苔蘚表達促進區域的製作方法

2023-08-07 18:44:41 5

專利名稱：苔蘚表達促進區域的製作方法
莒蘚表達促進區域
本申請是申請號2004800229689,申請日為2004年7月30曰的 同名專利的分案申請。
本發明涉及分離的核酸分子，這些分子促進多肽在遺傳修飾的真 核宿主細胞中的表達。
蛋白質類物質(蛋白質、肽、多肽及其片段，以及這些分子的翻 譯後修飾的形式，在此後被稱為"多肽"，在例如實施例部分中與"蛋 白質"作為同義詞一同使用)在遺傳修飾的細胞中的表達是提供這些 通常是稀缺或者貴重物質製備物的主要來源。為了在遺傳修飾的宿主 細胞中表達這些多肽，需要有對這一表達有正面控制("激活"、"促 進")的DNA區域的存在。啟動子是這種區域的重要實例，它們使RNA 聚合酶結合到DNA上，起始DNA轉錄為mRNA (Watson等 人，"Recombinant DNA" (1992)，Chapter I.1和2)。
作為研究植物生理和發育的有用研究對象，苔蘚(moss)吸引了 越來越多的注意力，因為它們簡單的特徵(苔蘚位於高等植物進化的 最底部)為高等植物的複雜生物學提供了信息。苔蘚簡單的形態學和
的模型生物。苔蘚可以毫不費力地使用包括純性培養(axenic culture)在內的體外技術，在控制的條件下培養，不僅僅在培養皿中 而且在液體培養基例如生物反應器中。單倍體的配子體可以在無菌的 培養基中進行光自養生長，並且很容易在細胞水平觀察到。
莒蘚的另一個主要優勢是它們的轉化能力儘管有很多研究，但 是在植物中的乾向整合事件很少達到l(T4，這阻礙了植物功能基因組 學的基因把向方法的一般使用。與所有其他至今被檢測的植物相比， 同源DNA序列在苔蘚(特別是已經建立的苔蘚模型生物例如小立碗蘚(Physcomitrella patens )(其分子遺傳學的綜述參見Reski， 1999)) 的基因組中的整合主要是以同源重組的方式出現在靼向的位置上。通 常使用PEG介導的原生質體攝取質粒DNA、粒子槍法DNA轉移、電穿 孔以及顯微注射(Cove等人，1997 )進行莒蘚的轉化，這些很容易進 行。根據轉化構建體的設計主要會出現隨機或者靶向的整合。
儘管使用苔蘚作為科學工具用於植物生理學研究，但是至今為止 使用苔蘚在苔蘚細胞中製備異源重組多肽仍然是相當有限，儘管已經 具備了有效的製備方法(例如根據EP 1 206 561 A中的描述培養原絲 體苔蘚組織)。
在真核宿主細胞特別是動物細胞或者高等植物細胞中轉化技術的 一個主要限制總是缺少有效的啟動子用於在這樣的宿主細胞中進行外 源基因的高的組成型表達。基於這個目的，花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子已經被廣泛地用於許多植物轉化系統中(參見例如W0 01/25456 A)，但是在一些植物物種中CaMV 35S啟動子活性低(特別 是單子葉植物例如水稻(McElroy等人，1991，))。對於單子葉植物 的轉化，已經使用了水稻肌動蛋白1 5'區域用於蛋白質的異源表達 (McElroy等人，1991，)。但是仍然存在對新型表達促進手段的不斷需 要用於在遺傳修飾的真核宿主細胞中表達重組(外源)多肽。
對於苔蘚，特別是小立碗蘚至今為止仍然沒有發表同源的(在這 裡同源的定義是苔蘚來源的)適當的來自細胞核的表達啟動子或者其 他來自細胞核的表達啟動序列(Holtdorf等人，2002)。研究人員因此
已經使用了異源的(在這裡異源的定義是非苔蘚來源的)啟動子用於 表達選擇標記基因和其他目的基因。但是這些啟動子中只有很少能夠 在某些苔蘚中可靠地起作用(例如CaMV 35S啟動子；在Holtdorf等 人，2002中予以總結；CaMV 35S啟動子在某些其他的物種中不起作用
(Zeidler等人，1999); TET-啟動子(在Reski (1998)中予以綜述)。
6因此，已經在本領域內開發了用於對苔蘚進行遺傳操作的其他方法，
例如基因捕獲和增強子捕獲系統(Hiwatashi等人，2001;但是還使用 了 (縮短的)CaMV 35S啟動子；作者在瞬時表達實驗中表明這個35S 啟動子的縮短形式是作為一個弱啟動子起作用；實際上，這篇文章涉 及了在增強子捕獲菌抹中表達報告基因，但是沒有顯示這一表達與任 何莒蘚的調控元件有任何聯繫)。
儘管在以上提及的在苔蘚中使用同源重組的研究中，異源啟動子 的使用是必要的(因此不需要同源啟動子，而且它們在大多數情況下 是沒有用的)，但是對於用於工業使用苔蘚製備重組多肽或者用於過 量表達同源多肽的適宜的苔蘚來源的表達促進手段的需要仍然存在並 且尚未解決。這些表達促進手段應該使得在應用的培養條件下存在穩 定和組成型的表達，並且應該優選地使表達與CaMV35S啟動子的表達 相當或者更高。
因此，本發明提供了編碼苔蘚表達促進區域(MEPR)，即來自野生 型苔蘚的表達促進區域的分離的核酸分子。本發明中提供了莒蘚來源 的表達區域(即來自野生型莒蘚的細胞核來源的區域)，它可以使在 遺傳修飾的宿主細胞中特別是在苜蘚中有組成型的表達，這樣就解決 了在現有技術中提出的對於這種工具的需要(Holtdorf等人，2002 ; Schaefer等人，2002)。
根據本發明，MEPR的基本特徵還有MEPR的表達促進活性是在特 異宿主細胞中起作用的異源啟動子(例如在小立碗蘚中用於表達重組 多肽的CaMV 35S啟動子)表達促進活性的至少30%,優選為至少50%， 因為不具有這種表達促進活性的莒蘚啟動子不能被正確地用於解決本 發明的目標，因此不被當做MERP。
因此，根據本發明MEPR從野生型莒蘚，即沒有通過引入非莒蘚物種的啟動子(例如高等植物或者(植物)病原的啟動子例如CaMV35S 啟動子或者TET啟動子)被遺傳修飾的苔蘚，的細胞核中分離。還4艮 清楚，具有微小序列改變(例如在對於表達促進活性沒有負面影響(破 壞)的區域中有1，2， 3，4，或者5個鹼基的交換)的MEPR，也被認為是 根據本發明的MEPR，它們可能是由於例如天然植抹序列變異或者由於 在MEPR的分離過程中出現的事件而造成的。用於分析表達促進活性的 方法或者用於分析這種微小序列改變對於這一活性的影響的方法是技 術人員已知的(例如通過與已知的CaMV 35S構建體進行比較)並且在 下面的實施例部分中進行描述。
根據本發明，非孢子體(sphorophyte )特異的MEPR表達促進被 定義為組成型MEPR，優選地MEPR促進在來自配子體的細胞中的表達， 更為優選地，MEPR促進在原絲體細胞中的表達。
根據本發明，組成型表達優選地被定義為蛋白質的表達導致該蛋 白在一般用於光自養生長的苔蘚的液體培養條件下(例如搖瓶培養， 生物反應器培養(EP 1 206 561 A))以及用於在下面描述的瞬時表達 系統的條件下具有可以被檢出的量。因此，組成型表達應當給予根據 本發明的MERP，優選地不必在培養基中添加特殊培養添加物，還有優 選地不必在培養基中添加糖、植物激素或者這些物質混合物。組成型 表達應該以穩定的形式進行；儘管它可能是瞬時的。
在本發明的說明中使用的術語"苔蘚"包括所有的苔蘚類植物(苔 類(hepatics )或者地錢(liverworts )、 角苔(hornworts )和苫 蘚)。苔蘚的特點是它們的異型世代交替，即兩個細胞核DM含量和 形態截然不同的世代的交替。二倍體的孢子體只在其年輕時具有光合 活性，它需要從佔據優勢的綠色的單倍體配子體上獲得營養供給。配 子體以兩種形態顯著不同的形式存在被稱為原絲體的年輕配子體以
及被稱為配子託的成年配子體。與原絲體相反，成年的配子體(配子
8託)具有性器官。
在本發明的背景下，瞬時表達被定義為如下所述將基於附加體核
酸的構建體(例如MEPR和目的基因)引入苔蘚的原生質體中，導致或 者允許載體的瞬間表達，表達優選地導致細胞外蛋白向培養基中的分 泌。原生質體來自苔蘚細胞，優選地來自配子體細胞，更為優選地來 自原絲體細胞。
儘管根據根據本發明的MEPR可以從任何苔蘚物種中取得，優選 地，MEPR從通常的模型莒蘚物種中分離。因此，MEPR優選地分離自立 碗蘚屬(physcomitrella )、 葫蘆蘚屬(Funaria )、 泥炭蘚屬 (Sphagnum)、 角齒蘚屬(Ceratodon)、 地錢屬(Marchantia)和 Sphaerocarpos中，特另'J是小立碗薛(Physcomi trel la patens )、 萌 ,蘚(Funaria hygrometrica )和地錢(Marchantia polymorpha)。
根據本發明的適宜MEPR選自序列編號l到27或者它們的表達促 進片段。"表達促進片段"是MEPR的片段，其具有的表達促進活性是 在特異宿主細胞中起作用的異源啟動子(例如在小立碗蘚中用於表達 重組多肽的CaMV 35S啟動子)的表達促進活性的至少30%，優選為至 少50%。
根據本發明的MEPR可以包含特異的區域，例如啟動子區域("啟 動子")，5'未翻譯區域("5'-UTRs") 、 5'內含子或者3'-UTRs。對於 一些MEPR，存在只含有5'內含子的表達促進片段。通常啟動子總是獨 自作為表達促進片段而有活性。因此，根據本發明的MEPR優選地包含 苔蘚的啟動子，優選是5'-UTR區域和/或5'內含子和/或3'-UTR。
儘管如果達到某種組成型表達通常就足夠了 ，但是許多情況下最 好能夠獲得高的表達率，特別是對於工業製備重組多肽。已經證明根據本發明的多數MEPR與CaMV 35S啟動子相比能夠為一個給定的重組 多肽提供更高的表達率，特別是在同源系統中(例如立碗蘚屬的MEPR 用於多肽在立碗蘚屬中的表達)。因此，根據本發明優選的MEPR其表 達促進活性至少與花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子的表達促進活性 相同，特別是，但是不止限於在MEPR分離的苔蘚物種中。更為優選的 MEPR表達促進活性是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子的表達促進活 性的至少200%、優選地至少500%、特別地至少1000%，特別地，但是 不止限於在MEPR分離的苔蘚物種中。
根據本發明的分離的核酸分子優選地用於轉化特異的宿主細胞， 用於製備重組轉基因多肽，優選地，但是不止限於，工業規模。因此 核酸分子作為適宜的栽體提供，使轉基因在宿主細胞中轉化並表達。 在根據本發明的MEPR用於代替苔蘚中的天然啟動子(這樣使同源苔蘚 多肽在MEPR的控制下表達，MEPR在苔蘚中的位置是它通常在野生型 植林中不在的位置)的可能性中，本發明MEPR的廣泛工業應用性是異 源("外源")基因在生產性宿主細胞中，特異地是在植物細胞中， 特別是在苔蘚細胞中的表達的控制。因此，根據本發明的核酸分子還 包含重組多肽產物的編碼區域，所述的編碼區域在MEPR的控制下。
如果根據本發明的分離的核酸分子還包含選擇標記和/或其他能 夠使被選擇的適當轉化方法進行所需的區域，則這也是有利的(參見 例如Cove等人1997; Schaefer， 2002 )。例如，如果優選乾向整合，
列同源的序列。這樣使得分離的核酸分子通過同源重組靶向整合入被 轉化的物種的基因組中。
而且，根據本發明的分離的酸分子可以用於篩選和確定表達促進 區域的共有序列。這種共有序列(區域，盒子，它們對於表達促進活 性是重要和/或必需的)的篩選在重組DNA技術中是一筆寶貴的財富，特別是對於使用苔蘚進行工業生物技術而言。
根據另一個方面，本發明還涉及在真核宿主細胞中表達重組多肽
產物的方法，包括以下的步驟提供了重組DNA克隆載體，該載體包 含根據本發明的編碼MEPR的分離核酸分子，以及選擇性地包含所述重 組多肽產物的編碼區域，所述的編碼序列在所述的宿主中，在所述核 酸分子的MEPR的控制下；轉化所述的真核宿主細胞，該細胞在天然情 況下不含有在所述的MEPR控制下的所述編碼序列；在適宜的培養基中 培養轉化的真核宿主細胞；表達所述的重組多肽以及分離表達的重組 多肽。
如以上所述，根據本發明的MEPR原則上具有在各種不同細胞類型 中實現組成型表達的能力，真核宿主細胞優選地選自植物細胞，優選 是苔蘚細胞，特別是小立碗蘚細胞。
對於本發明特別優選的系統是在苔蘚原絲體培養(原絲體苔蘚組 織)中培養。為了這樣做，將EP 1 206 561 A中描述的方法以及其
優選的實施方案在這裡明確引用作為參考，它們可以立即用於本發明。
不需要在培養基中加入各種不同的添加物，特別是沒有用於特異 分化或者促進不同組織生長的添加物使用根據本發明的方法進行多肽 的組成型表達是可能的。因此，除了電解質、選擇藥劑以及培養基穩 定劑以外，培養基優選不含有任何額外的添加物用於供給細胞營養。 用於穩定轉化植物的培養基優選地沒有外加的糖類、植物激素或者其 混合物。用於瞬時轉化的原生質體的培養基優選地沒有外加的植物激 素。
優選的莒蘚細胞為來自以下莒蘚的苜蘚細胞立碗蘚屬、葫蘆蘚 屬、泥炭蘚屬、角齒蘚屬、地錢屬以及Sphaerocarpos，特別是在原絲體培養物中。
根據另外一個方面，本發明還提供了編碼MEPR的分離的核酸分子 用於工業上製備多肽，特別是用於提供產生所述多肽的重組細胞。工 業製備使得可以在生物反應器中大規模製備給定的目標多肽，達到克 的量或者更高(商業產量)。這與製備出足夠用於研究用(毫克量) 或者分析用途(微克量)的製備不同，用於上面兩種目的的製備當然 也可以按照本發明進行。在瞬時表達系統中足夠用於這種分析目的的 蛋白質的量可以很容易地使用現有的DNA分子獲得。
所以，本發明還包括了使用編碼MEPR的分離的核酸分子表達莒蘚 多肽(所述苔蘚多肽的表達在天然情況下不受所述MEPR的控制)，特 別用於提供表達所述多肽的重組苔蘚細胞。這一使用可以在實際中用 於研究目的和用於工業規模的苔蘚多肽製備。
根據另一個方面，本發明還提供了編碼MEPR的分離的核酸分子的 用途，用於表達參與特異的翻譯後修飾的蛋白(例如糖基轉移酶)， 特別是用於提供表達多肽的重組苔蘚細胞，多肽具有的翻譯後修飾通 常不存在於未轉化的苫蘚細胞中，或者以另外一個比例存在。
根據另外一個方面，本發明還提供了使用編碼MEPR的分離的核酸 分子表達涉及代謝途徑的蛋白，特別是用於提供重組苔蘚細胞，這些 細胞的代謝物例如次級代謝物的含量改變了 。
根據另外一個方面，本發明還提供了使用編碼MEPR的分離的核酸 分子表達反義分子、siRM分子或者核酶，特別是用於提供重組苔蘚 細胞，這些細胞中特異的蛋白質含量減少，導致出現了改變的表型， 例如形態上的或者生化上的。
12根據另外一個優選的方面，本發明還涉及根據本發明的編碼MEPR 的分離的核酸分子用於翻譯後修飾蛋白的重組表達，特別是用於製備 翻譯後修飾的蛋白質。有了這樣一項技術，就有可能製備翻譯後被特 異修飾的蛋白質(與在天然宿主細胞中不同)，這樣使例如植物細胞 或者苕蘚培養物以例如哺乳動物或者甚至人類的糖基化型式產生蛋白
質。應用於特異的糖基轉移酶的這種技術的示例在例如WO 00/49153 A 和W001/64901 A中有所描述。
根據本發明的編碼MEPR的分離的核酸分子的另外一項優選的用 途涉及重組蛋白的體外表達。體外翻譯技術使重組產物在更加控制的 條件下產生，而不需要承擔與宿主細胞相聯繫的不確定性。
根據本發明的核酸分子的另外一項優選的使用是它們用於代謝修 飾蛋白質(例如修飾(翻譯後)翻譯的胺基酸鏈修飾的蛋白質)的重 組表達(參見例如Berlin等人，1994 )。
本發明還通過以下的實施例和附圖進行闡述，但是不限於這些實 施例和附圖。
附圖
圖l小立碗蘚中的p-微管蛋白基因，
圖2小立碗蘚中p-微管蛋白的表達促進區域分析，
圖3通過瞬時轉化rhVEGF構建體分析Pptubl的表達促進區域，
圖4通過瞬時轉化rhVEGF構建體分析Pptub2的表達促進區域，
圖5通過瞬時轉化rhVEGF構建體分析Pptub3的表達促進區域，
圖6通過瞬時轉化rhVEGF構建體分析Pptub4的表達促進區域，
圖7小立碗蘚肌動蛋白基因的基因組結構
圖8不同的5'肌動蛋白區域表達活性的比較
圖9 Ppact 1構建體

圖10 Ppact 5構建體
圖11 Ppact 7構建體
圖12 Ppact 3:: vegf構建體
圖13 Ppactl啟動子5，內含子替代
圖14 Ppactl啟動子vegf缺失突變體
圖15 Ppact3啟動子vegf缺失突變體
圖16 Ppact5啟動子vegf缺失突變體
圖17 Ppact7啟動子vegf缺失突變體
圖18不同苔蘚種中的肌動蛋白基因，以及
圖19來自小立碗蘚和葫蘆蘚的同源肌動蛋白基因啟動子序列的
比較
材料和方法 植物材料
以前已經對小立碗蘚(Hedw. ) B. S. G.進行了性質研究(Reski 等人1994)。它是植林16/14的再培養物，植抹16/14由H. L. K. Whi tehouse在英國Gransden Wood, Hunt ingdonshire收集，由Engel 進行增殖(1968; Am J Bot 55， 438-446)。
標準培養條件
植物在無菌條件下進行純培養，使用普通的改進Knop無機液體培 養基(1000mg/L Ca(N03)2x 4H20 250mg/L KCl， 250mg/L KH2P04， 250rag/L MgS04 x 7H20和12. 5mg/L FeS04 X 7H20 ; pH 5. 8 (Reski和Abel (1985) Planta 165， 354-358)。植物在含有200毫升培養基的500毫升 Erlenmeyer搖瓶中培養，或者在含有固化Knop培養基(10g/L瓊脂) 的9釐米平皿中培養。搖瓶在Certomat R搖床(B. Braun Biotech International,德國)上振蕩，轉速為120rpm。生長溫室的條件是 25+/-3°C,光-暗周期是16:8小時。通過提供35 |a mol/m_2s—1光強的 螢光管(Osram L 58 W/25)從上方照射培養物。每周進行一次液體培養物的傳代培養(subculturing)，使用Ultra-Turrax勻漿器(IKA， Staufen，德國)分界後接種與兩個新的含有100毫升新鮮Knop培養 基的500毫升Erlenmeyer搖瓶中。此外，在去整合後3或4天過濾 培養物，然後轉移至新鮮的Knop培養基中。
生物反應器培養物分別生長在Knop培養基或者1/10Knop培養基 中，在攪拌的玻璃生物反應器(Aplikon， Schiedam,荷蘭)中培養， 工作體積是5升(如Hohe and Reski， Plant Sci. 2002,163， 69-74 中所描述)。使用船推進式攪拌器(marine impeller)進行攪拌，攪 拌速度是500rpm。培養物通入0. 3vvm [(通氣體積)/ (培養基體積)/ 分鐘]的空氣。容器25'C的培養物溫度通過雙水套冷卻系統進行控制。 50 jamol/nTY1的光強由螢光管(Osram L 8W/25)提供，光/暗節律是 16/8小時。培養物內的pH值(pH 6.5-7.0)不進行調節。
原生質體分離
用於小立碗蘚的分離原生質體的不同的實驗方案已有描述 (Grimsley等人1977; Schaefer等人1991; Rother等人1994; Zeidler等人1999; Hohe and Reski 2002 ; Schaefer 2001)。對 於這裡提出的工作，使用以前描述的方法的修改/組合
苔蘚組織在Ca(N03)2含量降低(10°/ )的Knop培養基中培養7 天。在去整合後3或4天過濾培養物，然後轉移至新鮮的Ca(N03)2含 量降低(10%)的Knop培養基中。過濾後在0. 5M甘露醇中對莒蘚的原 絲體進行預孵育。30分鐘後向懸液中加入4°/。的崩潰酶(Sigma， Deisenhofen，德國)。崩潰酶溶解於0. 5M甘露醇(pH 5.6-5.8)中， 3600rpm離心10分鐘，通過0.22微米濾器(MillexGP， Millipore Corporation,美國)過濾除菌。含有1%崩潰酶(終濃度)的懸液在黑 暗中室溫孵育並且輕微搖動(2小時孵育後得到最好的原生質體產 量)。懸液通過100孩吏米和50;微米孔徑的篩子(Wilson， CLF， Germany)。
15懸液在無菌的離心管中離心，室溫55g(加速3;減速3; Multifuge 3 S-R， Kendro，德國)10分鐘沉澱原生質體。將原生質體輕輕地重懸 於W5培養基(125 mM CaCl2x 2 H20; 137 mM NaCl; 5.5mM葡萄糖；10 mM KCU pH 5. 6 ; 660-680 m0sm滲透壓；無菌過濾；Menczel等人 1981)中。懸液再次在室溫55g (加速3;減速3; Multifuge 3 S-R， Kendro，德國)10分鐘沉澱原生質體。再次將原生質體輕輕地重懸於 W5培養基中。將少量的懸液轉移到Fuchs Rosenthal小室中對原生 質體進行計數。
瞬時轉化
已經對小立碗蘚的不同轉化方法進行了描述(Schaefer等人1991; Reutter and Reski 1996， Schaefer 2001)。對於這裡提出的工作， 使用以前描述的方法的修改/組合
將原生質體在冰上在暗處孵育30分鐘用於轉化。接下來，在室溫 55g (加速3;減速3; Multifuge 3 S-R， Kendro) 10分鐘沉澱原生 質體。將原生質體重懸於3M培養基(15 mMCaCl2x2H20 ; 0. 1°/。MES; 0. 48 M甘露醇；pH5.6 ; 540 mOsm滲透壓；過濾除菌，Schaefer等人 (1991) Mol Gen Genet 226,418-424)中，濃度為1.2 x106個原生 質體每毫升。將250微升該原生質體懸液置於一個新的無菌離心管中， 加入50微升DNA溶液(層析柱(Qiagen， Hilden，德國)純化的DNA， 溶於水)；加入10-100;微升的含有60孩吏克DM (最佳量)的溶液， 最終加入250微升PEG溶液(40% PEG 4000; 0. 4 M甘露醇；0. 1 M Ca(N03) 2 ;高壓滅菌後pH 6)。懸液立即輕輕混和，然後在室溫下 孵育6分鐘，不斷輕輕混和。加入1，2， 3和4毫升的3M培養基對 懸液進行連續稀釋。懸液在20攝氏度55g(加速3;減速3;Multifuge 3 S-R， Kendro)離心10分鐘。沉澱重懸於400微升3M培養基中。 在48孑L培養板(Cel 1 s tar， greiner bio-one， Frickenhausen)中培 養轉化的原生質體。瞬時轉化在25攝氏度弱光(4. 6 pmolm_2s—')下 孵育。在24小時和48小時後分別取樣，用新鮮培養基替換培養基的一半(200微升)。培養基不完全被替代，因為原生質體必須在液 體中保存。取出的培養基(含有重組蛋白)在-20攝氏度儲存。用ELISA 測量48小時的樣品。
穩定轉化
已經對小立碗蘚的不同轉化方法進行了描述(Schaefer等人1991; Reutter and Reski 1996, Protocol Schaefer 2001)。對於這裡提 出的工作，使用以前描述的方法的修改/組合
將原生質體在冰上在暗處孵育30分鐘用於轉化。接下來，在室溫 55g (加速3;減速3; Multifuge 3 S-R, Kendro ) 10分鐘沉澱原生 質體。將原生質體重懸於3M培養基(15 mMCaCl2 x 2H20 ; 0. 1%MES; 0. 48 M甘露醇；pH 5.6 ; 540m0sm滲透壓；過濾除菌，Schaefer等人 (1991) Mol Gen Genet 226, 418-424)中，濃度為1.2 x106個原生 質體每毫升。將250微升該原生質體懸液置於一個新的無菌離心管中， 加入50孩i升DNA溶液(層析柱(Qiagen， Hilden，德國)純化的DNA， 溶於水)；加入10-100微升的含有60微克DNA (最佳量)的溶液， 最終加入250 ;欽升PEG溶液(40% PEG 4000; 0.4 M甘露醇；0.1 M Ca(N03)2 ;高壓滅菌後pH 6)。懸液立即輕輕混和，然後在室溫下孵 育6分鐘，不斷輕輕混和。加入1， 2， 3和4毫升的3M培養基對懸液 進行連續稀釋。懸液在20攝氏度55g (加速3;減速3; Multifuge3 S-R， Kendro)離心10分鐘。沉澱重懸於3毫升再生(regenerat ion ) 培養基中。根據Strepp等人(1998)的描述進行選擇步驟。
ELISA
瞬時轉化的莒蘚原生質體表達的重組VEGF121用ELISA(R & D Systems, Wiesbaden,德國)進行定量。ELISA根據生產商的說明進行。 稀釋樣品用於定量。
17細菌菌林和克隆載體
對於所有的克隆和增殖實驗使用大腸桿菌菌林ToplO (Invitrogen， Karlsruhe,德國)。使用pCR2. 1-T0P0 (Invitrogen， Karlsruhe,德國)，pCR4-T0P0 (Invitrogen, Karlsruhe,德國)， pZErO-2 (Invitrogen, Karlsruhe,德國)或者pRT101 (T6pfet等人 (1987)， NAR， 15， p5890)作為載體克隆DNA片段。
基因組DNA:製備、消化、連接
使用CTAB實驗方案(Schlink and Reski， 2002)從13天齡的原 絲體提取小立碗蘚基因組DNA。
用30單位的不同限制性內切酶(例如BamHI， EcoRI， HindIII， Kpnl， NcoI，NdeI，PaeI, Pagl， Xbal ;所有內切酶來自MBI Fermentas: St. Leon-Rot,德國)切割基因組DNA ( 3-5微克)，總體積為30微 升，37攝氏度下消化2小時，每一次消化使用一種內切酶。根據供應 商的使用手冊，用PCR Purification Columns (Qiagen， Hilden， Germany)純化消化後的DNA( 30微升消化產物+ 200微升PB緩沖液)。 使用50微升洗脫緩沖液(EB ; Qiagen, Hilden，德國)進行洗脫。在 進一步處理以前，用瓊脂糖凝膠(0， 5%)分析IO微升的洗脫物。
剩餘的DNA使用5單位的T4連接酶(MBI Fermentas， St. Leon-Rot，德國)連接，總體積為300微升，室溫連接2小時後再在4 攝氏度連接兩天。在加酶之前，將連接混合物置於50攝氏度5分鐘然 後置於冰上，目的是融化勦性的末端鹼基配對。加入0. 3M乙酸鈉(pH 4.8)用乙醇沉澱並且使用70%的乙醇洗滌沉澱兩次以後，重新連接的 DNA用200微升的EB重懸。從該重新連接的基因組DM中取l-3微升 用於I-PCR。
醒製備在液氮中研磨植物組織，使用E. Z. N. A. Plant RNA Kit (PeqLab) 或者RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen， Hilden，德國)，根據供應商 的操作手冊提取小立碗蘚的總RNA。總RNA用凝膠進行分析，定量 (OD260),分別於-20攝氏度或者-80攝氏度保存。
DNA酶處理和笫一鏈cDNA的合成
根據供應商的使用指南用DNA酶(GIBCO BRL)消化1微克的總 RNA，總體積為11微升。根據供應商的使用指南使用01igodT(12-18) 引物和SUPERSCRIPT II RNase H逆轉錄酶(GIBCOBRL)，用4. 5孩吏 升該DNA酶處理後的總RNA ( ~ 400納克)製備第 一鏈cDM。得到的cDNA 用無菌ddH20稀釋IO倍，保存於-20攝氏度。
普通PCR
如果未特殊說明，使用Advantage cDNA Polymerase Mix (BD Biosciences Clontech， Heidelberg,德國)進行PCR。對於所有其他 的PCR方法，使用下面的DNA聚合酶Taq重組聚合酶(MBI FermenUs St. Leon-Rot, 德國)，Pfu天然聚合酶 (MBI Fermentas， St. Leon-Rot， Germany), Platinum Pfx DM 聚合酶 (Invitrogen， Karlsruhe, 德國)或者 TripleMaster PCR 系統 (Eppendorf， Hamburg,德國)。註冊的溫度循環儀是Mastercycler梯度PCR 4義 (Eppendorf， Hamburg, 德國)。所有的引物由MWG Biotech AG, Ebersberg，德國合成。根據供應商的使用指南，使用GFX PCR DNA 和Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience, Freiburg, 德 國)進行PCR產物的純化或者凝膠洗脫。
重組質粒的構建和克隆
基本上按照Sambrook等人(1989)， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版.Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press的描述進行通常的分子生物學實驗方案。反向PCR(I-PCR)和巢式PCR
使用0. 25微升Advantage cDNA Polymerase Mix和緩沖液(包括 3,5 mM乙酸鎂，均來自BD Biosciences Clontech， Heidelberg,德 國)、0. 2mM每種引物、0. 2mM dNTP和1-3微升基因組重新連接產物(參 見上面)，總體積25微升進行I-PCR。循環條件是起始步驟96攝 氏度2分鐘，第二步是96攝氏度20秒，67攝氏度10秒(之後每一 個循環降低0. 15攝氏度)，68攝氏度10分鐘，重複35-40次，最後 一步是68攝氏度20分鐘，然後在程序結束時冷卻至4攝氏度。PCR 產物從瓊脂糖凝膠上洗脫。用30微升進行洗脫。洗脫的PCR產物或者 直接克隆到TOPO TA載體(pCR4-TOPO， Invitrogen， Karlsruhe,德 國)中或者作為巢式PCR中重新確證的模板。在巢式PCR中，將凝膠 洗脫的巢式PCR產物克隆到T0P0 TA載體(pCR4-TOPO， Invitrogen, Karlsruhe,德國)中。巢式PCR的循環條件是起始步驟96攝氏度 l分鐘，接下來第二步是94攝氏度20秒，56攝氏度10秒，68攝氏 度4分鐘，重複25次，最後一步是68攝氏度10分鐘。
pRT101new的產生，用於克隆擴增的啟動子片段 使用Pfu天然聚合酶(MBI Fermentas， St.Leon-Rot，德國)重新 擴增pRT101p21 (Gorr 1999),使用引物320和321 (對於這些引物 和所有接下來的引物參見表1 )。引物320 (正向)從VEGF信號肽的 第二個密碼子開始(5'- (atg) aac...)。引物321 (反向)從35S啟 動子之前的多克隆位點以內的HincII位點中央開始(5' -gac...)。使 用引物321，又引入了一個Xhol位點。PCR產物的重新連接導致35S 啟動子的喪失和HincII位點的恢復。通過測序確證VEGF基因的序列。 這個新的載體被稱為pRT101new，用於分別通過XhoI或者HincII位 點將表達促進區域克隆到報告基因之前。
測序所有的觀'J序反應由SEQLAB Sequence Laboratories, Goettingen， 德國進行。 軟體
使用Sci Ed Central, Clone Manager Suite用於引物設計、二 重以及多重序列比對。使用Lasergene， DNASTAR (第五版)Megalign 和SeqMan分析測序數據。使用BLAST 2 (Altschul等人，1997)進 行同源性搜索。
實施例
通過4個苔蘚表達促進區域的實施例闡述本發明第一個，小立 碗蘚各種不同的微管蛋白家族成員表達促進區域的分離和分析。在第
二個實施例中提供了來自多個不同苔蘚的肌動蛋白基因家族的表達促 進區域。第三和第四個實施例涉及泛素的表達促進區域以及RBCS表達
促進區域。
實施例1:小立碗蘚P微管蛋白基因及其表達促進區域的克隆和
分析
概述
為了從小立碗蘚(Pp)中得到P微管蛋白(tub)的調控/啟動子序 列，第一步通過聚合酶鏈式反應(PCR)分離出p微管蛋白同源物的編碼 序列。為此使用了所有9個發表的擬南芥的p微管蛋白基因組序列 (Attub l-9)的比對設計高度保守編碼區內的引物(8F， 9F和10R;對 於這些引物和接下來的所有引物參見表1)。此外，還使用了小立碗蘚 公共EST數據的序列信息，但是只有三個顯示了與P微管蛋白的同源 性。使用其中一個設計了預測的編碼區上遊的基因特異的引物(F7)。 對使用提及的引物得到的所有克隆的PCR產物以及EST數據進行序列 對比得到3組克隆，這3組克隆的DNA序列在組內是相同的，但是在 組間不同，主要(但是不僅僅)是由於內含子的差異。這些P微管蛋白直向同源物(orthologues )淨皮分別命名為Pptub 1， Pptub 2和 Pptub 3。
而且，由於在項目進行當中有更多的EST數據(在2002年初在 NCBI/dbEST中有50000以上的新條目)，所以對所有121個小立碗 蘚中與P微管蛋白有高度相似性的EST進行了詳細的分析，得到了三 個新的上遊和三個下遊EST組，各組序列在組內是相同的但是組間不 同且不同於任何其他組，與Pptub l-3也不同。對每個新的組使用來
自預測的非編碼上遊和下遊區域的引物進行PCR (參見下面)並且改 變所有引物組合的次序，確定了相應的上遊和下遊組與特定的基因座
(分別命名為Pptub 4, Pptub 5和Pptub 6)之間的聯繫。克隆所 有三個新的基因座的基因組和cDNA擴增產物並且測序，這將小立碗蘚 中P^t管蛋白直向同源物的數目增加到6個。
與Pptub 5和6相反，Pptub 1到4在EST資料庫中出現得更為 頻繁。主要使用原絲體和年輕得配子託的RM製備了相應的cDNA文庫。 因此，對於這四個基因，根據獲得的序列數據，進行反向PCR(I-PCR) 方法以獲得在基因組上這些序列周圍的區域。
Pptub 1
如第一步中已經提到的，使用小立碗蘚基因組DM和引物8F和 10R進行兩次獨立的PCR，克隆Taq (MBI Fermentas， St. Leon-Rot, Germany) PCR片段。對兩個PCR中分別得到的 一個(2-1)和兩個 (8-l，8-2)克隆進行部分測序，發現它們的序列是相同的。將相應的基 因座命名為Pptub 1。
使用這 一 初步的序列信息設計引物以進行基因組步移，對重新連 接的EcoRI和Hindlll基因組消化產物使用I-PCR方法(引物35, 36 ) 得到Pptubl的包圍區域。通過巢式PCR (引物40, 38 )對產物進行重
22新確證。巢式PCR產物PCR產生的兩個克隆(E#l和H 1. 7)進行完全測 序。
Hind III克隆H 1. 7不含有內部的HindIII位點，很有可能是 由於酶的星活性或者是隨機雙鏈斷裂的連接。但是通過兩次獨立的基 因組DNA PCR (引物113， 67和113， 90)對第一個EcoRI位點上遊的 序列進行了確證。此外，克隆了另外一個cDNAPCR產物(引物89,91 ; Pfu天然聚合酶(MBI Fermentas， St. Leon-Rot，德國))。
所有提及的克隆幫助產生和重新確證了序列數據。總共得到了起 始密碼子上遊~ 1500bp和終止密碼子下遊 1500bp的序列。
Pptub 2
如以上已經提到的，使用小立碗蘚發表的EST序列信息設計預測 編碼區域上遊基因特異的引物(F7)。對小立碗蘚基因組DNA的PCR(引 物F7,10R)以及接下來PCR產物的克隆和測序證明了，該PCR產物以 及所有三個迄今發表的Pptub EST (Pptub EST 1-3)都屬於一個基因 座，命名為Pptub2。可以通過比較EST與基因組序列證實內含子的位 置。
使用這一初步的序列信息設計內含子內的基因特異引物(引物95 和71)以進行Pptub2相鄰基因組區域的基因組步移，對重新連接的 Pag I, BamH I和Nde I基因組消化產物使用I-PCR方法。通過巢式 PCR (引物38， 35)對PCR產物進行重新確證。巢式PCR產物產生的兩 個克隆(C"Pag和M2Nde)進行完全測序。Nde I克隆D#2不含有內 部的Ndel位點，很有可能是由於酶的星活性或者是隨機雙鏈斷裂的連 接。但是使用C並2Pag和第三個I-PCR克隆(95f8BamHI ;引物149和 71)確證了序列數據。此外通過兩次獨立的基因組DNA PCR (引物 205， 149; Taq (MBI Fermentas， St. Leon—Rot，德、國)和引物205, 206 )確證了產物的長度。克隆了 205-206 PCR產物和另外的基因組下遊PCR 產物(引物71， 206 ; Pfu天然聚合酶(MBI Fermentas， St. Leon-Rot， 德國))並且幫助證實了序列數據。
所有提及的克隆幫助並且產生和重新確證了序列數據。總共得到 了起始密碼子上遊~ 1400bp和終止密碼子下遊 1400bp的序列。
Pptub 3
如第一步中已經提到的，使用小立碗蘚基因組DNA和cDM以及引 物9F和10R進行兩次獨立的PCR，克隆Taq (MBI Fermentas, St. Leon-Rot， Germany) PCR片段。從兩個PCR中分別得到的克隆(#3-3基 因組得到的克隆，#4-3 cDNA得到的克隆)進行部分測序，發現它們的 序列是相同的。將相應的基因座命名為Pptub 3。
使用這一初步的序列信息設計內含子內的基因特異引物(引物69 和70)以進行Pptub 3相鄰區域的基因組步移，對重新連接的Pag I 和Nco I基因組消化產物使用I-PCR方法。通過巢式PCR(引物38， 35 ) 對PCR產物進行重新確證。產生的兩個克隆(AHNco和井4-lPag)進行 完全測序。A#lNco是巢式PCR產物(38，35)產生的克隆而並4-lPagl 是開始I-PCR產物(69，70)產生的克隆。此外克隆了基因組PCR產物(引 物203， 204 )幫助證實序列數據。
所有提及的克隆幫助並且產生和重新確證了序列數據。總共得到 了起始密碼子上遊 1900bp和終止密碼子下遊 llOObp的序列。
Pptub 4
已經提到，對於Pptub 4使用EST數據設計基因特異的上遊和下 遊引物(297， 299)得到基因組和cDNA克隆。使用天然Pfu聚合酶 (MBI Fermentas， St. Leon-Rot,德國)得到的其他基因組克隆幫助證實序列數據。
將引物297和299反向(337， 383)用於進行Pptub 4相鄰基因組 區域的基因組步移，對重新連接的Nde I和Nco I基因組消化產物^f吏 用I-PCR方法。產生了兩個克隆(48井2Nco和A02#3Nde)以及另外的 基因組克隆(引物547和374 ; Advantage cDNA Polymerase Mix (BD Biosciences Clontech， Heidelberg, 德國)和 Triple Master (Eppendorf， Hamburg, 德國))。
所有提及的克隆幫助並且產生和重新確證了序列數據。總共得到 了起始密碼子上遊 2300bp和終止密碼子下遊 llOObp的序列。
Pptub 5和6
已經提到，對於Pptub 5和6使用EST數據設計基因特異的上遊 和下遊引物(Pptub 5: 298, 300和Pptub 6: 296, 336)得到每一個 基因的基因組和cDNA克隆。對於Pptub 5使用天然Pfu聚合酶(MBI Fermentas， St. Leon-Rot，德國)得到的其他基因組克隆幫助證實 序列數據。
所有提及的克隆幫助並且產生和重新確證了序列數據。總共得到 了 Pptub 5的2031bp基因組序列和Pptub 6的3161bp基因組序列。
克隆策略
使用Taq重組聚合酶產生了最初的Pptub 1 (2-l，8-l，8-l ;所 有都是基因組的)和Pptub 3 (3-3基因組的，4-3 cDNA的)克隆。將 PCR產物連接到TOPO TA載體(pCR4-T0P0， Invitrogen， Karlsruhe, 德國)中。PCR的條件是2. 5單位的Taq重組聚合酶，酶緩衝液，3. 3mM MgCl2(所有均來自MBI Fermentas， St.Leon-Rot，德國)，0.4raM每一 種引物，100納克cDM或者基因組DM作為模板，總體積是25微升。循環條件是起始步驟95攝氏度5分鐘，然後是第二步95攝氏度45 秒，60攝氏度(引物8F)或者65攝氏度(引物9F) 10秒，72攝氏 度1分鐘，重複30-35次，最後一步是72攝氏度5分鐘，然後在程序 結束時冷卻至4攝氏度。
所有其他的基因組和cDNA克隆是 Pptub 1: 113-67, 113-90, 89-90， 89-91cDNA Pptub 2: F7/R10, 205-206， 71-206 Pptub 3: 203-204
Pptub 4: 547-374 (+ TrippleMaster) ， 297-299 cDNA +基因組 (+ Pfu)
Pptub 5: 298-300 cDNA +基因組(+ Pfu) Pptub 6: 296-336 cDNA +基因組
以上力口下劃線的克隆使用Advantage cDNA Polymerase Mix產生， 每20微升PCR體系使用0. 25微升酶混合物，緩衝液(包括3，5mM乙 酸鎂，都來自BD Biosciences Clontech, Heidelberg,德國)，0. 25mM 每一種引物，0.25mM dNTP和10-20納克的模板。循環條件是起始 步驟96攝氏度2分鐘，然後是第二步96攝氏度20秒，60攝氏度10 秒和68攝氏度2分鐘每kb,重複35-40次，最後一步是68攝氏度15 分鐘，然後在程序結束時冷卻至4攝氏度。具有合適長度的PCR產物 從瓊脂糖凝膠上洗脫。根據擴增產物的量，用30-50微升進行洗脫。 洗脫的PCR產物克隆到TOPO TA載體(pCR4-TOPO， Invitrogen， Karlsruhe,德國)中。
所有其他的克隆，同兩個其他的基因組克隆297-299和298-300 一樣，使用Pfu天然聚合酶聚合酶，每20微升PCR體系使用0. 3微 升聚合酶(-O. 75單位)，緩衝液，2-4 mM硫酸鎂(所有均來自MBI Fermentas， St. Leon-Rot，德國)，0. 25mM每一種引物，0. 2mM譜P 和10-20納克的模板。循環條件是起始步驟96攝氏度2分鐘，然後
26是第二步96攝氏度20秒，60攝氏度10秒和72攝氏度2分鐘每kb， 重複35-40次，最後一步是72攝氏度IO分鐘，然後在程序結束時冷 卻至4攝氏度。具有合適長度的PCR產物從瓊脂糖凝膠上洗脫。根據 擴增產物的量，用30-50微升進行洗脫。洗脫的PCR產物克隆到經 EcoRV線性化的pZEr0-2 (Invitrogen， Karlsruhe,德國)中。
使用TripleMaster PCR系統產生了另外一個克隆547-374，每 20微升PCR體系使用0. 25微升聚合酶混合物(=1.25單位)，調整緩 衝液(包括2. 5mM Mg2+，均來自Eppendorf, Hamburg,德國)，0. 2mM 每一種引物，0.2mMdNTP和10-20納克的才莫板。循環條件是起始步 驟96攝氏度2分鐘，然後是第二步96攝氏度20秒，60攝氏度20秒 和72攝氏度3分鐘，重複40次，最後一步是72攝氏度IO分鐘，然 後在程序結束時冷卻至4攝氏度。具有合適長度的PCR產物從瓊脂糖 凝膠上洗脫。根據擴增產物的量，用30-50微升進行洗脫。洗脫的PCR 產物克隆到TOPO TA載體(pCR4-T0P0， Invitrogen, Karlsruhe,德 國)中。
總之，對小立碗蘚基因組DNA的PCR和PCR產物的克隆產生了 6 個轉錄的小立碗蘚P微管蛋白基因的序列信息。此外，使用了EST和 cDNA數據確證了基因組序列數據和內含子/外顯子的邊界。對於Pptub l到4，反向PCR得到了未轉錄的5'和3'包圍的基因組序列。所有6 個基因組區域的一般概括在圖1中給出。
基因結構和保守
已經強調了， Pptub 1到4在EST資料庫中出現得最多。此外， 它們對應的EST中多數來自全長的cDNA文庫。這兩個事實幫助計算機 (in silico)確定Pptub 1到4的轉錄起始位點(TSS) 。 5'EST與 相應的上遊基因組區域的多重比對顯示Pptub 1到3的確具有精確 的轉錄起始27個Pptub 1 5'EST中的20個，20個Pptub 2 5'EST中的16個以及14個Pptub 3 5'EST中的9個都在相同的最上遊位置 開始，標記為+1 (圖3-6)。此外所有三個TSS均被共有序列包圍(參 見下面)。對於Pptub 4而言，23個EST表明在100bp以內有多 個TSS。最上遊的5' EST的起始位點被確定為+1。
3'EST與相應的下遊基因組區域的類似多重比對重新確證了植物 基因幾乎總是攜帶一個以上poly(A)位點，且該共有序列不象在例如 哺乳動物基因中那樣非常明確，在哺乳動物中序列AAUAAA幾乎是遍布 的(綜述參見Rothnie等人，1996 )。
六個克隆的小立碗蘚基因座沒有顯示任何無義終止密碼子而且可 以預測與已知P微管蛋白具有高度相似性的適當蛋白。 一般在編碼區 域以外相似性立即並且顯著下降。考慮到5'的可能調控元件，對所有 4個上遊區域進行詳細比較後發現在基因家族內部或者沒有整體的保 守性，或者與其他已知的植物P微管蛋白基因的5'區域也沒有保守 性。但是可以在基因家族內部檢測到一些有趣的保守性匹配。
a) Pptub 1到3中確定的TSS在所有三種情況下都屬於共有序列 T/C C G/C T G T G C，且它們被包含在富含C/T的區域內(與 plantProm 資料庫，網址為 ht tp://mendel. cs. rhul. ac. uk/mende1. php topic-plantprom中171個無關的TATA植物啟動子 的共有序列T/C C A(+l) N M N比較)
b) Pptub 1到3中可以發現在TSS上遊22-24bp--這處於植物 TATA啟動子的典型距離內(參見plantProm資料庫)--有一個弱的 8bpTATA盒子，位於一個保守的20-25bp—段序列內部。來自171個 無關的植物啟動子的TATA盒子共有序列是T96 A95 T96 A， A62 /T38 A97 T" /A38 A73 (參見plantProm資料庫)，對於Pptub 1到3，共有序 列是T t T A T c T c/t/A，大寫字母表示與共有序列有關。
c) 所有四個基因在它們的5' UTR中確實有非常低水平(9-16%)的腺噤呤。
d) Pptub 4的5' UTR C/T總含量達到74%,此外在最短、最靠下 遊的5'EST的起始點之後還含有一個C/T一段序列(約50bp)。
e) Pptub 2在TSS上遊450bp附近(-450到-489)含有一個40bp 的polyA—段序列
f) Pptubl和4上遊大約-420位置處開始了非常富含A/T的區域 (Pptub 1在大約900bp中有80%以上的A/T; Pptub4 1750bp中有
75%的A/T，使得該基因上遊可能存在骨架/核基質附著區(S/MARs; (Liebich等人，2002)。
P微管蛋白啟動子的功能性鑑定和定量
在瞬時表達系統中使用非再生的小立碗蘚原絲體作為表達系統對 Pptub 1到4的可能5'調控序列進行功能定量，確定提供最大啟動子 活性的最小啟動子片段。對於每一個啟動子將幾個包括了上遊區域和 5' UTR的不同長度的構建體準確地置於報告基因的起始密碼子之前。 作為報告基因，人蛋白質(重組人血管內皮生長因子121: rhVEGF121 ; Gorr 1999 )通過其自己的信號肽被分泌到培養基中。rhVEGF121在苔 蘚培養物上清中的量使用ELISA進行定量，它反應了系統中啟動子或 者啟動子片段的強度。數值與使用35S啟動子得到的數值相聯繫。每 一個構建體在兩到三次不同的轉化實驗中轉化最少6次。分別在24 小時和48小時後取樣，48小時的樣品進行適當稀釋用ELISA測定兩 次。結果的總結在圖2中給出。
Pptub 1到4的表達促進區域被公開為序列編號1到8。
將Pptub 1到4的擴增啟動子片段克隆到pRT101 new中 Pptub 1: 1-0 (引物364Xho1， 363cat)
l一l (引物219Xho1， 363cat)
l一3 (引物549Xho1， 363cat)1-4 (引物226XhoI， 363cat) 1-5 (引物550XhoI, 363cat) Pptub 2: 2-0 (引物291， 225cat) Pptub 3: 3-0 (引物292， 223cat) Pptub 4: 4-0 (引物373Xho1， 374cat) 4-1 (引物548Xho1， 374cat)
以上給出的啟動子片段使用Pfu天然聚合酶(MBI Fermentas， St. Leon-Rot,德國)用基因組DNA擴增，使用從ATG起始密碼子反向互 補序列開始的反向引物(cat...)以及部分的含有Xhol位點的正向引 物。PCR產物使用Xhol切割並連接入XhoI/HincII中或者不進行切割 連接入用HincII打開的pRT101new中。產生的克隆通過測序進行證實。 克隆l-2 (XhoI/EcoRI)， 2-l(BglII), 2-2 (Sail), 2-3 (EcoRI/Sal I)， 2-4 (EcoRI/Sa11), 3-2 (Sail), 3-3 (Ecol47I/Hinc11) ， 3-4 (XhoI/SalI)通過從長克隆內部進行刪除而得到。剩餘的載體通過凝膠 洗脫並且重新連接。如果單鏈凸出末端不相匹配的話，在根據供應商 的使用手冊使用Klenow片段(MBI Fermentas， St. Leon-Rot,德國) 填平3'凹進端之後進行連接。
Pptub 1
將六個長度不同的啟動子克隆到轉化載體pRT101p21中的報告 基因之前。所有構建體的數據在圖3中給出。(5'UTR = +1 (TSS)到 +226, +227= ATG)
1-0 -1307 bp (Pptub 1 5'區域1533 bp )
l一l -985 bp (Pptub 1 5'區域1211 bp )
l一2 —416 bp (Pptub 1 區域642 bp )
l一3 —248 bp (Pptub 1 區域474 bp )
1-4 -83 bp (Pptub 1 區域309 bp )
1-5 -71 bp (Pptub 1 5'區域297 bp )啟動子片段1-2可以確定為提供高表達率的最短啟動子片段。與 35S啟動子產生的表達率(將其設定為100%)相比，表達率是其大約 150%。注意最小啟動子片段1-2的上遊開始了長的非常富含A/T的區 域(在近900bp中有80%以上的A/T )。
Pptub 2
將五個長度不同的啟動子克隆到轉化載體pRT101p21中的報告 基因之前。所有構建體的數據在圖4中給出。(5'UTR - +1 (TSS)到 +122， +123= ATG)
2-0 —1075 bp (Pptub 2 區域1197 bp )
2-1 —676 bp (Pptub 2 區域798 bp )
2-2 -425 bp (Pptub 2 區域547 bp )
2-3 -245 bp (Pptub 2 區域367 bp )
2- 4 -67 bp (Pptub 2 區域189 bp )
啟動子片段2-2可以確定為提供高表達率的最短啟動子片段。與 3SS啟動子產生的表達率(100%)相當。
Pptub 3
將長度不同的啟動子克隆到轉化載體pRT101p21中的報告基因 之前。四個構建體的數據在圖5中給出。(5,UTR-+1 (TSS)到+112， +113= ATG)
3- 0 -1274 bp (Pptub 3 5'區域1 386 bp ) 3-2 -765 bp (Pptub 3 區域879 bp ) 3-3 -272 bp (Pptub 3 區域384 bp ) 3-4 + 52 bp (Pptub 3 區域60 bp )
啟動子片段3-2可以確定為提供高表達率的最短啟動子片段。與 3SS啟動子產生的表達率(將其設定為100%)相比，表達率是其大約 300%。Pptub 4
將兩個長度不同的啟動子克隆到轉化載體pRT101p21中的報告 基因之前。數據在圖6中給出。(5'UTR-TSSs (+1到+103)到+205， +206= ATG)
4-0 -419 bp (Pptub 4 5'區域624 bp ) 4一1 -1 bp (Pptub 4 區域206 bp )
啟動子片段4-1提供的表達率是使用與35S啟動子得到的表達率 (將其設定為100%)的大約250%。注意該最小啟動子片段(4-0)的 上遊開始了長的非常富含A/T的區域(在1750bp中有75°/。的A/T)。
總之，對Pptub 1到4的基因組上遊區域的瞬時啟動子活性進行 了研究。確定了顯示最大啟動子活性的最小啟動子片段，它們的表達 率最高可達35S啟動子產生的活性的3倍。
Pptub構建體總結(還請參見序列表) Pptubl上遊
- 1533至-1(+1 =起始密碼子) -1533至-644 =81% AT
- 1533 VEGF l-O (引物364)
- 1211 VEGF l-l (引物219) -642 VEGF 1-2 (EcoRI/XhoI) -474 VEGF 1-3 (引物549) 一 309 VEGF 1-4 (引物226)
- 297 VEGF 1-5 (引物550;無推定的TATA盒子-304至-295)
- 226 TSS (5'UTR開始)
Pptubl下遊
1至1539 (1 =終止密碼子之後) 332最長的EST結束(3'UTR)
321539引物90的開始 Pptub2上遊
-1197至-l(+l =起始密碼子) -1197 VEGF 2—0 (引物291) -798 VEGF 2-l(BglII) -547 VEGF 2-2 (Sail) -450至-489 = poly A序列
- 367 VEGF 2-3(EcoRI/Sa11) -189 VEGF 2-4 (Xhol/Sall) -122 TSS (5'UTR開始)
Pptub2下遊
1至1012 (1 =終止密碼子之後) 297最長的EST結束(3'UTR) 1012引物206開始
Pptub3上遊 -1386至-l(+l =起始密碼子)
- 1386 VEGF 3-0 (引物292) -879 VEGF 3-2 (Sail)
-384 VEGF 3-3(Ecol47I/Hinc11) -112 TSS (5' UTR的開始) -60 VEGF 2-4(XhoI/Sa11)
Pptub3下遊
1到997 (1 =終止密碼子之後) 203最長的EST結束(3'UTR) 1012引物204開始Pptub4上遊
—624至-1 (+1 =起始密碼子) -624 VEGF 4-1 (引物373) -206 VEGF 4-2 (引物548)
- 205至-103 TSS的區域(5' UTR的開始)
- 55至-93 CT序列
Pptub4下遊
1至1146 (1 =終止密碼子之後) 466最長的EST結束(3'UTR) 1141至1164 Ncol
實施例2來自不同莒蘚種的肌動蛋白基因及其表達促進區域的 克隆和分析
2.1小立碗蘚肌動蛋白基因的基因組結構
已經從蘚類小立碗蘚中分離了四個肌動蛋白基因和啟動子區域， 從蘚類葫,蘚和苔類地錢中分離了三個肌動蛋白基因和啟動子區域， 構建表達載體用於苔蘚中。
使用根據公共資料庫中的立碗蘚屬EST序列設計的特異寡聚核苷 酸，通過幾輪反向PCR從基因組中分離出了四個肌動蛋白基因(Ppactl Ppact3， Ppact5和Ppact7)並且須'J序。
在立碗蘚屬中分離的基因中的一個(Ppactl)其結構類似於高等 植物肌動蛋白基因的保守結構組織。未翻譯的前導肽被一個較長 (955bp)的內含子打斷，該內含子位於起始密碼子ATG上遊14核苷酸處。編碼區域具有三個較小的內含子，它們的位置與其他植物物種肌
動蛋白內含子的位置相同。第一個內含子位於密碼子20 (lys)和21 (ala)之間，第二個內含子將密碼子152(gly)分開，第三個內含子在
密碼子356 (gln)和357 (met)之間。這--般結構與三個其他的立碗
蘚屬肌動蛋白基因(Ppact3， Ppact5，和Ppact7)看起來不同。在那三 個基因中，5'UTR內含子(分別是434bp， 1006bp和1055bp)也位 於ATG前14核苷酸處，但是編碼區域只被一個位於密碼子21 (lys)和 22 (ala)之間的內含子打斷(圖7)。
2. 2肌動蛋白基因表達促進區域的活性研究
為了研究不同立碗蘚屬肌動蛋白表達促進區域(序列編號5到8) 的活性以及不同基因5'UTR的作用，設計了不同的載體，在所研究的 5'區域控制下表達hVEGF蛋白。
從基因組DNA中通過反向PCR分離轉錄起始位點上遊大約2kb的 基因組區域並且測序，構建含有由啟動子引導的人VEGF cDNA以及包 括^內含子的準確前導序列的載體，用於瞬時轉染苔蘚的原生質體。 通過校對PCR擴增出完整的5'表達促進區域，使用的引物是395和 332用於Ppact 1， 408和333用於Ppact3，511和334用於Ppact5， 以及413和335用於Ppact7。
對於每個待測構建體使用相同數目的分子轉化原生質體，同時做 一個對照實驗，轉化攜帶在CaMV 35S啟動子控制下的hVEGF cDNA的 構建體。hVEGF蛋白在N端含有26個胺基酸的信號肽，它使得重組蛋 白被分泌到培養基中。原生質體轉化後孵育48小時後取不同稀釋度的 原生質體培養基，用ELISA對轉化進行分析。
不同的立碗蘚屬5'肌動蛋白區域引導表達的能力與組成型的35S啟動子的活性進行比較。
在所有分析的情況中，肌動蛋白基因的5'區域都比35S啟動子的 活性高。但是表達水平隨不同的肌動蛋白調控序列而有所差異。這樣， Ppact3的5'序列只能將VEGF的表達相對於35S啟動子提高大約2倍。 當含有Ppactl和Ppact7 5'區域的載體用於轉化時，測量出了更高水 平的VEGF。在那些情況下得到了 4-8倍相當於35S的數值。但是在使 用Ppact 5基因的5'區域時觀察到了最顯著的差異，在某些情況下， 得到了與35S的表達相比高出11倍的表達(圖8)。
為了進一步研究高活性的立碗蘚屬肌動蛋白基因5'UTR的功能， 製備了含有5'UTR內含子刪除、組合和替代的載體，用於莒蘚原生質 體的瞬時表達分析。
與4吏用完整Ppact 1 5'區域的表達相比，Ppact 1 5'內含子的刪 除顯著降低了瞬時表達的水平。在這種情況下，在原生質體培養基中 檢測到的分泌出的VEGF蛋白的量非常接近於通過CaMV 35S啟動子得 到的表達量。這表明Ppact 1 5'內含子對於基因從Ppact 1啟動子 的有效表達是必不可少的。當包含前導內含子的5'UTR與35S啟動子 的下遊融合時得到了相同的結果。這一構建體與完整的35S啟動子產 生了相同量的分泌蛋白，表明5'UTR區域對於非Ppactl啟動子的其他 啟動子的活性沒有任何顯著的影響。重要的是表明僅僅攜帶Ppact 1 5'UTR區域的構建體比35S啟動子對促進蛋白產生減少了 30%。這可能 提示在該基因的這個區域具有小的啟動子活性，或者剩餘的啟動子活 性存在於載體的主鏈序列中(圖9)。
使用相同的方法研究Ppact5和Ppact7基因中含有的5'UTR區 域對啟動子活性的影響。分析了 5'內含子被刪除的構建體，它們得到 了與Ppactl相似的結果，即對於Ppact5而言得到的蛋白質量與使用35S啟動子得到的蛋白質量大致相同，且對於Ppact7而言得到的蛋白 質量還要低一些，表明在5'UTR中內含子的存在對於啟動子的有效活 性是必不可少的。同樣，使用只含有5'轉錄區域至ATG的構建體進行 了轉化，也觀察到了一些殘餘的促進活性。而且，對於這兩個基因， 5'UTR與35S啟動子下遊的融合，與單獨使用35S啟動子相比使VEGF 蛋白產生了更高的表達率(2到7倍)(圖10,11)。對於Ppact3觀 察到了相似的結果，使用5'UTR自身或者與CaMV 35S的下遊融合分別 產生相對於35S兩倍和三倍的表達(圖12 )。這些結果提示在這三個 基因的5'轉錄區域中存在增強子的活性，即使將它們置於一個不同的 啟動子之下。
為了進一步研究Ppact 1， Ppact5和Ppact7基因中存在的5' 內含子的作用， <吏用Ppact5和Ppact7的5'內含子替換Ppact 1基 因的前導內含子，在栽體中進行工程操作，用於瞬時轉化。同時用 Ppact 1基因的編碼區中存在的內含子替4戈Ppactl 5'內含子。
用Ppact 1基因編碼區中的內含子1和3替代Ppactl 5'內含子 導致表達水平降低了大約25%。但是檢測出的蛋白表達量仍然比使用 CaMV 35S啟動子的表達高大約2-3倍。奇怪的是，使用編碼區的內含 子2代替5'內含子使得啟動子喪失了活性(圖13)。但是在檢查了構 建體的序列之後，發現內含子的拼接位點不正確。製備了攜帶正確拼 接序列的新構建體，在莒蘚轉化之後表明內含子2的作用與其他的替 代相同。
使用對應於Ppact5和Ppact7基因的5'內含子進行替代，也觀 察到了蛋白質表達的降低，但是這時降低的程度略小。
2.3.肌動蛋白基因表達促進區域的缺失構建體製備了肌動蛋白基因啟動子的5'未轉錄區的缺失構建體，通過將 這些構建體瞬時轉化苔蘚原生質體對其進行分析，進一步研究不同肌 動蛋白基因啟動子的特點。
這樣對於Ppactl，製備了攜帶轉錄起始(+l)上遊不同基因組區 域長度(-1823bp，-992bp，-790bp，-569bp，-383bp，-237bp，和-82bp) 的構建體。原理上除了-82bp的構建體以外，所有的構建體都應該具 有完全的啟動子活性。但是-383bp構建體表現出活性的下降，其活性 與-82bp構建體達到了相似的水平(圖14)。
對Ppact3啟動子區域的缺失構建體進行分析發現了一些有趣的 特徵。如以上所描述的，該啟動子與其他肌動蛋白基因啟動子比較活 性較低，儘管與CaMV 35S啟動子相比它的活性略高。這裡對下面的 5' 未 轉 錄 區 域 進 行 檢 測 -2210bp，-995bp，-821bp,-523bp，-323bp，-182bp和-81bp。奇怪的是 構建體中含有啟動子區域直至-821bp時，啟動子的活性與CaMV 35S 啟動子的活性大致相同。而含有從-523開始直至轉錄起始更短區域的 構建體產生兩倍量的重組蛋白。這可能表明在瞬時轉化試驗中(圖15) 位於-523bp上遊的順式作用區域下調了該基因的轉錄。
對於Ppact 5 ,製備了含有該基因轉錄起始上遊 -1872bp，-758bp，-544bp，-355bp，和-121bp片段的構建體。從瞬時試 驗得到的結果表明啟動子的完全活性位於轉錄起始(+1)的-758和 -121之間的區域(圖16)。
對以下的Ppact7基因5'未轉錄區域的缺失構建體進行分析 -1790bp,-107Qbp,-854bp，-659bp廣484bp，-299bp,和-66bp。得到 的結果表明在-484bp和-299bp之間包含的區域對在瞬時試驗分析中 啟動子的完全活性是必需的(圖17)。為了得到一套立碗蘚屬肌動蛋白基因的異源啟動子，使用另外兩
個種蘚類葫聲蘚和苔類地錢分離含有肌動蛋白基因的基因組DM片 段。為此，設計具有不同程度簡併性的寡聚核苷酸，使用來自兩個種 的基因組DNA作為模板進行PCR反應。
2.4來自不同苔蘚種小立碗蘚、葫蘆蘚和地錢的不同肌動蛋白基 因的比較
小立碗蘚
從小立碗蘚中分離的四個不同的基因組肌動蛋白序列可能代表了 該基因的全部功能性序列，包括5'啟動子序列，5' UTR+5'內含子， 0RF+內部的內含子以及3'UTR和進一步的3'下遊序列。總共分離了 Ppact 1 5809 bp， Ppact3 5633 bp，Ppact5 8653 bp以及Ppact7 6351 bp的基因組序列(圖18A)。除了 Ppact 1的ORF是1134bp以外， 分離的立碗蘚屬肌動蛋白cDNA的編碼區域幾乎全部都是1137bp長。 相對應的蛋白質是378個胺基酸長，Ppactl具有377個胺基酸。在核 苷酸水平上編碼序列之間的同源性在86. 6%到98. 9%之間。蛋白質序列 的相同性在97. 1%和99. 7%之間(DNA STAR, MegAlign程序，Clustal V (加權)序列比對軟體)。
對於所有四個立碗蘚屬肌動蛋白基因可以通過反向PCR分離ATG 起始位點5'的延伸基因組DNA序列並且進行測序Ppactl 2973nt， Ppact3 3091 nt ,Ppact5 3095 nt, Ppact7 3069 nt 。對於Ppactl， Ppact5和Ppact7使用Gene Racer Kit (Invi trogen)進行5, RACE(它 只擴增全長的cDNA)確定基因的VUTR。對於Ppact3，通過資料庫中 不同EST的長度確定5'UTR。通過比較cDNA與基因組的反向PCR片段， 可以顯示大的5'內含子的存在。對於Ppactl， Ppact3， Ppact5和 Ppact7,所有位於-14位置到ATG起始密碼子的5'內含子的長度分別 是955 bp， 434 bp， 1006 bp和1055 bp (圖18A)。通過比較基因組序列和衍生的蛋白質序列以及來自擬南芥肌動蛋白基因的cDNA序列 和蛋白質序列，確定0RF內部的內含子的位置。現有的立碗蘚屬肌動 蛋白基因的5'啟動子序列分別有Ppactl 1824 nt， Ppact3 2270 nt， Ppact5 1909 bp， Ppact7 1805 bp (圖18 A)。
通過對基因組DNA的簡併PCR從葫蘆蘚中總共發現了 4個不同的 肌動蛋白基因(表達促進區域序列編號9至12)，從地錢中總共發 現了 3個不同的肌動蛋白基因(表達促進區域序列編號13至15)。 因為目的主要是從不同的苔蘚種中分離可能的不同肌動蛋白基因同源 物的5'啟動子區域，至今為止3'端的大多數序列還是不完整的。(圖 18B/C)。
葫蘆蘚
對於葫蘆蘚屬，發現的肌動蛋白基因被命名為Fhactl， Fhact4. 4， Fhact5和Fhact5b。通過反向PCR可以分離的不同肌動蛋白基因的 基因組序列有Fhactl 3951 bp, Fhact4. 4 2417 bp, Fhact5 4432 bp 和Fhact5b 722 bp。對於編碼序列為1134個核苷酸的Fhactl基因， 可以分離完整的編碼cDNA序列。對於其他的葫蘆蘚屬肌動蛋白基因目 前有部分的序列，沒有3'端Fhact4.4 906 bp， Fhact5 965 bp以 及Fhact" 722 bp (圖18 B)。分離的編碼序列具有的同源性範圍在 核苷酸水平上是87. 4%到99. 2%。得到的蛋白質序列有90. 8闊99. 2% 是相同的(DM STAR, MegAlign程序，Clustal V (weighted加權)序 列比對軟體)。
除了 Fhact5b以外，可以通過反向PCR分離ATG起始密碼子5' 上遊的序列並且測序。已有的序列有Fhactl 1824 bp， Fhact4. 4 1333 bp， Fhact5 3289bp。使用Gene Racer Kit (Invi trogen)進行5'RACE 確定不同5'UTR的長度。通過比較cDNA序列和反向PCR獲得的基因組 序列以及與立碗蘚屬的基因比較確定內含子-外顯子的結構。對於立碗蘚屬肌動蛋白基因而言，發現的葫蘆蘚屬肌動蛋白基因含有大的5'
內含子，它們位於cDNA的-14位置上，其長度對於Fhactl Fhact4. 4和 Fhact5分別是928 bp， 1015 bp和656 bp。至今為止已經分離並且 測序了 Fhact 1 700 bp， Fhact4. 4 145 bp以及Fhact 5 2515 bp的 5'啟動子序列。對於Fhactl分離了 419 bp的3'區域。葫蘆蘚屬肌動 蛋白基因的5'區域和3'區域通過葫蘆蘚基因組DNA的PCR產生，使用 的引物是Fhactl 5'區域引物908和909; Fhactl 區域引物 983和984; Fhact4. 4 區域:引物1000和1001; Fhact5 5'區域引 物611和612。
地錢
發現的地錢屬的肌動蛋白基因^皮命名為Mpactl， Mpact4和 Mpactl5。所有3個序列都缺少3'端。至今為止分離並且測序的序列 有Mpactl 2229 bp，Mpact4 3987 bp以及Mpact15 2174 bp的基團 組序列。對於Mpactl， Mpact4和Mpactl5分離的編碼cDNA序歹'J分 別有997 nt， 962 nt和995 nt (圖18C)。與另外兩個莒蘚種相比， 地錢屬肌動蛋白基因內的序列同源性略微低一些，在核苷酸水平上介 於78. 3%和85. 5%之間，在胺基酸水平上介於94. 7%和96. 1%之間(DNA STAR, MegAlign #呈序，Clustal V (加斥又)序列比對軟體)。對於所 有三個鑑定出的不同的地錢屬肌動蛋白基因都通過反向PCR分離了 ATG的5'上遊序列並且進行了測序Mpactl 937 bp， Mpact4 3025 bp 以及Mpact15 910 bp。地錢屬肌動蛋白基因同源物的5'區域通過地4戈 基因組DNA的PCR產生，使用的引物是對於Mpactl的5'端^f吏用引 物950和951，對於Mpact4 <吏用引物960和961，對於Mpactl5寸吏用 引物970和971。通過比較來自不同吝蘚種的不同肌動蛋白基因序列 得到了 ORF的內含子外顯子結構。分離的Mpactl的5'序列顯示在-14 位置具有內含子拼接位點的共有序列(aggt),表明與其他立碗蘚屬和 葫蘆蘚屬基因一樣存在5'內含子。在Mpact4和Mpactl5的5'上遊序 列中不存在內含子拼接位點共有序列，提示沒有5'內含子(圖18C)。小立碗蘚、葫蘆蘚和地錢肌動蛋白基因的比較
如上面提到的， 一般情況下來自一個物種內的不同分離肌動蛋白 基因的核苷酸和蛋白質序列的同源性非常高，特別是在蛋白質水平上。 關係非常密切的兩個苦蘚種小立碗蘚和葫,蘚之間的同源性也非常
高。在核苷酸水平上肌動蛋白基因顯示的同源性在86. 9%到96. 3%之間 的相同性，而在胺基酸水平上的同源性範圍在95. 5°/。到99.7°/。之間。
相反苔類植物地錢與其他兩個種之間更遠的關係從在核苷酸水平 上基因更低的同源性上可以反映出來。立碗蘚屬和地錢屬肌動蛋白基 因之間的同源性範圍只有75.2%到78. 8%之間而葫蘆蘚屬和地錢屬之 間的同源性範圍是75. 5%到80.4%。在胺基酸水平上，地錢屬肌動蛋白 基因與立碗蘚屬相比同源性在93. 0%到96. 1%之間，與葫,蘚屬相比同 源性在93. 4°/。到96. 7%之間。
內含子-外顯子結構(圖18A/B/C)
如前面所表明的，立碗蘚屬肌動蛋白基因的內含子-外顯子結構 與高等植物內含子-外顯子結構有一定程度的相似性但是仍然有明顯 的差異。所有分離的立碗蘚屬基因都在5'未翻譯區域含有一個大的5' 內含子，這也是幾乎所有被研究的高等植物肌動蛋白基因所具有的。 只有Ppact 1在0RF中含有3個內部內含子，反映了例如所有擬南芥 分離肌動蛋白基因的情況。Ppactl 0RF內部的內含子位置與高等植物 肌動蛋白基因相比也是保守的。相反Ppact3， Ppact5和Ppact7在 0RF中只含有一個內部內含子。
在分離的葫蘆蘚屬肌動蛋白基因中可以發現相同的基因組結構， 在5'UTR中有一個延伸的內含子。Fhactl與Ppactl有相同的保守 內含子-外顯子結構而Fhact4. 4和Fhact5在ORF序列中只含有一個 內部內含子。分離的Fhact5b序列太短，所以關於它的內含子-外顯子結構不能看得很清楚，但是與Fhactl或者Ppactl相比它至少不含 有內部內含子2。
在地錢屬中分離肌動蛋白基因的基因組結構看起來更為不同。重 要的是表明在三個不同苔蘚種中不同肌動蛋白基因的數目還不知道， 有可能從地錢屬中分離出的三個肌動蛋白基因不代表獨立的有功能的 同源基因。有可能在地錢屬中存在三個以上的肌動蛋白基因，在立碗 蘚屬和葫蘆蘚屬中存在四個以上的肌動蛋白基因。
但是Mpactl的內含子外顯子結構看起來與Ppactl和Fhactl的結 構相同，5'UTR中有一個5'內含子以及0RF內部內含子1和2的保守 位置。Mpactl5還含有保守的0RF內部內含子1和內含子2,但是在 5'UTR中的-14位置或者-IO位置上沒有如同在立碗蘚屬或者一些擬南 芥肌動蛋白5'內含子中發現的保守內含子拼接位點，顯示缺少5'內含 子。對於Mpact4也發現了同樣的情況，很可能缺少5'內含子。此外 Mpact4在0RF中也不具有內含子1或者內含子2,這與目前分離出來 的所有苔蘚肌動蛋白基因都不同。
推測的同源苔蘚肌動蛋白基因
儘管從立碗蘚屬和葫,蘚屬中分離的不同肌動蛋白基因的內含子 -外顯子結構可能對兩個種之間的同源基因提出了推斷，但是我們不 能從基因組結構中得到這個結論。例如Ppactl和Fhactl具有相同的 保守內含子-外顯子結構但是正如以上所示，還不清楚在兩種植物的 基因組中是否存在更多的具有相同基因組結構的基因。為了就同源基 因給出一個結論，還需要表達數據以提議功能同源性。而且從蛋白質 或者編碼的cDNA序列的序列同源性中不能就兩個種之間的相應同源 基因作出任何假設，因為這兩個種太相似了。
但是有趣的是對於立碗蘚屬和葫聲蘚屬，還發現在UTR序列、內含子序列和啟動子序列等非編碼序列中有非常高的序列同源性。因此
在Ppactl和Fhactl以及Ppact3和Fhact5之間發現了高的同源性。 在兩種情況下內含子序列都顯示了非常高的保守性。對於Ppactl和 Fhactl，同源性如下5'內含子58%;內含子1: 64%,內含子2: 52 %以及內含子3: 55%。對於Ppact3和Fhact5同源性是對於5'內含 子是51%對於內含子1是48%。
在兩種情況中分離的5'啟動子序列顯示了高的同源性。圖19A圖 示了 Ppactl和Fhactl的分離的啟動子區域的比較。轉錄起始定為位 置l, 5'啟動子區域的第一個核苷酸定為-l。 Fhactl的5'啟動子區域 分離的267bp與Ppactl 5'啟動子區域的前267bp有58%的總體同源性。 在這些序列中可以，見察到具有不同同源性的部分。-267和-129之間的 序列同源性是51%。後面的29bp有62°/。的相同性，在-100到-l位置之 間同源性幾乎是70%。考慮到Ppactl和Fhactl內含子和啟動子序列 之間的高度序列相同性，有理由將這兩個基因作為這兩個苔蘚中的同 源基因。另一個有趣的方面是觀察到不同的Ppactl: vegf缺失構建體 之間表達的下降(圖15 )。表達的顯著下降出現在-237和-82缺失構 建體之間。這顯示了 5'啟動子區域-129和-1之間的重要功能，因為 剛剛提到Ppactl和Fhactl的啟動子區域序列高度保守，-82缺失構 建體不含有所有的高度保守序列而-237缺失構建體含有所有的高度
保守序列。
也可以觀察到Ppact3和Fhact5啟動子內的高度保守區域。這兩 個基因分離的啟動子區域要長得多。因此在兩個5'啟動子區域之間發 現更多的同源區域(圖19B) 。 Ppact3從-1到-2270以及Fhact5從 -64到-2325的啟動子區域顯示了一些有趣的同源性特徵。起始位點 位置的差異可能是由於Fhact5的5'UTR是由實驗確定的而Ppact3的 5'UTR是通過分析資料庫中的EST確定的。Ppact3 -2270和-1876之間的序列與Fhact5 - 2325和-1948之 間相同的序列區域之間只有很低(29%)的同源性。之後有一個大約 1100核苷酸的延伸區域，具有非常高的同源性(82%)。接下來的Ppact3 140nt區域和Fhact5啟動子的152nt區域"只"顯示了 53%的同源性。 Ppact3 -641和-463之間的序列與Fhact5的-705和-528之間的區域 再次顯示了 76%的高度保守性。接下來大約180nt再次顯示了較低的 同源性(5 3%) 。 Ppac 13啟動子序列的最後288bp與Fhac 15後面的28 Obp 之間再次顯示較高的同源性73%。兩個同源基因之間具有不同同源性 程度的這些區域可能顯示在5'區域中存在調控性的活性元件。
對於Ppactl和Fhactl，這裡對不同Ppact3: vegf缺失構建體的 表達分析也是有趣的(圖17)。與-523刪除構建體相比，-2210， -995，-821缺失構建體的vegf表達水平有顯著的升高。這三個缺失構 建體至少含有Ppact3和Fhact5中-1876和-779之間發現的延伸同源 區域的一部分，它們的表達水平達到了 35S啟動子的表達水平，而-523 缺失構建體與35S啟動子或者更長的缺失構建體相比，表達有2^倍的
二
增加。這可能顯示在這個Ppact3和Fhact5之間具有82%同源性的區 域中存在負調控因子。
對於地錢屬，沒有發現與來自立碗蘚屬和葫蘆蘚屬的不同肌動蛋 白基因之間有相當的序列同源性。
對於Fhact5基因，製備了一個含有1157bp 5'未轉錄區域與hVEGF cDNA融合的構建體，用它在立碗蘚屬原生質體上進行瞬時轉化實驗。 在這種情況下檢測出的蛋白量與使用CaMV 3SS啟動子得到的蛋白量處 於相同的範圍內但是略高一些(直到兩倍)。Fhact5基因與Ppact3 基因具有最高的同源性，有趣的是在瞬時試驗中兩個啟動子在立碗蘚 屬原生質體上顯示了相似的活性。2.5穩定的轉基因品系
將包含由Ppactl， Ppact5和Ppact7的5'MEPR引導VEGF c醒 表達的盒子引入立碗蘚屬植物的基因組中。對於每個MEPR得到5-10 個穩定的轉化植物，並且檢測了 rhVEGF的表達。對於這三個檢測的 MBPR，在植物生長的培養基(標準Knop培養基)的上清中檢測出了來 源於苔蘚的表達和分泌的rhVEGF,表明當MEPR整合到基因組的其他 部分中時會促進蛋白質在非誘導條件(標準條件)下的表達。在那些 表達系中可以測量的蛋白質的量從每毫克苔蘚乾重7ng VEGF到每亳克 苔蘚乾重53ng VEGF，這取決於構建體和穩定的品系。
使用一個含有Ppact5控制下的VEGF cMA轉基因苔蘚林進行生物 反應器培養。通過ELISA測定生物反應器培養物上清中來自莒蘚的重 組VEGF的量是每毫克莒蘚千重40-50ng VEGF。
實施例3小立碗蘚和葫^蘚泛素基因及其表達促進區域的克隆 和分析
利用存在幾個對應於立碗蘚屬聚泛素基因的EST序列，設計特異 的寡聚核苷酸分離與資料庫中最廣泛存在的泛素基因同源序列的EST 相對應的基因組序列，將其命名為Ppubql 。通過反向PCR鑑定出Ppubql 區域的2146bp。通過5'race確定了 ORF開始之前有129bp轉錄了的 5'前導序列。使用小立碗蘚基因組DNA和引物777與602通過PCR擴 增出Ppubql的5'區域。
構建攜帶不同部分啟動子和引導hVEGF cDNA表達的5'UTR區域的 載體，分析立碗蘚屬原生質體瞬時轉化中啟動子的活性。
結果表明該啟動子與Ppact5啟動子有相似的活性(或者更高)。 檢測的構建體、1. 6kb和1. 3kb的啟動子片段表達水平比CaMV 35S啟動子的表達水平高大約4倍和幾乎7倍。
通過對葫蘆蘚屬的總RNA進行5'race PCR,使用來自Ppubql編 碼序列的引物，發現了來自葫蘆蘚屬的泛素基因Fhubql。使用分離的 5' UTR序列和部分編碼序列設計引物對葫，蘚的基因組連接產物進行 反向PCR。這樣發現了 5'UTR 5'上遊的序列。使用引物943和944從 葫蘆蘚的基因組DNA中PCR擴增出區域。
實施例4小立碗蘚RBCS表達促進區域的克隆和分析
作為肌動蛋白、微管蛋白和泛素基因之後的可能候選者，考慮核 酮糖-1， 5-二磷酸羧化酶/氧化酶的小亞基(rbcS)基因。在核基因組上 編碼不同的rbcS基因。這些rbcS基因是一個基因家族的成員。rbcS 基因主要在能夠固定二氧化碳的植物的所有綠色部分中表達。因此該 基因家族在從不同莒蘚的不同rbcS基因區域得到5'和3'包圍的表達 促進區域方面是有用的。第一步對立碗蘚屬的EST資料庫進行分析。 發現來自小立碗蘚的rbcS基因組織成為一個基因家族，由12個基因 組成。
將rbcS基因中最廣泛存在的EST - -Pprbc-S12作為候選的EST 查找其5'和3'表達促進序列。從EST序列數據開始，通過反向PCR 確定該基因的5'和3'包圍區域並且對克隆的5'和區域進行測序。 使用引物839和858從小立碗蘚基因組DNA上PCR擴增出5'區域。使 用引物904和901PCR擴增出3'區域。
在所附的序列列表中給出了以下的序列(序列編號/序列名稱/相 對於蛋白編碼區5'或者3'區)1Pptubl5，
2Pptubl3,
3Pptub25,
4Pptub23,
5Pptub35,
6Pptub33,
7Pptub45,
8Pptub43,
9Ppactl5，
10Ppactl3，
11Pp3Ct35,
12Ppact33,
13Ppact55，
14Ppact53,
15Ppact75,
16Ppact73,
17Fhactl5，
18Fhactl3,
19Fhact4.4 5
20Fhact55,
21Mpactl5,
22Mpact45,
23Mpactl5)5,
24Ppubql
25Fhubql5,
26PprbcS12 527PprbcS12 3，1:芸？一J，
No. tj 一5、-3、一_
35 讓G醫iGOCG
38 AC,TI籠CTGC
40 GGBicGIOA醫c
69 GKGTCATSACGACMGACCGGGGATCCACS:
70 TCAGT謹CCGTG養謹CTC謹TG
71 i,GA,CTCC謹謹TGTG
89 T簡IA簡GiGGGC,
91 OTGC,MTicTG,MI
95 SGG,CTGC51A
113 TABBiT謹歸
149 OTOACCAOOCAATGOOTATOO
203 Cci歸i謹c5c
2CH GATCG1TGCTGC1C謹C
205 TCGCAGGMGTGTCCTTAGTCGAG芸
219 TTSCTCGAGMGTCCMMT讀讓ATAC
223 1謹震8CABG
225 CATCTTCA0TGTG0T0TACCTCACG
226 CTACTCGMOSVTS-AMS-GCS-AGTGCC
291 GAC1TCIGTCG,IGGGSG
292 GACCCGTGGGACTTAGTTGTCTTSCTTC
296 GQ-GC3TCTCGTSTGT0T
291 icc畫謹謹c
298 GT謹G,謹GG
299 ATCGCTTCTCGACT0TT3CC
300 IGCTCGIGCG8
321 GACCTGSGGCSCgGCTTGTMTCATGG3SG
332 CATTTCTTMTACCGACCTGCCC窩S
333 c雲iG,8il讓G
335 CATTTTTTAGMT習C9CAGGAGTTC
336 AGA3GGCMGTTCCCTTCG
337 GAA1霞I誓G
338 GGMGASGTCGA聖GCGAT
勢溢 a 誡45/91:3
Mo. ^f^ 一5、-3、一_
363 CATCTTOTCCMOTACCOOOSXCGAACOO
364 S5T, jT羅cc
373 GiG謹醫薩AGACBB
374 CATCTTG醫謹iG0TC
395 ATGTCGAGGATCCATTCAACGSGGATMOT
408 CASI,CTGT1謹TTTG
413 ivma-finmoM-TSG-TTA3GOCSGGT
511 TTACTCGAGACTCTAOTMTTGMAMTATG
547 0 CMGATTO0AGGTTCCTTSG
548 TC,CGIC0TCCG8醫TI
549 GTGCCTClcACATCCCicc
550 liA,ooci,,
S2 CATCCTTACAGGACGTACTGG
612 GBGATG,GTTCTG
.3 TT芸CTCGAGATACMGAGTTATMATCMATAC
839 S-ATCTCGAGMGCS-GTRRGATRMTCCMTTA
858 1CT,T3CCHTCGS
9W M-ATCTGCAGTCATGMACTTT9TTATGTMC
ATATGCOOCCGCGGAACGBATTTGTCGAGCTCTCT
908 CTTTCGT3TGC0TCMGA0TG
943 ATATCTCGAGGMTTCATTTCCATTMCGAGMTATGAC
944 ,TCACMCGCTTTATC5C
950 CAT,GT1GTTGTGG
mcGIICICC
9S1 ,CG震A,CCG
970 MGCmGCMGCAGCTCTCG詞
911 ATCGM!SA緊TGCgGCC
983 AGGAOTGTTACACATCTTTT;ic
9S GGCT芸GACGM;GCATTCTGTG
li GG3iGGiiG
1001 CGCT望CMTGATCCTGSTAG
10R TC0OTGMCTCCATCTCGTCST
8F CGG3CCTACMGGGCCTCTCG
9F TGGGACGTATCAGGGTACGTCT
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<110〉 greenovation Biotech GmbH <120〉苔蘚表達促進區域 <130〉 R 42095 27
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1 <211〉 1533 <212〉 腿
<213〉 小立碗蘚(Physcomitrella patens) <400〉 1
tagcataaga taaagatgtt ctctacctaa tttattttta tttatcacta ataactcata 60 tcaatctaaa atatataaat gcctttaaca atagaagaat atgattcaac aaacccaatt 120 ctatcattaa aaatatatct aagattagat atgataaaaa taga.taataa tattaataaa 180 tcattttaag gttgtaatgc aactataata atttttaata ttataacttt ttagtttttt 240 aaaataaaaa taaaatgtta aaatattata aaataattat actttatata tttatgatca 3003gttagta_ca_ ttgatscatt t犯agtcca^ a^t犯ttt犯tgata^cc^c ttgc3a^aB3 360
tttMtatt3 tta^3tatt ttaaeiaagtt ^gagc犯ga肌犯ttattc ta^tsg^t 化0
tcataccatg gtattataaa gatacaaaga atcaatgtgt atttatttat tttacataca 480
tt8cttgcaa tatatggttt atactac犯a tgactatata ttgeLagatac taaccac犯a 540
83t333a8tc cagcacta^ga t已3ttct333 aacstgaast 3C33t3333C 3tt3C3ttac 600
tagcttatat ggttactaaa tatttttaaa ttatacaaat aaaaaataaa aataaaacaa 660
aaaaatccta tagtgacaag aaataaaata aaataaaaaa attataattg accaatccct 720
肌肌catt^ tattt肌ggg atsttcatat gsc犯taa^g at朋tttatt tcatgg朋cc 780
ttgattattt tatcttttaa aggtggtatt tttaaaattg tttaatggta cttaaaatat 840
tgtatttata tagagaaaat cctcc犯a犯aMtctctca caagggaata gaattcctca 900
agtttttctc ttgactaaat tgaccaacca ccaaacaacc cacgtcatcc atccatccaa 960
cccccacaca acccaattgt ttctccattg tagacatcga caaatgaaaa tcatccgatg 1020
acgtatacac ttcatcctct g'gtccctcca gggtgccatg agccacatcc cgaccgccta 1080
tttcagatcc gacggcacag ggtgacagag cagcggtctc agaccacgcc atttggaact 1140
cgccagccct gccccagcta acagtttcaa agctgcccgc cataacccgg tcctcccagg 1200
gccgttagat cgtccatcct acgggagcac atataatact gccctagtgc cctaatccga 1260
tgggaacggg gagtccttta tctctctcgg a犯gcgactc attcgccagt gtgcgcatcg 1320
cccgtgtccc aaggcaccgg gccagactct cgcatcggct ctacccacac tcacccccac 1380
tcaccctgtg ttttctctgc ccccttcgcg ctcttcgtgt gtgtgtgttt tttcacggtc 1440
gattggcgag ttgc卿gga gggcaagggt gctgtggtgc agcatcagct ggtagt卿t 1500
cagtcagggt tcgggtcgcg gtagttggac aag 1533
〈210〉 2<211〉 1539 <212〉 DNA <213〉 小立碗蘚
〈400〉 2
atgtatttcg gagcgatttc gtgtgctgtt ggtgtctUt ggttggaagc gatttaaaca 60
ggagagtctg tttggtggct tagggtaatt cggtggagcc tg犯agatat tgctacgtct 120
tgaaatacca tcttgtttca gtgcgcattg cttgcaaaag cattgatagt tgtagcggga 180
tatggtgctg tttatggttg tatttgagca tatgtttcgt gacatctgtg ttgcttgttg 240
ggcttgccat actggtagtg tcttgttgag tatcatattt actttccaat gtaatattca 300
acattttctc ctagcattac tataccattt ccatctattx ccaatggcgc tatcgtctcc 360
ctgggataca tttaacccat atttgtagtc cagtgcatta aatgcatgtg aaatcgcatt 420
tatagatgcg catatttaat gtca犯ttag acatcttcac tcat3taata csttttacca 480
aaaaatgaaa tgtacacaca gaatattttc aaactgccga ctatctcaaa aacctataca 540
ttatcaatct cattgacata cctcattgaa atactcctca ttgaaatact acataatttt 600
csttgtcaat attgccaaca ttc肌ccatg agaagctgat tattatttct tttatactgc 660
ttactctctt aatgcaaatt caccattcct catgagagca gctgtatcta ctcccctgat 720
caatattact actaacttct caggaatagt actcgatatg ttgcgctggt tcagttacgc 780
aattataaag tccatcgtgt aaaccataat cgtcacaact ggatatctga tgccagaatt 840
tcagcaaatt ttagtgccga tccgaccagt tcaatgcaga agagg肌tat aactatctag 900
aggttgttca caatcttttt cattac兆tg cagccaaagt tctgcaacga agatacattc 960
gcaacttgca tgcaaggtga agacacatat cgcggctaga tcctcagttc gttgttaata 1020cctgggaaag aaaatcaaca aatcgaattt ttctgcatca aatagccatg acaaagatta 1080
gtacttccag tgcaagtata gtctgcggaa atatatcgca gtcctcgtac tacagcttca 1140
aaatttgggt acatgacgag gatttcgacg cacaagaaca gaattaaccc gatcgtatcg 1200
agcgttacag taaacgagac gaagtgcctg tgtcttcaaa ccggcagatc tctacgaagt 1260
aagaatctac tcagcagtga gagcgagagc gitctggtgtg gcagaatcta ctatgattac 1320
aag'tgcccta tactgaatgt agaagcctgt atccacctca tatagg肌ac gaagtaatcc 1380
ataccgacat gttacatatc tccactgaag cagttccg'ta tg'ggcataca ggaaatgatg 1440
aag'cacaacg cgtataccaa ttttttatca gatacacaat cacccaattc肌aacgcacg 1500
tttatacaac caacacgcca tgLctcaagat gagcaggca 1539
3 〈211〉 1〗97 腿 <213〉 小立碗蘚
<400〉 3
tccttagtcg agaaggcgcg ggacgtgsgt gagctctgaa gataagcttc caatttgcca 60
ctgcaagtgt aacctgctcc atcgggcgcg agtccgtagg gatcatgaac acctcatttc 120
acttggcgtt agtgcactct agcggcattg ,c組cca tgccctc卿atgagtcgcg 180
gggggcagtg aacgaactag ttaaga組c cagtaatgac ggcaccacat cggcagatcc 240
agatccattg cagattatcc tcttcagccg gaccgaataa accatgccta aataaccacc 300
ggaatgtgtc ctgtgcggga ctgattgttt tccaaagaaa cactaactaa ttatatccag 360
acagtgggat gtatgcgggt atccgtg, ccagatatga gatctctgst犯Eicctgagg 420aagatgtctt acatggcggc acgggaaaca cgaagaaaag ccgaggagaa ggtattgaaa 480
gctgagcata gccsttggct ggtgagga犯gggcstgc犯c犯ctc3tcg 3犯gcgg3gt 540
肌actttgaa已tcccgtagg cttcatgcga tgttctaaat tcttagcctc gacgacgatt 600
tcaaggtctg attcgaagct tccgagcggg gctccggaac tgtcacttca gtcgactttg 660
aaatgtga^g cgactttgct cacttgtgac acagcaattc aactccacaa tataa犯aaa 720
tcgcgaaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaatc tactttactc gtcgatgttc cactcgaaga 780
caaacagctt taaagcgttt acctgtggta gagatagatt tcggcgaagg aattcaaatc 840
cagcaaccct cccactcgta ccgcagacct tgagtttgaa cggttctgtt gctgtttgcg 900
gtgagttcaa aactcgactg acctctctga aaccaaaagt ttaccttgag ctgcccgeiga 960
atctccgaac gttcgtatata agatccaacg gtctcaagaB attctccctc gaggaacacc 1020
tatgcccagg ggcagggggt tcctttatct ttctccctct gccgcaatcc atttcattgt 1080
gcttgcagga ctg'tcatccc tccccttgtt gccagtggta tccggaggtt cccgcgacac 1140
cttctggtgc cggaactaag gtctgttgtt cctttcgtga ggtagagcac actgaag 1197
<210〉 4 <211〉 1012 〈212〉 DNA <213〉 小立碗蘚
<400〉 4
atgcgacccg aaggatgagt acacgcgttt tggttttacg ttactgactt ttagctcctc 60
cattcacact gcaggccctg gtttactgtt g犯agcacgg ttataccctc cgtaaactga 120
acattctgtt tcagcgcgtc gtgtcttag't tgtcctttgg ttcacttttt agtttggaag 180caagtcgttg tatagatgat acttagcaca tatagttgct gtcgatttgt tttaagttca 240
gcattccgct gcctgaattt cagtaaatac cttgtccaac ttcgatgcaa tataagttgg !300
cttcagtatc cagtcttgcc ttactccttc attgcaatct tggtggcggt ctggtgcgcc 360
tcgtccactt tcacgatgta cctcgtcagc ttgtttgaac acttcctttc tcctactgag 420
tatggcgttg gcctcttttt ccaagctctg ttgatgtagg tcctaccttg tcaaaacatc 480
acccacagag atttg'acgac aatcgtaatt ttaatccgat tgtatggggt tcctgtcata 540
gtcaatatat taacgcccat cctctcactt accaacgtct gttaccaact ggacaataat 600
gcattcacaa ccaaagtgca atttttgtat gagttggaaa tatcga肌ca gttagtgcca 660
gtaattcacg caaatagttg tgtcatggaa actttttttt aactttctgt tgtccaatca 720
tcgtgctgaa acatttagaa atgtggcag已cagttgcatt tgatgtatca actgctgtgg 780
tagtaacact tgttga犯ct gtaagataga catgccaact ttctggtgct atgtgctaat 840 tgtttatatc ttcctgaaga atggtacaat tcaaatga犯gtgggtggga gaattgatat 900 cattgatagt ggaataggtt attgcaatca gtgagtcctt ttttcagggt agctaatatt 960
ccttactgat tatccattga ccaccagtgt ggcttgtgga atgcgtgaag tt
1012
5
<211〉 1386
<212〉 醒
<213〉 小立碗蘚
<400〉 5
ccgtgggact tagttgtctt cacttcatta ggaaatctgt ttgagcctct ttccattcca 60 atcttctcg3 c朋33taggt Utttcagtg 3ctcat朋ct t3ttgtgctt tgc朋朋ttc 120
56ccactaatcc gaaatgtatg gtgtgatcac cgagctttta aattgattgt gtttgggcag 180
tctacgaaaa atccagacgt ggagccttcg aggaacaggt tgttcgcgca ccgctacttc 240
tgaacttcac aacgccgcgt ctatgtcgct ctaactcaga ggctataaca caagttagcg 300
atgtccatcc ctctagtctt catatttgca acattaggag gaggcacacg ctggtcgaga 360
tgcccgtgga actcttccag attgctacca tcaatgcact cgtagacaga tccaaaagtc 420
attccacatt attcaacatt aagggatccc caactgacca accaagagca ggtgctatga 480
gtggaacttg ttattttcca aatgagcgtc gactacatat gcccaggcag aaggatatgc 540
cgaggtatct gggggggcag gcatgtgttt tgtgta肌gt acccccgagg t犯gaacttt 600
taagcggcgg cactggattc agaaacagtg gacagatata tccattgcca atgtattgat 660
tggctggcga agaactgttg caaaccacgs ccagccgtag gggcgtaaaa tttgaatcca 720
ctgtttaaat ttcaaatttc aaacctcgac ggagtttcct ttagcttttc agatgggcgc 780
agaacg'gtta ggaaactgtc ccgtcgcccg aatttgaatt taaaaaataa atcaaaacgc 840
tagagcttcg attagtatgg gcttttttca ctcttctgtc caMtctttt tgttttttac 900
ctcatgcaag gcggtcggct aaagtgactt acagggagga atattactga gagc犯gagt 960
tttaccacgt tgtaggatct ggag肌atcc aacgatgcta ggcctacgca acgagtgtga 1020
ttcaacgcca gctataatct cattcgtgcc gtcgatcccg ccatccaacg gcgcagacgc 1080
tttgcgtggg aattgtacct tgcctacgat tggaatttga ctggcagctc ttgagctgga 1140
atttacttgt ctgcctgaga aagttgaagc gtaagatgct cgatccaacg atgggcagaa 1200
agtgttcgtg ggcaggaacc aaagccctag ggcgggctcc tccttttatc tatctctctg 1260
gcatatctct tctcagtgtg cccccaggga cgtcttcttc tctccttttg ttcagcgtct 1320
cagtgctcga gggacggttt gccgtctttg tttcttcgtt ctcgttgtag atcatcctta 1380
gcgaag
1386〈210> 6
〈211〉 997
<212〉 畫
<213〉 小立碗蘚
6
ttgtgacctc tcctctcgtt atcattacgt agcacgctac gaacaggaca ttctgtttca 60
gcgtctag'gg tctttcattc agcatttaga accaaatcat tgtatagatt tcacccagca 120
taccaagtag ctattgattt gttgtgagtt cagcatgctg ctgtctgatc cgaagattat 180
ttgtaattga ctgttatatt tgagcatttc tgttcaatca tgtggtgtgg gtttgaattt 240
taattagcag gcactgagtt ccgtgacccg a犯ag肌ttt tctgagaata gcc3ggtg3g 300
ttgcttcctc ttttgctgtc ggggat.attt cttccgaaat atgggttatc cagcgctcta 360
tccgcttctg ctctgtgcta tgtg肌catg aatgcaattg atattcttcc aacatccata 420
taactaatgc atacttcata agaaagcaga ccgtcacgga t肌tgggaga犯cattttcc 480
agtcatctcc gtgtccacat ttctctcaca cgctaaccat gttagtaaac cgcaaggact 540
gttatt肌gc犯tg83t3tg tctg朋33tc gtstgtgatc tgttgtc犯3 gtgtc3tsgt 600
acccgtcatc gccgcattgt gcactgctgt cagatccgca gtaaataccc gct犯cgaaa 660
ggaagagaaa gatgagagaa gatgagattg tcaccgggag agaatcagac gcagtcatca 720
gtgatactat tcgacggacc taacctcgtc cgtaaaatgc aagaatttaa cgaggcagta 780
aaatcagctt aaaacctccc cgcacgctta acgtaaccat ggctgtgcta aacatccacc 840
aagagaggaa acaccgcaca tgaacaactc ttctg肌cta cacgtgaagc agagattgag 900
gcgaaaagaa agccacagat cgctgctcct caagtggtga atttattttc ccttggaaca 960aaaatggagg tgtggaggcc肪gcagcaat ttcgatc
7
<211〉 624
<212〉 DNA
小立碗蘚
997
〈400〉 7
ctcgagtgca gtagacgaca aaatggaagg atgcgaccag ggatgaacgg gaagagtatc 60
attaatgcga gacccttgga gttgaaggcc acgagtggga cagcgatgcc gagaaaaatt 120
tgaaaatcgc tcatcccaga caaaMatct gtgggccagc cagggtttcc cagccagctg 180
ctctgccgtg ccagccgtag atctgctcat ccgacggcca ctgcgcccca tcctggactt 240
gtaccctccg gcatttggaa agtgtcagcc tctccctgac gaaca.tttca cctcggctgc 300
ccggg鄉cc aggagcgtca gatgggagat ctgacggcgg ggcggaggag卿cctg肌c 360
cggcgggcag gggaacgatg tcgttgcttg ttcttctggc tgaggcgtcc atccccttta 420
cctccgctgt gtgtttcaaa ggccgatatc tgcgcttccc ttgcggaccg恥ctctgtcc 480
cgctcgctta cttctctccc accgagcttc cgaggttggg cattcccacc cttccttctc 540
ttctcctctc cttctctgct cttcttctct gttgtctgcg gattaggtct tgtggtcttt 600
cgagcttcgc acagcttgag caag
8
<211〉 1146
DNA
小立碗蘚
624〈400〉 8
gcgcgcggU ggctgg犯ga卿gtcgaga agcgatgtgc ggcagcggca gcagcaggag 60
gggcaggcag tcag'gtgcag cacgtcgctg gggtgatgcg gagggactU gccggUggc 120
tggggtacag卿cgagggg ta組atagt a卿ttacgc gcggcgg卿gacgcgatgg 180
ccaacgaggt gg已ggggttg gggcggtttt acgtgtacag tatgagsctg acactgacgt 240
tgatcctgcg cgaaccaccg gggctagcgg tagtagatag ttggagcgag agttcgggag 300
cgttgttgcg gataagctcc ggcgtttgac cccagggtgc肌ccgtagtt gcatgggggt 360
ggtgggggga ttgaaattgg aaccggactt ggagttg, agttcgggtt gtttttggag 420
gcagttgaaa gacgttttta agaagtttga gctgttggaa atacattgtt accctgagct 480
taagcagtgt gtagtggcga tgtgtttaat tgtctgattc ctgtatgttg gtgtgtgcga 540
ggcgtgtgag tgcgtggttg tgtgcttgac gtggcggtta tgggccgtgc tgtcgg組g 600
atttactgga ttatttggtc cattggtttc gtggactgga gacggtggat gtttgtagtg 660
cttgtgtgaa caaggcgggc atgcagatga tgggctcgca ataaagacag ggtcatgtcg 720
ggtattgccc卿tgaaagt ctcttttggt gatgccgata cgg肌組gg ,ttggtac 780
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<211〉 2973
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<213〉 小立碗蘚
〈400〉 9
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<211〉 1128
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小立碗蘚
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〈400〉 10
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tggcttggag gtgtctcgaa ttctcttgag atagctctta ccgtaagctc tttttatttt 2520
tatttttata tatttttgtt tcttttttga actgtgaatt gtgtatattg ttttcctctg 2580
aaattttctt tcagaatcta ggtggtaaaa cattctgata cttatgctta ttgcacggtt 2640
tatctaattt actaagattt agtgtgaatg tgatgatata attttactaa aatttaagat 2700
ttttctaaaa tttaattgca gctagtgtta tctttcgagt cgatgctaaa acattcctgt 2760
tgacacgatg atcatg犯ag ttagatgtgg cttaataaca aalgcaggaa ttaatgaatt 2820
ttatttattt atttattttt gcagtttttg aaggatacca ttgctaagct aggcatacct 2880
tattcgtatg gtttcgcaat tattctttta actattttag tgaaggcagc tacttatcct 2940
cttacaaaaa agcaggtttg ttgttctact gattttctta ttttgtgctt tctttctttc 3000
actttttgcg tacaaatcat ttttgtgata tactaattta ttgtgt肌aa ctaeiaagaat 3060
tactatattt ttcagctaaa tatctgtcga tgtcctgtat ttactcataa gttttatggg 3120
tttaagatag tacccagaca ggactgagtt ccattggtag gtcagtactc ctgttagatt 3180agggaggctt ctattgttgt atatctaatt gaaagtggtt atgtttaaca ggtagaatca 3240
actttagcta tgcaaaactt acaacctaag ataaaagcta ttcagactcg ctstcagggg 3300
gatcaagagc gcattcaatt agagactgca agattgtata agcaggctgg agtcaaccct 3360
ctcgcaggtg caattttgtx gaagtcctcg aagcattaat gttaagaatg cttgcagatc 3420
actttccggt ttttgacgga cacaaaatac agtcgaaggg actaatactc aataacttgg 3480
ttctgtatgg tagctcataa gggttgtggt ttatgatttt acagggtgtc tgcctactct 3540
cgcaacccta ccagtatgga ttggattgta tcgtgctcta tcaaatgttg ctaatgaggt 3600
attgcatcat gaactggagt gcttgaaaca gttgtccttg tgcggcatgt tgttccacct 3660
tagtttattg tg肌acatag gcgtcattag ac組ccaca tttagagtaa tacaggaagg 3720
tcttaccata tattcatttc aaagaggttc aacagacatc gtaatgcaaa gttctgtaca 3780
ttttctcttg acttcaacgg gagaatatct attcttaaat gagatatttt ctgtggtact 3840
ggtattcaag tatgaatgta tgtaactatg atttacttat gcagttctgg ctttgcaggg 3900
gctcttgact gaggggttct tctggattcc atccttggca ggccctacaa cgattgctgc 3960
tcgttccagt gggagtggca tttcgtggct atttcccttt gtggttagtt agtcccttca 4020
gatgcttgtc ttcgttattt tttttccata tcaaatgt犯tgatgctggt catacagtaa 4080
catatagtga atttgttgat caa組ggtt gtccatggaa gctt 4124
<210〉 15 <211〉 3053 <212〉 DNA 〈213〉 小立碗蘚
15ttgttgaatc atgttaattg ccaatggtta tt肌tgacca tcatattgta cctggaatgc 60
attggaaaag taatgttcca ctaaataaaa gttgatccac caaatattgt tgtctagtca 120
tatcgacaaa tagattcaaa ataaattaaa attaaaattg aaaatgtata aacattggca 180
tg'肌船tg8t 8tt犯ttt犯aa_ca_3ttC￡L￡i 3acttELt8C3 att3ttt3^ 3t^LC3tt兆t 240
caccgggtta aaggagacag actgacag肌ttggattgcg gcaatcagta gcactgcaca 300
aata犯ttta acatg;a犯ac attatgattg ctaatactct gtttgcatgc acttctacaa 360
caacaaaaac aaaaaataca atcaaacaaa acaagcaaac aataaatgat tttagatttt 420
gcatgataca agcaccagag ataattatga cc3tgtgata aatacaattt ggaccattta 480
tstcctacaa a^m3g犯a 3肌g肌aB8a g肌肌gtttt tgtttgtatt tgatstcttt 540
attttgttac caaaattaga taattgcaag ccttgtattg tctgaga_tgg aatgtatatg 600
ta3c;ac3ttt gagcaa肌M ttgL犯tta^1 ttaaa_tt^a_ t幼gattttt ttiatststa^g 660
taaattgtaa aattgaccca aacatttact aaatcaaccc acccattcta accatcataa 720
gaagaattcc gctatc論at ccaggttggt tgaaaaccaa tgaa犯aatg gttggcttct 780
caaccaatga taatggatgg gttaatttaa taaattcatg ggtcaattta aaaattccat 840
3tatat肌tt肌犯atcaat tgc犯aa^at 3ttttgacac aatcsc3cgt gttttg朋aa 900
tcatacatgg acaaaaatac aaagagattt tttaaccaat attttggaaa cacatttagc 恥0
aaggtgtcca atgcccttcg atacccacaa g犯cacacct tactttgccc atatttaccg 1020
atatatgctg cagtcagtta gggttgaatc cctgagggag gggggctccc gtgtgaacaa 1080
agtcc犯tgt ggggccgccc aggattaggg caccaggtgt geiacgaggct ccacccgagc 1140
g;agagccagg aatttgaaac tggcatggga犯gggggttg gttccacctg atggcacctg 1200
cccaccacca ctagtaaaga ttcaatgccc accacactgg tttttgaata taggatcttc 1260
cttctccttc taattcttct cttgatggat gaat犯tata accgatg犯t gagtgggcac 1320atggacgggc ctcgccccct ctctactctc tgcaatacat tacaaaatac atacatgtat 1380
acatagggat ttgatgactt caatacatac acactacaaa accgggtcag gaggggggta 1440
taaccaggca agcccgagtg gcgggcagta acaaatacac acccccaaat cgtatgggcc 1500
ggacacgtct gagcgacacg cgggtgccct gccctcctgc cccttccctc gccccttttc 1560
tctcgaccgc ctgtcgccgg cccggcccag actcctgcca acctgggaac caacccccct 1620
ttttggtgag tgctcttcac ttccctcgca ctcgctgctc aagttgaggg agggagggag 1680
taggagtagt cactcacccg gcctggcccg gtccggttcc ggtccgcggg ggctgcgttg 1740
cgcgacccgt tctcgtgggg ttatctctgg ttctctatcg ctcgctcttg tgcatcgtac 1800
tgctcctact ttttcccatt gttgctatgc tcgctgccct gcgctgcttg gccgtccgtt 1860
gtgcccctcg ctcgtcaacc aagcactgca gttcgctccc gcattccttt ctgcagcacg 1920
gtgtatctct ctctctctct ctctctctcc tcatctgttt agcgctggtg ccggttctct 1980
taaggtgaga gcttctgttc tatcggtgtt ctcggttttg gtatgtgtgg tgaccgacga 2040
tcggtttgtt gtgcacggtc gctggatgta tggtcgtctt tgttcttgtt tagttctgtg 2100
tggcg'attaa cgtgttcttg gaggagtatt tttggccttt gtctgctgat gcgctcagca 2160
gcgttgcgtt agtgtaggct tgtgcttcac atgagcgtgc cgcgcgtcta ggcgtggtgt 2220
ttgagttgaa tcttttgccg aatgactata gttattgatt tcttgttatc tgaagatctt 2280
gtgctgagat atgtggtgta gggattcgag aagtgctatc cccttgttgt gatgaacagt 2340
tttcatttga tgtggttatc atactttgga gccttgcatt ccgg'atcgtc attagcttca 2400
tctacgtggc tggatttttc cgtcaaccgt aggctgaagt gccttaaggg gttacatgtg 2柳
ctgagttgac tacatgt犯c aatggcatgc aaactgattg cgtgcacttc atacttgtat 2520
tcagttcgtt gtagagtccg ggatatatgt taggt已gaat aaagaatctt atctctcggc 2580
attcgaataa aaatttcatc ctttttgaat gcaccttgtt tgaaaggtcg ccccatgccc 2640
76acggttgact gagaacaatg tctgcgcatc agttactgat ggtcgcacct gttgtcacta 2700
atttgagtga ttaaggtttc ctaccggctt tttcttttcc actgatttag tttattcttc 2760
atcaagttta caaatattgc tctgtatatc acggtttttg ttagtctttg atgtaatcat 2820
attacctggg tttfittatct agtgaactst gactgatatg ctggcgcata ttctcctsct 2880
taatttgacc ttattagaag atgttcgtac ttagagtacc ttttactt論tgtaactgaa 2940
tctatcattg ctttcgttct taatcgtgct acaaaattta actcattctc tcgttaacta 3000
atgtttttga gcacttgcac tgtttttgaa ctcctgtagg atcattctaa aaa 3053
〈210〉 16
<211〉 1879
<212〉 DNA
〈213〉 小立碗蘚
<400〉 16
atctgtactg cacagtttta catttttcag gcttgcattt tgctgggatt gagttcttgt 60
tttgatag犯ctctggacgc aaatgtcttt gactgcttag ttgggctggc gagcacacag 120
taagaagtgg tacatgttgc cgaaactatg gatttgtaaa aatgaaacgt atctgggcgc 180
ataacgaact gcttatatat gtcgctgtct gttaacttca atctctacat gtccagatcg 240
atgcggtaga acccgaccat tttttgatcg atgtttgaac ctttttatgt taaataaaag 300
gtaccatgtt ttcagcgcat taatcatatt tattttggtc actatggact tgatgtacac 360
cggatgttac agctcagttc tacttcacag ttattcactg acttgccctg aaaaagtcgg 420
agtgc柳tc tcgttgtgtt Uggtaatct ggttggccag tctcagagct ctatUUtg 480
atgaatccag ttgattggca ctcaatgttt ttttttattt tttactttta tcatagtgtc 540
77aaggttgcta cgccaggaat gctgtgaggc acattctacc cgtatgaatt tcctcgttcg 600
caatagctgc aagctcaatt taggtttttc tgagcaagtt gtagaactat cgtgtactct 660
caccagattt cagcctctca gtgctgagtg ctttcgtcac gttaactaat tgtggaagat 720
ttggaatcat ggttgcatcc cttagtttga cagaattcac agtcgttagt tgacctctct 780
atcttggtcc accatatgtc幼cctgttca agagggctgt gctcggttag gtaatcactc 840
agaagtttct tcctacagaa aacttgtttt gtgggcatca tctacgtgga agaattgttt 900
gagcattaaa tcattcaaca ccttcagtta catgaagtag gttggaagca gtgccttgaa 960
gagatccttc acagaaagcc tctcaattct catgaagtct gcatctaact tcttttgaag 1020
tttgtacacg tgtgggcaga attgaagttg gttttgtgtt gtttg犯aca actgtaattt 1080
aataaatccc aaacaagact aaggccatct aacgttttca catgttttaa aaaattacat 1140
tgaactttgg gctaccgtag ttttagacag atgcaatt犯aaata肌aag aaaa犯atga 1200
aaagaaaaaa gtcttgtttg ttttagttgt ctgttttgta cagttttgtg' acctatttta 1260
gagtgtcatg tatcgaacat ttgactcaca attataaggt tttatatttt aaatgagtct 1320
tgttgtcttt tattttattt tgttctacat tctgtaatat taaaacttct attgaaaaca 1380
caacaaacat ttaatttcaa gtttttcaaa tttatatatg catattttgt atgtaaattg 1440
tacaaatgtt cataatgcaa attgaaatat ttaatgtaag attatagcac ttaaacctga 1500
tccda肌gat肌taattttg ggc肌ataat taa犯ttatg 3t鄧eicaaag ttteig^tgt 1560
tgtaataaaa atttatggta agtgctaaag tatgtaaaac aaatttcata aagaattgct 1620
tgtagcattt tcaagagaaa aa犯taaata cttacgacta tttttaaaat gacacaaata 1680
gtsaeite^c3 atatattgat gaggatstst Btststaatc 3a^tt犯cc sttsgtgstt 1740
tttaacctgc atagtattaa tgtatgggac cgcaaggtag acacctacct ctactggata 1800
gcacctctca tatacacaat aaaactttta ccttgctaaa agtccaaggg aatttacaaa 1860agaaattctt ttaaaaact 1879
<210〉 17 1823
<212〉 DNA
<213〉 葫蘆蘚(Funaria hygrometrica) <400〉 17
ctttcgtgtt gcctcaagag tgcctcgcga agaaagaagg ttccagcaac aactagag肌 60
tgggtacagc attcataaaa ctacagataa ttatccttca aataagtaag aaaaaagaag 120
gaagg犯ttg 3t肪ataagc aagsaattsa gca犯gcsgc cax:tcggct3 gacaaasgag 180
actgcacacg ggtggccaag gaaagcgccg gtcatagggg atatgcggtc atggggtcac 240
tgtttccggc agccggaatc gattgcaccc tcgcagtggc tgacgagtca gaaccgggtg 300
ccaagtggac ccagctcagt cgcgggcagg ccgaggtggc accgaagcct ggtc肌cgtg 360
gaatggatac gaatgtactg gatacgagat acgaatacga tacagtagag aaagaacgcg 420
gcgagggtgg cacgaattcg cagacacaac cgagtcggcc tgac犯ggcg ccccgcctgt 480
tctgccgccc cttccatcac ccgctttgtc tcattcatcc acggctcctt tttagtgtct 540
ctgcgcgggt cccaccccct ctcactggac tcgagatgcc gccctgcgct gcctgactcc 600
acctggcccg gcccgacccg ccccgacccg ttccatggca g'atgttgatc gccccgtctc 660
gcagctcctt ttgtgcaccg cgtggcttcg tacttggcca ttgttgctgt tgctgttgcc 720
ggtgctctgc tctgtcttcg cgaggcactc ttgaggcgat tttttttgta gtagcgcaag 780
ctcgttgtgg agccgcgccc agtaaatcat ctaggcttag tctgtatcca ctaccctccg 840
ctgcgatcac ccctgcttcg ttgtcggcgt ctatttctca ggtt.cgagtg tttctgagtg 900
79ttggcgagga ttgagtgt已g gagcgggagg ggtttgctgt tgtttttgtc gctggcggat 兆0
gtcgatcttt cgacgcgatc gcatttttct tttgattgtt ctgttttgga gaacggaatc 1020
ttttgattgg atatatagat tgtgtgtttt gcatgcgttt agaacgttta cacgggcgat 1080
gcatgagtcc tggtgtcgtt tggaggcc3c ggstttagt3 gtttcttgtg caaggtggct 1140
tagatcttgt actacgagat gtttctccat gattgtggtg gcgatgactt tgtatacttg 1200
acgtgtagtt taatggtgat gattc抓ta tcagtggtgc atgattttgt tacggatcgg 1260
atgatcctgg atccctgatg attctttttc aagtaggttt aattctctgc aagcgcgaac 1320
ggttggtcgt ctcattctaa tggtggcatg atcgcttatt aaattacgtc gactgaattt 1380
tctccgtctc ctgaattgtt ggagtagcgc ctggaaattt gttagatgga gatttttcca 1440
ttatccggga aattattcta ttaattcttt tagactcact cgctcataac gcatattgaa 1500
ataaaccaca gatgattgct tgatcacttei ttcatttgaa tttgacagaa tacttcccct 1560
tcctgtttcg gtgaattaaa ttatttcgat atttagaatt taatttaata ttatttttac 1620
acagtacaac gaatgcaaag tggaggagtt gtcaggacaa ctgaatccct cagtttttct 1680
agtctatatt tctgaagact tccacacaat atagtagacg ttctgtgcta tcctgactgc 1740
aagacaaaat ttacg'acgca aagtaacatc tcctttttta atctgagatc tcttcaaatg 1800
gttgggcagg tccgtattaa gaa
18
419
<212〉 DNA
〈213〉 葫蘆蘚
1823
<400〉 18aggagtgtta cacatctttt acttttttca gcacgcctct tcgctcggct tattgaactt 60
cgattacaaa cttgtgtggg taccg犯cta ggccggctag cgtagatcga gtagaggtcc 120
ttgttgcagg aagttttcgt ttgtaaaaat agctgatatc tggacacata cgagtggctg 180
attggattca gtgacattca cattatttgt taacaggtcc agggttgttc gtagagtctg 240
gccccatttc tcgtcggaat gttggcgccg ttttgtgtga aatgatggtg attatggtta 300
aaatgcatgc gtagtcctgt tgactatggc tgaatggata agatatattt ccatcatagg 360
ttagatttca agcggagcgt gaactgtgac gctcaatcac agaatgcgtc gtcttagcc 419
〈210〉 19
〈211〉 1333
〈212〉 DNA
<213〉 葫盧蘚
19
ggatccgaga ggaaagagag ag犯gaggga gcgactcatc tagccaggcc cggtccggtc 60
ctctgccctg cctggcgcga cccgttctcg tgcctatctg tggttctcta tcgctcttgt 120
gcctcgccct gcacctcctt ttcccattgt tgctgctttc tgccctgtgc tgcttggccg 180
ttcgttgtgc ccctcacctg tacactctcg cagccaagca ctgcagtggc agttcgcctc 240
cgcattcctt tcgtggccgc gtatcccccc cgtcatcttt ttcgtcggtg acagttcttt 300
gaaggttaga gcctctgtcc tgctgccgtt ctcgctgtgc ttgtgttgtg gccgacgatc 360
gggtttgttg tgcaaggtcg ctgtgcgcat cgtcttgttt agtattgtat gtcgattact 420
gtgttgtagg agcagtggct aagctttgtc cgctgatgtg gcacccaacg gcgtcgctca 480
agtgtaggct ttttctttac acgagcttgg tccgcgttta tggtgtttgg atgttacttt 540tttcccgaat gacgatatgt tgtgatttct ttacaacaag agattttgtg acgtgaactg 600
tagtttgtgg attcgaaaag tgttgtttcc tcgtttttga tggacattac ttatgccttt 660
tagttgtcac ggttggtggc tttgcattct tggtcgtcat tagtttcatc cgatgctgga 720
c;dttcgctac catcccaagc tgaagtgctg aagttgattt catatgttca gtttgctgtg 780
tgcaccagta tgagtcaaaa ctgattggat gtccttcaca acttcattct cttcatctta 840
aagtcgagta caaatcaata ggtacaggac tcctatattt tggtgttccg ccatagttat 900
cgtctttcgt caaaattacc ttattgagag gacttttcct tgcaaaggtc tcatcgagac 恥O
caatctctca gagtcagata cctatggtcg cagcaga犯t ctctagtcaa tgtttctaag 1020
ctctcctaag gattttcgct ctttcatcag atgtattcta tccaactcca agttcgcaac 1080
aatttcttca tacatcattg tcttctggtc tttctgttct gatactgcac cgattcattt 1140
taggatctta taatccgtgc ttgatgtgcg gatatgtgaa ttccctgagt gttcacctca 1200
acgtactcaa agttgttcta ctttcagcat ctttcagcca atgcggcaga tgcgatcact 1260
tccgaggact ttaaaattct gtactgtttc tttaaaacgc ctttttcgat tctatgcagg 1320
atcattgt肌gcg'
<210〉 20
<2il〉 3289
<212〉 DNA
〈213〉 葫戶蘚
1333
〈400〉 20
atgcatggca aaacatcccc tgtcttccat gatgagaaag gcgaacctgg actgcttgat 60 gg'tcUccca ggtatctcat tgtgcttcgg tagttgttga cgtcttcact tctgcttctt 120tcgcttcctc ttcttcttct tcttcttctt ctttctctct ctctctctct ctctcccaaa 180
ccttccttct gtcttccttc ctcttatttt cctatgtcaa tgaagtttag cacctcctaa 240
aatttttgga tgctgttttt taaatagaag ggacgggatc aaaggacgag tgagtgtcgg 300
cttttgcatt gcttccgttt tataacaacc tattaaggac gtagatcgtg tctgtaaagt 360
catctcttat agccttttat agtcttttta agagagaaga gccacctctg agtttcttat 420
agattcg'gac aagagatgtg acgacttagg aagtgtcttt cggaattttt cttgtgataa 480
tggcgttgca tttcttgtcc tgtcttattt ttaactgaac agtatgtacc atttttccgt 540
atagtcctta ctttataata tgtcctcttt tctttcgcct cacgttcatc atattctttg 600
atatgtacta ttaactttcg ctatctgttt tcttgtagtc ctttcaccgc gtgccgctat 660
cacagcttgg tcatagagga ggcctcattt ccagctgacc aactcgagat tacagcatgg 720
actgaggacg ggcttgtgat gggggttcgt cacaaagtct ac肌gcacat ccaaggagtg 780
caatttcatc ctgagagcat ccggactcaa aatgggatgc agatcgttgg犯attttctc 840
a卿ttttag ata卿a卿ggcggctgac卿gaaggag ctgaaatgaei aattttggag 900
agtgtttgag tgatgagttg tactggtata tcttttcttg tgc卿attg ccagcatttg 960
tcagcttgct tttgttagag tcctgacccc cagcgtataa ctccttgagt atatgcccaa 1020
gcaggcctag atgctgctgc aataaccttc tcggtg,c agggtagttt ttgaggtatt 1080
tttgcacttc cagatggagc tactactaca aatatctatc cttatcttac gttaaactac 1140
gatggaattg ccatgatcac tcaggtacgt ttaagttgtg attggacttt tagtgattac 1200
tttcagagcg agctatc犯a ctggtgcttg gaggagcaac gcaaggaatg ctg組tttt 1260
ctaatgatct aattcagctt aagtttttcg tcaaacttag tgatattttg etagttcatct 1320
cgttagtgaa acatctcaaa gaagtacgcc attaaattat tgcagggctt gtgatgacst 1380
tatttgatag tttacctctt aaactgagaa cgcattgctc tcctttgtat agttccagtc 1440atttgaaagc tctatttgct ctctgtaact t犯gccttgt tcaaggcatt taaattccct 1500
cttccacgat aaaaatggta gttatgttgc tggttggaac tttcaagata ccataacatt 1560
gtggtt.ctca ttcacaacgc aggaagtttg ttgacctata tttttgaaag tggcgagtga 1620
aattgtttac tcatcacttt atgtgtgttt ctagtatgtc acttcaattc cttcctcaac 1680
tg'tgcctaat ttttcatctc tgtgtgtcac gagcgtaatt tggcttagac gttggaacat 1740
tctaaggttc cagtaaccag ttttcattta ttatttttaa attcacagcg cctcaagtaa 賜O
tgaaaggaca aacgccgatc attgcgcaac tctaattgtg acggtcttca agacaact犯 1860
cggcaggtca ctctcttgtg atgttctcgt tgttgtc犯a cctgtat肌t ggcaattcat 1920
ttcgacatca cggca犯ctc atgatggttt ttaacgtgat ttgctcacca cctttcattc 1980
aaagttatca ccgacaccct atgggtttaa ccatgttatc tgaaagcttt ctctacgtat 2040
gtatgaatct gctcattagg gtgaMttgg aacttaaaga atctxacacg atgtccatga 2100
attttgttac tggacaacat atactgttga ccacatagat atgcatgttt agaactgcaa 2160
aaaagtttgt tcacgaagac agaacgjacta gaacgcagaa tacctgcgat cggtggaatg 2220
ggatcatttg cagtaaagct agta犯ggat cgaaatagac gcagagtaaa cccgatgcgt 2280
tagaggggaa tgggagatcc acaggactcg gagagaaaat gcaeiccctgc gggtaaa肌t 2340
agagaacgcg aggaggaagg gtagccagaa gagtttcacc gggatctaca gtataagccg 2400
caaagggagc cacgggtact agtgcc兆ct ttgcagcaga gagcg肌cgc gagggagcga 2460
acagatccgg gccccaaatc cccttcttct atctctcaag ccgtccacag ccttcattct 2520
ccatcctcgc actattctcc tcacagcagt tgcatttgtg gttctctcca tcttcaaccc 2580
ttcgactttg gtgcaagccc gcttgttatc tatcccaagg tttcacgcac tccccccttc 2640
gctgtgtgtt tcgttgcaat atttttggct ttagttttta ggtttataca tagtgcacat 2700
gctctcgcaa aaccgtgccg cttcagggga tcgtggttct gtagacttga gcacagagat 2760gcgggtgaac tcttagtggt cgccgctgca tccccagagt agttatgcta cctaaagaag 2820
cgtgctcgta cggtcgatat gtttagagat ggatatttag acgatggtgc gtgtcctgcg 2880
gtcatcagag taggtgaagg gatttttcgt aagatctgct tttgtgacgg atctgcaatg 2940
caggaggtct gcgtctttct ttttcttcag cttcgtgccc aatgcgtcaa atgcgcaccc 3000
attgcacaga gtgctattaa ggcggcttca tgaagctccc agttttgtga atcatgttaa 3060
cttgtccact gatcagaacg ttcgggctgg catacgtgaa gcgaatacac atttttctac 3120
agcatgttcc ttattttagt cttcstactc actgcttcga ttgccggagg gcctccatgt 3180
tcgaccacat cttcacacgg ggcttatcat ctgacctaaa tcgcacgtgg cctctgtatt 3240
gtgtcaatgc cagtaacagt ctttttgatg cgcagaacat ttcatctcc 3289
21 937 <212〉 DNA
<2〗3〉 地錢(Marchantia polymorpha)
<400〉 21
catatgcgta cggagttgtg gtccccgatc aggattcttt gcttcgcttc ctaatgtagg cttcgtttgg acacatacat ctggatcttg g'tattgcgtc atctttgcga ggtaacggcc gactcaagga atcttccctc tcctgctcca tggg'aaatct ttcatcttgt tgaccatcga tctgcatgtg atactagcgc agtcttcatg
gccgtagttg ctgttggtgt ctggtcacag 60
tggccagggg tggatcgtct tcctcctacg 120
agaggaacac gtgaattaga gttacatgcg 180
gcgccgcaga cctagcggtt gcttctgcgc 240
tcactggaat gagagttgca gtctgatctt 300
ctctgtcctc tcgatgaggt ctgggatgat 360
attgtcacat gcatccagat gcgacatctg 420
85gcgcgctttg tgcttggtca tagccgcctt tttccagacg tggacggcag atcggtcata gtttgcgtgg tctacctctg ctggcctgcg taaacattag gctcttcagt tgtctcgctc gtgtgttgct atgtcagccc gtgtagtctc txatgacgg'c acgtatctcg tcgccccgaa tctgcgtcct cgttcatgtt gacatgaatg gttgacatat acattgtgat gctcatgtct tcatcttctt tcattttggt taggtaactt
〈210〉 22
<211〉 3025
<212〉 賺
<213〉 地錢
cttttatctt gatttgccta atgagcccca 480
aggtccaaga gcaggaaatg ctatgaggcc 540
aa犯gactgc ctgtccgact tcaatatctt 600
agaccattat tatgagttat tgttaccgta 660
gtc犯tttct ggagggtaat gcgaacttgt 720
gatcaccctt gttgagaagg atttcatgcg 780
atagaagccg ttctgaagsc acga犯tgtg 840
tttgtcgagt caccaagatc cgcaaccatc 900
cgcgaaa 937
<400〉 22
tcatgatgtt aagcgttttc ataatcc論a ctgaatatgc aagcatcata ttctaaattt tttctttttc tttaaatt犯atttccttca gagtattttc cgactataga tcttagggta ttttttctaa ttttatgaaa agagataaat gaaattcaca ga朋atacca tttttgtctc atggtcatat acttgggata ttttt肌att
gaggttttgt atatagataa aatttacttt 60
aatcgaacat aattttttct gagctttctc 120
ctgcaatttt tttattacga ctcccacgag 180
tataactata tatcacgctx gttctaaaca 240
3tWL^t33 t￡Lta_ggtta_t ttagattstt 300
attcgatatg ttctagatgt gtgtgcgtat 360
gtgaatacaa gattataaca aagttatcat 420tgcaaaatac taaagataag ttatctttgg tgagaagaca tgatatacca tctgcatatt 480
acttattcac caattgacca aagatttaca atctaccttg atgaaccata犯tttgagaa 540
ttttatatgc agatatttgc ggatctttcc aatcattatc tagctcttgt ttacattttt 600
gctttcacaa aaatgcaata atgtgaaagt tgatgcaata atc.cctttag gttttttgac 660
tcataacaat tttctctcca aagcattgag attcaatgtg gacgtgatac ataaattcac 720
atcttgatta gttacatata aMgtggaac tgccgtattt gtcggaaagt tcatac犯tt 780
ttttttgttc atttgaagat cat犯gatag ctgcatatat caccattagt gatgatatga 840
tatatgacat gagaaaaata taacttaata tgaaggaagt cttgatatgc cttgctatcc 900
ctaggttgg'g gtaggtcttt ctttcatttg cgattattat tactgtgagg aatattcggt 960
agaatggatt ccttggaagt gttgtatttt tgacctctca taattaagca cagattaatc 1020
ccttcatttg tggtctatca atcaagtggt ctacgaatga ctctaMttt aagattattt 1080
ttgtagttgt gtg'gtgtttt agtagttacc aatcttatac ttgaaagaaa atgaaagcaa 1140
tgattactca tactactcaa tgccaagatc ggaggctaaa tccaatgtat acaagtatag 1200
aaatttgtaa agagttaagc tctttctttg ttcatgtagc tttgaggctt tgtaaaaata 1260
tggacattga ttcggatala gaggtgagtt gtgcac犯ga gatgaccsta cttggtgtca 1320
aggtgtagca tttttttcag attatttata agaaaataat caggaaagga aaataagtag 1380
tattcatcct agatataaca tttgtcgaga aatctacgag at肌acattt tttcagacga 1440
gaacaattct tcaaattttc agatgcaagg gtacgcattt agcattgcgc tgatatteiga 1500
gctagtctcc tattgcatgt ttgatttcat acatgtacca cccattcttg ttactgcagt 1560
gtgtgaaact tgttgaat肌gaagttccgc aattatttca aattattgag agtcttctta 1620
cataattttt acttatccaa aattcttaag aaccccacaa taaMtcagt gatacgcttt 1680
gaatggctca ccagttactg gactgccaca attcgcagca ttggagactt ggcc犯ctca 1740acc3gsg犯g
ggtgCElgtat
cgg'gtacagt cg柳agttg
aatctgattc agtgtctcag tagcttcttg cagtcccggg tcgtttggga gagg肌tgca
gtgcgagcgg gatccgcatg gggg卿Uc gag,ttcg agcgatattc ccgatcttcc tgtgctccca tgaccatcac gagcagctca ttcttcggac
ggaccacgtc tgtccaagtc aaagttgcca aagtccsagg ctcgaaacct ctgtgaaeigt ttagtctgat cgtataatct agattaatct
aaccagcgga ggggacga犯 cgacggacat
gggttggggc tgag組gcg
attctgtttt gtgcttctgt cgccttcagg 3tcgcttcgt acctccttcg
g犯cgatcta ctggaatgtc
ctcggggcac tgtttcgcca
tcctgtgaat g^ctgttga gcttccgcta cggacgggaa ccacgta肌g gggaccgccc ggatcggcgt tgggggc, cg,caggt acagggcgag atdagagcgg cacagagctc ctcggatctg acgctcacgc taacgcgttt ttaac
cctccctccc gatccagccg gcaacga已cc atctccctgg gcgttatgat cttcataccc gttagttagt taMggtta^ agctcgagga tatgcgtcgc aggcccacga aggccgacca ttggttgcgg
aaggaacacc agcactgtgg gggacattcg ttcgtcgaac ctctgctcgg ccaacgcaag gcggagatct
agtgagtgag c鄉accagg acagatccgg tagaattaga
cagcattatg asgttcaggc actcttgaat tgcacsgcag gagttccgag cagtccagca cctgatgtca tccagaagcg gstcgtgggg gatgatgctg ggcag犯tgg
agagcctctc cttcgcgctt 肌tttcgagt tcgaggtttc
tgagtcttcg 卿atcgggc gacgatctag atccatagcc cgtccccgtt
cttctcgtaa tacgacatat t犯ttttggg taggagtgag gcccagctgt ggg,gctg ggcgaggagg
aaactcgctt gttgttcttg cg肌gta^gc gcgttcg,
1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3025<210〉 23
<211〉 909
<212〉 DNA
<213〉 地錢
〈400〉 23
aagcttagca agcagctctc gcagcggatc tgctcttctg ctgctccctc tgcttcctcg 60
tg'ctacacgg tcttcgtcct cgcttcctcc acgcttcctc gcgctctctc caggtactcg 120
tcgcctcgcg ctctttcttc ttcctagttc gtccgttcct cgtaccggga tagggcggtc 180
gcgggtctcg tgagggtttt ttcgagc卿gtgcgtgagc aagttcatat cggtgggc犯 240
tg'catggggc gaacctggtc gg'gccctttt ccgaggccgc cggagagcct agtctccaag 300
ctgtagtatc ggtgttctcg aagatcggtc ggtgtctgca tctctccatc tcgattcgtt 360
tcgtctgagc tgatccgccg gtcgattttg acgatgtcgt gtcctcacct acgcaagttt 420
ggUccgagg attagttUg a,tgctgt c組gggaag tttagctctt ggttcgtgat 480
tagtttggac acggtcacat gaatcgtagg gacccaggtg tcgggcggaa tcttcagcag 540
tcatttcggt ttccgtaacg ctggatttaa gctgaaaacg ttcatcgatg gattgcggat 600
acc.atgacct aatggatcgt ccagctt已tt cttctggaag tetagacgtg tgatggctgt 660
ggcctgtggt agggttggac acgcccgcag tggtctctcc gaatttg組gtcgcaatgg 720
tcgatgtgct ctgccgattt ggggaatcga agtggc犯ac cggtcgttcg gactgtcgag 780
tgtatgcctg ctgcttgtgc gatgtagtgt ggatttttcc tccgatgttt tccaaacgtg 840
gtcgggattg cagttcttca atctaccagc ggagctaatt tcgtctttgg cttgcagtct 900
atcgtcgat 909 24
<211〉 2146
<212〉 DNA
小立碗蘚
24
atacaagagt tat3aatcat atacaatgat tactttcata t犯ttgttgs atattattgt 60
tacaacctaa gtaacaataa cattcaatta aacattcatt gtggttttca agcatattaa 120
tcattctttc ttctctaccc tatagtgatg ggaaattatc ccaaactcaa tgtcatactc 180
caggcaattc agaaatatag tgagatgaat accaggaata tttattcaca tcgaccccta 240
tcgccgggca atgccactcc caccgcggaa tgagaaactc cttgaaaaaa caagtccctt 300
cccagctgcc cgaaatcggc cgcctggtca gcacggcacg acactgccca cgtgcaatcc 360
tgacgtggcc tctacgtccg gaaggcggcg ccgttagcga tgtcctccta tgcaagttcc 420
txttgtggcg gggcagtgtg cccgccaact tcaccgtcac cctccacccc aacaagtggc 480
ccaaattact caggggcagc ccagcttcga aattttaagc ggtgaccgcc ccttctcatc 540
gtcacgcgtt acttcttttt cactcaatcg agtctgttta ttattggccg ctaggaaatt 600
gcagcttcca actccgcatc accgcgtgca gtacagtgga gatcttc肌g' agtgtcctca 660
ccaggaattt gcaacttgct ccttgcaatt tgtaataaat ggacagagaa gcctagattc 720
cgcatccaca gtgatgggtc acgtatc犯t aagcgaagct gcgttggc犯ctatggcaat 780
tggtttggtg tcttcgttcc tgtcaagttt gaaaagaaga gggagatctg atttcttaat 840
aagtgtcgsc ttgtctgggt agtggattgc gtggggcgtg tcgtagtgcg acgcgatcgc ■
atcaaattca tcgcctcaaa atttgtcacg ttgttgggtc aattgcaacg aactgcgatt 960gaaggattct tctcggtggc cttcaaattt gctttagtat gacagaagtt ttgcagctgt 1020
actcggcgtt tggaaggagt gg犯gtgagg tggatcacca cgcaccggag ttggtgaatt 1080
gtttactgca gaaaa犯atg gctttgatca catcagaatg attgatgttt cagcttgaat 1140
ttcacctcaa gatgtgttct catcatgaaa tttttattgg gccaggatgt actttcattg 1200
ttttgaaaga atattttaag acgcttgtgt tttacaacct ttcgg犯gat gcgtccttga 1260
ttgaaagtgg tt犯tgtttt gtacatcatt actggatatg犯aataccaa taa犯tgaaa 1320
tacaataaaa tatttttttg aaatgaaaat tggtttaaat aagcatgtaa ataatagacg 1380
gtggagt^aa ga犯aggt肌ta^aa犯犯a agtatgaatt ctattwtct tc^tatsaa 1440
agtaagaggt gtccgtttgc aagc犯t犯a aattcagtaa ttgctagata aattcaaaag 1500
ccaaccaata cacaccattg' ttttgctgca aagctagggt ttctaaggcc acaattcaat 1560
gactagtgac ttacatatta cttccaaacc gaagcaaagc aagggtactc cacgattgta 1620
tatatactca cttgtttatt tttaaaccat ctgaaatcac acaaaaatgt tgtgaccctg 1680
cttcattatg ataattaagt gacgttttaa tctcattaaa tttaatgcca ccgtaggtta 1740
tggacggaaa tggatggatg taaatggaaa gatcggcggc犯aaagacca aattccatac 1800
tactgcccga gtccgataaa gacggaaaca atgcgataaa agtaaaagtg agcagaagaa 1860
agtgcacggt cgaaggcggc gtttgtttac atttacttca ccaaaaccga gcaggatatc 1920
gggcacacgg tcaggaagaa attgttcatg acggtcagaa cattctggat ggttggcgtg 1980
cttgctataa gaacactgct cctccgatct aaacctcgga ttgtgcgctt ctagatactg 2040
aatttgtttc gaccctgcct tgttgagtgg ccgtagaggc tcgacagtta ggatcagtgt 2100
gccgttgaat ttagtgattg tgtagcgscc agtacgtcct gtasgg 2146
〈210〉 25 <211〉 524<212〉 DNA <213〉 葫盧蘚
〈400〉 25
gaattcattt ccatt肌cga g犯tatgaca gtgggaagag cttccacgtc atcca犯ctc 60
aaagtatccg acgtggtcaa tccaagtgcc agtgccacct cagctccttc accagtccat 120
ctcgcggata agggtgacag caaggcgcgg tattactgga taagagaagc ggccaaggcg 180
gcagccactg tggtccactt tgctgcgtca ctacctactg cgattgtaat gacgagcggc 240
agcgtcgtgt gacaggcttg aaccgaccgc tgcttcagcc gcaggcagac tagaaaagtt 300 tactcgctgt cccactcgtt ttctgggtgt gcatccgaag tttctggatg gttgcccgtc 360
gttcaataaa ttgtcgcgcg tcgagctagc ggacactttt gtcaccgttc ttctctgttt 420
attctggacc ag.aggtgctg ttagctttgt tgtgtgtgag tccttgggga aatccctgcg 480
cgtcacgaga gtttattgca ggg肌gtgat a肌gcgttgt gaag 524
<210〉 26
2088
廳
<213〉 小立碗蘚
〈400〉 26
atgcatgtaa gataattcca attagaatct ataaatttct tattataatt ttttaaaaac 60
aaagtaccaa aatattatta ttttaatatc ctctaagtta aatccatata ttaagtagaa 120
acaattattc taataaataa tgataaaeiat tagacatctt gcaataaaat ttcttttt肌 180aaatagatac ataacatgaa aaatatccca t肌atagcta acaccatcaa aacatttgac 240
caaatatgca cttttagatg tgtcaagaca aaaagaaata tttgcaagat tttggagtat 300
ctaaactaat gtttgtcctc tttgcactat gagtaggatt tcttttattt tgtttagtga 360
a肌gatacat tgc犯tttgt tttcat犯ta aa肌ctatax t犯tga^td gtgcta肌肌 420
ataacaagat taaaaaaaca taacccttct tacaacctta aatccttcta attsgactac 480
ctcaaagttg tgccatttag cac肌aaacc attcttttaa atctactt犯ccctccaatt 540
tccaatgagc ttcatgtgca tacacaagca tgctttcttt ctttctttct tgaagaaaac 600
ttatctgaac a肌cgttaat actctacttg ttgatgaaag tggaactttg accacataca 660
ggcttggtga tgtactttgt atatctcctc acagttagtc tggtgcaatc caaccatgca 720
catagaatat gaatgggg'ac atgcttccag ccactcgggt gtgcagaaaa cttgacaagc 780
gagattcaag caacggcgac tacgacgccg atcacgcaat acaaagcatt gttagtatgt 840
gataaaccag ag犯agagat cgagtatgtg cacacaaaaa cacacagatc cacaggtatt 900
gtctacggcg ccaccaccat ccgtcaaagc taccatctcg tcgaggaaga atggtatttc 960
t.朋aactagc aatac肌ccg ctgatggaa3 caaccg犯ag ctatgtcatt ggagagggcg 1020
cacgagttca tggaatacac agtgagaaga gataaagaaa taaaataata taaaatacaa 1080
gtgtgcatca gcaagacatg gccgaaatct aacaactgtc tgcacatgct gtggtg'ggtt 1140
gtatcceicgc gctggaggaa gt肌ctttcc tacatgcaca gaaaaacatt ttcagattag 1200
aaagctcttc tgttctagct aatctctagt accaagctca gacgtgtagc cgacgaagcc 1260
組agcagct gggtatgcta gtcactgatt ctg卿cggc cggtgtgtcg attgcgatgt 1320
atxtcagttc ggcgaaggcc tgtgtctgga acatgggaag agggtcttct tgcactcgtc 1380
aatctctcac agcaactggg c鄰ggttgta tccgaacgtg ga肌acgcag caaccgttgt 1440
tgaaccaaag gatggtattt ttctccgaga aaaacgccgt ggcttatctg gtgtagacga 1500
93tccctaatcc ggacatgacc gccgctgtgc aggtgttggg aaaccacaat gcgcsagaga 1560
tgcgagagat ggaggagtgc aagaagtacg actgcgaagc tacatgcttc atcgagcaat 1620
gaagtct.ggg ttttctccaa cttccgcatg cacacacttt tctcgacgac atccgtttca 1680
aggtacgcat cgggaaactg acgattctct gcactggtgt tcagactctc cggagaggcg 1740 gtgtcatgtt ctgagctctt tttcgataag gtgctgttga agtccagaat組ggggtct 1800
ggattatcct ctggacggct ccgcttctgg tcgaaaaaat ttcatcccaa aaaaggactt 1860
atctgttgac tgaaaalgtt taattgtggt gaggattgca tgcagcgacg tcgtaaagat 1920
agggtgacaa ggagcgttcc agagctcagc tcggggcatg ccccggcact ccctagcata 1980
taaacatacc gggtggaatt tgtacccacc aggtcttgct cggtgtcccc tgtgcccaag 2040
ctgttggctg cattgccctt gcgattcgag tgtggagaga ttttagca 2088
〈210〉 27 500 〈212〉 DNA 小立碗蘚
27
ggaacgaatt tgtcgagctc tctggttctg ggtcgggtag cagtagcttt gatggtgagg 60
cactgacagt cagtcgctca cacggcaaag tagcctggat gtgcttcgca acgaactctt 120
g肌tttgeigt atgtgagttc ELCtttgsaca tcccagaagc犯肌g犯tgg gttttttcat 180
gtttgaattt tatUtgtat agttgtgttg agccgcgatt tctatctgtc acttggcttg 240
atattctgag tttctccgat acgaatagcg aagtccactt gaacatctgt aacggcagca 300
attgcgtcag gtc組cctc tcagattctt tcggtgcttt tgtcgtaaac tagcttgatt 360gttgtccatt aagcttggtt gcttttcgtg agaaagcatg aaacttctat gacgaaaccc 420 ggttg已ttgt aatgtaacta gtttgattgt agtttg肌tt tggtaattgc gttgtatgst 480 acataatgaa agtttcatga 500
權利要求
1.編碼野生型細胞核來源的苔蘚表達促進區域(MEPR)的分離的核酸分子。
2. 根據權利要求1的分離的核酸分子，其特徵在於MEPR選自立碗 蘚屬(Phys國itrella )、葫,蘚屬(F固ria)、泥炭蘚屬(Sphag畫)、 角齒蘚屬(Ceratodon)、地錢屬(Marchantia)以及Sphaerocarpos 的MEPR，優選地選自小立碗蘚(Physcomitrella patens)、葫蘆蘚(Funar ia hygrometrica )和地錢(Marchant ia polymorpha )的MEPR。
3. 根據權利要求1或者2的分離的核酸分子，其特徵在於MEPR選 自序列編號1到27的序列或者其表達促進片段。
4. 根據權利要求1到3中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在 於它包含苔蘚啟動子以及優選地，5' UTR區域和/或5'內含子和/或 3'UTR。
5. 根據權利要求1到4中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在於 MEPR具有的表達促進活性至少與花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子的 表達促進活性相等。
6. 根據權利要求1到5中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在 於MEPR具有的表達促進活性至少是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子 表達促進活性的200%，優選至少是500%，特別至少是1000%。
7. 根據權利要求1到6中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在 於它還包含重組多肽產物的編碼區，所述的編碼區在MEPR的控制下。
8. 根據權利要求1到7中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在 於它還包含選擇標記。
9. 根據權利要求1到7中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在於 它還包含與將要用其轉化的物種的基因組序列同源的序列，以使在該物 種中靶向整合。
10. 根據權利要求1到5中任何一項的分離的核酸分子，其特徵在 於核酸分子以反義或者核酶分子的形式提供。
11. 在真核宿主細胞中表達重組多肽產物的方法，包括以下的步 驟提供重組DNA克隆載體，該栽體包含根據權利要求1到10中任何 一項的編碼MEPR的分離的核酸分子，以及選擇性地包含所述重組多肽 產物的編碼區域，所述的編碼序列在所述的宿主中，在所述核酸分子的 MEPR控制下；轉化所述的真核宿主細胞，該細胞在天然情況下不含有在 所述的MEPR控制下的所述編碼序列；在適宜的培養基中培養轉化的真 核宿主細胞；表達所述的重組多肽以及分離表達的重組多肽。
12. 根據權利要求11的方法，其特徵在於所述的真核宿主細胞選 自植物細胞，優選是莒蘚細胞，特別是小立碗蘚細胞。
13. 根據權利要求11或者12的方法，其特徵在於所述的宿主細胞 是原絲體莒蘚組織細胞。
14. 根據權利要求11到13中任何一項的方法，其特徵在於培養基 不含有向其中添加的植物激素。
15. 根據權利要求11到14中任何一項的方法，其特徵在於細胞 選自來自立碗蘚屬、葫蘆蘚屬、泥炭蘚屬、角齒蘚屬、地錢屬以及Sphaerocarpos的莒蘚細胞。
16. 根據權利要求11到15中任何一項的方法，其特徵在於宿主細 胞瞬時表達所述的重組多肽產物。
17. 根據權利要求1到10中任何一項的編碼MEPR的分離的核酸分 子的用途，用於在工業上製備多肽，特別是用於提供製備所述多肽的重 組細胞。
18. 根據權利要求1到10中任何一項的編碼MEPR的分離的核酸分 子的用途，用於表達苔蘚多肽，所述苔蘚多肽的表達在天然情況下不由 所述的MEPR控制，特別用於提供表達所述多肽的重組苔蘚細胞。
19. 根據權利要求1到10中任何一項的編碼MEPR的分離的核酸 分子的用途，用於篩選和確定表達促進區域的共有序列。
20. 根據權利要求1到10中任何一項的編碼MEPR的分離的核酸分 子的用途，用於重組表達翻譯後修飾蛋白，特別是製備翻譯後被修飾的 蛋白。
21. 根據權利要求1到10中任何一項的編碼MEPR的分離的核酸分 子的用途，用於體外表達重組蛋白。
22. 根據權利要求l到10中任何一項的編碼MEPR的分離的核酸分 子的用途，用於重組表達代謝修飾蛋白。
全文摘要
公開的是編碼野生型細胞核來源的苔蘚表達促進區域(MEPR)的分離核酸分子以及使用這種MEPR製備重組多肽的方法。
文檔編號C07K14/415GK101555479SQ20081013111
公開日2009年10月14日 申請日期2004年7月30日 優先權日2003年8月11日
發明者A·威斯, G·戈爾, M·羅德裡格斯-佛朗哥, W·約斯特 申請人:格裡革新生物技術有限公司