人趨化因子β－13的製作方法

2023-07-07 10:25:51

專利名稱：人趨化因子β－13的製作方法
技術領域：
本發明涉及新鑑別的多核苷酸，由這些多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸及多肽的用途及多核苷酸及多肽的生產。更具體地，本發明的多肽是人趨化因子β-13，有時後文中稱為「Ckβ-13」。本發明還涉及抑制該多肽的作用。
趨化因子，也稱內分泌(intercrine)細胞因子，是一類結構和功能相關的細胞因子亞家族，這些分子大小為8-10kd。一般地，趨化因子在胺基酸水平呈20-70％的同源性且特徵在於四個保守的半胱氨酸殘基形成兩個二硫鍵。基於頭兩個半胱氨酸殘基的排列，趨化因子被分成兩個亞家族α和β。在α亞家族，頭兩個半胱氨酸被一個胺基酸分開因此稱作「C-X-C」亞家族。在β亞家族，兩個半胱氨酸位置相鄰因此稱作「C-C」亞家族。迄今為止，已在人體內鑑別出至少9個這一家族的不同成員。
內分泌細胞因子顯示有許多功能。一個特點是其能誘導不同的細胞類型包括單核細胞、嗜中性白細胞、T淋巴細胞、嗜鹼性粒細胞和成纖維細胞做趨化性遊走。許多趨化因子有促炎活性且涉及炎症期間的多個步驟。這些活性包括刺激組胺的釋放，溶酶體酶類和白三烯釋放，提高免疫靶細胞對內皮細胞的粘連，增強補體蛋白質的結合，誘導粒細胞粘附分子和補體受體的表達及呼吸爆發。除了其涉及在炎症中，還發現某些趨化因子呈現其它活性。例如，巨噬細胞炎性蛋白質1(MIP-1)能抑制造血幹細胞增殖，血小板因子4(PF-4)是內皮細胞生長的有效抑制物，白細胞介素3(IL-3)促進角化細胞增殖，GRO是黑素瘤細胞的自泌生長因子。
根據其多種生物活性，趨化因子與各種生理或病理狀態，包括淋巴細胞運輸，傷口癒合，造血機能調節及免疫失調如變態反應，哮喘和關節炎相關是毫不驚奇的。
「C-C」分支的成員在下述細胞上發揮其功效嗜酸性細胞可殺滅寄生蟲以減輕寄生蟲感染，嗜酸性細胞也能引起呼吸系統的氣道慢性炎症；單核細胞和巨噬細胞可抑制脊椎動物腫瘤的形成；T淋巴細胞可吸引T細胞；嗜鹼性粒細胞可釋放在變態反應炎症中起重要作用的組胺。
儘管C-C分支的成員主要作用於單核細胞而C-X-C分支成員主要作用於嗜中性白細胞，但是不能基於此準則把獨特的化學引誘物的性質歸於一個趨化因子。來自一個家族的一些趨化因子呈現與其它家族的特點。
本發明的多肽具有保守的半胱氨酸「C-C」區，並與已知趨化因子具有胺基酸序列同源性。
根據本發明的一個方面，提供了新的多肽及其生物活性的並且診斷或治療有用的片段，類似物和衍生物。
根據本發明的另一方面，提供了編碼本發明多肽的分離的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA及其生物活性的並且診斷或治療有用的片段，類似物和衍生物。
根據本發明的另一方面，提供了核酸探針，其包含長度足以與編碼本發明的多肽的核酸序列特異雜交的核酸分子。
根據本發明的再一方面，提供了通過重組技術生產這些多肽的方法，包括在促進所述蛋白表達和所述蛋白的後續回收的條件下培養包含編碼本發明的多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞。
根據本發明的又一方面，提供了為治療目的而使用這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的方法，如治療實體瘤、慢性感染、白血病、T細胞介導的自身免疫疾病、寄生蟲感染、銀屑病，調節造血功能、刺激生長因子活性、抑制血管生成及促進傷口癒合。
根據本發明的再一方面，提供了抗這些多肽的抗體。
根據本發明的又一方面，提供了這些多肽的拮抗劑，其可用於例如在治療自身免疫疾病，動脈粥樣硬化，慢性炎症及感染性疾病，組胺和IgE介導的變態反應，不依賴於前列腺素的發熱，骨髓功能低下，矽肺，結節病、風溼性關節炎和嗜酸性細胞增多症候群時抑制這些多肽的作用。
根據本發明的另一方面，提供了用於診斷與本發明的核酸序列中的突變及與由此核酸序列編碼的蛋白的改變水平相關的疾病和疾病的易感性的方法。
根據本發明的又一方面，提供了為科學研究、DNA合成和DNA載體的生產相關體外目的使用這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的方法。
本發明的這些及其它方面根據本文的教導對本領域技術人員將是顯而易見的。
下述附圖旨在說明本發明的實施方案，並非限制本發明的範圍。


圖1示出Ckβ-13的cDNA序列及相應的推導的胺基酸序列，開頭的28個胺基酸代表前導序列，由此推定的成熟多肽包含65個胺基酸，使用了標準的單字母胺基酸縮寫。使用373自動DNA測序儀(Applied Biosystems，Inc.)進行測序。
圖2示出Ckβ-13(頂行)與人MIP-1α多肽(底行)間胺基酸序列同源性。
根據本發明的一個方面，提供了分離的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖1的推導的胺基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由1995年4月28日保藏的ATCC保藏號97113的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
編碼Ckβ-13的多核苷酸從激活的單核細胞cDNA文庫中分離。Ckβ-13是趨化因子C-C分支的一個成員。其含有一編碼93個胺基酸殘基的蛋白質的開放讀框，該蛋白質大約開始28個胺基酸是推定的前導序列，如此成熟蛋白質包括65個胺基酸。該蛋白質與趨化因子多肽有結構同源性，並且其在整個序列上與人MIP-1α多肽呈33％相同性及53％相似性僅僅是舉例性的。
在趨化因子中的4個空間保守的半胱氨酸殘基在本發明的多肽中也被發現，如圖1所示。
本發明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，並且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由於遺傳密碼的豐餘性或簡併性，與圖1(SEQ ID NO1)的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內含子或成熟多肽編碼序列的5』和/或3』非編碼序列。
因此，術語「編碼多肽的多核苷酸」包含如下的多核苷酸，即僅包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1(SEQ IDNO2)的推導的胺基酸序列的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸的變異體可以是天然發生的該多核苷酸的等位基因變異體，或是該多核苷酸的非天然發生的變異體。
因此，本發明包括編碼圖1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物，這些核苷酸變異體包括缺失變異體、取代變異體和添加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1(SEQ ID NO2)所示的編碼序列的天然發生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發生的等位基因變異體的編碼序列。如本領域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以取代、缺失或添加一個或多個核苷酸，但基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框內與有助於多肽從宿主細胞表達和分泌的多核苷酸融合，例如前導序列，其是用於控制多肽從細胞轉運的分泌序列。具有前導序列的多肽是一種前蛋白(preprotein)，前導序列可以由宿主細胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸還可編碼一種蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5』胺基酸殘基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原並是蛋白質的非活性形式，一旦原序列被切掉，則保留活性成熟蛋白。
因此，例如，本發明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或編碼具有序列原的蛋白或具有序列原和前序列(前導序列)的蛋白。
本發明的多核苷酸還可以具有在讀框內與標記序列融合的編碼序列，其可用於純化本發明的多肽。標記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標記物用於在細菌宿主中純化與該標記物融合的成熟多肽，或者，例如，當使用哺乳動物宿主如COS-7細胞時，標記序列可以是血凝素標記物(HA)。HA標記物相應於由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et a1.，Cell，37767(1984))。
術語「基因」指的是生產多肽鏈中涉及的DNA區段；它包括編碼區之前和之後的區域(前導序列和尾隨序列)及各個編碼區段(外顯子)間的間插序列(內含子)。
本發明的全長Ckβ-13基因的片段可用作與cDNA文庫雜交的雜交探針以分離全長cDNA並分離與基因有高序列相似性或有相似生物活性的其它cDNA。此型探針優選具有至少30個鹼基且可含如50個或更多個鹼基。此探針也可用於鑑別對應於全長轉錄本的cDNA克隆和含有包括調節基因和啟動子區、外顯子和內含子的完整Ckβ-13基因的基因組克隆。篩選的一個例子包括用已知DNA序列合成一寡核苷酸探針以分離出Ckβ-13基因的編碼區。具有與本發明的基因互補的序列的標記的寡核苷酸用於篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫以確定探針與文庫的哪些成員雜交。
本發明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少70％、優選90％、更優選95％的相同性。本發明特別涉及在嚴格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術語「嚴格條件」是指雜交僅發生在序列間具有至少95％、優選97％相同性的情況下。在一優選的實施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學功能或活性的多肽。
或者，多核苷酸可以具有至少20個鹼基，優選30個鹼基、更優選至少具有50個鹼基，其與本發明的多核苷酸雜交且具有上述的相同性，並且可保持或不保持活性。例如，如此的多核苷酸可用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探針，如用於多核苷酸的回收或作為診斷探針或作為PCR引物。
如此，本發明涉及與編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸及其片段具有至少70％相同性，優選至少90％相同性、更優選至少95％相同性的多核苷酸，所述片段具有30個鹼基、優選50個鹼基。本發明還涉及由該多核苷酸編碼的多肽。
本文所指的保藏物將根據國際承認的用於專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的規定期限保藏。這些保藏僅為本領域技術人員提供方便，而不是對根據35 U.S.C 112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的胺基酸序列引入本文作參考，並且在與本文的序列描述有牴觸時，其是參照。製造、使用或銷售保藏物需經許可，而本文不授予這種許可。
本發明還涉及具有圖1(SEQ ID NO.2)的推導的胺基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的胺基酸序列的趨化因子多肽，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當指圖1(SEQ ID NO.2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持這些多肽的相同的生物學功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，其可通過裂解蛋白原部分而激活以生產有活性的成熟多肽。衍生物或片段可以包括，例如具有少於圖1的多肽的胺基酸殘基數但仍保留人趨化因子多肽的生物學活性特徵的剪接變體。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優選重組多肽。
圖1(SEQ ID NO.2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的一或多個胺基酸殘基被保守或非保守的胺基酸殘基取代(優選由保守的胺基酸殘基取代)，並且這種取代的胺基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個胺基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的胺基酸與成熟多肽融合，例如前導序列或分泌序列或用於純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類似物被視為屬於本領域熟練技術人員根據本文的教導而理解的範圍。
本發明的多肽和多核苷酸優選地以分離的形式提供，並優選純化至均質。
術語「分離的」是指從其原始環境(例如，若其是天然存在的則是天然環境)中脫離的物質。例如，存在於活體動物中的天然發生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，並且如果這種載體或組合物不是其天然環境的一部分，則其還是分離的。
本發明的多肽包括SEQ ID NO2所示的多肽(尤其是成熟多肽)，及與SEQ ID NO2的多肽有至少70％相似性(優選至少70％相同性)、優選與SEQ ID NO2的多肽有至少90％相似性(更優選至少90％相同性)、更優選與SEQ ID NO2的多肽有至少95％相似性(更優選95％相同性)的多肽；也包括這些多肽的通常至少含30個胺基酸優選至少50個胺基酸的部分。
本領域已知兩多肽間的「相似性」的測定是通過將一種多肽的胺基酸序列及其保守的胺基酸取代物與另一種多肽的序列相比較測定的。
本發明的多肽的片段或部分可通過肽合成法用於生產對應的全長多肽；因而所述的片段可用作生產全長多肽的中間物。本發明的多核苷酸的片段或部分可用於合成本發明的全長多核苷酸。
本發明還涉及包括本發明的多核苷酸的載體，用本發明的載體基因工程化的宿主細胞，以及用重組技術生產本發明的多肽。
宿主細胞用本發明的載體基因工程化(轉導或轉化或轉染)，所述的載體可以是克隆載體或表達載體。載體可以是質粒、病毒顆粒、噬菌體等。基因工程化的宿主細胞可以在改良的傳統營養培養基中培養，改良培養基是為了激活啟動子，選擇轉化子或擴增Ckβ-13基因。培養條件如溫度、pH等是先前用於選擇用來表達的宿主細胞的條件，其對本領域普通技術人員是顯而易見的。
本發明的多核苷酸可通過重組技術用於生產多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達載體中以表達多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；杆狀病毒；酵母質粒；衍生於質粒和噬菌體DNA的結合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可複製和生存。
可通過多種程序將合適的DNA序列插入載體，通常，通過本領域公知的程序將DNA序列插入合適的限制性內切酶位點。這些和其它程序屬於本領域熟練技術人員的範疇。
表達載體中的DNA序列與合適的表達調控序列(啟動子)連接以指導mRNA合成，作為這些啟動子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動子，E.colilac或trp啟動子，λ噬菌體PL啟動子和其它公知用於控制基因在原核細胞或真核細胞或者病毒中表達的啟動子。表達載體還含有一用於翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體還可包括用於擴增表達的合適的序列。
另外，表達載體優選含有一個用於為選擇轉化的宿主細胞提供表型標記的基因，如對於真核細胞培養為二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，而在E.coli中例如為四環素或氨苄青黴素抗性。
可採用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動子或調控序列的載體轉化合適的宿主以使宿主表達蛋白質。
作為合適的宿主的例子，可以提及的有細菌細胞，如E.coli、鏈黴菌、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如果蠅S2和Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細胞等。選擇合適的宿主細胞被視為屬於本領域熟練技術人員根據本文的教導而理解的範圍。
更具體地，本發明還包括重組構建體，所述構建體包含一或多種上述序列。該構建體包括載體，如質粒或病毒載體，在該載體中以正向或反向插入本發明的序列。在這一實施方案的一個優選方面，該構建體還包括調節序列，包括例如，與所述序列連接的啟動子。本領域熟練技術人員已知大量的合適的載體和啟動子，它們是可商購的。以下舉出載體的例子，細菌的載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phage script，psiX174，pBluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質粒或載體，只要其可在宿主中複製和生存即可。
啟動子區可以選自使用CAT(氯黴素轉移酶)的載體或其它帶有選擇性標記的載體的任何所需基因，兩個合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動子屬於本領域普通技術人員的水平範疇。
在另一實施方案中，本發明涉及含有上述構建物的宿主細胞，所述的宿主細胞可以是高等真核細胞，如哺乳細胞，或低等真核細胞，如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。可通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))將構建物導人宿主細胞。
可以用傳統的方式使用宿主細胞中的構建物以生產由重組序列編碼的基因產物。或者，也可通過常規的肽合成儀合成生產本發明的多肽。
在合適的啟動子的控制下，可以在哺乳細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達成熟蛋白質，也可採用無細胞翻譯系統使用由本發明的DNA構建物衍生的RNA生產這種蛋白質。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達載體見Sambrook，et al，Molecular ClonningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書引入本文作參考。
高等真核生物對編碼本發明的多肽的DNA的轉錄可通過在載體中插入一增強子序列而得以增加，增強子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用於啟動子以增加其轉錄。其例子包括位於複製起點晚期側(100-270bp處)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點晚期側的多瘤病毒增強子，以及腺病毒增強子。
通常，重組表達載體包括複製起點和允許宿主細胞的轉化的選擇標記，如E.coli的氨苄青黴素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生於高表達基因的啟動子以指導下遊結構序列的轉錄。這種啟動子可以衍生於編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白的操縱子。在合適的階段，異源結構序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優選地，裝配一能指導翻譯的蛋白質進入周質空間或胞外培養基的前導序列。任選地，異源序列可以編碼一包括N-末端鑑別肽的融合蛋白質，以賦予所需的特徵，如表達的重組產物的穩定性和純化簡便性。
用於細菌的表達載體的構建是通過將編碼所需蛋白質的結構DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號一起插入帶有功能啟動子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標記及一個複製起點以確證載體保持在宿主中，並且，如果需要，可以在宿主中擴增。合適的用於轉化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當然，也可採用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細菌表達載體可以包括衍生於包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購質粒的選擇標記和細菌複製起點，這些商購質粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madi son，WI，USA)。這些pBR322「骨架」部分與合適的啟動子及待表達的結構序列結合。
轉化合適的宿主菌株並將宿主菌株培養至合適的細胞密度後，用合適的方法(如溫度改變或化學誘導)誘導選定的啟動子，並繼續培養細胞一段時間。
典型地，細胞由離心收集，用物理或化學方法破碎，保留得到的粗提物以進一步純化。
用於表達蛋白質的微生物細胞可用任何常規方法破碎，如凍-融循環、超聲處理、機械破碎，或使用細胞裂解試劑，這些方法是本領域熟練技術人員熟知的。
也可使用各種哺乳細胞培養系統表達重組蛋白，哺乳細胞表達系統的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系，以及其它能表達相容載體的細胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細胞系。哺乳類表達載體包括複製起點，合適的啟動子和增強子，以及任何必需的核糖體結合位點，多腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉錄終止序列，和5』旁側非轉錄序列。可使用源自SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點、早期啟動子、增強子、剪接體和多腺苷酸化位點以提供所需的非轉錄遺傳因子。
可通過硫酸銨或乙醇沉澱、酸抽提、陽離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析羥基磷灰石層析和凝集素層析等方法從重組細胞培養物中回收並純化Ckβ-13多肽。如果需要，可使用蛋白質重摺疊步驟以完成成熟蛋白的構型，最後，可採用高效液相色譜(HPLC)進行最後的純化步驟。
本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成過程的產物，或者通過重組技術從原核或真核宿主(例如，通過培養細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細胞)而生產。根據在重組生產過程中採用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化或是非糖基化的。本發明的多肽還可以包括一起始的甲硫氨酸殘基。
本發明的多核苷酸和多肽可用作研究試劑和研究材料以揭示對人類疾病的療法和診斷劑。
本發明的多肽可用於抑制骨髓幹細胞集落形成以作為在腫瘤化療及白血病治療期間的輔助保護性治療手段。Ckβ-13多肽可以抑制造血細胞如骨髓幹細胞的增殖和分化。對定型祖細胞(如粒細胞和巨噬細胞/單核細胞)的抑制作用可治療性地用於抑制白細胞的增殖。
由於發現皮膚中的郎氏細胞可產生趨化因子，因此本發明的多肽也可用於抑制表皮角化細胞增殖以治療以角化細胞過度增殖為特徵的銀屑病。
本發明的多肽也可通過趨化性刺激宿主防禦細胞如胞毒性T細胞和巨噬細胞的侵入及活化及抑制腫瘤的血管生成用以治療實體腫瘤如Karposi肉瘤。
其也可用於增強宿主抗慢性及急性感染的抵抗力，如經誘導和激活殺菌性白細胞抗分支桿菌的感染。
本發明的多肽也可通過抑制IL2生物合成來抑制T細胞增殖以治療T細胞介導的自身免疫疾病和淋巴細胞型白血病。
Ckβ-13也可用於刺激傷口癒合及在傷口癒合期間防止瘢痕形成，都是通過清除碎屑及結締組織促炎細胞的募集，也通過其對過量的TGFβ介導的纖維化的控制來完成。以這種相同方式，Ckβ-13可用於治療其它纖維性疾病，包括肝硬化，骨關節炎和肺纖維化。
本發明的多肽也可提高嗜酸性細胞數量，這些細胞具有獨特的殺死侵入組織中寄生蟲的幼蟲的功能，如在血吸蟲病，毛線蟲病和蛔蟲病中。
本發明的多肽也可通過調節各種原始造血細胞的活化和分化來調節造血機能。例如，在化療後從骨髓釋放成熟白細胞。
本發明的多肽還可用於靶向不希望的細胞，如在癌症治療中的編程性細胞死亡。
多核苷酸及由多核苷酸編碼的多肽還可用於與科研，DNA合成和DNA載體的製備及設計治療人體疾病的治療劑及診斷劑等相關的各種體外目的。
多肽也可用於將骨髓幹細胞移至外周血中，使幹細胞易於分離。分離的幹細胞可在大劑量化療後用於骨髓集落化。
本發明還涉及Ckβ-13基因用作檢測與編碼本發明的多肽的核酸序列中存在突變相關的疾病或疾病的易感性的診斷分析的一部分。此類疾病與人趨化因子多肽的低表達相關，如腫瘤和癌症。
攜帶本發明的基因的突變的個體可通過各種技術在DNA水平上加以檢測。用於診斷的核酸可從病人的細胞中獲得，如從血液、尿、唾液、活組織檢查及屍體剖檢中獲得。基因組DNA可直接用於檢測或可在分析前使用PCR(Saiki et al.，Nature，324163-166(1987))進行酶擴增。RNA或cDNA也可用於同一目的。例如，互補於編碼Ckβ-13的核酸的PCR引物可用於鑑別及分析Ckβ-13突變。如通過與正常基因型相比擴增產物的大小的變化能檢測缺失或插入。點突變可通過將擴增的DNA與放射標記的Ckβ-13RNA或放射標記的Ckβ-13反義DNA序列雜交加以鑑別。完全匹配的序列可通過RNaseA消化或通過解鏈溫度的不同與錯配的雙螺旋區分開。
基於DNA序列的不同的遺傳測試可通過檢測在帶有或不帶有變性劑的凝膠中的DNA片段的電泳遷移率的改變來完成。通過高解析度凝膠電泳可觀察小的序列缺失及插入。不同序列的DNA片段可通過在變性甲醯胺梯度凝膠中區分，其中不同DNA片段根據其特異的解鏈溫度或部分解鏈溫度在凝膠中的不同位置停留(例見，Myers etal.，Science，230-1242(1985))。
特異位置的序列的改變通過核酸酶保護分析如RNase和S1保護或化學裂解法加以揭示(例如，Cotton etal.，PNAS，USA，8543934401(1985))。
因此，特異性DNA序列的檢測可經如雜交、RNase保護、化學裂解、DNA直接測序或使用限制性酶(例如，限制性片段長度多態性(RFLP))及基因組DNA的Southern印跡分析等方法來完成。
除了更常規的凝膠電泳和DNA測序，也可經原位分析檢測突變。
本發明還涉及一種檢測各種組織中本發明的多肽變化水平的診斷分析法，因為與正常對照組織樣品相比該多肽的過量表達可檢測疾病或疾病的易感性的存在，如腫瘤。用於檢測衍生自宿主的樣品中的本發明的多肽水平的分析法已為本領域技術人員所熟知，包括放射免疫分析、競爭-結合分析、Western印跡分析、ELISA分析及「夾心」分析。ELISA分析(Coligan，et al.，Current Protocols inImmunology，1(2)，Chapter 6(1991))最初包括製備一種特異於Ckβ-13抗原的抗體，優選一種單克隆抗體。另外製備一種抗單克隆抗體的報導抗體。該報導抗體與可檢測的試劑如放射活性、螢光或本實施例中的辣根過氧化物酶相連。從宿主取出樣品且在結合樣品中的蛋白質的固相載體中如聚苯乙烯皿中保溫，然後用非特異性蛋白如牛血清白蛋白溫育而覆蓋皿中的任何游離蛋白質結合位點。接著，在皿中溫育單克隆抗體，在此期間單克隆抗體與同聚苯乙烯皿結合的任何Ckβ-13蛋白結合，用緩衝液洗去所有未結合的單克隆抗體。將與辣根過氧化物酶連接的報告抗體置入皿中導致報導抗體與同Ck -13多肽相結合的任何單克隆抗體結合，然後洗去未結合的報導抗體。將過氧化物酶底物加入皿中，當與標準曲線相比時在一定時間內的顯色量是一定體積的病人樣品中ckβ-13蛋白量的測量尺度。
競爭分析的使用方法是將特異於Ckβ-13多肽的抗體與固相支持物相連，將標記的Ckβ-13多肽及衍生自宿主的樣品流過固相支持物，通過例如液閃層析檢測的標記量與樣品中Ckβ-13多肽的量相關。
「夾心」分析與ELISA分析類似，在「夾心」分析中，將Ckβ-13多肽流過固相支持物而結合於同固相支持物連接的抗體。然後將第二抗體與Ckβ-13多肽相結合。將標記的並特異於第二抗體的第三抗體流過固相支持物並結合於第二抗體，然後定量。
本發明提供了一種鑑別本發明的多肽的受體的方法。編碼受體的基因可經許多本領域技術人員已知方法如配體淘選和FACS分選(Coligan，et al.，Current Protocols in Immun.，1(2).Chapter 5，(1991))進行鑑別。優選地，採用表達克隆法，其中從對多肽有應答的細胞中製備多腺苷酸化RNA，將產自該RNA的cDNA文庫分成各集合體用於轉染COS細胞或對多肽無應答的其它細胞。將在玻片上生長的轉染細胞暴露於標記的多肽。可用多種方法包括碘化或引入位點特異性蛋白激酶的識別位點將多肽標記。在固定和溫育後，對玻片進行放射自顯影分析。鑑別出陽性集合體並使用重複的亞集合和重篩選方法製備亞集合體，最後產生編碼推測的受體的單一克隆。
作為受體鑑別的另一種方法，可將標記的多肽與細胞膜或表達受體分子的提取製備物光親和性連接。經PAGE分析將交聯材料分解並在X線下曝光。切下含多肽受體的標記複合物，分解成肽片段並進行蛋白質微量測序。由微量測序得到的胺基酸序列用於設計生成一套寡核苷酸探針以篩選cDNA文庫從而鑑別編碼推測的受體的基因。
本發明提供了一種篩選化合物用以鑑別本發明的多肽的激動劑或拮抗劑的方法。激動劑是一種與本發明的多肽的受體結合併使其活化的化合物，而拮抗劑與這種受體結合併抑制受體或與Ckβ-13競爭受體。趨化性的檢測可通過將被本發明的多肽化學引誘的細胞置於具有足夠的孔徑(約5μm)以容納細胞的濾膜上。將可能的激動劑的溶液置入小室的底部，而在上部分隔間中帶有合適的對照培養基，因此通過計數在一段期間內遷移進入或通過多孔膜的細胞測定激動劑的濃度梯度。
當分析拮抗劑時，將本發明的多肽置入小室底部並加入潛在的拮抗劑以測定細胞的趨化性是否被抑制。
或者，將表達多肽受體的哺乳細胞或其膜製備物在化合物的存在下與如放射性標記的本發明的多肽進行溫育，則可檢測該化合物阻斷此相互作用的能力。
潛在的本發明的多肽的拮抗劑包括與多肽結合的抗體，或在某些情況下，寡核苷酸。潛在的拮抗劑的另一例子是多肽的顯性失活突變體。顯性失活突變體是與野生型多肽的受體結合但不能保持其生物活性的多肽。
用反義技術製備的反義構建物也是可能的拮抗劑。反義技術通過三螺旋形成或反義DNA或RNA可用於控制基因表達，這兩種方法均基於多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，用編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸序列的5』編碼區設計長度為10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設計一DNA寡核苷酸以互補於轉錄涉及的基因的某區域(三螺旋-見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney etal，Science，241456(1988)；and Dervan et al，Seience，2511360(1991)，從而防止趨化因子多肽的轉錄和生產。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內雜交並阻斷mRNA分子翻譯成多肽。(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上述的寡核苷酸也可輸送至細胞，從而反義RNA或DNA可以在體內表達以抑制Ckβ-13多肽的生產。
另一種潛在的拮抗劑是多肽的肽衍生物，其是失去生物學功能但仍能識別並與多肽受體結合從而有效地阻斷受體的多肽的天然或合成的修飾的類似物，肽衍生物的例子包括但不限於小肽或類肽分子。
拮抗劑可用於在自身免疫疾病、慢性炎症及感染性疾病當中抑制巨噬細胞及其前體、嗜中性白細胞、嗜鹼性粒細胞、B淋巴細胞及一些T細胞亞型如活化的CD8細胞毒性T細胞及天然殺傷細胞的趨化性和活化作用。自身免疫疾病的例子包括多發性硬化症及胰島素依賴型糖尿病。
拮抗劑還可通過阻止單核噬細胞的增生及激活治療如矽肺、結節病、原發性肺纖維化等感染性疾病。也可通過阻止嗜酸性細胞的產生和遷移治療原發性嗜酸性細胞增多綜合症，並可通過阻止巨噬細胞的遷移及其生產本發明的多肽而用拮抗劑治療內毒性休克。
拮抗劑也可通過阻止在動脈壁的單核細胞的侵潤用於治療動脈硬化。
拮抗劑也可通過抑制趨化因子誘導的肥大細胞和嗜鹼性粒細胞脫粒並釋放組胺用以治療組胺介導的變態反應和免疫失調包括晚期變態反應，慢性蕁麻疹和特應性皮炎。也可治療IgE介導的變態反應如過敏性哮喘、鼻炎及溼疹。
拮抗劑也可通過阻止單核細胞對傷口區域侵潤治療慢性和急性炎症。由於急性和慢性肺部炎症與肺內單核吞噬細胞的隔絕有關，因而拮抗劑也可用於調節正常肺吞噬細胞數量。
拮抗劑也可通過阻止單核細胞對患者關節內滑液的侵潤用以治療風溼性關節炎。單核細胞的侵入及激活是退化性和炎症性關節病的一個重要致病因素。
拮抗劑也可用於幹擾主要是IL-1和TNF引起的損害性級聯作用，其能阻止其它炎性細胞因子的生物合成。由此拮抗劑可用於預防炎症。拮抗劑也可用於抑制趨化因子誘導的前列腺素不依賴型發熱。
拮抗劑也可用於治療骨髓機能低下疾病，如再生障礙性貧血和骨髓發育不良綜合症。
拮抗劑還可通過防止嗜酸性細胞積聚在肺內用於治療哮喘及變態反應。拮抗劑還可用於治療上皮下基底膜纖維化，其是肺氣腫的一個顯著特徵。
拮抗劑還可與如下所述藥學可接受的載體一起形成組合物而應用。
本發明的多肽及激動劑和拮抗劑可以與合適的藥物學載體聯合應用。如此的組合物包括治療有效量的多肽和藥物學可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限於鹽水，緩衝鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其結合物。配製品應適合給藥的方式。
本發明還提供了一種藥物包裝盒或試劑盒，其包括一或多個填充有一或多種本發明的藥物組合物成分的容器。與這種容器在一起的還有由控制藥品或生物產品的生產、使用或銷售的政府機構出具的通知，該通知反應了該機構許可其為人體用而生產、使用或銷售。另外，本發明的多肽和激動劑和拮抗劑可以與其它藥物化合物結合應用。
此藥物組合物可以諸如局部，靜脈，腹膜內，肌內，腫瘤內，皮下，鼻內，或皮內途徑的傳統方式給藥。藥物組合物的給藥量是足以治療和/或預防特定的病症。一般來說，多肽的給藥量至少為大約每天每千克體重10微克，大多數情況下給藥量不超過每天每千克體重約8毫克。大多數情況下，考慮到給藥途徑、症狀等，藥劑量為每天每千克體重約10微克至1毫克。
根據本發明，本發明的多肽和也是多肽的激動劑或拮抗劑也可以用於體內表達多肽，即經常被稱為「基因治療」的方法。
因此，例如，可用編碼來自體內的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對患者的細胞進行工程化，隨後將工程化的細胞再提供給需用多肽治療的患者，這些方法是本領域公知的。例如，可用含編碼本發明的多肽的RNA的反轉錄病毒顆粒利用本領域熟知的程序對細胞進行工程化。
類似地，例如也可通過本領域公知的程序在體內對細胞進行工程化以在體內表達多肽。如本領域所公知的，可將生產含編碼本發明的多肽的RNA的反轉錄病毒顆粒的生產者細胞給予患者以在體內進行細胞的工程化並在體內表達多肽。通過這種方法給予本發明的多肽的這些和其它方法對於本領域熟練技術人員根據本發明的教導是顯而易見的。例如，用於工程化細胞的表達載體可以不是反轉錄病毒，而是例如腺病毒，其在與合適的輸送載體結合後可用於在體內工程化細胞。
可以衍生上文描述的反轉錄病毒質粒載體的反轉錄病毒包括但不限於莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房腫瘤病毒。在一個實施方案中，反轉錄病毒質粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個或多個啟動子。可以使用的合適的啟動子包括但不限於反轉錄病毒LTR；SV 40啟動子；和人類巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller，等，生物技術，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或者其它任何啟動子(例如真核細胞啟動子，如包括但不限於組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。使用的其它病毒啟動子包括但不限於腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。通過本文的描述，合適的啟動子的選擇在本領域技術人員的知識範圍內。
編碼本發明多肽的核酸序列在合適的啟動子控制下。可以使用的合適的啟動子包括，但不限於腺病毒啟動子(如腺病毒主要晚期啟動子)；或者異源啟動子(如巨細胞病毒(CMV)啟動子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導的啟動子(如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子)；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子(如單純皰疹胸苷激酶啟動子)；反轉錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人類生長激素啟動子。所說的啟動子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動子。
使用反轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系以便形成生產細胞系。可以被轉染的包裝細胞的例子包括但不限於PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VI-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN細胞系(Miller，人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部內容本文一併參考)。可以通過本領域任何已知的方法用所述載體轉導包裝細胞。這些方法包括但不限於電穿孔、使用脂質體和CaPO4沉澱。另外，反轉錄病毒質粒載體可以包在脂質體中，或者和脂類偶聯，然後施用到宿主中。
生產細胞系產生感染性的反轉錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然後可以使用這些反轉錄病毒載體顆粒體內或者體外轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達編碼所述多肽的核酸序列。可被轉導的真核細胞包括但不限於胚幹細胞、胚癌細胞、以及造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質化細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。
本發明的序列還可用於染色體鑑定，該序列特異地定向於個別的人染色體的特定位置並可與之雜交。另外，目前需要鑑定染色體上的特定位點，而現在只有很少幾種基於實際序列資料(重複多態性)的染色體標記試劑可以商購用於標記染色體位置。本發明的將DNA定位於染色體是將這些序列與相關疾病的基因聯繫起來的非常重要的第一步。
簡而言之，可通過從cDNA製備PCR引物(優選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用3』-非翻譯區的計算機分析快速選擇長度不超過基因組DNA的一個外顯子並因而不會使擴增複雜化的引物，隨後使用這些引物對含有個別的人染色體的體細胞雜合子進行PCR篩選。只有那些含有相應於引物的人基因的雜合子能得到擴增片段。
體細胞雜交體的PCR作圖是將特定DNA定位於特定染色體的一個快速程序。採用本發明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進行亞定位。其它的可類似用於染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標記的流選的染色體進行的預篩選，以及通過雜交預選以構建染色體特異cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體塗片的螢光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術可使用短至500或600個鹼基的cDNA。此技術的綜述見Verma et al.，Human ChromosomesaManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位於染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關係，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中發現(可在線從JohnsHopkins University Welch Medical Library獲得)。隨後可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑑別基因與已定位於相同染色體區的疾病之間的關係。
接著，必須確定感染個體和未感染個體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個體中觀察到某一突變而未在任何正常個體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應用目前的物理作圖和遺傳作圖技術的解析度，一種精確定位於與疾病有關的染色體區的cDNA可以是50-500個潛在的致病基因中的一個(這假定作圖解析度為1兆鹼基，並且每20kb為一個基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達其的細胞可用作免疫原生產抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發明還包括嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達文庫的產物。可使用現有技術中公知的各種程序生產這些抗體和片段。
抗對應於本發明的序列的多肽的抗體可以通過將多肽直接注射給動物或將多肽給予動物、優選非人而獲得，如此獲得的抗體隨後與多肽本身結合。以這種方式，僅編碼多肽的一個片段的序列也可用於生產與完整天然多肽結合的抗體，這種抗體隨後可用於從表達該多肽的組織中分離該多肽。
為製備單克隆抗體，可使用任何提供由連續細胞系培養物生產的抗體的技術，例如雜交瘤技術(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用於生產單鏈抗體的技術(USP4,946,778)可以用來生產本發明的免疫原性多肽產物的單鏈抗體。另外，轉基因小鼠也可用於表達本發明的免疫原性多肽產物的人源化抗體。
以下將參照實施例進一步描述本發明，但是應理解的是，本發明不受這些實施例的限制。除非另有說明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進對下述實施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術語。
「質粒」的命名是將小寫字母p置於前面和/或後跟大寫字母和/或數字。本文的起始質粒或者是商購得到的，或者是公眾可以不受限制地得到的，或者可以根據公布的程序由可得到的質粒構建的。另外，與所述的這些等效的質粒是本領域公知的，並對本領域普通技術人員是顯而易見的。
DNA的「消化」是指用僅作用於DNA的特定序列的限制性酶對DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購的，其反應條件、輔因子和其它要求對於本領域普通技術人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質粒或DNA片段使用約2單位的酶，反應體積為20μl緩衝液；為分離DNA片段用於構建質粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μg DNA。對特定限制性酶的合適的緩衝液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時的溫育時間，但可根據供應商的指示而變化。消化後，將反應物直接在聚丙烯醯胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據Goeddel，D.et al.，Nucleic AcidsRes.，84057(1980)所述在8％聚丙烯醯胺凝膠上進行。
「寡核苷酸」是指可化學合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個互補的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5』磷酸，並因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經過脫磷酸化的片段連接。
「連接」是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以採用公知的緩衝液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(「連接酶」)的條件下進行。
除非另有說明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進行轉化。
實施例1 Ckβ-13的細菌表達和純化用對應於加工的Ckβ-13蛋白(減去推測的信號肽序列)的5』和3』序列的PCR寡核苷酸引物擴增編碼Ckβ-13的DNA序列，ATCC#97113。將對應於Ckβ-13基因的附加的核苷酸分別加入到5』和3』序列。5』寡核苷酸引物序列為5』CCCGCATGCCCAACATGGAAGACAG 3』(SEQ ID NO.3)，其含有一SphI限制性酶位點(黑體字)，後接起自編碼成熟蛋白序列的第二個核苷酸的16個Ckβ-13編碼序列的核苷酸。ATG密碼子包含在SphI位點內，ATG後的下一個密碼子，其第一個鹼基來自SphI位點，剩下兩個鹼基對應於推定的成熟蛋白的第一個密碼子(殘基29)的第二個和第三個鹼基。3』序列為5』AAAGGATCCTTGGCTCAGCTTATTGAG3』(SEQ ID NO.4)，其含有互補於BamHI位點的序列(黑體字)，後接18個在終止密碼子前的基因特異性序列的核苷酸。限制性酶位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，OA，91311)上的限制性酶位點。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr』)，一個細菌複製點(ori)，一個IPTG可調控啟動子操縱子(P/O)，一個核糖體結合位點(RBS)，一個6-組氨酸標記(6-His)及限制性酶位點。用SphI和BamHI消化pQE-9。將擴增序列連到pQE-9中並插入有編碼6-組氨酸標記的序列及RBS的框架中。然後通過Sambrook，J.et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)所述步驟，用連接混合物轉化E.coli菌株M15/rep4(來自Qiagen，Inc.)。M15/rep4含有多拷貝的表達1acI阻遏物並賦予卡那黴素抗性(Kanr』)的質粒pREP4。在LB平板上鑑別轉化子並篩選氨苄青黴素/卡那黴素抗性克隆。分離質粒DNA並經限制性分析確定。在補加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液體LB培養基中將含有所需構建物的克隆培養過夜(O/N)，O/N培養物以1∶100-1∶250的比例接種到大體積培養基中。培養細胞至光密度600(O.D.600)為0.4-0.6。隨後加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導激活P/O，使基因表達水平提高。再培養細胞3-4小時，隨後離心收集細胞。將細胞沉澱溶解到離液劑6M鹽酸胍pH5.0中，澄清後，在使得與含6-His標記的蛋白質緊密結合的條件下，通過鎳-鰲合柱層析(Hochuli，E.et al.，J.Chromatography 411177-184(1984)，從溶液中純化溶解的Ckβ-13。在6M鹽酸胍pH5.0中從柱中洗脫Ckβ-13(純度＞98％)。蛋白質由GnHCl中復性出來可以各種方案進行(Jaenicke，R.andRudolph，R.，Protein Strueture-A Practical Approach，IRL Press，NewYork(1990)。首先使用透析步驟以除去GnHCl。或者從鎳-鰲合柱中分離出的純化的蛋白質結合到第二個柱中，在第二個柱中具有下降的線性GnHCl梯度。在結合到柱中時使蛋白質復性，隨後用含250mM咪唑，150mM氯化鈉，25mM Tris-HCl pH7.5及10％甘油的緩衝液洗脫。最後，將溶解的蛋白質對含5mM碳酸氫銨的貯存緩衝液透析。
實施例2 重組Ckβ-13在COS細胞中的表達表達質粒Ckβ-13 HA衍生自載體pcDNAI/Amp(Initrogen)，含有1)SV40複製起點，2)氨苄青黴素抗性基因，3)E.coli複製起點，4)CMV啟動子，後接多接頭區、SV40內含子和多腺苷酸化位點。編碼完整Ckβ-13前體和在框內融合到其3』末端的HA標記的DNA片段被克隆至載體的多接頭區，從而重組蛋白質直接在CMV啟動子下表達。HA標記對應於衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標記與靶蛋白質融合使得用識別HA表位的抗體很容易檢測重組蛋白質。
下面闡述質粒構建策略使用兩種引物由PCR構建編碼Ckβ-13的DNA序列，ATTC#97113，5』引物序列為5』AAAAAGCTTAACATAGGCTCGCCTACAGACT 3』(SEQ ID NO.5)，其含有一HindIII位點，後接18個起自相應於起始密碼子-3位的Ckβ-13編碼序列的核苷酸；3』序列為5』CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTGGCTCAGCTTATTGAGAAT 3』(SEQ ID NO.6)，其含有互補於XbaI位點，轉譯終止密碼子、HA標記及Ckβ-13編碼序列的最後21個核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。因此PCR產物含有一HindIII位點，Ckβ-13編碼序列，後接框內融合的HA標記，HA標記後的轉譯終止密碼子及XbaI位點。將PCR擴增的DNA片段和載體，pcDNAI/Amp，用HindIII和XabI限制性酶消化並連接。用連接混合物轉化E.coli菌體SURE(得自Strategene CloningSystems，La Jolla，CA 92037)，在氨苄青黴素培養平板上培養轉化的培養物並篩選抗性克隆。從轉化子中分離出質粒DNA並用限制性分析檢測正確的片段的存在。為表達重組Ckβ-13，將COS細胞通過DEAE-DEXTRAN方法用表達載體轉染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringLaboratory Press，(1987)。用放射標記和免疫沉澱法檢測Ckβ-13HA蛋白的表達(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)。轉染二天後，將細胞用35S-半胱氨酸標記8小時。然後收集培養物培養基，用去汙劑(RIPA緩衝液(150mM氯化鈉，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))將細胞裂解，將細胞裂解物和培養基用HA特異性單克隆抗體沉澱。將沉澱的蛋白質用SDS-PAGE分析。
實施例3 利用杆狀病毒表達系統克隆和表達Ckβ-13利用PCR寡核苷酸引物擴增編碼全長Ckβ-13蛋白質的DNA序列，ATCC#97113，所說引物相應於該基因的5』和3』序列Ckβ-135』引物具有序列5′AAAGGATCCGCCACCATGGCTCGCCTACAGACT3′(SEQ ID NO7)，包含BamHI限制位點(粗體)，後接類似真核細胞中起始翻譯的有效信號的6個核苷酸(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))，以及Ckβ-13基因的頭18個核苷酸(翻譯起始密碼子「ATG」以下劃線示出)。
3』引物具有序列5′AAAGGTACCCCTCATTGGCTCAGCTTATT3』(SEQ ID NO8)，包含限制性內切酶Asp718的切割位點和互補於Ckβ-13基因3』-非翻譯序列的18個核苷酸。用市售試劑盒(「Geneclean」BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴增的序列。然後將所說的片段用核酸內切酶BamHI和Asp718消化，並在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段指定為F2。
載體pRG1(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)用於表達Ckβ-13蛋白質，這種表達使用杆狀病毒表達系統(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養方法手冊，德克薩斯農業的試驗站公報1555)。這種表達載體包含苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強多角體蛋白啟動子，其後面是限制性核酸內切酶BamHI和Asp718的識別位點。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用於有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子同樣的方向插入，其後是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側是用於細胞介導的共轉染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列。可以用很多其它的杆狀病毒載體代替pRG1，所說的載體如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學，17031-39)。
用限制酶BamHI和Asp718消化所說的質粒，並用本領域已知的方法利用小牛腸磷酸酶使質粒去磷酸化。然後用市售試劑盒(「Geneclean」，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA命名為V2。
用T4 DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質粒V2。然後轉化大腸桿菌HB101細胞並利用限制酶BamHI和Asp718鑑別含有帶Ckβ-13基因的質粒(pBac Ckβ-13)的細菌。通過DNA測序確認所克隆的片段的序列。
用脂轉染法(Felgner等，美國科學院學報，847413-7417(1987))將5μg質粒pBac Ckβ-13與1.0tg市售的線性杆狀病毒(「BaculoGoldTM杆狀病毒DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質粒pBac Ckβ-13在含有50微升無血清Grace’s培養基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉染試劑和90微升Grace’s的培養基後，混合併於室溫下培養15分鐘。然後將轉染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL1711)中，所說細胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養基的35mm組織培養平板上。來回搖動平板以混合新添加的溶液。然後將平板在27℃下培養5小時。5小時後，從平板除去轉染溶液，添加1毫升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續培養4天。
4天後，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。一點改變是使用具有「Blue Gal」的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易於分離染藍的噬斑(「噬斑測定」的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發布的昆蟲細胞培養和杆狀病毒學用戶指南9-10頁中找到)。
四天後，將系列稀釋的病毒添加到細胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然後將包含重組病毒的瓊脂懸浮於包含200微升Grace’s培養基的Eppendcrf管中。經簡短離心除去瓊脂，將包含重組杆狀病毒的上清液用於感染接種到35毫米培養皿中的Sf9細胞。4天後，收穫這些培養皿中的上清液，於4℃貯存。
使Sf9細胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace』培養基中生長。在感染複數(MOI)2下用重組杆狀病毒V-Ckβ-13感染細胞。6小時後，除去培養基，用SF900II培養基(減去甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時後，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經離心收穫之前，將細胞進一步培養16小時，標記蛋白質經SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實施例4 通過基因治療的表達成纖維細胞得自皮膚活組織檢查的材料，將所得組織置入組織培養物培養基並分成小片。將小體積組織放在組織培養瓶的溼表面上，在每瓶中放置大約10片組織。將瓶倒轉，密封並在室溫下過夜。在室溫下24小時後，將瓶顛倒，組織仍固定在瓶底，加入新鮮培養基(如含有10％FBS、青黴素及鏈黴素的Ham」S F12培養基)。然後在37℃溫育大約一周。此時加入新鮮培養基，每幾天換一次。又培養兩周後，成纖維細胞的單層形成。將該單層胰蛋白酶化並量入較大的燒瓶。
將兩側具有Moloney鼠肉瘤病毒的長末端重複序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.，DNA，7219-25(1988))用EcoRI及HindIII消化，隨後用牛腸磷酸酶處理。用玻璃珠在瓊脂糖凝膠中將線性載體分離並純化。
編碼本發明多肽的cDNA用分別對應於5』和3』末端序列的PCR引物擴增。5』引物包括一EcoRI位點而3』引物還包括一個HindIII位點。將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性骨架及擴增的EcoRI和HindIII片段在T4 DNA連接酶的存在下加到一起。在使兩片段連接的合適條件下保持所得混合物。該連接混合物用於轉化細菌HB101，然後將其在含卡那黴素的瓊脂上鋪板用以確定載體具有正確插入的感興趣的基因。
兼嗜性pA 317或Gp+am12包裝細胞在含10％牛血清(CS)、青黴素和鏈黴素的Dvlbecco’s改良的Eagles培養基(DMEM)中組織培養生長至鋪滿密度。然後將含基因的MSV載體加入培養基並用MSV載體轉導包裝細胞。包裝細胞現能生產含基因的感染性病毒顆粒(現將包裝細胞稱為生產者細胞)。
將新鮮培養基加入轉導的生產者細胞，隨後自鋪滿的生產者細胞的10cm平板中收集培養基。將含感染性病毒顆粒的失效培養基經微孔濾膜過濾以除去脫落的生產者細胞，然後該培養基用於感染成纖維細胞。自成纖維細胞的一個亞鋪滿平板中除去培養基並迅速用取自生產者細胞的培養基代替。除去該培養基並替以新鮮培養基。如果病毒的滴度較高，則所有成纖維細胞都被感染且不需篩選。如果病毒的滴度很低，則需要使用具有選擇標記如neo或his的反轉錄病毒載體。
隨後將工程化的成纖維細胞注射入宿主，或者將將工程化的成纖維細胞在cytodex 3微載體珠上培養至鋪滿後再注射入宿主。現在成纖維細胞可以生產蛋白質產物。
依據上述教導對本發明可做各種修改及變動，因此在權利要求範圍內本發明可以與具體描述的不同方法實施。
序列表(1)一般信息(i)申請人LI，ET AL.(ii)發明名稱人趨化因子β-13(iii)序列數8(iv)聯繫地址(A)聯繫人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWARTOLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)郵編07068(v)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5寸軟盤(B)計算機IBM PS/2(C)作業系統MS-DOS(D)軟體WORD PERFECT 5.1(vi)本申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請號(B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)註冊號36，134(C)案號/文檔號325800-(ix)通訊信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度282個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGCTCGCC TACAGACTGC ACTCCTGGTT GTCCTCGTCC TCCTTGCTGT GGCGCTTCAA60GCAACTGAGG CAGGCCCCTA CGGCGCCAAC ATGGAAGACA GCGTCTGCTG CCGTGATTAC 120GTCCGTCACC GTCTGCCCCT GCGCGTGGTG AAACACTTCT ACTGGACCTC AGACTCCTGC 180CCGAGGCCTG GCGTGGTGTT GCTAACCTTC AGGGATAAGG AGATCTGTGC CGATCCCAGA 240GTGCCCTGGG TGAAGATGAT TCTCAATAAG CTGAGCCAAT GA 282(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度93胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Arg Leu Gln Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu-25 -20 -15Ala Val Ala Leu Gln Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn-10 -5 1Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu5 10 15Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser Cys20 25 30Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu Ile35 40 45Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu Asn Lys50 55 60Leu Ser Gln65(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCGCATGCC CAACATGGAA GACAG 25(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4AAAGGATCCT TGGCTCAGCT TATTGAG 27(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AAAAAGCTTA ACATAGGCTC GCCTACAGAC T31(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度60個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT TGGCTCAGCT TATTGAGAAT 60(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7AAAGGATCCG CCACCATGGC TCGCCTACAG ACT 33(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8AAAGGTACCTC ATTGGCTCAG CTTATT 2權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的成員(a)編碼包括SEQ ID NO2所示的-28位胺基酸至65位胺基酸的多肽的多核苷酸；(b)編碼包括SEQ ID NO2所示的1位胺基酸至65位胺基酸的多肽的多核苷酸；(c)能與(a)或(b)的多核苷酸雜交且與其有至少70％相同性的多核苷酸；(d)(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO2的-28位胺基酸至65位胺基酸的多肽。
4.權利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO2的1位胺基酸至65位胺基酸的多肽。
5.一種分離的多核苷酸，包括選自如下一組的成員(a)編碼具有由ATCC保藏號97113所含的DNA表達的胺基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)能與(a)所述多核苷酸雜交且與其至少有70％相同性的多核苷酸；(c)(a)或(b)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
6.一種含有權利要求2的DNA的載體。
7.用權利要求6的載體基因工程化的宿主細胞。
8.一種生產多肽的方法，包括用權利要求7的宿主細胞表達由所述DNA編碼的多肽。
9.一種生產能表達多肽的細胞的方法，包括用權利要求6的載體對細胞進行基因工程化。
10.一種多肽，選自如下一組(i)具有SEQ ID NO2的推導的胺基酸序列的多肽及其片段、類似物及衍生物；以及(ii)由ATCC保藏號97113的cDNA編碼的多肽及所述多肽的片段、類似物及衍生物。
11.一種模擬權利要求10的多肽的活性的化合物。
12.一種拮抗權利要求10的多肽的活性的化合物。
13.一種權利要求10的多肽的抗體，包括選自單克隆抗體和多克隆抗體組成的一組的成員。
14.一種治療需要Ckβ-13的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求10的多肽。
15.權利要求13的方法，其中通過提供給患者編碼所述多肽的DNA並在體內表達所述多肽而給予治療有效量的多肽。
16.一種治療需要抑制Ckβ-13多肽的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求12的化合物。
17.一種診斷與權利要求10的多肽低表達相關的疾病或疾病的易感性的方法，包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中的突變。
18.一種診斷方法，包括分析衍生自宿主的樣品中權利要求10的多肽的存在。
19.一種鑑別作為權利要求10的多肽的激動劑有活性的化合物的方法，包括(a)在細胞應答權利要求13的多肽而正常遷移的條件下將待篩選的化合物與所述細胞接觸；(b)確定細胞遷移的程度以鑑別該化合物是否是有效的激動劑。
20.權利要求18的方法，其中將Ckβ-13多肽加到步驟(a)的結合物中，並且遷移程度的確定能鑑別化合物是有效的拮抗劑。
全文摘要
本發明公開了人趨化因子多肽和編碼這種趨化因子多肽的DNA(RNA),以及通過重組技術生產這種多肽的方法。還公開了利用該趨化因子多肽用於治療白血病、腫瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纖維化疾病、傷口癒合及銀屑病的方法,以及抗此趨化因子多肽的拮抗劑及其作為治療劑治療風溼性關節炎、自身免疫和慢性和急性炎症及感染性疾病、變態反應、前列腺素不依賴型發熱及骨髓功能低下的應用。還公開了用於檢測與核酸序列中的突變和多肽的改變濃度相關的疾病診斷方法,以及用於檢測編碼趨化因子多肽的多核苷酸中的突變以及檢測宿主中多肽的改變水平的診斷方法。
文檔編號C12N15/63GK1183807SQ95197843
公開日1998年6月3日 申請日期1995年6月6日 優先權日1995年6月6日
發明者李浩東, 喬治·塞貝爾 申請人:人體基因組科學有限公司, 史克比徹姆公司