蛋白、核酸和藥物的製作方法

2023-08-07 18:22:46 4

專利名稱：：蛋白、核酸和藥物的製作方法蛋白、核酸和藥物本發明涉及衍生自TGF-(33的蛋白、這種蛋白的生物活性片段和編碼所述蛋白的核酸。本發明也提供了所述蛋白或生物活性片段的衍生物。本發明還提供了包括本發明的蛋白、片段、衍生物或核酸的藥物，以及利用本發明的蛋白、片段、衍生物或核酸的治療方法。轉化生長因子p(TGF-p)是參與調節很多細胞過程的生長因子的超家族的部分，所述細胞過程包括增殖、遷移、細胞凋亡、粘連、分化、炎症、免疫抑制和胞外蛋白的表達。TGF-(3有3種哺乳動物同工型，稱為TGF-|31、TGF-卩2和TGF+3。TGF-P是由廣泛類型的細胞產生的，所述廣泛類型的細胞包括上皮細胞、內皮細胞、造血細胞、神經元細胞和結締組織細胞。TGF-(3在多種不同的治療環境有功效，並且TGF-(33同工型尤其有許多有利的治療用途。由於TGF-P3的治療潛力，其藥學應用受到很多關注。全長的野生型TGF-卩3的胺基酸序列以序列ID號1提出，編碼該TGF-卩3的cDNA以序列ID號2^是出。已知TGF-卩3在調節傷口癒合反應中起關鍵作用。TGF-(33的活性可能影響傷口癒合的速度和癒合引起的瘢痕形成程度。TGF-P3還可用於治療纖維化症狀，肺纖維化、肝硬化、硬皮病；血管生成病症，再狹窄、粘連、子宮內膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨誘導、體外受精、口腔黏膜炎、腎病、預防、減少或抑制瘢痕形成、促進外周和中樞神經系統神經元重連接、預防、減少或抑制眼外科手術(例如LASIK或PRK手術)併發症或眼後部瘢痕形成(例如增殖性玻璃體糹見網膜病變)。TGF-P3自身具備的治療用途已經建立了對生物活性TGF-(33蛋白來源的公認需求，已經^f故出^[艮多嘗試來通過重組方法產生這種有價值的蛋白。然而，現有的產生TGF-(33的方法被嚴重限制了，這是由於為了獲得生物活性分子而必須再摺疊這種複雜的蛋白質。TGF-卩以包含兩個112個胺基酸的亞基的同型二聚體蛋白形式天然存在。這些TGF-(33亞基的每一個在活性肽片段的第58個和第67個殘基間都含有a螺旋形成結構域。除了殘基58和67之間的a螺旋外，每一個TGF-P3亞基還含有許多亞基內部鍵，所述鍵包含鹽橋和二硫鍵。TGF-(33是以100-kDa的潛在的無活性前體分子(LTGF-(33)形式分泌的。所述LTGF-(33分子由以下成分組成i)C末端MkDa二聚體信號肽(活性片段)；以及ii)潛在相關肽(LAP)。LTGF-P是通過LAP從活性片段解離而被激活的。LTGF-P的裂解可通過酶如內肽酶(弗林蛋白酶、纖溶酶和凝血酶)的作用來介導，或通過酸化細胞外周空間來介導。活性TGF-P二聚體片段通過疏水和離子相互作用來穩定，所述相互作用通過亞基間的二硫鍵進一步加強。每個單體包括通過4個內部二硫^;中的3個連鎖的幾個延伸的|3鏈，並形成已知為"半胱氨酸結"的緊密結構。由於生物活性TGF-(33分子(如上文已顯示的，其是含有8個鏈內二硫鍵和1個鏈間二硫鍵的同型二聚體蛋白)的複雜性，它們最初是在真核生物中表達。然而，使用真核生物表達系統可能實現的相對低的表達水平以及這種方法的高成本，意味著為了提高TGF-(33生產的商業效率要對使用微生物宿主進行考察。用微生物宿主如大腸桿菌(￡.//)表達重組分子(如包含多個二硫鍵的TGF-P3)的不利因素在於，產生的蛋白通常沒有正確摺疊並且經常形成不可溶的包涵體。這些包涵體需要增溶，然後復性以使蛋白再摺疊成其天然的生物活性構象。為有效復性TGF-P3同型二聚體，需要再產生正確取向的共價二硫鍵。假設有9個二硫鍵，允許34,459,245種可能的二硫鍵組合，則通過隨機的二硫4建形成方法來形成正確的TGF-(33同型二聚體的可能性很低。因此就不驚訝於重組產生的TGF-P3的再摺疊嚴重影響了它的生產，因為這種摺疊可能需要達144小時，並且通常僅獲得20%左右的再摺疊效率。本發明的目的之一是排除或減少現有技術存在的一些問題。本發明某些方面的目的之一是提供TGF-P3(或其片段或衍生物)，所述TGF-(33(或其片段或衍生物)與野生型TGF-(33相比具有提高的再摺疊效率。本發明某些方面的另一個目的是提供具有TGF-P3活性的不同於野生型TGF-P3的藥劑。所述藥劑提供了對於天然產生的TGF-P3的有價值的供選方案。在本發明的第一個方面，提供了TGF-p3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-P3的胺基酸殘基58和67之間的a螺旋形成區包括至少一個穩固a螺旋的置換。根據本發明的第一個方面，本發明也提供了編碼TGF-(33或其片段或衍生物的核酸。本發明的發明人驚奇的發現，在本發明的第一個方面公開的新的TGF-|33與天然形成的TGF-P3有相同的生物活性，並且與野生型TGF-|33相比有顯著改善的蛋白再摺疊的效率。這種增加的蛋白再摺疊的效率構成顯著重要的優勢，因為其簡化了用於生產生物活性TGF-(33的再摺疊的條件，又極大的增加了所述蛋白(或所述蛋白的片段或衍生物)的產率，所述蛋白可通過使用原核蛋白表達系統來生產。不希望受到任何布支設的限制，本發明的發明人相信，將穩固a螺旋的置換引入a螺旋形成區可有益降低此區域形成的a螺旋的靈活性。該降低的靈活性有助於^R高本發明第一個方面的TGF-P3的正確再摺疊，以生產生物活性蛋白質(或其片段或衍生物)。a螺旋的穩固(通過穩固a螺旋的置換)賦予的降低的靈活性足以增加正確再摺疊的TGF-P3的產率(尤其是再摺疊的TGF-(33二聚體)，然而令人驚奇的是，本發明的發明人發現所述置換不會改變本發明第一個方面的TGF-P3的生物活性，並且所述TGF-(33的生物和治療效力也不會降低。除了上下文另有要求夕卜，本說明書中胺基酸殘基的編號是基於TGF-卩3活性肽部分的胺基酸序列。例如，對"全長的野生型TGF-P3"的提及，通常用來指顯示在序列ID號1中活性肽的胺基酸序列，而對在胺基酸殘基58和67之間的a螺旋形成區也是作相應的解釋。一個穩固a螺旋的置換可優選包括在全長的野生型TGF-卩3的63位置上的甘氨酸殘基的置換。然而，合適的置換可另外的或做為選擇的包括例如，全長的野生型TGF-J33的60或67位置上的一個或兩個蘇氨酸的置換，或者全長的野生型TGF-P3在66位置上的天冬醯胺的置換。優選的是，本發明使用的穩固a螺旋的置換不包括纈氨酸61的置換。本發明的"穩固a螺旋的置換"應理解為如下置換其中存在於野生型TGF-|33中一個指定的胺基酸殘基被更傾向於形成a螺旋的殘基替換。因此引入穩固a螺旋的置換的替換胺基酸殘基不必需是其本身容易穩定整合到a螺旋上的胺基酸殘基，而只需比被置換的胺基酸殘基有更多的穩定整合傾向性。然而，通常優選的是，作為穩固a螺旋的置換的部分而引入的替換胺基酸殘基是確實有利於整合入a螺旋的胺基酸殘基。本發明的發明人發現可以引入本發明第一個方面的穩固a螺旋的置換中的優選替代胺基酸殘基可以是選自下述組的任一個胺基酸或胺基酸的組合丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，曱硫氨酸和苯丙氨酸組成。這些優選的替換胺基酸殘基都被認為是適用於全長的野生型TGF-(33的63位置上甘氨酸殘基的穩固a螺旋的置換。也就是說，選自所述組的替換胺基酸殘基可在58和67胺基酸殘基間a螺旋形成區中的任意位置置換，在所述位置所述替換胺基酸殘基可提供穩固a螺旋的置換。儘管上述列舉的胺基酸殘基代表了用於穩固a螺旋的置換的優選殘基，也應該可以理解有一些可選^^的定性和定量系統可以測定促成a螺旋形成的胺基酸殘基的傾向性(和用於穩固a螺旋的置換的殘基的適合性)，合適的用於穩固a螺旋的置換的胺基酸殘基可參考任何這些系統並結合TGF-J33序列的知識進行選衝奪。作為例子，Chou和Fasman說明的定性系統鑑定了基於它們形成a螺旋的傾向性的5種不同分類的胺基酸殘基。它們依次是強螺旋形成型；弱螺旋形成型；中性形式；弱螺旋破壞型；以及強螺旋破壞型。針對本發明說明書，胺基酸殘基穀氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、丙氨酸、曱硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、穀氨醯胺和苯丙氨酸可被認為是螺旋形成型，其中穀氨醯胺、曱硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸構成強螺旋形成型。相反，天冬醯胺、甘氨酸和脯氨酸可被認為構成螺旋破壞型，其中甘氨酸和脯氨酸是強螺旋破壞型。因此，如果是參考該定性等級評價a螺旋形成的傾向性，那應該認可的是，儘管穩固a螺旋的置換可優選胺基酸殘基被螺旋形成型替換的置換，但適合的穩固a螺旋的置換可選擇地利用中性形成型或甚至螺旋破壞型，這取決於待替換的胺基酸殘基的性質。例如，在中性形式的胺基酸殘基是穩固a螺旋的置換的對象的情況下，適合的替換胺基酸殘基可以是強螺旋形成型或弱螺旋形成型。在強螺旋破壞型是穩固a螺旋的置換的對象的情況下，替換胺基酸殘基可以是強螺旋形成型、弱螺旋形成型、中性形式胺基酸或弱螺旋破壞型。相應的，本發明的穩固a螺旋的置換可包括強螺旋破壞型被弱螺旋破壞型、或中性形式、或弱螺旋形成型或強螺旋形成型置換。可選擇的或另外的，適合的穩固a螺旋的置換可包括弱螺旋破壞型被中性形式、弱螺旋形成型或強螺旋形成型置換。可選擇的或另外的，適合的穩固a螺旋的置換可包括中性形式胺基酸被弱螺旋形成型或強螺旋形成型置換。可選擇的或另外的，適合的穩固a螺旋的置換可包括弱螺旋形成型被強螺旋形成型置換。胺基酸殘基形成a螺旋的傾向性、以及因此其用作穩固a螺旋的置換部分的適合性的一種可選擇的評價是基於本領域技術人員所知的任何定量等級數。這種用於確定胺基酸殘基用於穩固a螺旋的置換的適合性的定量等級的例子示於表1。該表提供了以kcal/mol標度的值，反映了胺基酸促成a螺旋的傾向性。表l中的高值伴隨形成a螺旋的低的傾向性。如此，依照本發明第一個方面的要求，當使用定量等級(如表1所顯示的)評價胺基酸殘基用於穩固a螺旋的置換的適合性時，適合的穩固a螺旋的置換是其中胺基酸殘基被比被替換殘基有更大的螺旋形成傾向性(表1中顯示的更低的kcal/mol值)的胺基酸殘基替換。依照本發明可被利用的適合的置換包括引入人工的替換胺基酸的那些置換。可有益用於穩固a螺旋的人工胺基酸的適合的例子包括具有烷基和鞋基側鏈的胺基酸殘基。丙氨酸代表了特別優選的適合用於穩固a螺旋的置換的替換胺基酸殘基。最優選的是，本發明的第一個方面的TGF-(33或其片段或衍生物包括在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸被丙氨酸替換。優選的本發明第一個方面的TGF-卩3的胺基酸序列以序列ID號3顯示(Gly-63Ala)，編碼該TGF-卩3的DNA以序歹'jID號4顯示。含有在全長的野生型TGF-P3的63位置上的丙氨酸的置換的序列ID號3的TGF+3的片段或衍生物，代表了優選的本發明第一個方面的TGF-(33的片段或衍生物。適合的置換可以是其中全長的野生型TGF-(33中58和67之間的一個或多個胺基酸殘基被一個或多個天然的或人工的胺基酸殘基替換的置換。作為進一步說明，適合的置換可包括單個的胺基酸殘基被一個或多個替換殘基置換，或者多於一個的胺基酸殘基被一個或多個替換殘基置換。優選的置換可以是其中胺基酸殘基數是保守的置換，即其中被置換的胺基酸殘基數與引入的替換胺基酸殘基數是相同的置換。還應該理解的是，優選的待替換的胺基酸殘基(或多個殘基)可參考如上討論的定性或定量等級來選擇。因此，適合作為穩固ot螺旋的置換的對象的胺基酸可以是分類為螺旋破壞型、或優選強螺旋破壞型，參考如上討論的定性等級。參考表l顯示的定量等級，適合作為穩固a螺旋的置換的對象的胺基酸可以優選螺旋傾向性值大於或等於0.50、更優選螺旋傾向性值大於或等於0.60和最優選螺旋傾向性值是1.00的胺基酸。本發明的發明人相信，本發明的第一個方面的TGF-(33、或其生物活性片段或其衍生物可用於其中希望利用野生型TGF-(33的生物活性的所有環境中。這些環境具體包括但不限於治療用途。與所述治療用途一致，本發明也提供了依據本發明的第一個方面的TGF-(33、或其片段或衍生物作為藥物的用途。應該可以理解，儘管可能優選的是本發明第一個方面的TGF-(33的片段或衍生物包括含有穩固a螺旋的置換的全長的a螺旋形成區，但這種需要不是必須的情況。適合的片段或衍生物可包括截短的a螺旋形成區，只要所述截短的a螺旋形成區包含至少一個穩固a螺旋的置換即可。在本發明的第二方面提供了其中在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸殘基被脯氨酸替換的TGF-P3或其片段或衍生物。本發明也提供了編碼本發明的第二方面的TGF-(33或其片段或衍生物的核酸。本發明的發明人驚奇的發現，本發明的第二方面的蛋白(或其片段或衍生物)具有與野生型TGF-P3相當的生物活性。這個發現是意想不到的，因為認為脯氨酸在通常與a螺旋形成有關的TGF-P3區域中的出現將幹擾此種蛋白的二級結構，從而削弱其生物功能。儘管本發明的第二方面的TGF-P3的再摺疊效率低於野生型TGF-f33，但預期的功能削弱驚奇地沒有發生。因此本發明的第二方面的蛋白(或其片段或衍生物)給本領域提供了有價值的貢獻，因為它們擴展了對於技術人員有用的能夠發揮TGF-(33活性的化合物的所有組成成分。所述化合物可以例如用於其中需要治療性地使用TGF-P3活性的環境。優選的本發明的第二方面的優選TGF-P3的胺基酸序列以序列ID號5顯示(Gly-63Pro),編碼所述TGF-(33的DNA以序列ID號6顯示。含有在全長的野生型TGF-p3中63位置上脯氨酸的置換的序列ID號5的TGF-(33的片段或其衍生物，代表了優選的本發明的第二方面的TGF-P3的片段或其衍生物。若本發明的第二方面TGF-P3或其片段或衍生物可被應用於其中需要治療性地利用野生型TGF-(33生物活性的環境，則應該可以理解也提供了本發明的第二方面的TGF-P3或其片段或衍生物作為藥物的用途。本發明的發明人相信所述藥物可用於其中已知利用TGF-(33的生物活性的全部臨床環境。在本發明的第三方面，提供了包括全長的野生型TGF-P3中12位置上穀氨酸殘基的置換和/或全長的野生型TGF-P3中52位置上精氨酸殘基的置換的TGF-(33或其片段或衍生物。本發明也提供了本發明的第三方面的編碼TGF-(33或其片段或衍生物的核酸。應該可以理解，本發明第三方面因此包括其中全長的野生型TGF-卩3中12位置上的穀氨酸被置換但是保留了全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸的TGF-P3。本發明第三方面也包括其中保留了全長的野生型TGF-P3中12位置上的穀氨酸但是全長的野生型TGF-(33中52位置的精氨酸被置換的TGF-P3。然而，優選的是，本發明第三方面的TGF-(33包括全長的野生型TGF-卩3中12位置上的穀氨酸殘基的置換和全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸殘基的置換。本發明的發明人驚奇的發現本發明第三方面的蛋白也具有與野生型TGF-P3的生物活性相當的生物活性。這個發現是預料不到的，因為置換一個或兩個全長的野生型TGF-P3中12位置上的穀氨酸殘基和/或全長的野生型TGF-卩3中52位置的精氨酸殘基，破壞了通常在野生型TGF-P3中存在的亞基內部的鹽橋的形成。不能完成正確的鹽橋形成的這種失敗，可以預期降低本發明的第三方面的TGF-(33的生物活性，因為蛋白質如TGF-卩3的生物活性通常被認為是依賴於它們的構象。此外，本發明的發明人還發現本發明第二方面的TGF-P3顯示了成功再摺疊的效率，所述效率與野生型TGF-P3所觀察到的一樣高。這個發現非常令人驚訝，因為本領域技術人員認為的是，本發明第二方面的TGF-卩3中必然發生的亞基內部鹽橋形成的缺失會有害地影響再摺疊發生率，因而會降低生物活性TGF-(33的產率。因此本發明的第三方面的蛋白服務於擴展了對於技術人員有用的能夠發揮TGF-P3活性的化合物的所有組成成分。如上文記錄的，所述化合物的可用性在其中需要治療性地利用TGF-(33活性的環境中是重要的。本發明的發明人發現，全長的野生型TGF-(33中12位置上的穀氨酸或全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸中不管哪一個都可被選自下述組的任一個胺基酸殘基(或胺基酸殘基的任何組合)置換絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。優選的是，絲氨酸作為替換胺基酸殘基用於本發明的第三方面的TGF-(33或其片段或衍生物。絲氨酸可被用來替換全長的野生型TGF-(33中12位置上的穀氨酸或全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸。最優選地，絲氨酸既用於替換全長的野生型TGF-(33中12位置上的穀氨酸，又用於替換全長的野生型TGF-(33中52位置的精氨酸。優選的本發明第三方面的TGF-P3的第一個例子以序列ID號7顯示。本發明包含序列ID號7的生物活性片段或衍生物，所述序列ID號7包括Glul2-Ser置換。編碼所述優選TGF-卩3的cDNA在序列ID號8中顯示。優選的本發明第三方面的TGF-(33的第二個例子以序列ID號9顯示。的本發明的片段或衍生物。編碼所述優選TGF-|33的cDNA以序列ID號IO顯示。優選的本發明第三方面的TGF-|33的第三個例子以序列ID號11顯示。包括Glul2-Ser置換和Arg52-Ser置換的序列ID號11的生物活性片段或衍生物也構成了優選的本發明的片段或衍生物。編碼所述優選TGF-P3的cDNA以序列ID號12顯示。本發明的發明人相信，本發明第三方面的TGF-P3或其生物活性片段或其衍生物可用於其中可能希望利用野生型TGF-P3生物活性的全部環境。這些環境包括但不限於TGF-P3的治療用途。相應的，本發明也提供了本發明第三方面的TGF-(33或其片段或衍生物作為藥物的用途。本發明的TGF-P3或其生物活性片段或其衍生物可用於治療傷口(包含慢性傷口例如潰瘍)。它們尤其可用於通過預防、減少或抑制瘢痕形成來促進加速傷口癒合，和/或促進傷口的上皮再生。本發明的TGF-(33還可用於實現預防或治療纖維化疾病，所述疾病可獨立的選自包括肺纖維化、肝硬化、硬皮病和腎小球腎炎、肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化、增殖性玻璃體視網膜病變和子宮纖維化的組。本發明的TGF-P3可用於治療硬皮病、血管生成病症、再狹窄、粘連、子宮內膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導、體外受精、口腔黏膜炎和腎病。作為例子，野生型二聚體TGF-P3在動物模型和臨床中的局部應用已經顯示能夠加速慢性、非癒合的壓迫性潰瘍的癒合速度；降低了口腔黏膜炎的發病率、嚴重度和持續時間；並降低了放射性胃腸道症候群的不良副作用，所述症候群是由癌症治療中的放療和化療導致幹細胞損傷而形成的。本發明的發明人相信本發明的TGF-P3或其片段或衍生物可有益地用於全部的這些適應症。本發明的TGF-(33可與天然存在的TGF-P3相同的方式用於例如治療可以例如獨立選自下述的狀態纖維化疾病、硬皮病、血管生成病症、再狹窄、粘連、子宮內膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導、體外受精、口腔黏膜炎、腎病，預防、減少或抑制瘢痕形成，促進外周和中樞神經系統神經元重連"l妄和預防、減少或抑制眼外科手術(如LASIK或PRK手術)併發症。本發明的TGF-P3可用於治療唇和顎裂(例如與這種狀態的手術修補相結合)，和減少或抑制瘢痕形成和促進腱的癒合。本發明公開的TGF-卩3的突變型能夠以與天然存在的TGF-(33相同的方式促進加速的傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。它們也可以促進上皮細胞的損傷部位的上皮再生。"本發明的TGF-P3"包括本發明的第一、第二或第三方面中任何方面的任何的突變型TGF-(33。應該可以理解本發明的TGF-(33不包含TGF-pi或因此，可基於能夠減少施用了TGF-f33的傷口處的瘢痕形成來將TGF-f33與TGF-卩1或TGF-|32區分。本發明的TGF-(33可優選是非天然TGF-(33。本發明任何方面的TGF-P3都可用於製備用於治療其中可能希望利用TGF-(33的任何狀態的藥物。這種用途包括但不限於，治療任何本說明書中考慮到的任何狀態。可以優選的是，本發明的TGF-P3用於製備用於促進加速傷口癒合，和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥劑。所述瘢痕形成可能與傷口和/或纖維化疾病有關。用本發明TGF-P3生產的藥物可優選用於皮膚，或眼(例如加速皮膚或眼的癒合，或預防、減少或抑制皮膚或眼的瘢痕形成)。本發明的TGF-P3可以是潛在的TGF-(33或有活性的TGF-p3(例如有或沒有潛在相關肽)。除上下文另有要求外，所有對本發明的TGF-(33的提及都應認為包括所述TGF-P3的片段或其衍生物，其中所述片段或衍生物的特徵是它們包括使它們與野生型TGF-P3的片段或其衍生物(其胺基酸序列在本發明意圖中用序列ID號l代表)相區別的置換(適當地與本發明的第一、第二或第三方面一致)。本發明的第一、第二或第三方面的適合的TGF-|33的片段或其衍生物可包括至少IO個胺基酸殘基，優選至少40個胺基酸殘基，更優選至少70個胺基酸殘基，最優選至少100個胺基酸殘基。除了上下文另有要求，本發明說明書中對TGF-P3和TGF-(33的片段的提及也包括這種蛋白或片段的衍生物。不受限制的，適合形式的衍生物的適合的例子可選自本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效肽衍生物、包括或基於本發明TGF-P3(或其片段)藥效基團的治療有效片段或衍生物、本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效類肽衍生物、本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效D-胺基酸衍生物、基於本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效肽模擬物、本發明TGF-P3(或其片段)的治療有效肽類似物、基於本發明TGF-P3(或其片段)的治療有效假肽、基於本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效逆反式肽、基於本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效縮酚酸肽衍生物、基於本發明TGF-(33(或其片段)的治療有效p-肽衍生物和基於本發明TGF-P3(或其片段)的治療有效逆類肽書t生物。應該可以理解，為本發明目的，"TGF-P3"可以包括單體和二聚體形式的TGF-P3。本發明的發明人驚奇的發現本發明的TGF-P3以單體和二聚體形式都能發揮其生物效應。這驚奇地與現有技術之前報導的不同，現有技術通常認為TGF-P例如TGF-(33隻可在二聚體形式下才能發揮生物活性。本發明人有關本發明的TGF-p3可以單體形式使用的發現提供了巨大的優點，因為所述單體形式可通過相對簡單的摺疊技術(如後面進一步討論的例子)就能生產，因此提高了生物活性分子生產的速度，同時也降低了與所述分子生產相關的費用。優選的是，本發明的單體TGF-(33是以序列ID號3、5、7、9或11顯示的TGF-(33，或其片段或衍生物。"本發明的藥物"包括本發明TGF-P3的任何藥物。本發明的藥物可另外或可選擇的是包括編碼本發明TGF-P3的核酸的藥物。所述藥物既包含藥物本身(即，不考慮藥物的用途)，又包括用於具體治療應用(例如治療或改善本發明說明書中考慮到的狀態)的藥物。本發明的藥物預期應被理解為包括包含適合的本發明TGF-(33的片段或其衍生物，或編碼所述片段或衍生物的核酸的藥物。"本發明的治療方法"(或"本發明的方法")被認為包括任何治療方法，所述治療方法利用了治療有效量的本發明的TGF-(33，或編碼所述TGF-(33的核酸。本發明治療方法還預期應被理解為包括利用了適合的本發明的TGF-(33的片段或其衍生物，或編碼所述片段或衍生物的核酸的治療方法。包括本發明TGF-(33或其生物活性片段或衍生物的藥物可用於治療傷口(包含慢性傷口如潰瘍)。它們尤其可用於通過預防、減少或抑制瘢痕形成來促進加速傷口癒合，和/或促進傷口處上皮再形成。本發明TGF-P3可用於實現纖維化疾病的預防或治療，所述纖維化疾病例如肺纖維化、肝硬化和纖維化、硬皮病、腎小球腎炎、皮膚纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化、增殖性玻璃體^L網膜病變或子宮纖維化。本發明TGF-P3可用於治療獨立選自下述的狀態硬皮病、血管生成病症、再狹窄、粘連、子宮內膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導、體外受精、口腔黏膜炎、腎病、肺纖維化、肝硬化和纖維化、腎小球腎炎、皮膚纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化和子宮纖維化。作為例子，野生型、二聚體TGF-P3在動物模型和臨床中的局部應用已經顯示能夠加速慢性、非癒合的壓迫性潰瘍的癒合速度；降低口腔黏膜炎的發病率、嚴重度和持續時間；降低放射性胃腸道症候群的不良副作用，所述症候群是由癌症治療中的放療和化療導致的幹細胞損傷而形成的。本發明的發明人相信本發明的TGF-(33或其片段或衍生物可有益的用於全部的這些適應症。瘢痕形成活性，所述抗瘢痕形成活性可優選體內研究的。本發明的治療有效量的TGF-(33或其片段或衍生物是足以引起下述需要的量i)加速傷口癒合和/或抑制瘢痕形成；或ii)促進上皮再生；或iii)預防和/或治療纖維化疾病。加速傷口癒合和/或抑制瘢痕形成的程度或者可能需要的上皮再生對於例如負責照料患者的臨床醫生是顯然的，或實際可容易地由其決定。力口速傷口癒合和/或抑制瘢痕形成或促進上皮再生的程度的適合的評定可由臨床醫生決定，可參考這裡描述測量的建議方法。適合的本發明的TGF-(33以及這種TGF-卩3的優選片段或衍生物，可參考本文描述的任何或全部考慮進行選擇。參考治療的傷口顯示的特性，本發明TGF-P3加速傷口癒合的能力易於理解和/或測量。出於當前目的，"治療的傷口"可認為是暴露於治療有效量的本發明藥物的傷口或已依據本發明方法接受治療的傷口。治療的傷口癒合的加速可由與對照傷口相比上皮形成增加的速率表示。這樣，本發明的方法和藥物與其他方式相比，促進傷口面積上方的功能性上皮層更快地重建。可選擇地或另外，治療的傷口癒合的加速可由與對照傷口相比對應時間點上減小的寬度表示。應理解的是，這種傷口寬度的減小確保了傷口閉合的相對較快的速率(由於待閉合的傷口寬度更小)，預示這些藥物加速癒合反應的能力。較窄的傷口可導致美學上優於較寬瘢痕的較窄瘢痕。因此，本發明上下文中的加速的傷口癒合應被採用來包括，與對照治療或未治療傷口中發生的癒合速率相比，任何治療的傷口癒合速率的提高。優選地，傷口癒合的加速可從治療和對照傷口中得到的上皮再形成速率比較方面，或治療和對照傷口在對應時間點上相對寬度的比較方面進行評定。更優選地，加速的傷口癒合可定義為包含與對照傷口相比上皮再形成提高的速率和傷口寬度在對應時間點的減小。優選地，促進傷口癒合加速可產生的傷口癒合速率比對照或未治療傷口中發生的癒合速率高至少5%、10%、20%或30%。更優選地，促進傷口癒合加速可產生的癒合速率比對照傷口的癒合高至少40%、50%或60%。甚至更加優選地，促進傷口癒合加速可產生的癒合速率比對照傷口中發生的高至少70%、80%或90%，最優選地，促進傷口癒合加速可產生的癒合速率比對照傷口中發生的速率高至少100%。存在範圍廣泛的傷口癒合疾病，其特徵為或至少部分特徵為正常傷口癒合反應的不當的失效、延遲或障礙。因此，本發明某些方法和藥物促進加速傷口癒合的能力在預防或治療這些疾病中是有用的。由於本發明的某些方法和藥物能通過促進上皮再形成反應的激活(因此提高了傷口閉合的速率)而引起傷口癒合的加速，因此可理解地，本發明的這些方法和藥物尤其有利於有上皮再形成缺陷、延遲或其他方式損傷傾向的患者傷口的治療。例如，眾所周知老年人的皮膚傷口表現出比年輕個體的皮膚傷口更弱的上皮再形成反應。也有很多其它的狀態或疾病，在這些狀態或疾病中，傷口癒合與延遲或其他方式損傷的上皮再形成相關。例如，患糖尿病的患者、複方用藥的患者(例如由於老齡)、絕經期後的婦女、易於壓迫受傷的患者(例如截癱患者)、靜脈疾病患者、臨床肥胖患者、接受化療的患者、接受放療的患者、接受類固醇治療的患者或免疫功能低下的患者可能都會經受損傷上皮再形成的傷口癒合。在很多這樣的情況下，缺乏適當的上皮再形成反應促成了傷口部位感染的發生，這可能又促成慢性傷口例如潰瘍的形成。因此，可理解的是，這些患者尤其可能從本發明適合的方法或藥物中受益。慢性傷口可能是與延遲傷口癒合反應相關的疾病的最重要的實例。如果受到適當(常規)治療處理時，傷口在形成八周內沒有表現出任何癒合傾向，就被定義為慢性。慢性傷口眾所周知的實例包括靜脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍和褥瘡，但是慢性傷口可在任意時間由另外的正常急性損傷引發。通常，慢性傷口可由傷口部位的感染、不當的傷口治療引發，或作為靜脈、動脈或代謝血管疾病、壓迫、放射損傷或腫瘤造成的進展性組織衰竭的結果。可理解的是，能加速傷口癒合的本發明的方法和藥物可應用於現有慢性傷口的治療，旨在促進它們的癒合。這些方法和藥物可促進慢性傷口的上皮再形成，從而使得疾病治癒和終止。本發明優選的方法和藥物(例如那些利用包含序列ID號3、5、7、9或11的TGF-P3的方法和藥物)還可抑制與傷口癒合相關的瘢痕形成。由於慢性傷口可典型地在患者身體相對大的部分延伸，這些情況中瘢痕形成的預防尤其有利。可選擇地或除了在現有慢性傷口治療中的應用之外，本發明適合的方法和藥物可用於預防患者的急性傷口，所述患者具有受損的傷口癒合發展成慢性傷口的傾向。由於本發明適合的方法和藥物能促進上皮對損傷部位的覆蓋，因此它們能減小治療的傷口發生感染的可能性。同樣地，對上皮再形成的這種促進可能有利於由其它狀態例如糖尿病或靜脈疾病引發的慢性傷口的治療。可以從本發明方法和藥物中得到特別益處的另一組患者是那些免疫系統低下的患者(例如經受化療或放療或患有HIV感染的患者)。廣為承認的是免疫低下患者可能不能在傷口產生後發生正常的炎症反應，其傷口傾向於與較差的癒合結果相關。這些患者可從本發明適合的方法和藥物治療中受益。本發明的TGF-P3(諸如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)促進加速的傷口癒合，同時預防、減少或抑制瘢痕形成的能力在更多普遍的臨床背景中也有用處。這些更多益處的實例可參考下面描述的初級、二級或三級癒合的傷口癒合進行判斷。立邊緣的閉合(例如縫合、粘合帶或釘)。初級癒合治療典型地用於手術切口或其它清潔傷口的治療，且與最低水平的組織缺失相關。技術人員認識到由於本發明的TGF-(33(例如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)能減小傷口寬度，因此它們也有利於傷口對立邊緣的接合，這樣可能有益於為初級癒合的傷口癒合。而且，這些方法或藥物(正如下面進一步描述的)導致預防、減少或抑制這種癒合可能另外發生的瘢痕形成。本發明人認為這種方式的治療可對治療的傷口形成瘢痕的肉眼和顯微鏡下的外觀產生影響；肉眼下瘢痕可能更不引人注意並與周圍的皮膚融合，顯微鏡下瘢痕可表現出更多正常的皮膚結構的再生。出於本發明的目的，二級癒合治療可認為包括傷口癒合過程中，非直接手術幹預的傷口閉合。有待二級癒合治療的傷口可經過持續地護理(例如傷口的包紮和再包紮以及施用適合的藥物)，但是它是肉芽組織形成和上皮再形成的、產生傷口閉合的天然過程。可理解的是由於本發明的TGF-(33(例如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)與對照傷口中所發生的相比，能提高上皮再形成的速率，因此它們在促進二級癒合的傷口癒合中有用處。三級癒合治療可認為包含先前開著的傷口的手術閉合，允許至少部分肉芽組織形成和上皮再形成。使之適合初級或二級癒合治療應用的本發明優選方法和藥物的特性也有益於促進三級癒合治療傷口方面。本發明TGF-(33(例如序列ID號3、5、7、9或ll)促進上皮再形成(作為它們促進傷口癒合加速的一部分)同時抑制瘢痕形成的應用也在與移植過程相關的傷口治療中尤其有效。用本發明這些方法和藥物的治療有益於移植供體部位(在此部位其能輔助功能性上皮層的重建同時預防、減少或抑制瘢痕形成)和移才直受體部位(在此部位治療的抗瘢痕形成作用抑制了瘢痕形成，同時加速的癒合促進了移植組織的整合)。本發明人認為本發明的方法和藥物在用皮膚、人造皮膚或皮膚取代物移植的方面中提供了優勢。本發明人發現利用TGF-(33(包含序列ID號3、5、7、9或ll)的本發明的方法和藥物，在傷口產生前或者傷口已經形成時施用，能促進加速的傷口癒合且抑制瘢痕形成。本發明人發現利用TGF-P3(例如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)的本發明的方法或藥物能促進上皮再生。在本發明上下文中的促進上皮再生可理解為，包括與對照治療或未治療的上皮發生的再生相比，任何上皮再生速率的提高。可容易地將使用本發明的適合的方法或藥物得到的上皮再生速率與對照治療或未治療的上皮獲得的速率相比，這可用本領域已知的任何適宜的上皮再生模型進行。例如，具有已知面積的實驗上皮損傷部位的再生速率可用公知的小鼠、大鼠、兔子或豬體內模型進行比較，例如在Tomlinson&Ferguson(2003)、Davidson等(1991)和Paddock等(2003)中描述的那些。本發明人不希望被任何假說限制，認為通過本發明的TGF-(33實現的上皮再生的促進由上皮細胞遷移的促進作用介導。上皮細胞(其遷移已被促進)因此能夠比未治療的上皮更快速地重建和再生損傷的上皮。可理解地，利用本發明的TGF-(33促進上皮再生可用於誘導有效的上皮再形成，其處於上皮再形成反應被損傷、抑制、延遲或具有其他缺陷的情況中。上皮再生的促進也可有效地加快經受上皮損傷患者的具有缺陷的或正常上皮再生反應的速率。在很多情況中，機體上皮再形成反應可能是具有缺陷的。例如，皮膚上皮再形成的缺陷可能與狀態相關，所述病狀態如天皰皰、Hailey-Hailey病(家族性良性天皰瘡)、中毒性表皮壞死松解症(TEN)/Lyell's綜合症、大皰性表皮鬆解症、皮膚利什曼病和光化性角化病。肺上皮再形成的缺陷可能與原發性肺纖維化(IPF)或肺間質性疾病相關。眼上皮再形成的缺陷可能與狀態相關，所述狀態例如部分角膜緣幹細胞缺失或角膜糜爛。胃腸道或結腸的上皮再形成的缺陷可能與狀態相關，所述狀態例如慢性肛裂(肛(門)裂)、潰瘍性結腸炎或克羅恩病(Crohn，sdisease)和其他炎症性腸病。正如上文所陳述的，本發明的TGF-P3可用於預防、減少或以其他方式抑制瘢痕形成。瘢痕形成的這種抑制能在任意機體部位和任意組織或器官，包括皮膚、眼睛、神經、肌腱、韌帶、肌肉和口腔(包括嘴唇和上顎)，以及內部器官(例如肝臟、心臟、大腦、腹腔、骨盆腔、胸腔、腸和生殖組織)實現。皮膚中，治療可改善瘢痕肉眼下和顯微鏡下的外觀；肉眼下瘢痕可能更不明顯並且與周圍的皮膚融合，顯微鏡下瘢痕裡的膠原纖維可具有與周圍皮膚的形態和組織更相似的形態和組織。本發明上下文中的預防、減少或抑制瘢痕形成應被理解為與對照治療或未治療傷口(如說明書其他地方定義)產生的瘢痕形成的水平相比，包括任何程度的預防、減少或抑制瘢痕形成。除了上下文另外需要參考的地方，瘢痕形成的"預防"、"減少"或"抑制"可被作為抗瘢痕活性中全部被證實的等效機制。使用本發明的方法和藥物實現的皮膚瘢痕形成的預防、減少或抑制，可根據治療的瘢痕的顯^t鏡下或優選肉眼下的外觀與未治療瘢痕的外觀比較來進行評定和/或測量。更優選地，瘢痕形成的預防、減少或抑制可根據治療的瘢痕的顯微鏡下和肉眼下的外觀進行評定。出於本發明的目的，"治療的瘢痕"可被定義為在治療的傷口癒合時形成的瘢痕，而"未治療的瘢痕"可被定義為未治療的傷口、或用安慰劑治療或標準護理治療的傷口癒合時形成的瘢痕。適合的瘢痕比較可優選地才艮據瘢痕年齡、部位、尺寸和患者，與治療的瘢痕進行匹配。在考慮治療傷口產生的瘢痕肉眼下外觀時，瘢痕的程度和由此的任何瘢痕形成預防、減少或抑制的量級可根據以下很多參數中的任一項進行評定。肉眼下瘢痕評定的適合參數可包括i)瘢痕的顏色。正如上文提到的，瘢痕典型地可相對於周圍皮膚而色素沉著減少或色素沉著過度。當治療的瘢痕的色素沉著比未治療瘢痕的色素沉著更接近無瘢痕皮膚時，表明瘢痕的抑制或減少。同樣地，瘢痕可能比周圍皮膚更紅。在這種情況下，當治療的瘢痕的紅色與未治療瘢痕比較，更早褪色、褪色更完全或更類似周圍皮膚的外觀時，表明瘢痕形成的抑制或減少。ii)瘢痕的高度。瘢痕與周圍皮膚比較可典型地升高或降低。當治療的瘢痕的高度比未治療瘢痕的高度更接近無瘢痕皮膚(即無升高和降低)時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iii)瘢痕的表面肌理。瘢痕比周圍皮膚可能具有相對更光滑的表面(瘢痕產生"有光澤的，，外觀)或比周圍皮膚更粗糙。當治療的瘢痕的表面肌理比未治療瘢痕的表面肌理更接近無瘢痕皮膚時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iv)瘢痕的硬度。瘢痕異常的成分和結構意味著它們通常比瘢痕周圍未損傷的皮膚更硬。在這種情況下，當治療的瘢痕的硬度比未治療瘢痕的硬度更接近無瘢痕皮膚時，表明瘢痕形成的抑制或減少。優選地，當根據上文所述肉眼下評定的至少一項參數進行評定時，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。更優選地，根據這些參數中至少兩項參數，甚至更加優選地至少三項參數和最優選地全部四項參數，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。瘢痕形成的全面評定可利用，例如視覺模擬評分(VisualAnalogueScale)或數字評定等級來進行。顯微鏡下瘢痕評定的適合參數可包括i)胞外基質(ECM)纖維的厚度。瘢痕典型地比周圍皮膚包含較細的ECM纖維。這個特性在瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的情況下甚至更明顯。當治療的瘢痕的ECM纖維厚度比未治療瘢痕的ECM纖維厚度更接近無瘢痕皮膚的ECM纖維厚度時，表明瘢痕形成的抑制或減少。ii)ECM纖維的定向。瘢痕中發現的ECM纖維比無瘢痕皮膚發現的那些(經常具有隨機的定向，稱為"籃網狀")傾向於表現出互相之間更高程度的排列。病理性瘢痕，例如瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的ECM可表現出更加不規則的定向，經常形成ECM分子的大的"渦旋"或"嚢"。因此，當治療的瘢痕的ECM纖維定向比未治療瘢痕中的ECM纖維定向更接近無瘢痕皮膚中發現的ECM纖維定向時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iii)瘢痕的ECM成分。瘢痕中存在ECM分子的成分表現出與其在正常皮膚中發現的成分的差異，瘢痕的ECM存在的彈性蛋白數量有所減少。因此，當治療的瘢痕真皮的ECM纖維成分比未治療瘢痕中發現的成分更接近無瘢痕皮膚中發現的這種纖維成分時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iv)瘢痕的細胞結構。瘢痕傾向於比無瘢痕皮膚包含相對少的細胞。因此可理解當治療的瘢痕的細胞結構比未治療瘢痕的細胞結構更接近無瘢痕皮膚的細胞結構時，表明瘢痕形成的抑制或減少。優選地，當根據上文所述的顯微鏡下評定的至少一項參數進行評定時，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。更優選地，根據這些參數中的至少兩項參數，甚至更加優選地至少三項參數，最優選地全部四項參數進行評定，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。治療的傷口的瘢痕形成預防、抑制或減少可進一步根據以下使用的適合參數進行評定i)瘢痕肉眼下的臨床評定，尤其是對個體瘢痕的評定；ii)瘢痕照片圖像的評定；iii)有機矽模具或由瘢痕的有機矽模具製作的陽性石膏模型進行評定；和iv)瘢痕的顯微鏡下評定，例如瘢痕顯微結構的組織學分析。可理解地，治療傷口的瘢痕形成的預防、抑制或減少可通過改善這些適合參數的一項或多項來顯示，在根據大量參數評定預防、抑制或減少的情況下，可根據不同的評定方案將這些參數結合(例如肉眼評定中使用的至少一項參數和顯微鏡下評定中使用的至少一項參數的減少、抑制或改善)。可通過一項或多項參^:的改善表明瘢痕形成的預防、減少或抑制，這顯示根據所選的參數，治療的瘢痕比未治療或對照瘢痕更接近無瘢痕皮膚。瘢痕臨床測量和評定的適合參數可基於多種測量或評定進行選擇，包括由Beausang等(1998)和vanZuijlen等(2002)描述的那些。典型地，適合的參數可包括2.橫禁視#模擬#為\^4》威疾#炎時#定。當與對照瘢痕比較時，由治療的瘢痕的VAS分數的減少，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。在瘢痕評定中使用的適合的VAS可基於Beausang等人(1998)所述方法進行。2.疾疾W/^,、疾症對Jt^、嫂疾WA長、嫂疾時面^4疾疾時謬歡。瘢痕的高度和寬度可直接從個體測量，例如通過利用手工測量裝置例如卡鉗。瘢痕的寬度、周長和面積可直接從個體測量或從瘢痕的照片圖像分析進行測量。本領域技術人員也知道其他非損傷的方法和裝置，所述方法和裝置可用於研究適合的參數，包括有機矽制模、超聲波、光學三維剖析圖和高解析度核磁共振圖像。通過與未治療瘢痕比較，治療的瘢痕的高度、寬度、面積或體積以及其任意組合的減少，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。與屌風無凌疾發歡^較疾疾^^A應和/減盧^。治療的瘢痕的外觀或顏色可與周圍無瘢痕皮膚的外觀或顏色進行比較，將其差異(如果有)與未治療瘢痕的外觀和顏色和無瘢痕皮膚的外觀和顏色之間的差異進行比較。這種比較可在各自的瘢痕和無瘢痕皮膚的視覺評定的基礎上進行。瘢痕的外觀可根據瘢痕是否比無瘢痕皮膚更亮或更暗，來與無瘢痕皮膚比較。瘢痕和皮膚各自的顏色可完美地互相匹配、輕微錯配、明顯錯配或顯著錯配。對於視覺評定可選擇地或另外地，有大量非損傷比色裝置，其能夠提供關於瘢痕和無瘢痕皮膚的色素沉著以及皮膚的紅色(可作為瘢痕或皮膚中存在的血管分布程度的指示)的數據。這些裝置的實例包括MinoltaChronameterCR隱200/300;Labscan600;Dr.LangeMicroColour;皮月夫分光計(DermaSpectrometer)、雷射-都卜勒流速計(laser-Dopplerflowmeter)和皮內分析分光光度法(SIA)。治療的瘢痕的外觀或顏色和無瘢痕皮膚之間差異的量級比未治療瘢痕和無瘢痕皮膚之間差異更小時，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。4.症疾#^多;^*樹'#雜瘢痕的變形可通過瘢痕和無瘢痕皮膚的視覺比較進行評定。適合的比較可將所選的瘢痕分類為無變形、輕微變形、中等變形或嚴重變形。瘢痕的機械性能可利用大量基於吸力、壓力、扭轉力、張力和聲學的非損傷的方法和裝置進行評定。適合的實例包括能用於評定瘢痕機械性能的已知裝置，包括直讀壓痕硬度計、皮膚彈性4義、Reviscometer、粘彈性皮膚分析儀、Dermaflex、硬度計、皮膚扭力計和彈力計。當與未治療瘢痕造成的變形比較時，由治療的瘢痕造成的變形的減少，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。還可理解地，由治療的瘢痕的機械性能比未治療瘢痕更類似於無瘢痕皮膚的機械性能，可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。5.疾症W粉肩;^疾參理瘢痕的輪廓可通過視覺評定的方式進行研究。這種評定中考慮的適合參數包括瘢痕和周圍的皮膚是否為齊平、輕微隆起、輕微鋸齒狀、肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。瘢痕的肌理可根據瘢痕的外觀進行評定，這也可通過當與無瘢痕皮膚比較時，瘢痕例如是否無光澤或有光澤發亮或具有粗糙或光滑外觀的視覺評定來進行。肌理)，與無瘢痕皮膚比較，是否可觸摸到、結實或堅硬來進行評定。瘢痕的肌理也可根據漢密爾頓量表(Hamiltonscale)(Crowe等描述,1998)進行評定。除了上文所述的技術外，有大量的使用光學或機械的方法評定瘢痕的輪廓和/或肌理的非損傷剖析圖裝置。這種評定可在個體的身體上進行，或例如在瘢痕的有機矽模具印模，或由這種印模做出的陽性石膏模型上進行。如果治療的瘢痕具有的i侖廓和肌理比未治療瘢痕更與無瘢痕皮膚相當，則表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。照片評定治療和未治療瘢痕的照片評定可由獨立外行的評定者小組用標準化和校準的瘢痕照片來進行。瘢痕可由獨立外行的小組進行評定以提供分類的評分數據(例如特定治療的瘢痕與未治療瘢痕比較是"較好"、"較差"或"無差異")和使用基於Beausang等(1998)描述方法的視覺模擬評分(VAS)獲得定量的數據。這些數據的取得可利用在申請人共同待決的的專利申請中描述的適合軟體和/或電子系統。昔家,/、逸可選擇地或另外地，治療的和未治療瘢痕的照片評定可由專家評定者小組用待評定的瘢痕的被標準化和校準的照片來進行。優選地，專家小組由適合的本領域技術人員，例如整形外科醫生和適合背景的科學家組成。這種評定可提供分類的數據，如上文所述的或根據所選治療和未治療瘢痕的一段時間過程的圖像比較。所進行的適合的評定可包括出於本發明的目的，最好的瘢痕的鑑別被認為是最類似於周圍皮膚的瘢痕。一旦鑑別出最好的瘢痕，瘢痕間差異的量級可認為是，例如瘢痕之間的輕微或明顯的差異。所考慮的進一步的參數包括瘢痕形成後檢測到瘢痕間差異的最早時間，形成後瘢痕間差異最明顯的時間(或可選擇地在最後評定時間點繼續發現差異)，以及考慮較好的瘢痕是否一貫地保持更好。也要考慮一個瘢痕是否會一貫地比另外一個的更紅和紅色是否會在所認定的時間點後—逸色(或在最後時間點後繼續)以及如果是這樣，則在瘢痕形成後的什麼時間出現。專家小組也可考慮在形成後的什麼時間紅色的任何差異變得可覺察，以及形成後的什麼時間紅色差異最明顯。專家小組也可考慮治療或未治療的一個瘢痕是否一貫地比另一個更白或比無瘢痕皮膚更白。如果白色的差異可覺察，則考慮瘢痕形成後差異可被檢測的時間，差異最明顯的時間和差異消失的時間。專家小組可評定的進一步參數是治療和未治療瘢痕的肌理。在治療和未治療瘢痕的比較中，專家小組可考慮哪個瘢痕具有最好的皮膚肌理，瘢痕形成後所存在的任何差異可被檢測的最早時間，形成後任何差異最明顯的時間和任何差異消失的時間。治療和未治療瘢痕的比較可進一步評定哪個瘢痕是最窄的和哪個瘢痕是最短的。也可考慮瘢痕的形狀和區別於周圍皮膚的瘢痕邊緣的比例。正如與前文所述，還可考慮視覺評定，和色素沉著過度的存在、程度和位置的顏色評定。如上所述，治療和未治療瘢痕性質比較的一種方法是通過顯微鏡評定進行。瘢痕性質的顯微鏡評定可典型地用瘢痕的組織學切片進行。顯微鏡評定和測量瘢痕的過程可考慮基於以下適合參數的分類數據1.表皮重建。特別關注網脊(reteridge)的恢復程度和恢復表皮的厚度。2.血管形成和炎症。可考慮存在血管的數量、存在血管的尺寸和炎症的跡象，包括評定存在的任何水平的炎症。3.膠原組織。在評定膠原組織時，可參考瘢痕中存在的膠原纖維的定向、這些纖維的密度和乳突狀及網狀真皮中膠原纖維的厚度。4.乳突狀真皮和網狀真皮的膠原組織的^L覺才莫擬評分(VAS)評定也可提供有用的瘢痕性質指標。5.評定瘢痕的顯^t鏡下性質時可考慮其他特徵，包括相對於周圍無瘢痕皮膚的瘢痕的升高或降低和正常真皮界面的瘢痕的突出或明顯度。6.可以看出，與對照、未治療或其他適合比較的瘢痕比較，上文描述的評定產生了能提供關於治療的瘢痕是否更好、更差或無差別的指示的瘢痕評分數據。除了分類數據外，可將圖像分析與適合的可視技術結合使用來產生定量數據(優選與上文參數有關的)。可用於評定瘢痕性質的適合可視技術的實例是特異的組織學染色或免疫標記，其中呈現的染色或標記程度可通過圖像分析定量測定。可有效和容易地產生與下列參數有關的定量數據1.瘢痕的寬度、高度、升高、體積和面積。2.上皮的厚度和範圍(例如瘢痕中存在的表皮的面積或具有表皮覆蓋傷口的比例)。3.血管的數量、尺寸、面積(即橫截面)和位置。4.炎症的程度、存在的發炎細胞的數量、位置和種群/類型。5.膠原的組織、膠原纖維的厚度和膠原纖維的密度。通過上文考慮的任何一項參數的變化，可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制，以至於治療的瘢痕比對照或未治療瘢痕(或其他適合的比較物)更類似於無瘢痕皮膚。所討論的評定和參數適合於在動物或人中比較肽與對照、安慰劑或標準護理治療的效果。為了研究結果的顯著性，適當的統計學檢驗可用於分析產生自不同治療的邀:據組。優選地，根據一項以上參數可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。更優選地，根據臨床(即觀察個體)參數和照片參數可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。甚至更加優選地，根據臨床參數、照片參數和顯微鏡下評定參數(例如組織學參數)可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。最優選地，根據臨床VAS分數、外行小組VAS分數以及網狀真皮的評分(來自照片圖像)和顯微鏡下的VAS分數可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。使用本發明適合方法和藥物能使接受如此治療的損傷區域的美觀表徵快速改善。美觀考慮在大量臨床情況中，尤其是當傷口在身體顯著的部位例如臉、頸和手上形成時是重要的。因此，在這些期望改善所形成的瘢痕美觀表徵的部位抑制瘢痕形成(優選地與加速傷口癒合相結合)代表了本發明的優選實施方案。除了它的美觀效果外，皮膚瘢痕形成導致了大量使經受這種瘢痕形成的患者痛苦的不良後果。例如，皮膚瘢痕形成與身體和機械的功能減弱有關，尤其是在收縮性瘢痕(例如肥厚性瘢痕)的情況下和/或跨越關節形成瘢痕的情況時。在這些情況下，對照於無瘢痕皮膚，瘢痕形成皮膚改變的機械性質和瘢痕收縮的效果使受到如此影響的關節(關節連接)運動受到很大限制。因此，優選的實施方案是使用本發明適合的藥物和方法來預防、減少或抑制覆蓋機體關節的傷口的瘢痕形成(優選地也加速這些傷口的癒合)。另一個優選的實施方案是，使用本發明適合的藥物和方法促進傷口的加速癒合，和/或預防、減少或抑制具有增加的形成收縮瘢痕危險的傷口瘢痕形成。瘢痕形成的程度，由此由瘢痕造成的美觀或其他損傷的程度也會受到很多因素，例如傷口形成部位的張力的影響。例如，已知相對高張力下的皮膚(例如遍布胸或與張力線有關的)傾向於比機體其他部位形成更嚴重的瘢痕。這樣在優選的實施方案中，使用本發明適合的藥物和方法促進傷口的加速癒合和/或預防、減少或抑制位於高皮膚張力部位的傷口瘢痕形成。很多外科方法可用於瘢痕修復以使傷口和瘢痕重排，以至於減少它們經受的張力。大概這些中最熟知的是"z字成形術"，其中調換兩個v形的皮膚薄片組織以使張力線旋轉。這樣在更優選的實施方案中，使用本發明這樣的藥物和方法促進傷口的加速癒合和/或預防、減少或抑制外科修復毀容瘢痕過程中傷口的瘢痕形成。病理瘢痕形成比相對嚴重的正常瘢痕形成具有更顯著的不良後果。病理瘢痕普遍的實例包括肥厚性瘢痕和瘢痕瘤。可認識到某些類型的傷口或某些個體傾向於形成病理瘢痕。例如加勒比黑人、日本人或蒙古人種，或那些具有病理瘢痕家族史的個體可能被認為具有增加的形成肥厚性瘢痕或瘢痕瘤的風險。兒童的傷口，尤其是兒童燒傷也與增加的肥厚性瘢痕形成有關。因此，本發明優選的實施方案是使用適合的藥物和方法來促進傷口的加速癒合和/或預防、減少或抑制具有增加的病理瘢痕形成風險的傷口的瘢痕形成。儘管已經經歷了病理瘢痕形成的個體會經受另外過多的瘢痕形成的傾向，但是通常臨床上必須外科修復肥厚性瘢痕或瘢痕瘤，其伴隨有隨後形成病理瘢痕形成的風險。因而，本發明進一步的優選實施方案是使用適合的藥物和方法來促進加速傷口的癒合和/或預防、減少或抑制由外科修復病理瘢痕產生的傷口瘢痕形成。可認識到，燒傷造成的傷口(出於本發明的目的，也可包括涉及熱的液體或氣體的燙傷)會在受到如此痛苦的個體上大面積擴展。因此，燒傷可產生覆蓋患者機體上大部分的瘢痕形成，從而增加了形成的瘢痕覆蓋具有高的美觀重要性的區域(例如臉、頸、臂或手)或機械重要性區域(尤其是覆蓋或圍繞關節的區域)的風險。兒童經常遭受熱的液體造成的燒傷(例如打翻的鍋、壺或類似的)並且由於兒童相對小的身體尺寸，尤其可能造成覆蓋身體大部分的大面積損傷。本發明進一步的優選實施方案是使用適合的藥物和方法來促進傷口的加速癒合和/或預防、減少或抑制燒傷產生的傷口瘢痕形成。如上所述，響應於燒傷的傷口癒合經常與不利的瘢痕形成結果有關，例如形成肥厚性瘢痕。相對大尺寸的燒傷的進一步後果是它們尤其易發生併發症，例如感染和由於缺乏功能性的上皮層造成的脫水。根據上文，可理解的是，本發明適合的藥物和方法可用於燒傷的治療，以減少由傷口產生的瘢痕形成的水平和/或加速功能性的上皮屏障的重建。本發明人已發現，利用本發明的TGF-(33的本發明的藥物和方法能促進上皮再形成。因此這些方法和藥物在涉及上皮層損傷的所有損傷的治療中尤其有效。這些損傷示例有，但不限於上皮受到損傷的皮膚損傷。但是可理解的是，本發明的這樣的方法和藥物也可用於其他類型的上皮受到損傷的傷口，例如涉及呼吸道上皮、消化道上皮或圍繞內部組織或器官的上皮(例如腹膜上皮)的損傷。涉及腹膜(覆蓋內部器官和/或體腔內部的上皮)的傷口癒合經常引發粘連。這種粘連是涉及婦科或腸組織手術的普通結果。本發明人相信，本發明方法和藥物(例如包含序列ID號3、5、7、9或11所列TGF-卩3的那些)加速腹膜再生而減少瘢痕形成的能力，可減少腹膜各部分互相之間不當連接的發生，因而減少了粘連的發生。因此，使用本發明這樣的方法和藥物預防腸或婦科粘連形成了代表本發明的優選的實施方案。事實上，在涉及腹膜的任何傷口癒合中使用本發明這些方法和藥物是優選的實施方案。本發明的方法或藥物可用於預防，例如在無傷口存在但以其他方式會產生瘢痕的傷口或形成慢性傷口的部位。通過實施例，可將本發明的藥物施用到遭受選擇性操作(例如手術)造成的傷口的部位，或被認為具有提高的創傷風險的部位。優選地，本發明的藥物可在大約創傷時或在傷口形成前(例如創傷前直到6小時期間)立即施用到部位，或藥物可在創傷前更早的時間施用(例如傷口形成前直到48小時內)。技術人員理解的是，傷口形成前施用的最優選時間將根據大量因素來決定，所述因素包括所選藥物的製劑和施用途徑、施用藥物的劑量、傷口形成的尺寸和性質以及患者的生物學狀況(根據例如患者的年齡、健康和發生癒合併發症或不利瘢痕形成傾向等來確定)。本發明的方法和藥物的預防性應用是本發明優選的實施方案，在外科傷口的情況下，特別優選用於促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。如果在傷口形成後施用本發明的方法和藥物，也能促進傷口加速癒合和/或抑制瘢痕形成。優選地，這種施用應在傷口形成後儘可能早地進行，但是本發明的藥劑能在直到癒合過程完成前的任何時間(即甚至如果傷口已經部分癒合，本發明的方法和藥物也可用於剩下的未癒合部分的加速傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成)促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。可理解地，可使用本發明方法和藥物促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的"窗口"，取決於所討論的傷口的性質(包括發生損傷的程度、損傷區域的尺寸)。因此在大的損傷的情況下，本發明的方法和藥物在癒合反應中的施用可相對晚一些，但是仍然能促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。優選地，本發明的方法和藥物可例如在傷口形成後的第一個24小時內施用，但如果傷口發生後十天或更長時間內施用，仍然可促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。為了促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成，本發明的方法和藥物根據需要可施用一或多次。例如治療有效量的藥物可根據需要經常給傷口施用，直到完成癒合過程。通過實例，本發明的藥物可在傷口形成後至少前三天糹會傷口一天一次或一天兩次施用。最優選地，本發明的方法和藥物可在傷口形成前後都施用。發明人已發現，本發明藥物在傷口形成前立即施用，接著在創傷後的時間內每天施用這些藥劑，可特別有效的促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。出於本說明書的目的，"藥劑"或"本發明藥劑"是指具生物學或治療活性的本發明的TGF-(33;和/或具生物學或治療活性的本發明的TGF-卩3片段；和/或具生物學或治療活性的本發明的TGF-P3衍生物。本發明的藥劑還可包括編碼本發明TGF-(33(或其片段或衍生物)的核酸。可理解地，所有這些藥劑可根據本發明摻合到藥物裡，可用於本發明的方法或應用。可理解地，本發明藥物應用於傷口的量依賴於大量因素，例如藥物中存在的藥劑的生物活性和生物利用率，在其他因素中還依賴於藥劑的性質和藥物施用的模式。決定藥物的適合治療量的其他因素可包括A)藥劑在受治療個體體內的半衰期。B)待治療的特定狀態(例如急性或慢性傷口)。C)個體的年齡。施用的頻率也受到上文提及的因素，尤其是在受治療個體體內所選藥劑的半衰期的影響。一般地，當將本發明的藥物用於治療現存的傷口時，藥物應在傷口一發生(或在傷口未立刻顯現的情況下，例如在才幾體內部部位的那樣，傷口一經診斷出就施用)時就施用。用本發明的方法或藥物進行治療應持續到癒合過程已經被加速和/或瘢痕形成已經被預防、減少或抑制，直到臨床醫生滿意為止。施用頻率依賴於使用藥劑的生物半衰期。典型地，應將含有本發明藥劑的乳膏或軟膏施用到耙組織，以使藥劑在傷口上的濃度保持在適合產生治療效果的水平。這需要每天一次或甚至每天幾次施用。本發明的藥物可通過能達到期望的促進傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成效果的任何途徑施用，但是優選藥物在傷口部位局部施用。本發明人已發現，促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成可通過在傷口部位注射施用本發明的藥劑實現。例如，在真皮傷口的情況下，本發明的藥劑可通過真皮內注射的方式施用。因此本發明的優選藥物包含本發明藥劑的可注射溶液(例如在上皮損傷部位或可能損傷部位邊緣的周圍注射)。本發明實施方案中使用的適合的製劑在下文考慮。可選擇地或另外地，本發明的藥物也可通過局部的形式施用以促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。這樣施用可作為傷口區域的初期和/或後續護理後的一部分起作用。發明人發現通過本發明藥劑對傷口的局部施用(或在對形成傷口的組織或部位預防性施用的情況下)尤其改善了促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。含有本發明藥劑的組合物或藥物可採取很多不同的形式，尤其依賴於它們被使用的方式。因此，例如它們可以為液體、軟膏、乳劑、凝膠、水凝膠、粉末或氣溶膠的形式。所有這些組合物適合對傷口局部施用，是對需要治療的個體(人或動物)施用本發明藥劑的優選方式。本發明的藥劑可以由無菌敷料或貼片的形式提供，其可用於覆蓋傷口或所治療上皮損傷的其他部位。可理解地，包含本發明藥劑的組合物的賦形劑應被患者很好地耐受，使得藥劑對傷口釋放。這種賦形劑優選是生物可降解、生物可溶解、生物可吸收和/或非炎性的。包含本發明藥劑的藥物和組合物可以很多方式使用。因此，例如為了促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成，組合物可應用於傷口內部和/或周圍。如果組合物應用於"現存的，，傷口，那麼藥劑學可接受的賦形劑將是相對"溫和的"，即賦形劑是生物可相容的、生物可溶解和非炎性的。本發明的藥劑，或編碼這種藥劑的核酸(下文進一步考慮)，可摻入緩釋或延遲釋放的裝置。這些裝置可例如放在或插入皮下，藥劑或核酸可在數天、數周或甚至數月內釋放。這種裝置對於需要長期促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的患者(例如經受慢性傷口的那些)尤其有用。當用於通常要求頻繁施用(例如通過其他途徑至少每天施用)的藥劑或核酸施用時，該裝置尤其有利。本發明藥劑的每日劑量可以單次施用(例如局部製劑的每日應用或每曰注射)。可選擇地，本發明的藥劑一天內可能需要施用兩次或多次。進一步可選擇地，緩釋裝置可用於對不需要施用重複劑量的患者提供本發明藥劑的最佳劑量。在一個實施方案中，用於本發明藥劑施用的藥學賦形劑可為液體，適合的藥學組合物將採取溶液的形式。在另一個實施方案中，藥學可接受的賦形劑是固體，適合的組合物採取粉末或片劑的形式。在進一步的實施方案中，本發明藥劑可配製成為藥學可接受的經皮貼片的一部分。固體賦形劑可包括可作為調味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮輔助劑、粘合劑或片劑崩解劑的一種或多種物質；也可是包嚢材料。在粉末中，賦形劑是細碎的固體，所述固體與細碎的本發明的藥劑混合。在片劑中，本發明藥劑以適合比例與具有必要壓縮特性的賦形劑混合，以期望的形狀和尺寸壓制。優選地，粉末和片劑含有達到99%的本發明藥劑。適合的固體賦形劑包括，例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、澱粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點蠟和離子交換樹脂。液體賦形劑可用於製備溶液、懸浮液、乳劑、糖漿劑、酏劑和加壓的組合物。本發明的藥劑可在藥學可接受的液體賦形劑，例如水、有機溶劑、藥學可接受的油或脂肪或其混合物中溶解或懸浮。液體賦形劑可含有其他適合的藥學添加劑例如增溶劑、乳化劑、緩沖液、防腐劑、甜味劑、調味劑、懸浮劑、增稠劑、色素、粘度調節劑、穩定劑或滲透調節劑。口服和腸胃施用的液體賦形劑的適合實例包括水(部分包含上文的添加劑，例如纖維素衍生物、優選羧曱基纖維素鈉溶液)、醇(包括單羥基醇和多羥基醇，例如乙二醇)和它們的衍生物以及油(例如分餾的椰子油和花生油)。對於腸胃外施用，賦形劑也可為油酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。無菌液體賦形劑在用於腸胃外使用的無菌液體形式組合物中是有利的。加壓組合物的液體賦形劑可為卣代烴或其它藥學可接受的推進劑。液體藥學組合物的無菌溶液或懸浮液可以例如以肌內、鞘內、硬膜外、腹腔內、皮內、基質內(角膜)或皮下注射的方式使用。無菌溶液也可靜脈施用。本發明藥劑可製備成無菌固體組合物，可在施用時用無菌水、鹽水或其它適合的無菌可注射介質溶解或懸浮。賦形劑傾向於包括必要和惰性的粘合劑、懸浮劑、潤滑劑和防腐劑。在期望以口服攝取的方式施用本發明藥劑的情況下，可理解地，所選的藥劑將優選為具有提高程度的抵抗降解的藥劑。例如，本發明藥劑可被保護(例如用上文所述的技術)，以便降低其在消化道中的降解速率。本發明藥劑的組合物適合用於促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制角膜內的瘢痕形成。角膜傷口可由意外傷害(如上文考慮的)或外科手術(例如角膜的雷射手術)造成的眼外傷引起。在這種情況下本發明優選的藥物是滴眼劑的形式。本發明藥劑可應用於一系列"內部的"傷口(即傷口發生在機體內，而不是在外表面上)。因此，例如可配製本發明的藥物供吸入用於肺或其它呼吸道上皮產生的傷口。已知的，例如那些藥學領域常規使用的方法(例如在體內實驗、臨床試驗等中)，可用於建立包括本發明藥劑的組合物的特殊製劑和這些組合物施用的精確治療方案(例如活性藥劑的每日劑量和施用的頻率)。本發明的藥劑能促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的適合的每日劑量，依賴於一系列因素包括(但不限於)傷口組織的性質、治療傷口的面積和/或深度、傷口的嚴重性和形成病理性瘢痕或慢性傷口的誘病因素的存在或缺乏。通過例子，可以通過局部注射施用到傷口或上皮損傷部位的活性劑總量優選為每釐米線性傷口或上皮損傷區域約50ng/100|iL。這種劑量可一天給予一次延續三天，因而提供的總劑量是150ng/釐米線性傷口或上皮損傷。在局部應用到急性傷口或上皮損傷部位的情況下，活性劑的適合量可優選為約100ng/cm2。這種劑量可一天給予一次延續三天，因而提供的總劑量是300ng/cm2傷口或上皮損傷。通過進一步的實例，每日施用給傷口或上皮損傷部位的活性劑的優選量可為約50ng/cm線性傷口或上皮損傷(如果注射施用)或約100ng/cn^傷口或上皮損傷(如果局部施用)。通過進一步的例子，在單次發病治療中可施用給傷口或上皮損傷部位的活性劑的量可優選為約50-200ng/cm線性傷口或上皮損傷(如果注射施用)，或約100-300ng/cn^傷口或上皮損傷(如果局部施用)。治療傷口或其它上皮損傷部位需要的本發明的藥劑量典型地為每24小時每釐米線性傷口或上皮損傷施用1pg到1mg藥劑，儘管這個數字可根據上文概括的因素向上或向下修正。藥劑可優選地以1pg/100|iL-lmg/100!iL的藥劑溶液的形式提供，24小時期間每釐米線性傷口或上皮損傷施用100fxL這種i容液。更優選地，藥劑以10pg/100iiL-100(ig/100的溶液施用，24小時期間每釐米線性傷口或上皮損傷施用100|LiL這種溶液。最優選地，藥劑以1ng/100[iL-1000ng/100|iL的溶液施用，24小時期間每釐米線性傷口或上皮損傷施用100jiL這種溶液。一般地，包括本發明藥劑的組合物應被配製使得當給傷口施用時藥劑濃度達到每釐米線性傷口或上皮損傷0.79pM至0.79mM。優選地，藥劑以每釐米7.9pM至0.079mM的濃度提供。本發明藥劑的(例如序列ID號3至8的肽)施用濃度可為0.79pM至0.79mM。優選地，本發明藥劑的施用濃度可為7.9pM至0.079mM。最優選地，本發明藥劑的施用濃度可為0.79nM至0.79pM。純粹通過實例，當皮內注射施用並以100|iL每釐米線性傷口邊緣給藥，含有濃度為10pg/100(iL至100嗎/100jiL的本發明藥劑(例如序列ID號3、5、7、9或11的TGF-P3)的可注射溶液適合於用來促進真皮傷口加速癒合和/或抑制瘢痕形成。在序列ID號3的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優選劑量為約1ng/100pL-1000ng/100每cm線性傷口邊緣施用約100|iL的這種溶液。在序列ID號5的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優選劑量為約1ng/100pL-1000ng/100|_iL，每cm線性傷口邊緣施用約100jiL的這種溶液。在序列ID號7的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優選劑量為約1ng/100(iL-1000ng/100nL,每cm線性傷口邊緣施用約100的這種溶液。在序列ID號9的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優選劑量為約1ng/100(iL-1000ng/100jaL，每cm線性傷口邊緣施用約100jiL的這種溶液。在序列ID號11的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優選劑量為約1ng/100[iL-1000ng/100fiL，每cm線性傷口邊緣施用約100的這種溶液。本發明的藥劑可作為單一療法(例如通過單獨使用本發明的藥物)用於促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。可選擇地，本發明的藥物或方法可用於與其它促進傷口癒合或抑制瘢痕的化合物或治療結合。本發明人發現，本發明的TGF-(33可在糖存在時有利地配製。這種糖可為還原或非還原糖和/或其磷酸酯或其磷酸酯衍生物。這些糖的實例可選自，但不限於選自由麥芽糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯醣、甘露醇、蔗糖、果糖、右旋糖和葡萄糖組成的組的那些。優選的糖可選自由麥芽糖和海藻糖組成的組。可理解地，通過包括編碼這些分子的核酸序列的細胞表達技術，包含本發明TGF-P3的肽可代表有利的施用藥劑。這些細胞表達的方法尤其適合醫療應用，其中需要長期的肽的治療效果，例如在期望其長時間增強有缺陷的傷口癒合反應的情況下。尤其優選的是，通過細胞表達施用的TGF-P3包括序列ID號3、5、7、9或11定義的那些肽或其片段或衍生物。編碼這些肽的核酸在序列ID號4、6、8、10或12中列出。給組織例如傷口施用本發明肽藥劑的很多已知方法具有如下缺點由於肽藥劑在體內的半衰期短，即使幾天的過程也^[艮難達到本發明藥劑在治療部位上的持續水平。藥劑的半衰期短出於^[艮多原因，包括(i)被蛋白酶和類似物的降解。(ii)被結合蛋白的清除。(iii)被胞外基質分子結合和抑制藥劑活性。而且，用於促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥劑需要在適合的賦形劑內施用，並且經常以包含藥劑和賦形劑的組合物的形式提供。正如所討論的，優選地這些賦形劑是非炎性、生物可相容的、生物可吸收的並且必須不能使藥劑降解或失活(貯存或使用中)。然而，經常難以提供令人滿意的賦形劑以將藥劑遞送到具有待治療傷口的組織。排除或減輕這些問題的便利方法是，通過基因治療的方式提供治療有效量的本發明藥劑到待治療的區域。本發明第四方面提供了用於基因治療技術的遞送系統，所述遞送系統包括編碼選自下述組的肽的DNA分子序列ID號3、序列ID號5、序列ID號7、序列ID號9和序列ID號11,所述DNA分子可淨皮轉錄導致被選擇肽的表達。本發明第五方面提供了前段定義的遞送系統用於生產應用於促進加速傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥物的用途。本發明第六方面提供了上述定義的遞送系統用於生產應用於促進上皮再生的藥物的用途。本發明第七方面提供了促進加速傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括施用給需要這種治療的患者治療有效量的由本發明第九方面定義的遞送系統。本發明第八方面提供了促進上皮再生的方法，所述方法包括施用給需要這種治療的患者治療有效量的由本發明第九方面定義的遞送系統。由於遺傳密碼簡併性，顯然編碼適合本發明應用的藥劑的核酸序列是可不同的或可變的，並且基本上不會影響被編碼產物的序列，以提供其功能變體。可用於編碼由序列ID號3、5、7、9或11定義的肽的可能的核酸的序列對技術人員是明顯的，技術人員可參考由分別作為序列ID號4、6、8、10或12而提供的例子。本發明的遞送系統非常適合於在比大多數傳統遞送系統可能的時段更長的時段內在傷口處獲得持久水平的本發明的藥劑。適合促進加速傷口癒合和/或抑制瘢痕形成的本發明藥劑可從傷口部位的細胞持續表達，所述細胞經過由本發明第四方面公開的DNA分子轉化。因此，即使本發明的藥劑在體內有非常短的半衰期，治療有效量的藥劑仍可從被治療組織持續表達。此外，本發明遞送系統可用於提供DNA分子(和由此的本發明的藥劑)而不需要使用傳統的藥物賦形劑，例如在接觸傷口的軟膏或乳劑中所需要的那些l武形劑。本發明的遞送系統優選使DNA分子能夠表達(當遞送系統施用患者時)產生由序列ID號3、5、7、9或11組成的組定義的肽或這些肽的片段或衍生物。DNA分子可被包含在適合載體內以形成重組載體。載體可例如是質粒、粘粒或噬菌體。所述重組載體非常適合於用DNA分子轉化細胞的本發明的遞送系統。重組載體也可包括其它功能性元件。例如，重組載體可被設計以使載體在細胞核內自主複製。在這種情況下，誘導DNA複製的元件在重組載體內是必需的。可選擇地，重組載體可這樣設計以將載體和重組DNA分子整合進細胞的基因組。在這種情況下，利於把向整合的(例如通過同源重組)DNA序列是期望的。重組載體也可含有編碼用作克隆過程中可選擇標記物的基因的DNA。重組載體也可進一步根據需要包含控制基因表達的啟動子或調節子。DNA分子可(^旦不必須)整合進受治療個體細胞的DNA內。未分化細胞可被穩定地轉化，引起遺傳改變的子細胞的產生。在這種情況下，需要對受治療個體的表達進行調控，例如用特異的轉錄因子、基因激活子或更優選地用可誘導的啟動子，其可轉錄響應於在傷口中發現的特異信號的基因。可選擇地，遞送系統可設計為利於受治療個體未分化細胞的不穩定或瞬時轉化。在這種情況下，因為當轉化細胞死亡或停止表達蛋白時(理想地當實現促進傷口加速癒合並減少瘢痕形成時)DNA分子的表達將終止，所以表達調控的重要性變小。遞送系統可給個體糹是供沒有整合進載體的DNA分子。例如，DNA分子可整合進脂質體或病毒顆粒。可選擇地，"棵"DNA分子可通過適合的方式例如直接內吞攝取插入個體的細胞。DNA分子可通過轉染、感染、微注射、細胞融合、原生質體融合或基因槍轟擊的方式轉移到個體的細胞內。例如，轉移可通過用包被的金顆粒、包含DNA分子的脂質體、病毒載體(例如腺病毒)的基因槍轉染和通過直接應用質粒DNA到局部傷口或注射來直接提供DNA攝取(例如內吞)的方式進行。本發明藥劑的細胞表達可以是通過傷口周圍無損傷區域的邊緣的細胞，或可選擇地通過治療性引入傷口的細胞(例如培養的與傷口癒合反應有關的內源或外源細胞)。可理解地，被治療性誘導促進傷口加速癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的細胞可體外操作，以使它們可表達增加水平的本發明藥劑，接著引入傷口區域。優選地，這些細胞是體外培養用於製備或製造在促進傷口癒合中使用的人造皮膚或皮膚取代物的細胞。更優選地，細胞是自體同源的細胞，儘管可理解地任何適合細胞都可用。因此，本發明第九方面中提供了包含被誘導表達本發明藥劑的細胞的藥物。本發明藥劑細胞表達的誘導可通過將核酸整合進細胞的方式實現，所述核酸可使本發明適合使用的藥劑表達。現在，本發明將通過實施例進一步描述，參考以下實驗方案和研究以及附圖，其中表1顯示指示在a螺旋結構中涉及的胺基酸殘基傾向性的值；表2顯示提及本發明突變體TGF-(33時所使用名稱的詳細內容；表3顯示野生型TGF-P3和本發明TGF-(33再摺疊效率；表4對比了野生型TGF-卩3和Gly63-Ala(—種本發明的TGF-(33蛋白)的生物活性，通過細胞生長抑制測定評價；表5顯示體內傷口癒合研究中使用的反應物濃度；表6顯示體內傷口癒合研究中使用的反應物濃度；圖1顯示TGF-p3'野生型，在苯基-瓊脂糖凝膠柱的層析圖；圖2顯示TGF-(33'野生型，單體和二聚體在UN0-S1柱中的層析圖；圖3顯示通過考馬斯藍染色的SDS-PAGE比較TGF-(33突變蛋白和'野生型，TGF-(33(請注意更換Gly63-Ala和Gly63-Pro突變體蛋白的緩沖液會導致一些樣品損失，因此加入凝膠中的實際濃度會比所陳述的3jig少一些)；圖4顯示用於切口創傷的模板；圖5顯示用野生型TGF-卩3或本發明TGF-p3治療切入性傷口(A和B)第3天的平均肉眼評定分數，其中"*"表明與未治療傷口相比顯著增強的癒合(p〈0.05);圖6是用'野生型，和突變型TGF-P3蛋白治療切口創傷(C和D)第3天的顯微鏡下平均傷口寬度；圖7顯示用於切入性創傷的模板；圖8說明了用'野生型，TGF-(33、Gly63-Ala和Gly63-Pro治療傷口的肉眼瘢痕評分(第70天)；圖9說明了用'野生型，TGF-(33、Gly63-Ala和Gly63-Pro治療傷口的肉眼瘢痕圖像(第70天)；圖10說明了用'野生型，TGF-(33、Glul2-Ser和雙絲氨酸突變體(Glul2陽Ser和Arg52-Ser)治療傷口的肉眼瘢痕評分(第70天)，其中"+"表明與安慰劑治療傷口相比顯著降低的瘢痕形成(p0.05)。圖11說明了用'野生型，TGF-P3、Glul2-Ser和雙絲氨酸突變體(Glul2-Ser和Arg52-Ser)治療傷口的肉眼瘢痕圖像(第70天)；圖12說明了用'野生型，TGF-(33、Gly63-Pro和Gly63-Ala突變蛋白治療傷口的代表性顯微鏡瘢痕圖像(創傷後70天)；以及圖13說明了用Glul2-Ser和雙絲氨酸突變體(Glul2-Ser和Arg52-Ser)在創傷後70天治療傷口的代表性顯微鏡瘢痕圖像。特別感興趣的序列的詳細內容在"序列信息"部分提供。實驗方案和結果1.本發明第一和第二方面的TGF-P3的產生、生產、再摺疊和純化。1.1cDNA的產生源於人切入性傷口的總RNA(創傷後第5天取樣)用DNA-Free(Ambion)處理以除去任何汙染性DNA。用總RNA作為才莫板，TGF-(33的cDNA通過逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)產生。RT-PCR的反應混合物是由BrilliantQRT-PCRCoreReagentKit，一步法(Stratagene)製備的。將1微克RNA加入到50pL的溶液，所述溶液含有一步QRT-PCR緩衝液、0.2mMdNTP、3.5mMMgCl2、lpLStrataScript逆轉錄酶、2.5單位Taq聚合酶、0.4pM有義引物(5'GATATACCATGGCTTTGGACACCAATTACTACTGC3')和0.4pM有義引物(5'-CAGCCGGATCCGGTCGACTCAGCTACATTTACAAGAC3')。反應在熱循環器(HybaidPCRExpresses)中發生，並且按照下列條件進行45。C30分鐘，95。C10分鐘，然後是40個循環的95°C30秒、65°C1分鐘和72。C1分鐘。最後的步驟是72°C10分鐘。PCR樣品用2。/。(w/w)瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小，並用WizardPCRPrepKit(Promega)純化。1.2質粒的構建pET-3d載體來自pBR322載體，並且包含LacUV5控制的T7啟動子和氨苄西林抗性標誌物基因。TGF-P3的cDNA片段(3.2部分中產生的)被亞克隆進pET-3d的NcoI和BamHI位點(分別是5'-3')。產生的連接接著被轉化進XLIOGold細胞(Stratagene)並進行菌落PCR分析來定位包含插入物的克隆。使最後的克隆生長並用Qiaprep⑧Spin小量製備試劑盒(Qiagen)將質粒DNA提取進水中。質粒用T7啟動子引物(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')和T7終止子引物(5'誦GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')測序和驗證。1.3定向誘變從1.2部分獲得的'野生型，TGF-(33構建體經過定向誘變產生兩種編碼TGF-f33突變蛋白的突變構建體。構建體/突變體的名稱和核酸序列變化總結於表2。經過誘變的核苷酸位置在序列信息部分顯示。體外定向誘變方法是基於Stratagene'sQuickChange⑧定向誘變試劑盒。100ng質粒(來自L2部分)力。入到溶液中，所述溶液含有2.5pL10xQuickChange多反應緩衝液、Quick溶液、1OOng的誘變引物、1mLdNTP混合液、PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene)，用雙蒸餾水補充到2.5mL終體積。反應在熱循環器(HybaidPCRExpresses)中發生，並且在下列條件下進行95°C1分鐘，30個循環的95°C1分鐘、55。C1分鐘，最後一步是65。C2分鐘。一旦熱循環結束，將反應物在冰上放置2分鐘以使溫度降到37。C以下。lpLDpnI限制性酶(lOU/(iL)加入到每個反應中徹底混勻。對反應混合物進行離心(用SorvallBiofbge,10,000rpm/min),然後在37。C溫育消化雙親的雙鏈DNA。每個誘變反應中1-5DpnI處理的DNA加入45|iL活化的XLI-Blue大腸桿菌(Stratagene)和2|iLp-ME混合液(Stratagene)。將所述混懸液混合併且在冰上溫育30分鐘。所述混懸液用42。C水浴加熱30秒。所述混合物在冰上再溫育2分鐘。0.5mL預加熱(42。C)的NZY+肉湯加入到每一個細胞懸液中。轉化肉湯在225-250rpm條件下振動孵育1小時。每個誘變反應的轉化肉湯中取出lpL、10(iL和lOO(iL塗布到LB瓊脂平板上，並在37。C溫育18小時，所述LB瓊脂平板含有100jig/mL的氨千西林(Sigma)、80jig/mL的5-澳-4-氯-3-吲哚-(3-D-他喃半乳糖苷(X-gal,Stratagene)和20mM的異丙基P-D-硫代吡喃半乳糖普(IPTG,Sigma)。藍色菌落含有突變的質粒。從瓊脂挑出每種突變型的單菌落，然後接種到10mL含有100|ig/mL氨千西林的LB培養基上。用QIAprepSpin小量製備試劑盒(Qiagen)分離質粒。使用pQEfor和pQERev引物測序質粒並驗證正確的突變。1.4轉化和克隆10!iL(50ngVl)質粒DNA(來自1.2和1.3部分)力口入到lmL冷的(4。C)感受態的大腸桿菌BL21(DE3)pLysSSingles細胞(Novagen)。20分鐘後將所述細胞在42。C水浴溫育30秒熱激。lOO^iL的Psi培養基加入到細胞/質粒混合液中並在37。C振蕩90分鐘。50(xL和lOO^iL等分試樣塗布到含有100嗎/mL的氨千西林(Sigma)LB瓊脂平板上並在37。C溫育18小時。單菌落被培養，並產生細胞凍存物，在-80。C條件保存。分析細胞凍存物的質粒DNA從，以驗證正確的轉化。1.5表達復甦凍存的轉化的大腸桿菌細胞(來自1.4部分)的安瓿，接種到含有100mLLB培養基和100嗎/mL氨千西林的封口的Erle腿eyer燒瓶裡。燒瓶振蕩溫育，37。C過夜。將5mL這種過夜的培養物加入到2升的Erlenmeyer燒瓶(500mLLB培養基/和100嗎/mL氨千西林)並在37°C振蕩溫育。每小時取2mL肉湯樣品，追蹤其生長和TGF-(33"野生型，，和突變型蛋白的表達(誘導後)。生長由分光光度計測量在波長600nm的吸收來確定。當測得的吸收是0.6Abs時，通過加入異丙基(3-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)至終濃度1mM來誘導細胞表達"野生型"和突變型TGF-(33蛋白。培養物再多溫育4小時。0.5mL肉湯樣品離心沉澱(SorvallBioftige10,000rpm離心10min)，棄去上清液。沉澱在50|iL十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)樣品緩衝液中重懸浮，並在95。C水浴中加熱10分鐘。將10樣品加到SDS-PAGE上。SDS-PAGE和考馬斯藍染色(如A.TAndrews(1986)描述的)用HoeferMightySmallSE245DualGelCaster(Amersham)進行。凝膠厚度是1mm,含有15%(v/v)聚丙烯醯胺凝膠。1.6細胞收集和包涵體的分離來自1.5部分的細胞通過在帶有4315轉頭的HettichRotina46R離心機中，以5000g離心10分鐘而沉澱。於4。C進行細胞破碎和不溶性(包涵體)TGF-卩3蛋白的回收。細胞在pH8.3的50mL100mMTris/HCl(Sigma)和10mMEDTA(Sigma)中懸浮，用SanjoSoniprep150超聲破碎。加入0.2%(w/w)TritonX-100(Sigma),將懸浮液攪拌l小時。懸浮液15，000g離心40分鐘。沉澱在以12,000g離心40分鐘之前，於pH8.3的50mL100mMTris/HCl和10mMEDTA中重懸浮。1.7包涵體的溶解來自1.6部分的沉澱在40mL8M尿素l%(w/w)DL-二硫蘇糖醇(DTT)中重懸浮，並在HeidolphDiax900勻漿機中破碎。懸浮液加蓋並攪拌1小時以溶解包涵體，將TGF-P3"野生型"和突變型蛋白還原成它們的單體形式。接著懸浮液以15,000g離心30分鐘。將上清液透析以-使緩衝液乂人8M尿素(ICNBiomedical)換成10%(v/v)醋酸。當緩衝液交換到10%(v/v)醋酸時，溶於8M尿素的E.coli蛋白從溶液沉澱出來。將1%(w/w)DTT(Sigma)加入懸浮液中，加蓋並攪拌30分鐘以便還原緩沖液交換過程中TGF-(33單體間形成的任何二硫鍵。以12,000g離心懸浮液40分鐘以便分離可溶和不溶的蛋白。尿素溶解和緩沖液交換步驟取出的樣品(醋酸可溶和不溶物質)，接著用SDS-PAGE分析。1.8超濾來自1.7部分的10%(v/v)醋酸可溶物質用10kDa膜在Vivoflow50(Vivascience)中進行超濾。這樣做的目的是減少10%(v/v)醋酸懸浮液的體積到3mL，以及除去低分子量的蛋白(<10kDa)。1.9凝膠過濾來自1.7部分的樣品用Hiprep26/60SephacrylS-100高分辨柱(Amersham，320mL)在10。/。(v/v)醋酸1.5mL/min流速下層析分離。包含單體的變性的TGF-卩3部分(在100至140分鐘之間洗脫)被收集。1.10冷凍乾燥包含變性單體TGF-P3的收集部分用IECLyoprep-3000冷凍乾燥器冷凍乾燥，以^v樣品中除去醋酸和水。1.11再摺疊來自1.10部分的凍幹的單體TGF-(33在含有10mMDTT的8M尿素中溶解，直到達到10mg/mL的TGF-p3終濃度。在攪拌的同時，將TGF-(33溶液逐滴加入再摺疊溶液(1M3-(-吡啶並)-l-丙烷磺酸鹽(NDSB-201)、20%(v/v)二曱基亞碸(DMSO,Sigma)、2%(w/v)3-(3-膽醯胺丙基)二曱銨基-l-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、1MNaCl(Sigma)、1%(w/v)還原型穀胱甘肽(GSH,Sigma)和0.05MTrizmaBase(Sigma)pH9.3)直到0.2mg/mL的TGF畫卩3終濃度。重要的是用濃NaOH/HCl將pH保持在9.2-9.4的範圍內。溶液用石蠟封口膜(Parafilm)封口，石蠟封口膜上打孔以允許單體TGF-p3氧化，並在8。C攪拌。144小時後將溶液15,000g離心40分鐘，去除形成的沉澱，pH用冰醋酸調整為pH3.5。上清液含有二硫化物連接的二聚體TGF-(33，其通過SDS-PAGE(非還原的)和Western印跡進行測定。SDS-PAGE如2.1部分中所描述的進行。至於Western印跡，樣品被加載到lmm厚、15%(v/v)的聚丙烯醯胺凝膠中。一旦電泳結束，使用TE22Western印跡裝置(Pharmacia)將凝膠內的蛋白電泳轉移到硝化纖維膜(Sigma)上，按其指導手冊說明的。硝化纖維膜上非特異結合位點被封閉緩沖液(5。/。(w/v)脫脂奶粉，l%(v/v)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸S旨(Tween20,Sigma),於磷酸鹽緩沖鹽水(Invitrogen)中)封閉。然後所述硝酸纖維素膜用洗滌緩沖液(PBS,0.1%Tween20)洗滌。然後將所述硝化纖維膜用一抗(MAB643(R&D體系))溫育1小時，所述一抗是用含0.1%(v/v)Tween20的PBS以1:500稀釋。所述硝化纖維膜經再次洗滌，然後與山羊抗鼠抗體(Abcam)的二抗溫育1小時，所述二抗是用含0.1。/。(v/v)Tween20的PBS以1:3000稀釋。將所述硝化纖維膜最後洗滌一遍，然後加入ECL試劑(Amersham)使抗原-抗體複合物顯影。在暗室中所述硝化纖維膜在浸於顯影劑、固定劑和終止液前用X射線膠片曝光。然後使所述硝化纖維膜乾燥。再摺疊的TGF-P3'野生型，和突變型單體蛋白顯示了不同水平的二聚體形成。從其他非正確再摺疊或非二聚體TGF-(33蛋白回收正確摺疊的二聚體的百分比在表3中顯示。有趣的是，TGF-P3蛋白的a螺旋內的胺基酸置換對再摺疊產率(二聚體形成)產生最大影響。用精氨酸置換甘氨酸穩固a螺旋會使再摺疊產率從20%增加到50%。相反，用脯氨酸置換甘氨酸a螺旋破壞，會導致低得多的二聚體形成百分比。這說明a螺旋在形成正確再摺疊TGF-P3分子中起重要作用。置換參與'鹽橋，形成的胺基酸，不影響再摺疊產率。1.12疏7jC相互作用色鐠1.11部分的復性溶液用在Vivoflow50(Vivascience)上10kDa(分子量截留)膜超濾濃縮到50mL。所述復性溶液用含有2M硫酸胺(Sigma)和10。/。(v/v)醋酸的溶液1:1稀釋。填充有苯基-瓊脂糖凝膠快流速(Amersham)的2mlBiorad柱用緩衝液A(1.0M硫酸胺和10。/。(v/v)醋酸)平衡。20mL稀釋的復性溶液以1mL/min的流速(整個過程都使用這個流速)加到所述柱中。然後用緩衝液A洗柱直到280nm的吸光度讀數達到基線水平(10mL)。然後加入100。/。緩衝液B(10。/。(v/v)醋酸30。/。(v/v)異丙醇)到柱中。收集第一個峰，所述峰含有TGF-(33蛋白的單體和二聚體形式(見圖1)。1.13陽離子交換色鐠陽離子交換色譜用來把二聚體TGF-(33蛋白從單體中分離出來。2mLUN0-S1柱(Biorad)用緩衝液A(含有10。/。(v/v)醋酸，30。/。(v/v)異丙醇)平衡。從3.12部分收集的部分以lmL/min的流速加到UN0-S1柱上。然後用緩沖液A洗柱直到280nm的吸光度讀數達到基線水平(5分鐘)。線性梯度運行5分鐘，以60%1￡沖液a和40%緩衝液B(10。/q(Wv)醋酸、30。/。(v/v)異丙醇和1MNaCl)的混合液結束。所述緩沖液混合液的加入要再維持15分鐘。單體TGF-P3在樣品注入10分鐘後/人柱中洗脫出來。再4吏用第二個線性梯度運行5分鐘，用100。/。緩衝液B維持IO分鐘結束。二聚體TGF-P3在樣品注入後30分鐘/人柱中洗脫出來(見圖2)。1.14超濾/'滲濾1.13部分中含有純化的單體和二聚體TGF-(33分子的部分經過超濾/滲濾來把緩衝液更換為20mM醋酸、20。/。(v/v)異丙醇，然後濃縮樣品到約10mg/mL(TGF-p3濃度由紫外分光光度計測定)。帶有10kDa截留的Vivoflow50(Vivascience)用來更換緩衝液和濃縮樣品。2.本發明TGF-P3的體外特性2.1SDS-PAGE分才斤純化的本發明TGF畫卩3純化的TGF-P3突變蛋白(來自1.14部分)用SDS-PAGE評價確定純度和分子量。由於來自3.14部分TGF-(33突變樣品的低pH,緩衝液用蛋白質脫鹽洗脫柱(Pierce)更換成SDS-PAGE樣品緩衝液。3嗎純化的TGF-(33突變蛋白(還原的或非還原的樣品)、3昭'野生型，TGF-P3陽性對照(還原的和非還原的)和10[iLInvitrogenMark12分子量標準品加到聚丙烯醯胺凝膠中(10。/。-20。/。(v/v)梯度的丙烯醯胺)。一旦電泳結束，凝膠就用考馬斯藍染色。如所預料的'野生型，TGF-(33和Gly63-Ala突變蛋白跑到了凝膠的相同位置(對於還原的樣品為約13kDa，對於非還原樣品為約25kDa)。有趣的是沒有Gly63-Pro突變蛋白條帶在非還原膠中檢測出來但是在還原膠中檢測出來。由於Gly63-Pro再摺疊效率非常低(〈1。/。)，可能會產生低於考馬斯的檢測水平(>1昭)的多種再摺疊種類。然而當這些種類被還原後，還原的Gly63-Pro單體濃度就高於l(ig的考馬斯染色檢測限，因此Gly63-Pro能在還原膠中看到。還原的Gly63-Pro蛋白條帶位置比'野生型，TGF-(33條帶位置稍高。這正是所預期的，因為63位置上甘氨酸用脯氨酸的置換使得Gly63-Pro突變蛋白的分子比'野生型，TGF-卩3大(見圖3)。2.2對比本發明的TGF-卩3和野生型TGF-P3的生物活性的細胞生長抑制測定細胞生長抑制測定(AMeager,1991)是一種TGF-p分子體外生物活性測驗。比色測定是基於TGF-P分子對水貂肺上皮細胞(MinkLungEpithelialcells)(MLEC)的生長抑制作用。將包含下述物質的100jiL的細胞混懸液加入到96孔組織培養板中的每一孔1x104MLEC細胞/mL和完全培養基(DMEM(Invitrogen),0.01MHepesi爰沖液(Invitrogen),2mML-穀氨醯胺(Invitrogen)、L-精氨酸(Invitrogen)、L-天冬醯胺(Invitrogen),100單位/mL青黴素(Invitrogen)，50昭/mL鏈黴素(Invitrogen)和5%胎牛血清(Invitrogen))。經過37。C、5%C02過夜溫育後，100pL系列稀釋(10pg/mL到500pg/mL)的二聚體TGF-卩3突變樣品(來自3.14部分)力。入到所述板中。對照孔加入200|iL完全培養基和10%(v/v)0.25M麥芽糖。所述板再溫育120小時，50pL的2mg/mL3-[4,5-二曱基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鐵噻唑蘭(MTT，Sigma)加入到每孔中。所述板再溫育4小時然後除去培養基。lOO)iL的0.05MHC1(BDH)、無水異丙醇(BDH)力口入到每孔中，然後對得到的溶解的曱月替(formazan)用全自動定量繪圖酶標儀(Victor21420)在570nm定量測定。Gly63-Ala、本發明的TGF-卩3在濃度範圍0-500pg/mL時對MLEC細胞有抑制效果。從表4可以看出，Gly63-Ala突變蛋白的IC50為34pg/mL,對比於'野生型，TGF+3的ICso為26pg/mL。2.3絲醋列分析來自3.14部分50微升純化的'野生型，和突變型TGF-(33樣品被真空乾燥然後用20nL含有50mMNH4HCO^p10%(v/v)乙腈的溶液重懸。20|ig測序級胰蛋白酶(Promega)用10|iL試劑盒提供的重懸緩沖液(Promega)重懸，使胰蛋白酶濃度是2嗎/VL。然後將所得物用50mMNH4HC03和10%(v/v)乙腈稀釋到胰蛋白酶終濃度是0.2嗎/pL。通過加入與野生型，和突變型TGF-(33蛋白比率是1:20(w/w)的胰蛋白酶來消化過夜。通過加入蟻酸(Fluka)到終濃度0.1。/。(v/v)來結束消化。然後將樣品稀釋到lpmole/|iL。肽通過nano-flowRPLC-MS方法分析(臨界系統，Dionex聯機到Q-ToF2,微量)。層析是在7SpmC18柱(LC填料)利用45分鐘梯度從5。/。(v/v)乙腈到55%(v/v)乙腈進行的。MS分析採用的是數據依賴型分析的形式，其中儀器測量了從LC中洗脫的肽離子的m/z並且選擇適合的離子用於MS-MS分析，其中採用碰撞引發的分解以使肽離子片段化，以提供序列信息。3本發明TGF-P3的體內特性在成年雄鼠中考察了再摺疊活性'野生型，和突變型TGF-P3蛋白對切入性傷口和切口創傷癒合(創傷後3天)和瘢痕形成(創傷後70天)的生物效應。3.1野生型TGF-P3和本發明TGF-p3的傷口癒合效果對比雄鼠(SpragueDawley)用氟烷麻醉並且削去背毛。傷口位置使用標準模板和皮膚標記墨水如圖4所示進行標記。樣品用含有0.25M麥芽糖(Sigma)、0.002%(v/v)醋酸和0.33%(v/v)異丙醇的無菌賦形劑緩衝液稀釋到表4說明的濃度。所有樣品都無菌過濾並且不含內毒素。4隻鼠用於每一個治療組。來自每個治療組的(表4)100jiL樣品皮內注射到標記傷口的位置A和B(不接受治療的(未實驗的)鼠除外)。傷口位置A和B進行鑽取活組織檢查。所有動物都單獨籠養。24小時後所述動物接受二次劑量的樣品。3天後傷口一皮拍照並<吏用肉目艮#見覺才莫擬評分系統(VisualAnalogueScoringsystem)(修改自Beausang，E等1998)分析。數據的統計分析用MannWhitneyU/StudentT檢驗進行。p<0.05的值被認為是顯著的。3.2使用肉目械覺模擬評分法評估用野生型TGF-P3或本發明TGF-P3治療的第3天切入性傷口的傷口癒合切入性傷口在3天後使用肉眼視覺模擬評分法(VAS)檢查。在這個10分制中，0分代表良好癒合的傷口，IO分代表很差癒合的傷口。數據顯示與未治療的相比(未實驗的對照)，用50ng膽iiL或100ng/100^L的野生型TGF-(33治療會降低VAS分數(即，改善了傷口的肉眼外觀)。與未治療的相比(未實驗的對照)，用100ng/100(iL的劑量治療明顯改善了(pO.05)傷口的外觀，即加速癒合。與未治療的相比(未實驗的對照)，用50ng/100jiL或100ng/100(iL的Gly63-Ala突變型治療會降低VAS分數，並且比得上用野生型TGF-(33治療的傷口，即沒有削弱癒合。與未治療的相比(未實-驗的對照)，用50ng/100jiL或100ng/100faL的Gly63-Pro突變型治療會降低VAS分數，並且與用野生型TGF-p3治療的傷口相當，即，沒有削弱癒合。3.3用野生型和突變型TGF-P3蛋白治療的切口創傷第3天的傷口寬度顯微鏡評估切口創傷寬度在3天後顯微鏡評估。所有用TGF-P3的野生型和突變型蛋白治療的傷口都顯示了與安慰劑和未治療(未實驗)對照相當的傷口寬度，證明TGF-P3突變蛋白在癒合方面沒有不良作用(圖6)。3.4'野生型，和突變型TGF-(33蛋白在傷口瘢痕形成方面的效果(創傷笫70天)雄鼠(SpragueDawley)用氟烷麻醉並且削去背毛。傷口位置用標準模板和皮膚標記墨水如圖7所示的進行標記。樣品用含有0.25M麥芽糖(Sigma)、0.002%(v/v)醋酸和0.33%(v/v)異丙醇的無菌載體緩衝液稀釋到表5說明的濃度。所有樣品都無菌的、無內毒素的和無熱原的。4隻鼠用於每一個治療組。來自每個治療組的(表6)100pL樣品皮內注射到標記傷口的位置A和B(不接受治療的(未實驗的)鼠除外)。在傷口位置A和B用ll號手術刀片做出總深度lcm長的切口。所有動物都單獨籠養。24小時後所述動物接受二次劑量的樣品。70天後瘢痕形成被拍照並使用肉眼視覺模擬評分系統(修改自Beausang，E等1998)分析。傷口處被切除並在處理成蠟塊前放置在10%緩沖鹽水中。所述蠟塊被切成5pm連續切片並放置在載玻片上。所述載玻片用Masson三色法(MassonsTrichrome)染色和分析。數據的統計分析用MannWhitneyU/StudentT檢驗進行。p<0.05的值被認為是顯著的。3.5使用肉眼VAS對第70天切入性傷口的評估切入性傷口在70天後使用肉眼VAS系統進行檢查。10分說明很壞的瘢痕，0分是正常皮膚(圖8)。第70天傷口的VAS分析顯示'野生型，TGF-P3(以50ng/100iiL和100ng/100(iL劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。與用安慰劑治療的傷口相比這兩種劑量瘢痕形成的減少是統計學上顯著的(p0.05)。Gly63-Ala突變型(以50ng/100|iL和100ng/100^L劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。與用安慰劑治療的傷口相比用50ng/100!iL劑量的瘢痕形成的減少是統計學上顯著的(pO.05)。Gly63-Pro突變型(以50ng/100|iL和100ng/100|iL劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。Glul2-Ser突變型(以50ng/100|iL和100ng/100^L劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。與用安慰劑治療的傷口相比用50ng/100)aL劑量的瘢痕形成的減少是統計學上顯著的(p0.05)。雙絲氨酸突變型(Glul2-Ser和Arg52-Ser)以50ng/100(iL和100ng/100(iL劑量，與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比減少了瘢痕形成。3.6第70天切入性傷口的顯孩t鏡評估使用VAS評分系統記錄的肉眼效果用組織學分析來確認。組織切片代表性的例子在圖12和13中顯示。所述的組織顯微照片顯示本發明TGF-(33蛋白的加入引發了與"野生型"TGF-P3中所見到的相似的改善。本發明的蛋白誘導瘢痕中的膠原纖維具有與周圍正常皮膚相似的形態和組織。4.結論a螺旋(在胺基酸殘基58-67之間)的靈活性影響再摺疊過程中有功能的、正確再摺疊的二聚體TGF-(33的形成。通過用丙氨酸置換63位的甘氨酸來穩固a螺旋極大改善再摺疊效率，而用脯氨酸置換63位的甘氨酸來去穩定a螺旋則有相反的效果。與'野生型，TGF-(33相比，用丙氨酸或脯氨酸置換63位的甘氨酸沒有改變傷口癒合。與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，Gly63-Ala和Gly63-Pro減少了瘢痕形成。'鹽橋，的形成(在Arg52和Glul2之間)沒有改變TGF-p3再摺疊效率。與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，Glul2-Ser型和雙絲氨酸突變型減少了瘢痕形成。5.生產本發明單體或二聚體TGF-P3的優選實驗方案產生本發明正確再摺疊的單體TGF-(33的優選條件如下0.7M2-(環己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM還原型穀胱甘肽、0.4mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。30mM牛石黃脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、0.4mMGSSG、0.12mg/mLTGF-P3，pH9.5、2-8°C。1MNDSB-201、2mM還原型穀胱甘肽(GSH)、2mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF畫[33，pH9.5、2-8。C。0.7MCHES、2mM還原型穀胱甘肽(GSH)、2mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。30mM牛石黃脫氧膽酸鹽加上1MNDSB-221、2mM還原型穀胱甘肽(GSH)、2mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。30mM牛磺脫氧膽酸鹽加上0.7MCHES、2mM還原型穀胱甘肽(GSH)、2mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2-8。C。30mM牛磺脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、2mMGSSG、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2-8。C。總體來講本發明的TGF-(33可通過一種方法摺疊成二聚體生物活性形式，所述方法包括將溶解的、未摺疊的單體TGF-(33加入到一種溶液中，所述溶液包含(i)2-(環己基氨基)乙磺酸(CHES)或其功能類似物；以及(ii)低分子量的巰基/二硫化物氧化還原系統；以及在所述溶液中孵育生長因子直到二聚體生物活性TGF-(33形成。產生本發明正確再摺疊二聚體TGF-(33的優選條件如下0.7M2-(環己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM還原型穀胱甘肽、(MmM氧化型穀胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2-8。C。30mM牛磺脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、0.4mMGSSG、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2畫8。C。30mM牛石黃脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、2mMGSSG、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。優選的實驗M5.1載體克隆和宿主細胞轉化pET-24d載體來自pBR322載體，和包含一個LacUV5控制的T7啟動子和一個抗卡那黴素標記基因。編碼本發明TGF-P3的DNA可用0.75pL7Vcol(NewEnglandBiolabs)和0.75(iL5am//l(NewEnglandBiolabs)與1xBaw/fl糹爰沖液(NewEnglandBiolabs)在15pL反應液(NucleaseFreeWater,Novagen)中37。C消化4小時。1微升pET-24d質粒(Novagen)用同樣的方法消化。消化的cDNA和大的質粒片段經瓊脂糖凝膠純化，並用SpinPrepGelDNA提取試劑盒(Novagen)回收。純化的cDNA和質粒片段用T4連接酶試劑盒(Novagen)連接。連接的cDNA/質粒轉化進HMS174(DE3)(NovagenHMS174(DE3)轉化試劑盒)。轉化體通過在含有50嗎/mL卡那黴素(Invitrogen)的Luria肉湯(LB)瓊脂平板上塗布來選擇。選擇適合的克隆進行限制性消化和/或表達。5.2用於產物表達的克隆篩選將克隆在1/2濃度的"TerrificBroth"(6g/L植物蛋白腖(BectonDickinson)、12g/L酵母"t是耳又物(BectonDickinson)、2g/L的甘油(JTBaker)、1.16g/L磷酸二氫鉀(JTBaker)、6.25g/L磷酸氫二鉀(JTBaker),蒸餾水適量至1升)的搖瓶培養基中培養且在指數生長期OD,為0.65-0.85時用1mM的異丙基-P-D硫代吡喃半乳糖脊(IPTG)誘導。在加入IPTG3小時後取誘導後的樣品並用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析產物的誘導和表達。來自適合克隆的樣品在NuPAGENovex12%Bis-TrisGel,1.0mm(Invitrogen)中，於120毫安和200伏下跑膠約40-50分鐘，然後用考馬斯藍染色。由此，本發明的TGF-P3的表達在這些培養物中被誘導出來。5.3細胞凍存物將克隆在1/2濃度的TerrificBroth的搖瓶中生長到OD6oo約為1且通過加入甘油到20。/。(v/v)而以甘油儲存液的形式保存。1.2ml的肉湯等分至12x2ml的冷凍管(其含0.3mL的甘油)，然後在-70。C儲存。5.4TGF-卩3基因序列確認用於細胞凍存物的培養物樣品在加入甘油前獲得並被用於使用QiagenMiniPrepKit進行質粒分離。對分離的質粒進行測序，並用T7啟動子引物(5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，)和T7終止子引物(5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG畫3，)驗證。5.5種子培養物將選擇的合適克隆接種到2升封口的(baffled)Erlenmeyer燒瓶，該燒瓶含有500mLHySoy培養基(12g/L蛋白腖(QuestInternational)、24g/L酵母提取液(BectonDickinson)、10g/LNaCl(Sigma)和10g/L甘油(Sigma)及50嗎/mL卡那黴素。燒瓶37。C、200rpm振蕩溫育，周期性取樣測OD550。當培養物的OD達到3.21U/mL(7小時後)時，細胞肉湯用於接種150L發酵罐(100L工作體積)。5.6發酵900毫升的細胞肉湯(來自3.6部分)用於接種1S0L發酵罐(WHE),所述發酵罐含卯L分批培養基(0.6g/LK2HP04、0.4g/LKH2HP04、1.25g/LNH4S04、12g/L蛋白腖、24g/L酵母提取物和10g/L甘油)。發酵的運行參數控制如下溫度設定值37。C;pH設定值7.0(用4N的氫氧化銨和4N的磷酸維持)且溶解氧(DO)最初校準到100%。容器排出壓力為7psi，攪拌速度和空氣流速分別為200-400rpm和每分鐘每體積培養基1體積的空氣(vvm或slpm)。以下列優先順序通過調節發酵設定的參數將DO保持於20%以上攪拌速度(最大400rpm)、通風量(最大1.5vvm)、吸氧量(最大33.3Ipm)和背壓(最大12psi)。用PluronicL-61(25%v/v)控制起泡沫。當培養物的OD到10U/mL時，以45mL/分鐘的起始流速補充甘油(50。/。v/v)。當OD值到40U/mL,加入IPTG至終濃度為0.2mM進行細胞誘導。5.7收集誘導後4小時，將發酵罐冷卻到10。C且氣流和攪拌速率分別降到0.3vvm和100rpm。結束對泡沫和pH的控制且背壓調整到3psi。通過用WestfaliaCSA8連續離心機在10°C連續離心收集培養物。離心機運行速度為15,000rpm,流速為每分鐘3升並收集細月包漿液。5.8細胞裂解和IB回收發酵細胞體(來自5.7部分)用裂解緩衝液(6.1g/LTrizmaBase(Tris)、3.7g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、58.44g/LNaCl和10g/LTritonX-100,pH8.0)以1:5比例稀釋，並用手提式勻漿器重懸。重懸的細胞體經高壓勻漿器兩次(參數壓力10,000psig;流速450mL/分；溫度15°C)。然後將勻漿的細胞裂解液在5,000xg於4。C離心(桶式離心機，固定角轉頭)20分鐘。去掉上清液，留下不溶(包涵體)的TGF-P3。包涵體(IB)沉澱用手提式勻漿器在洗滌緩衝液(6.1g/LTris和3.72g/LEDTA,pH8.0)中重懸後離心(4。C,5,000xg20分鐘)。5.9包涵體溶解來自5.8部分的沉澱用溶解緩衝液(6.1g/LTris，15.4g/LDL-二硫蘇糖醇(DTT)和360.4g/L尿素，pH8.0)以l:10比例稀釋並用手提式勻漿器重懸。懸浮液加蓋並於室溫攪拌60-75分鐘以溶解包涵體並將TGF-P3還原為單體形式。在第二次溫育60-75分鐘時間之前，用NaOH/醋酸將重懸沉澱的pH調至pH9.4-9.6。5.10淨化/超濾和滲濾來自5.9部分的溶解的材料在切向流過濾(TFF)系統(Millipore)中被淨化、濃縮和滲濾。初期的淨化和濃縮用預處理的淨化TFF膜(MilliporePellicon1000kDa，再生纖維素，篩網V)完成。淨化的TGF-|33在透過液中收集。換到超濾/滲濾(UF/DF)膜(MilliporePellicon5kDa，再生纖維素，篩網C)，接著TGF-卩3在6置換體積(diavolume)溶解緩沖液(6.1g/LTris、15.4g/LDTT和360.4g/L尿素，pH9.5)中清洗。5.11超濾/疏7jC相互作用色鐠選擇的再摺疊溶液用超濾(膜為平板微孔Pellicon5kDa,O.lm2，再生纖維素，篩網)濃縮5倍。在稀釋緩衝液(2.72g/L醋酸鈉、264.28g/L硫酸銨、100g/L醋酸和210.7g/L鹽酸精氨酸，pH3.3)裡1:1稀釋之前，濃縮的再摺疊物質的pH用冰醋酸調節到pH2.5-2.8。丁基瓊脂糖凝膠4快流速柱(Amersham,床高16cm)用四柱體積的緩衝液A(2.72g/L醋酸鈉、132.14g/L硫酸銨和100g/L醋酸，pH3.3)平衡。在以100cm/hr的流速(整個過程都用這個流速)加樣到丁基瓊脂糖凝膠柱之前，再摺疊物質經0.22(iM膜(微孔Millipak過濾器)過濾。然後柱子用四柱體積的緩沖液A清洗。TGF-卩3蛋白用緩衝液B(2.72g/L醋酸鈉、100g/L醋酸和300g/L乙醇，pH3.3)洗脫離柱。在分離單體和二聚體蛋白之前，包含TGF-(33蛋白單體和二聚體形式的第一個峰被收集。序列信息TGF-卩3(序列ID號1)aldtnycfrnleenccvrplyidfrqdlgwkwvhepkgyyanfcsgpcpylrsadtthstvlgeynt!jNpeasaspccvpqd:lep:lt工;lyyvgrtpkveqijSnmwksckcs突變型TGF-卩3"Gly63-Ala"(序列ID號3)ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRGDLGWKWVHEPKGYYAISIFCSGPCPYLRSADTTHSTVL^LYNTLNPEASASPCCVPQDLEPI/riLYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS突變型TGF-p3"Gly63-Pro"(序列ID號5)ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYIiRSADTTHSTVL^LYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLT工LYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS突變型TGF-p3"Glul2-Ser"(序列ID號7)ALDT1S!YCFRNL呈E1SICCVRPLY工DFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGIjYISITLilSIPEASASPCCVPQDLEPIiTILYWGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS突變型TGF-卩3"Arg52-Ser"(序列ID號9)a:ldtnycfr肌eenccvrp]lyidfrqd]lgwkwvhepkgyyanfcsgpcpyl呈sadt突變型TGF-卩3"Glul2-Ser/Arg52-Ser"(序列ID號11)aldtnycfrnl旦enccvrp:lyidfrqdlgwkwvhepkgyymfcsgpcpy:l旦sadt序列ID號2-編碼野生型人類TGF-P3的DNAGCTTTGGACACCTACTGCTTCCGCTTGGAGGAGAACTGCTGTGTGCGCcccCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGC(XCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGAAGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號4-編碼Gly63-Ala突變型的DNAGCTTTGGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGAACTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATIGACTTCCGACAGGMCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGSACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGCACTGTACAACACTCTGAACCCTGARGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號6-編碼Gly63-Pro突變型的DNAGCTTTGGACACCTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGAACTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCMGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGCCACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCGCCTGACCATCCTGTAC窗GTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCTCTCCAACATGGTGGTGAAGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號8-編碼Glul2-Ser突變型的DNAGCTTTGGACACCAM1TACTGCTTCCGCAACTTGICGGAGAACTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號10-編碼Arg52-Ser突變型的DNAGCTTTGGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGARCTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTARGGGCTACTM1GCCAACTTC一TCCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCAGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAAC'ACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGAAGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號12-編碼Glul2-Ser/Arg52-Ser突變型的DNAGCTGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGTCGGAGTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCAGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGTCTTGTAAATGTAGC表1基於蛋白和肽的實驗研究的a螺旋傾向性等級螺旋傾向性胺基酸(kcal/mol)Ala0.00Glu°0.16Leu0.21Met0.24Arg:0.21Lys+0.26Gin0.39Glu0.40He0.41Asp00.43Ser0.50Trp0.49Tyr0.53Phe0.54Val0.61Thr0.66His00.56His+0.66Cys0.68Asn0.65Asp-0.69Gly1.00Pro3.16表2tableseeoriginaldocumentpage58表3野生型TGF-P3和本發明TGF-P3再摺疊效率tableseeoriginaldocumentpage58表4用細胞生長抑制測定評估野生型TGF-卩3和Gly63-Ala(一種本發明的TGF-P3蛋白)的生物活性tableseeoriginaldocumentpage58表5傷口部位治療tableseeoriginaldocumentpage59表6傷口部位治療tableseeoriginaldocumentpage59權利要求1.TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-β3的胺基酸殘基58和67之間的α螺旋形成結構域包括至少一個穩固α螺旋的置換。2.根據權利要求1所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸殘基被穩固a螺旋的胺基酸殘基替換。3.根據權利要求1或權利要求2所述的TGF-P3或其片段或衍生物，其中所述穩固a螺旋的置換包括引入選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸和苯丙氨酸的殘基。4.根據權利要求3所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-卩3的63位置上的甘氨酸殘基被丙氨酸替換。5.根據權利要求4所述的TGF-p3，其包括序列ID號3或其片段或衍生物。6.根據任一項前述權利要求所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其不包括在全長的野生型TGF+3的61位置上纈氨酸殘基的置換。7.TGF-P3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸殘基被脯氨酸替換。8.根據權利要求7所述的TGF-(33,其包括序列ID號5或其片段或衍生物。9.TGF-J33或其片段或衍生物，其包括在全長的野生型TGF-P3的12位置上穀氨酸殘基的置換和/或在全長的野生型TGF-(33的52位置上精氨酸殘基的置換。10.根據權利要求9所述的TGF-P3或其片段或衍生物，其中所述的一個或多個置換是使用選自下述的胺基酸殘基絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。11.根據權利要求9或權利要求10所述的TGF-p3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-|33的12位置上的穀氨酸殘基被絲氨酸置換。12.根據權利要求9至11任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-P3的52位置上的精氨酸殘基被絲氨酸置換。13.TGF-卩3或其片段或衍生物，所述TGF-卩3選自序列ID號7、序列ID號9和序列ID號11。14.根據權利要求1至13任一項所述的單體TGF-(33或其片段或衍生物。15.根據權利要求1至13任一項所述的二聚體TGF-(33或其片段或書亍生物。16.根據任一項前述權利要求所述的TGF-P3或TGF-(33的片段或TGF-[33的衍生物作為藥物的用途。17.根據權利要求1至15任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物在製備用於加速傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥物中的用途。18.根據權利要求1至15任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物在製備用於促進上皮再生的藥物中的用途。19.根據權利要求17或權利要求18所述的用途，其中所述藥物用於皮膚。20.根據權利要求17或權利要求18所述的用途，其中所述藥物用於眼。21.根據權利要求1至15任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物在製備用於預防和/或治療纖維化疾病的藥物中的用途。22.根據權利要求22所述的用途，其中所述纖維化疾病選自肺纖維化、肝纖維化、硬皮病、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化、增殖性玻璃體視網膜病變和子宮纖維化。23.根據權利要求1至15任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物在製備用於治療血管生成病症、再狹窄、粘連、子宮內膜異位、缺血性疾病、口腔黏膜炎和腎病的藥物中的用途。24.根據權利要求1至15任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物在製備用於誘導骨和軟骨或體外受精的藥物中的用途。25.編碼權利要求1至15任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物的核酸。26.加速傷口癒合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括向有相應需要的患者提供治療有效量的權利要求1至13任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物。27.預防和/或治療纖維化疾病的方法，所述方法包括向需要這種預防和/或治療的患者提供治療有效量的權利要求1至13任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物。28.根據權利要求26或權利要求27所述的方法，其中所述的TGF-(33或其片段或衍生物被提供至患者的皮膚。29.根據權利要求26或權利要求27所述的方法，其中所述的TGF-卩3或其片段或衍生物被提供至患者的眼。全文摘要本發明提供了TGF-β3或其片段或其衍生物，其中在全長野生型TGF-β3的胺基酸殘基(58)和(67)之間的α螺旋形成結構域包括至少一個穩固α螺旋的置換。本發明還提供了TGF-β3或其片段或其衍生物，其中在全長野生型TGF-β3的位置(63)上的甘氨酸殘基被脯氨酸替換。並且更進一步，本發明提供了TGF-β3或其片段或其衍生物，其包括在全長的野生型TGF-β3的位置(12)上穀氨酸殘基的置換和/或全長的野生型TGF-β3的位置(52)上精氨酸殘基的置換。本發明還提供了使用這種TGF-β3的藥物和治療方法。文檔編號C07K14/435GK101437846SQ200780016343公開日2009年5月20日申請日期2007年3月12日優先權日2006年3月11日發明者修·傑勒德·萊弗蒂,尼克·奧克萊斯頓,沙倫·奧凱恩,愛瑪·阿特金森,菲利普·梅勒,馬克·威廉·詹姆斯·弗格森申請人:瑞諾弗有限責任公司