胃癌標誌物與胃癌檢測方法

2023-07-18 00:37:46 3

專利名稱：胃癌標誌物與胃癌檢測方法
技術領域：
公開的主體通常涉及胃癌標誌物和胃癌檢測方法。
背景技術：
注意到了以下現有技術的出版物Busslinger, M. , Klix, N. , Pfeffer, P. , Graninger, P. G. , & Kozmik, Z. (1996).Deregulation of PAX-5 by translocation of the Emu enhancer of the IgH locusadjacent to two alternative PAX-5 promoters in a diffuse large-cell lymphoma(在彌散大細胞淋巴瘤中通過兩個可選PAX-5啟動子相鄰的IgH基因組的Emu增強子的轉位而下調 PAX-5). Proc Natl Acad Sci U S A，93 (12)，6129-6134. Livak, K. J. , & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T))
(利用實時定量PCR和2(_A AC(T))分析相關基因表達數據)Method. Methods, 25 (4),402-408.Takai, D. , & Jones, P. A. (2002). Comprehensive analysis of CpG islands inhuman chromosomes 21 and 22 (人類染色體 21 和 22 中 CpG 島的綜合分析) Proc NatlAcad Sci U S A，99 (6)，3740-3745.Takai, D. , & Jones, P. A. (2003). The CpG island searcher a new Wffffresource (CpG 島搜索工具新的網絡資源).In Silico Biol, 3 (3), 235-240.Tao, Q. , Huang, H. , Geiman, T. M. , Lim, C. Y. , Fu, L. , Qiu, G H. , et al. (2002).Defective de novo methylation of viral and cellular DNA sequences in ICFsyndrome cells (ICF綜合症細胞中病毒和細胞DNA序列的重新甲基化缺陷).Hum MolGenet,11(18),2091-2102.US2004248171Palmisano and Belinsky，於 2004 年 3 月 25 號提交，其中公開了利用PAX5作為肺癌、結腸癌和乳腺癌的標誌物。US2010028875 Rhytu et al，於2006年8月19日作為PCT申請提交,其中公開了通過測定甲基化水平來診斷癌症和確定預後的方法。發明概述在一個實施方案中，公開了診斷或確定來自患者的生物樣品中胃癌的預後的方法，所述方法包括以下步驟檢測所述樣品中與由SEQ. ID. NO. 24組成的區域至少95%相似的連續序列中的至少15個連續鹼基對的靶DNA序列的甲基化；並且其中顯著的甲基化水平指示胃癌的不良預啟。在一個實施方案中，所述靶序列的長度可以為至少50個鹼基對並含有多個CpG鹼基對。在一個實施方案中，所述方法還可以包括將患者樣品中靶序列的甲基化水平與非癌細胞的甲基化水平進行比較。在一個實施方案中，所述確定可以包括用能差異性地修飾甲基化的DNA和非甲基化的DNA的試劑處理樣品。在一個實施方案中，所述區域可以由SEQ. ID. NO. 11組成。在一個實施方案中，所述確定可以包括用硫酸氫鈉處理樣品。在一個實施方案中，可以通過COBRA、BGS或MSP進行所述確定。在一個實施方案中，所述樣品是血液樣品。在一個實施方案中，所述樣品是糞便樣品。在一個實施方案中，所述確定包括以下步驟使用根據SEQ. ID. NO. 24中的含CpG的基因組序列所選擇的引物來擴增用限制性酶處理的DNA ;和將未知樣品中基因組序列的擴增部分的水平與非癌樣品的甲基化水平進行比較，從而檢測胃癌的存在。 在一個實施方案中，所述試劑包括優先切割非甲基化的DNA的酶。在一個實施方案中，所述擴增使用聚合酶鏈反應。在一個實施方案中，所述檢測可以使用選自以下的引物或探針SEQ. ID. NO. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。在一個實施方案中，公開了分離的核酸序列，其與SEQ. ID. NO. 24的10個連續鹼基對的區域至少約95%相似。在一個實施方案中，所述分離的序列與SEQ. ID. NO. 11的約20個連續鹼基對的區域至少99%相似。在一個實施方案中，公開了檢測患者樣品中的胃癌的方法，該方法包括檢測所述樣品中與SEQ. ID. NO. 13在至少約15個連續鹼基上至少95%相似的RNA序列的表達，其中與正常或對照樣品(例如從非癌細胞或組織樣品、從正常胃黏膜提取的RNA樣品)相比，所述序列的mRNA水平顯著下調的表達指示胃癌的存在。在一個實施方案中，公開了抑制胃癌細胞發展的方法，所述方法包括以下步驟在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分，從而抑制所述細胞的生長。在一個實施方案中，所述表達包括將所述胃癌細胞中與SEQ. ID. NO. 24在至少15個連續鹼基對上具有至少95%序列相似性的DNA序列脫甲基。在一個實施方案中，所述表達包括將分離的DNA分子引入所述細胞，所述分離的DNA分子適於表達與SEQ. ID. NO. 23在約50個連續胺基酸上至少約95%相似的蛋白。在一個可選實施方案中，公開了治療個體中胃癌的方法，該方法可以包括以下步驟用適於在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 12,SEQ. ID. NO. 13或SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分的組合物治療患者，從而抑制所述細胞的生長。在一個可選實施方案中，公開了治療個體中胃癌的方法，該方法包括在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 12,SEQ. ID. NO. 13或SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分，從而抑制所述細胞的生長。在可選實施方案中，可以將所述生物學有效序列直接引入所述癌細胞。在可選實施方案中，公開了試劑盒，所述試劑盒包含本文公開的用於實施本發明的方法的序列或試劑。根據以下所選實施方案的詳細描述並結合附圖，本發明主題的特徵和優點會變得更清楚。應當意識到，所公開的和要求保護的主題能夠在不脫離權利要求的範圍的情況下在不同方面進行修改。因此，附圖和描述應被理解為說明的性質而不是作為限制，主題的全部範圍如權利要求所述。附圖概述圖I顯示了一個實施方案中的PAX5CpG島。圖2顯示了一個實施方案中細胞系中PAX5 mRNA表達。圖3顯示了一個實施方案中脫甲基劑對PAX5表達的影響。圖4顯示了一個實施方案中胃癌細胞和相鄰正常組織的配對樣品中的相對PAX5表達水平。圖5顯示了一個實施方案中轉染的細胞系中PAX5mRNA的相對水平。
圖6顯不了一個實施方案中細胞中的外源PAX5表達。圖7顯示了一個實施方案中PAX5表達對轉染的細胞在集落形成測定中的影響。圖8顯示了一個實施方案中來自腫瘤和正常的人胃組織的甲基化百分比。圖9顯示了一個實施方案中細胞中PAX5CpG島的甲基化狀態。

圖10顯示了一個實施方案中PAX5的甲基化的接受者操作特徵(ROC)曲線。圖11顯示了一個實施方案中胃癌患者存活的Kaplan-Meier分析。實施方案詳細描述術語在本公開中，以下術語具有下文所示的含義在本公開中，術語「或」通常的含義包括「和/或」，除非文中內容明確表明並非如此。在本公開中，術語「生物標誌物」或「標誌物」表示與疾病相關的諸如基因的物質或變量測量，所述物質或變量測量可以作為該疾病的指示物或預測物。生物標誌物或標誌物是參數，從中可以推知疾病的存在或風險，而不是疾病自身的量度標準。在本公開中，術語「核酸」、「核酸序列」以及相似術語表示多核苷酸，其可以是gDNA、cDNA或RNA，並且可以是單鏈的或雙鏈的。該術語還包括肽核酸(PNA)，或任何化學上的DNA類似物或RNA類似物。「cDNA」是指由細胞中天然存在的mRNA製備而來的拷貝DNA。「gDNA」是指基因組DNA。以上的組合也是可能的(即，部分是gDNA且部分是cDNA的重組核酸)。在本公開中，術語「可操作地相連」和「可操作地連接」表示功能上連接的核酸序列。在本公開中，術語「嚴緊的雜交條件」和「高嚴緊性」是指探針與其靶標子序列雜交而不與其它序列雜交時的條件，所述靶標子序列通常處於核酸的複合混合物中。嚴緊的條件是序列依賴性的，並且在不同情況下會不同。較長的序列在較高的溫度下特異性地雜交。核酸雜交的廣泛指導見於 Ti jssen, Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化學和分子生物學技術-核酸探針的雜交)，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays (雜交原理和核酸測定策略的概述)"(1993),並且會被本領域技術人員容易理解。通常，將嚴緊的條件選擇為低於在限定的離子強度、PH下具體序列的熱熔點(Tm)約5-10°C。Tni是平衡時與靶標互補的探針中的50%與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、PH和核酸濃度下)(因為靶序列是過量存在的，所以在Tni下，在平衡時，50%的探針被佔據)。添加例如甲醯胺的去穩定劑也可以實現嚴緊的條件。對於選擇性雜交或特異性雜交，陽性信號至少是背景的2倍，優選為10倍於背景的雜交。示例性的嚴緊雜交條件可以如下50% 甲醯胺，5XSSC和 1% 303，421下孵育，或5\33(，1% SDS，65°C下孵育，在 65°C下0. 2X SSC和0. 1% SDS中洗滌。對於在嚴緊的條件下不彼此雜交的核酸，如果它們編碼的多肽是基本上相同的，則所述核酸仍然是基本上相同的。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡併性產生核酸拷貝時，會發生這種情況。在這些情況下，所述核酸通常在中等嚴緊的雜交條件下雜交。示例性的「中等嚴緊的雜交條件」包括在37°C下、40%甲醯胺、IM NaCl、l%SDS的緩衝液中雜交，以及在45°C下IXSSC中洗滌。陽性雜 交至少是背景的兩倍。本領域技術人員會容易地認識到，可選的雜交和洗滌條件可以用於提供相似的嚴緊性條件。用於確定雜交參數的其它指導在很多參考文獻中提供，例如，Current Protocols in MolecularBiology (現代分子生物學實驗方法)，ed. Ausubel, et al.。對於PCRJ^ 36°C的溫度通常用於低嚴緊性擴增，但是根據引物長度，退火溫度可以在約32°C _48°C變化。對於高嚴緊性PCR擴增，通常是約62°C的溫度，但是根據引物長度和特異性，高嚴緊性退火溫度可以為約50°C -約65°C。高和低嚴緊性擴增的通常的循環條件包括持續30秒-2分鐘的90°C -95°C的變性期，持續30秒-2分鐘的退火期，和持續1_2分鐘的約72°C的延伸期。低和高嚴緊性擴增反應的方法和指導是本領域公知的，並且提供於，例如 Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR手冊_方法和應用指南)，Academic Press, Inc. N. Y.。在本公開中，術語「多肽」表示由核酸分子編碼的多肽。在本公開中，術語「基因表達」和「蛋白表達」表示並包括涉及樣品中存在的基因轉錄本或蛋白的量的任何信息，以及關於基因、RNA或蛋白表達或積累或降解的速率的信息(例如，報告基因數據、核失控實驗的數據、脈衝追蹤數據等)。某些種類的數據可以視為與基因和蛋白表達都有關。例如，細胞中的蛋白水平反映蛋白水平以及轉錄水平，並且意圖將這樣的數據包括在短語「基因或蛋白表達信息」中。可以以每個細胞的量，相對於對照基因或蛋白的量，無單位測量等形式給出這樣的信息；術語「信息」不應限制為任何特定表示手段，並且意圖表示提供相關信息的任何表示。術語「表達水平」是指基因或蛋白表達數據中反映出的或從基因或蛋白表達數據中推斷出的量，無論該數據是關於基因轉錄本積累或蛋白積累或蛋白合成速率等。在本公開中，術語「多肽」表示由兩個或更多個胺基酸、優選多於三個胺基酸組成的分子。其確切的大小取決於很多因素。在本公開中，術語「寡核苷酸」表示由兩個或更多個核苷酸，優選多於三個核苷酸組成的分子。寡核苷酸確切的大小取決於很多因素，反過來，這些因素取決於寡核苷酸的最終功能和用途。在具體實施方案中，寡核苷酸的長度可以為約10個核苷酸-100個核苷酸或10和100之間的任何整數。在實施方案中，寡核苷酸的長度可以為約10-30個核苷酸，或長度可以為約20-25個核苷酸。在實施方案中，為了特異性，寡核苷酸的長度可以大於約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 個核苷酸。在某些實施方案中，短於這些長度的寡核苷酸可以是合適的。在本公開中，術語「引物」表示當置於能誘發與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成的條件下，即在核苷酸和諸如DNA或RNA聚合酶的誘發劑的存在下並且在合適的溫度和pH下，能夠作為合成起始點的寡核苷酸，無論它是純化的限制性消化物中天然存在的或合成產生的。引物可以是單鏈或雙鏈的，並且必須足夠長而使其在誘發劑的存在下能引發所需延伸產物的合成。引物的確切長度取決於多種因素，包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，為了診斷和預後應用，根據靶序列的複雜性，寡核苷酸引物通常含有至少或多於約10、或15、或20、或25或更多個核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。參與確定引物合適長度的因素是本領域技術人員熟知的。具體實施方案中所用的引物如本公開的表I. I所示，其中標明了它們的具體應用。在本公開中，術語「引物對」表示與靶DNA分子相反鏈雜交或與側翼連接待擴增的核苷酸序列的靶DNA區域雜交的引物對。在本公開中，術語「引物位點」表示引物雜交的靶DNA或其它核酸的區域。在本公開中，所描述的和要求保護的核酸、多核苷酸、蛋白和多肽是指所有形式的核酸和胺基酸序列，包括但不限於如下所述的基因組核酸、前mRNA、mRNA、多肽、多肽、多態性變體、等位基因、突變體和種間同系物(I)具有或編碼與由參考核酸編碼的多肽或本文所述的胺基酸序列在優選至少約25、50、100、200、500、1000或更多個胺基酸的區域上具有大於約60%胺基酸序列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、優選 91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 % 或
99%或更高的胺基酸序列同一性的胺基酸序列；(2)特異性地結合或編碼與諸如多克隆抗體的抗體特異性地結合的多肽，所述抗體是針對包含參考胺基酸序列、其免疫原性片段以及保守型修飾的變體的免疫原產生的；(3)在嚴緊的雜交條件下與公開的核酸序列或編碼公開的胺基酸序列以及其保守型修飾的變體的核酸序列特異性地雜交； (4)具有與參考核酸序列在優選至少約15、25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的區域上具有大於約95%、優選大於約96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列同一性的核酸序列。多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括但不限於，靈長類，例如人；齧齒動物，例如，大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、馬、羊或任何哺乳動物。在具體實施方案中，公開的多核苷酸和多肽序列來自人。本發明的核酸和蛋白包括天然存在的分子或重組分子。在本公開中，術語「生物樣品」或「樣品」包括諸如活檢和屍檢樣品的組織切片、和為了組織學目的而獲取的冷凍切片、或任何這些樣品的處理後形式。生物樣品包括血液和血液組分或產物(例如血清、血漿、血小板、紅細胞等)，痰液或唾液，淋巴和舌組織，諸如原代培養物、外植體和轉化的細胞的培養的細胞，糞便，尿液，胃活檢組織等。生物樣品通常獲自真核生物，所述真核生物可以是哺乳動物，可以是靈長類並且可以是人類個體。在本公開中，術語「活檢」是指為了診斷或預後評估取出組織樣品的過程，並且也指組織樣本自身。本領域已知的的任何活檢技術可以用於本發明的診斷和預後方法。所用的活檢技術取決於待評估的組織類型(例如舌、結腸、前列腺、腎、膀胱、淋巴結、肝、骨髓、血細胞、胃組織等)等因素。代表性的活檢技術包括但不限於切除活檢、切去活檢、針吸活檢、手術活檢和骨髓活檢，並且可以包括結腸鏡檢查。多種活檢技術是本領域技術人員公知的，他們需要進行很少的實驗便可以從這些技術中選擇並使用。
在本公開中，術語「分尚的」核酸分子表不從通常與該分尚的核酸分子相關聯的其它核酸分子中分尚出的核酸分子。因此，「分尚的」核酸分子包括但不限於這樣的核酸分子其不具有在分離的核酸來源於的生物體的基因組中天然地側翼連接該核酸的一個或兩個末端的序列(例如，通過PCR或限制性核酸內切酶消化而產生的cDNA或基因組DNA片段)。通常將這樣的分離的核酸分子引入載體(例如，克隆載體或表達載體)，以便於操控或產生融合核酸分子。此外，分尚的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重組的或合成的核酸分子。存在於例如核酸文庫(例如cDNA或基因組文庫)或含有限制性消化的基因組DNA的凝膠(例如，瓊脂糖或聚丙烯醯胺)的一部分中的數百至數百萬其它核酸分子中的核酸分子不被認為是分離的核酸。在本公開中，「細胞」可以是分離的，可以被包含在細胞群體中，可以在培養物中，或可以被包含在活的個體中，並且可以是哺乳動物細胞，且可以是人的細胞。同樣，「組織」可以包括任何數目的細胞，並且可以被包含在活的個體中或可以從其中被分離出。在本公開中，「癌症」表示並包括任何惡性腫瘤(malignancy)、或惡性細胞分裂或 惡性腫瘤(malignant tumour),或具有不受控制的或不適當的細胞增殖的任何疾病狀態，並且包括但不限於特徵為不受控制的或不適當的細胞增殖的任何疾病。在本公開中，術語「胃癌(gastric cancer)」和「胃癌(stomach cancer)」具有相同含義，並且表示胃或胃細胞的癌症。這些癌症可以是發生於胃的內層(黏膜)並且可以發生於胃的幽門部、胃體部或賁門部(下部、體部和上部)的腺癌。在本公開中，術語「胃癌細胞」表示具有胃癌特徵的細胞，並且包括癌症前期細胞。在本公開中，術語「癌症前期」表示處於轉化為癌細胞的早期階段或傾向於轉化為癌細胞的細胞。這樣的細胞可以表現出一種或多種具有癌細胞特徵的表型性狀。在本公開中，術語「純化的」或「基本純化的」，當用來指核酸或多肽時，表示從它們的天然環境中分離出的核酸或多肽，使得它們佔給定樣品中全部核酸或多肽或有機化學物的至少約75 %、80 %、85 %、90 %或95 %。本文中，可以通過SDS-PAGE和銀染評估蛋白純度。可以通過瓊脂糖凝膠和EtBr染色評估核酸純度。在本公開中，術語「檢測」表示觀察生物樣品中的標誌物或標誌物改變(例如標誌物甲基化狀態的改變或核酸或蛋白序列的表達水平)的任何過程，無論實際上是否檢測到標誌物或標誌物改變。換言之，探測樣品的標誌物或標誌物改變的行為是「檢測」，即使標誌物被測定為不存在或低於靈敏度水平。檢測可以是定量、半定量或非定量觀察，並且可以基於與一個或多個對照樣品的比較。應當理解，檢測本文公開的結腸癌包括檢測癌症前期細胞，所述癌症前期細胞開始發展為結腸癌細胞或將要發展為結腸癌細胞，或具有增加的發展為結腸癌細胞的傾向。檢測結腸癌還可以包括檢測可能的死亡概率或疾病條件的可能的預後。在本公開中，術語「表達載體」表示可複製的DNA構建體，所述DNA構建體用於表達編碼所需蛋白或RNA序列的DNA並且包括轉錄單元，所述轉錄單元包含以下的組裝(1)在基因表達中具有調節作用的基因元件，例如啟動子、操縱子或增強子，所述基因元件與(2)編碼所需蛋白(在本文情況下為PAX5蛋白)的DNA序列可操作地連接，所述DNA序列被轉錄為mRNA和翻譯為蛋白，和(3)合適的轉錄和翻譯起始和終止序列。啟動子和其它調節元件的選擇通常根據預期的宿主細胞而不同。通常，重組DNA技術中表達載體的應用常常是「質粒」的形式或病毒序列的形式，質粒是指環狀雙鏈DNA環，其在載體形式時不與染色體結合；病毒序列可以或可以不整合到染色體中。多種表達載體是本領域技術人員能容易識別並進行使用的。在本公開中，術語「同源性」、「同一性」和「相似性」表示2個肽或2個核酸分子之間的序列相似性。可以比較每個序列中的位置來測定「同源性」、「同一性」或「相似性」，為了比較的目的可以將所述序列進行比對。當比較的序列中的等同位置被相同鹼基或胺基酸佔據時，所述分子在該位置是相同的；當等同位點被相同或相似胺基酸(例如，在空間性質或帶電性質上相似)殘基佔據時，所述分子可以稱為在該位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性百分比的表達是指比較的序列所共享的位置上相同或相似胺基酸的數量的函數。「無關的」或「非同源的」序列與本發明的序列共享小於40%同一性，優選小於25%同一性。在比較2個序列時，殘基(胺基酸或核酸)的缺失或多餘殘基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具體實施方案中，對於兩個或更多個序列或子序列，按照使用具有下文所述的默認參數的BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法進行測定或通過例如 國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))在線提供的手動比對和肉眼檢查進行測定，當在比較窗或指定區域上為最大對應性進行比較和比對時，如果它們的序列在規定的區域上同一性為約60 %，或約65 %、70%、75%、80 %、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高，可以認為是基本或顯著同源的、相似的或同一的。該定義也涉及或可以用於測試序列的互補物。因此，在本文背景允許的程度下，例如，如果核苷酸序列可以被預測為天然存在於DNA雙鏈體中，或可以以互補鏈中的一條或兩條的形式天然存在，則與規定靶序列或其變體互補的核苷酸序列自身被視為與靶序列是「相似的」，並且當涉及「相似的」核酸序列時，包括單鏈序列、其互補序列、雙鏈的鏈複合物、能夠編碼相同或相似多肽產物的序列、以及上述任意一項的任何容許的變體。相似性必須限制為單一核酸鏈序列的分析的情況可以包括例如細胞中特定RNA序列或編碼序列的表達的檢測和定量。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在實施方案中，同一性或相似性可以是在長度為至少約10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25或更多胺基酸或核苷酸的區域上，或在長度為多於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或多於約 100 個胺基酸或核苷酸的區域上。在本公開中，術語「甲基化敏感PCR」 (即，MSP)表示進行化合物轉化的模板序列的擴增的聚合酶鏈反應。設計兩套引物用於MSP。每套引物包括正向引物和反向引物。如果靶DNA中CpG 二核苷酸的C鹼基是甲基化的，則稱為甲基化特異性引物的一套引物擴增化合物轉化的模板序列。如果靶DNA中CpG 二核苷酸的C鹼基是非甲基化的，稱為非甲基化特異性引物的另一套引物擴增化合物轉化的模板序列。在本公開中，術語「抑制(inhibit) 」和「抑制(suppress) 」，當涉及癌細胞或癌細胞的生長或發展時，表示並包括導致或包括以下的任何效應減緩或防止細胞的生長或細胞分裂、殺死細胞、使細胞失去功能以及以任何方式降低細胞的活力、分裂速率或壽命，並且包括更具良性細胞群體的性質而不具有惡性細胞群體的性質的方式改變細胞特徵的任何代謝改變。在本公開中，「抗體」是指包含來自免疫球蛋白基因或其片段的框架區的多肽，其特異性地結合和識別抗原。公認的免疫球蛋白基因包括K、入、a、Y、S、e和ii恆定區基因以及多種免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為K或:V。重鏈被分類為Y、ii、a、S或e，這些分類進一步分別限定了免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗體的抗原結合區在結合的特異性和親和力中是最關鍵的。抗體可以是多克隆的或單克隆的，可以來源於血清、雜交瘤或可以是重組克隆的，並且抗體還可以是嵌合的、靈長動物源化的或人源化的。例如，抗體以完整免疫球蛋白或多種良好表徵的片段存在，可以通過各種肽酶的消化而產生所述片段。本文所用的術語抗體包括完整抗體以及抗體片段，所述抗體片段通過全抗體的修飾或使用重組DNA方法從頭合成(例如單鏈Fv)或使用噬菌體展示文庫鑑定的那些。在本公開中，術語「特異性地(或選擇性地)結合」抗體或「特異性地(或選擇性地)與…發生免疫反應」，當涉及蛋白或肽時，是指由通常蛋白的異質群體和其它生物製劑中的蛋白的存在而決定的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，特異性抗體與特定蛋白的結合至少是背景的2倍，並且更通常是大於背景10-100倍。在該條件下與抗體的特異性結合需要根據其對特定蛋白的特異性而選擇的抗體。例如，可以選擇多克隆抗體來獲得僅與所選抗原發生特異性地免疫反應而不與其它蛋白發生免疫反應的那些多克隆抗體。可 以通過剔除與其它分子發生交叉反應的抗體來實現這種選擇。多種免疫測定形式可以用於選擇特異性地與特定蛋白發生免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定是常規用於選擇特異性地與蛋白發生免疫反應的抗體。在本公開中，術語「擴增」表示由核酸的一個具體基因座得到多個拷貝的過程，所述核酸例如基因組DNA或cDNA。可以使用多種已知手段中的任何一種實現擴增，所述手段包括但不限於聚合酶鏈反應(PCR)、基於轉錄的擴增和鏈置換擴增(SDA)。在本公開中，術語「聚合酶鏈反應」或「PCR」表示這樣的技術變性、與引物的退火和與DNA聚合酶的延伸的循環被用於將靶DNA序列的拷貝數擴增至約IO6倍或更多。用於擴增核酸的聚合酶鏈反應過程可參見美國專利第4，683，195號和第4，683，202號。在本公開中，術語「保守型修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列。對於具體核酸序列，保守型修飾的變體是指編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的核酸，或當核酸不編碼胺基酸序列是，保守型修飾的變體是指基本上相同的序列。由於遺傳密碼具有簡併性，所以大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子規定為丙氨酸的每個位置，可以將該密碼子改變為任何上述對應的密碼子而不會改變所編碼的多肽。這類核酸變異是「沉默變異」，是保守型修飾變異的一種。本文中，編碼多肽的每個核酸序列也描述了該核酸的每個可能的沉默變異。本領域技術人員應當意識到，可以修飾核酸中的每個密碼子(除了 AUG和TGG，AUG通常是蛋氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)來產生功能相同的分子。因此，當涉及表達產物而不涉及實際探針序列時，編碼多肽的核酸的每種沉默變異隱含在每個所述序列中。對於胺基酸序列，本領域技術人員應當意識到，改變、添加或缺失編碼序列中單個胺基酸或少量百分比的胺基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列進行的分別的取代、缺失或添加是「保守型修飾的變體」，其中所述改變導致胺基酸被化學上相似胺基酸所取代。提供功能相似的胺基酸的保守型取代列表是本領域公知的。所述保守型修飾的變體是除本發明的多態性變體、中間同系物和等位基因之外的變體並且不排除是本發明的多態性變體、中間同系物和等位基因。下述8組中，每一組含有可彼此保守型取代的胺基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E) ；3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見，例如，Creighton,Proteins(1984))。在本公開中，「標記」或「可檢測的部分」是可通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理手段檢測的組分。例如，有用的標記包括32P、螢光染料、電子緻密試齊U、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被製備為可檢測的蛋白，例如，通過將放射性標記併入肽或用於檢測與肽特異性反應的抗體。在本公開中，術語「重組」，當涉及例如細胞、核酸、蛋白、或載體時，表示已經通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白對所述細胞、核酸、蛋白或載體進行了修飾，或 表示所述細胞來源於按此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達不見於細胞的天然(非重組)形式中的基因，或表達異常表達的、低表達的或根本不表達的天然基因。某些序列的排除應當理解，在具體實施方案中，可以排除序列、探針、引物、多肽等的個別實例。核酸和多肽的檢測檢測具體核酸序列和多肽及其應用的多種方法對於本領域技術人員是顯而易見的。可以使用多種不同方法檢測核酸分子和多肽。核酸檢測方法包括，例如，PCR和核酸雜交(例如，Southern印跡、Northern印跡或原位雜交)。具體而言,能夠擴增祀核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用於PCR反應。PCR方法通常包括以下步驟獲得樣品、從所述樣品分離核酸(例如，DNA、RNA或兩者)和使所述核酸與一種或多種寡核苷酸引物接觸，所述引物在能使模板核酸擴增發生的條件下特異性地與模板核酸雜交。在模板核酸的存在下，產生擴增產物。核酸擴增和擴增產物檢測的條件是本領域技術人員已知的。已開發出多種對於基礎PCR技術的改進，包括但不限於，錨定PCR、RACE PCR、RT-PCR和連接酶鏈式反應(LCR)。擴增反應中的引物對必須與模板核酸的相對鏈退火，並且應該彼此保持合適的距離，使得聚合酶能有效地跨過區域進行聚合併使得可以例如使用電泳來容易地檢測擴增產物。例如，可以使用諸如 0LIG0(Molecular Biology Insights Inc. ,Cascade,Colo.)的電腦程式來設計寡核苷酸引物，以助於設計具有相似熔解溫度的引物。通常，寡核苷酸引物長度為10-30或40或50個核苷酸(例如，長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)，但是寡核苷酸引物可以更長或更短，只要使用合適的擴增條件。在本公開中，術語「標準擴增條件」是指擴增反應混合物的基本組分和循環條件，所述循環條件包括模板核酸變性、寡核苷酸引物與模板核酸退火和通過聚合酶的引物延伸以產生擴增產物的多個循環。通常使用可檢測的標記實現擴增產物或雜交複合物的檢測。術語「標記」，當涉及核酸時，意圖包括通過將可檢測的物質偶聯(即，物理連接)至核酸的核酸直接標記，以及通過與直接標記了可檢測的物質的另一試劑進行反應的核酸間接標記。可檢測的物質包括各種酶、輔基、螢光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的實例包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的螢光材料的實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯代三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；冷光材料的實例包括魯米諾；生物冷光材料的實例包括螢光素酶、蟲螢光素和水母蛋白；合適的放射性材料的實例包括125I、131I、35S或3h。間接標記的實例包括用生物素將核酸進行末端標記，使得可以用螢光標記的抗生物素蛋白鏈菌素檢測該核酸。可以使用多克隆或單克隆抗體來檢測具體多肽序列，可以以本領域技術人員容易理解並應用的常規方式來製備所述抗體。本領域技術人員可容易地鑑定和製備並產生對於所需多肽序列的抗體來實施所公開的和要求保護的主題。 術語「探針」，當涉及核酸序列時，以其通常含義使用，表示在規定條件下能與靶序列雜交並且可以用於檢測該靶序列的存在的選擇的核酸序列。本領域技術人員應當理解，在某些情況下，探針也可以用作引物，並且引物可以用作探針。甲基化在本公開中，DNA 「甲基化」是指甲基添加到胞嘧啶(C)的5位，這通常(但不必須)是在CpG(胞嘧啶之後為鳥嘌呤)二核苷酸的情況下。本文所用的「增加的甲基化水平」或「顯著的甲基化水平」是指DNA序列中至少存在一個甲基化的C核苷酸，其中正常對照樣品(例如從非癌細胞或組織樣品提取的DNA樣品或對DNA殘基的甲基化進彳丁處理的DNA樣品)中的對應C是非甲基化的，在某些實施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個C可以是甲基化的，其中對照DNA樣品中的這些位置的C是非甲基化的。在實施方案中，多種不同的方法可用於檢測DNA甲基化改變。檢測DNA甲基化的方法包括，例如，利用southern或聚合酶鏈反應(PCR)分析的甲基化敏感的限制性內切核酸酶(MSRE)測定、甲基化特異性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的單核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高解析度熔解(HRM)分析、重亞硫酸鹽測序、焦磷酸測序、甲基化特異性單鏈構象分析(MS-SSCA)、組合重亞硫酸鹽限制分析(COBRA)、甲基化特異性變性梯度凝膠電泳(MS-DGGE)、甲基化特異性熔解曲線分析(MS-MCA)、甲基化特異性變性高效液相色譜(MS-DHPLC)、甲基化特異性微陣列(MSO)。這些測定可以是PCR分析、利用螢光標記的定量分析或southern印記分析。在實施方案中，可以使用甲基化敏感的DNA切割試劑來測定序列的甲基化程度，所述試劑可以是限制性酶，並且例如可以是Aatll、Acil、Acll、Agel、AscI、Asp718、Aval、BbrPI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、Eagl-HF 、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinPlI、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、Nar I, NgoMIV、NotI、Not I-HF , NruI、Nt. BsmAI、PaeR7I、PspXI、PvuI、RsrII、SacII、Sail、SalI-HF 、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI 或 TspMI。產品本公開包括含有一種或多種核酸分子或編碼核酸分子的一種或多種載體的產品(例如，試劑盒)。所述核酸分子被製備用於按本文所述進行給藥，並且可以按照計劃的給藥途徑適當地包裝。例如，核酸分子或編碼核酸分子的載體可以包含在藥學可接受的載體中或伴隨藥學可接受的載體。
按照實施方案的試劑盒可以包含其它試劑(例如，緩衝液、協同因子或酶)。按照實施方案的藥物組合物可以包含將所述組合物給予個體的說明書。試劑盒還可以包含可以進行測定並與生物樣品進行比較的一個對照樣品或一系列對照樣品。試劑盒的每個組分可以封裝在單獨的容器中，並且所有不同的容器可以位於單一的包裝中。組合物和組合物向靶細胞的遞送
在某些實施方案中，公開了用於向靶細胞遞送的組合物。應當理解，具體實施方案中使用的組合物可以與合適的藥學可接受的載體或賦形劑聯合使用，並且可以以任何合適的劑型使用。本領域技術人員可容易地從上文所述進行鑑定、選擇和使用，以符合所需的情況。如果待處理的細胞包含在個體體內，那麼可以實施所公開的方法，並可以將所公開的組合物以任何常規方式遞送至所述細胞，所述常規方式包括但不限於四糖或前藥的遞送、口服遞送、腸胃外遞送、腸內遞送、肌內遞送、皮下遞送、靜脈內遞送或通過吸入遞送，並且所公開的組合物可以與合適的載體或賦形劑、以合適的劑型聯合遞送，所述劑型包括但不限於片劑、膠囊劑、皮下泵或用於實現效應的其它途徑。可選的遞送方法可以包括滲透泵、可植入的輸注系統、靜脈內藥物遞送系統和可重新填裝、可植入的藥物遞送系統。吸入遞送可以包括利用噴霧器、計定劑量吸入器、乾粉吸入器的遞送，以上所有裝置都是本領域技術人員所熟悉的。本領域技術人員可容易地辨別和實施合適的方法、組合物和遞送途徑。。選擇的實施方案在第一組實施方案中，公開了對生物樣品中的胃癌進行診斷或提供預後的方法。所述方法可以包括以下步驟檢測所述樣品中與由SEQ. ID. NO. 24組成的區域至少95%相似的連續序列中至少約15個連續鹼基對的靶DNA序列的甲基化。應當理解，在實施方案中，靶DNA序列的長度可以為至少約10個鹼基對或可以為至少約15、20、25、30、35、40、45、50或更多個鹼基對，並且序列相似性程度可以為至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%,97%,98%,99%^； 100%。在可選實施方案中，靶DNA序列可以在與由SEQ. ID. NO. 11組成的區域至少95%相似的連續序列中。在一個實施方案中，顯著的甲基化水平可以指示胃癌的不良預後。在可選實施方案中，靶序列的長度可以為至少約50個鹼基對並且可以含有多個CpG鹼基對。在具體的可選實施方案中，靶序列可以包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個CpG鹼基對，並且顯著的甲基化可以與這些CpG鹼基對中的任意一個或多個單獨相關，或與這些CpG鹼基對中的任意一個或多個和這些CpG鹼基對中的任意其它一個或多個的組合相關。在可選實施方案中，所述方法還可以包括將患者樣品中靶序列的甲基化水平與非癌細胞或其它合適的對照樣品的甲基化水平進行比較，所有的對照樣品對於本領域技術人員是顯而易見的。在可選實施方案中，所述確定可以包括用差異性地修飾甲基化的DNA和非甲基化的DNA的試劑處理樣品。在可選實施方案中，所述試劑可以包括優先切割非甲基化的DNA或優先切割甲基化的DNA的限制性酶。在其它可選實施方案中，所述確定可以包括用硫酸氫鈉處理樣品，或可以通過組合重亞硫酸鹽限制分析(COBRA)進行所述確定。在實施方案中，樣品可以是血液樣品或糞便樣品。在可選實施方案中，所述確定可以包括以下步驟a)使用根據SEQ. ID. NO. 24或SEQ. ID. NO. 11中含CpG的基因組序列而選擇的引物擴增經限制性酶處理的DNA ;和幻將未知樣品中基因組序列的擴增部分的水平與非癌樣品中的甲基化水平進行比較，從而檢測或評價胃癌的預後。在可選實施方案中，所述擴增可以使用聚合酶鏈反應。在可選實施方案中，所述檢測可以使用選自以下的引物或探針:SEQ. ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、
18、19、20、21 或 22。在第二組實施方案中，公開了分離的核酸序列，所述核酸的長度可以為至少約10個鹼基對並且與SEQ. ID. NO. 24或SEQ. ID. NO. 11的片段具有95%的同一性。在可選實施方案中，所述分離的序列的長度可以為至少約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個鹼基對，並且可以與對應的片段約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似。在一個可選實施方案中，公開了用於檢測生物樣品中的胃癌或確定生物樣品中的胃癌的預後的試劑盒，並且所述試劑盒可以包括任何其它實施方案中的分離的核酸序列。所述試劑盒還可以包括說明書和試劑。在其它可選實施方案中，所述試劑用於檢測生物樣品中與由SEQ. ID. NO. 24組成的區域至少95%相似的連續序列中至少15個連續鹼基對的靶DNA序列的甲基化，優選地，所述靶序列的長度為至少50個鹼基對並且含有多個CpG鹼基對。在另一實施方案中，本文公開的試劑盒還包括非癌細胞的甲基化水平的對照。
在可選實施方案中，試劑盒中所用的試劑能差異性地修飾甲基化的DNA和非甲基化的DNA。優選地，所述試劑包括優先切割非甲基化的DNA的酶。在另一實施方案中，通過COBRA、BGS或MSP進行所述檢測或測定。在另一實施方案中，生物樣品選自血液樣品和糞便樣品。在可選實施方案中，本文公開的試劑盒還包括限制性酶和用於選擇性地擴增經限制性酶處理的並包含在SEQ. ID. NO. 24中的含CpG的基因組序列的引物。優選地，所述擴增是聚合酶鏈反應。在優選實施方案中，所述檢測或確定使用選自以下的引物或探針SEQ.ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。在第三組實施方案中，公開了檢測患者樣品中的胃癌的方法，所述方法包括檢測所述樣品中與SEQ. ID. NO. 12或13在至少約15個鹼基上至少95%相似的RNA序列的表達或檢測所述樣品中與SEQ. ID. NO. 23在至少約15個胺基酸上至少約95%相似的蛋白序列，並且其中與正常對照樣品(例如從非癌細胞或組織樣品或從正常胃黏膜提取的RNA或蛋白樣品)相比，序列的顯著降低的mRNA或蛋白表達的水平指示胃癌的存在。在可選實施方案中，所述序列相似性可以擴展到約 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400、600、800 或更多鹼基對或編碼的胺基酸上，並且可以是約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100 %。在實施方案中，可以將表達的序列的水平與非癌對照中表達的序列的水平進行比較。在實施方案中，使用如SEQ. ID. NO. 1、2、3和4所示的引物可以實現所述檢測。在可選實施方案中，公開了用於檢測患者樣品中的胃癌的試劑盒，所述試劑盒包括用於檢測所述樣品中與SEQ. ID. NO. 12或13在至少約15個鹼基上至少95%相似的RNA序列的表達或用於檢測所述樣品中與SEQ. ID. NO. 23在至少約15個胺基酸上至少約95%相似的蛋白序列的表達的試劑，所述試劑盒任選地包括檢測方法中使用的非癌對照。優選地，所述試劑盒包括SEQ. ID. N0S. 1、2、3和4所示的引物和/或用於檢測方法中提及的RNA序列或蛋白的抗體。在第三組實施方案中，公開了抑制胃癌細胞發展的方法。所述方法可以包括以下步驟在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 12、SEQ. ID. NO. 13或SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分，從而抑制細胞生長。在實施方案中，序列同一性可以擴展到約11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400、600、800 或更多鹼基對上，並且可以為約 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96 %、97 %、98 %、99 %或100 %。在可選實施方案中，所述表達可以包括將分離的DNA分子引入細胞，所述DNA分子包含與啟動子可操作地連接的PAX5編碼序列。啟動子可以適於驅動PAX5編碼序列的組成型表達或外源激活表達。在實施方案中，PAX5編碼序列可以與包含 SEQ. ID. NO. 12 或 SEQ. ID. NO. 13 或 SEQ. ID. NO. 23 的至少 11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400,600,800 或更多核苷酸的區域至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似，並且在一個實施方案中，相似性可以擴展到SEQ. ID. NO. 12或SEQ.ID. NO. 13 或 SEQ. ID. NO. 23。在實施方案中，所述表達可以包括將胃癌細胞中與SEQ. ID. NO. 24或SEQ. ID. NO. 11在至少15個連續鹼基對上具有至少95%序列相似性的DNA序列脫甲基。在實施方案中，表達可以包括將分離的DNA分子引入細胞，所述DNA分子包含與啟動子可操作地連接的PAX-5編碼序列。在一個可選實施方案中，公開了治療個體中的胃癌的方法，所述方法可以包括以下步驟在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 12的生物學有效部分或SEQ. ID. NO. 13的生物學有效部分或SEQ. ID. NO. 24的生物學有效部分或與包含上述序列任意一個的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、400、600、800 或更多核苷酸的區域至少約 90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似的生物學有效序列，從而抑制細胞生長。預期的是可以通過以下實現表達用合適劑型的脫甲基劑治療個體，或通過注射或其它合適方法給予患者處於合適載體中的或受合適啟動子控制的序列的生物學有效部分。在實施方案中，所述治療方法包括用適於表達所述生物學有效序列的組合物治療患者或將其給予患者。所述組合物可以包括本文實施例部分公開的合適的載體和構建體，給予、調整、改變和製備構建體以及誘導所需序列在靶細胞中表達的方法對於本領域技術人員是顯而易見的。同樣，可以將序列的生物學有效部分直接引入目的細胞。在可選實施方案中，公開了用途本文公開的SEQ. ID. NO. 12,SEQ. ID. NO. 13或SEQ.ID. NO. 23的生物學有效部分或抑制胃癌細胞發展或治療個體中的胃癌的方法中使用的試劑在抑制胃癌細胞發展或個體中的治療胃癌中的用途或在製備用於抑制胃癌細胞發展或治療個體中的胃癌的藥物或藥物組合物中的用途。其它可選實施方案在實施方案中，公開的材料和方法可以用於評價癌症的存在或進展、癌症的預後或癌症相關的其他因素。所有以上都是本領域技術人員能容易理解的。
實施例以下實施例說明了用於實踐公開的實施方案的主題的材料、方法和步驟。應當理解，本文所述的實施例和實施方案僅是舉例說明的目的，根據其所進行的各種改動或變化對於本領域技術人員是顯而易見的，並且意圖包括在本申請的實質和範圍內。
I.材料和方法I. I人胃樣本I. I. I組織樣品本研究中涉及三組人的樣品1)用於描述甲基化狀態正常胃黏膜活檢的來自威爾斯親王醫院(Prince of Wales Hospital)的內鏡檢查中心；2)胃癌(「GC」)組織及其相應的相鄰非癌組織獲自內鏡檢查時的GC患者，所述非癌組織距腫瘤邊緣至少5cm，這些樣品用於PAX5基因表達水平的比較；3)也用於檢測甲基化狀態的石蠟包埋的GC樣品來自廣州中山醫院。按照美國聯合委員會的癌症 !系統對GC樣品進行分期。將所有新鮮的組織在液氮中快速冷凍並然後保存在-80°C直至下一步處理。為了評價GC患者中PAX5的甲基化狀態和臨床重要性，將161個GC樣本和19個正常胃活檢用於BGS測定。GC組包括107名男性和54名女性，平均年齡為56. 8± 12. 6歲； 正常組包括7名男性和12名女性，平均年齡為51. 9±17. 2歲。也測定了其它臨床病理學特徵，例如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori (H. pylori))感染、TNM分期和分化狀態。通過使用快速尿素酶試驗(RUT)，發現29名患者有幽門螺桿菌感染，70名患者是幽門螺桿菌感染陰性。 M I、II、III和IV期的患者數分別為20、23、49和52。94名患者具有低分化GC，43名患者具有發展的中等或高度分化GC。患者的信息由廣州中山醫院提供。部分信息是不完整的。所有患者和對照都提供了知情同意書，並且研究方案得到香港中文大學臨床研究倫理學委員會的批准。I. I. 2腫瘤細胞系使用了來自胃腸道的16個腫瘤細胞系，包括8個GC細胞系(AGS、BGC823、KatoIII、MKN28、MKN45、N87、SNUl 和 SNU16)和 8 個結腸直腸癌(CRC)細胞系(Caco2、DLDUHCT116、HT29、LoVo、LS180、SW480和SW620)，這些細胞系購自ATCC (美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection) ,Manassas, VA,USA)。所有 GC 細胞系和 3 個 CRC 細胞系(LoVo、LS 180 和 SW480)培養在補充了 10%胎牛血清(FBS) (Sigma-Aldrich)的 RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)中。加入10% FBS的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM) (Sigma-Aldrich)用於培養 HT29、SW620 和 Caco2。使用加入 10% FBS的McCoy’s 5a培養基(Sigma-Aldrich)培養細胞系HCT116。所有這些細胞系都在95%空氣和5% CO2的培養箱中37°C下培養。每2-4天更新培養基。使用0. 25%胰酶-EDTA溶液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)以 I : 3-1 : 4 的比例將細胞傳代。I. 2PAX5基因的生物信息學分析加州大學聖克魯茲分校基因組生物信息學(UCSC) (http://Renome. ucsc. edu/)的在線資料庫用於獲得PAX5基因的相關信息。通過CpG 島搜索工具(http://cpgislands.usc.edu/) (Takai&Jones, 2003,Takai, D. , &Jones, P. A. (2003) The CpG island searcher a new Wffff resource (CpG 島搜索工具新的網絡資源).In Silico Biol，3(3) ,235-240)來預測PAX5基因啟動子區的CpG島。CpG島被定義為大於500bp、GC含量高於55%且觀察到的/預期的CpG比高於0. 65的DNA 區域(Takai & Jones, 2002, Takai,D. ,& Jones,P. A. (2002). Comprehensive analysisof CpG islands in human chromosomes 21 and 22 (人類染色體 21 和 22 中 CpG 島的綜合分析).Proc Natl Acad Sci U S A，99 (6)，3740-3745)。以上方法和和工具對於本領域技術人員是顯而易見的。I. 3基因表達分析1.3. IRNA 分離使用Quizol 試劑(Qiagen, Valencia, CA, USA)分離總 RNA。首先，將約 5-10 X IO6細胞或30mg組織在ImL Qiazol試劑中勻漿，並在室溫下孵育10分鐘。向每個樣品加入0. 2mL氯仿。將混合物劇烈振蕩15秒，在室溫下再靜置3分鐘。將樣品在4°C下以12，OOOg離心20分鐘，樣品分為兩層。將含RNA的上層水相轉移到新管中，與0. 7ml異丙醇混合，在室溫下孵育10分鐘，並然後在4°C下以12，OOOg離心10分鐘。棄去上清後，用ImL 75%乙醇洗滌RNA沉澱兩次；風乾5分鐘並用不含RNA酶的水重新溶解RNA。通過不含RNA酶的 DNA 酶 I 消化(GE Healthcare, Buckinghamshire, England)去除 DNA 汙染。通過使用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)測量 260nm/280nm 的吸光度來測定總RNA的質量和獲得量。純化的RNA保存在-80°C直至使用。 1.3.2cDNA 合成MultiScribe 逆轉錄酶試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)用於合成cDNA。反應混合物含有IX逆轉錄酶試緩衝液、I XdNTP、l X隨機引物(試劑盒提供)、2. 5U/ u L逆轉錄酶、IU/ u L RNA酶抑制劑和2 u g總RNA。將混合物在25°C下孵育10分鐘，然後37°C下孵育120分鐘，然後85°C下孵育5分鐘來使酶失活。cDNA保存在_80°C直至其它應用。I. 3. 3 半定量逆轉錄 PCR(RT-PCR)以總體積25 ii L的反應進行半定量RT-PCR，所述反應含有GeneAmp IXPCR緩衝液
II(Applied Biosystems) >2. 5mM MgCl2、200 u M每種 dNTP、200nM每種引物、0. 5U AmpliTaqGold DNA聚合酶(Applied Biosystems)和 30_50ng cDNA。PCR程序的開始為 95°C持續 10分鐘的初始變性，然後是32-35個擴增循環(94°C持續30秒、58°C持續30秒和72°C持續30秒)，在72°C下進行10分鐘的最終延伸。在紫外光下觀察PCR條帶並照相。用作為內參的管家基因￠-肌動蛋白的表達將靶基因的表達的標準化。用於擴增轉錄本的所有引物列在表I. I中。I. 3. 4 實時定量 PCR(qPCR)對於實時定量RT-PCR，使用ABI PRISM 7500序列檢測系統(AppliedBiosystems)測定 PAX5 表達。按照 SyberGreen Master Mix (Applied Biosystems)的實驗方案，以總體積25 ii L反應進行qPCR,所述反應含有IXSyberGreen Master Mix> IOOnmol/L引物和30ng cDNA模板。qPCR條件為95°C持續10分鐘，然後是40個循環，每個循環為95°C持續15秒、58-60°C (按照引物的退火溫度)持續40秒、72°C持續30秒。使用相對定量 2_AACT 法(Livak & Schmittgen, 2001 Livak, K. J. , & Schmittgen, T. D. (2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2 (-Delta Delta C (T) )Method. Methods，25 (4)，402-408)分析基因表達數據，該方法是本領域技術人員所公知的。I. 3. 5mRNA 表達陣列通過CancerPathway Finder PCR陣列系統(SABiosciences,Frederick,MD,USA)分析具有或不具有PAX5蛋白的GC細胞系的基因表達譜。該陣列系統能檢測代表轉化和腫瘤發生中涉及的6個生物學通路的84個基因(http://www.sabiosciences.com)。按照實驗方案，使用ABI PRISM 7500序列檢測系統(Applied Biosystems)進行實時PCR。將cDNA模板與合適的即用PCR master mix(試劑盒提供)簡單地混合，96孔板的每孔分配25 y L的等份，然後運行實時PCR循環程序I) 95°C持續10分鐘，2) 40個循環，每個循環為95°C持續15秒和60°C持續I分鐘。通過基於網絡的PCR陣列數據分析軟體按照說明(http://www. sabiosciences. com/pcrarraydataanalysis. php)分析表達結果。I. 5 倍變化的基因表達上調或下調被認為是具有生物學意義。1.3. 6蛋白提取使用CytoBuster 蛋白提取試劑(Merck Chemicals, Nottingham, UK)製備蛋白。將細胞以3000g離心10分鐘。然後以100 u L/106個細胞將沉澱重懸於CytoBuster。將混合物在室溫下孵育5分鐘。然後將管在4°C下以15，OOOg離心10分鐘，並將上清轉移到新 管中。I. 3. 7十二燒基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和western印跡利用5%上層膠和10%下層膠使40iig蛋白分離。SDS-PAGE後，利用半乾轉膜儀在15V下運行40分鐘，將蛋白轉移到平衡過的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(AmershamBiosciences, Buckinghamshire, UK)。將膜在溶解於 TBS/T 溶液(Tris 緩衝鹽溶液(Invitrogen)和0. I % Tween 20 (Sigma-Aldrich))的5%脫脂奶中室溫下振蕩封閉I小時。封閉後，將膜在稀釋於5%脫脂奶的一抗中4°C下振蕩孵育過夜。與二抗在室溫下孵育I 小時後，通過加強化學發光(ECL, Amersham Corporation, Arlington. Heights, IL, USA)檢測蛋白。I. 4DNA甲基化分析I. 4. I基因組DNA提取使用DNA小型試劑盒(Qiagen),按照試劑盒實驗方案從GC細胞系和組織樣品分離基因組DNA。將約25mg樣品在I. 5mL微離心管中的180 u L QIAamp ATL緩衝液和20 y L蛋白酶K中56°C下裂解I小時。加入4 ii L RNA酶A(100mg/ml，QIAgen)，並用漩渦脈衝混合15秒，然後室溫下孵育2分鐘。然後，將200 AL緩衝液加到裂解液，將樣品在70°C下孵育10分鐘。添加200UL無水乙醇後，用漩渦脈衝將溶液混合15秒。然後，按照生產商說明使用QIAamp柱純化裂解液。將基因組DNA稀釋在200 y L不含DNA酶的水中。通過使用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop)測量260nm/280nm處的吸光度來測定DNA的質量和獲得量。1.4. 2重亞硫酸鈉轉化按照Tao et al. (2002)所述用偏亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA。簡單而言，將30 y LTE緩衝液(Sigma-Aldrich)中5 y g基因組DNA與3. 3 y L的3mM NaOH混合至終濃度0. 3mM,並在37°C下孵育15分鐘。變性的DNA與333 L重亞硫酸鹽溶液混合，並在55°C下避光處理4小時。重亞硫酸鹽溶液被製備為2. 4M偏亞硫酸氫鈉(pH 5. 0-5. 2) (Sigma-Aldrich)和0. 5mM氫醌(Sigma-Aldrich)。使用Qiaex II試劑盒(Qiagen),按照試劑盒提供的實驗方案將處理過的DNA脫鹽和純化。然後，用0. 3M NaOH在37°C下處理DNA15分鐘，並用3M醋酸銨和3倍體積的乙醇進行沉澱。將回收的DNA溶解於100 UL TE緩衝液中(pH 8. 0)並保存在_20°C。I. 4. 3脫甲基處理使用5-氮雜-2'-脫氧胞苷(「5-Aza」)
以每個IOOmm皿IXlO5的密度接種細胞，並生長24小時。然後，用2 y M 5_氮雜-2,-脫氧胞苷(「5-Aza」)(Sigma-Aldrich)處理細胞5天。每天補充5_Aza。使用半定量RT-PCR評價PAX5的基因表達。I. 4. 4 甲基化特異性 PCR(MSP)設計甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物來評價GC和CRC細胞系中的甲基化狀態。PCR 混合物含有 I XPCR 緩衝液 II (Applied Biosystems)、2mM MgCl2、200 y M 每種dNTP、600nM每種引物、0. 5U of AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)和 20ng重亞硫酸鹽處理過的DNA。PCR程序為95°C持續10分鐘，然後是38個擴增循環(94°C持續30秒、60°C持續30秒和72°C持續30秒)，在72°C下最終延伸5分鐘。在紫外燈下觀察MSP條帶並照相。I. 4. 5重亞硫酸鹽基因組測序(BGS)
將PCR產物的直接BGS用於描述正常和GC樣品中的甲基化狀態。使用BigDyeTerminator循環測序試劑盒I. 0版(Applied Biosystems)進行測序。簡而言之,添加10 ii L混合物(包含2yL of BigDye-Terminator即用反應混合物、3. 2pmol特異性引物和IOngPCR產物)用於如下所述的測序反應25個循環，每個循環96°C持續30秒，50°C持續15秒；然後是60°C持續4分鐘。將10 ii L醋酸鈉(5M，pH 5. 2)和50 y L無水乙醇組成的60 y L混合物添加至每個反應產物。-80°C保存20分鐘後，將混合物在4°C下以3，700rpm離心30分鐘。棄去上清，用IOOiiL 75%乙醇將沉澱洗滌一次。最後，將乾燥的沉澱溶解於IOiiLHi-Di甲醯胺中(Applied Biosystems)。95°C下變性5分鐘後，測序溶液在冰上靜置2分鐘，然後用ABI 3100基因分析儀(Applied Biosystems)進行分析。使用SeqScape軟體(Applied Biosystems)分析序列。按照以下公式計算每個CpG位點的甲基化百分比甲基化％=Hc/(Hc+Ht) X 100%, (Hc = C 峰的高度，HT = T 峰的高度)。I. 5生物學功能分析I. 5. 1PAX5的克隆和表達載體的構建通過PCR克隆產生PAX5基因表達載體的全長cDNA。將來自人胃的總RNA (Ambion,Austin, TX, USA)逆轉錄成cDNA。通過PCR擴增對應於PAX5的開放讀碼框(ORF)的序列。按照生產商的指導(Invitrogen)，將PCR產物亞克隆入pCDNA3. 1T0P0 TA表達載體。簡單而言，將Iu L PCR產物連接到含有240mM NaCl和12mM MgCl2的2. 5 y L總體積中的0. 5 y LT0P0載體。在室溫下使混合反應孵育30分鐘，然後進行熱休克轉化。使用JM109 化學感受態大腸桿菌(Escherichia coli (E. coli))細胞(Promega,Madison, WI, USA)進行熱休克轉化。將JM109感受態細胞(50 u L)在冰上解凍，並將2 y L連接產物添加到細胞。冰上孵育20分鐘後，將細胞在42°C水浴中熱休克45秒不伴隨搖動，然後立即將管轉移到冰上靜置5分鐘。將S. 0. C.培養基(250 u L)添加至細胞，將管在振蕩孵育器中以220rpm在37°C下振蕩I小時。孵育後，將150 y L細胞接種在含0. lmg/ml氨節青黴素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上並於37°C下孵育過夜。通過PCR鑑定細菌集落。陽性集落培養在含0. lmg/ml氨苄青黴素的LB培養基中。通過測序檢查插入DNA。使用HiSpeed Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen)分離具有非突變靶基因的質粒。簡單而言，將細菌在ImL含0. lmg/ml氨苄青黴素的LB培養基中於37°C下以-250rpm過夜振蕩培養。然後，再將0. 5mL細菌培養物接種於IOOmL含0. lmg/ml氨苄青黴素的LB培養基中，並在37°C下以250rpm振蕩生長16小時。通過4°C下6000g離心15分鐘收集細菌沉澱。將沉澱重懸於IOmL緩衝液P1。用IOmL緩衝液P2將細菌蛋白、染色體和質粒DNA變性。將管顛倒混合6次，然後在室溫下靜置5分鐘。用IOmL緩衝液P3中和混合物，然後在室溫下孵育10分鐘。通過用QIA濾芯進行過濾清除細胞裂解液中的碎片。將過濾後的裂解液通過重力流動施加到試劑盒中提供的樹脂柱，質粒DNA與樹脂柱結合。用30mL QC緩衝液通過重力流動洗滌柱，從而去除質粒製備期時的所有汙染物和來自細菌菌株的糖類。用15mL緩衝液QF洗脫質粒DNA。通過異丙醇沉澱將DNA沉澱，並用70 %乙醇洗滌DNA沉澱。將DNA沉澱風乾並用ImL不含DNA酶的水溶解。I. 5. 2 PAX5 基因轉染將細胞以I X 104-2. 5 X IO4細胞接種於不含抗生素的24孔板中，孵育約24小時，直至細胞密度達到約90%融合。然後，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen),用0. 8 u g PAX5和對照載體(pCDNA3. I)分別轉染細胞。稀釋於50yL Opti-MEM(Invitrogen)的Lipofectamine 2000 (2. 0 u L)在室溫下孵育5分鐘。然後，稀釋於50 y L Opti-MEM的質粒DNA與Lipofectamine混合物混合。在5% CO2培養箱中37°C下孵育24-48小時後，收穫細胞，用於轉基因表達的測試。對於穩定細胞系，以I : 10的比例將細胞傳代至含有合適濃度的新黴素(G418) (Invitrogen)的新鮮生長培養基中。選擇14-21天之後收穫穩定轉染的細胞用於功能測定。1.5. 3集落形成測定轉染後兩天，以I : 20的比例將細胞隨後分到含有RPMI1640的6孔板中，RPMI1640含有10% FBS和500 ii g/mL新黴素(G418)。選擇14-18天後，用70%乙醇固定細胞10分鐘並用0. 5%結晶紫溶液染色10分鐘。對每個集落大於50個細胞的集落進行計數。以三個獨立平行樣品進行實驗。I. 5. 4細胞活力測定使用CellTiter 96AQueous One溶液細胞增殖測定試劑盒(Promega)進行MTS測定，MTS測定是3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑測定的簡稱。用胰酶消化轉染的細胞並進行計數。將細胞以5，000個細胞/100 稀釋於RPMI1640培養基中。在96孔板中的每個孔中接種IOOii L細胞。在5% CO2培養箱中於37 °C孵育平板。48小時後，將20 ii L MTS試劑添加到培養基中。將培養物在CO2培養箱中37°C下培養30分鐘-2小時。轉染後48小時，在490nm處測量樣品的吸光度。該實驗重複3次。I. 5. 5劃痕癒合測定劃痕癒合測定是用於研究細胞遷移。簡單而言，以5X IO5細胞/孔的濃度將胰酶消化的細胞接種於6孔板的完全培養基中。在5% CO2培養箱中於37°C孵育細胞24小時。去除細胞的培養基後，使用非常細的槍頭橫跨每個孔製造3道劃痕。通過用IX磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗滌兩次去除鬆散貼壁的細胞。在每孔中添加僅具有一半濃度FBS的飢餓培養基。在0小時、24小時和48小時採集劃痕的圖像。該測定重複2次。1.5. 6侵襲測定使用24孔基質膠生物包被的侵襲小室(BD Biosciences, Bedford, MA, USA),按照試劑盒的實驗方案進行基質膠侵襲測定。該測定中使用具有PAX5基因或對照載體P⑶NA3. I的穩定細胞。對於每個基質膠聚碳脂膜(transwell)，添加具有2. 5X IO4細胞的0. 5mL細胞懸液。作為化學引誘劑，在下室中添加0. 75mL含有10% FBS和0. 1%牛血清白蛋白(BSA)的培養基。在5% CO2環境的培養箱中於37°C下孵育小室24小時。從膜的上表面去除非侵襲的細胞。使用0.5%結晶紫溶液將侵襲通過基質膠膜的細胞染色。在顯微鏡下計數侵襲細胞的數量。從3次獨立測定收集和分析數據。I. 5. 7細胞周期分析和膜聯蛋白V凋亡測定碘化丙啶(PI)是嵌入劑和可用於染色DNA的螢光分子。該染料不能進入活細胞，但能穿透將要死亡的或已死亡的細胞的細胞膜。通常通過流式細胞儀分析PI染色的細胞，從而評價細胞活力或細胞周期分析中的DNA含量。對於細胞周期分析,收穫細胞並用IXPBS緩衝液洗滌2次。將冷的70%乙醇用於在4°C下將細胞固定過夜。用IXPBS將固定的細胞洗滌2次。將PI染色液(配製於I XPBS緩衝液中的50 u g/mL PI和100 u g/mLRNA酶A)添加至細胞並充分混合。將混合物在4°C下靜置30分鐘，直至進行流式細胞儀分 析。計數約 20，000 個細胞，並用 ModFit 3. 0 軟體(Verity Software House, Topsham,ME,USA)分析結果。膜聯蛋白V是可以結合已發生凋亡但還未失去膜的完整性的細胞膜的蛋白。使用膜聯蛋白V和PI雙染評價凋亡細胞的比例。簡單而言，將用IXPBS洗滌的細胞重懸於IOOiI L 冰冷膜聯蛋白結合緩衝液中(IOmM HEPESU40mM NaCl 和 2. 5mM CaCl2, pH 7. 4)，該緩衝液中含有5 ii L綴合了 Alexa Fluor 488的膜聯蛋白V(Invitrogen)和2 y L PI染色液(50 u g/mL) (BD Pharmingen，San Jose,CA,USA) 室溫下孵育15分鐘後，將細胞與另外的400 u L冰冷膜聯蛋白結合緩衝液混合，並使用流式細胞儀進行分析。1.5. 8體內腫瘤發生分別將用pCDNA3. 1-PAX5轉染的或僅用pCDNA3. I轉染的BGC823細胞(0. ImL PBS中的IXlO6細胞)皮下注射到5周齡雄性Balb/c裸鼠的背部左側。可觀察到腫瘤之後，每兩天測量腫瘤大小，持續3周。通過測量腫瘤的最長徑和最短徑並按照下述進行計算來估計腫瘤體積(_3):體積=(最短徑)2X (最長徑)X0. 5。動物的飼養和所有實驗操作得到香港中文大學動物倫理學委員會的批准。3周後，處死小鼠，將腫瘤稱重並固定在福馬林中用於組織學分析。I. 6組織學分析I. 6. I石蠟組織切片的製備處死小鼠後，取出腫瘤並用福馬林固定。然後，將固定的組織包埋在石蠟中。將石蠟包塊切成4-6 厚，並漂浮在蒸餾水的水浴上。將切片挑出在載玻片上。將載玻片在烘箱或室溫下過夜乾燥。1.6. 2免疫染色使用Histostain-Plus試劑盒(Invitrogen)進行免疫組化染色。簡單而言，用二甲苯將石蠟切片脫石蠟，並在梯度乙醇中再水化。將載玻片浸在過氧化物酶猝滅溶液(3%過氧化氫)中10分鐘。然後，用微波表位恢復處理載玻片10分鐘，並用PBS洗滌2分鐘，共3次。加入血清封閉液，並孵育10分鐘。該步驟時不應當漂洗。然後，加入一抗4°C下孵育過夜。然後，用PBS漂洗載玻片2分鐘，共3次。將載玻片與足量的生物素化的二抗孵育30分鐘，用PBS漂洗2分鐘，共3次。漂洗後，在潮溼小室中加入酶綴合物保持30分鐘，然後PBS漂洗2分鐘，共3次。在二氨基聯苯胺(DAB)底物溶液中顯色。最後，用蘇木精將切片復染並用封片劑封片。I. 6. 3原位DNA缺口末端標記利用Dead End TM Colorimetric TUNEL系統(Promega)進行末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP-地高辛缺口末端標記(TUNEL)測定。簡單而言，將石蠟切片脫蠟、再水化、用蒸餾水漂洗並在IXPBS中洗滌。然後，用20 ii g/mL蛋白酶K在室溫下消化組織25分鐘。用10%緩衝福馬林PBS溶液進行組織的再固定。加入平衡緩衝液後，將切片在含有生物素化的核苷酸混合物的工作濃度的TdT酶中於37°C下孵育60分鐘。通過加入工作濃度的終止/洗滌緩衝液終止反應。洗滌後，用0. 3%過氧化氫處理5分鐘來進行內源過氧化物酶的猝滅。在潮溼小室中加入抗生物素蛋白鏈菌素HRP溶液，室溫下保持30分鐘。在DAB底物溶液中顯色。然後，用蘇木精將切片復染。具有棕色信號的細胞核被認為是程序性死亡的細胞。將凋亡細胞比例計算為至少1，000個細胞中陽性細胞的百分比。
I. 7統計學分析通過配對t檢驗分析腫瘤和相鄰非腫瘤原代胃組織之間PAX5mRNA表達水平的差異。進行獨立樣品t檢驗來分析對照和PAX5過表達細胞在集落形成、MTS測定、細胞周期、膜聯蛋白V-PI雙染測定、TUNEL、侵襲測定和裸鼠中的腫瘤重量中的統計學顯著差異。卡方檢驗用於分析患者特徵。接受者操作特徵(ROC)曲線用於估計用於甲基化狀態測定的甲基化百分比截取值。Kaplan-Meier存活曲線和對數秩檢驗用於評價對應於PAX5甲基化狀態的整體存活數據。通過變量重複測量分析(ANOVA)確定用PAX5表達載體和對照載體穩定轉染的兩組小鼠之間腫瘤生長速率的差異。當P小於0. 05時，認為數據是統計學顯著的；當P小於0. 01時，認為數據是統計學非常顯著的。表I. I本研究中所用引物的DNA序列。
權利要求
1.診斷或確定來自患者的生物樣品中胃癌的預後的方法，所述方法包括以下步驟 檢測所述樣品中與由SEQ. ID. NO. 24組成的區域至少95%相似的連續序列中的至少15個連續鹼基對的靶DNA序列的甲基化； 其中顯著的甲基化水平指示胃癌的不良預後。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述靶序列的長度為至少50個鹼基對並含有多個CpG鹼基對。
3.如權利要求I或2所述的方法，還包括將患者樣品中靶序列的甲基化水平與非癌細胞的甲基化水平進行比較。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述確定或檢測包括用能差異性地修飾甲基化的DNA和非甲基化的DNA的試劑處理樣品。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述區域由SEQ.ID. NO. 11組成。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述確定或檢測包括用硫酸氫鈉處理樣品。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中通過COBRA、BGS或MSP進行所述確定或檢測。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述樣品是血液樣品或糞便樣品。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述確定包括以下步驟 a)使用根據SEQ.ID. NO. 24中的含CpG的基因組序列所選擇的引物來擴增用限制性酶處理的DNA ;和 b)將未知樣品中基因組序列的擴增部分的甲基化水平與非癌樣品的甲基化水平進行比較， 從而檢測胃癌的存在。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述試劑包括優先切割非甲基化的DNA的酶。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述擴增利用聚合酶鏈反應。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法， 其中所述檢測使用選自以下的引物或探針:SEQ. ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。
13.分離的核酸序列，其與SEQ.ID. NO. 24的10個連續鹼基對的區域至少約95%相似。
14.如權利要求13所述的分離的核酸，其中所述分離的序列與SEQ.ID. NO. 11的約20個連續鹼基對的區域至少99%相似。
15.檢測患者樣品中的胃癌的方法，該方法包括檢測所述樣品中與SEQ.ID. NO. 13在至少約15個連續鹼基上至少95%相似的RNA序列的表達，其中與正常對照樣品相比，所述序列的顯著水平的降低表達指示胃癌的存在。
16.抑制胃癌細胞發展的方法，所述方法包括以下步驟 在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分，從而抑制所述細胞的生長。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述表達包括將所述胃癌細胞中與SEQ.ID. NO. 24在至少15個連續鹼基對上具有至少95%序列相似性的DNA序列脫甲基。
18.如權利要求16或17所述的方法，其中所述表達包括將分離的DNA分子引入所述細胞，所述分離的DNA分子適於表達與SEQ. ID. NO. 23在約50個連續胺基酸上至少約95%相似的蛋白。
19.用於診斷或確定生物樣品中的胃癌的預後的試劑盒，所述試劑盒包括用於檢測所述樣品中與由SEQ. ID. NO. 24組成的區域至少95%相似的連續序列中的至少15個連續鹼基對的靶DNA序列的甲基化的試劑，優選地，所述樣品選自血液樣品和糞便樣品。
20.如權利要求19所述的試劑盒，其中所述靶序列的長度為至少50個鹼基對並含有多個CpG鹼基對。
21.如權利要求19或20所述的試劑盒，還包括非癌細胞的甲基化水平的對照。
22.如權利要求19-21中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑可以差異性地修飾甲基化的DNA和非甲基化的DNA。
23.如權利要求19-22中任一項所述的試劑盒，其中所述區域由SEQ.ID. NO. 11組成。
24.如權利要求19-23中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑還包括用於處理樣品的硫酸氫鈉。
25.如權利要求19-24中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑用於COBRA、BGS或MSP。
26.如權利要求19-25中任一項所述的試劑盒，還包括限制性酶和引物，所述引物用於選擇性地擴增用所述限制性酶處理的並包含在SEQ. ID. NO. 24中的含CpG基因組序列。
27.如權利要求19-26中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑包括優先切割非甲基化的DNA的酶。
28.如權利要求26所述的試劑盒，其中所述擴增是聚合酶鏈反應。
29.如權利要求19-28中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑包括選自以下的引物或探針SEQ. ID. NOS. 1、2、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 和 22。
30.用於檢測患者樣品中的胃癌的試劑盒，包括用於檢測與SEQ.ID. NO. 13在至少約15個連續鹼基上至少95%相似的RNA序列的試劑，以及正常對照樣品的對照，優選地，所述樣品選自血液樣品和糞便樣品。
31.SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分在抑制胃癌細胞發展中的用途，包括在所述癌細胞中表達SEQ. ID. NO. 23的生物學有效部分，從而抑制所述細胞的生長。
32.如權利要求31所述的用途，其中所述表達包括將所述胃癌細胞中與SEQ.ID. NO. 24在至少15個連續鹼基對上具有至少95%序列相似性的DNA序列脫甲基。
33.如權利要求31或32所述的用途，其中所述表達包括將分離的DNA分子引入所述細胞，所述分離的DNA分子適於表達與SEQ. ID. NO. 23在約50個連續胺基酸上至少約95%相似的蛋白。
全文摘要
本發明提供了用於檢測胃癌的方法和試劑盒，其中PAX5基因的表達或甲基化被用作胃癌的診斷和預後的標誌物。本發明還提供了通過在癌細胞中表達PAX5基因抑制胃癌細胞發展的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102782157SQ201180003932
公開日2012年11月14日 申請日期2011年4月29日 優先權日2010年4月30日
發明者於君, 李曉星 申請人:香港中文大學