和(d)的循環後進行。
109. 權利要求101到108任一項的方法，其中結合元件包括一種 或多種能夠捕獲靶核酸的捕獲分子，靶核酸通過一種或多種捕獲分子 被捕獲在相應的結合元件上。
110. 權利要求101到109任一項的方法，其中步驟(a)的進行在空 間上與步驟(b)分開。
111. 權利要求101到IIO任一項的方法，其中結合元件包含粒子。
112. 權利要求101到111任一項的方法，還包括在進行步驟(c)和 /或(d)之前，通過加入一種或多種可檢測的標記來標記靶核酸。
113. 權利要求112的方法，其中一種或多種可檢測的標記是螢光標記。
114. 權利要求101到113任一項的方法，其中步驟(e)包括時間依 賴性地監測獲得的一或多個指示值。
115. 權利要求101到114任一項的方法，還包括在進行步驟(a)之 前提供一種或多種靶核酸。
116. 權利要求115的方法，其中提供一種或多種靶核酸包括從生 物學材料中釋放靶核酸。
117. 權利要求116的方法，其中生物學材料選自一種或多種原核 細胞， 一種或多種真核細胞， 一種或多種病毒粒子以及它們的混合物。
118. 權利要求116或117的方法，其中從生物學材料釋放靶核酸 包括將生物學材料與裂解試劑相接觸。
119. 權利要求115到118任一項的方法，其中提供一種或多種靶 核酸包括提供含有一種或多種靶核酸的樣品，其中樣品選自全血，血 漿，血清，尿液，痰液，唾液和腦脊髓液。
120. 權利要求101到119任一項的方法，還包括將一種或多種靶核酸與相伴的物質分離開。
121. 權利要求116到120任一項的方法，其中提供靶核酸的進行 在空間上與步驟(b)， (c)， (d)和(e)分開。
122. 權利要求101到111任一項的方法，其中方法在權利要求1 到99任一項的裝置中進行。
123. 權利要求122的方法，其中裝置包括適於容納液體的第一結 構，其中步驟(a)在第一結構中進行。
124. 權利要求122或123的方法，其中裝置包括適於容納液體並 被構造用於檢測一種或多種靶核酸的第二結構，第二結構含有覆蓋第 二結構的覆蓋元件，以及適於被致動以使覆蓋元件變形的致動器單元， 其中步驟(e)在第二結構中進行。
125. 權利要求124的方法，其中步驟(c)和/或(d)在第二結構中進行。
126. 權利要求124或125的方法，其中步驟(e)使用被致動以使覆 蓋元件變形的致動器來進行。
127. 權利要求126的方法，其中覆蓋元件被變形，由此使得第二 結構的體積減小。
128. 權利要求127的方法，其中第二孔的體積在進行步驟(e)後重 新增加。
129. 方法，包括(a) 提供一定量的報告化合物；被構造為與捕獲分子的錨定基團結合的第一結合元件； 能夠捕獲報告化合物的第二結合元件；一定量的能夠與報告化合物形成複合物的靶核酸，與報告化合物 形成複合物抑制報告化合物被第二結合元件捕獲；以及一定量的捕獲分子，其中每個捕獲分子含有特異性針對靶核酸的 區域的結合部分和錨定基團；(b) 形成每個含有靶核酸和捕獲分子的複合物；(c) 將複合物與第一結合元件相接觸，將複合物結合到第一結合元件上-，(d) 從第一結合元件上釋放出至少一部分量的靶核酸；(e) 將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物；(f) 將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲 在第二結合元件上；以及(g) 測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量 的值。
130. 權利要求129的方法，還包括根據表明捕獲在第二結合元件 上的報告化合物的存在和/或量的值，來測定表明靶核酸的存在和/或量 的值。
131. 權利要求129或130的方法，還包括在測定表明捕獲在第 二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的步驟之後，從第二結 合元件上釋放剩餘部分量的報告化合物；形成一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸的複合物； 將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第 二結合元件上；以及測定表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值。
132. 權利要求121的方法，還包括進行釋放，形成複合物，捕獲和測定的步驟額外的N次，其中N是大於或等於1的整數。
133. 權利要求132的方法，其中N^5。
134. 權利要求132的方法，其中N^10。
135. 權利要求132的方法，其中N^20。
136. 權利要求129到135任一項的方法，其中將一部分量的報告 化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步驟和將沒有與靶核酸 形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結合元件上的步 驟，相伴進行。
137. 權利要求129到136任一項的方法，還包括對靶核酸進行擴增。
138. 權利要求137的方法，其中靶核酸的擴增在將一部分量的報 告化合物與至少一部分量的耙核酸形成複合物的步驟之前開始。
139. 權利要求136到138任一項的方法，其中表明捕獲在第二結 合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，在將一部分量的報告化合 物與至少一部分量的耙核酸形成複合物，以及將沒有與靶核酸形成復 合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結合元件上達到化學平衡 之前進行測定。
140. 權利要求136到139任一項的方法，其中表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，在將一部分量的報告化合 物與至少一部分量的耙核酸形成複合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結合元件上的步驟 開始後1秒到120秒時進行測定。
141. 權利要求129到140任一項的方法，其中報告化合物含有一種或多種可檢測的標記物。
142. 權利要求141的方法，其中一種或多種可檢測的標記物是熒 光標記物。
143. 權利要求129到142任一項的方法，其中報告化合物是寡核 苷酸。
144. 權利要求137到143任一項的方法，還包括在將靶核酸進行 擴增之前對它們進行反轉錄。
145. 權利要求129到144任一項的方法，其中第二結合元件包括 能夠將報告化合物捕獲在第二結合元件上的一種或多種不同的報告化 合物特異性捕獲分子。
146. 權利要求145的方法，其中報告化合物特異性捕獲分子是寡 核苷酸。
147. 權利要求145或146的方法，其中不同的報告化合物特異性 捕獲分子布置在第二結合元件的不同位置上。
148. 權利要求145到147任一項的方法，其中報告化合物通過與 報告化合物特異性捕獲分子形成複合物而捕獲在第二結合元件上。
149. 權利要求145到148任一項的方法，其中報告化合物能夠與 靶核酸形成複合物的相互作用位點的至少一部分，也能夠與報告化合 物特異性捕獲分子形成複合物。
150. 權利要求145到149任一項的方法，其中報告化合物特異性 捕獲分子和靶核酸競爭與報告化合物形成複合物。
151. 權利要求137到150任一項的方法，其中擴增包括使雙鏈核 酸變性的步驟。
152. 權利要求151的方法，其中雙鏈核酸包括報告化合物與靶核 酸的複合物，報告化合物與報告化合物特異性捕獲分子的複合物，雙 鏈報告化合物和雙鏈靶核酸。
153. 權利要求137到152任一項的方法，其中擴增包括將引物分 子退火到耙核酸的步驟。
154. 權利要求153的方法，其中退火步驟與將一部分量的報告化 合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步驟，和/或將沒有與靶核 酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結合元件上的步 驟相伴進行。
155. 權利要求137到154任一項的方法，其中擴增是循環式的擴增。
156. 權利要求155的方法，其中循環式的擴增是PCR。
157. 權利要求156的方法，其中PCR的進行包括使用具有外切核 酸酶活性的聚合酶。
158. 權利要求155到157任一項的方法，其中循環式擴增包含至少io個循環。
159. 權利要求155到158任一項的方法，其中循環式擴增包含至 少20個循環。
160. 權利要求155到159任一項的方法，其中表明捕獲在第二結 合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，在循環式擴增的至少一個 循環後進行測定。
161. 權利要求155到160任一項的方法，其中表明捕獲在第二結 合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，在循環式擴增的每個循環 後進行測定。
162. 權利要求155到161任一項的方法，其中表明靶核酸的存在 和/或量的值，在每次表明捕獲在第二結合元件上的報告化合物的存在 和/或量的值被測定後進行測定。
163. 權利要求129到162任一項的方法，其中表明捕獲在第二結 合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的測定，包括指示值的時間 依賴性監測。
164. 權利要求130到163任一項的方法，其中表明靶核酸的存在 和/或量的值，根據將表明報告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸 的存在和/或量的值相關聯的校正曲線來確定。
165. 權利要求129到164任一項的方法，其中方法在權利要求1 到99任一項的裝置中進行。
166. 權利要求165的方法，其中裝置包括適於容納液體的第一結構，其中形成每個含有靶核酸和捕獲分子的複合物的步驟在第一結構 中進行，其中每個捕獲分子含有特異性針對靶核酸的區域的結合部分 以及錨定基團。
167. 權利要求165或166的方法，其中裝置包括適於容納液體的 第二結構，其中在第二結構中提供了第一以及任選的第二結合元件。
168. 權利要求100到167任一項的方法，其中樣品是體積為1 到50pL的流體樣品。
169. 權利要求100到168任一項的方法，其中樣品是流體全血樣
170. 權利要求1到99任一項的流體裝置，被構造為進行權利要 求100到169任一項的方法。
171. 方法，包括形成含有下列成分的組合物 -一定量的報告化合物，-能夠捕獲報告化合物的結合元件，以及- 一定量的能夠與報告化合物形成複合物的靶核酸，與報告化合 物形成複合物抑制報告化合物被結合元件捕獲；將一部分量的報告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物；將沒有與靶核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結 合元件上；以及測定表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值。
172. 權利要求171的方法，還包括在表明捕獲在結合元件上的報 告化合物的存在和/或量的值的基礎上測定表明靶核酸的存在和/或量 的值。
173. 權利要求171或172的方法，還包括在將一部分量的報告化 合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物，將沒有與靶核酸形成複合 物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結合元件上，以及測定表明捕獲 在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值的步驟之後，從結合元 件上釋放剩餘部分量的報告化合物。
174. 權利要求173的方法，還包括進行釋放，形成複合物，捕獲 以及測定的步驟額外的N次，其中N是大於或等於1的整數。
175. 權利要求174的方法，其中N^5。
176. 權利要求174的方法，其中N^10。
177. 權利要求174的方法，其中N^20。
178. 權利要求171到177任一項的方法，還包括在形成複合物的 步驟之前 將至少一部分量的報告化合物捕獲在結合元件上； 測定表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值；以及從結合元件上釋放被捕獲的報告化合物。
179. 權利要求171到178任一項的方法，其中將一部分量的報告 化合物與至少一部分量的耙核酸形成複合物的步驟，以及將沒有與靶 核酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結合元件上的步 驟，相伴進行。
180. 權利要求171到179任一項的方法，還包括對靶核酸進行擴增。
181. 權利要求180的方法，其中靶核酸的擴增在將一部分量的報 告化合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步驟之前開始。
182. 權利要求171到181任一項的方法，其中表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或量的值，在將一部分量的報告化合物與 至少一部分量的靶核酸形成複合物，以及將沒有與靶核酸形成複合物 的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結合元件上達到化學平衡之前進行 測定。
183. 權利要求171到182任一項的方法，其中表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值，在將一部分量的報告化合物與 至少一部分量的耙核酸形成複合物的步驟，以及將沒有與靶核酸形成 複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在第二結合元件上的步驟開始 後1秒到120秒時進行測定。
184. 權利要求171到183任一項的方法，其中報告化合物包含一 種或多種可檢測的標記物。
185. 權利要求184的方法，其中一種或多種可檢測的標記物是熒 光標記物。
186. 權利要求171到185任一項的方法，其中報告化合物是寡核 苷酸。
187. 權利要求180到186任一項的方法，還包括在將靶核酸進行 擴增之前，對它們進行反轉錄。
188. 權利要求171到187任一項的方法，其中形成物質的組合物 包括形成含有以下的物質的組合物- 一定量的第一報告化合物，- 一定量的能夠與第一報告化合物形成複合物的第一靶核酸，與 第一報告化合物形成複合物抑制第一報告化合物被結合元件捕獲，- 一定量的第二報告化合物，以及- 一定量的能夠與第二報告化合物形成複合物的第二靶核酸，與 第二報告化合物形成複合物抑制第二報告化合物被結合元件捕獲。
189. 權利要求171到188任一項的方法，其中結合元件包含一種 或多種能夠將報告化合物捕獲在結合元件上的不同的捕獲分子。
190. 權利要求189的方法，其中捕獲分子是寡核苷酸。
191. 權利要求189或190的方法，其中不同的捕獲分子布置在結 合元件的不同位置上。
192. 權利要求189到191任一項的方法，其中報告化合物通過與 捕獲分子形成複合物而被捕獲在結合元件上。
193. 權利要求189到192任一項的方法，其中報告化合物上的至 少一部分能夠與靶核酸形成複合物的相互作用位點，也能夠與捕獲分 子形成複合物。
194. 權利要求189到193任一項的方法，其中捕獲分子和靶核酸 競爭與報告化合物形成複合物。
195. 權利要求180到194任一項的方法，其中擴增包括使雙鏈核 酸變性的步驟。
196. 權利要求195的方法，其中雙鏈核酸包括報告化合物與靶核 酸的複合物，報告化合物與捕獲分子的複合物，雙鏈報告化合物以及雙鏈靶核酸。
197. 權利要求180到196任一項的方法，其中擴增包括將引物分 子退火到靶核酸的步驟。
198. 權利要求197的方法，其中退火步驟與將一部分量的報告化 合物與至少一部分量的靶核酸形成複合物的步驟，和/或將沒有與耙核 酸形成複合物的剩餘部分量的報告化合物捕獲在結合元件上的步驟相 伴進行。
199. 權利要求180到198任一項的方法，其中擴增是循環式擴增。
200. 權利要求199的方法，其中循環式擴增是PCR。
201. 權利要求200的方法，其中進行PCR包括使用具有外切核酸 酶活性的聚合酶。
202. 權利要求199到201任一項的方法，其中循環式擴增包括至 少IO個循環。
203. 權利要求199到202任一項的方法，其中循環式擴增包含至 少20個循環。
204. 權利要求199到203任一項的方法，其中表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值，在循環式擴增的至少一個循環 後進行測定。
205. 權利要求199到204任一項的方法，其中表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值，在循環式擴增的每個循環後進 行測定。
206. 權利要求199到205任一項的方法，其中表明靶核酸的存在和/或量的值，每次在表明捕獲在結合元件上的報告化合物的存在和/或 量的值被測定後進行測定。
207. 權利要求171到206任一項的方法，其中表明捕獲在結合元 件上的報告化合物的存在和/或量的值的測定包含了指示值的時間依賴 性的監測。
208. 權利要求172到207任一項的方法，其中表明靶核酸的存在 和/或量的值，根據將表明報告化合物的存在和/或量的值與表明靶核酸 的存在和/或量的值相關聯的校正曲線來確定。
209. 權利要求171到208任一項的方法，其中方法在選自生物傳 感器分析裝置，微流體盒和晶片實驗室的裝置中進行。
210. 方法，包括將至少一種耙多核苷酸進行擴增，以形成雙鏈擴增子， 將擴增子與被構造為與擴增子選擇性結合的表面相接觸，以及擴增子通過錨定基團結合到表面上，任選的測定擴增子的存在。
211. 權利要求210的方法，還包括在任選的測定步驟之後從表面 上釋放擴增子，對釋放的擴增子進行至少一次額外的擴增循環，將得 到的擴增子與表面相接觸，以及擴增子通過錨定基團結合到表面上， 任選的測定擴增子的存在。
212. 權利要求211的方法，還包括進行釋放，進行擴增，接觸和 任選的測定的步驟額外的N次，其中N是大於或等於1的整數。
213. 權利要求212的方法，其中N^5。
214. 權利要求212的方法，其中N^10。
215. 權利要求212的方法，其中NSO。
216. 權利要求210的方法，在進行擴增的步驟之前，還包括 提供靶多核苷酸；形成每個含有從病原體釋放的靶多核苷酸和至少一種捕獲分子的 複合物，每個捕獲分子含有特異性針對靶多核苷酸的區域的結合部分 和錨定基團，以及將複合物與表面相接觸，表面被構造為與捕獲分子的錨定基團非 選擇性地結合，從而非選擇性地結合複合物和表面。
217. 權利要求216的方法，其中提供多核苷酸包括釋放一種或多 種細胞，孢子或病毒的內含物，內含物中含有靶多核苷酸。
218. 權利要求217的方法，其中釋放的步驟包括將含有一種或多 種細胞，孢子或病毒的樣品與裂解試劑和捕獲分子相接觸。
219. 權利要求218的方法，其中將樣品與裂解試劑和捕獲分子相 接觸的步驟，包括將樣品與冷凍乾燥形式的裂解試劑和捕獲分子相接 觸。
220. 權利要求216的方法，其中提供靶多核苷酸的步驟包括提供 相伴的物質，方法還包括將表面結合的複合物與相伴的物質分離開。
221. 權利要求221的方法，其中相伴的物質包括多核苷酸從其中 釋放出來的至少一種細胞，孢子或病毒的內含物。
222. 權利要求220的方法，其中表面是粒子的表面。
223. 方法，包括提供一種或多種靶多核苷酸，形成每個含有靶多核苷酸和至少一種捕獲分子的複合物，每個捕 獲分子含有特異性針對靶多核苷酸的區域的結合部分和錨定基團，以 及將複合物與表面相接觸，表面被構造為與捕獲分子的錨定基團非 選擇性地結合，從而非選擇性地結合複合物和表面。
224. 權利要求223的方法，其中提供的步驟包括釋放一種或多種 細胞，孢子或病毒的內含物，內含物中含有多核苷酸。
225. 權利要求224的方法，還包括將表面結合的複合物與從一種 或多種細胞，孢子或病毒釋放的其他內含物分離開。
226. 被構造用於進行權利要求210到225任一項的方法的裝置。
227. 方法，包括將液體導入到微流體裝置的反應室中，液體中含有靶多核苷酸， 將靶多核苷酸結合到位於反應室中的第一結合元件上， 對反應室中的靶多核苷酸進行擴增以形成擴增子，擴增在存在報 告化合物的情況下進行，將一部分報告化合物在反應室中與擴增子結合， 將剩餘部分的報告化合物與反應室中的第二結合元件結合，以及 檢測與第二結合元件結合的報告化合物。
228. 方法，包括將液體導入到微流體裝置的反應室中，液體中含有靶多核苷酸， 將靶多核苷酸結合到位於反應室中的第一結合元件上， 在反應室中對靶多核苷酸進行擴增以形成擴增子，擴增在存在報告化合物的情況下進行，在反應室中將一部分報告化合物與擴增子結合，將剩餘部分的報告化合物與反應室中的第二結合元件結合，以及 檢測與第二結合元件結合的報告化合物。
229. 方法，包括在擴增混合物中擴增靶多核苷酸以形成擴增子，擴增在存在報告 化合物的情況下進行，至少一部分擴增子能夠與報告化合物形成複合 物，將一部分量的報告化合物與至少一部分擴增子形成複合物；以及檢測剩餘部分的報告化合物，剩餘部分的成員沒有與擴增子複合。
230. 權利要求229的方法，還包括根據檢測到的剩餘部分的報告 化合物在擴增後確定表明存在的擴增子的數量的值。
231. 權利要求230的方法，還包括根據表明擴增子的數量的值來 確定表明擴增混合物中存在的耙多核苷酸的數量的值。
232. 權利要求229到231的方法，其中擴增的步驟還包括對擴增混合物中存在的對照多核苷酸進行擴 增，以形成對照擴增子，擴增在存在對照報告化合物的情況下進行， 至少一部分對照擴增子能夠與對照報告化合物形成複合物，將一部分量的對照報告化合物與至少一部分對照擴增子形成複合物；檢測剩餘部分的對照報告化合物，剩餘部分的成員沒有與對照擴 增子複合；以及根據檢測到的剩餘部分的報告化合物和檢測到的剩餘部分的對照 報告化合物在擴增後確定表明存在的擴增子的數量的值。
233. 權利要求232的方法，其中報告化合物和對照報告化合物各含有光學標記物，檢測的步驟包括檢測光學標記物。
234. 權利要求229到233任一項的方法，還包括將沒有與擴增子 複合的報告化合物與固定在表面上的結合元件相結合，其中對與結合 元件結合的剩餘部分的報告化合物進行檢測。
235. 權利要求234的方法，其中結合元件是第一結合元件，方法 還包括將沒有與對照擴增子複合的對照報告化合物與固定在表面上的 第二結合元件相結合，其中剩餘部分的對照報告化合物的檢測是對與 第二結合元件結合的剩餘部分的對照報告化合物進行的。
236. 權利要求234的方法，其中結合元件位於反應室中，檢測的 步驟在反應室中進行。
237. 權利要求235的方法，其中第一和第二結合元件位於反應室 中，檢測報告化合物和對照報告化合物的步驟在反應室中進行。
238. 權利要求229到237任一項的方法，還包括在擴增步驟之前 將耙多核苷酸結合到第三結合元件上，並將靶多核苷酸從第三結合元 件上釋放。
239. 權利要求236或237的方法，還包括在擴增步驟之前將靶多 核苷酸結合到第三結合元件上，將靶多核苷酸從第三結合元件上釋放， 其中第三種結合元件位於反應室中。
240. 權利要求229到239任一項的方法，還包括重複擴增，形成 複合物和檢測的步驟N次，N至少為2，並且重複的擴增步驟包括擴增 擴增子。
241. 權利要求240的方法，還包括對於至少某些N次重複中的每次來說，在檢測到的剩餘部分的報告化合物的基礎上，來測定表明擴 增子的數量的值。
242. 權利要求241的方法，還包括對於N次重複中的至少一次來 說，在表明擴增子的數量的值的基礎上，來測定表明擴增混合物中存 在的靶多核苷酸數量的值。
243. 權利要求240到242任一項的方法，其中N是至少20。
244. 權利要求240到243任一項的方法，其中重複的擴增步驟包 括擴增對照擴增子，方法包括重複在對照擴增子和對照報告化合物之 間形成複合物，以及檢測剩餘部分的對照報告化合物N次的步驟。
245. 權利要求244的方法，對於至少某些N次重複中的每次來說， 根據檢測到的剩餘部分的報告化合物和檢測到的剩餘部分的對照報告 化合物來測定表明擴增子數量的值。
246. 權利要求229到245任一項的方法，其中靶多核苷酸源自於 病原體，方法包括裂解病原體以釋放耙多核苷酸。
247. 權利要求246的方法，其中病原體是病毒。
248. 權利要求247的方法，其中病毒是HIV。
249. 權利要求229到248任一項的方法，其中報告化合物含有可 光學檢測的標記物，當報告化合物與擴增子複合時，以及當報告化合 物沒有複合時，可光學檢測的標記物的可檢測性基本上相同。
250. 權利要求249的方法，其中標記物是螢光，當報告化合物與 擴增子複合時螢光標記物的量子產率，在報告化合物沒有與擴增子複合時標記物的量子產率的10%的範圍內。
251. 權利要求249的方法，其中對照報告化合物含有可光學檢測 的標記物，當對照報告化合物與對照擴增子複合時，以及當報告化合 物沒有複合時，可光學檢測的標記物的可檢測性基本上相同。
252. 權利要求251的方法，其中對照報告化合物的標記物是螢光， 當對照報告化合物與對照擴增子複合時螢光標記物的量子產率，在對 照報告化合物沒有與對照擴增子複合時標記物的量子產率的10%的範 圍內。
253. 權利要求235的方法，其中第一和第二結合元件被固定在同一表面上。
254. 權利要求240到253任一項的方法，其中 擴增混合物中耙多核苷酸的擴增還包括在擴增混合物中對另外N'種不同的靶多核苷酸進行擴增，以形成相應的不同的擴增子，擴增在 存在N'種相應的報告化合物的情況下進行，至少一部分的每個第N'個 擴增子能夠與第N'個報告化合物形成複合物，N'至少為2,將一部分量的N，個報告化合物中的每一個與至少一部分第N'個 擴增子形成複合物；以及檢測剩餘部分的N'個報告化合物中的每一個，每個剩餘部分的成 員沒有與相應的擴增子複合。
255. 權利要求254的方法，其中N'至少為4。
256. 被構造用於進行權利要求229到255任一項的方法的裝置。
全文摘要
一種裝置，該裝置包括剛性的基體以及至少部分覆蓋著基體的撓性覆蓋元件，在基體中形成的第一結構，該結構適於容納液體並適於釋放一種或多種細胞，孢子或病毒的內含物，內含物中包含有靶分子，在基體中形成的第二結構，該結構適於容納液體並含有至少一個結合元件，該結合元件適於捕獲靶分子並適於測定表明靶分子的存在和/或量的值，微流體網路，將至少第一結構和第二結構相互連通，還包括致動器元件，適於通過將撓性覆蓋元件壓向基體以選擇性關閉一部分微流體網路，來實現第一結構和第二結構之間的流體流動。
文檔編號B01J19/00GK101553306SQ200780041209
公開日2009年10月7日 申請日期2007年11月6日 優先權日2006年11月6日
發明者卡特林·施泰因梅策, 尤金·埃曼特勞特, 託爾斯滕·舒爾茨, 託馬斯·凱澤 申請人:科隆迪亞戈有限公司