無標記的生物傳感器和細胞的製作方法

2023-07-20 04:01:01

專利名稱：無標記的生物傳感器和細胞的製作方法
無標記的生物傳感器和細胞
I. 相關申請的交叉參考
本申請要求2005年4月5日提交的美國臨時申請系列號60/668,908、標 題為"無標記的生物傳感器和細胞"的優先權，並將其納入作為參考。
II. 背景
最終會為市場帶來新藥的藥物研究和開發過程是一個複雜和費用很大的 過程。此外，藥物開發的最初階段利用親和結合檢測，此檢測通常在體外進行， 提供有限的潛在藥物化合物對感興趣靶標產生作用的能力的信息。許多這樣的 潛在前導物在基於細胞的檢測或臨床前/臨床實驗中的基於動物模型有效性的 檢測中都以失敗告終，導致高的損耗率。最近，包括高含量篩選技術在內的創 新的細胞基技術已在藥物和生物技術工業普及。這些檢測技術為靶標-化合物 相互作用的細胞結果提供了功能性的、動力學方面的細胞基信息。所獲得的數 據包括信號傳導途徑、藥物作用機制、藥效、選擇性和毒性的信息。需要使用 螢光標記或發光標記以進行基於圖象的檢測的大多數現有細胞基技術通常著 重於評估離散的胞內事件(如Ca2+流、c細P產生和積累、靶標遷移、報導子 基因產生等)。由於細胞功能的複雜性，細胞響應通常產生自多種信號的集合， 因此基於給定的單細胞響應或信號的檢測技術往往無法產生針對藥物刺激的 全部綜合細胞應答的信息。標記物的使用、或者人工增強行為的採用(如轉染 或RNAi剔除)或報導子基因系統的使用可產生一種不同的闡明感興趣靶標的 真實細胞生理學的途徑。基於這些原因，仍需要能夠檢測分子對活細胞的影響， 如檢測分子是否影響到特定的信號途徑，如G蛋白偶聯的受體(GPCR)或表皮 生長因子受體(EGFR)，或分子是否引起細胞增殖，或引起細胞死亡或停止生 長。無標記或非標記依賴性檢測(LID)生物傳感器的使用是有利的，因為該 生物傳感器滿足了通常很複雜的標記策略和檢測機制的需求。無標記生物傳感 器對於高通量方法而言更為便利。所公開的是使用無標記生物傳感器進行任何 類型的細胞檢測的方法和系統，包括檢測信號傳導途徑和細胞增殖和死亡。ni.概要—-
本發明公開了涉及無標記的生物傳感器和它們在細胞方面的用途的方法 和組合物。
iv.


納入本文並構成本說明書一部分的附圖闡述了幾個實施例，並與說明書一 起闡述了所公開的組合物和方法。
圖1顯示肝細胞粘附在傳感器表面後光學波導光柵(0WG)微板的一個具 體檢測方案的例子。圖象顯示採用陣列式角度(arrayed angular)訊問系統 獲得的細胞培養獲得 95%細胞覆蓋率後5行(7個/行)傳感器的共振帶圖象。 該陣列式角度訊問系統由用於產生光束陣列、使各光束照射OWG傳感器的發射 系統和用於接收從這些傳感器反射的光束所產生的所有響應的接收系統。此系 統允許同時測量多個系統中貼壁細胞的響應。此實施例是5X7，但可使用6X7、 或7X7，或者任何與該光產生和接收系統相適應的配置。這些測量值可以實時 獲取，時間解析度例如是 3秒。不連續的環表示，如光顯微鏡圖象所證實的， 細胞密度在此傳感器上不是一致的。
圖2a顯示用於細胞檢測的基於細胞貼壁層內刺激誘導的定向物質再分布 的光學生物傳感器。所示的實施例是一種光學波導光柵傳感器，由位於折射率 nA=l. 50的玻璃基底之上的高折射率(nF=2. 36)、厚度為dF (75mm)的Nb205 薄膜，位于波導管薄膜之上的總折射率nA=1.37的細胞貼壁層，以及折射率 為 1.33 (nC)的周圍介質構成。該OWG生物傳感器是一種攸逝波傳感器，以 光通過衍射光柵諧振耦合到波導之中為基礎。雷射以各種角度照射該波導，光 僅在特定角度耦合到波導中，取決於導向模式的有效折射率(N)。配體誘導 的耙標激活導致與靶標相互作用的組分向該靶標集合、所產生的靶標複合物的 移動、以及潛在的細胞骨架結構的重構(即形態學變化)。當這些移動或變化 發生在非常靠近OWG傳感器表面的邊緣時(細胞在在該表面上培養)，在某個 時間就會產生DMR信號(如箭頭所指)，可對此信號進行實時監控。細胞貼壁 層內配體誘導的定向物質再分布導致有效折射率的改變，這又會使出耦合的光 (out-coupled light)發生角度偏移。圖2b顯示檢測傳感體積範圍內的刺激 介導的縱向物質再分布的三層構型。細胞底部被表示為由多個相同間隔和均質 的薄層組成，各層各自的折射率為ni，蛋白質濃度為Ci，距離為Zi (與傳感器表面之間的距離)。周期為A的光柵嵌埋在折射率為nF、厚度為dF的波導 膜中。波導膜放置在折射率為ns的基底是上表面上。
圖3顯示作為刺激介導的細胞內容物的不對稱橫向再分布的函數的相變。 在平面波導中傳播的被導光顯示為Z字形的波。傳感體積範圍內不均勻的橫向 物質分布導致給定模式的共振峰的擴大，甚至分裂。
圖4顯示作為與傳感器表面之間的距離的函數的傳感器一導向模式的攸逝 波的強度。
圖5顯示0WG傳感器的另一種對稱性。這種所謂的反對稱波導管構型由波 導膜(如Nb2(U構成，該膜由通常為1一100微米厚的納米孔二氧化矽(有或 沒有玻璃底部支持)支持。該納米孔二氧化矽的有效折射率為 1. 1，它的折 射率低於覆蓋介質的折射率，該覆蓋介質通常是用於本發明的水溶液。
圖6顯示一些參數，基於這些參數可使用OWG生物傳感器進行細胞檢測。 圖6A顯示的是示範性的用8nM EGF誘導的 95%覆蓋率的靜息態A431細胞貼 壁層的時間依賴性響應，採用角度訊問系統獲得。如圖6A所示，可定義細胞 內刺激誘導的定向物質再分布的動力學的6個參數是1)總動態特徵(即形 狀)；2)響應階段(如，在此具體實施例中有三個階段正向物質再分布(P-DMR)、 淨零定向物質再分布(net — zero DMR)和逆向物質再分布(N-DMR) ) ; 3) 各階段的動力學；4) P-DMR階段和N-DMR階段兩者的總持續時間；5) P-DMR 階段和N-DMR階段兩者的總振幅；和6) P-DMR階段到N-DMR階段的過渡時間 t 。圖6B顯示 90%覆蓋率的示範性A431細胞的典型的共振峰，採用TM。模
式獲得，該圖闡述了以下另4個參數7)峰位置；8)強度；9)形狀；和IO)
最大值一半的寬度(PW服)。圖6C顯示在示範性A431細胞在其上培養到覆蓋 率 95%的傳感器貼的典型的TM。共振帶圖象。使用陣列式角度訊問系統獲得
這些數據，它們闡述了另5個特徵11)帶的形狀；12)位置；13)強度；14) 分布；和15)寬度。所有這些參數可獨立或一起用於使用本文所揭示的傳感器 的任何細胞檢測的任何給定應用中。可用這些參數的亞組合或組合來為一特定
檢測或特定檢測的特定變化提供一特徵，例如細胞受體實驗特徵，如基於EGF 受體的實驗的特徵。
圖7顯示EGF誘導的靜息態A431細胞的劑量依賴性響應。(A)並行採用 我們的系統獲得的不同濃度EGF誘導的細胞響應的實時動力學。EGF的最終濃 度顯示在圖中。(B)基於圖7A所示的過渡階段和終了階段之間的差異而計算
22得到的N-DMR信號的振幅，它是EGF濃度的函數。獲得了典型的飽和曲線。(C) 從P-DMR到N-DMR時間的過渡時間t ,它是EGF濃度的函數。(D)採用非線 性回歸獲得的N-DMR事件的k值，它是EGF濃度的函數。
圖8顯示一種基於定向物質再分布的篩選和歸類針對特定靶標或信號途徑 的化合物的方法。在此圖中，標記物可以是特定靶標或信號途徑或細胞功能的 活化劑或滅活劑，它導致或阻止定向物質再分布或信號。虛箭頭指示兩個步驟 可以互換，或組合在一起。步驟804和806可以視為是本文所討論的一種刺激 事件。
圖9顯示具有各種典型組分的生物細胞的示意性圖。該細胞由含有大量細 胞器官的細胞質(通常10 — 30pM)構成。最大的細胞器官是細胞核，其大小通 常為3—10iira。細胞核裡有蛋白質，最重要的蛋白質是染色質。線粒體是小細 胞器，它含有一系列的摺疊的膜，大小通常為0.5 — 1.5pm。其它細胞組分包括 內質網(ER)(通常為0. 1 —lfim)、溶酶體(lysome)(通常為0. 2-0. 5|im)、 過氧物酶體(通常為0.2-0. 5km)，和內含體(通常 100nm)。
圖10顯示顯示了光學LID系統的圖，該系統用於根據本文所公開的方法 和系統監控活細胞中的物質再分布(如GPCR遷移)。
圖11顯示分別具有不同的穿透深度100、 200和300nm的三種類型的傳 感器的攸逝場(即相對響應)，它作為與生物靶標與傳感器表面的距離的函數。 這證明了不同穿透深度對細胞傳感的重要性，尤其對於探測細胞內的移動或 DMR事件。
圖12顯示一種基於定向物質再分布而鑑定和評估靶標的方法。注意(1)
在此種情況中標記物是具體靶標的活化劑或滅活劑，它能導致或阻止定向物質 再分布事件或信號；(2)所獲得的響應可用於鑑別具體細胞中的靶標水平，
或評估具體信號途徑或給定的疾病細胞類型中的靶標；和(3) 1206可視為是 本文所公開的一種刺激事件。
圖13顯示基於定向物質再分布鑑別和評估靶標的另一種方法。注意(1)
在此種情況中標記物是具體靶標的活化劑或滅活劑，它能導致或阻止定向物質 再分布事件或信號；(2)所獲得的響應可用於鑑別具體細胞中的靶標水平， 或評估具體信號途徑或給定的疾病細胞類型中的靶標；和(3) 1304和1304兩 者都可視為是本文所公開的一種刺激事件。
圖14顯示可用於例如圖13所述的另一種方法中的光學LID生物傳感器微板。這種特定的微板是一種多區室平板，在各孔中有嵌埋有光學生物敏感器的
多區室。在此96孔微板中，各孔含有4個區室，各區室嵌埋有一個波導光柵 基片，可用於容納一個類型的細胞或感興趣的靶標。四個區室被內壁分開，內 壁的高度(優選100微米到2毫米)要比各孔的高度(通常是給定微板的高度) 低得多，不論各區室的不同靶標是什麼，具有4個區室的各孔可用於同時檢測 一種藥物候選物對多個靶標或多種細胞類型的作用。灰色的線條表示基于波導 光柵的生物傳感器。
圖15顯示基於定向物質再分布鑑別和評估靶標的另一種方法。注意(1)
在此種情況中標記物是具體靶標的活化劑或滅活劑，它能導致或阻止定向物質 再分布事件或信號；(2)所獲得的響應可用於鑑別具體細胞中的耙標水平，
或評估具體信號途徑或給定的疾病細胞類型中的靶標；和(3) 1503、 1504、 1508和1509都可視為是本文所公開的一種刺激事件。
圖16是顯示與刺激事件導致的細胞調節相關的不同狀態的圖，所示細胞 調節例如是可通過分析光學LID系統(如圖10所示的系統)的時間依賴性光 學響應輸出來鑑別的生物細胞中的GPCR遷移。
圖17顯示闡述實時監控刺激事件的方法的基本步驟的流程圖，所述事件 例如是使用本文所述的光學LID生物傳感器獲得的激動劑誘導的細胞受體的物 質再分布，包括活細胞內的GPCR遷移。1706和1708可以視為是本文所述的一 種剌激事件。
圖18顯示基於定向物質再分布的鑑別靶標的一個例子。注意(1)此圖 所示的實施例是癌細胞系A431的EGF-誘導的DMR響應與另一細胞系CH0之間 的比較。(2)在如圖中所示的三種不同條件下培養的 95%覆蓋率的A431細 胞貼壁層的EGF-誘導的DMR響應與在0. 1X胎牛血清(FBS)培養了 20小時的 95%覆蓋率的中國倉鼠卵巢細胞貼壁層的EGF-誘導的DMR響應比較。在加入 50[U 4x的EGF溶液(32nM)之前，用25^1的正規Hanks平衡鹽溶液(HBSS) 處理被100|il培養基覆蓋的細胞至少2次，間隔15分鐘，這樣細胞達到一種 穩定的狀態，表現為長時間的net-zero響應。(3)刺激事件是導致定向物質 再分布事件或信號的特定靶標(EGFR)的活化劑(如同源配體，EGF)。和(4) A431細胞內源性地過表達表皮生長因子受體(EGFR)(每個細胞 1700000拷 貝)。相反，CHO細胞不內源性地表達EGFR。 1801表示CH0細胞的輸出數據。 1802表示在0. 1%胎牛血清(FCS)培養20小時的A431的輸出數據。1803表示10%FCS中的A431細胞的輸出數據。1804表示在0. 1%FCS中培養4小時的A431的輸出數據。
圖19是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基於活細胞內的物質再分布來篩選針對靶標(如GPCR)的剌激事件(如激動劑事件)的方法的基本步驟的流程圖。
圖20是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基於活細胞內的物質再分布來篩選針對細胞耙標，如受體，如GPCR的刺激事件(如拮抗劑事件)的方法的基本步驟的流程圖。2006和2008可視為是本文公開的刺激事件。
圖21是闡述產生可用於本文所述的任一方法的自參考(self--referencing)光學LID生物傳感器的方法的基本步驟的流程圖。
圖22是闡述產生自參考光學LID生物傳感器的另一種方法的基本步驟的流程圖，該自參考光學LID生物傳感器在同一傳感器的空間上分開的區域中容納兩種細胞類型的貼壁層，該方法可用於本文所述的任一種方法中。2212可以視為是本文所公開的剌激事件。
圖23是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基於多種類型的活細胞內的物質再分布來篩選刺激事件(如激動劑誘導的受體活動，所述受體例如GPCR)的方法的基本步驟的流程圖。2306和2308可視為是本文公開的刺激事件。
圖24是闡述使用本文所述的光學LID生物傳感器基於物質再分布來篩選一系列化合物(如特定受體的潛在激動劑或拮抗劑，所述受體例如一個類型活細胞中的多種GPCR)的方法的基本步驟的流程圖。2406和2408可視為刺激事件。
圖25顯示顯示篩選幹擾細胞骨架結構的調節劑的方法。2506、2508和2510
可以視為是刺激事件。
圖26顯示篩選幹擾膽固醇外溢的調節劑的方法的一個例子。2606、 2608和2610可以視為是刺激事件。
圖27是顯示體內脂質信號傳遞和通信的示意圖。
圖28 (A)顯示甲基-p-環糊精(mpCD)對LID傳感器上靜息態A431細胞和Hela細胞貼壁層的時間依賴性響應。圖28 (B)顯示化合物(20nM EGF或1000nMH7)對m(3CD誘導的靜息態A431細胞響應的作用。在加入mpCD溶液之前預先用相應的化合物處理該靜息態A431細胞至少40分鐘。
25圖29顯示粘附在波導生物傳感器上CH0細胞層的DMS0誘導的劑量響應和 時間依賴性響應。在20XDMS0，觀察到4個事件(A)由於DMSO溶液剛加入 之後指數明顯變化而產生的大的響應信號；(B)可能由於兩種液體在孔中混 合而產生的小的減弱的信號；(C)可能由於DMSO滲入並替代細胞內的生物液 體而導致的緩慢而穩定的增強的信號；和(D)由於高濃度DMSO的毒性引起的 細胞蛋白質或其它生物分子的損失而導致的長時間的減弱的信號。
圖30顯示粘附在波導生物傳感器上的A431細胞層的DMSO誘導的劑量響 應和時間依賴性響應。所觀察到的響應與在CHO細胞層上觀察到的類似。
圖31A顯示培養於他205光學波導生物傳感器上具有不同覆蓋率(30%、 50%和90%)的CHO細胞層的入射耦合光的強度，它是入射角的函數。耦合模 式是橫向磁場(TM。)模式。圖31B:使用TM。模式計算了半最大值峰寬，並作 為CHO細胞覆蓋率的函數作圖。
圖32A和32B顯示培養在波導光柵傳感器上覆蓋率分別為5%和75%的CHO 細胞層的TM。模式共振峰。圖32B:加入DMSO (最終濃度為18%)後不同時間 記錄的共振峰譜。右圖中的虛箭頭顯示DMSO處理後25分鐘峰變寬並開裂。
圖33顯示全部傳感器的TM。模式共振帶圖象，其中各傳感器覆蓋有不同覆 蓋率的CHO細胞層(如圖中所示)。所示圖象為用緩衝液(第2欄)和18% DMSO (第l欄)處理25分鐘後獲取。
圖34顯示全部傳感器的TM。模式共振帶圖象，其中各傳感器覆蓋有相同覆 蓋率( 95% )的CHO細胞層。該圖象在用緩衝液(第2欄)和不同濃度的腿SO (第1、 3欄，如圖所示)處理25分鐘後獲取。環表示 15%的DMSO對CHO 細胞的毒性所誘導的峰分裂。
圖35A和35B顯示培養在波導光柵傳感器區域上和該區域之外的CHO細胞 的相襯度成像(phase contrast image)。
圖36A顯示CH0細胞(培養在恥205光學波導生物傳感器36小時)的TM0 模式的入射耦合光(incoupled light)的強度，它是入射角的函數。初始接 種的細胞數量不同，用以研究CH0細胞的增殖速率。耦合模式是橫向磁場(TMo) 模式。圖36B顯示使用TM。模式計算得到的半最大值的峰寬，並將其繪製成CHO 最初接種數量的函數。
圖37顯示波導管光柵生物傳感器上，不同最初細胞接種數量，CH0細胞增 殖的監測。觀察到全部傳感器TM。模式共振圖象的形狀和位置是最初接種細胞數量依賴性的，表明CHO細胞的增殖速率依賴於最初接種的細胞數量。
圖38顯示錶皮生長因子受體(EGFR)信號途徑。酪氨酸激酶的表皮生長 因子(EGF)受體家族由四種受體組成RGF-R (ErbBl) 、 ErbB2 (Neu) 、 ErbB3 和ErbB4。 EGFR家族的成員包括細胞質酪氨酸激酶結構域、單一跨膜結構域、 和涉及配體結合和受體二聚作用的胞外結構域。配體與EGFR的結合導致該受 體與其它家族成員形成同型二聚體或異型二聚體。各二聚體受體複合物將通過 召集不同的含Src同源物2 (SH2)效應蛋白來啟動不同的信號途徑。二聚體化 導致自磷酸化，從而啟動不同的一系列的下遊細胞信號途徑。活化的EGF-R二 聚體複合物與銜接蛋白質Grb (偶聯於鳥嘌呤核苷酸釋放因子S0S)複合。該 Grb-S0S複合物可直接結合到受體中的磷酸化的酪氨酸位點或通過She間接結 合。這些蛋白質相互作用使SOS非常接近Ras，使得Ras被活化。這然後活化 ERK和JNK途徑，繼而活化促進基因表達和細胞增殖的轉錄因子如c-fos、 AP-1 和Elk-l。 EGF^表皮生長因子；EGFR二表皮生長因子受體；Shc = src同源結 構域共有序列；grb2二生長因子受體結合的蛋白2; S0S二哺乳動物"無七之子" (mammalian son of sevenless) ; Raf = Ras活化的因子；MEK=MAP激酶激 酶；MAPK二有絲分裂原活化的蛋白激酶；PI3K二磷脂醯肌醇3，激酶；PIP2 = 磷脂醯肌醇3，4-二磷酸；PIP3二磷脂醯肌醇3,4,5-三磷酸；PIOy二磷脂酶-Y; DAC^二醯基甘油；IP3二肌醇3，4,5-三磷酸；PKC二蛋白質激酶C。
圖39顯示，與靜息態CHO細胞(以CH0表示)相比，EGF-誘導的增殖(以 A431表示)和靜息態A431 (以A431-S表示)的P — DMR和N-DMR淨響應。
圖40顯示用不同化合物對飢餓的A431細胞層進行30分鐘的預處理對加 入16nMEGF後的時間依賴性響應的作用。化合物的最終濃度為生長激素(GH) 0. 5pg/ml、 PD 98059 0. lraM、 PP1 l(iM、渥曼青黴素0. ljxM和發動蛋白抑制肽 (DIP) 50pM。
圖41顯示培養在波導生物傳感器上的飢餓A431細胞層應答16nM EGF剌 激的P-D服和N-DMR淨響應。
圖42顯示AG1478誘導的靜息態A431細胞的EGF-誘導應答的劑量依賴性 抑制。(A)不同濃度的AG1478預處理靜息態A431細胞導致32nM EGF誘導的 響應出現劑量依賴性改變。(B) N-D服信號的振幅與AG1478濃度相關。
圖43顯示Src激酶抑制劑PP1對EGF-誘導的A431細胞的DMR響應的作用。
圖44顯示Ras/MAPK途徑調節物對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。
27圖45顯示蛋白激酶抑制劑對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。 圖46顯示細胞骨架調節物對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的作用。 圖47顯示磷酸二酯酶和其它抑制劑對32nM EGF-誘導的A431細胞響應的 作用。
圖48顯示使用光學生物傳感器觀察到的EGF誘導的靜息態A431細胞全部 DMR信號的兩種主要作用物。細胞在室溫(22°C)條件下，EGF在A431中誘導 EGFR內化、細胞形態變化和定向質量再分配。(A)用8nM四甲基若丹明標記 的EGF (TMR-EGF)染色、接著用4'C酸性溶液去掉表面結合的TMR-EGF之後得 到的增殖A431 (10%FBS)的螢光圖象。(B)用TMR-EGF染色後的靜息態A431 (0. 1XFBS)的螢光圖象。(C)染色並用4。C酸性溶液除去表面結合的TMR-EGF 之後的靜息態A431 (0. 1%FBS)的螢光圖象。(D)使用放大倍數為32倍的熒 光顯微鏡檢測(固定和用德克薩斯紅標記的鬼筆環肽染色後)經16nM EGF處 理指定時間的靜息態A431細胞。
圖49顯示EGF誘導的DMR信號的一種可能機制-受體內吞作用的示意圖。
圖50顯示加入皂苷之前和之後粘附在LID傳感器表面上中國倉鼠細胞 (CHO)的劑量依賴性響應。
圖51顯示用不同化合物預處理、接著用皂苷處理之後CHO細胞的實時響應。
圖52顯示加入化合物之前和之後中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的時間依賴性 LID響應。
圖53顯示激動劑誘導的GPCR活化導致的物質再分布的不同動力學特徵。 圖54顯示圖16所示的階段3中激動劑誘導的質量變化的化合物依賴性總 響應。
圖55顯示化合物加入之前和之後中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的時間依賴性 LID響應。所有化合物的使用濃度是lOpM。
圖56顯示化合物加入之前和之後過表達大鼠毒蕈鹼性受體亞型l(因此將 該細胞系稱為Ml CHO)的經遺傳改造的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的時間依賴 性LID響應。
圖57比較了圖16所示兩種不同細胞系的階段3的化合物依賴性同響應。 圖58顯示加入氧化震顫素M (oxotremorine M) (IO幽)之前和之後兩種 類型的細胞(CHO和Ml CHO)的時間依賴性LID響應。加入化合物之前，用冊SS
28緩衝液(Invitrogen)("無DIP")或濃度為50|iM的發動蛋白抑制肽(DIP) 預先培育細胞45分鐘。
圖59顯示加入可樂定(IO剛)之前和之後兩種類型的細胞(CHO和Ml CHO) 的時間依賴性LID響應。加入化合物之前，用HBSS緩衝液(Invitrogen)("無 DIP")或濃度為5(^iM的發動蛋白灘制肽(DIP)預先培育細胞45分鐘。
圖60顯示加入NECA (IO幽)之前和之後兩種類型的細胞(CHO和Ml CHO) 的時間依賴性LID響應。加入化合物之前，用HBSS緩衝液(Invitrogen)("無 DIP")或濃度為50pM的發動蛋白抑制肽(DIP)預先培育細胞45分鐘。
圖61顯示靜息態A431細胞貼壁層內GPCR激動劑誘導的定向物質再分布。 與EGF (8nM)誘導的相比，三種GPCR激動劑緩激肽UOOnM)、卡巴膽鹼(10 幽)和可樂定(1幽)誘導了靜息態A431細胞的時間依賴性響應。(F) IO^iM AG1478預處理對GPCR激動劑和EGF誘導的響應的影響。
圖62是顯示EGF誘導的EGFR活化機制和G蛋白偶聯的受體(GPCR)激動 劑誘導的EFGR轉激活的一種可能機制。GPCR激動劑誘導的EGFR轉激活還可通 過其它機制實現例如蛋白激酶C途徑，或PI3K途徑。圖61所示的靜息態A431 細胞的緩激肽誘導的DMR響應可通過蛋白激酶C途徑實現。
圖63顯示GPCR激動劑誘導的四類光學特徵。據使用共振波導光柵生物傳 感器實時監測，該光學特徵與靜息態A431細胞下部的動態物質再分布相關。
(a) Gq型DMR特徵，以凝血酶誘導的為例(40單位/ml) 。 (b) Gs型D服特 徵，以腎上腺素誘導的為例(25nM) 。 (c) Gi型DMR特徵，以a—MSH (oc— 黑素細胞刺激激素)誘導的為例(40nM) 。 (d)淨-零D服特徵，以神經降壓 肽誘導的為例(40nM)。實心箭頭(其餘圖中亦然)表示加入激動劑溶液的時 間。
圖64顯示腺苷酸環化酶活化劑毛喉素和NKH447誘導的靜息態A431細胞 的光學特徵。
圖65顯示用毛喉素和NKH447預處理靜息態A431細胞完全消除了 25nM腎 上腺素介導的DMR響應。純HBSS預處理用作陽性對照。
圖66顯示啟動Gq型特徵的激動劑的有效性。分別為ATP (a、b)、 SLIGLR-醯胺(c、 d)、凝血酶(e、 f)和SLIGKV-醯胺(g、 h)作劑量依賴性動力學 響應和相應的飽和曲線。最終的濃度顯示在圖中。
圖67顯示啟動Gs型信號的激動劑的有效性。分別為腎上腺素(a、 b)、腺苷胺類(adenosine amine cogener) (c、 d)、和NECA (e、 f)作劑量依 賴性動力學響應和相應的飽和曲線。
圖68顯示a—MSH (ot—黑素細胞刺激激素)誘導的靜息態A431細胞的劑 量依賴性動力學響應和飽和曲線。
圖69顯示低劑量(a)到高劑量(b)的LPA (油醯基-L-oc-溶血磷脂酸) 誘導的光學特徵的轉變。
圖70顯示低劑量(a)到高劑量(b)的HTMT誘導的光學特徵的轉變。將 P-DMR的總振幅繪製成HTMT濃度(c)的函數，從而展示該轉變。
圖71顯示胞內Ca2+水平的最大百分比增加，繪製成PAR激動劑的函數，該 百分比增加根據採用Fluo-3測定的Ca2+的螢光強度測得。
圖72顯示細胞骨架調節物對lOOnM胰蛋白酶(a)和40單位/ml的凝血酶 (b)介導的D服信號的作用。用於預處理細胞的這些調節物包括紅海海綿素A (latrunculinA)、松胞菌素B、鬼筆環肽和諾考達唑(nocodazole)，各自 濃度為lOmM。僅用載體(即HBSS)預處理的細胞用作對照。
圖73顯示激酶抑制劑對200nm胰蛋白酶(a)和40單位/ml的凝血酶(b) 介導的DMR信號的作用。激酶抑制劑是GF109203x (lOmM)和KN-62 (10mM)。
圖74顯示YFFLNRP對凝血酶(40單位/ml) 、 SFFLR-醯胺(20mM)和SLIGKV-醯胺(20mM)介導的D服響應的作用，體現為P-DMR振幅，繪製成YFFLNRP濃 度的函數。
圖75顯示PAR介導的Ca2+信號傳遞的交叉去敏作用。胰蛋白酶在先處理 後，用凝血酶(a) 、 SFFLR-醯胺(b) 、 SLIGKV —醯胺(c)和緩激肽(d)刺 激A431細胞。另一方面，在用胰蛋白酶刺激前，先用凝血酶(e) 、 SFFLR-醯 胺(f) 、 SLIGKV —醯胺(g)和緩激肽(h)預先刺激A431細胞。凝血酶、胰 蛋白酶、SFFLR-醯胺、SLIGKV—醯胺和緩激肽的最終濃度分別為40單位/ml、 200nM、 20mM、 20mM、和100nM。兩次刺激之間的時間間隔大約是6分鐘。實心 箭頭表示加入溶液的時間(其它圖中也指同樣的意思)。
圖76顯示PAR介導的動態物質再分布信號的交叉去敏作用。胰蛋白酶在 先處理後，用凝血酶(a) 、 SFFLR-醯胺(b) 、 SLIGKV —醯胺(c)和緩激肽
(d)剌激A431細胞。另一方面，在用胰蛋白酶剌激前，先用凝血酶(e)、 SFFLR-醯胺(f) 、 SLIGKV —醯胺(g)和緩激肽(h)預先刺激A431細胞。凝 血酶、胰蛋白酶、SFFLR-醯胺、SLIGKV—醯胺和緩激肽的最終濃度分別為40
30單位/ml、 200nM、 20mM、 20mM、和100nM。兩次刺激之間的時間間隔大約是1 小時。
圖77顯示mpCD導致的膽固醇流失對40單位/ml凝血酶(a)和200nM胰 蛋白酶(b)介導的P-和N-DMR信號的振幅的作用。為了比較，圖中也包括ocCD (oc-環糊精)的作用。
圖78顯示PAR信號傳遞的功能性恢復。在用mpCD除去細胞表面的膽固醇， 並將細胞洗滌後，在各指定時間分別將凝血酶溶液加到孔中。實時記錄麗R信 號。各圖是7次獨立響應的平均值。
圖79顯示EGF在先刺激對PAR信號傳遞的影響。(a)胰蛋白酶介導的Ca2+ 活化。(b)胰蛋白酶介導的D服信號。(c)胰蛋白酶介導的DMR響應。最終 的濃度是100nMEGF、 lOOnM胰蛋白酶、和40單位/ml凝血酶。還包括僅用HBSS 預處理的細胞響應，作為對照。
圖80顯示作為時間的函數的應答lmM過氧化氫的靜息態A431細胞的多個
參數。(A)入射角的移動；(B)歸一化PWHM; (C)歸一化峰值強度；(D)
歸一化峰面積。箭頭指加入溶液時的時間。
圖81顯示加入過氧化氫之前和之後粘附在LID傳感器表面上的靜息態 A431細胞的劑量依賴性響應。
圖82顯示six抑制劑對lmM HA介導的靜息態A431細胞的D服信號的影響。
圖83顯示靜息態細胞的不同氧化還原態對4mM HA介導的DMR響應的影響。
圖84顯示靜息態A431細胞對EGF刺激的響應。(A)作為時間的函數的 入射角的動態移動。(B)作為時間函數的歸一化PWHM。 (C)未用TR-鬼筆環 肽處理的A431的肌動蛋白絲的染色模式。(D)用16nM EGF處理15分鐘、接 著用德克薩斯紅-鬼筆環肽(phalloid)染色的A431的肌動蛋白絲的染色模式。 標杆表示40mM。
圖85顯示由緩激肽通過緩激肽B2受體信號傳遞介導的靜息態A431細胞 的光學特徵TM。模式的共振峰的PWHM (A)和強度(B)。箭頭指示加入緩激 肽溶液時的時間。
圖86顯示作為化合物的函數的檢測過程中兩個時間點之間的波長改變。 這兩個時間點是恰在加入化合物之前(基線點)和加入化合物後5分鐘(測量
31點)。兩個終點之間的不同反映了緩激肽---種緩激肽B2受體激動劑介導
的P-DMR事件的總振幅。B2受體在A431細胞中內源表達。緩激肽刺激前細胞 已轉為靜息態。此實施例使用384孔Coring Epic生物傳感器平板。各孔含有 覆蓋率為 90%的A431細胞。半數孔用100nM的緩激肽處理，而另外半數孔 僅用緩衝液HBSS處理。
圖87顯示作為化合物的函數的檢測過程中兩個時間點之間的波長改變。 這兩個時間點是恰在加入化合物之前(基線點)和加入化合物後5分鐘(測量 點)。兩個終點之間的不同反映了凝血酶——一種PAR1受體激動劑介導的P-麗R 事件的總振幅。PARI受體在CHO細胞中內源表達。凝血酶刺激前在DMEM培養 基中培育細胞4小時，這些細胞部分靜息態。此實施例使用384孔Coring Epic 生物傳感器平板。各孔含有覆蓋率為 90X的CH0細胞。半數孔用40單位/ml 的凝血酶處理，而另外半數孔僅用緩衝液HBSS處理。
圖88顯示作為凝血酶濃度的函數的檢測過程中兩個時間點之間的波長改 變。這兩個時間點是恰在加入化合物之前(基線點)和加入化合物後5分鐘(測 量點)。用不同劑量的凝血酶處理CHO細胞。
V.詳細描述
在公開和描述本發明的化合物、組合物、製品、設備和/或方法之前，應 理解它們並不限於具體的方法或具體的生物技術方法，除非另有說明，或者它 們也不限於具體的試劑(除非另有說明)，因此，它們當然是可以變化的。還 應理解本文所用的術語是僅僅是為了描述具體實施例的目的，而不是為了限 定。
I.定義
在本說明書和附帶權利要求書中，單數形式"一"、"一種"和"該"包 括複數形式，除非相關的內容已明確指出不包括。因此，例如，"一種標記物 或剌激事件"包括兩種或多種這樣的標記物或刺激事件等。
在本文中，範圍可以表示為"約" 一個特定值和/或"約" 一個特定值到 "約"另一個特定值。當表示這樣一個範圍時，另一實施例包括從一個特定值 起算和/或到另一個特定值。類似地，當以近似值表示數值時，通過使用先行 詞"約"，將應理解該特定數值構成了另一實施方式。還應理解的是，各範圍
32的端點都與另一端點有明顯關聯，且不取決於另一端點。還應理解的是，本文 公開了大量的數值，各數值在本文中包括該數值本身以及用"約"限定該具體 數值的形式。例如，如果公開了數值"10"，那麼"約10"也被公開。還應理 解的是，當一數值公開為"低於或等於"該數值，則"大於或等於該數值"或 這些數值之間的可能範圍也被公開，如本領域技術人員所能適當理解的那樣。 例如，如果數值"10"公開了，那麼"低於或等於10"以及"大於或等於10"
也被公開。還應理解的是，在整篇申請中，數據以不同的形式提供，這些數據 代表了終點和起始點，以及這些數據點的任何組合的範圍。例如，如果公開了
具體的數據點"10"和"15"，那麼應理解大於、大於等於、小於、小於等於 以及等於10和15以及10和15之間的數值也應當認為己被公開。還應理解的 是，範圍之內的任何數值以及形成該範圍的數值也公開，例如，對於10到15 的範圍，則認為10、 11、 12、 13、 14鄰15都己被公開。
"任選的"或"任選地"指接下來描述的事件或情況可能或可能不發生， 說明書包括所述事件或情況發生的例子以及所述事件或情況不發生的例子。
"粘附(adhere)"和"粘附的"或者這兩個詞的其它形式指兩個物品相 互接觸，在它們之間相互具有親和力，例如粘貼。基底上的細胞貼壁層指一層 細胞，該細胞層例如粘附到該表面上，這樣當用緩衝液輕柔洗滌該細胞時，細 胞不會變成不粘附。應理解接觸(contact)或此詞的其它形式指兩種或多種 物品相互接近，以致被視為相互觸碰。接觸通常不要求粘貼。例如，在沒有粘 附的情況下也可發生接觸。連接(attach)或此詞的其它形式指兩種或多種物 品之間的一種比粘附更持久的狀態。它並非必須是例如共價連接，但可以是共 價連接。因此，根據兩種或多種物品之間的結合的所需強度，接觸低於粘附， 而粘附低於連接。應理解這些詞具有不同的含義，但除非有明確的相反說明或 本領域技術人員能清楚理解其相反含義，否則這些詞語可在本說明書中在它們 所出現的地方交替使用。例如，如果一句子包括"細胞粘附到生物傳感器"， 應理解"細胞接觸到傳感器"和"細胞連接到傳感器"也被公開。還應理解存 在多種粘附的、接觸的或理解的物品，如細胞或蛋白。
"振幅"可指特定響應的量或大小。例如，生物傳感器的輸出數據可產生 具有特定振幅如強度的共振峰。
"生物學擴散限制的"指被溶液中分子擴散，和/或分子滲透或被攝取到 細胞中並在到達靶標前在細胞內接著擴散限制的過程。例如，當含有化合物或刺激物的溶液被加到預先存在的用於覆蓋粘附在生物傳感器表面上的細胞的 培養基中時，該化合物或刺激分子不得不擴散到所產生的混合物(該培養基和 溶液)中，並花費一段時間到達該細胞。之後，根據該化合物或刺激物將與之 相互作用的靶標，該化合物或刺激分子可能不得不花費額外的時間來達到該靶 標，這取決於分子滲入細胞或被細胞所攝取。
"整體系數(bulk index)"指溶液或培養基的絕對摺射率，由該溶液或 培養基的組成決定。"整體系數變化"指當兩種混合物混合在一起、或者一種 溶液加到一種培養基或另一種溶液中並與之混合時該混合溶液的折射係數(折 射率)所產生的變化。
"導向模式"或"耦合模式"指光耦合進入波導基片的特定模式。在平面 波導中存在兩種基本類型的導波(或模式)TEm (橫向電場或s-極化)和TMm (橫向磁場或p-極化)，其中ra=0、 1、 2……，它是模式編號。由於光學波 導光柵(OWG)生物傳感器是一種攸逝波傳感器，並且是基於用衍射光柵將光 共振耦合到波導中。兩種基本模式可能有不同數量的模式，例如TM。、TM!、TM2…… 和TE。、 TE,、 TE2……。可耦合到波導基片的具體模式依賴于波導的結構和給定 模式的有效折射率，這取決於該模式的攸逝尾隨脈衝(evanescent tail)之 中的細胞材料和整體溶液的折射率來測定。
"劑量依賴性響應"通常指隨著剌激時間如化合物的加入的變化而變化的 生物傳感器輸出或生物傳感器參數的響應。
"入射耦合光"指用來照射生物傳感器從而被耦合到波導膜中的某個帶寬的光。
"無標記生物傳感器"所公開的組合物、方法和技術的許多方面都涉及 到無標記生物傳感器的使用。在本文中，無標記生物傳感器指在不需要標記物 如螢光分子的情況下可檢測和/或產生產生自細胞內的事件或變化(如物質再 分布)的信號的任何傳感器。無標記生物傳感器通常包括將細胞中的事件轉換 成可定量的信號的光學傳感器。這些信號產生可通過多種途徑實現。例如，直 接表面傳感法包括表面等離子體振子共振(SPR) (Jordan & Corn,"吸附到 化學修飾的金表面上的靜電生物聚合物的表面等離子體振子共振圖像測量" (Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces) ， Anal. Chem. ， 1997， 69:1449—1456)、光柵耦合器(Morhard等，"在微模式中固定
34抗體以通過光衍射進行細胞檢測"(Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction) ， Sensors and Actuators B， 2000， 70, 232-242)、 橢圓光度法(Jin等，"基於圖像橢圓 光度法以使生物分子相互作用可視化的生物傳感器概念"(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions) ， Analytical Biochemistry, 1995， 232， 69-72)、攸逝波 設備(Huber等，"直接光學免疫傳感(敏感性和選擇性"(Direct Optical Immunosensing (Sensitivity and Selectivity) ) ， Sensors and Actuators B， 1992， 6， 122-126)、和反射測定法(Brecht & Gauglitz，"光學探針和 傳感器，，(Optical Probes and Transducers) ， Biosensors and Bioelectronics: 1995， 10， 923-936)。通常用於訊問SPR或波導光柵傳感器的儀器使用具有 適當光譜或角度內容(angular content)的光束，這樣，當該光束被傳感表 面反射時，共振角度或波長響應成為輸出響應的主要內容。
許多無標記生物傳感器是己知的，在本文其它地方描述了它們的例子。無 標記生物傳感器的例子包括非接觸型生物傳感器、不依賴標記的檢測性生物傳 感器、無標記光學生物傳感器、光學非接觸型生物傳感器、基於光學的生物傳 感器、光學生物傳感器、不依賴標記的光學檢測性生物傳感器、基于波導光柵 的生物傳感器、光學波導光模式(lightmode)光譜學生物傳感器、攸逝波設 備。本文描述並涉及到各種無標記生物傳感器及其應用。在涉及具體無標記生 物傳感器的內容中描述了無標記生物傳感器的一些具體使用方法和模式，以提 供無標記生物傳感器及其應用的一些具體實施例。為了避免不必要的重複，涉 及每種類型的無標記生物傳感器時不重複提及這些描述。但是，應理解，當在 特定的方法或模式中使用特定的生物傳感器時，該使用表示任意無標記生物傳 感器都可用於這些方法或模式，除非該使用的相關內容或性質排除了一種或多 種類型的無標記生物傳感器。本文所述的任意和所有生物傳感器在任意和所有 方法或模式中的這些用途(除非該用途的內容或性質排除了一種或多種類型的 無標記生物傳感器)都應視為是具體考慮和已被具體公開。因此，例如，如果 記載了使用特定光柵耦合器生物傳感器分析細胞中EGF誘導的EGFR信號傳遞， 那麼應視為也公開了使用任何其它合適的無標記生物傳感器分析細胞中的EGF 誘導的EGFR信號傳遞。因此，例如，使用基於表面等離子體振子共振的生物 傳感器分析細胞中的EGF誘導的EGFR信號發出也應當視為己被公開。
35"時間依賴性響應"通常是隨著時間而變化的生物傳感器輸出或生物傳感 器參數的響應。
"飢餓培養基"指減弱細胞培養物的繁殖能力的任何培養基。當使用飢餓
培養基培育或培養細胞時，所產生的細胞是靜息態的。
本申請參考了各種出版物。這些出版物的公開內容全文納入本申請作為參
考，以更全面地描述本申請所述領域的技術水平。所公開的參考資料也被單獨 或獨自納入本文，包括這些參考資料中包含的該資料所依賴的句子中所討論的 材料。
II.組合物和方法
所公開的組合物、方法和技術涉及無標記光學生物傳感器領域，包括用於 基於細胞的檢測和技術的波導光柵基生物傳感器。總的來說，這些方法和系統 可涉及直接的光學傳感器領域，具體而言，涉及使用不依賴標記的光學檢測 (LID)生物傳感器(如波導光柵基生物傳感器)的系統和方法，用於例如實 時監控活細胞中化合物誘導的物質再分布，包括G蛋白偶聯受體(GPCR)激動 機制和拮抗機制、表皮生長因子受體活性、細胞骨架重構、細胞死亡和細胞增 殖，以及細胞信號傳遞、失敏，和活細胞內的移位，以及貼壁細胞的形態學變 化、細胞脫粘附(deadhension)、細胞移動，和在生物傳感器上培養的細胞。 直接光學傳感器(DOS)技術指利用光學轉換器將分子識別或細胞活動轉換成 可定量的信號而不需激活螢光或發光標記物的技術。依賴於這些標記的激活和 然後發射或發光的技術被稱為間接光學技術，在所公開的方法的某些實施方式 中也可採用這些技術。還公開的是篩選作用於細胞(如抗細胞上的受體，如GPCR 或EGFR或PDGFR或細胞因子受體)的化合物的活性的方法。
公開了利用無標記生物傳感器(如波導光柵基生物傳感器)監控和測量定 向物質再分布(DMR)的組合物和方法，該組合物和方法可將此簡R與特定的 細胞狀態或細胞時間或細胞活性相關聯。應理解，所公開的"細胞-生物傳感 器"和"細胞-生物傳感器-製劑"可以是本文所公開的任意組合物的組合。例 如，在此公開了一種含有A431細胞、生物傳感器和EGF的細胞-生物傳感器-製劑組合。
例如，在某些公開的檢測中，可使用無標記的光學生物傳感器來檢測化合 物或化合物或組合物對細胞的毒性或增殖影響，測量例如細胞表面受體(例如受體酪氨酸激酶(RTK)，如表皮生長因子受體(EGFR)或血小板衍生的生長 因子受體(PDGF)、或G蛋白偶聯的受體(GPCR))介導的或通過內部信號傳 遞(如各種信號傳遞途徑或細胞骨架重構)介導的細胞信號轉導事件的發生。 本文公幵的無標記生物傳感器可用於檢測刺激介導的蛋白質靶標移位或底物 聚集，例如向細胞核中，或到膜中，或到細胞質中，或到其它細胞器(如內含 體、內質網(ER)或高爾基體或核)，或在各種再循環途徑中，或從胞外被攝 取(如配體結合、基因轉染或蛋白質轉導、吞噬、內吞等)的移位或聚集。在 其它實施例中，無標記生物傳感器可用於監控不同功能性區室中和/或特定微 環境中應答刺激時特定靶標或靶標複合物的再分布，或用於測量特定靶標的從 頭合成，或用於檢測刺激介導的特定區室或位置的物質釋放(如由於激動劑誘 導的Gq偶聯受體或Ca離子載體導致的Ca動員)。就此而言，靶標指將被追 蹤或作為檢測的一部分的分子或細胞組分。在其它實施例中，無標記光學生物 傳感器可用於監控靶標分子或靶標複合物(如細菌、病毒、噬菌體、脂質顆粒 或外體顆粒等等)從一個細胞轉運到另一個細胞(如通過間隙連接或離子通 道)，或通過例如己知稱為胞吞的過程或控制釋放過程如凋亡或通過細胞表面 膜上的人造孔的擴散而從周圍環境中轉運出或轉運到該周圍環境。某些實施方 式中，採用和鑑定數據收集過程中某時間點，由此可通過收集例如僅僅一個、 兩個或三個分開的時間點的數據來完成測定，這些時間點的數據反應預測監控 過程中發生的可能是例如刺激引起的某類細胞事件，這樣，可將這些組合物和 方法適用於高通量方法。
在某些實施例中，所公開的組合物、方法和技術涉及基于波導光柵的生物 傳感器用於監控作用於生物傳感器上貼壁活細胞的化合物的吸附、分布和/或 毒性的的用途及使用方法。
在某些實施例中，所公開的組合物、方法和技術涉及使用給定導向模式的 光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰譜、或共振帶成像與角度的或波長訊 問相組合的篩選細胞增殖的抑制劑或活化劑的方法。這種方法可用於高通量篩 選。
在某些實施例中，所公開的組合物、方法和技術涉及使用給定模式的光學 波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰光譜學或的給定模式的共振帶成像繼續高 通量篩選化合物毒性的方法，以及涉及本文所述的其它方法。
所公開的組合物、方法和技術可使用基於光學的生物傳感器來監控作用於
37生物傳感器上貼壁活細胞的化合物的吸附、分布和/或毒性。在另一實施例中， 所公開的組合物、方法和技術提供了篩選或監控作用於粘附在光學傳感器上多 個可空間尋址區域之上或單個孔中的多個生物傳感器之上的多種類型的細胞 的化合物的吸附、分布和/或毒性的方法。
所公開的組合物、方法和技術公開了一種實時的和無標記的檢測，用於化 合物吸附、分布和/或毒性篩選和表徵。這些方法可用於多種不同檢測(如 ADME/Tox、功能性檢測)中，且實際上可將多種不同的檢測整合成一個檢測模 式。
在某些實施例中，所公開的組合物、方法和技術提供了無標記的測量，這 種測量適用於高通量篩選化合物對細胞增殖的作用。在某些實施例中，所公開 的組合物、方法和技術利用給定模式的光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振 峰光譜學或給定模式的共振帶成像而不是單獨使用波長或角度改變來高通量 地篩選細胞增殖的抑制劑或活化劑。這種方法利用了一給定傳感器的入射耦合 峰的半最大值峰寬(PWHM)依賴於細胞密度的關係。在所公開的組合物、方法 和技術的某些實施方式中，微板內所有傳感器的入射耦合共振帶的圖像可在同 一時間採集，並作為高通量手段用於根據它們對細胞增殖的作用而篩選化合 物。
公開了使用光學生物傳感器篩選細胞信號發出途徑的調節物的方法。這些 方法可用於細胞表面(例如RTK或GPCR)以及用於細胞內發生的信號發出事件。
公開了使用光學生物傳感器篩選細胞骨架組分的調節物的方法。這些方法 以測量細胞骨架組分的調節物誘導的大分子從透化細胞中釋放為基礎。具體而 言，這些方法利用特定的化學物質或生物物質(如皂苷、鏈球菌溶血素0等) 使活細胞的質膜具有足夠孔隙，從而使細胞內的可溶性蛋白質散逸。用破壞細 胞骨架的調節物處理細胞導致生物分子進一步釋放，其中包括隨後被細胞骨架 封鎖蛋白質和RNA，結果導致可由光學生物傳感器檢測到的物質流失。
提供了光學生物傳感器以及怎樣以不同的配置和組合使用它們的討論，所 述光學生物傳感器如無標記光學生物傳感器，如光學波導光模式光譜學和波導 光柵及生物傳感器。接著討論了物質再分布和這種物質再分布是如何與光學生 物傳感器相關。還提供了關於可使用本文所述的光學生物傳感器進行示例性細 胞檢測的討論，以及這些檢測的增加和修改，如首先使用無標記光學生物傳感 器進行檢測，但接著將特定類型的標記物偶聯到檢測中的一種或多種試劑，之
38後可將該試劑用於第二個或另外的檢測。
公開了可用於進行可進行化合物篩選和表徵的無標記功能性細胞檢測(如
基於GPCR的細胞檢測)的方法。所公開的方法允許技術人員在不需要遺傳工 程加工細胞以使其過表達感興趣的受體的情況下研究活細胞內的內源性GPCR， 雖然在某些實施方式中優選使用過表達感興趣GPCR的細胞以獲得高敏感性和 最佳的檢測結果。
所公開的方法能夠使用單個傳感器或多個傳感器實施多個基於細胞的檢 測，以比較化合物對源自不同親代細胞或相同親代細胞的至少兩種不同類型的 細胞(即給定的特定類型的細胞)的功能。這些方法的優點包括提高了通量。
公開了可使用單個傳感器或多個傳感器實施多個檢測的方法，以證實在特 定細胞靶標參與了所測量的刺激引起的信號傳遞或細胞事件。這些方法可使用 具有至少兩個不同區域的單個傳感器 一個沒有修飾，而另一個具有修飾；或 者可使用在相同區室或分開的區室中的至少兩個傳感器 一個沒有修飾，而另 一個具有修飾。傳感器的修飾區域例如可具有印刷或沉積的點，該點含有試劑 /基因或幹擾RMA (RNAi)或反義寡核苷酸或反義/反基因肽核酸(PNA)或蛋白 質或抗體，這樣當細胞在這些區域上培養並覆蓋這些區域時，粘附的細胞或攝 取這些試劑/物質，並被轉染。這些方法被稱為定位表面介導的轉染。 一旦被 這些物質轉染，細胞中的特定靶標就會通過表面介導的基因轉染或蛋白質送遞 過表達，或通過反義/反基因抑制或RNA幹擾或剔除或抗體阻斷而被下調。本 文至少將US2004/0023391A1和US 6， 544, 790中細胞送遞方法中所涉及的物質 納入本文作為參考。定位表面介導的轉染使得可檢測具有或不具有特定靶標的 特定類型細胞的刺激誘導的響應。定位表面介導的轉染可視為是一種刺激事 件。因此，本方法可用於證實特定細胞靶標是否參與到使用無標記光學生物傳 感器測量的信號或細胞事件中。可採用現有技術的方法將物質沉積或印刷到傳 感器表面上，這些現有技術方法包括但不限於接觸型印刷，如針式印刷技術 (US5807522 A或US6101946 A)或微印記方法(美國專利5， 731， 152)、毛細 分配設備(美國專利5,807,522)和微滴定設備(美國專利5,601,980)，或 非接觸型印刷，如壓電驅動的印刷或微米/納米分配設備(US6656432 Bl、 EP0895082 Bl或US6399396 Bl)。
公開了利用多個穿透深度實施基於無標記生物傳感器的細胞檢測的方法。 此外，公開了可讓技術人員以單一或多項檢測模式進行這些檢測的設備。根據0WLS， TM模式的PWHM變化要比TE模式的PWHM變化對表面不均勻性 更敏感。當細胞開始在表面上普展時，PWHM增加，在約50%細胞覆蓋率時達 到最大值，之後衰減到最初水平。
如本文所公開的，已顯示可實時監控化合物對接近細胞一傳感器界面的高 度鋪滿的細胞層的吸附、分布和毒性，如使用光學生物傳感器測量得到的化合 物毒性誘導的波長或角度改變所證明。
公開了研究用光學生物傳感器測量的反應性氧物質(R0S)的細胞功能的 方法。此外，公開了評估培養的細胞的氧化還原狀態的方法，以及篩選影響培 養的細胞的氧化還原狀態以及ROS信號傳遞的調節物的方法。反應性氧物質是 諸如過氧化物之類的分子、諸如次氯酸鹽離子之類的離子、諸如羥基之類的基 團，以及同時是離子和基團的過氧化物陰離子。具有氧化其它物質的能力的物 質被認為是氧化性的，稱為氧化劑。氧化劑通常是具有高氧化數元素的化學物 質(如H202、 Mn04—、 Cr03、 Cr2072—、 0s04)，或者是可通過氧化物質而獲得一個 或兩個額外電子的高負電性物質(02， 03， F2， Cl2， Br2)。反應性氧物質通過 幾種不同的機制形成(1)離子化輻射與生物分子的相互作用；(2)作為細 胞呼吸的不可避免的副產物(如一些電子通過呼吸鏈從主通道中逃逸(尤其在 它們通過輔酶Q時)而直接將氧分子還原成過氧化物陰離子)；(3)在噬菌 細胞如嗜中性粒細胞和巨噬細胞(如NADra氧化酶(在兩種類型的噬菌細胞中)； 或髓過氧物酶(僅在嗜中性粒細胞中))中由指定的酶合成。R0S是必需的， 但重要的是限制R0S生產不能過度，因為R0S在細胞中執行重要的功能。例如 (1)甲狀腺細胞必須生產過氧化氫，以在甲狀腺素的合成中將碘原子連接到 甲狀腺球蛋白上。(2)巨噬細胞和嗜中性粒細胞必須產生ROS，以殺死它們通 過噬菌作用吞噬的一些類型的細菌。(3)嗜中性粒細胞(而不是巨噬細胞) 也通過使用髓過氧物酶而將吞噬的致病原殺死，該酶催化過氧化氫(產生自過 氧化物陰離子)與氯離子的反應，產生強的殺菌劑次氯酸鹽離子。(4)許多 生物能量通過氧化還原反應被保存和釋放。光合成涉及二氧化碳還原成糖，和 水氧化成分子氧。逆反應，即呼吸，則將糖氧化，產生二氧化碳和水。作為一 些中間步驟，還原的碳化合物被用來還原煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)， 後者則對質子梯度的產生有貢獻，該質子梯度驅動了三磷酸腺苷(ATP)的合 成，並通過氧的還原得以維持。在動物細胞中，線粒體執行類似的功能。術語 氧化還原態通常用於描述生物系統如細胞或器官中NAD+/NADH和NADP+/NADPH
40的平衡。氧化還原態表現為幾組代謝物(如乳酸和丙酮酸、0-羥基丁酸和乙 醯乙酸)的平衡，這些代謝物的相互轉換依賴於這些比例。多種有害的情形下 會產生異常的氧化還原態，如缺氧、休克和膿毒症。應理解，此段落所討論的 所有分子、化合物和組合物的流動和作用都可用本文所述的方法鑑定，或將它 們用於本文所公開的方法中。
公開了檢測靶標家族成員(如CPGR、 RTK和其它)之間以及不同靶標類別 之間(如CPGR和RTP之間)的交叉通話(cross communication)的方法。細 胞相互之間需要溝通，而不管它們離得近還是遠。胞外信號傳遞分子調控細胞 之間的相互作用。基本的機制需要一個配體(信號傳遞分子)與其受體相互作 用，從而將胞外信號轉化成胞內信號。此過程被稱為信號轉導，可以幾種形式 出現。首先，如果信號需要傳遍整個生物體，則信號傳遞分子被分泌到血液中。 例如，內分泌信號傳遞要求細胞合成和分泌激素到循環系統中。然後，該激素 被質膜上或胞質內的特定靶細胞蛋白(受體)識別。其次，在其它情形中，信 號需要在局部發揮作用。例如，旁分泌信號發出分子(局部介體)可由相鄰的 細胞釋放，通過ECM局部擴散，然後刺激鄰近的靶細胞。例如，生長和分化因 子被認為主要作為旁分泌信號分子起作用。溝通的第三種形式是神經信號發 出。這種類型的信號傳導可長距離發生，但其傳遞是通過稱為軸突的長細胞過 程實現。神經元信號可作用於靶細胞或其它神經元細胞。信號通過軸突如電脈 衝一樣傳遞，到達軸突末端後，它被轉換成稱為神經遞質的化學信號。第四類 信號轉導是所有信號轉導中距離最短的。它通常不需要釋放分泌的分子。例如， 接觸依賴性信號傳遞要求在錨定於信號傳遞細胞的質膜上的信號傳遞分子與 嵌埋於靶細胞的質膜內的受體分子結合時完成轉導。接觸依賴性信號發出還可 以以細胞與胞外基質相互作用的形式發生。由於其特化的功能以及其有限的受 體，各細胞能夠對有限的一組信號作出應答。此外，各細胞對信號分子可作出 不同的應答。在這種情況下，例如，神經遞質乙醯膽鹼可刺激一種類型的肌肉 細胞收縮(骨骼)或抑制另一類型的細胞的收縮(心臟)。乙醯膽鹼還可刺激 某些細胞分泌它們分泌小泡的內容物。或者，類似的受體可激活不同的胞內信 號傳遞途徑，或著，配體結合不同的受體。在一線性模型中可以看到信號傳遞 途徑是這樣的信息的主流連續地從受體通過中間步驟的線性鏈到達特定的功 能細胞。但是，由於細胞生物學很複雜，信號傳遞不是線性的信息流，取而代 之的是，由刺激介導的信號傳遞由大量的指令構成，這些指令由涉及擴散步驟的反饋(可擴散反饋系統)相連接，或與信號發出蛋白和/或支架蛋白的複合 物物理連接。例如，可在正反饋環和負反饋環中看到可擴散反饋指令，鈣和肌 醇三磷酸受體籍此調節胞質鈣濃度。這些正反饋環和負反饋環在信號傳遞的交 叉溝通中起重要作用。例如，已證明許多促有絲分裂GPCR的信號傳遞以負反 饋途徑或正反饋途徑與EGFR信號發出交叉溝通。這些GPCR的活化也導致相同 細胞中EGFR通過蛋白激酶C或作為銜接蛋白質的P —抑制蛋白而活化。
公開了基於至少兩個終點測量值高通量篩選抗特定靶標或一類靶標的調
節物的方法。
a) OWLS在監測細胞死亡中的應用
本發明組合物、方法和技術公開使用給定模式的光學波導光模式光譜學或 共振峰譜或共振帶成像來高通量篩選化合物毒性。公開了適用於使用基於光學 的生物傳感器高通量篩選化合物毒性的測量方法。可使用所公開的方法、組合 物和技術來監測細胞或細胞群的健康狀況。術語"健康狀況"指細胞生存能力 和細胞功能方面的總體狀態。當其健康狀態受損時，細胞有多種表現行使如 細胞分裂下降，細胞功能如蛋白質或mRNA生產下降，細胞信號傳遞下降，和/ 或例如與細胞死亡相關的蛋白質增加。以往，採用檢測細胞膜完整性，或特定 耙蛋白(如線粒體脫氫酶)的功能，或特定基因產物的合成，或DNA或RNA中 標記核苷酸的慘入，或細胞核中染色體完整性的螢光染色方法或其它方法來評 估細胞健康。在某些實施方式中，這些方法利用了給定傳感器的入射耦合峰的 半最大值寬度(P冊M)依賴於細胞密度、細胞死亡情況和由於化合物毒性而被 改變的細胞層不均勻性的關係。化合物毒性導致在波導膜表面上形成三種細胞 種群，分別是活的、受影響的和死亡細胞。所產生的表面不均勻性增加導致共 振峰變寬，甚至分裂。共振峰變寬和分裂可作為化合物毒性的特徵。可在細胞 接觸化合物後的某個時間收集共振峰譜或整個傳感器共振圖形，並進行分析。
所公開的組合物、方法和技術提供了監測作用於培養於光學傳感器上的細 胞層的化合物的吸收、分布和毒性的方法。這些方法可涉及使用光學生物傳感 器實時測量細胞層在應答給予細胞或與細胞一起培養的化合物時由於物質再 分布而發生的角度或波長改變。這些方法可用於研究細胞毒性和凋亡的動力學 和機制。還公開了高通量方法。
422. 監測細胞死亡的髙通量方法
在某些實施方式中，這些方法利用可同時監測多個波導光柵生物傳感器， 和/或可獲得多個生物傳感器的給定導向模式的共振峰譜，和/或可展示多個生 物傳感器的給定導向模式的共振帶圖像的光學訊問系統。例如，對於光學角度 訊問系統，可參見2003年6月24日提交的美國專利申請號10/602,304 (2004 年12月30日公開，公開號為US-2004-0263841) 、 2004年12月21日提交的 美國專利申請11/019,439和N. Fontaine等的美國專利申請"光學訊問系統 和2 — D傳感器陣列方法"(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS) (2005年4月5日提交)，所有這些文獻的全文(至少 關於生物傳感器及其用途方面的內容)被納入本文作為參考。
美國專利申請號10/602,304 (公開號US-2004-0263841) 、 2004年12月 21日提交的美國專利申請11/019， 439和N. Fontaine等的美國專利申請"光 學訊問系統和2 — D傳感器陣列方法"(2005年4月5日提交)提供了一發射 系統和一接收系統，該發射系統用於產生一陣列的光束，各光束以 200WnX 3000Wn的照射面積照射RWG傳感器，該接收系統用於接收由這些傳感器反射的 光束的角度顯示的所有響應。此系統允許例如7X7孔傳感器以3秒的速率同 時釆樣(圖l顯示了一個例子)。這意味著96孔微板中96份樣品的細胞健康 評估可在幾秒內完成。2004年11月18日N. Fontaine等提交的美國申請 10/993， 565和Y. Fang等於2005年4月5日提交的"消除位於微板中的波導 光柵基生物傳感器和所得的微板之間的色亮度幹擾的方法"(METHOD FOR ELIMINATING CROSSTALK BETWEEN WAVEGUIDE GRATING-BASED BIOSENSORS LOCATED IN A MICROPLATE AND THE RESULTING MICROPLATE)(兩者的全文(至 少涉及生物傳感器、掃描設備以及微板的內容)納入本文作為參考)的另一示 例性系統使用陣列式光纖來產生陣列式光，這樣各束光照射一個生物傳感器， 並從接收來自該生物傳感器的響應；且該系統使用受控掃描模塊依次收集來自 單個傳感器內多個區域以及來自多個生物傳感器的響應。該系統可在約30秒 內完成細胞健康狀態評估。
3. 基於光學的生物傳感器
基於光學的生物傳感器已被用來檢測各種生物分子之間的相互作用，包括 寡核苷酸、抗體-抗原相互作用、激素-受體相互作用、和酶-底物相互作用。描述使用光學無標記技術進行基於細胞的檢測的報告相對較少。例如，已使用 光學波導光柵基生物傳感器來研究動物細胞的粘附可擴展(J.J. Ramsden，等，
"動物細胞的粘附和擴展動力學"(Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells) ， Biotechnol. Bioeng. 1994， 43， 939-945);和已使用表 面等離子體振子共振(SPR)來研究配體誘導的活細胞的胞內反應(M. Hide,等，
"使用表面等離子體振子共振基生物傳感器實時分析活肥大細胞的配體誘導 的細胞表面禾口胞內反應，，(Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface ancMntracellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor) ， Anal. Biochem. 2002， 302， 28-37)。 基於光學的生物傳感器通常由兩個組件構成高度特異的識別元件和將分 子識別事件轉換成可定量的信號的光學轉換器。直接表面傳感法包括表面等離 子體振子共振(SPR) (Jordan & Corn,"吸附到化學修飾的金表面上的靜電 生物聚合物的表面等離子體振子共振圖像測量"(Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces) ， Anal. Chem. ， 1997， 69:1449-1456)、 光柵耦合器(Morhard等，"在微模式中固定抗體以通過光衍射進行細胞檢測"
(Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction) ， Sensors and Actuators B， 2000， 70， 232-242)、 橢圓光度法(Jin等，"基於圖像橢圓光度法以使生物分子相互作用可視化的 生物傳感器概念，，(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions) ， Analytical Biochemistry, 1995， 232， 69-72)、衰減波設備(Huber等，"直接光學免疫傳感(敏感性 禾口選擇性，， (Direct Optical Immimosensing ( Sensitivity and Selectivity) ) ， Sensors and Actuators B， 1992， 6， 122—126)、禾口反身寸 測定法(Brecht & Gauglitz，"光學探針和傳感器"(Optical Probes and Transducers) ， Biosensors and Bioelectronics, 1995， 10， 923-936)。 通常用於訊問SPR或波導光柵傳感器的儀器使用具有適當光譜或角度含量
(angular content)的光束，這樣，當該光束被傳感表面反射時，共振角度 或波長響應成為輸出的響應中的主要內容。 一個共有特徵是SPR和光柵耦合器
(即0WG或RWG)技術都對傳感器表面上或附近的折射率變化敏感。
這種技術作為生物傳感器的一個主要應用是原位監測不同表面特徵和不
44同溶液特徵條件下特定分析物的界面行為。此技術允許無標記檢測，這與大多 數需要特異性標記以讀出相互作用的信號的當前技術不同。與標記相關的缺點 是標記不僅僅需要大量的勞動和成倍，而且還潛在地幹擾靶生物物質或化合物 的生物學性質，使數據解譯困難，而且還可能在檢測中產生錯誤信息。但是， 如本文所公開的，當使用無標記展示技術時，或當標記與本文所公開的無標記 技術結合使用時，可減少這些缺點。還應理解的是，本文所公開的任意傳感器 可以各種方式使用，包括例如以多路復用的方式使用，當使用多孔板如修飾的 96孔微板時就可實現多路復用(multiplexing)。如本文所公開的，無標記生 物傳感器如RWG或OWG生物傳感器可與細胞結合使用，並監測細胞的活動。細 胞可培養在生物傳感器上，這樣所培養的細胞粘附到生物傳感器，與細胞在常 規的平板上培養並粘附到平板的底部表面非常相似。當細胞培養在所公開的傳 感器上時，生物傳感器的輸出會改變。圖1顯示一例培養在該系統上的細胞的 輸出。圖2顯示光學波導光柵傳感器。在此圖中，細胞培養在傳感器的上面。 當光源如雷射以各種角度射向傳感器時，在一組特定的角度，光將耦合到傳感 器中。在其它角度，光將直接反射，或者透過傳感器。如本文所述，在細胞操 作如刺激細胞表面上的受體之後，在細胞內發生物質再分布。這種物質再分布 引起許多事情，其中之一是改變光耦合到傳感器中的角度。這種角度變化可用 來鑑定細胞中發生的事件，且應理解，如本文所描述的，基於細胞內發生的物 質再分布，就生物傳感器相關的輸出而言，特定的事件具有特徵特徵。
與通常需要標記和長的培養步驟的常規細胞增殖檢測不同，所公開的組合 物、方法和技術的某些實施方式提供了不需要任何標記物的基於給定導向模式 的光學波導光模式光譜學(OWLS)或共振峰光譜學或給定導向模式的共振帶成 像的方法。此外，在某些實施方式中，所公開的組合物、方法和技術消除了任 何額外處理步驟，包括試劑反應和洗滌步驟。此外，在某些實施方式中，所公 開的組合物、方法和技術如細胞增殖檢測可在不存在或僅存在感興趣的化合物 的標準培養條件下實施，而不會有幾乎所有常規方法通常所需的任何其它試劑 的幹擾。其它試劑的存在可導致檢測結果的錯誤解讀(J.J. Ramsden，等， "動物細胞的粘附和擴展動力學"(Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells) ， Biotechnol. Bioeng. 1994， 43， 939—945);因為這些試 劑本身可能對細胞增殖有直接的影響(M. Hide,等，"使用表面等離子體振 子共振基生物傳感器實時分析活肥大細胞的配體誘導的細胞表面和胞內反應"(Real—time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and IntracellularReactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance—BasedBiosensor) ， Anal. Biochem. 2002， 302， 28-37)。待篩選的化合物可能對這些試劑而不是細胞增殖有影響。例如，直接抑制細胞線粒體脫氫酶的化合物可能抑制MTT轉化，從而在使用MTT篩選針對另一感興趣的特定靶標時導致假陽性。
在某些實施方式中，所公開的組合物、方法和技術提供了超高通量篩選方法，用於找出抑制劑和活化劑，這與當前其它的無標記細胞增殖檢測不同(包括涉及實時測量細胞增殖導致的角度和波長轉移的光學波導傳感方法)。由於細胞增殖通常是個緩慢的過程(如這個過程需要許多小時、天甚至周)且通常需要在37'C培養，除了本文公開的檢測之外的無標記增殖檢測(通常在室溫採集信號)難以實現高通量篩選。
本文公開的方法可提供準確的測量值，而不需要額外的試劑，且這些方法易於使用，並易於與其它功能性篩選整合。例如，可能不需要保存或操作放射性物質或其它物質(如光敏感性螢光化合物)。
雖然其他人已使用光學波導基生物傳感器來進行細胞增殖檢測，但他們使用光學波導基生物傳感器來監測，就給定數量的起始細胞，不同濃度化合物存在下的粘附而導致的傳感器波長改變(Cunningham, B.T.等，"BIND系統的無標記檢測，，(Label-Free Assays on the BIND System) ， J. Biomol. Screening2004， 9， 481-490，和美國專利申請出版物US20030068657 Al，"進行使用比色共振反射光學生物傳感器的檢測的無標記方法"(Label-free methods forperforming assays using a colorimetric resonant reflectance opticalbiosensor) ， SRU Biosystems LLC的Lin， Bo等)。在某些情況下可使用這些方法檢測化合物對細胞增殖的ICs。值。但是，這些方法並不像本文所公開的方法那樣適用於高通量篩選。如本文所公開的，基于波導的生物傳感器可不僅可用於監測活細胞中由G蛋白偶聯的受體(GPCR)或受體酪氨酸激酶如EGFR的活化導致的激動劑誘導的定向物質再分布，而且還可用於研究導致定向物質再分布的信號傳遞途徑或細胞機制。
a) OWLS和細胞毒性
根據0WLS，波導表面上的模式和不均勻性可導致入射耦合峰譜變寬，並產生細微結構。不再是傳感器上均勻表面固定化所產生的各模式的尖銳共振峰，實驗上和理論上觀察到的具有生物物質或材料不均勻附著的傳感器的細微結構包括但不限於與各模式的主共振峰一同出現的至少一個肩峰(即第二個峰)，和各模式的明顯分開的雙(或更多個)峰(見Horvath, R.等，"用於光學波導光模式光譜學應用的波導表面上的模式和不均勻性的影響"(Effect ofpatterns and inhomogeneities on the surface of waveguides used foroptical waveguide lightmode spectroscopy applications) ， Appl. Phys.B. 2001， 72， 441-447; Voros， J. 、 Graf, R.等，"基於光學波導技術的在線毒理學傳感器的可行性研究"(Feasibility Study of an OnlineToxicological Sensor Based on the Optical Waveguide Technique)，Biosensors & Bioelectronics 2000， 15， 423-429，這些文獻納入本文作為參考)。先前，研究者已觀察到，細胞在波導上附著和鋪展期間，入射耦合峰變寬，同時光柵上規則的微結構造成峰的遷移和分裂。共振峰的變寬已被用作為細胞粘附和擴展的指印。
4.光學生物傳感器和細胞中的物質再分布
通常用於訊問SPR或波導光柵傳感器的儀器使用具有適當光譜或角度含量的光束，這樣當該光束被傳感表面反射時，共振角度或波長響應在輸出響應中是佔優的。具體而言，用作傳感器的平面光學波導由基底、波導膜和覆蓋介質構成，其中該覆蓋介質是將通過測定折射率而表徵的物質。該基於平面波導的生物傳感器可用來檢測隨著在該波導中傳播的電磁場延伸到周圍介質中成為攸逝電磁場時該波導周圍介質中的變化(深度指滲透滲透或感測容積)。當在傳感容積內發生物質再分布時，觀察到響應變化，反映為反射光束中的角度或光譜變化。可測量角度變化以獲得物質再分布響應信號的動力學。此外，由於上述原因，不同的細胞響應將對總的物質再分布信號作出不同的貢獻。例如，在傳感器表面上或附近細胞與胞外基質脫離，因此，這種脫離所產生的響應明顯大於發生在細胞內而產生的響應。
生物細胞是複雜的結構，其組分的大小範圍從幾納米到幾十微米，如圖9所述。細胞由含有各種細胞器的細胞質(通常為5-30幽)構成。最大的細胞器是細胞核，其大小通常為3—10pM。細胞核裡具有DNA —蛋白複合物和蛋白質，最重要的是染色質。線粒體是小的細胞器，含有一系列摺疊的膜，大小通
47常為0. 1-1. 5jim。其他細胞組分包括內質網(ER)(通常為0. 1 —l|im)、溶酶 體(通常為0. 2-0. 5pm)、過氧物酶體(通常為0. 2-0. 5^)，內含體(通常 100nm)，和高爾基體。
a)基於光學波導光束的表面傳感技術
可交換使用共振波導光柵傳感器(RWG)和光學波導光柵(0WG) 。 RWG生 物傳感器是一種攸逝波傳感器，以光通過衍射光柵諧振耦合到波導之中為基 礎。基於RWG的表面傳感技術利用了攸逝場的優點，它在波導表面之外的穿透 不超過一個波長，從而在給定譜帶寬上對固定化的化學或生物分子的吸附作出 選擇性應答。
光學LID生物傳感器的一個例子(如圖10的1004)是SPR傳感器1004或 基于波導光柵的傳感器1004。也可使用其他基於光學的生物傳感器，例如橢圓 光度法設備、衰減波設備和反射測定法設備。關於這兩者類型的光學LID生物 傳感器的結構和操作的更詳細的討論在美國專利4,815,843 ("選擇性檢測氣 體、液體、固體和多孔樣品中的物質和/或折射率變化的光學傳感器"(Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples)) 和K. Tiefenthaler等的"集成光學開關和氣相傳感器" (Integrated Optical Switches and Gas Sensors, Opt. Lett. 10， 第4期， 1984年4月，pp. 137-139)提供，本文將他們的全文，至少是關於生物傳感器 的材料，納入作為參考。尤其是2005年7月20日提交的美國專利申請 60/701,445 ("無標記高通量生物分子篩選系統和方法"(Label-Free High Throughput Biomolecular Screen System and Method))禾口 N. Fontaine等 於2004年12月21日提交的美國專利11/019,439 ("光學訊問系統和2 — D傳 感器陣列方法"(OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS) ) (2005年4月5日提交)中公開的光學生物傳感器，所有這些都被 全文(至少關於生物傳感器及其用途)納入作為參考。 一
(1)對稱波導光柵生物傳感器
對稱波導光柵生物傳感器的一個例子是光柵耦合器或耦合的生物傳感器。 光柵耦合的生物傳感器的例子可見Jordan & Corn,"吸附到化學修飾的金表面上的靜電生物聚合物的表面等離子體振子共振圖像測量"，Anal. Chem.，1997， 69:1449-1456; Morhard等，"在微模式中固定抗體以通過光衍射進行細胞檢測"，Sensors and Actuators B， 2000, 70, 232-242;和Tiefenthaler,K.和W. Lukosz，"作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器的靈敏性"(Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemicalsensors) ， J. Opt. Soc. Am. B， 1989， 6， 209-220。所有這些文獻的全文(至少涉及光柵耦合的生物傳感器的材料)納入本文作為參考。
光柵耦合器生物傳感器是以光通過衍射光柵諧振耦合到波導中為基礎的攸逝波傳感器。光柵耦合器傳感器由波導和衍射光柵構成。圖2a顯示了一種典型的四層波導生物傳感器，它由位於較低折射率XI737玻璃的ns=1.50)的基底之上的高折射率(NbA的np^2.36 )、厚度為dF的薄膜構成。固定在波導膜上的是折射率(nA)在1.4左右、厚度為dA的生物物質貼壁層，在整個傳感器結構頂部的是覆蓋介質，為折射率(ne)大約為1.5的生物溶液。在此常規構型中，波導薄膜的折射率至少比低折射率基底的折射率高1%，例如，高1%、 5%、 10%、 20°/。、 30%、 50%、 70%或100%。低折射率基底的折射率比覆蓋介質的折射率高(例如)5%、 7%、 10%、 15%、 20%、 30%或50%。用於細胞基檢測的覆蓋介質(通常是水性介質)的折射率通常大約為1.32、 1. 35和1.38。
平面波導中的導波或模式是TEm (橫向電場或s-極化)和TM (橫向磁場或P-極化)，其中m二0、 1、 2……，它是模式編號。給定導向模式指例如TM。、TE。、 TMh TEt等。雷射以各種角度照射波導，光僅在導向模式的有效折射率所確定的特定角度(稱為N)耦合到波導中。由於光模式的攸逝尾隨脈衝在基底和覆蓋介質中傳播(但仍沿著該膜)，光模式同時經歷並感知所有介質。這意味著行進中的光模式所經歷的折射率是三種折射率的加權混合值。有效折射率N可根據以下四層波導的模式方程計算出數值，假設薄貼壁層的厚度低於光的波長(必《入)(Tiefenthaler, K.和W. Lukosz，"作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器的靈敏性"J. Opt. Soc. Am.B， 1989， 6， 209-220)，則該方程可寫成以下形式
49formula see original document page 0(1)
其中，k=27t/L X是導向光的真空波長，CJ是模式類型數，對於TE等於1，對於TM模式則等於O。
如果通過表面起伏光柵(surface-relief grating)耦合到波導中，N可由入射耦合角度計算
(±)W = iV。,.r sin(6>)+/A/A ( 2 )
其中，Nair=1.003，指空氣的折射率；e指空氣中測量的入射角；入指波長；
A指光柵周期(grating period) ; /=±1、 ±2……，為衍射級。此方程左側
的加減號分別指導向模式以+ z和-,方向傳播。
150.光柵區域中波導內的誘導的有效折射率變化AN導致Ae變化，如以下
方程所述
臘Uos(豐6f (3)由於雷射耦合到波導膜的平面並平行於該平面傳播，這就在鄰近界面的液體中產生了電磁場(即攸逝波)。攸逝波的振幅(Era)隨著與該界面之間的距離d的增加而指數性減弱
、A2V J
其中，
^ 1-(T ,如 )2+(W/"c)2-1「 (5)
是高強度波導模式進入覆蓋介質中的穿透深度。
如果滿足兩個條件，那麼，給定模式類型僅作以導波形式傳播(a)波導膜的折射率得至少不周圍基底和覆蓋介質折射率大1%;和(b)波導膜的厚度大於很好限定的值，即閾值厚度dc:
《=—
鵬+arctan
f"L-"L、 J 〔"》-"L
、05、、 (6)
*《J5 , ,其中，Nmin=min{ns，nc;^。 nmM=max{ns,nc}。已知當膜厚度接近閾值厚度時，模式的有效折射率N接近nmax。此外，方程5暗示，在閾值厚度，具有較大折射率的膜那一側穿透深度趨向無窮大，而在另一側穿透深度將是有限的。在這種情況下，dw也是無限的。
50再次，當波導光柵生物傳感器為常規的波導構型時，光在波導傳感器中傳播產生的指數性衰減的攸逝波場僅能以高強度滲透到覆蓋介質50-200nm的深度。這一數值依賴於界面上存在的介質的折射率、照射波長以及光柵結構。當入射角等於臨界值(critical value)時，c^趨向無窮大，折射光的波陣面與表面垂直。
考慮到四層波導具有以下參數nF=2.37 (Nb20s層)，ns=1.51 (1737玻璃)，nc=1.333 (水溶液)，nA=1.37 (細胞)，dA = 500nm (培養的細胞的平均厚度)，dF=157nm,波長830nm，光柵周期530nm，我們得到(1) TE。模式的閾值厚度為27nm、TM。的為69nm, TM^莫式的為252nm、 TM1模式的為294nm，表明這種傳感器僅支持TR。和TM。模式；(2) TEO的穿透深度為78nm、 TM0模式的為112nm。這意味著(1)我們僅監測細胞貼壁層底部，如圖2a細胞內部的虛箭頭所指示的；(2)當靶標或複合物較接近傳感器表面時，與它們與傳感器表面較遠相比，某些質量的靶標和複合物更能影響到總響應，如圖4所示。圖4顯示滲透到介質中的攸逝波的強度隨著距離增加而指數性減弱。由於較高敏感性的緣故，本申請中大多數示例採用TM。模式，除非另有說明。
(2)反對稱波導光柵生物傳感器
在前述具有常規構型的波導傳感器中，基底折射率(如玻璃基底，通常ns 1.5)通常高於水性覆蓋介質的折射率(通常 1.33)。在這種對稱波導傳感器中傳播的光的指數性衰減的攸逝波場滲透入覆蓋介質不深(通常 50-200nm)。基底一側的攸逝波尾隨脈衝比覆蓋介質一側的更長更強。這限制了對分析物的響應，因為敏感性依賴於分析物粘附層中傳播的模式能所佔的分數。將模式的特徵(profile)反轉有可能克服這種限制，並允許較大(較長)的穿透深度，從而可分析形態學或胞內組分。Horvath等(US20030109055A1和Horvath， R. 、 Lindvold， L, R.和Larsen， N. B.的"水溶液中反對稱波導傳感的證明，，("Demonstration of Reverse Symmetry Waveguide Sensing inAqueous Solutions" ， Applied Physics B， 2002， 74， 383—393，其中的文獻納入作為參考)已證明所謂的反對稱波導的可行性。反對稱波導的原理以使波導基底的折射率低於覆蓋波導膜的介質的折射率(即，對於水溶液，通常為1.33)為基礎，如圖2a所示。如圖5所示，可通過三種不同的幾何構造實現反對稱(1)沉積在具有微觀結構的支持物上的薄的波導薄膜；(2)沉積在中孔或納米孔支持物上的薄波導薄膜，其中這種納米孔基底的折射率大約為 1.15;和沉積在納米結構化的支持物上的薄波導薄膜。通過使用這些反構型， 當膜厚度接近這兩種波導的閾值厚度時，覆蓋介質穿透深度明顯超過常規波導 的穿透深度。此外，通過控制膜厚度，探測深度可以得到控制，且可無限增大。
(3)光學檢測系統
在某些實施例中，當使用光學波導生物傳感器時，光學檢測系統可以是角 度訊問、波長訊問或由它們的變形而來的系統，例如陣列式角度訊問系統或掃 描波長訊問系統(2004年11月18日N. Fontaine等提交的美國申請10/993， 565 和Y. Fang等於2005年3月31日提交的"消除位於微板中的波導光柵基生物 傳感器和所得的微板之間的色亮度幹擾的方法"，兩者的全文(至少涉及生物 傳感器、掃描設備以及微板的內容)納入本文作為參考)。2003年6月24曰 提交的美國專利申請號10/602,304 (2004年12月30日公開，公開號為 US-2004-0263841) 、 2004年12月21日提交的美國專利申請11/019,439和 N. Fontaine等的美國專利申請"光學訊問系統和2 — D傳感器陣列方法" (OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS) (2005 年4月5日提交)，所有這些文獻的全文(至少關於生物傳感器及其用途方面 的內容)被納入本文作為參考。
可用於構成微板中含特定構型0WG生物傳感器的平板的例子是96孔康寧 Epic生物傳感器微板，其中各孔含有嵌埋於玻璃支持基底底部表面中的光學波 導光柵(OWG)生物傳感器。
由於受導模式的攸逝波場投入到覆蓋的液體中的緣故，波導模式對覆蓋環 境極度敏感。當在波導表面上發生細胞事件時(例如生物材料從能透過的細胞 中控制釋放)，由於質量損失，導致覆蓋介質的折射率發生變化，根據Maxwell 電磁方程，波導模式的傳播常數也必然變化。因為上述波導光柵結構的相期匹 配(phase matching)條件，入射光的優選耦合角度(或波長)必然隨著波導 傳播常數的變化而變化。可監測這些宏觀的物理變化來指示微觀的細胞事件。
b)光學波導光模式光譜學(OWLS)理論
光柵耦合器生物傳感器是以光通過衍射光柵諧振耦合到波導中為基礎的 攸逝波傳感器。受導模式完全通過內部反射在平面波導中傳播，可將此描述為Z型波。在通過一個完整Z字形後，只有對給定波導結構和固定的極化和波長，
普通波與兩次反射波之間的相差才是膜中光的波矢((3)的5C要素的函數。通過自洽性標準測定，P值可根據以下模式方程計算(Horvath, R.等，"用於光學波導光模式光譜學應用的波導表面上的模式和不均勻性的影響"，A卯l. Phys.B. 2001， 72， 441—447):
formula see original document page 53(7)
其中，A-》r/丄；i是導向光的真空波長；p是導向類型數，TE模式中等於1， TM模式中等於0。 nF、 ns和n。分別是膜、基底和覆蓋介質的折射率。波導中模式傳播方向是X， m = 0、 1、 2……，它是第m種波導模式的模式指數。在Z形波長模型中，各光線代表一個平面波(P.K. Tien.，"檢測光路和光線波導中新的波現象，，(Integrated Optics and New Wave Phenomena in OpticalWaveguides" ， Rev. Mod. Phys. 1977， 49， 361)。如果光耦合到波導中，則僅需要考慮Z形波擊中膜表面的那些點的耦合，以及可使用簡單的光線光學的那些點的耦合。
如圖3所示，假設一個Z字波期間的相移是$ (p) ， n個Z字形之後的波振幅(An ( P ))將是幾何級數的
(8)
其中
和
表示虛數單位，和G(y )=
_i
0(aj二2加，ot = 0,1,2…,.
(9)
(10)
假設整個光柵長度都被照射，則耦合長度L等於光柵長度，完整Z字波的總數n可用下式計算以角度OC。照射光柵，則產生具有P。的波導模式
A) =H',sin("o)+2"/A (12)
其中n&是空氣的折射率，A是光柵周期。由於光柵和雷射束的限定寬度， 當用平面波以角度oc。照射光柵時，可使用平面波分布來描述衍射的光。由此達 的到在P。處的一個峰，根據光學不確定性原理計算得到其半最大值峰寬(PWHM) 約為2tt/L (Tiefenthaler, K.和W. Lukosz，"作為集成光學化學傳感器的光 柵耦合器的靈敏性"，J. Opt. Soc. Am. B， 1989， 6， 209-220)。
n個節段之後的耦合光的強度(/n (P ))與光的振幅的絕對平方成正比
|G |2=IG 。耦合光強度/ (a)和入射角(也可使用光學波導光模
式光譜學(OWLS)技術測定)之間的關係可使用下述方程計算
/(")=J/d(y9，or)/GWK (13)
其中/a (P,oO是一級衍射的強度分布。
sin(0.5Z</ - z 、 2"、、 ,m(") + 丁))(14)
sin(c、2-、 。+s
c)縱向物質再分布和橫向物質再分布
活細胞高度活躍，大多數細胞器，例如響應信號傳遞分子或途徑的活化， 在細胞內廣泛運動。例如，微管可長距離轉運細胞器。 一個刺激可導致被緻密 包裹的細胞器在細胞於其上培養的傳感器表面的很外圍的區域做亞微米級的 移動，這種移動導致細胞內的物質再分布。可將應答信號刺激的這種移動稱為 "轉運"或"移位"或"再分布"。這種轉運或移位或再分布事件通常與物質 再分布有關。可使用光學生物傳感器檢測物質再分布，並將與物質再分布相關
的信號稱為定向物質再分布(DMR)信號。
由於刺激可導致細胞內容物在三維方向動態再分布，因此通過入射角或波 長的變化來監測細胞響應對於使用生物傳感器進行細胞傳感而言可能是不夠
的。為了簡化分析，可將動態物質再分布分成兩種類型縱向物質再分布，發
生在與傳感器表面垂直的方向上；和橫向或水平物質再分布，發生在與傳感器 表面平行的方向上。應理解，特定的刺激事件可引起這兩種物質再分布之一或兩者。
如入射角或共振波長的動態變化所暗示的，DMR信號主要是由於發生在垂
直於傳感器表面的方向上的細胞內容物的再分布，因為傳感器對平行於傳感器
攸逝波方向的物質再分布最敏感。這種DMR也稱為縱向物質再分布。具體而言， 在平行於傳感器表面且垂直於傳感器攸逝波方向上發生的刺激事件誘導的物 質再分布可導致細胞層內質量均勻性發生變化，從而導致共振峰、共振帶圖像 和/或0WLS譜發生變化。可檢測這些變化，並用作刺激事件或化合物對刺激事 件誘導的細胞響應的作用的特徵。該物質再分布被稱為橫向物質再分布。
如圖2和3所示，細胞直接在共振波導管光柵(RWG)生物傳感器表面上 培養。外源信號介導了特定細胞信號傳遞的活化，在許多情況下導致細胞內容 物的動態再分布，相當於動態物質再分布。當D服發生在傳感容積(即攸逝波 的穿透深度)範圍內時，它會被顯示出來，從而被RWG生物傳感器實時監測
到---種對傳感器表面附近局部折射率變化敏感的無標記技術。由於其可測
量多個參數的能力，生物傳感器具有為細胞傳感提供高信息內容的潛力。這些 參數包括角度變化(最常見的輸出中的一種)、強度、半最大值峰寬(PWHM) 和共振峰的面積。此外，由於我們的角度訊問系統的獨特設計(該系統使用 200WnX3000um的光束照射各傳感器)，各傳感器的共振帶圖像可提供其它有 用的信息整個傳感器不同位置上的細胞的細胞狀態(如密度和粘附程度)的 一致性以及細胞響應的均勻性。
RWG生物傳感器利用光通過衍射光柵共振耦合到波導中而產生的攸逝波。 由於只有基底-膜和介質-膜界面上的內部反射，被導光可視為傳播方向都平行 于波導的一種或多種光模式。波導的折射率比其周圍基質的折射率高。因為被 導光模式具有覆蓋所有層的橫向振幅，各模式的有效折射率W是所有層的折射 率的加權和
W = /w("F,"s,"c,"w,A，《d,義，M,cr) (15) 其中，nF、 ns、 ne和r^分別是波導、基底、覆蓋基質和細胞貼壁層的折射
率。dp和cU分別是波導膜和細胞層的有效厚度。X是所使用的光的真空波長。M
=0、 1、 2……，它是模式數。a是模式類型數，對於TE (橫向電場或s-極化)
它等於l，對於TM模式(橫向磁場或p-極化)它等於l。
由於細胞與表面相互作用的性質和細胞結構和功能的複雜性的緣故，貼壁
細胞的光學傳感是獨特的和非常有挑戰性的。已知一些類型的細胞可粘附在表面上，主要通過三種類型的接觸焦點接觸、鄰近接觸和胞外基質(ECM)接 觸。焦點接觸是粘附的細胞膜的狹窄區域(如0.2 pMX10 nm)與基底表面的 距離在10—15nm。鄰近接觸指細胞膜區域與基底的距離在l一50nm，而ECM接 觸指細胞膜區域與基底的距離為100nm或更遠。因此，人們可以理解傳感器仍 可感測覆蓋基質，即使細胞覆蓋率很高( 95%)。但是，已知活細胞含有 70%的水，並且，在哺乳動物細胞內，大多數胞內生物大分子通過絲狀網絡而 高度組織化，它們在空間上被限制在適當位點上。此外，細胞的高度通常超過 入射光的波長(在此 i二830mn)，而穿透深度通常遠小於細胞的高度。因此， 用於細胞傳感的生物傳感器可視為是一種三層構型基底、波導和細胞層。
可由三層波導管的給定模式的模式方程計算有效折射率N的數值 (Tiefenthaler， K.和W. Lukosz，"作為集成光學化學傳感器的光柵耦合器 的靈敏性"，J. Opt. Soc. Am. B， 1989， 6， 209-220):
-卜')2+ arctan—ro2—《-
U，-w2j」("cj u，-H —
(16)
其中，波矢a-^t辺/;l。
被導光模式平行於平面波導管的表面傳播，產生延伸進入膜兩側低折射率 介質的電磁場(即攸逝波)，該電磁場的特徵是指數性衰減。攸逝波的振幅(&)
隨著與界面的距離Z增加而指數性衰減
(17)
g巾
、7 _ i-",如"J2+(W/"J—(18)
是波導管模式的攸逝波尾隨脈衝深入覆蓋介質的穿透深度。基於所使用的 生物傳感器的構型和細胞性質的獨特性，本文所用的TM。模式的穿透深度是 120nm，意味著我們僅監測細胞的底部。
蛋白質和/或分子集合體的移位常見於許多外源信號啟動的細胞響應。移 位使得可對特定靶標引起的細胞信號發出的振幅、持續事件以及動力學進行準 確控制。此外，有時，外源刺激還可引起細胞狀況例如粘附程度和細胞骨架結 構發生變化。當這些變化在傳感容積範圍內時，模式折射率N由於覆蓋介質和 攸逝波尾隨脈衝之間的相互作用被改變。
對垂直於傳感器表面但平行於導向模式的攸逝波尾隨脈衝的方向上的細 胞內容物再分布(稱為縱向物質再分布)，假定給定時間用光探測的細胞的粘
56附程度和構型相似，則可將貼壁細胞的底部分成多個相同間隔且均勻的薄層。 各層具有各自的折射率仏，且離傳感器表面的距離為&(圖2b)。因為單位面 積^視為是恆定的，並由光學生物傳感器的空間解析度所確定，因此所有的層 可視為具有相同的體積，其中該空間解析度受限於入射光的物理大小以及被導 波在波導中的傳播長度。細胞內給定體積的折射率主要由生物分子(主要是蛋
白質)的濃度決定(Beuthan J， 0. Minet， J. Helfmann， M. Herrig和G. Muller. ， 1996，"生物細胞中折射率的空間變化"(The spatial variation of the refractive index in biological cells ) ， Phys. Med. Biol. 41:369-382):
",="。+ C, (19)
其中n。是溶劑的折射率，它是恆定的，大約等於細胞中的水的折射率。a
是比折射係數增量，對於蛋白質而言大約是0.0018，對於細胞中的其他溶質如
鈉而言是0.0016。 G是層i中的溶質的濃度(g/100ml)。雖然蛋白質和其他
溶質的折射係數增量類似，但是各層的折射率仍主要受到蛋白質的影響，這是
因為蛋白質的濃度(以每體積重量計)遠遠大於其他溶質。因此，均勻層i的
折身寸率變化A'近似形成一個分片連續函數(piece-wise continuous function):
A",=aAC, (20)
傳感容積內的加權折射率變化」仏是J仏與加權因子exp (-z/AZ。)的積分
乂Jz
(21)
從z二0到Z二①積分，在用式(7)取代A"(z)並進行重排後，我們得到
Awe = AC,
CC 一C C
(22)
由於在大多數情況下Z1"。是生物傳感器傳感的細胞的折射率的一小部分
(通常低於20%)，因此對於第一階(order)，有效折射率的變化是
AA^S(C)A"c (23)
其中，S (C)是對覆蓋介質(即細胞)的敏感度
TV
c 一w廣
JV2 《
(24)
dw是有效波導厚度，由下式計算:
57《# = A十Z
(25)
將方程9和ll代入方程12，得到以下檢測信號的方程:
A -Zw
緒=&
TV
Az廣
2
JV2
.1
(26)
方程26表明(i)有效折射率的變化以及由此導致的與所測入射角變化相關的光學特徵主要對傳感容積內的縱向物質再分布敏感；(ii)有效折射率的變化直接是刺激介導的蛋白質重新定位而導致的蛋白質濃度變化的函數，而不是離子運動如Ca2+流入和Ca2+流出的函數；(iii)與遠離傳感器表面相比，
靶標或某些物質的複合物向傳感器表面的重新定位對總響應貢獻更大；(iv)
光學特徵是一整合的信號，它是離開傳感器表面不同距離處發生的物質再分布的作用之和。由於細胞信號傳遞的複雜性，同不同靶標介導的不同細胞信號傳
遞的活化可能產生類似的總DMR信號。但是，由於參與特定信號傳遞的是一組獨特的細胞靶標，用一組預定選擇性抑制劑組介導進行抑制的方案提供了一種將特定刺激活化的細胞信號傳遞的特異性進行分類類的方法。
如上面所討論的，當細胞應答刺激時，入射角度或共振波長的改變主要由傳感容積內縱向物質再分布來決定。由於生物傳感器的橫向解析度差的緣故，橫向物質再分布可能難由這些改變來分辨。但是，因為光束和雷射束的限定寬度，因此當用平面波以角度oc。照射光柵時，可使用平面波分布來描述衍射的光，如RWLS理論部分所討論的。當沒有任何貼壁層存在時，由此發現P。處一個PWHM約為2兀/L的峰(根據光學不確定性原理計算)。使用這些方程構建的模型獲得了有趣的發現，這些發現表明共振峰(或譜)的形狀帶有關於物質分布的橫向不均勻性的有價值的信息。這種橫向不均勻性不強烈擾亂覆蓋介質的折射率，但明顯改變了共振峰的形狀。
已知某些外源信號可引起單細胞和多細胞水平的顯著的不對稱橫向物質再分布。例如，不同群體的細胞可對對細胞有毒性的化合物發出不一致的應答，而單個貼壁細胞在一些細胞過程中(如細胞遷移和浸潤)可經歷某些細胞靶標或分子集合體的不均勻分布。我們假定，當不對稱橫向物質再分布發生時，該再分布還可導致共振峰的細微結構和形狀發生改變。
d)細胞信號傳遞和細胞生理學中的動態物質再分布
活細胞由複雜的和動態的蛋白質絲狀網絡構成，該網絡稱為細胞骨架，在
58真核生物細胞的整個細胞質中延伸。細胞骨架參與執行不同的細胞活動，例如為維持細胞形狀提供抗張強度，為信號傳遞和通信提供"途徑"或"泊位"，和為細胞運動、胞內轉運和細胞分裂提供力量。有三種細胞骨架纖維肌動蛋白纖維、中間纖維和微管，各自執行不同的生物學功能。在這些纖維中，肌動蛋白纖維高度集中在質膜之下，因為它們保持細胞形狀、形成細胞質凸起，並參與-一些細胞與細胞或細胞與基質的連接、信號轉導和肌肉收縮。
已知在哺乳動物細胞中，大多數的胞內生物大分子通過纖維網絡基質高度組織化，並在空間上定位於相應的位置。此外，細胞蛋白質的定位受到緊密控制，以調節蛋白質相互作用的特異性和效率，從而在空間上隔開蛋白質活化和滅活機制，並確定特定的細胞功能和應答。在應答刺激時，根據信號傳遞的性質及其網絡相互作用、細胞狀況和細胞內容物，常常會發生細胞蛋白質的再定位，這種再定位有時是顯著的。蛋白質和分子集合體的再定位不僅對於細胞信號傳遞是重要的(通過實現精確控制信號的振幅、持續時間和動力學)，而且對於細胞功能如遷移、侵入、生長、周期、分化、生存和死亡也是重要的。
一個很好的例子是G蛋白偶聯受體(GPCR)信號傳遞。GPCR是膜結合蛋白質超家族。在未刺激細胞中，內源GPCR主要位於細胞表面上。在接觸配體後，細胞作出應答，產生受到胞內信號傳遞和調節機制緊密和精確控制的一系列時空事件。這些事件導致GPCR信號發出周期期間有序的、有引導的、定向的和動態的細胞內容物再分布。監測細胞內容物的動態再分布已提供了關於GPCR信號傳遞方面的認識，並提供了一個有力的篩選GPCR的手段。例如，激動劑刺激後P2-腎上腺素受體-GFP偶聯物再定位的直接展示引起了將這種方法作為直接篩選策略的興趣。這些通信試驗(trafficking assay)中的一種是得自Xsira Pharmaceuticals Inc (其前身是Norak Biosciences) 的Transfluor技術。這種技術使用高解析度螢光成像來監測響應某化合物的螢光標記的抑制蛋白的胞內定位。螢光標記的抑制蛋白的再定位可視為是激動剌激的指示。
許多這類事件在細胞的底部發生(這可由光學生物傳感器得以證實)，結果產生了與動態這類再分布(DMR)相關的光學信號。DMR信號是活細胞的新的生理學響應。理論分析表明，由入射角或波長轉移所示的光學特徵主要對傳感容積中的縱向物質再分布(稱為DMR)敏感，而涉及共振峰的形狀(如半最大值峰寬、強度和面積)的光學輸出參數則對剌激誘導的橫向物質再分布敏感。由於透入細胞層的攸逝波尾隨脈衝的指數性衰減，與靶標或某些物質的複合物遠離傳感器表面相比，當這些靶標或某些物質的複合物更接近傳感器表面時，
它們對總響應的貢獻更大。此外，向著傳感器表面移動的靶標或某些物質的復
合物的再定位導致信號增加，而遠離該表面移動的靶標或複合物的再定位則導
致信號下降。 -
已發現，通過特定靶標介導的D服信號依賴於細胞狀況如粘附程度，和細
胞狀態(state)(如增殖和靜息態狀態)。由於傳感器共振峰的寬度或位置
對細胞密度和活力敏感，因此可檢測可能顯著影響檢測結果的細胞的生物學狀
況(status)(如細胞活力、細胞密度和粘附程度)，由此提高檢測的再現性。定性評價一種給定方法是否適合系統生物學應用的三項主要內容是多元
化能力、多參數分析的能力以及定量系統應答特徵(profile)的能力。由於光學生物傳感器是無標記的和非侵入性的，因此基於生物傳感器的細胞檢測能夠多元化。例如，A431中，激動劑誘導的內源緩激肽B2受體(P2Y受體)以及蛋白酶活化受體(PAR)的活化產生類似的Gq-型光學特徵(圖66)。此外，由於光學生物傳感器提供了多響應的整合，特定靶標介導的DMR信號傳遞還可用於表徵其下遊的信號傳遞靶標。例如，A431中EGF誘導的DMR可用來表徵耙向其下遊耙標之一的MEK1的化合物(圖44)。這些結果表明基於生物傳感器的細胞檢測具有多元化特性。
光學生物傳感器為分析配體誘導的DMR響應提供了多個參數。這些參數包括對縱向物質再分布敏感的反射光角度或波長改變、和定義主要對橫向物質再分布敏感的共振峰形狀的參數。這些參數的組合還可提供關於配體對所檢測的細胞的作用的詳細信息(例子顯示在圖80、 84和85中，其中圖80涉及反應性氧物質信號傳遞，圖84涉及EGFR信號傳遞，圖85涉及緩激肽132信號傳遞)。此外，由於生物傳感器是非侵入性的，因此基於生物傳感器的細胞檢測可容易地與其它技術整合，例如與質譜和螢光成像整合。這些技術還可證實化合物或配體對細胞的作用。
特定靶標介導的DMR信號是一種整合的可定量的信號，它是得自離傳感器表面不同距離的位置上發生的物質再分布的作用之和。由於細胞信號傳遞的複雜性，不同靶標介導的不同細胞信號傳遞的活化可能產生類似的總DMR信號。但是，由於參與特定信號傳遞的是一組獨特的細胞靶標，用預定選擇性抑制劑介導抑制的方案提供了一種將特定刺激活化的細胞信號傳遞的特異性進行分類的方法。因此，可將DMR響應視為獨特的和理想的讀出數據，用於活細胞的系統生物學研究(例子顯示在涉及EGFR信號傳遞的圖38-47和涉及A431細胞PAR信號傳遞的圖71-79中)。這些研究顯示，對不同靶標的調節導致EGF誘導的DMR信號的不同減弱。在應答表皮生長因子(EGF)刺激時，發現靜息態A431細胞的DMR響應對於EGF濃度是可飽和的，且能夠完全被特定的強效EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478所抑制。各種已知抑制劑/藥物對靜息態A431細胞的DMR響應的作用主要將細胞響應與主要通過MEK進行的Ras/有絲分裂原活化的蛋白(MAP)激酶途徑聯繫起來。
5.細胞檢測
公開了光學無標記生物傳感器進行任何細胞檢測的用途和方法，例如檢測細胞死亡、檢測細胞增殖、檢測受體活化或抑制、檢測細胞膜完整性、檢測脂質體信號傳遞、檢測細胞信號傳遞、檢測反應性物質信號傳遞、評估細胞氧化還原態的檢測、研究不同靶標之間的交叉通話的檢測、使用終點測量值的高通量化合物篩選試驗、以及檢測核信號傳遞或活性，或者例如檢測細胞骨架重構。這些檢測使用到一個或多個生物傳感器輸出參數，所述參數可用於形成該檢測的特徵或可用來根據檢測以及一個或多個步驟作出決定。
生物傳感器可產生的不同形式的輸出值，例如像素、角度改變或波長改變。該輸出值可是輸出數據的形式，該輸出數據是一種輸出信息，是就一組特定條件採集的數據，可保存或實時分析。當使用時，生物傳感器產生數據輸出，該數據輸出通常以圖形的方式呈現，例如響應單位與時間相關的圖(作為一個例子，可見圖6A以及本文公開的許多其它附圖)。當使用角度訊問檢測系統時，響應單位可以是角度變化(以度計)，或當使用波長訊問檢測系統時，響應單位是波長改變(以皮米計)，或當使用利用CCD照相機的角度訊問檢測系統來採集生物傳感器的共振帶圖像時，響應單位是像素位置遷移(以像素計)。此外，當採用給定模式的共振峰譜時，響應單位可以是作為入射耦合角(見圖6B)或波長的函數的入射耦合光的強度。在另一實施方式中，當使用利用CCD照相機的角度訊問檢測系統來採集生物傳感器的共振帶圖像時(見圖6C)，響應單位可以像素中的位置或位置強度。生物傳感器輸出參數或生物傳感器輸出數據參數分別是生物傳感器輸出值或輸出數據的任意特徵，可測量這些特徵，並可使用它們分析生物傳感器輸出值或生物傳感器輸出數據。在某些實施方式中，生物傳感器輸出參數還可以是可鑑定的並可在多個檢測中通用的特徵。特徵可
61以是任意的生物傳感器輸出參數或參數組合，可作為特定檢測的表徵。例如，特徵可採用刺激事件後峰值強度，或可以是刺激事件後峰值強度的位置，或可以是半最大峰值強度的位置。該信號然後可用於例如比較兩種不同化合物對細胞培養物的影響，或單個化合物對兩種不同的細胞培養物的影響，而不是用於比較全部輸出數據。因此，特徵可出現在單個時間點或單個波長或單個波角度或它們的任意組合，這取決於所檢測的是什麼(見上述關於響應單元的討論)。
a)生物傳感器輸出參數
圖6描述了可使用的大量不同的生物傳感器輸出參數。例如，定義細胞內刺激誘導的定向物質再分布的動力學的六個參數可以是總動態(即形狀)，響
應階段(在此具體實施例中，有三個涉及細胞響應的主要階段正向物質再分
布(P-DMR，圖6A的C點到D點)、淨零定向物質再分布(net— zero DMR，圖6A的D點到E點)和逆向物質再分布(N-DMR，圖6A的E點到F點到G點))，各階段的動力學、總持續時間，P-畫R階段和N-鹿R階段兩者的總振幅，和P-D服階段到N-D服階段的過渡時間t (圖6A)。其它生物傳感器輸出參數可由共振峰獲得(圖6B)。例如，可使用峰位置、強度、峰形狀和半最大值峰寬(P冊M)(圖6B)。生物傳感器輸出參數還可從生物傳感器的共振帶圖像獲得。使用陣列式角度訊問系統獲得數據，這些數據闡述另外5種特徵帶形狀、位置、強度、分布和寬度。對於使用本文所公開的生物傳感器的任意細胞檢測的任意給定應用，所有這些參數可分別或一起使用。任意亞組或組合中這些參數的使用可為給定檢測或特定檢測中的給定變化提供一特徵，如細胞受體檢測的特徵，以及為之後的基於EGF受體的檢測提供特定的特徵。
(1)與剌激誘導的定向物質再分布動力學相關的參數
有大量的生物傳感器輸出參數與刺激階段的DMR的動力學相關。這些參數著眼於對細胞施加刺激事件時生物傳感器數據輸出發生變化的速率。刺激事件是可改變細胞狀態的任何事件，如將分子加到培養基中、從培養基中除去分子、溫度變化或pH變化、輻射細胞。刺激事件可產生刺激效果，這種效果可以是刺激事件導致的細胞的任意效果，如定向物質再分布。刺激事件可以是化合物、化學的、生化的或生物學的以及聚合物。生化的或生物學的刺激事件可以是肽、合成肽或天然肽。例如，許多不同的肽以信號分子起作用，包括促炎肽緩激肽、緊張肽。雖然這三種蛋白質的序列和生理學不同，且通過不同的細胞表面受體起作用，但是它們具有同一類細胞表面受體，即G蛋白偶聯的受體(G0CR) 。 GPCR的其它多肽配體包括血管升壓素、催產素、促生長素抑制素、神經肽Y、 GnRH、促黃體生成激素、促卵泡激素、甲狀旁腺素、增食因子(orexins)、硬骨魚緊張肽II、內啡肽、腦啡肽以及其它配體。GPCR是一廣譜且多樣的基因家族，它們不僅應答肽配體，還應答小分子神經遞質(乙醯膽鹼、多巴胺、5-羥色胺和腎上腺素)、光、臭氣物質、味道、脂質體、核苷酸和離子。GPCR使用的主要的信號傳遞機制是與與下遊次級信使系統(包括胞內鈣釋放和cAMP生產)相連的G蛋白GTP酶蛋白相互作用。肽GPCR使用的胞內信號傳遞系統與所有GPCR使用的那些系統類似，通常根據它們與之相互作用的G蛋白以及所活化的次級信使系統將它們歸類。對於Gs偶聯的GPCR，受體引起的G蛋白Gs的活化刺激了下遊的腺苷酸環化酶活化和cAMP的生產，而Gi偶聯的受體則抑制cAMP的生產。cAMP生產的一個關鍵結果是蛋白酶A的活化。Gq偶聯的受體刺激磷脂酶C，釋放IP3和二醯基甘油。IP3結合ER中的受體，引起胞內鈣釋放，結果活化了蛋白激酶C、鈣調蛋白依賴性途徑。除了這些GPCR次級信使信號傳遞系統外，GPCR途徑還表現出與包括酪氨酸激酶生長因子受體和map激酶途徑在內的其它信號傳遞途徑的串話。受體酪氨酸激酶如EGF受體或粘著斑複合物(focal adhesion complex)的轉激活可通過銜接蛋白Shc、 Grb2和Sos以及下遊Map激酶活化的Erkl和Erk2來刺激ras活化。Src激酶還可在ras和map激酶途徑中通過GPCR起到必需的中間角色作用。
發生一些剌激事件而數據輸出沒有發生變化是可能的。這種情況仍舊是一種刺激事件，因為細胞的狀態已經以某些可能已導致定向物質再分布或導致細胞或細胞培養物發生變化的方式發生了改變。
應理解，可如本文所公開的測定任意檢測或任意細胞狀態的特定特徵。本文公開了許多不同檢測的"特徵"，但對於本文所實施的任意檢測，該檢測的"特徵"可被測定。任意給定的檢測可存在一種以上的"特徵"，而各特徵都可如本文所述被測定。在採集生物傳感器輸出數據並考慮一個或多個參數後，可獲得給定檢測的信號。可能需要進行多個實驗，以鑑定最佳的特徵，且也可能需要在不同條件下進行實驗，以找出最佳的特徵，但這都是可以實現的。應理解，本文所公開的任意方法可具有"鑑定"或"測定"或"提供"例如加給
63這些方法的特徵的步驟。
(a) 總體動態
可以考慮的一個參數是數據輸出的總動態學特徵。該總動態學參數觀察數 據收集的全部動力學圖像。可觀察的總動態學的一個方面是數據輸出隨時間而 產生的曲線形狀的改變。因此，數據輸出產生的曲線形狀在發生剌激事件後可 能變化或維持不便。
變化的方向表明整個物質分布；例如，正向DMR (P-DMR)階段表明在傳感 器的攸逝波尾隨脈衝內的質量增加；淨-零DMR表明傳感器攸逝波尾隨脈衝內 質量幾乎沒有淨值變化；而逆向DMR表明傳感器攸逝波尾隨脈衝內質量淨值降 低。使用光學生物傳感器獲得的刺激誘導的細胞響應的總態可由單階段(P-DMR 或N-DMR或淨-零DMR)、或兩階段(如兩個階段可以是這三個階段的任意組合)、 或三階段、或多階段(如在時間過程中可出現一個以上N-DMR)組成。
(b) 響應階段
可觀測到的作為時間的函數的另一參數是數據輸出中出現的階段變化。無 標記生物傳感器產生可作圖(將是一曲線)的數據輸出。該曲線將在例如數據 從增加狀態轉變為減少狀態或從減少轉變為增加的數據處具有拐點。這些變化 稱為階段過渡，發生的時間以及它們的形狀可用作例如生物傳感器輸出參數。 例如，存在正向物質再分布(P-DMR)、淨零定向物質再分布(net — zeroDMR) 和逆向物質再分布(N-DMR) 。 P-DMR、 N-畫R和NZ-DMR的振幅可分別測量為生 物傳感器輸出參數(例如可參見圖6A和圖7)。
(c) 動力學
另一生物傳感器輸出參數可以是數據輸出的任意方面的動力學，例如，完 成階段過渡的速率；例如，階段過渡多快能夠完成或數據輸出花費多長時間結 束。可測量的動力學的另一例子是全部階段的數據輸出所花費的時間長度。另 一例子是一個或兩個P-DMR和N-DMR階段的總持續時間。另一例子是獲取一個 或兩個P-DMR和N-DMR階段的總振幅所需的速率或時間。另一例子是從P-D服 到N-D服階段的過渡時間T (圖6A，其它圖也提供了所有這些類型的動力學參 數的許多例子)。也可測量P-DMR和N-DMR事件或階段兩者的動力學。例如，用表皮生長因子(EGF)刺激人靜息態人表皮樣癌A431產生了由至少三個階段 組成的動力學響應，如圖6A和7A所示。如圖6A和7A所證明，EGF濃度越高， P-DMR和N-函R兩者的信號振幅越大，P-DMR和N-DMR事件也都越快，從P-DMR 到N-DMR事件的過渡時間也越短。當P-DMR事件的振幅顯示與EGF濃度具有復 雜的關係時，N-DMR信號的振幅清楚顯示對EGF濃度是可飽和的，產生 1. 45nM 的EC5。(見圖7B)。發現以秒計的過渡時間T隨著EGF濃度C的增加而指數性下 降(見圖7C)。此外，N-畫R信號的衰減可用非線性回歸擬合。所獲得的單階 段衰減常數K也是可飽和的，產生5. 76nM的Kd (見圖7D)。
(2)共振峰相關的參數
給定導向模式的共振峰是一類通過觀測例如光強度與光耦合到生物傳感 器中的角度，或光強度與光耦合到生物傳感器中的波長而產生的數據輸出。光 學波導光模式譜是一類觀測光強度與光耦合到傳感器中角度而產生的數據輸
出，這是如下測得的使用多種角度的光照射生物傳感器並監測作為角度函數 的耦合光的強度。在此光譜中，多個導向模式的多個共振峰同時出現。由於共
振峰和OWLS光譜所基於的原理相同，因此可交替使用給定導向模式的共振峰 或多個導向模式的OWLS光譜。在生物傳感器中，當發生特定波長的光或產生 了以特定角度撞擊生物傳感器的光時，從光源發出的光耦合到生物傳感器中， 這種耦合增強了生物傳感器產生的信號。作為耦合光角度或波長的函數的這種 強度變化被稱為共振峰(例如參見圖6B)。傳感器的不同給定模式可產生具有 不同特徵的類似共振峰。有大量的定義給定模式的共振峰或共振光譜的不同參 數，這些參數與這種峰相關聯可用來評估DMR或細胞效應。下文討論和這些參 數的一個亞組。
(a)峰位置
當繪製數據輸出圖時，在例如光耦合進入生物傳感器的特定波長或特定的 入射角處出現共振峰的最高峰。由於應答刺激事件而發生的物質再分布或細胞 事件的緣故，峰出現的角度或波長的位置可能發生改變。例如，在特定受體如 EGF受體的潛在生長因子的存在下，培養細胞的共振峰的位置可增加或降低耦 合的角度或耦合的波長，這將導致共振峰的中心位置發生改變。應理解，可測 量峰值強度的位置，而且這個位置也是個很好測量的點，也可測量該共振峰上的任意點的位置，例如測量75%峰值強度或50%峰值強度或25%峰值強度或 66%峰值強度或45%峰值強度(應認為公開了 1一100%峰值強度範圍內的所 有水平的峰值強度)的位置。但是，當使用除峰值強度之外的一個點時，總會 有一個在峰值強度之前和一個在峰值強度之後的例如45%峰值強度的位置。因 此，對於任意強度，除了峰值強度之外，峰內總是會存在兩個該強度的位置。 可使用這些非峰值強度的位置作為生物傳感器輸出參數，而人們僅需要知道該 強度的位置是在峰值強度之前還是之後即可。
(b)強度
與共振峰特定強度的位置可用作生物傳感器輸出參數一樣，強度自身的量 也可作為生物傳感器輸出參數。 一個特別相關的強度是給定模式共振峰的最大 強度。與位置一樣，最大強度的大小在對細胞或細胞培養物具有特定作用的刺 激事件存在下可發生變化，且這種變化可可測量並用作特徵。與共振峰值位置 一樣，也可測量峰內任意強度或位置的共振峰強度。例如，最大強度的50%或 最大強度的30%或最大強度的70%或最大強度的1一100%之間的任意百分數 的強度可用作生物傳感器輸出參數。同樣地，與強度的位置類似，如果使用最 大強度之外的強度，例如45%最大強度，在共振峰內也總會存在兩個此強度位 置。與強度位置參數相同，可也使用非最大強度而僅需考慮該強度是最大強度 之前還是之後的強度。
例如，原細胞覆蓋率約為50% (在 50%的覆蓋率，傳感器表面上的細胞 往往產生最大PWHM值)時，抑制劑和活化劑的存在並培養後都會導致覆蓋率 覆蓋率半最大值峰寬(PWHM)下降；但是，另一生物傳感器輸出數據，例如總 角度變化(即共振峰中心位置)可用來區分是抑制劑，是活化劑還是根本沒有 作用的分子。PW麗是峰上最大強度(高度)的一半處兩點之間的連線的長度， 如圖6B所示。當所有傳感器上的細胞密度基本相同或近乎相同時，與細胞根 本沒有被處理的傳感器相比，抑制劑(例如細胞增殖的抑制劑)引起的角度改 變往往小於根本沒有處理的細胞的角度改變，而活化劑引起的角度改變則往往 大於無處理細胞的改變。如果所有化合物的濃度都相同，則可通過它們對PWHM 值的影響而確定它們抑制(作為抑制劑)或刺激(作為活化劑)細胞增殖的潛 力或能力。結合共振峰中心位置的變化，PWHM變化的預定值可用於篩選出抑制 劑或活化劑。根據用於檢測給定模式的共振峰的訊問系統，PW腿值的單位可以
66不同。PWHM變化的程度可以是例如一千分之一、二千分之一、三千分之一、五
千分之一、七千分之一、或萬分之一。
(c)峰形狀
可使用的另一生物傳感器輸出參數是整個峰的形狀或某些強度之間或某 些強度處的峰的形狀。例如，最大峰強度一半處的峰的形狀或任意其它強度(如
30%、 40%、 70%或88%，或20—100%之間的任意百分數)的峰形狀可用作 生物傳感器輸出參數。該形狀可通過特定強度之下或之上的峰面積來表徵。例 如，在最大峰強度一半處有一個峰值強度之前的點和一個峰值強度之後的點。 可在這兩個點之間畫條線，可確定共振峰內這條線之上的面積或共振峰內這條 線之下的面積，形成生物傳感器輸出參數。應理解，給定峰的積分面積也可用 來分析化合物對細胞的作用。
另一與性質相關的生物傳感器輸出參數是特定峰強度的共振峰寬度。例 如，通過測量共振峰上峰值強度之前的50%峰值強度點峰值強度之後的50% 峰值強度點之間連線的長度來確定最大峰強度一半處的共振峰寬度(HMPW)。 然後可將該測量值用作生物傳感器輸出參數。應理解，可通過這種方式測定20 %到100%峰值強度之間的任意強度的共振峰寬度。(這方面的實施例可見全 部的附圖，例如圖6B)。
(3)涉及生物傳感器共振帶圖像的參數
迄今為止，大多數的光學生物傳感器監測靶分子與固定在傳感器表面上的 探針分子之間的結合、傳感器表面上細胞附著或或細胞活力(一次一種監測)。 對於多個生物傳感器上的結合事件或細胞附著或細胞活力，研究者通常在時間 上依次監測這些事件。因此，很難進行不同傳感器之間的直接比較。此外，不 論是波長訊問還是角度訊問，這些檢測系統都使用小光點(small spot)( 100 — 500^im直徑)雷射來照射傳感器。響應或共振峰代表了照射區域細胞響應 的平均值。對於96孔生物傳感器微板(如康寧的Epic微板)，各RWG傳感器 大約是3X3mm2，並位於各孔的底部，而對於384孔微板形式，傳感器的直徑 通常為lXlmm2。因此，使用當前的傳感器技術獲得的響應僅代表少部分的傳 感器表面。理想的是，檢測系統應不僅允許同時監測粘附在多個生物傳感器上 的活細胞的響應，還應允許來自各個傳感器上相對較大區域或多個區域的信號問詢。
通過成像光學訊問系統(如CCD照相機)獲得的共振帶是一類觀測例如單 個傳感器上確定的位置處反射(如出耦合)光的強度與物理位置而獲得的數據 輸出。將反射光直接與入偶合光相關聯。或者，可通過掃描訊問系統以使用小 雷射光點照射傳感器、以一維或二維掃描整個傳感器、然後收集給定導向模式 的共振峰的方式收集共振帶。作為傳感器內位置的函數的共振峰或光強度最終 可重新組合，形成傳感器的共振帶。在生物傳感器中，當出現光的特定波長， 或當產生以特定角度撞擊生物傳感器的光時，出耦合(outco叩led)的光作為 傳感器表面上/附近的折射率變化的函數而改變，這種改變導致成像系統採集 的各傳感器的共振帶的特徵發生改變。此外，使用共振帶可直接展示培養後細 胞在整個傳感器表面上的不均勻附著(例如，見圖l所示的環狀共振帶)。在 理想的多孔生物傳感器微板中，各傳感器的位置的相對關係便於與其它生物傳 感器標準化(歸一化)，即各傳感器依微板上各孔的中心行對齊、列對齊。因 此，所獲得的共振帶圖像可用作細胞粘附或應答刺激的細胞變化的內部參考。 因此，給定模式的各傳感器的這種共振帶提供了另額外與共振帶相關的參數以 用來評估DMR或細胞作用。下文討論了這些參數的一個亞組。
(a) 帶形狀
可使用的另一生物傳感器輸出參數是給定模式的各生物傳感器的共振帶 的形狀。該形狀有各傳感器大面積上的強度分布來限定。如圖l和本文其它附 圖所示，可使用該形狀指示大面積上附著細胞的均勻性或應答刺激的細胞變化 (例如，如圖1所示，各共振帶代表 200mmX3000mm的整個傳感器的響應。
(b) 位置
與給定模式的各傳感器的共振峰的位置類似，可將各共振帶的位置作為生 物傳感器輸出參數。可使用成像軟體定量強度，以產生各帶最大強度的中心位 置。該位置可用來檢測應答刺激或化合物處理的細胞變化。
(c) 強度
與共振帶的位置一樣，使用成像系統採集的出耦合光的強度可作為生物傳 感器輸出參數。整個帶的平均強度或各成像帶中各像素的絕對強度可用來檢測
68細胞附著的質量和評估細胞響應。
(d) 分布
採用成像系統採集的具有特定角度或波長的出耦合光的分布可作為生物 傳感器輸出參數。此參數可用於評估沒有固定細胞或探針分子時傳感器自身的 表面特徵，並用於檢測傳感器表面整個照射面積上細胞附著的質量。此外，當 整個區域的細胞密度相同時，此參數可用於檢測化合物對細胞的影響的一致 性；或當在照射面積中一個區域的細胞密度不同於另一個區域的密度時，此參 數可用於檢測細胞密度對化合物誘導的細胞響應的影響。
(e) 寬度
與給定模式的共振峰的PWHM相同，使用成像系統獲得的共振帶的寬度可 用作生物傳感器輸出參數。此參數具有幾乎與共振峰的PWHM值完全相同的特 徵及有用的信息內容，但與共振峰僅存在一個P冊M不同的是，人們可獲得該 傳感器照射面積多個區域的多個帶寬。與採用共振帶圖像獲得的其它參數類 似，該寬度可用於上述應用。
對於使用本文所公開的生物傳感器的任何細胞檢測的任何給定應用，所有 這些參數可獨立或一起使用。參數以各種亞組合或組合形式的使用可為給定檢 測或特定檢測的給定變化提供特徵(如細胞受體檢測特徵)，以及為之後的基 於EGF受體的檢測的特定特徵。
b)細胞和細胞內容物操作
細胞是生物系統的基礎結構單元。因此，理解細胞對於理解亞細胞現象(如 細胞生物學、生物化學和分子生物學)和多細胞現象(如生理學)是必需的。 通過分析細胞，生物學家已認識到不同靶分子之間的許多複雜的功能性關係。 靶分子可以是任意生物學分子，包括DNA、 RNA、脂質體、蛋白質和碳水化合物 等，以及這些分子的集合體。此外，生物學家也已知道使用細胞來理解基本細 胞生物學原理和篩選治療人類疾病、提高人健康的藥物候選物的價值。
使用光學生物傳感器可分析細胞或將細胞用於分析。本質上，待分析的細 胞可以是任意細胞類型。可在所公開的任一方法中分析任意類型的細胞。待分 析的細胞可直接獲得自生物體或體外培養的細胞。具有耙標的細胞可以是任意從生殖細胞系或體細胞系、全能或多能細胞、分裂或未分裂細胞、軟組織細胞 或上皮細胞、無限增殖或轉化的細胞。迄今為止，已有許多現成穩定的無限增 殖細胞系。這些穩定的細胞系衍生自許多不同的生物體、組織和發育階段。可 從美國典型培養物保藏中心以及其它保藏中心獲得這一大類細胞的樣品。細胞 通常包括所有至少部分被膜雙層結構所包圍並能複製和分裂成兩個或多個實 體的生物體或其後代。
細胞的例子包括真核生物細胞，即具有細胞核的細胞，包括從動物、植物、 真菌、酵母和原生動物的細胞；無核細胞或其突變衍生物或後代，如網織紅血 球和成熟的紅血球等；其去核衍生物；以及前述任意細胞的融合細胞。此外， 細胞可包括配子，如蛋、精子等。細胞還可包括原核生物，如細菌和結構菌 (archactacteria)。
合適的細胞可來自任何合適的生物體，包括為了研究(如基礎的、臨床和 生物技術研究)、藥物設計、藥物開發、和/或其它經濟、政治或人道主義理 由而進行研究的任意生物體。示例性的生物體包括哺乳動物，如猿、貓、母牛、 狗、馬、人、猴、小鼠、豬和綿羊等。示例性的生物體還包括非哺乳動物類脊
椎動物，如鳥、爬行動物、兩棲動物(如青蛙，如爪蟾(Xenopus laevis))， 和魚(如kout、鮭魚、金魚和斑馬魚)等。示例性的生物體還不堪非哺乳動物 無脊椎動物，如果蠅物種(如D. melanogaster和D. simulans)、線蟲類(如 C. elegans)、海月旦類(如Strongylocentrotus purpuratus)禾口粘液菌類(如 Dictyostelium discoideum)。示例性的生物體還不堪單細胞真核生物，如酵 母(如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)禾口白色念球菌(Candida albicans)) 和原生動物(如致病性或非致病性原生動物)。示例性生物體還包括植物，如 擬南芥(Arabidopsis thaliana)、稻米、玉米、馬鈴薯、豆、火炬松以及非 脈管植物。
合適的細胞可以是直接獲自野生型、突變型、轉基因、嵌合受精卵、桑椹 胚、囊胚、胚胎、胎兒、新生兒、青少年、成年或任何生物體的其它發育階段 的初級細胞(primary cell)。初級細胞可起源自不同的細胞類型、組織、器 官或生物體的各區域，或可以是它們的混合物。例子包括血液幹細胞、B-和T-淋巴細胞、紅血球、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、粒細胞、巨核 細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、膠質細胞、星形細胞、成神經細胞、神經元、骨骼成肌細胞或肌小管。平滑肌成肌細胞、心臟成肌細胞、成纖維細胞、成骨細 胞、骨細胞、內分泌細胞、外分泌細胞、內皮細胞、角化細胞、軟骨細胞、衍 生自內胚層、中胚層或外胚層的細胞，和/或胚胎外衍生物，如滋養層。
合適的細胞可得自任何來源的一種或多種組織。組織通常包括生物體中臨 時或穩定地空間上接近的各種細胞群體，或其培養的外植體。這種空間接近可 天然發生和/或人工形成，可代表天然或正常的狀態和/或誘導的或患病狀態 等。人工形成的接近可包括移植、植入的和/或移植的組織(包括器官或組織 移植、異種移植物、同種異體移植物等)和從個體生物體內取出的組織，如皮 膚移植物等。患病組織包括由於(1)遺傳缺陷；(2)環境損害，如汙染物、 毒素或輻射；(3)生長失控；(4)異常分化；(5)異常細胞遷移；(6)感 染，如被病毒、細菌、原生動物、酵母、真菌和/或寄生蟲的感染；或(7)它 們的任意組合而導致異常的組織。
適用於本發明的示例性患病組織是採用外科手術獲得的或從液體吸出物 (針刺活組織檢査)獲得的腫瘤材料。組織可以是獲自野生型、突變型、轉基 因、嵌合受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成年生物體 的任意組織。合適的出生後組織例子包括(1)肌肉，包括心肌、平滑肌和骨 骼肌；(2)獲自中樞神經系統或外周神經系統如脊髓或腦的神經組織；(3) 其它心臟組織；(4)腎；(5)肝；(6)脾；消化系統的任意部分，包括食 道、胃、小腸和大腸，和結腸；(a)胰腺；(9)膀胱；(10)循環系統組織， 包括心臟、靜脈、動脈和造血系統的細胞；(11)免疫組織，如胸腺和淋巴結； (12)腎上腺；(13)骨；(14)軟骨；和(15)各種上皮組織，如乳房上皮 等等。組織還包括上述各種組織的天然或人為的組合。
在將其用於光學生物傳感器之前，可將組織部分或完全分散成單個細胞， 或者可將塗布在整個傳感器上或某些部分上。
本發明的一些應用適用於使用得自出生前或出生後的人或其它動物的細 胞進行的臨床診斷。出生前細胞的例子包括得自羊水、卵裂球、絨毛膜絨毛、 胎兒血和其它胎兒組織的細胞。出生後的細胞例子包括得自骨髓吸出的淋巴細 液、全血、血清、血漿、胸腔積液、皮膚活檢組織、腫瘤活檢組織或外科手術 的細胞。出生後細胞的其它例子包括得自體液和/或分泌物如尿、糞便、唾液、 粘液、痰、眼淚、汗液、精液、脊髓液、乳液、唾液等的細胞，或從前述組織 獲得的細胞。除從原代細胞和組織或其培養衍生物獲得外，合適的細胞還可得自已建立 的細胞系。這些己建立的細胞系可採用任何合適的方法製備，包括病毒、致癌 的、物理的、化學的、突變的、自發的和/或轉基因(kansgenic)轉化。此外， 細胞可包括經合適方法改變的已建立的細胞系的已鑑定或未鑑定的衍生物，所 述方法例如遺傳改造(如通過物理的和/或化學的處理、輻射、轉介 (transaction)、傳染或注射)和外遺傳的修飾(如通過甲基化或其它分子 修飾、kansposon功能、染色體印記、酵母雜交類型轉換和/或端粒沉默)。
細胞可以是幹細胞或巳分化細胞。已分化細胞類型包括脂肪細胞、成纖維 細胞、肌細胞、心肌細胞、內皮細胞、神經元、神經膠質、血細胞、巨核細胞、 淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、肥大細 胞、白細胞、粒細胞、角化細胞、軟骨細胞、造骨細胞、破骨細胞、肝細胞、 以及內分泌或外分泌腺的細胞。幹細胞可以是最近從捐獻者獲得的幹細胞，在 某些優選實施例中，幹細胞是自體幹細胞。幹細胞還可以得自已建立的體外繁 殖的幹細胞系。合適的幹細胞包括胚胎幹細胞和成人幹細胞，不論是全能、多 能還是較低發育能力的幹細胞。幹細胞優選得自哺乳動物的幹細胞，如齧齒動 物(如小鼠或大鼠)、靈長類動物(如猴、黑猩猩或人)、豬和反芻動物(如 母牛、綿羊和山羊)。
通常，根據其起源、基因型、無限增殖化方法、培養條件和曾經所在的環 境，各細胞系具有不同的特徵。因此，沒有一個細胞系適用於所有的實驗或化 合物篩選。例如，特定靶標的表達水平在不同細胞類型中可能明顯不同；在一 些例子中，通過特定靶標(如EGFR)的信號傳遞途徑在不同細胞類型中明顯不 同。因此，可以看到，通過特定靶標產生效果的調節物可能產生極其不同的細 胞響應(包括物質再分布)。由於某些原因，可能需要對特定類型的細胞進行 遺傳再造從而使得特定靶標能夠被受控表達或減少或剔除，在一些情況下，可 對特定的信號傳遞途徑進行幹預。有許多現有技術可產生這種遺傳再造的細 胞。例如，在轉染試劑或其它物理方法的幫助下，用靶基因或耙分子轉染可使 特定靶標的表達水平增加，而用抗靶標抗體或反義、反靶標基因寡核苷酸及其 衍生物，或肽抑制劑，或幹擾RNA (RNAi)轉染細胞則可抑制靶標分子。此外， 需要新的技術來確定依賴於細胞環境的細胞信號傳遞或細胞響應。受體酪氨酸 激酶信號傳遞很好地闡述了細胞信號傳遞對細胞環境的依賴性。因應答RTK刺 激而在細胞表面產生的信號強烈依賴於細胞環境。當在不同的細胞或在特定細
72胞系的不同分化階段中表達時，相同的RTK將誘導完全不同的響應(見J. Schlessinger的綜述"受體酪氨酸激酶引起的細胞信號發出"(Cell signaling by rec印tor tyrosine kinases) ， Cell 2000， 103， 211-225)。例如，在 早期發育階段，FGFR1在控制細胞遷移(中胚層模式形成(patterning)和原 胚層形成起關鍵作用的一個過程)等方面起到重要作用。另一方面，刺激成纖 維細胞中的FGFR1將導致細胞增殖，而刺激神經元細胞中表達的FGFR1則誘導 細胞生存和分化。對於這些觀察結果，最合理的解釋是不同細胞表達介導這些 不同響應的細胞類型特異性效應蛋白和轉錄因子。根據這一觀點，RTK及其信 號傳遞途徑能夠加入到多個過程中，從而在不同細胞環境中調節不同的效應蛋 白和轉錄因子的活性。換言之，獲得了 RTK活化的信號傳遞盒，用於應它們的 激活，將信息由細胞表面傳遞到細胞核和其它細胞區室。
術語"培養"包括將細胞置於各種條件下。雖然"培養"細胞常常指使一 個或多個細胞活著或生長，但在某些情況下，在一種或多種條件下培養細胞可 實際上殺死一個或多個細胞。
c) 一般方法步驟
進行本文公開的細胞檢測的一般方法可參見圖8。在此一般方法中，人們 可提供無標記光學生物傳感器(801)。然後，直接將細胞培養在此生物傳感 器上(802)，直到獲得所需的覆蓋率(從1%到100%以及這兩個數值之間的 各百分比的覆蓋率)。然後，任選地，可添加緩衝溶液(803)。還可將待測 的化合物或組合物加到培養在生物傳感器上細胞中。這是一個刺激事件(804)。 然後，使用本文所述的各種生物傳感器輸出參數，可訊問該生物傳感器，並收 集數據，從而可監測細胞對刺激事件的響應(504)。
總的來說，在此公開的是使用無標記生物傳感器(如光學非標記依賴性檢 測(LID)生物傳感器)實施基於活細胞的檢測，以監測粘附在該光學LID生 物傳感器上的活細胞內物質再分布。總的來說，所公開的方法可包括大量的不 同的步驟。例如，該方法可包括提供無標記光學生物傳感器，如光學LID生物 傳感器。該方法一般還涉及在本文所討論的生物傳感器上培養細胞。細胞的培 養通常在可覆蓋光學生物傳感器的細胞培養基中進行。在某些實施方式中，細 胞可附著到生物傳感器的表面，就象它們附著到例如培養皿上一樣。當細胞培 養在生物傳感器上時，它們可生長到如本文所討論的任何覆蓋率，然後可對這些細胞實施各種檢測。例如，可將細胞與測試化合物或一組測試化合物或組合 物(如調節物，如受體的激動劑或拮抗劑或信號轉導途徑的活化劑或抑制劑， 或潛在的調節物、激動劑、拮抗劑、活化劑或抑制劑) 一起培養，以測定這些 化合物或組合物對細胞或對細胞內的特定靶標的影響。調節物可以是任何增強 或降低特定事件的分子。激動劑是諸如化合物或組合物之類的分子，它以天然 配體影響該受體的方式的相關方式影響該受體。通常，這會啟動該受體或將其 活化。拮抗劑是一種分子(如化合物)或組合物，它以導致天然配體的作用減 弱或消除的方式作用於受體。通常，拮抗劑是受體的抑制劑或阻遏物。應理解， 有些激動劑在天然配體或配體類似物不存在的情況下起作用，而另一些則在配 體或配體類似物的存在下起作用。例如，拮抗劑可以是天然配體的競爭性抑制 劑，或者可以是非競爭性抑制劑。
在細胞培養過程中的任意時間點，可按照預先設定使用生物傳感器檢測細 胞，例如提供特定光譜或特定角度的光。可以各種方法收集生物傳感器的輸出， 包括時間依賴性方式。例如，可實施這樣的步驟訊問光學LID生物傳感器以 獲得指示活細胞內物質再分布的時間依賴性光學應答，由此可監測活細胞內激
動劑誘導的GPCR活化。
可在各種方法實施過程中的任意時間點實施至少一次將緩衝溶液加到光 學LID生物傳感器上的細胞培養基中的步驟。這些緩衝液可用來使培養基或生 物傳感器或細胞穩定。通常根據調節物一靶標相互作用或刺激事件一靶標相互 作用來選用緩衝液，以實現最佳的檢測結果。
還應理解，可採用這些方法來篩選調節(即活化或抑制)活細胞信號轉導 途徑、調節特定細胞表面受體如GPCR或EGFR的分子。
還應理解，在某些實施方式中，可以平行或依次的方式進行用一種以上化 合物的孵育。例如，可將一種生物傳感器-細胞培養物複合物與一種已知調節 物一起培育，由此產生本文所述由一組參數的組成的特定特徵，然後可將另一 化合物或組合物與該生物傳感器-細胞-調節物混合物一起培育，通常在訊問 後，通過尋找該生物傳感器的特徵或其輸出數據的變化來確定該化合物對調節 劑活性的影響。應理解，涉及化合物或緩衝液的所有步驟可以逐漸增量的方式 進行，以找出組合物的濃度對生物傳感器輸出的影響。
可使用本文所述的各種生物傳感器實施這些方法，但可將一特定生物傳感 器製成自參考的生物傳感器，這種生物傳感器是一種不僅能夠收集細胞檢測的輸出數據，而且還能夠收集相對於從該生物傳感器上收集到的數據的對照數 據。這可通過許多方式實現，包括使用阻止培養細胞附著的粘貼物(stamp) 封閉光學LID生物傳感器的一部分表面，然後將包含在細胞培養基中的活細胞 加到該光學LID生物傳感器上未被封閉的那部分表面，使活細胞能夠附著到這 部分未被封閉的表面；然後從該光學LID生物傳感器表面上移除所述粘貼物。
自參考方法的一個變化形式是在第一次培養的細胞已粘附到生物傳感器 之後移除該粘貼物，然後將加入第二細胞培養基，以在生物傳感器上之前被粘 貼物所保護的位置上產生第二細胞培養物。第二種細胞可以是不同類型的細 胞，或可以是相同類型但處於不同階段的細胞等，但第二種細胞的培養與第一 種細胞不相關。應理解，有多少粘貼物，這樣的操作就可以進行多少次。因此， 例如，如果在生物傳感器上已使用了四個分開的粘貼物，那麼如果依次去除這 些粘貼物並依次向該傳感器添加另一細胞種群的話，則最多可在該生物傳感器 上獲得5種細胞培養物。自參考方法和系統可減少或消除對環境溫度、壓力波 動和其它環境變化的不利的敏感性，且能提供關於特定耙標或細胞類型的確認 信息。
應理解，不僅能夠分析多種化合物對不同細胞類型的影響以及單個化合物 對不同細胞類型的影響，還可以分析例如具有不同受體的細胞以及它們是如何 被調節的，並將其相互比較。還可以通過提供具有多個生物傳感器的設備如具 有不同生物傳感器的室來實現多元化。
還應理解，如果例如生物傳感器上培養的不同細胞中存在多種不同的受 體，則可提供特異性的分子，如特異性拮抗劑，然後例如可測試一種或多種化 合物。這類方法將提供關於例如哪種受體拮抗劑受到哪種化合物影響的信息。
公開了系統，該系統包括訊問系統；和光學非標記依賴性檢測(LID) 生物傳感器；其中所述訊問系統向所述光學LID生物傳感器發出光束，並接收 來自所述光學LID生物傳感器的光束，該訊問系統由此能夠監測該光學LID生 物傳感器表面上的活細胞內的物質再分布。
還公開了這樣的系統，其中所述訊問系統還能夠在實施了以下步驟後監測 活細胞內的細胞調節，如激動劑誘導的G蛋白偶聯受體(GPCR)活化提供光 學LID生物傳感器；將包含於細胞培養基中的活細胞覆蓋到該光學LID生物傳 感器上以使細胞能夠附著到該光學LID生物傳感器的表面；施加含有化合物的 溶液到光學LID生物傳感器表面上的細胞培養基中；訊問該光學LID生物傳感器，獲得時間依賴性光學響應，該響應指示活細胞的物質再分布，使得人們能 控制活細胞內激動劑誘導的GPCR活化導致的物質再分布。還公開的是包括向 光學LID生物傳感器溶液表面上的細胞介質施加至少一次緩衝溶液的系統。 應理解，本文所討論的任意方法步驟可用於實施這些步驟的系統。 還應理解，可實時監測光學輸出信號，但時間間隔不同(例如，1秒、3 秒、5秒、10秒、15秒、30秒、60秒、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、 30分鐘、60分鐘、2小時、5小時、IO小時、24小時)。
還應理解，在將化合物加到細胞中之前和之後，檢測過程中僅測量兩個點。 分析光學輸出參數的不同。
d)細胞增殖檢測中生物傳感器的應用
表徵促進或阻滯細胞阻滯的試劑是細胞生物學和藥物開發研究中極其重 要的領域。過去已採用了幾種方法。錐蟲藍染色是評價作為細胞存活的指示的 細胞膜完整性的一個簡單方法，但該方法需要在顯微鏡下計算死亡細胞的數 量，且不能用於高通量篩選。許多細胞增殖檢測要麼通過在增殖(即細胞分裂) 期間加入3H—胸苷或5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU，胸苷類似物)到細胞中，要 麼通過測量裂解細胞的總核酸或蛋白含量來估算細胞的數量。將5-溴-2'-脫 氧尿苷加到新合成的DNA中使得可使用螢光標記的抗-BrdU抗體或某些核酸染 色(如Hoechst 33342、 TO-PRO-3和LDS 751)間接檢測快速增殖的細胞，從 而促進己在BrdU標記期間經歷了細胞周期的S-期的細胞的鑑別。另一最常見 的檢測是MTT細胞增殖檢測。比色MTT檢測以黃色四唑鹽(MTT)轉換成不溶 的紫色甲膘晶體為基礎，由僅在活著的和存在代謝活動的細胞中起作用的細胞 線粒體脫氫酶的還原作用實現該轉換。將細胞與MTT試劑培養大約2 — 4小時 後，將去汙劑溶液加到細胞中，使有顏色的甲臘晶體增溶。使用平板閱讀器在 570nm波長下讀取樣品。所產生的顏色的量與存活的細胞數量直接成正比。活 細胞數量的擴大導致線粒體脫氫酶活性增加，結果導致形成的甲臘染料的量增 加。
之前的檢測類型很費時，因為它們需要長時間的培養步驟。例如，許多常 規的基於BrdU的方案需要DNA變性，以使抗BrdU抗體能夠接近BrdU表位。 DNA變性通常通過加熱(〉90° C)或用酸(2-4 M HC1)來實現。這種苛刻的 處理通常使多參數分析難以實施，因為其它的細胞結構和抗原在這種處理過程中也難以保存。此外，這些常規檢測可用於檢測某些細胞類型；不同細胞類型 需要不同的培養方案，以獲得最佳的檢測結果。
e)高通量篩選的特徵
公開了適用於高通量篩選調節或影響細胞或細胞增殖或細胞死亡中的一 個或多個信號傳遞途徑的化合物的方法。這些高通量方法基於這樣的理解即 可如本文所討論，使用多種不同參數評估生物傳感器輸出數據。如本文所討論 的，特定細胞或細胞內特定受體或特定細胞事件如死亡、增殖或信號發出途徑 的調節可具有特定的特徵。這種特徵可有本文所述的一種或多種生物傳感器輸 出參數組成。重要的是，對於高通量方法，在方法進行期間有這樣一個時間點， 在該時間點採集到的生物傳感器輸出參數數據是細胞狀態表徵，所述狀態例如 即信號傳遞途徑已被激活或滅火或細胞已死亡或細胞正在增殖。此時間點可以 是這樣一個時刻，此時有一組生物傳感器輸出參數可用來定義所述特徵。
可在例如具有許多生物傳感器的設備(如達49孔，或96孔或更多)中採 用高通量方法。還應理解，可具有生物傳感器輸出參數事件的這些方法收集1 小時、30分鐘、12分鐘、ll分鐘、IO分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、 5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、1分鐘、59秒或59秒內或各秒內到1秒內 的生物傳感器上細胞培養物的刺激事件。還優選的是，所有整板的生物傳感器 的信息收集也在這些時間內完成，但這不是必須的。
除了與數據收集持續時間和平行檢測的樣品數量相關的特徵之外，使用本 文所公開的方法和系統的數據分析或所得結果的集合展現可以是，例如，可就 地收集和呈現的共振帶圖像和預定的時間點。
(1)細胞覆蓋率
對於本文公開的這些方法，尤其是高通量篩選，它們的一個關鍵性參數是 所使用的起始細胞的數量。起始細胞的數量應當在一個臨界範圍內，這樣，正 常培養條件下波導基底上所產生的細胞密度可使人們能夠檢測細胞數量的變 化，包括增加和減少。應理解，細胞密度越大，生物傳感器產生的輸出信號越 多，因為平板上存在越多的細胞，則在任意給定事件如刺激事件後所測得的DMR 事件也越多。因此，細胞的數量可改變例如共振峰的特徵(如強度、PWHM、形 狀和/或位置)，禾B/或共振帶圖像的特徵(如帶形狀、寬度、強度、分布和/
77或位置)，和/或DMR事件的幅度(如P-畫R禾n/或N-DMR)。例如，覆蓋率可 以是30-100%、 30-70%、 40-60%、 45-55%或約50%，但是，覆蓋率可以是30 — 100%之間的任意百分數，例如38、 57、 63、 88、 75、 95或99%。對於不同的 應用，可改變優選的覆蓋率，以獲得最佳的性能。例如，對於細胞增殖檢測， 通常，優選的覆蓋率是約50%，但不同細胞類型或不同檢測的覆蓋率可稍微不 同。在這些條件下，正常條件下培養的細胞的P冊M接近最大值，這樣可結合 相同時間角度/波長改變或共振峰/帶位置測評幹擾細胞增殖的調節物，不管該 調節物對細胞增殖是促進劑還是抑制劑。在此，兩種調節劑都導致PWHM下降， 但是與未處理的細胞相比，促進劑加大了角度變化，而抑制劑則減小角度變化。 對於受體檢測或其它涉及細胞信號發出和網絡相互作用的應用，細胞的覆蓋率 可在30%到 99%範圍內變化，取決於將監測的細胞事件。例如，對於細胞凋 亡研究，細胞覆蓋率可以為 10%到 99%。對於GPCR篩選或EGFR篩選，細 胞覆蓋率優選在50%到 99%的範圍內。
(a)對細胞增殖的幹擾
本發明方法可用整板的探測在短時間，例如在60秒，50秒，40秒，30秒， 20秒，10秒內或每秒至1秒內影響細胞增殖的化合物。在一個實施例中，揭 示了檢測化合物影響細胞增殖的效果的方法，包括(a)提供第一和第二無 標記光學生物傳感器；(b)在所述第一傳感器上放置特定接種數量的細胞， 這樣，在細胞生長條件下經最佳培養，附著的細胞達到理想的覆蓋率 (confluency) ; (c)將相同與接種數量的相同細胞放置在含特定濃度本發明 化合物的所述培養基中；(d)在相同條件下培養細胞至所述第一傳感器的細 胞密度達到理想密度；(e)用光學查詢(interrogation)系統收集光輸出參 數。理想密度優選為40%-70%;特別優選為45%-55%。光查詢系統優選平行查 詢系統或掃描查詢系統。另一方面揭示了作為抑制劑或活化劑的化合物，它們 影響特定類型細胞增殖速度，得到不同數量的附著於傳感器的細胞。所附細胞 密度的不同引起不同的光學波導光模光譜。根據角度改變(angular shift) 和P麗H兩個參數，可以區分抑制劑和催化劑。
f)生物傳感器在細胞毒性篩選中的應用
藥物發現已經成為工業化過程，針對作用於選定靶點的活性在大量化合物
78庫中進行篩選。這些初級篩選出的大量活性化合物形成了藥物發展的一個瓶 頸。第一輪的中標者經常不能滿足人類治療學要求的安全和功效標準，因此需 要後續的優化篩選，指導獲得可用於人的產品。優化需要化驗吸收，分布，新 陳代謝，排出(排洩)，和毒性特徵，即(ADME/Tox) 。 ADME/Tox篩選，目前 佔據30億美元的市場份額，由於大部分首選化合物(lead compound)和藥物 因毒性而無法通過，它在藥物發現和發展背景中成為主角。開發過程中，新藥 總數的30%因毒性和副作用而被廢棄。ADME/Tox篩選本可以阻止幾種市售或處 方藥引起的死亡(Zechnich, A. D. etal。 (1994) West. J. Med. 160， 321-5 )。 鑑於目前市場上安全抗組胺劑的數量和藥物學家對早期A謹E/Tox篩選中越來 越多的關注，上述意料之外的毒性提供了一個很好的案例教學。由於大部分首 選化合物和藥物因毒性被廢，ADME/Tox篩選在藥物發現和發展背景中成為主 角。化合物庫包含的化合物有一系列積極和消極作用，這種假設是ADME/Tox 篩選的基礎。其中候選藥物的有益特點包括高特異性，低毒性，好的口服吸收 和半衰期。早期高通量ADME/Tox篩選的目的是在早期開發過程中從毒性方面 區分"好的"和"壞的"化合物。藥物篩選過程中的問題的早發現 (identification of problems)為目前的製藥工業提供了 一個極大的成本節 約機會。
ADME/Tox篩選是通常用於描述測試腸道吸收，在器官的分布，肝臟新陳代 謝，腎臟排洩和毒性特徵等化合物性質的成套測試的術語。ADME/Tox篩選通常 在藥物開發過程的晚期開展， 一在發現"中標化合物"的初期階段之後的過程 的絕對後期。當藥物開發目標數量少，且製藥企業間高通量篩選化驗點的較少 時，這種設定是可行的。隨著藥物發現空間規範的變化，藥物耙點數量和高通 量篩選化驗點增加了。因此，業界迫切希望能夠快速有效的優選(triage)或 確定可能無法通過ADME和毒性篩選的"潛在中標者"。這樣，ADME/Tox篩選 需要在藥物發現和發展過程中較早階段進行，例如初次篩選(高通量篩選)和 次級篩選。此外，預測藥物吸收，毒性和生理效果的集成方法(integrated approach)將非常有助於藥物發現和發展過程。
(1)實時監測化合物吸收，分配和毒性
ADME/Tox篩選包括測試關於腸道吸收，器官分布，肝臟代謝，腎臟排洩和毒 性特徵的化合物性質。傳統HTS篩選中與化合物吸收和毒性相關的信息一般被
79放棄或缺失；另外，化合物吸收和毒性引起的效應會使數據分析複雜化。不斷 增多的高容量篩選技術的應用開始將毒性篩選和功能性篩選直接相連。
所揭示的成分，方法和技術的一方面是為了消除目前ADME/Tox篩選和採 用以無標記光學傳感器進行的細胞實驗進行的功能篩選之間的斷口 。
在一個實施例中，公開了實時監測細胞吸附和毒性的方法，包括(a) 提供基於光學的無標記生物傳感器；(b)放置包含在培養基中的細胞，其中 該細胞附著到該生物傳感器的表面上；(c)將含有化合物的溶液施用到細胞 培養基中；(d)監測培養在該生物傳感器上的細胞的響應。所公開的方法的 特徵還包括(c)任選地給該細胞介質施加至少一次緩衝溶液。此外，所公開 的方法還可在分析中加入本文所討論的一個以上生物傳感器輸出參數。實際 上，可實施使用至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15 或更多個生物傳感器輸出參數的方法，且在某些實施例中，可能需要使用一個 以上參數來精確獲得例如檢測或細胞狀態的特徵。此外，在某些實施方式中， 該特徵的生物傳感器數據輸出參數可在刺激事件或生物傳感器事件輸出收集 後少於l小時、50分鐘、40分鐘、25分鐘、IO分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、 6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、l分鐘、59秒或59秒內的各秒到1 秒內出現。
g)用生物傳感器監測細胞活性
公開了與無標記光學生物傳感器(包括基于波導光柵的生物傳感器)領域 相關的組合物、方法和技術。公開的組合物、方法和技術還與基於細胞的試驗 領域相關。因為可用的傳感器的穿透深度小以及攸逝波的特性，只有發生在鄰 近傳感器表面處的細胞粘附層中刺激誘導的服R導致有效折射指數的改變，這 種改變繼而造成從傳感器中發出的折射光的角度改變。可檢測這種角度改變以 獲得DMR響應信號的動力學。此外，正因如此，不同的細胞響應對總物質再分 布信號的影響也不同。例如，細胞脫離細胞外基質發生在傳感器表面處或其附 近，因此比發生在細胞內部產生的響應大得多。公開了利用光學生物傳感器基
於傳感器的傳ii體積內質量的再分布來檢測細胞活性和化合物-/刺激物-誘導
的細胞變化的方法。例如，公開的組合物、方法和技術與以下用途和方法有關 利用基於光學的生物傳感器監測配體與受體酪氨酸激酶(RTKs)的結合以及相 繼的(sequential)信號傳遞事件，包括信號內化、實時分子運動或細胞內的組裝、和/或細胞骨架重構和細胞形態變化。公開了篩選可在活細胞中幹涉這 些信號傳遞事件之一的化合物或調節劑的方法。
本發明利用基於光學的生物傳感器(包括基于波導的生物傳感器)監測或 研究配體與受體酪氨酸激酶(RTKs)(—個細胞表面受體家族)的結合以及活
細胞中的幾種相繼信號傳遞事件。公開了篩選有可能干涉這些信號傳遞事件 (例如，結合、相繼的磷酸化、內化/細胞骨架重構和細胞解吸附)的化合物 或調節劑的方法。在另一種實施方式中，公開了確認一種化合物針對活細胞中 一種特定受體的生理或藥理作用的方法。
公開了用於化合物篩選和表徵(profiling)的、基於細胞的、實時和無 標記的功能性受體酪氨酸激酶檢測方法。公開的方法允許人們同時研究受體信 號傳遞途徑中三種主要事件的動力學配體結合、磷酸化和內化/細胞骨架重 構。根據本發明的方法還可用於篩選可幹涉這些信號傳遞事件的化合物或對其 進行分類。在又一種實施方式中，公開了基於(調節劑)獨特的特性(如光學 輸出參數所定義的)來篩選信號途徑中多個靶標的調節劑的方法，所述調節劑 幹擾檢測到的DMR信號。
已證明EGF受體系統的計算機模型在理解受體途徑不同部分的複雜相互作 用中非常有用。然而，對於細胞內的這些信號傳遞和運輸的動力學的直接檢測， 現在只有有限的試驗數據。缺少對信號傳遞事件動力學的直接檢測限制了對這 些模型的驗證。因此，需要可同時研究細胞信號傳遞事件的方法和技術以進一 步理解EGFR信號傳遞。
(1)物質再分布監測
如此處所公開的，可實時監測化合物在接近細胞-傳感器界面的某個鋪滿 度的細胞層的吸收、分布和毒性。因為基於光學的生物傳感器固有的有限穿透 傳感特性(50-500 nM)(即，傳感體積)，該體積內發生的傳感器可感知的 物質再分布導致響應變化，這種變化可被觀察為折射光束中角度或光譜的變 化。這種傳感器響應可被記錄為時間的函數和溶液組成變化。以這種方式，可 分析導致在傳感體積內的物質再分布的任何剌激事件的動力學或由刺激事件 引起的效果。應理解，待檢測細胞的鋪滿度對高靈敏度檢測很重要。對本文所 述的光學檢測，所需的靈敏度越高，所允許的細胞鋪滿度越重要。對於刺激事 件誘導的物質再分布監測，細胞鋪滿度優選在30-100%範圍內。或者可為
8170-99%。本文公開的方法應用於不同用途時(細胞增殖、化合物毒性、細胞凋
亡、化合物吸收和代謝、細胞信號傳遞途徑激活、細胞形態變化、細胞解吸附 和運動、受體和靶標(分子組裝)活化和運動，等)可能需要不同的細胞覆蓋 率(即細胞密度)以獲得最佳試驗結果。另外，不同的細胞類型和不同的耙/ 信號傳遞途徑活化可能需要不同的細胞覆蓋率以獲得最佳的細胞響應和功能。 應理解這種覆蓋率不限制試驗步驟或方法。
h)細胞組分和生物傳感器
生物細胞，如圖9的示意圖中所示，是複雜的結構，其組分的大小在納米 到幾十微米範圍內。細胞，如圖10所示的1008，通常有含有各種細胞器的細 胞質(通常在5-30幽範圍內)。通常，最大的細胞器是細胞核，其範圍可在 3-10 Wn。核含有DNA、 RNA、蛋白質和核酸-蛋白質複合體，如DNA-蛋白質或 RNA-蛋白質複合物。 一種很重要的DNA-蛋白質複合物是染色體。線粒體是由一 系列摺疊的膜(大小通常在0.5-1.5 Wn範圍內)組成的小細胞器。其它細胞 組分包括例如內質網(ER)(通常0.2-l陶)、溶酶體(通常0. 2-0, 5Wn)、 過氧化物酶體(通常0. 2-0. 5陶)、內含體(通常約100nm)和高爾基體。活 細胞，例如1008，是高度動態的，大多數細胞器在細胞內廣泛運動。例如，微 管可在很長距離內運輸細胞器。刺激物可導緻密集的細胞器在培養細胞(如 1008)的傳感器表面(如1010)的恰好邊緣處做亞微米運動；這種運動導致細 胞(如1008)內物質再分布，如1006。物質再分布(如1006)可被光學生物 傳感器(如1014)待測；與物質再分布(如1006)有關的信號稱為定向物質 再分布(DMR)信號。由於的生物傳感器(如光學LID傳感器1014)傳播的作 為瞬逝電磁場的電磁場可伸入周圍介質(例如貼壁細胞1008)的範圍有限(幾 十到幾百納米)，在某些情況下，只可檢測到一部分物質再分布(如1006)， 因為穿透深度不足以穿透整個細胞或多個細胞(例如在細胞層中)。電磁場可 延伸的具體稱為穿透深度或傳感體積。某些情況下，只可檢測與生物傳感器表 面(如1010) —定距離內的下層貼壁細胞。
(例如)當分泌型細胞器佔據其位於質膜下的對接位點，或質膜處的細胞 內小泡到達其細胞溶質中的加工位置時，可發生細胞運輸。在任一方向上，細 胞器通常必須穿透質膜下所謂的肌動蛋白皮層， 一種達幾百納米厚的肌動蛋白 絲密集網狀組織。肌動蛋白絲總是組裝和分解，因此這種網狀組織是動態的，可透過細胞器。調控組裝和分解的控制機制也調控肌動蛋白皮層的可透過性。
胞泌小泡可將受體插入到質膜中並將配體釋放到胞外空間。胞內小泡攜帶 已結合配體的受體至內部加工位置。質膜穴樣凹陷是質膜結合的載體，猜測其 在細胞信號傳遞中發揮作用。脂類伐被認為作為小漂浮島位於質膜中，在脂類 伐中選擇性的膜蛋白私下交換信號。最後，如本文公開的，膜受體是相同的。 它們可嵌在大分子複合物中，這些複合物不停募集和釋放下遊效應器分子。
細胞組分或細胞外刺激物的運輸不僅發生在質膜處，還通過信號傳遞發生 在細胞內和多個細胞內區室和細胞器中。這些事件包括(1)蛋白質靶標或底 物向核、膜、細胞溶質，通過再循環途徑，至或自其它細胞器，從胞外空間攝 取(配體結合、基因轉染、傳染和蛋白質遞送)募集；(2)各種功能性區室 內新合成的細胞內組分在確定的微環境內以及介導的釋放位置的再分布。這些 細胞事件可導致在信號傳遞循環中某些時間發生定向物質再分布。
(3)細胞監測的多種穿透深度
大多數或所有細胞區室是高度動態的，在毫秒至分鐘的時間範圍內發揮功 能，有時在發揮功能後迅速分散。為了觀察由單個細胞器和信號傳遞複合物介 導的信號傳遞事件，通常需要體內方法使單個細胞器顯影、檢測少數分子並在 時間和空間上以髙解析度報告它們的功能。螢光顯微術是迄今為止的一個很自 然的選擇，因為一些細胞器可被染料特異性染色，並且越來越多的蛋白已與熒 光蛋白例如綠色螢光蛋白(GFP)偶聯而不影響其功能。然而，很多質膜事件 涉及與瞬時募集到質膜上的胞質蛋白的相互作用。因為即使當共聚焦顯微鏡聚 焦於質膜時可觀察到細胞內將近半微米的深度，這些和更經典的螢光顯微鏡顯 示出來自細胞溶質的強"背景"螢光，使來自靠近質膜的微小結構或分子組 件的較弱螢光變得模糊。
經刺激，活細胞可經歷非常多的細胞事件，包括但不限於，配體/化合物 結合到受體或細胞內靶標，細胞組分的運動和移位，細胞信號傳遞分子的相互 作用，細胞器或分子組件的活性改變甚至移動，第二信使的產生，細胞骨架重 構和甚至顯著的細胞形態變化。例如，GPCR參與一系列的細胞信號傳遞途徑。 配體結合啟動一系列細胞內和細胞信號傳遞事件，包括受體構象變化，受體寡 聚化，G蛋白活化(GDP-GTP在G。亞單位上互換，G。和Gh解離，G蛋白與受 體分離，產生G。-和G"信號傳遞複合物)，和導致產生第二信使(C移動，產生肌醇三磷酸，和/或細胞內CAMP水平的調節)並最終導致具體基因表達變 化的下遊信號傳遞活化。配體介導的GPCR活化還導致GPCR從細胞表面脫敏、 很多細胞內蛋白的運輸，以及靶細胞的表型、形態和物理特性的變化。這些變 化可以是靜態的、長久的或動態的(例如，循環或擺動)。不同的信號傳遞事 件顯示出顯著不同的動力學，從毫秒(例如GPCR構象變化)至幾十秒(例如 Ca2+流)至甚至幾十分鐘(例如基因表達或形態變化)。雖然它們的特徵(例 如動力學)不同，這些事件可導致物質再分布。而且，用光學生物傳感器獲得 的光學輸出參數一般代表大量細胞事件的總體平均響應，不同的細胞事件對總 輸出參數的貢獻不同。細胞總的DMR響應對穿透深度的依賴將是何處和何時發 生DMR信號的極為有用的指示。
如上所述，光學生物傳感器，依賴於傳感器結構和性質，在表層介質產生 有限的穿透深度(通常50-500nm)，並且只可檢測高(tall)細胞(直徑約 IO微米)或細菌(直徑約l微米)的底層部分。因此，檢測質量主要與生物體 和表面的接觸區、近質膜區和傳感器表面附近發生的形態變化有關。為了探測 與質膜相距較遠的細胞內不同區室或細胞器的運動或活性、或整個生物體的折 射率，需要將穿透深度延伸到(能夠檢測)這些變化。圖11顯示了依賴於穿 透深度的傳感器攸逝波的行為。它強調了穿透深度對細胞監測的重要性。因為 光學輸出信號或參數是對刺激誘導的細胞響應的一種整合的(intergrated) 和代表性讀數，多種細胞事件如受體胞吞或靶複合物移動或細胞形態變化或細 胞解吸附或移動對用光學生物傳感器獲得的總體響應的貢獻可能不同。這些事 件可發生在與傳感器表面相關的不同位置。因此，通過利用多種穿透深度來監 測由同一種刺激事件誘導的細胞響應，可了解各事件對總體響應的貢獻，並因 此了解細胞響應的機制。
公開了可用於監測響應於刺激(而產生)的細胞DMR信號的方法。在一種 實施方式中，該方法包括傳感器的不同模式以檢測特定細胞類型響應於具體刺 激(而產生)的總DMR信號。傳感器的不同給定模式產生靈敏度不同的不同穿 透深度(例如，TM。模式傾向於比TE。模式產生更長的穿透厚度，例如對於給定 的傳感器TM。模式的穿透深度為120咖，對於同一傳感器TE。模式約為90nm)。 在另一種實施方式中，公開的方法可將具有不同波導和光柵結構及性質並產生 不同穿透深度的至少兩種生物傳感器用於給定的模式以檢測細胞的總匿R信 號。在另一種實施方式中，公開的方法可用傳統的對稱和反相對稱波導光柵生
84物傳感器來檢測細胞的總DMR信號。運輸信號或定向物質再分布(DMR)信號對穿透深度的靈敏度可用作特徵(signature)來鑑定特定的細胞運輸事件。本發明方法包括對生物傳感器構型和結構的修飾，或對具體波導傳感器的穿透深度進行"細調"，提供了以高靈敏度和細胞內區室特異性監測或檢測具體細胞運輸事件的有用手段。具體說，應用具有不同穿透深度的多個傳感器可描述各細胞D服或運輸事件的特徵標記。對於具體的運輸或DMR事件，本發明允許
人們以更高的z-軸空間解析度和更高的靈敏度監測或檢測該事件。
(4)用光學生物傳感器進行多路(multiplexed)細胞試驗
標準的篩選方法， 一次檢測一種靶標，已成功用於鑑別有效的藥物候選物。然而，產生的關於化合物選擇性的信息非常之少。當前，在藥物開發過程的下遊進行選擇性研究；由於不良結合在該階段排除一些化合物，使藥物開發過程費錢費時。需要平行檢測化合物對多個靶標的活性的多靶標篩選以在藥物開發過程的早期解決化合物選擇性的問題。基於這些考慮，以及靶標鑑定腳步的加快和化合物文庫的擴充，需要可進行多靶標篩選的新技術。
公開了可進行多靶標和多細胞篩選的方法。 一種實施方式中，本發明方法利用整合的光學輸出參數作為針對多類靶標或同類靶標的多個家族成員篩選化合物的手段。例如，EGF介導的通過EGFR的人A431細胞Ras/MAPK途徑的活化產生獨特的DMR特徵；多類靶標包括EGFR、 Src激酶、MEK1/2、地那明和肌動蛋白絲在總DMR特徵中發揮不同作用。此外，在另一個例子中，在A431細胞中，Ras/MAPK途徑的活化可通過幾個GPCR激動劑誘導的EGFR轉活介導，導致與EGF誘導的響應類似的DMR特徵；因此，可篩選和檢測GPCR類耙標的多個家族成員。
另一種實施方式中，本發明公開了在單個傳感器的不同區域上順序培養至少兩種類型細胞的方法，這些細胞可用於用光學生物傳感器進行的多路細胞試驗。所述細胞可以是不同類型的細胞，或生理相關的、或疾病相關的、或病理相關的。細胞也可以起源於同類型的細胞，或未修飾的，或經遺傳再工程化或類似的在工程化，如敲除或抑制或過度表達特定的感興趣靶標的細胞。例如，可用中國倉鼠卵巢(CH0)細胞和經再工程化的CHO細胞。如圖12所示，可提供生物傳感器(1201)，然後可物理隔離(block)該生物傳感器的一部分(1202)，從而即使將細胞放置在該生物傳感器上，細胞也不會在該部分生物傳感器上生長。然後可將A細胞類型的細胞培養基放置在未隔離區域(1203)並允許其在上面生長。然後不再隔離生物傳感器上被隔離的區域，可施加第二種細胞，例如細胞類型B的培養基，從而細胞類型B在曾經被隔離的區域生長(805)。然後可提供含有能夠產生刺激事件的分子的溶液(1206)。然後運行該生物傳感器，從兩個區域(起初未隔離的區域和曾被隔離的區域)收集數據並比較。可通過放置橡皮圖章(rubber stamp)覆蓋一部分傳感器來實現隔離，或通過放置具有給定數目的柱形結構(posts或columns)的蓋板來實現隔離。柱形結構的末端可由軟材料如橡膠製成的末端組成，從而當柱形結構的末端接觸部分傳感器表面時不會破壞傳感器的性質或對其不利。柱形結構的數目和位置與給定傳感器微板的形式相適應。或者，可將一個裝置放入傳感器微量滴定板中來實現隔離，從而各傳感器可被分為至少兩個區室。例如，所述裝置可以是具有給定數目微柱體的蓋板；在各柱體(或總柱體)末端可具有撓性材料如聚合物製成的薄壁(通常lmm)。 一旦將柱體置入各孔中，微柱體的底部接觸傳感器的中心區域，兩邊均接觸各孔的內壁。蓋板優選含有給定數目的流體通道；各通道與各微柱體或部分微柱體連接。
在又一實施方式中，公開了利用物理上分離的多個生物傳感器的方法，各生物傳感器可用於容納一種類型的細胞。最初的細胞貼壁之後，可將通用培養基加到含有多個生物傳感器的小室中。如圖13和14所示的方法提供所公開方法的一種改進形式，此改進與生物傳感器位於小室(例如微板的孔)中具體的位點有關。如果採用含有多孔微量滴定板(各孔中有多個區室，各區室有生物傳感器)的裝置，則可將不同類型的細胞置於各個不同小室中，允許對各孔或生物傳感器分析不同的細胞或條件設置(1302)。然後可任選將通用培養基放入各孔以覆蓋所有生物傳感器，或各區室可用不同介質，所公開的這兩種方式可任意組合(1303)。溶液1303可含有標記物，如可產生刺激事件的分子，或可施加含有可產生刺激事件的一種或多種分子的第二溶液(1304)。然後可監測並詢問生物傳感器(一個或多個)，收集並比較各區室或傳感器產生的結果。在一種具體實施方式
中，本發明提供一種獨特類型的生物傳感器微量滴定板，如圖14所示的例子， 一種嵌有光學生物傳感器的多區室多孔微量滴定板，其中各孔中含有四個區室，各區室可具有嵌入的一種波導光柵基材。各區室可用於容納單一類型的細胞。可用內壁分隔四個區室，內壁高度(優選在100微米和2毫米之間)通常比各孔高度(任何給定微量滴定板的典型高度)低得多，從而具有四個區室的各孔可用於同時檢測一種藥物候選物對多個靶標或多種細胞類型的作用。可用物理屏障分隔小孔中的區室，從而當一種細胞介質溶液施加於一個區室時，從而當一種細胞介質(medium)溶液施加於一個區室並在所述區室停留時不與相鄰區室交叉汙染。應理解區室可以是2、 3、 4、 5、 6或更多個。可用更高的物理屏障分隔具有多個區室的各孔，例如用常規微量滴定板的塑料壁，從而可將相對大體積的共用溶液加入各孔覆蓋所有區室並用於單個試驗。
在另一種實施方式中，公開了一種方法，該方法可利用位置和表面介導的轉染在單個傳感器或單個小室或單個孔中的多個傳感器來產生多種類型的細胞。對於單個傳感器，選擇預定的區域沉積材料，從而一旦細胞生長並貼壁，細胞可攝取所述材料並因此產生修飾的或再工程化的細胞，這種細胞有別於生長並粘附在沒有沉積所述材料的其它區域的原始細胞。所述材料可優選是靶基因，或反義寡核苷酸和其衍生物，或反基因寡核苷酸和其衍生物，或幹擾RNA(單鏈或雙鏈或任何類型)，或抗體，或蛋白，或蛋白結構域，或藥物，或肽。對於待被細胞遞送或攝取的不同類型的材料，可用具體的轉染試劑來達到最佳效果。可如US2004/0023391A1和US 6， 544， 790中所述實現這些方法或組合物，這兩篇文獻以全文納入本文，但至少納入與遞送入細胞的方法有關的材料。
在另一種實施方式中，公開了一種方法，該方法可利用位置和表面介導的轉染在單個傳感器或單個小室或單個孔中的多個傳感器來產生多種類型的細胞。對於單個傳感器，選擇預定的區域沉積材料，從而一旦細胞生長並貼壁，細胞可攝取所述材料並因此產生修飾的或再工程化的細胞，這種細胞有別於生長並粘附在沒有沉積所述材料的其它區域的原始細胞。所述材料可優選是靶基因，或反義寡核苷酸和其衍生物，或反基因寡核苷酸和其衍生物，或幹擾RNA(單鏈或雙鏈或任何類型)，或抗體，或蛋白，或蛋白結構域，或藥物，或肽。對於待被細胞遞送或攝取的不同類型的材料，可用具體的轉染試劑來達到最佳效果。可如US2004/0023391A1和US 6， 544， 790中所述實現這些方法或組合物，這兩篇文獻以全文納入本文，但至少納入與遞送入細胞的方法有關的材料。可用接觸印刷技術(如針印刷技術)、戳記裝置或非接觸印刷技術如分配器裝置或系統實現材料的沉積。對於物理屏障分隔的同一孔中的多個生物傳感器，可用微量滴定板分配器實現含有材料的溶液的直接沉積。可如US5807522 A、US6101946 A、美國專利號5,731,152、美國專利號5， 807， 522、美國專利號5， 601， 980、 US6656432 Bl、 EP0895082 Bl或US6399396 Bl中所述實現這些方法，這些文獻全文納入本文，但至少納入與將所述材料遞送到基材表面的方法有關的材料。
另一種實施方式中，公開了一種方法，該方法可將定位溶液(positionsolution)轉染技術用於位於不同傳感器上的細胞，所述不同傳感器在同一小孔中但被物理屏障分隔。這些方法可將與轉染試劑混合的材料直接引入各區室中，在區室中細胞被預先培養並粘附到傳感器上。例如，將含有DNA的轉染試劑溶液加入各區室，區室中的細胞已被放置在底部基材上。
(5)用光學生物傳感器鑑別靶標
藥物靶標包括在具體疾病的發生和發展中發揮重要作用的大多數蛋白。直到最近，藥物研究者們只限於研究約500個生物學靶標(Drews，丄，"DrugDiscovery: A Historical Perspective" Science 2000， 287, 1960—1963)。隨著人類基因組測序的完成，可用和潛在的生物學靶標的數目正急速增加。基於基因組學方法發現的潛在靶標的數目使人們非常需要靶標評價技術。然而，傳統的藥物發現方法已經並且也只能解決有限數目的靶標家族。這種情況提示傳統方法已變得非常局限。也就是說，這些方法不能迅速產生滿足大藥物公司商業目標所需數目的新藥(例如，每年三至五種)。傳統的方法不可能為重大疾病(例如心血管疾病、神經退行性疾病、癌症和2型糖尿病)或其它遠未滿足的藥物需要提供突破性治療。基於這些原因，靶標評價已稱為基因組學研究中增長最快和最重要的領域之一。在靶蛋白和疾病之間建立更強的聯繫將使藥物進展到臨床試驗時的失敗率更低，已證明有價值藥物靶標的靶標數目更少將使成功率更大。此外，獲得對蛋白質功能了解的更快速的手段將縮短靶標評價過程。
在藥物發現中，靶標評價一般包括三個主要的、重要階段1)靶標篩選，
2)靶標鑑定，和3)靶標確認。作為靶標評價中的第一和/或早期階段，靶標篩選階段包括鑑定可能與疾病過程相關的分子(例如通過基因表達分析鑑定到特定基因的上調)。靶標鑑定包括鑑定非常清楚地在疾病過程中發揮作用的分子。這樣，這種方法提供了更大的確定性，但仍然存在這樣一種可能，即鑑定到的靶標不是最好的或不連接於最好的結合位點以幹擾疾病過程，或者它們不是"可作藥的"，亦即這種靶標不適合作為藥物靶標，因為它們不在疾病或癌症中發揮支配性作用，或者藥物對該耙標的修飾可產生不利副作用。如果這些(前面兩步)都成功了，則可進入靶標確認階段，該階段確定在所選分子中哪個分子如果被調節則導致表型改變，從而暗示其可能具有治療性靶標的價值。
在一種實施方式中，公開了一種方法，該方法可用於基於光學生物傳感器監測的物質再分布的靶標鑑定和評價。(例如)與信號傳遞途徑活化、細胞運動性和表型改變相關的物質再分布可用作與特定靶標相關的疾病的指徵，因為這些改變中的很多涉及腫瘤進展和轉移。 一種實施方式中，該方法包括比較兩種類型細胞的通過特定靶標產生的刺激事件介導的DMR響應。如圖15所示，可提供光學生物傳感器(1501)。然後，可將含有特定類型細胞(細胞A( 1502))的細胞培養基置於該傳感器上。然後任選提供緩衝溶液(1503)。可加入例如配製在溶液(1504)中的具體標記物，該標記物是刺激事件，如特定途徑或受體或細胞的調節劑或潛在調節劑。然後可用生物傳感器監測細胞響應(1505)。可用第二種細胞類型或細胞培養物(1507)在第二傳感器(1506)上進行同樣的一組步驟。詢問第二生物傳感器(1510)後，可對兩種響應(1505)和(1510)進行比較(1511)。
圖12顯示基於定向物質再分布進行靶標鑑定和評價的另一種可選方法。可提供生物傳感器(1201)，然後可物理隔離一部分該生物傳感器(1202)從而即使將細胞置於該生物傳感器，細胞也不會在該部分生物傳感器上生長。然後可將具有細胞類型A的細胞培養基置於未隔離區(1203)並使其在上面生長。然後任選不再隔離生物傳感器上被隔離的區域，施加第二種細胞，例如細胞類型B的細胞培養基，從而細胞類型B在曾經被隔離的區域生長(1205)。然後可提供含有能夠產生剌激事件的分子的溶液(1206)。然後運行該生物傳感器，從兩個區域(起初未隔離的區域和曾被隔離的區域)收集數據並比較(1207)。
圖13顯示基於定向物質再分布進行靶標鑑定和評價的另一種可選方法。圖13提供所公開方法的一種改進形式，此改進與生物傳感器位於小室(例如微板的孔)中具體的位點有關。如果採用含有多個小室的裝置並使用多個生物傳感器，則可將不同類型的細胞置於各個不同生物傳感器上，從而能對各孔或生物傳感器分析不同的細胞或不同條件設置(1302)。然後可任選將通用培養基放入各孔以覆蓋所有生物傳感器，或各小室可用不同培養基，所公開的這兩種方式可任意組合(1303)。溶液1303可含有標記物，如可產生剌激事件的分子，或可施加含有可產生刺激事件的一種或多種分子的第二溶液(1304)。
然後可監測並詢問生物傳感器(一個或多個)，收集並比較各區室或傳感器產
生的結果(1305)。
與圖2a所示類似，圖IO提供的圖顯示示範性無標記生物傳感器及其基本組件。光學LID系統1000包括詢問系統1002和光學LID生物傳感器1004，詢問系統1002由控制光、電子和用於數據產生、收集和分析的其它模塊組成，光學LID生物傳感器1004可用於檢測和監測物質再分布。當沿著(align with)傳感器攸逝波的方向發生物質再分布時，產生稱為定向物質再分布的信號並可被收集和分析。然而，如一些輸出參數如PWHM、共振帶寬和形狀等所示，光學生物傳感器也可能檢測到沿著傳感器表面或與該表面平行發生的物質再分布。例如，分子如GPCR 1020的移位或分子裝配的發生可開始於面向傳感器的細胞表面至細胞內區室如內含體或ER。這些運動，如活細胞1008 (只顯示一個)中所示的的箭頭1006， 一般導致傳感器內傳感體積(由穿透深度定義)的減少。在一種優選實施方式中，詢問系統1002詢問光學LID生物傳感器1004 (例如，SPR傳感器1004，波導光柵傳感器1004)，從而可檢測和監測活細胞1008中的物質再分布。這可通過以下方式實現發射光束1012至光學LID生物傳感器1004，從而當光束1012被傳感表面1010反射時，表徵物質再分布的共振角或波長響應在反射束1014中佔優勢，所述光束1012具有本文所述的合適光譜或角度。因此，當在活細胞1008中有可檢測的物質再分布時，光學LID生物傳感器1004可感知響應的變化，該變化被觀察為反射束1014的角度或波長改變。光學響應可記錄為時間的函數。以這種方式，如本文所述，可分析導致活細胞1008內發生物質再分布的任何事件的動力學生物傳感器輸出參數或任何其它參數。
參考圖16，該圖顯示光學LID系統1000用於監測刺激事件，如位於光學LID生物傳感器1014上表面上的活細胞1008 (只顯示了一個)中G蛋白偶聯受體1602 (GPCRsl602)的激動劑誘導的移位。具體說，該圖顯示了部分由於活細胞1008內的靶標GPCR 1602移位造成的激動劑誘導和時間依賴性的光學響應1601。細胞粘附於基于波導的生物傳感器1014的上表面1010。清楚起見，在標記為"C"的部分未顯示詢問系統1002。
可以看出，靜息態的GPCR 1602位於細胞表面1604 (質膜1604)，而GPCR激酶1606 (GRK 1606)和抑制蛋白(arrestin) 1608均勻分布在活細胞1008
90的細胞溶質中(見圖"A")。經激動劑激活後，GPCR 1602活化由a、 p和 Y亞單位組成的異源三聚體G蛋白。Ga和GP Y亞單位解離，引起質膜1604 處GRK 1606向受體1602募集。然後，GRK 1606磷酸化GPCR 1602的羧基末端。 另外，13-抑制蛋白1608 (—種相對豐富的細胞內蛋白)，在胞質中迅速移位 (在分鐘級別)到質膜1604處的活化的GPCR 1602，結合GRK-磷酸化受體， 將受體與其相應(cognate) G蛋白解偶聯。然後抑制蛋白1608結合到脫 敏的GPCR 1602並移位到細胞表面1604處的網格蛋白小窩(clathrin-coated pits)，此處1602在籠形蛋白包裹的小泡(CVV)中內化(見圖"B")。最 後，整個1602和1606複合物被遞送到內含體1610 (細胞內小泡1610)(見 圖"C")。該過程稱為移位。關於GPCR移位的更多信息，可參考以下三篇文 章Pierce, K丄等， "Seven-transmembrane receptors. ，， Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002， 3， 639-650，整體納入本文，至少針對與移位相關的部分。
應理解，這些移位事件導致某個時間點活細胞1008內定向質量分布(例 如，向細胞表面或離開細胞表面)，因此在延長的時間段中產生不同的光學響 應。可導致定向質量分布的另一個可能的生物學事件是由於GPCR活化引起的 細胞形態變化。細胞形態變化包括細胞骨架重構以及細胞貼壁(狀態)的變化。 細胞骨架是複雜的蛋白絲網絡，延伸經過真核細胞的細胞質，參與執行這些細 胞中的多種活性。除了為這些細胞提供抗張強度之外，細胞骨架還使肌肉能夠 收縮、進行細胞運動、並參與細胞內信號傳遞和運輸、細胞分裂和細胞形狀變 化。G蛋白偶聯受體(GPCR)的活化導致至少兩個獨立事件，理論上講這些事 件可對細胞骨架重構產生作用。第一個事件是細胞內信號傳遞途徑的活化，第 二個事件是受體介導的胞吞作用(即移位)，其發生在大多數GPCR的激動劑 活化之後。然後，激動劑/GPCR結合之後發生的細胞內信號傳遞途徑的活化又 導致另外兩組相關的事件。第一組過程導致細胞內第二信號傳遞途徑(G蛋白 —效應子一信使)的活化，而第二組的機制通過影響第一組事件調控細胞內 信號傳遞的程度。這些機制包括磷酸化/脫敏、內化和膜結合受體的下調。假 定兩組事件均導致細胞中肌動蛋白絲重構。例如，GPCR活化後，各種形式的G 蛋白(例如Ga和Gh)可與F肌動蛋白絲結合；這些和其它信號傳遞分子可與 肌動蛋白絲解離。通過受體介導的胞吞而發生的膜結合受體的內化也可導致肌 動蛋白絲的動態變化。
再參考圖16，根據本發明，可通過從光學LID系統1000分析光學響應1601
91來鑑定和監測活細胞1008中與GPCR移位相關的不同狀態。實際上，從圖16
所示的光學響應1601可鑑定三種不同事件。可看到的三種主要事件包括(1)
加入激動劑後，信號1601由於折光率體積指數變化發生非常大的快速減少 (bulk index of refraction changes)(艮卩，該例子中化合物溶^夜相Xf於細 胞培養基的折射係數較低，因此加入化合物導致LID信號降低)；(2)過渡 階段，響應信號1601變化慢，持續約20分鐘該階段可能與細胞信號傳遞途 徑活化相關，包括但不限於，已活化的受體1602被GRKs 1606磷酸化，抑制 蛋白結合，受體從網格蛋白小窩(chathrin-coated pits)脫敏，和/或其它 細胞響應；和(3)響應信號1601緩慢減少，持續約50分鐘，對應於GPCR復 合物1602和1608移位到內含體1602或其它細胞響應如細胞骨架重構。其它 情況下，緊跟起始步驟之後發生的另外的事件可能很明顯(例如，圖16);它 是一種快速波動的響應信號1601，主要是化合物在細胞培養基中的加入和/或 擴散和/或細胞表面處細胞內組分向活化的GPCR募集造成的。下面參考圖17 所示的方法1700描述光學LID系統1002如何進行這種測試的細節。
圖18表示用服R進行把靶標鑑定的例子。圖18中，不管CHO細胞培養在 含有10%胎牛血清(FBS)(數據未顯示)還是0. 1% FBS (至少16小時)的培 養基中(1801)，除了將50 ral EGF溶液加入到150 ml細胞培養基中之後立 即發生的信號快速變化(通常持續少於20秒)之外，EGF刺激未引起顯著的 DMR。這種快速變化是由於體積指數變化。相反，當發生刺激事件時，例如加 入EGF， EGF-誘導的A431細胞的響應強烈依賴於培養條件。在0. 1% FBS中飢 餓20小時的A431細胞用EGF處理產生時間依賴性響應(1802)，該響應由三 個連續相組成，提供3種生物傳感器輸出參數(i)陽性相，信號增加(P-DMR) (點C-D) , (ii)淨-零(net-zero)相(點D-E)，和(iii)衰減相，信 號減少(N-DMR)(點E-F-G)，在體積指數變化的最初快速相之後。相反， 與處於靜息態的A431細胞相比，增殖中的A431細胞(10%FBS)只產生P-DMR 相(1803)，而用0. 1%FBS只處理4小時的A431細胞產生類似的響應(1804)， 但動力學發生改變，振幅小得多。這些結果表明可基於標記物-誘導的醒R響 應，例如使用細胞信號傳遞途徑(在該具體實例中是EGF)的活化物或抑制物， 來鑑定或評價給定細胞類型中的靶標(例如，EGFR)。
i)細胞信號傳遞
92可用本文公開的系統和方法監測細胞信號傳遞。例如，參考圖17，該流程 圖顯示了根據本發明的方法用光學LID生物傳感器1004在活細胞1008中實時 監測由激動劑誘導的GPCR活化引起的物質再分布的方法1700的基本步驟。方 法1700包括下述步驟(a)提供光學LID生物傳感器1004 (步驟1702);
(b) 將一定數目的活細胞1008置於覆蓋光學LID生物傳感器1004的介質中， 從而活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的表面1010 (步驟1704);
(c) 任選至少施加一次緩衝溶液至細胞培養基(步驟1706) ; (d)將含有化 合物(激動劑)的溶液加入細胞培養基(步驟1708);和(e)詢問光學LID 生物傳感器1004，監測培養在光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008的時 間依賴性光學響應1601 (步驟1710)。
應理解，如果進行歩驟1706，在加入化合物之前將緩衝溶液(與用於配製 感興趣化合物的緩衝溶液相同)施加到活細胞1008，則由於活細胞1008對環 境改變發生的響應而引起的任何不利作用可被最小化。這是可能的，因為培養 在光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008是活的、動態的，這表示它們可 感知周圍介質組合物中的變化以及溫度的變化並對這些變化做出響應。然而， 因為活細胞1008感知到緩衝液的加入等變化，如果不加入另外的化合物，它 們可能對介質組合物中的那些變化產生抗性。
還應理解，實時方法1700提供了可量化的信息，同樣重要的是，它提供 了由於GPCR活化造成的細胞內的物質再分布的動力學。與篩選GPCR的傳統方 法不同，該方法1700更易於操作，更靈敏，不依賴於標記，可用於所有GPCRs 1002，而不需要事先知道天然配體或者給定的受體如何偶聯於下遊信號傳遞途 徑。
還應理解，步驟1704中應優化細胞的數目使得在優化的條件下培養一定 時間後，這些細胞粘附在光學LID傳感器1004的表面1010上並達到高覆蓋率 (任選大於75%)，以獲得高靈敏度。
參考圖19，該流程圖顯示了根據本發明採用光學LID生物傳感器1004、 基於活細胞1008中的物質再分布，篩選針對耙標GPCR 1002的激動劑的方法 1900。方法1900包括下述步驟(a)提供光學LID生物傳感器1004 (步驟 1902) ; (b)將一定數目的活細胞1008置於覆蓋光學LID生物傳感器1004 的培養基中，從而活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的表面1010 (步驟1904) ;(c)向細胞培養基中施加一定濃度含有拮抗劑的溶液一段時
93間，直到光學LID生物傳感器1004變得穩定(步驟1906)，所述拮抗劑的親 和力已知；(d)將含有化合物(激動劑)的溶液加入細胞培養基(步驟1908)， 其中該化合物濃度足夠高到可與結合於受體的拮抗劑競爭並使拮抗劑脫離受 體；和(e)詢問光學LID生物傳感器1004，監測培養在光學LID生物傳感器 1004上的活細胞1008的時間依賴性光學響應1601 (步驟1910)。
應理解，該方法1900中，通過預先施加針對活細胞1008中一種受體的拮 抗劑可有效篩選化合物針對該特定受體的激動性。而且還應理解，該方法1900 與先前的方法1800類似，只有一個區別就是方法1900需要事先知道化合物對 活細胞中其相應受體的功能性。例如，需要知道該拮抗劑是否抑制GPCR 1020 活化，或該拮抗劑是否活化GPCR 1020從而導致移位。
參考圖20，該流程圖顯示了根據本發明採用光學LID生物傳感器1004、 基於活細胞1008中的物質再分布，篩選針對靶標GPCR 1020的拮抗劑的方法 2000。方法2000包括下述步驟(a)提供光學LID生物傳感器1004 (步驟 2002) ; (b)將一定數目的活細胞1008置於覆蓋光學LID生物傳感器1004 的培養基中，從而活細胞1008粘附到光學LID生物傳感器1004的表面1010 (步驟2004) ; (c)向細胞培養基中施加一定濃度含有激動劑的溶液一段較 短時間，從而不會發生移位(歩驟2006)，所述激動劑的親和力已知；(d) 所述較短時間後，將一定濃度含有化合物的溶液加入細胞培養基(歩驟2008); 和(e)詢問光學LID生物傳感器1004，監測培養在光學LID生物傳感器1004 上的活細胞1008的時間依賴性光學響應1601。應理解，和方法1900類似，該 方法2000需要預先知道活細胞1008中的靶GPCR 1020 (的一些信息)，還需 要預先選擇針對該特定GPCR 1020的拮抗劑或拮抗劑預先處理活細胞1008。
應理解，步驟2006和歩驟2008可組合為一個步驟；即，可將細胞中耙標 GPCR的已知激動劑與化合物一起加入。還應理解，與方法1700類似，可先加 入待測試化合物，然後加入已知激動劑。
方法1700、 1900和2000中的每一個還可用自參照(self-referencing) 光學LID生物傳感器1004進一步強化。眾所周知，光學LID生物傳感器1004 的性能一般受傳感器的設計和特性、光學、以及環境變動(包括環境氣溫和氣 壓)的影響。採用自參照光學LID生物傳感器1004的一個主要優點是上表面 1010既有參照區又有樣品區，樣品區可用於檢測活細胞1008中的物質再分布， 同時可用參照區(未粘附活細胞1008)參照出幹擾性(spurious)變化，這些幹擾性變化對活細胞1008中物質再分布的檢測有不利影響。
一種實施方式中，可根據圖21所示方法2100製備自參照光學LID生物傳 感器1004。可通過以下步驟製備自參照光學LID生物傳感器1004: (a)提供 光學LID生物傳感器1004 (歩驟2102) ; (b)用軟印模(如橡膠印模)物 理隔離光學LID生物傳感器1004的表面1010的一個區域(參照區)(步驟2104);
(c) 將一定數目的活細胞置於覆蓋光學LID生物傳感器1004未隔離區(樣品 區)的培養基中(步驟2106);和(d)活細胞1008粘附到光學LID生物傳 感器1004未隔離區之後移除軟印模(步驟2108)。這時，可如方法1800、 1900 和2000所述進行基於活細胞的試驗。應理解，可用不同的方法來製備用於細 胞研究的自參照LID傳感器。例如，可用物理屏障將傳感器分成兩部分，介質 中的細胞只施加並覆蓋其中的一個部分。細胞貼壁後，移除物理屏障。
現在參照本文公開方法的另一個特徵，眾所周知，多路細胞試驗已變得日 益重要，不僅是因為通量日益增加，還因為從單個試驗獲得的大量的和確定的 信息。因此，希望本發明方法可以多路模式進行，在某一個時間進行多個試驗。
一種實施方式中，採用圖22所示的方法2200，可加強本發明方法以在同 一時間進行多個基於活細胞的試驗。根據方法2200，可監測多種類型的活性 1008中由於激動劑誘導的GPCR活化引起的物質再分布，歩驟如下(a)提供 光學LID生物傳感器1004 (歩驟2202) ; (b)用印模隔離光學LID生物傳 感器1004上表面1010的一部分，印模阻止活細胞1008粘附到光學LID生物 傳感器1004的所述部分上(步驟2204) ; (c)將第一種類型的活細胞1008 置於覆蓋光學LID生物傳感器1004未隔離部分的培養基中，從而活細胞1008 能夠粘附於光學LID生物傳感器1004的表面1010的未隔離部分(步驟2206);
(d) 從光學LID生物傳感器1004上表面1010移除印模(步驟2208) ; (e) 將第二種類型的活細胞1008置於覆蓋光學LID生物傳感器1004的培養基中， 從而第二種類型的活細胞1008能夠粘附於光學LID生物傳感器1004的上表面 IOIO上剛剛解除隔離的部分(步驟2210) ; (f)向位於光學LID生物傳感器 1004的上表面1010上的細胞培養基中施加含有化合物的溶液(步驟2212); 和(g)詢問光學LID生物傳感器1004以監測時間依賴性光學響應1601，其代 表了光學LID生物傳感器1004上的兩種類型活細胞1008內的物質再分布(步 驟2214)。
應理解，這兩種類型的細胞可與例如以下細胞相關中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和含有過度表達靶受體的工程化CH0細胞。該方法不僅可進行多路細胞試 驗，而且因為兩種細胞除靶受體表達水平之外其餘都相同，所以通過比較同一 化合物施加於兩種不同細胞時產生的光學響應，該方法還可提供關於化合物對 靶受體作用的確切結果。
另一種實施方式中，採用圖23所示的方法2300，可加強本發明方法以在 同一時間進行多個基於活細胞的試驗。根據方法2300，可監測多種類型的活性 1008中由於激動劑誘導的GPCR活化引起的物質再分布，步驟如下(a)提供 含有光學LID生物傳感器1004陣列的小室(微量滴定板)(步驟2302) ; (b) 將第一種類型的活細胞1008置於覆蓋一個或多個光學LID生物傳感器1004的 細胞培養基中，從而第一種類型的活細胞1008能夠粘附於一個或多個光學LID 生物傳感器1004的表面1010 (步驟2304) ; (c) 將第二種類型的活細胞 1008置於覆蓋一個或多個未覆蓋的光學LID生物傳感器的培養基中，從而第二 種類型的活細胞1008能夠粘附於所述一個或多個未覆蓋的光學LID生物傳感 器1004的表面1010 (步驟2306) ; (d)向位於光學LID生物傳感器1004 的上表面1010上的細胞培養基中施加含有化合物的溶液(步驟2310);和(e) 詢問覆蓋的光學LID生物傳感器1010以監測時間依賴性光學響應1601，其代 表了各覆蓋的光學LID生物傳感器1004上的活細胞1008內的物質再分布(步 驟2312)。
應理解，可將含有不同靶受體基因的不同DNA載體以及轉染試劑陣列置於 LID傳感器上；放置一種類型的細胞，然後覆蓋這些載體和轉染試劑使細胞吸 收這些基因。因此，只有各位點上覆蓋的細胞被轉染並因此形成轉染的細胞簇 (US6544790 B1 "Reverse transfection method"("反向轉染方法"))。 類似地，可將一系列功能性受體蛋白與蛋白遞送試劑複合，然後用於類似的轉 染細胞簇 (US2004/0023391A1 "Methods and devices for protein delivery"("蛋白質遞送的方法和裝置")).利用當前技術，這兩種形式 的轉染細胞簇均可用於化合物篩選。
另一種實施方式中，採用圖24所示的方法2400，可進一步加強本發明方 法以在同一時間在一種類型的細胞中進行多個靶標篩選。根據方法2400，可篩 選一種類型的活細胞1008中針對多個GPCR1020的激動劑，步驟如下 (a) 提供光學LID生物傳感器1004 (步驟2402) ;(b)將活細胞1008置於覆蓋 光學LID生物傳感器1004的細胞培養基中，從而活細胞1008能夠粘附於光學
96LID生物傳感器1004的表面1010 (步驟2404) ; (c)施加(多種)拮抗劑 的混合(cocktail)溶液(步驟2406) ; (d)向位於光學LID生物傳感器1004 的上表面1010上的細胞培養基中施加含有化合物的溶液(步驟2408);和(e) 詢問光學LID生物傳感器1004以監測時間依賴性光學響應1601，其代表了活 細胞1008內的物質再分布(步驟24)。
應理解，通過改進方法2400，類似的方法可用於在相同的細胞系中篩選針 對多個受體的拮抗劑。不採用步驟2406中拮抗劑的混合溶液，而可採用感興 趣化合物的溶液；同時，激動劑的混合溶液用於代替步驟2408中的化合物溶 液。
(1)運輸動力學研究的重要性
與細胞信號傳遞途徑、相關的細胞活性和其它細胞變化有關的動力學不僅 對於理解細胞生物學和生理很重要，而且對於細胞試驗的開發和藥物發現也很 重要。例如，EGFR信號傳遞網絡包括的反應從幾乎是瞬時的反應(配體結合後 的受體磷酸化)到持續很多分鐘的反應(小泡的形成或溶酶體分裂)或某些細 胞系的形態變化。EGFR的運輸在很多步驟被調控，包括胞吞、早期內含體分揀 和溶酶體靶向。內化之後，EGFR被轉回質膜或被運輸到晚期或多泡內含體。晚 期內含體中的受體再被分揀到溶酶體進行降解或循環回細胞表面。受體的佔據 (結合)狀態表明它們能夠參與分揀過程的各歩驟。雖然EGFR信號級聯的主 要分層結構和其活化順序已經公知，但對於控制這麼多種細胞響應(如細胞生 長、存活或分化)的複雜動力學網絡和關鍵信號傳遞事件的了解很少。可監測 對配體介導的EGFR活化的細胞響應的實時動力學的技術將大大有利於了解信 號級聯和網絡的動力學。
(2) G-蛋白偶聯受體途徑
GPCR屬於細胞表面受體家族，是設計新藥物化合物最常針對的耙點之一。 因為GPCR可將外源信號(即刺激物例如新藥的存在)轉導為細胞內響應，這 使它們極有價值作為藥物靶點和用於新藥測試。
GPCR參與多種細胞信號傳遞途徑。配體結合啟動了一系列細胞內和細胞信 號傳遞事件，包括受體構象變化，受體寡聚化，G蛋白活化(GDP-GTP在G。亞 單位上互換，G。和Gh解離，G蛋白與受體分離，產生G「和Gp、—信號傳遞復
97合物)，和導致產生第二信使(C,移動，產生肌醇三磷酸，和/或細胞內cAMP
水平的調節)並最終導致具體基因表達變化的下遊信號傳遞活化。配體介導的
GPCR活化還導致GPCR從細胞表面脫敏、很多細胞內蛋白的運輸，以及靶細胞 的表型、形態和物理特性的變化。這些變化可以是靜態的、長久的或動態的(例 如，循環或擺動)。不同的信號傳遞事件顯示出顯著不同的動力學，從毫秒(例 如GPCR構象變化)至幾十秒(例如Ca"流)至甚至幾十分鐘(例如基因表達或 形態變化)。現有的GPCR試驗包括配體-受體結合試驗、第二信使(Ca2+、 IP3 的cAMP)試驗、蛋白相互作用試驗、移位試驗和報告基因試驗。因為GPCR活 化最終導致蛋白運輸和/或形態變化，所以需要可研究任意化合物通過GPCR對 細胞表面的作用以及被作用的細胞的後續事件(例如，運輸和/或形態變化) 的方法。
(3)受體酪氨酸激酶(RTK)信號傳遞途徑 (a) RTK的多樣性
在所有真核生物中， 一大類基因編碼的蛋白質的功能是作為跨膜細胞表面 受體。基於它們識別的配體、誘導的生物學反應以及其一級結構，膜受體可分 為不同的家族。 一個很大的細胞表面受體家族具有內在受體酪氨酸激酶(RTKs) 活性，催化ATP的磷酸根轉移到靶蛋白酪氨酸的羥基上。RTKs在很多基本細胞 過程的控制中發揮重要作用，這些細胞過程包括細胞周期、細胞遷移、細胞代 謝和存活、以及細胞增殖和分化。
受體酪氨酸激酶(RTKs)屬於蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的一個超家族。PTKs 是一個很大的、多樣性的多基因家族。它們的主要功能包括調控生物體的多細 胞方面。與生長、分化、貼壁、運動和死亡有關的細胞至細胞的信號常常通過 酪氨酸激酶傳遞。相反，很多絲氨酸/蘇氨酸家族，如周期蛋白依賴性激酶和 MAP激酶，在真核生物中是保守的，調控單細胞和多細胞生物體中的過程。人 類中，已證明酪氨酸激酶在很多疾病狀態(包括糖尿病和癌症)的發展中發揮 重要作用。歷史上，酪氨酸激酶確定了一類致癌基因的原型，參與大多數人類 惡性腫瘤。酪氨酸激酶基因還與很多先天性症候群有關。酪氨酸激酶含有高度 保守的催化結構域，與蛋白絲氨酸/蘇氨酸和雙特異性激酶中類似，但它還有 獨特的亞結構域基序清楚地表徵這些成員是酪氨酸激酶。已在海綿動物、刺胞 動物、線蟲、環節動物、節肢動物、棘皮動物、脊索動物以及其它動物中鑑定
98到酪氨酸激酶。基於內含子/外顯子結構或系統發生序列分析，人類的酪氨酸 激酶可分類為20種受體和IO種非受體類別。
所有受體酪氨酸激酶都含有通常是糖基化的並參與受體二聚化的胞外配 體結合結構域。該配體結合結構域通過一個跨膜螺旋連接於胞質酪氨酸激酶結 構域。胞質結構域含有保守的蛋白酪氨酸激酶(PTK)核心和另外的調控序列， 它們自身磷酸化並被異源蛋白激酶磷酸化。RTK可進一步分類為幾個受體亞家 族例如，胰島素受體(IR)家族、表皮生長因子(EGF)受體家族、PDGF受 體家族。受體酪氨酸激酶的表皮生長因子(EGF)家族由四個受體組成EGF-R (ErbBl) 、 ErbB2 (Neu) 、 ErbB3和ErbB4。
(b) RTK的二聚化
除RTK的胰島素受體(IR)家族之外，所有巳知的RTK (例如表皮生長因 子(EGF)受體、PDGF受體)在質膜中都是單體。配體結合誘導了這些受體的 二聚化，導致其細胞質結構域的自身磷酸化。IR家族成員是形成22-異二聚體 的兩條多肽鏈通過二硫鍵連接的二聚體。胰島素結合於IR的胞外結構域，誘 導四元的異源四聚體結構重構，導致胞質結構域的自身磷酸化增加。
雖然所有RTK都通過二聚化活化，但不同配體誘導形成不同的活化二聚體 狀態。具體的配體限定二聚體對；二聚體對繼而限定信號傳遞途徑。生長激素 (GH)和GH受體(GHR)的複合、促紅細胞生成素(EPO)和EPO受體(EPOR) 的複合的結構研究表明，這些細胞因子是二價的， 一個配體同時結合於兩個受 體分子，形成1:2 (配體受體)複合物。受體二聚化被另外的受體受體相 互作用進一步穩定。只有RTK和細胞因子受體的胞外和細胞質結構域均具有獨 特構型的某些形式的受體二聚體導致反式自身磷酸化和PTK刺激。
(c) EGFR
EGR受體，如上所述由四個成員組成，屬於受體酪氨酸激酶家族，事實上 在哺乳動物所有器官中都表達。在胚胎和出生後發育以及腫瘤進展中，EGF受 體發揮的作用很複雜。除它們在生長和發育中的作用之外，EGFR受體還參與轉 活過程，和其它受體如GPCR有交叉。
(d) EGFR信號傳遞途徑
99EGFR和其相應配體的結合導致產生很多細胞內信號(如圖38所示)。配 體結合後，最初的變化是受體二聚化形成同二聚體或與其它家族成員的異二聚 體，受體激酶活性的活化和受體在細胞質結構域的酪氨酸殘基上的自身磷酸 化。受體自身磷酸化為很多二級信號蛋白產生了停泊位點，這些二級信號蛋白 帶有特定的蛋白相互作用結構域如Src同源區2 (SH2)結構域，其與磷酸化 的酪氨酸殘基特異性相互作用。各二聚化的受體複合物通過募集不同的含有 SH2的效應子蛋白而啟動不同的信號傳遞途徑。作為這種相互作用的結果，這 些二級信號蛋白自身被活化並引發很多下遊信號。例如，活化的EGF-R二聚體 與接頭蛋白Grb複合，Grb偶聯於鳥嘌呤核苷酸釋放因子SOS。 Grb-S0S複合物 可直接結合受體中的磷酸酪氨酸位點，或通過Shc間接結合。這些蛋白相互作 用使SOS非常靠近Ras，從而使Ras活化。這又繼而活化ERK和JNK信號傳遞 途徑，它們繼而活化轉錄因子，例如c-fos、 AP-1和Elk-l，這些轉錄因子促 進基因表達並有助於細胞增殖。促進細胞增殖的一個具體途徑包括信號蛋白 Shc、 Grb2、 Sos、 Ras、 Raf、 MEK、 ERK禾口 ERK/MAPK，稱為Ras/MAPK途徑。
(i) EGra信號傳遞和物質再分布
EGFR的配體包括EGF、 TGF-ci 、雙調蛋白、肝素結合EGF樣生長因子、P -動物纖維素和表皮調節蛋白(印iregulin) 。 EGFR可被很多不同配體之中任 何一個的結合而活化，各配體似乎刺激產生多少不同的生物反應。而且，隨著 受體微環境例如小泡內pH值的不同，不同的EGFR配體結合受體的能力不同。
結合後，活化的EGFR迅速被胞吞作用內化。受體介導的胞吞作用可使細 胞表面受體特異性去除、從質膜卸除並使它們靶向內含體，在那裡它們被分揀 以使之下調或進行再循環。胞吞之後，受體-配體複合物經過幾個不同的區室， 這些區室中的小泡內環境不同。受體在細胞區室間移動(稱為運輸)對複合物 活性具有重要作用。不同細胞內區室對一些EGFR激酶底物的可獲得性也不同。 不同的胞吞區室中底物可獲得性和依賴配體的活性之間的聯合關係暗示，運輸 能夠"解碼"各配體獨特的信息。而且，配體-受體相互作用的持續性控制受 體運輸。因此，受體胞吞和降解是控制信號大小、反應特異性和反應持久性的 重要機制
配體誘導的EGFR內化是一個可飽和的過程，EGFR表達水平的增加超過某 個閾值將導致受體內化的削弱。
100EGF受體的內化可通過誘導途徑或組成型途徑。通過誘導途徑形成的小泡 稱為被膜小窩(coated-pit)介導的早期內含體(EE)小泡。所有EE小泡都 經過分揀階段，它們可返回細胞表面或合併到晚期內含體(LE)中。當EE小 泡再循環回到質膜(PM)時，所有它的受體都成為PM的一部分，任何未結合 的配體都被釋放到胞外介質中。類似地，當EE細胞合併入LE時，其所有內含 物都被轉移到LE。再循環回到質膜的速率和合併入晚期內含體的速率取決於 EE小泡的類型。胞吞小泡以很快的速率或延時之後(即，緩慢)被再循環回到 質膜。 一般，被膜小窩EE小泡緩慢再循環回到質膜，很大百分比的被膜小窩 EE小泡合併到LE。相反，組成型EE小泡具有更快的再循環速率，因此它們大 多數返回到質膜。受體在LE中經過第二階段的分揀，被標記然後降解並送到 溶酶體，或者再循環回到細胞表面。小的囊泡以一定速率從執行分揀的內含體 逃脫。這種囊泡或融合入溶酶體使其內含物被降解，或再循環回到質膜。從機 械學上講，從晚期內含體再循環的受體可能經過高爾基體。這些胞吞過程的淨 結果導致EGFR活化後細胞中的定向物質再分布。
取決於具體細胞系中的細胞情況，配體誘導的EGFR活化可導致不同的信 號傳遞途徑或多個信號傳遞途徑，其中一個信號途徑相對於其它信號途徑佔優 勢。而且，各細胞系的EGFR表達水平可能不同。因此，不同細胞系中，細胞 中由配體誘導的EGFR活化而介導的物質再分布可能不同。例如，人表皮樣癌 A431細胞已知可內源性過度表達EGFR (~1，700, 000拷貝/細胞)，因此已被 用作EGFR信號傳遞的理想模型 (D. W. Barnes, "Epidermal growth factor inhibits growth of A431 human epidermoid carcinoma in serum—free cell culture," J. Cell. Biol. 1982， 93， 1 - 4) 。 EGF結合之後，A431中的EGFR 被活化，導致通過不同途徑(包括Ras/MAPK途徑)導致多種細胞響應。例如， 37。C用EGF刺激休眠的A431細胞導致受體胞吞、可折射的(refractile)形 態變化和細胞從胞外基質脫離 (Z. Lu, G. Jiang， P. Blume-Jensen, and T. Hunter, "Epidermal growth factor—induced tumor cell invasion and metastasis initiated by d印hosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase, ，， Mol. Cell Biol. 2001， 21， 4016 - 4031，禾口 Y. Danjo 禾口 I. K. Gipson， "Actin 'purse string' filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement, ，， J". Cell Sci.1998， 111， 3323 - 3332)。另外，受體胞吞是弱化EGF信號的重要細胞過程， 雖然一些證據暗示EGF受體複合物在內含體區室中繼續進行信號傳遞。胞吞過 程包括多個步驟細胞內組分募集到活化的受體，產生的複合物隨後內化到內 含體，內化的受體複合物在幾個細胞內區室間移動，最終降解和再循環回到細 胞表面。此外，因為這些配體的大小、細胞表面受體的密度、所用細胞系(如 A431細胞系)的密度和形態以及活化後受體的運輸，在RTK途徑中有很多信號 傳遞事件導致定向物質再分布。例如，配體結合到細胞表面EGFR導致細胞表 面的質量增加；隨後的自身磷酸化和細胞內組分與活化的EGFR的相互作用導 致短時期內物質再分布的淨零變化。活化的受體的運輸導致各細胞不同區室內 顯著的物質再分布。
物質再分布的另一個可能來源是細胞骨架重構。例如，受體募集到質膜處 的網格蛋白小窩啟動EGFR運輸過程，網格蛋白小窩是將網格蛋白和接頭組裝 到質膜細胞溶質表面上的蛋白網格而形成的結構。網格蛋白多聚化成六角形陣 列中為組織接頭提供了骨架，接頭識別內化受體的細胞質結構域的序列基序。 雖然連接肌動蛋白絲和胞吞機器的具體組分還不清楚，但據信肌動蛋白細胞骨 架有助於網格蛋白小窩的形成。皮層肌動蛋白(Cortactin)是F-肌動蛋白相 關蛋白，位於培養細胞的質膜褶皺處，是大GTPase發動蛋白(dynamin)的直 接結合配對蛋白。皮層肌動蛋白和肌動蛋白、發動蛋白一起，是受體介導的胞 吞機制的重要組分 (Bajzer， Z.，等，"Binding internalization, and intracellular processing of proteins interacting with recycling receptors - a kinetic analysis" ， J. Biol. Chem. 1989， 264:13623 - 13631)。
(ii) EGFR的組成型活性
據認為，受體單體與受體二聚體平衡。很有限的一部分受體二聚體胞外和 胞質結構域的四聚結構構型與反式-自身磷酸化和PTK活性的刺激相容(活性 二聚體)。結合於胞外結構域的配體穩定了活性二聚體的形成並因此穩定了 PTK 刺激。已提出，即使不存在配體結合，也存在活性二聚體，因為即使不存在配 體結合，RTK的自身磷酸化也可被蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑加強或被受體過 度表達而加強。實驗顯示，每分鐘質膜上2%的未結合(無配體)受體和15% 配體結合的受體被內化。而且，在用含相對低濃度生長因子如胎牛血清(FBS)
102(低於0.5重量％)或無FBS的培養基培養獲得的休眠A431細胞中，由於其 為組成型，仍然有一定程度的EGFR磷酸化。
圖7表示EGF剌激導致強烈的劑量依賴性動態響應(見圖7A) ; EGF濃度 增加時，限定響應的三種主要生物傳感器參數顯著改變。EGF濃度越高，l)P-D服 和N-DMR信號的振幅越大，2) P-DMR和N-DMR事件的動力學越快，禾B 3)導致 P-DMR至N-DMR事件轉換的時間(轉換時間t )越短。當P-薩R事件的振幅顯 示與EGF濃度的並發(complicate)關係時，N-DMR信號的振幅顯示對EGF的 強烈和可飽和性劑量依賴，產生EC50為約1.45 nM (見圖7b)。隨著EGF濃 度增加，發現以秒計算的轉換時間t呈指數減少(見圖7c):另外，N-D服信 號的衰減可用非線性回歸擬合。獲得的一相衰減常數K也產生通常的可飽和反 應，Kd為5. 76nM (見圖7d)。那些劑量依賴性動力學參數(轉換時間和N-D服 相的衰減常數)和以前與耙基因C-fos在HeLa細胞中表達的動力學和EGFR胞 吞的動力學有關的實驗數據和計算機預測很好的吻合(Schoeberl， B. ， C. Eichler-Jonsson， E. D. Gilles， and G. Muller. "Computational modeling of the dynamics of the MAP kinase cascade activated by surface and internalized EGF rec印tors" . Nat. Biotech. 2000， 20:370 - 375)。這 些結果表明，EGF誘導的細胞形態改變和受體胞吞是DMR事件，D服是EGFR活 化依賴性事件。
(e) PDGFR
與EGFR類似，血小板衍生的生長因子(PDGF)已證明可驅動細胞反應， 包括增殖、存活、移動和細胞外基質的沉積以及組織重塑因子。敲除研究證明， 對PDGF的很多細胞響應在小鼠發育過程中是很重要的。有兩種配體，PDGFa和 PDGFb，兩種受體，PDGF受體a和PDGF受體P (分別是PDGFR a禾卩PDGFR P )。 PDGFb和PDGFRI3對維管系統中支持細胞的發育很重要，而胚胎發生過程中更 廣泛地需要PDGFa和PDGFR a ，它們在很多情況下發揮重要作用，包括中樞神 經系統、神經嵴和器官發育。
PDGF信號傳遞網絡由四種配體PDGFA-D和兩種受體PDGFR a和PDGFRfi組 成。所有的PDGF都作為分泌型、二硫鍵連接的同二聚體發揮作用，但只有PDGFA 和B可形成功能性異二聚體。PDGFR也可作為同或異二聚體發揮功能，體外試 驗已證明配體對a 13和郎受體的親和性不同。所有已知的PDGF都具有特徵性
103"PDGF結構域"，包括參與分子間和分子內鍵的八個保守性半胱氨酸。
PDGFR是受體酪氨酸激酶，就象EGFR—樣。各受體在胞外配體結合結構 域有五個免疫球蛋白重複，在胞質區有一個分裂酪氨酸激酶結構域。配體結合 之後，PDGFR 二聚化，激活酪氨酸激酶結構域，然後在受體胞質結構域自身磷 酸化幾個酪氨酸殘基。這為信號蛋白和接頭創造了停泊位點，這些信號蛋白和 接頭在PDGFR結合後啟動信號傳遞。兩種受體可活化很多同樣重要的信號傳遞 途徑，包括Ras-MAPK (分裂素活化的蛋白激酶)，磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K) 和磷脂酶C途徑。然而，與PDGFRa和PDGFRI3相互作用的蛋白譜有輕微差別， 導致它們在體外的功能性有一些差別。
與EGFR信號傳遞途徑類似，PDGFR的活化也可導致可被光學生物傳感器監 測並分析的顯著物質再分布。
(f)其它RTK
酪氨酸激酶主要可分為受體酪蛋白激酶(RTK)，例如EGFR、 PDGFR、 FGFR、 IR，禾口非-受體酪蛋白激酶(NRTK)，例如SRC、 ABL、 FAK和Janus激酶。除 EGFR和PDGFR之外，其它受體酪氨酸激酶包括胰島素受體、胰島素樣生長因子 I受體 (IFG-1R)、神經生長因子受體(NGFR)、成纖維細胞生長因子受體 (FGFRs)。類似地，這些RTK不僅是細胞表面跨膜受體，而且是具有激酶活 性的酶。受體酪蛋白激酶的結構組織顯示多結構域的細胞外配體(用於傳遞配 體特異性)、單通路(single pass)跨膜螺旋和含有酪氨酸激酶結構域的細 胞溶質部分。激酶結構域在N端和C端都有規則序列。
NRTK細胞溶質蛋白，顯示可觀的結構可變性。NRTK具有激酶結構域，並 且常具有幾個另外的信號傳遞或蛋白-蛋白相互作用結構域如SH2、SH3和ra結 構域。酪氨酸激酶跨越約300個殘基，其N末端部分(lobe)由5條鏈的P片 層和一個a螺旋組成，C末端是一個大的胞質結構域，主要是a螺旋。ATP 結合到兩個末端部分(lobe)之間的裂口中，含有酪氨酸的蛋白質底物序列與 C末端部分(lobe)的殘基相互作用。通過配體結合於細胞外結構域，然後受 體二聚化，促進細胞溶質結構域的轉磷酸化，從而活化RTK，而NRTK的活化機 制要更為複雜，包括異源蛋白-蛋白相互作用以發生轉磷酸。
(4)細胞骨架調節
104細胞骨架是細胞質中含有的獨特的細胞"架構"或"骨骼"。細胞骨架是 複雜和動態的蛋白纖絲網絡，延伸經過真核細胞的細胞質。細胞骨架參與執行 細胞中的多種活性。它通過為細胞提供抗張強度而維持細胞形狀。它還引起一 些運動(利用鞭毛和纖毛等結構)，在細胞內運輸(例如，小泡和細胞器的運 動)和細胞分裂中發揮重要作用。通過提供"軌道"使細胞可在上面移動細胞 器、染色體和其它物質，細胞骨架參與細胞內信號傳遞和運輸。
細胞骨架賦予真核細胞形狀和組織。細胞骨架的長纖維是亞單位的多聚 體。組成細胞骨架的主要纖維類型是微絲、微管和中間絲。(i)微絲是由一 串蛋白組成的扭曲雙鏈，通常7mn至12cm長。蛋白是肌動蛋白。其功能有助 於肌肉收縮、細胞形狀和細胞質中的運動。(ii)中間絲由八個亞單位組成索 狀。這些蛋白的結構在不同組織類型中也不同。該組分有助於維持形狀、支持 神經細胞延伸和粘附細胞。(iii)微管是由形成螺旋的兩部分亞單位的管構 成。它由微管蛋白組成，有助於染色體移動、細胞器移動、纖毛和鞭毛的移動。 例如，在腸內皮細胞中，存在所有這三種類型的纖維。微絲伸入絨毛中，賦予 細胞表面以形狀。微管從中心體長出至細胞周緣(pheriphery)。中間絲通過 橋粒連接相鄰細胞。
(a)細胞骨架結構
細胞骨架是細胞的"架構"或"骨骼"，象所有其它細胞器一樣，包含在 細胞質中。它是一種動態結構，維持細胞形狀，引起一些運動(利用鞭毛和纖 毛等結構)，在細胞內運輸(例如，小泡和細胞器的運動)和細胞分裂中發揮
重要作用。真核細胞有三種細胞骨架蛋白絲肌動蛋白絲、中間絲和微管
(Janmey， P. A. ( 1998) . The cytoskeleton and cell signaling: component
localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78， 763-781))。
肌動蛋白絲直徑約7nm。該蛋白絲由兩個肌動蛋白鏈組成螺旋狀。它們主要集
中於質膜下，因為它們保持細胞形狀，形成胞質突起(如偽突起和微絨毛)， 參與一些細胞-細胞或細胞-基質的連接以及信號的轉導。它們對於胞質分裂
(和肌球蛋白一起)以及肌肉收縮也非常重要。中間絲直徑約8-11納米。它 們是細胞骨架中更穩定(強烈結合)和異源的組分。它們組織細胞內部的三維 結構(例如，它們是核膜或肌節的結構成分)。它們也參與一些細胞-細胞和 細胞-基質的連接。微管是約25nm的中空圓柱狀結構，由13根原絲組成，這些原絲是a和e微管蛋白的多聚體。它們的行為非常動態，結合GTP以進行多 聚化。它們由中心粒組織。這些蛋白絲在細胞內運輸(與動力蛋白和驅動蛋白 一起，運輸細胞器如線粒體或小泡)和有絲分裂紡錘體中發揮重要作用。
(b)生物物質從經透化處理的細胞中有控制地釋放
關於生物物質從經透化處理的細胞中有控制地釋放的描述可見 Negrutskii， B. S.禾口 Deutscher， M. P. ( 1992 ) "A sequester pool of aminoacyl-tRNA in mammalian cells，， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 3601-3604; Negrutskii， B. S. ， Stapulionis, R.和Deutscher， M. P. (1994) "Supmmolecular organization of the mammalian translation system" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 3601-3604，整體納入本文作為參考，至少 針對與生物物質從經透化處理的細胞中有控制地釋放相關的描述。
活細胞是一個大分子的集合。很多研究已證明，內源性大分子通過直接結 合於細胞骨架成分而在哺乳動物胞質中具有高度組織性。細胞骨架，尤其是肌 動蛋白微絲網絡在維持這種組織性方面具有重要作用。
經透化處理的細胞已被用於檢測細胞結構。用很多化學品或生物製品處理 細胞可在細胞表面上形成孔，產生透化的細胞。這些化學品或生物製品包括去 汙劑如皂苷和菲律賓菌素(filipin)，或毒素如毛地黃皂苷或鏈球菌溶血素0。 然而，與其它成孔試劑相比，如果仔細滴定，皂苷對內部膜造成的損傷最小， 並且可產生很均勻的透化細胞群(〉97%)。皂苷是一種衍生自植物的糖苷，以 其可使質膜產生允許可溶性蛋白分散的足夠的孔隙而知名。雖然皂苷處理的細 胞會損失一部分生物大分子，但產生的透化細胞仍然保持了活細胞的大部分生 物功能。這一點已得到以下事實的支持雖然蛋白質合成是一個很複雜的過程， 但這些透化細胞中的蛋白質合成保持較高水平，說明該系統保持了完整細胞的 很多原有結構完整性。這是因為大部分大分子是作為有組織的細胞結構而被隔 絕的(sequestered)，所以它們不會從這些透化細胞中釋放出來。例如，在 透化細胞中，翻譯機器的組分，如tRNA、氨醯-tRNA合成酶、和EFl通常是高 度隔絕的。不但蛋白質合成機器被細胞骨架隔絕，細胞的很多其它組分也穩定 地或瞬時地與細胞結構相結合；這些瞬間結合的組分可從透化細胞中部分釋放 出來。
然而，微絲被破壞之後，蛋白質合成顯著減少，伴隨著這些翻譯組分從細
106胞中釋放。另外，細胞骨架結構破壞之後，很多其它隔絕的生物大分子也從透 化細胞中釋放出來。這些從透化細胞中再被釋放的物質引起質量損失；因此導 致LID傳感器表面上的細胞層的有效折射率變化，這種變化可被LID傳感器檢 測到。因此，用光學生物傳感器獲得的變化可用於指示幹擾細胞骨架結構的調 節劑。
通常，篩選幹擾細胞骨架結構的調節劑的方法主要基於採用體外試驗的結 合親和性檢測，包括肌動蛋白結合蛋白試驗、微管穩定性/去穩定性試驗和肌 動蛋白/微管多聚化試驗。其它方法基於高解析度螢光顯像技術，直接觀察細 胞內骨架結構，或者在化合物處理後檢測細胞運動性，或檢測細胞骨架相互作 用標記物蛋白如Cdc42或Rho的活化。
本文公開了無標記檢測方法，採用光學生物傳感器篩選幹擾細胞骨架結構 的調節劑。
公開了光學生物傳感器領域的一些方法，在某些實施方式中，公開了採 用光學標記獨立性檢測(LID)生物傳感器(例如基于波導光柵的生物傳感器) 實時監測化合物誘導的細胞內組分釋放的系統和方法，所述細胞內組分在透化 細胞和功能性細胞中被細胞骨架隔絕。公開了一種方法，採用化學品或生物制 品產生可允許可溶性蛋白質擴散通過的透化細胞。公開了使用光學LID生物傳 感器篩選細胞骨架組分的調節劑的系統和方法。
與所有研究細胞骨架結構的現有試驗技術不同，本文公開的方法提供無標 記的實時方法來篩選幹擾細胞骨架結構的調節劑。此外，與所有研究細胞骨架 結構的現有的基於細胞的試驗不同，本發明方法利用保持了活細胞的大多數生 物功能、但比活細胞簡單得多的透化細胞。與一般針對單個耙標篩選調節劑的 基於螢光顯像的試驗不同，本發明方法提供多路能力，即可篩選細胞中幹擾多 個靶標的調節劑。與完全內反射螢光顯像技術結合，本發明方法提供高信息含 量的篩選，包括動力學、親和性、涉及的靶標以及毒性。
圖25表示基於實時檢測化合物誘導的細胞內組分釋放的方法的實施例， 所述細胞內組分在透化和功能性細胞中被細胞骨架隔絕。該方法包括使用成孔 劑(如皂苷)產生允許可溶性蛋白質擴散通過的透化細胞。已知用很多成孔劑 處理細胞可產生透化細胞。因為細胞內大分子通過直接結合於細胞骨架成分而 在哺乳動物細胞質中具有高度組織性，所以雖然皂苷處理的細胞損失了一部分 生物大分子，但透化細胞通過細胞骨架超-集合的結構隔絕細胞內機器而仍然
107保留了活細胞的大多數生物功能。然而，微絲被破壞之後，蛋白質合成顯著減 少，伴隨著這些翻譯組分從細胞中釋放。另外，細胞骨架結構破壞之後，很多 其它隔絕的生物大分子也從透化細胞中釋放出來。這些從透化細胞中再被釋放 的物質引起質量損失；因此導致LID生物傳感器表面上的細胞層的有效折射率 變化，這種變化可被LID生物傳感器檢測到。因此，用光學生物傳感器獲得的 變化可用於指示幹擾細胞骨架結構的調節劑。 一種實施方式中，可用圖25所 示的方法2500篩選擾細胞骨架結構的調節劑。根據方法2500，可監測由於成 孔劑如皂苷在活細胞1008中誘導的細胞表面膜成孔而造成的物質再分布，步 驟如下(a)提供光學LID生物傳感器1004 (步驟2502) ; (b)將細胞培 養基中的活細胞1008置於所述生物傳感器1004上(歩驟2504) ; (c)任選 施加緩衝溶液(步驟2506) ; (d)將含有化合物的溶液加入覆蓋的光學LID 生物傳感器1004上表面1010上的細胞培養基中(步驟2508);施加含有成孔 劑的溶液(歩驟2510);和(e)詢問覆蓋的光學LID生物傳感器1010,監測 時間依賴性光學響應，其表明了透化細胞1008中的物質再分布(步驟2512)。 成孔劑是接觸細胞時可導致細胞表面膜形成孔隙的化學或生物化合物或組合 物。
通常，本文所述用光學生物傳感器進行的與細胞功能或活性相關的檢測或 試驗可實時進行。雖然很多光學輸出信號可用於細胞監測和檢測，與刺激誘導 的定向物質再分布動力學相關的輸出參數是實時監測細胞信號傳遞及其結果 的兩個參數。
細胞信號傳遞途徑，包括但不限於Ras/MAPK途徑、cAMP途徑、GPCR信 號傳遞途徑、RhoA途徑、Akt途徑、整聯蛋白(intregin)途徑、GPCR弱化途 徑、G蛋白途徑、Ca途徑、磷脂酶C途徑、細胞轉化途徑、細胞遷移途徑、 細胞粘附途徑等，可與用光學生物傳感器檢測到的D服信號相關。例如，MAPK 激酶途徑的活化已鑑定為在細胞擴展或移動過程中利用整聯蛋白調控基因表 達從而導致細胞形態變化的一種機制。上皮細胞響應於細胞外基質(ECM)， 引起整聯蛋白介導的FAK磷酸化，繼而磷酸化周圍的蛋白(樁蛋白(paxillin)、 Fyn/shc、和src)，導致信號放大。FAK還結合PI-3激酶，並在MAP激酶途 徑的上遊。當MAP激酶或PI-3激酶被抑制，阻斷了肌動蛋白的重新組織。Src 磷酸化pl90RhoGAP，使其GAP功能失活(使RhoGTP保持更長久的活性)，促 進進一步信號放大。活化的RhoGTP結合下遊激酶如與Rho結合的巻曲的含巻曲蛋白激酶 (pl60ROCK)和p140透明(diaphanous) (pl40Dia)，從而 增加肌動蛋白多聚化和收縮。肌動蛋白的重新組織有助於整聯蛋白成簇，產生 更多ECM結合，增加FAK活化和其它信號傳遞事件。因為細胞信號傳遞途徑及 其在細胞中產生的結果強烈依賴於細胞背景，因此應理解對於給定的細胞類 型，通過特定和預定的靶標活化給定的信號途徑可能不導致任何DMR (即，刺 激可能只導致淨零DMR相)，或一些情況下，引起的DMR響應和使用不同細胞 系時獲得的響應不同。而且，通過不同靶標(例如，GPCR和RTK)引起的刺激 介導的特定信號傳遞途徑的活化可導致同一種細胞類型相同或不同的DMR響 應。換句話說，由通過特定靶標引起的刺激介導的DMR代表了多種細胞信號網 絡相互作用的整合的和代表性的結果。而且，剌激誘導的細胞響應可能還依賴 於細胞條件(例如，增殖vs休眠狀態，或分化vs未分化，細胞周期狀態一 一G1 vs其它狀態，等)。 一些情況下，粘附於傳感器表面的細胞可能需要預 先處理以達到希望的狀態。例如，為了研究某些靶標對某具體信號傳遞途徑造 成的最終導致細胞生長和增殖和/或分化的刺激誘導性活化，優選細胞處於休 眠狀態。為了達到休眠狀態，需要用只有很少或沒有任何生長因子或刺激細胞 生長和增殖的類似因子的培養基預處理處於增殖狀態的細胞。因為細胞的功能 和動態，預處理時間對達到希望的狀態也很重要。
本文公開了具體用於研究細胞途徑的活化及其結果的方法，該方法需要預 處理細胞使其達到休眠狀態而非增殖狀態。RTK可作為例子。 一種實施方式中， 公開了實時監測細胞中的配體結合以及相繼的信號傳遞事件的方法，包括
(a)提供基於光學的無標記生物傳感器；(b)將具有受體酪蛋白激酶的細胞 置於傳感器表面；細胞懸浮在含有生物傳感器表面的細胞貼壁和生長所需某濃 度血清的培養基中；(c)任選在37'C不含或含有低濃度血清的培養基中培養 貼壁細胞使其飢餓；(d)將具有一層所述細胞的生物傳感器置於檢測系統中， 監測響應；(e) 任選在某時間中向細胞培養基中至少施加一次緩衝溶液；
(f)任選向培養基中施加含有RTK配體的溶液；和(g)監測所述貼壁細胞 層的時間依賴性響應。優選對具有RTK的細胞進行飢餓處理以使細胞對配體的 響應最大化，因為在血清中可找到很多生長因子。這些生長因子包括PDGF (血 小板衍生的生長因子)、EGF、胰島素、TGF-a 、胰島素樣生長因子I (IGF-I)、 和神經生長因子(NGF)。不含或含有低濃度( 0. 5。/。)血清或牛血清白蛋白(BSA) 的培養基可用於使細胞飢餓。飢餓時間通常包括過夜飢餓。應理解，本文公開
109的這些方法不限於RTK信號傳遞途徑；可用於很多其它類型的靶標，如促有絲 分裂的GPCR及其配體。
另一種實施方式中，公開的方法用於檢測和確定細胞中RTK的表達水平和 細胞表面表達水平，該方法包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，各孔具
有嵌在底部的基於光學的無標記生物傳感器；(b)提供多種類型的細胞；(C) 將懸浮在培養基中的一種類型的細胞置於至少一個孔中；(d)在合適的培養 基中培養細胞使其貼壁和生長直到達到一定水平的鋪滿度；(e)將具有生物
傳感器的微量滴定板(各生物傳感器覆蓋有一層細胞)置於檢測系統中，監測
響應；(f)向培養基中施加含有RTK配體的溶液；(g)監測和比較不同細胞
類型的細胞層的時間依賴性響應。不同細胞類型可能需要不同培養基。對於同
一類型的細胞，可用不同的培養基研究培養基對感興趣的RTK在細胞表面表達 水平的影響。
另一種實施方式中，公開的方法利用光學生物傳感器確定配體對RTK的效 力，該方法包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，各孔具有嵌在底部的基 於光學的無標記生物傳感器；(b)在培養基中提供一定數目的、具有相對高 水平RTK表達的細胞，使細胞以所需覆蓋率粘附於各生物傳感器；(c)更換 培養基使粘附的細胞飢餓一段時間；(d)將具有生物傳感器的微量滴定板(各 生物傳感器覆蓋有一層細胞)置於檢測系統中，監測響應；(f)向覆蓋各生 物傳感器的培養基中施加含有不同濃度配體的溶液；(g)監測和比較細胞的 劑量-和時間-依賴性響應。劑量依賴性結合和DMR信號及其相應的動力學可 用於確定配體對感興趣RTK的效力。應理解，這些方法也可用於確定抑制劑對 下遊靶標的效力，所述下遊信號在由於RTK或其它信號分子的活化以及後續細 胞變化而產生的總D服信號中有重要作用。例如，休眠A431細胞的EGF誘導 的D服信號可被以下信號細調或受其影響下遊信號例如MEK1/2、 或肌動蛋 白絲多聚化、或發動蛋白或受體激酶活性，或上遊信號分子如某些GPCR激動 劑包括氯化氨甲醯膽鹼。也可利用靶標調節劑獨特的DMR特徵或其對獲得的總 DMR信號的作用來檢測調節劑的效力。
還公開了影響RTK信號傳遞的調節劑的篩選方法。該方法包括(a)提 供基於光學的無標記生物傳感器；(b) 將具有感興趣RTK的一定數目的細胞 置於培養基中覆蓋所述生物傳感器從而細胞粘附於生物傳感器表面；(c)用 所述生物傳感器監測細胞響應；(d)向細胞培養基中施加一定濃度含有化合物的溶液；(e)施加含有RTK配體的溶液並連續監測生物傳感器上培養的細 胞的時間依賴性響應。
(5)檢測膽固醇運輸
細胞膜上膽固醇正確的細胞內分布對哺乳動物細胞的很多生物功能非常 重要，其中包括信號傳遞和膜運輸。膽固醇在膜運輸中的突出作用正變得日益 明顯。例如，位於質膜上的膽固醇耗竭抑制網格蛋白介導的胞吞，但小泡再循 環似乎不受影響。既然直接檢測膽固醇不可行，已開發了幾種間接方法來研究 膽固醇的細胞內分布和脂類信號傳遞。利用非浸透(impermeant)淬滅劑進行 螢光甾醇的發射淬滅已用於確定膽固醇在質膜中的跨膜雙層(transbilyar) 分布。然而，這種方法並不理想，部分是因為螢光膽固醇類似物相比膽固醇在 性質上可能有量上的差別。而且，雖然膽固醇在水中溶解度很差，但它能夠以 可察覺的速率自發地從膜上解吸附。大多數時候它會回到同一個質膜，但它也 可結合到存在的任何其它疏水結合位點。
可將3H-醋酸鹽摻入活細胞中並在不同時間檢測分離的膜中3H膽固醇的 量來確定新合成膽固醇的運輸和分布。放射性標記的膽固醇和膽固醇酯可被遞 送到脂蛋白。可用直接化學方法如氣相色譜-質譜或間接方法如基於膽固醇氧 化酶的試驗來檢測總膽固醇。為了應用檢測膽固醇運輸和分布的這些方法，必 須純化感興趣的各種細胞器。獲得高度純化的膜部分一般非常困難；耗時的純 化過程可能增加膽固醇轉移的風險。當細胞器可被容易地分離時，例如對於ER 和質膜，這些方法非常有用，當涉及內含體或高爾基體膜等細胞器時，這些方 法可能很難翻譯。
菲律賓菌素染色已廣泛用於檢測完整細胞裡多種膜細胞器中的膽固醇，因 為這種螢光去汙劑選擇性結合膽固醇但不結合膽固醇酯。菲律賓菌素是一種較 弱的螢光基團，可用冷電荷耦合(cooled charge-co叩led)器件照相機來檢 測。然而，菲律賓菌素染色只能提供膽固醇分布的定性信息，因為螢光強度不 一定與膽固醇含量成線性相關。另一個限制是膽固醇與菲律賓菌素孵育的過程 中可能發生再分布。因此，從採用菲律賓菌素的試驗中不可能定量膽固醇的細 胞內分布。
已發展了一些專門技術如膽固醇氧化酶試驗來定量質膜中的膽固醇。如果 該酶進入細胞內區室(例如由於活細胞胞吞或膜破裂)或試驗中膽固醇移動到
111質膜中，則該試驗會過高估計質膜上膽固醇的量。雖然已開發了很多方法檢測 細胞中的膽固醇分布，但所有這些方法(結果)的解釋都有各種程度的不確定 性。因此需要比較幾種不同方法的結果以獲得對細胞內膽固醇分布的可信分 析。
膽固醇不僅可從細胞中的一個位置或區室運輸到另一個位置或區室。它還 可被稱為反向膽固醇運輸的過程分泌到細胞外。反向膽固醇運輸的第一歩是遊 離膽固醇從周圍細胞的質膜中流出到細胞外的接納體(acceptor)。膽固醇的 這種運動受細胞的因子和細胞外因子的控制。很多研究巳聚焦於細胞膽固醇的 細胞外接納體，具體地說是聚焦於這些接受體的修飾如何能夠正向加強膽固醇 流出。 一般相信反向膽固醇運輸由高密度脂蛋白(HDL)介導。對於含有磷脂 的接納體如HDL，限速步驟是膽固醇分子從質膜解吸附。
膽固醇從周圍細胞中移出至少通過兩種途徑。膽固醇接納體(它們已經含 有磷脂)，如HDL顆粒或PL-即oA-l碟片，可通過膜膽固醇供體和接納體顆粒 之間的濃度梯度通過擴散使膽固醇移動。因此膜孔擴散模型是一種雙向物質運 輸模型，不需要接納體顆粒結合或穿透細胞質膜。清道夫受體B l型(SR-B1) 的表達水平與膽固醇流出到HDL或磷脂顆粒的速率相關。SR-Bl刺激膽固醇流 出的能力似乎不依賴於受體-配體結合，可能反應了對膜膽固醇結構域的組織 的影響，這種影響有助於膽固醇向接納體顆粒的膜孔擴散。
或者，含有較少脂類的膽固醇接納體如apoA-1與質膜直接作用，同時抽 取膽固醇和磷脂。膽固醇流出到不含脂類的apoA-l的過程很大程度依賴於ATP 結合表達盒轉運蛋白Al (ABCA1)的表達。雖然ABCA1在apoA-1介導的膽固醇 流出中的重要性已非常清楚，但對其在膽固醇輸出中的確切功能仍然存有爭 議，最近的研究暗示其作為apoA-1受體、細胞內膽固醇轉運蛋白或參與誘導 膜脂類分布的變化，這種變化有助於apoA-l在細胞表面停泊。
本文公開的方法可用於檢測膽固醇運輸，或用於(例如)篩選影響膽固醇 運輸(例如流出或攝取)的分子。圖26顯示了篩選幹涉膽固醇流出的調節劑 的方法的實施例。該方法基於實時檢測化合物對膽固醇流出的影響。質膜上或 細胞內庫中膽固醇含量的耗竭導致細胞表面微絨毛的消失，造成貼壁細胞呈扁 平狀。細胞扁平狀產生正的DMR相，信號增加。基於這種生物學作用，我們利 用從細胞表面抽取膽固醇的試劑(例如甲基-e-環糊精(mPCD)或高密度脂 蛋白(HDLs))、或結合或隔離細胞表面上的膽固醇的試劑(例如相對低濃度
112的皂苷)作為標記物。光學生物傳感器獲得的變化可用於指示幹涉膽固醇流出 的調節劑。圖27提供了膽固醇途徑的示意圖。
圖28的結果表明，用meCD處理A431和HeLa細胞均產生可用LID生物 傳感器獲得的類似的時間依賴性響應。這兩種細胞類型的差別是由於與細胞表 面結合的膽固醇含量不同。用EGF預處理A431顯著抑制mf3 CD誘導的響應。 這時因為EGF結合於細胞表面的EGFR導致該受體的大量胞吞；受體胞吞引起 細胞表面膽固醇含量的降低。類似地，用H7 (—種蛋白激酶A、 C和G的抑制 劑)預處理A431也抑制mf3CD誘導的響應。這是因為蛋白激酶是細胞表面上 膽固醇含量的重要調控者。
(6)分析活性自由基信號傳遞和細胞氧化還原狀態
分子氧(雙氧；02)對於所有需氧生物體的存活非常重要。需氧能量代謝
依賴於氧化磷酸化，這是一個線粒體電子傳遞(通過多組分NADH脫氫酶複合 物)的氧化還原能量被轉換為ATP的高能磷酸鍵的過程。02作為細胞色素《氧 化酶的最終電子接納體，細胞色素-C氧化酶是線粒體酶學複合物中的最後一個 酶組分，催化02的四電子還原，成為H20。可在這些(或其他)電子傳遞反應 中形成02的部分還原和高度反應性的代謝物。這些代謝物包括超氧陰離子 ((V )和過氧化氫(H202)，分別通過02的一電子和二電子還原而形成。在過 渡金屬離子的存在下，可形成更具反應性的羥基自由基(0H* )。因為它們相 對於分子02具有較高的反應性，因此02的這些部分還原代謝物通常稱為"活性 氧自由基"(ROS)。
ROS對細胞功能具有雙重作用。ROS起初被認為是代謝的毒性副產物，可 能引起對脂類、蛋白質和DNA的損傷。為了保護細胞不受ROS的潛在損傷作用， 細胞有幾種抗氧化酶，如過氧化物岐化酶(將02*還原為H2CU 、過氧化氫酶 和穀胱甘肽過氧化物酶(將H202還原為H20)。因此，氧應力可廣泛定義為氧化 劑的產生和細胞抗氧化以防止氧化傷害的能力。氧應力參與很多人類疾病，包 括動脈粥樣硬化、肺纖維化、癌症、神經退行性疾病和衰老。
雖然一般認為ROS是呼吸的毒性副產物，但最近的證據暗示，ROS的產生 可能是細胞信號和調控的重要參與者。在哺乳動物細胞中，最近已證明很多細 胞外刺激誘導ROS細胞內濃度的瞬時增加，特異性抑制ROS的產生將導致刺激 物依賴性信號傳遞的完全阻斷。ROS產生的下遊效應是蛋白質或多或少可逆性的氧化。硫醇，由於它們能夠被可逆性氧化，被認為是氧化脅迫的關鍵靶標。 氧還敏感性蛋白，包括蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)作為活性位點賴氨酸，是很 多氧化劑(包括仏02)特異性氧化的靶標，這種修飾可被細胞內的還原劑逆轉。 R0S對PTP的抑制有助於蛋白酪氨酸磷酸化介導的受體酪氨酸激酶(RTK)信號 的傳播(通常與增殖性刺激物有關)。
R0S在細胞功能調控中作為必需的生物分子這一作用與其作為代謝有毒副 產物這一作用的明顯矛盾可能至少部分與產生的ROS濃度的不同有關。當細胞 中產生的R0S超過其抗氧化能力時，可能發生對細胞分子如脂類、蛋白質和DNA 的損傷。
R0S的高度反應性和相對不穩定性使它們在生物系統中極難被檢出或測 定。因此，針對R0S和自由基產生的很多評估(試驗)都是通過間接檢測R0S 與細胞組分如脂類、蛋白質或DNA相互作用產生的各種終產物進行的。鑑定特 定ROS的大多數方法是基於與各種"探測"分子(例如產生螢光的探針、化學 發光探針或顯色探針)的作用，所述探測分子被氧化性修飾以產生發光或螢光 信號。這些方法可能很複雜，因為在同一細胞中有可能具有多種形式的活性氧。 此外，氧化氮自由基可使探針的光學性質產生與其他氧分子造成的同樣的變 化。定量分析也很困難，因為1)穀胱甘肽的細胞內濃度高，可形成硫醇或 亞磺醯自由基、或捕獲或還原氧自由基；2)金屬的濃度可變，這可催化或抑 制自由基反應；和3)存在其他自由基淬滅劑如精胺。
公開了實時監測化合物對^02誘導活細胞內動態物質再分布(DMR)的作 用的方法。為了研究ROS信號，利用了各種細胞靶標的很多己知的和特異性的 調節劑預處理細胞一定的時間(通常是一小時)。然後可根據調節劑對^02誘 導的D服信號的作用繪製出ROS信號傳遞網絡。為篩選調節細胞氧化還原狀態 的化合物，用化合物預處理細胞較長的時間(通常從過夜至數天)。可通過}1202 誘導的函R信號來檢測化合物對細胞氧化還原狀態的作用。
與檢測ROS信號傳遞和氧化還原狀態的所有現有試驗技術不同，本發明提 供無標記和實時的方法來篩選幹涉ROS信號傳遞和其網絡相互作用的調節劑。 本發明還延伸到應用基於光學生物傳感器的細胞傳感。
細胞中ROS的產生來自酶學和非酶學來源。任何電子傳遞蛋白或酶學系統 都可形成作為電子傳遞反應"副產物"的R0S。酶學來源包括
(i)線粒體中的細胞代謝。線粒體中ROS的產生佔還原條件下總02消耗
114的約1-2%。因為線粒體中S0D濃度高，O"在線粒體中的濃度保持在很低的穩 態水平，不可能逃出細胞質。最近幾年，線粒體ROS介導細胞信號的能力，特 別是關於凋亡調控，受到了很大重視。已表明線粒體可能作為"02傳感器"介 導低氧誘導的基因轉錄。
(ii) 內質網(ER)中脂類和蛋白質的生物合成。ER是脂類和蛋白質生物 合成主要涉及的另一種膜結合的細胞內細胞器。滑面內質網(缺少結合的核糖 體)含有酶，包括催化一系列反應使脂溶性藥物和其他有害的代謝產物解毒的 細胞色素P-450。細胞色素P-450可氧化不飽和脂肪酸和外源性化學物質，還 原分子02產生02 和/或H202。
(iii) 來自核膜的R0S。核膜含有細胞色素氧化酶和電子運輸系統，與 ER類似，但是它們的功能未知。有一種假設是電子從這些酶系統中洩漏，產生 可體內損害細胞DNA的R0S。
(iv) 過氧化物酶體中H.A的產生。過氧化物酶體是總細胞&02產生的重 要來源。它們含有很多產生&02的酶，包括葡糖酸氧化酶、D-胺基酸氧化酶、 尿酸氧化酶、L一醇酸氧化酶和脂醯輔酶A氧化酶。過氧化物酶體的過氧化氫 酶利用這些氧化酶產生的^02在"過氧化"反應中氧化很多其他底物。這些類 型的氧化反應在肝臟和腎臟細胞中尤其重要，在這些細胞中，過氧化物酶體使 進入循環的很多毒性分子(包括乙醇)解毒。過氧化物酶體中進行的氧化反應 的另一個主要功能是氧化脂肪酸，在哺乳動物細胞中這種氧化發生在線粒體和 過氧化物酶體中。這些細胞內細胞器中產生的仏02隻有一小部分似乎逃過了過 氧化物酶體的過氧化氫酶。
(v) 來自可溶性酶的ROS。在催化循環中，可溶性酶，例如，黃嘌呤氧化 酶、醛氧化酶、雙氫乳清酸酯脫氫酶、黃素蛋白脫氫酶和色氨酸雙加氧酶可 產生R0S。
(vi) 來自小分子的R0S。小分子，例如多巴胺、腎上腺素、黃素和氫醌 的自身氧化可以是細胞內ROS產生的重要來源。大多數情況下，這些自身氧化 反應的直接產物是02* 。
(vii) 來自質膜相關酶的R0S。質膜相關的氧化酶(例如吞噬細胞的 (phagocytic) NADra氧化酶)已表明是大多數生長因子一和/或細胞因子一刺
激產生的氧化劑的來源，雖然精確的酶來源還沒有完全鑑定到。
(viii) 來自信號傳遞的R0S。已報導，結合不同種類受體的很多細胞因子和生長因子可在細胞中產生R0S。
(ix)來自環境的R0S。外源性R0S也可被引入活細胞中。例如，外源H必 能夠通過質膜擴散到細胞中。
R0S在從受體到核的不同水平上調節許多信號途徑。雖然較不清楚，在過 去十年已鑑定了許多細胞靶標，使其範圍擴大。受體激酶和磷酸酶可能是氧化 應激的靶標。生長因子受體最常被配體誘導的二聚化或寡聚化活化，這些作用 使其胞質激酶結構域自磷酸化。已經良好演示了響應紫外光，依賴於配體的受 體依賴性成簇和活化，該作用可能是由ROS介導的。已顯示外源H202 (通常以 毫摩爾範圍)誘導酪氨酸磷酸化和PDGF-、 PDGF-和EGF受體的活化。EGF受體 的溶血磷脂酸誘導的反式激活可能是由形成ROS中間物介導的。由於大部分生 長因子和細胞因子似乎在質膜上或其附近產生R0S，磷脂代謝物可能是氧化還 原信號傳遞的重要靶標。例如，二醯基甘油的氧化形式在PKC活化中比其非氧 化形式更有效。另外，內皮細胞和成纖維細胞中，PKC活化和蛋白質酪氨酸磷 酸化似乎需要仏02誘導的PLD活化。屬於Src家族(Src激酶)和Janus激酶 (JAK)家族的非RTK也是至少外源加入的氧化劑的靶標。
ROS信號傳遞也能觸發許多細胞類型，包括平滑肌細胞中胞內Ca"的改變。 另外，ROS信號傳遞能夠參與MAPK途徑。外源氧化劑可激活ERK MAPK途徑。 該作用的機制未明，精確的分子靶標也是未知的。 一些研究提示，R0S介導的 ERK活化可能是生長因子受體、Src激酶和/或p21Ras水平的上遊事件。該作 用的另一種可能機制可能是蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)和/或蛋白質磷酸酶A 的氧化劑誘導的失活。
還有許多其它胞內靶標也被鑑定為氧化響應分子。這些靶標包括NF-KB( — 種轉錄因子，調節許多與免疫和炎症反應有關的基因)、活化蛋白-1 (AP-1)
(一種轉錄複合物，是由Fos-Jun或Jun-Jun蛋白二聚化形成的)、和其它轉 錄因子，其中相似氧化還原機制調節DNA結合，例如Sp-1、c-Myb、p53和egr-1。
ROS信號傳遞主要涉及兩種一般作用機制1)胞內氧化還原態的改變，和 2)蛋白質氧化修飾。
在一個實施例中，本發明提供了一種使用光學生物傳感器篩選能干擾R0S 信號傳遞的化合物的方法。該方法涉及用過氧化氫作為外源R0S來介導培養細 胞層底部部分的物質再分布。該方法包括下列步驟提供非光學標記依賴性檢 測(LID)生物傳感器，它能測定多個光學輸出參數；在生物傳感器表面培養
116細胞；在細胞中加入調節物溶液；在細胞中加入外源反應性氧物質溶液；監測 所述光學輸出參數。所述調節物加到所述細胞中，並且孵育一段較短時間(例 如30min、 60min、 1小時、3小時、6小時、24小時、2日、3日、5日等)。 所述反應性氧物質是過氧化氫。
6.除了無標記細胞實驗
a)與標記技術聯合，使用無標記生物傳感器的兩部分實驗
還可聯合常規標記技術(例如螢光)使用公開的無標記生物傳感器區室基 於細胞的實驗來提供對生物樣本的多參數信息。
非標記依賴性檢測包括包括一套不需要標記任何分析物就可測定生物分 子事件的技術。兩種最常用的技術基於質譜(MS)和使用表面質子共振(SPR) 或如本文所述的光柵耦合波導測定折射率(Rl)改變。本文公開的是含有一種
裝置的系統，該裝置與光學生物傳感器結合，該傳感器含有具有電介質塗層的 光柵，以同時測量折射率和螢光的改變(共焦或漸逝場)。
雖然基於RI的非標記依賴性檢測(RILID)方法提供了相對於標記技術更 顯著的優點，其限制是不能直接將事件與特定的物質關聯。例如，與螢光不同， 所需蛋白質和某些不良蛋白質的結合在性質上提供了同樣"類型"的信號(指 標改變)。無標記檢測法本身因此是不具有特異性的。為了克服這種不確定性， 將RILID法與MS結合，能鑑定結合的物質。
RILID測量可實時進行，通常由其能力限制， 一般能檢測基質表面約200nm 內或更小距離內的事件，橫向解析度為約lOum。螢光能使得多種物質被標記 (使用不同螢光染料或顆粒)，並可以在可檢測約200mn內的漸逝模式使用(使 用全內反射螢光或光柵耦合波導)，或以可檢測約10wm內的共焦模式使用， 具有卓越的橫向解析度(在遠場內降至約300nm或在近場內小於100nm)。公 開了用RILID作為另一種生物檢測"通道"，使用兩種技術的組合-無標記生 物傳感器和標記，兩者的時空解析度相同，但其中一種對物質具有特異性(標 記，即螢光)，另一種無物質特異性(無標記生物傳感器，RILID)。這種組 合本身夠強，因為它能夠分解複雜的生物檢測事件，例如當研究細胞內生物途 徑時遇到的那些事件。例如，配體與受體(例如GPCR)的結合可誘導胞內級聯， 從而可能導致折射率曲線隨時間複雜改變。可通過螢光使用不同報導系統或標 記在細胞、細胞器(例如使用細胞器特異性染料來探測ER、 Golgi、或核)、蛋白質(例如GFP-p-捕獲蛋白的移位)、或DNA水平(基因表達，使用螢光原 位雜交，FISH)來檢測這些級聯中的一個或多個。將LID信號與多色螢光時空 關聯可提供有關途徑的重要線索。另外，某些螢光報導物和/或標記通常互相 是不兼容的。公開的方法能分析這種關聯，並能改進實驗，從而不再需要一種 或多種螢光報導物，因為能通過RILID.309獲得信息。公開了使用基於平面型 波導的生物傳感器的多模式檢測系統。該系統不僅監測折射率的改變(由生物 物質在結合和隨後活化和細胞應答後的淨變引起的折射光的波長或角度改變 指示)，還可以監測螢光(或化學發光、生物發光、磷光或電致發光等)的改 變。還提供了檢測系統，它提供用於藥物開發和基礎研究中的超高含量分析。
目前的生物分析技術通常僅提供一種參數。結果，多個不同實驗輸出的結 果必須重複整理，以指導有關藥物開發(或診斷)的決定。該過程既費時又容 易誤導。多參數檢測設法用分析技術的組合獲得有關幾個方面的信息，從而提 供一途徑(或多個途徑)中多個步驟的線索，以及可能的藥物化合物對它們的 調節。多參數檢測與多路方式不同，多路方式意味著用一種技術(或組合，例 如放射和螢光標記的組合)同時檢測多種生物物質的結合或活化以監測途徑中 的同一歩驟。多參數檢測聯合多路分析(例如反向轉染分析)可能同時對多個 樣本上提供多種類型的信息。光柵耦合波導在用RILID和螢光多參數檢測平臺 上有特別的優點。
III.組合物
公開了要用來製備公開的組合物，以及在本文所述方法中使用的組合物的 成分。本文公開了這些和其它物質，應理解當公開這些物質的組合、子集、相 互作用、組等，而沒有明確公開特別引用各種成分及其集合組合時，本文特別 考慮了各物質並對其進行了描述。例如，如果公開並討論了一種特定受體，可 針對許多分子(包括所討論的受體)對其進行許多修改，特別考慮的是受體可 能的每種和全部組合和排列，除非相反說明。因此，如果公開了分子A、 B和C 組，也公開了分子D、 E禾PIF組，而且公開了組合分子的例子A-D，那麼即使沒 有單獨陳述，分別且綜合考慮每種分子，意味著視為公開了組合A-E、 A-F、B-D、 B-E、 B-F、 C-D、 C-E和C-F。該概念應用於本申請的所有方面，包括但不限於， 製備和使用所公開組合物的方法中的步驟。因此，如果存在許多額外的步驟， 應理解每一個這些額外歩驟都可和公開方法的任何特定實施方式或實施方式的組合一起實施。
1.用公開的組合物/組合化學篩選鑑定的組合物 (a)組合化學
可用公開的組合物作為任何組合技術的耙標，以鑑定與公開的化合物以理 想方式作用的分子或大分子。本文公開的核酸、肽、和相關分子可用作組合方 法的靶標。還公開了組合物可通過組合技術或篩選技術鑑定，其中本文公開的 組合物或其部分被用作組合或篩選方案的靶標。
應理解當聯合組合技術或篩選方法使用公開的組合物時，能鑑定出具有特 定所需性質(例如抑制或刺激或靶分子功能)的分子(例如大分子)。當用於 公開的組合物(例如公開的細胞)時，也公開了鑑定和分離出的分子。因此， 本文也視用涉及公開的組合物(例如公開的細胞)的組合或篩選方法產生的產 品也被公開了。
人們理解，如本文所述的鑑定分子的方法可用高通量方法進行。例如，可 用螢光共振能量轉移(FRET)快速鑑定相互作用，從而鑑定推定的抑制劑。該 技術的原理是當兩個分子空間上靠近，即以超出背景的水平相互作用時，產 生信號或信號可熄滅。然後，可進行各種實驗，包括例如，加入推定的抑制劑。 如果抑制劑與兩種信號分子之間的相互作用競爭，可迅速(in space)使信號 分子相互分離，從而導致信號減弱或增強，視所使用的信號類型而定。可將減 弱或增強的信號與推定抑制劑的存在與否關聯。可使用任何信號傳遞手段。例 如，公開了鑑定任何兩種公開的分子之間的相互作用的抑制劑的方法，包括將 第一種分子和第二種分子在推定的抑制劑存在下相互接觸，其中第一種分子或 第二種分子含有螢光供體，其中第一或第二種分子(通常不含供體的分子)含 有螢光受體；在推定抑制劑存在下或在推定抑制劑不存在的情況下測定螢光共 振能量轉移(FRET)，其中推定抑制劑存在下，FRET與不存在推定抑制劑的情 況下相比減弱，表明推定的抑制劑抑制兩種分子之間的結合。這類方法也可用 細胞系統進行。
具有給定功能的催化性或配體結合性的寡核苷酸分子可分離自隨機寡核 苷酸的複雜混合物，它被稱為"體外遺傳學"(Szostak， TIBS 19:89， 1992)。 合成攜帶隨機和給定序列的分子集合，對複雜混合物(例如lOOpglOO寡核苷 酸RNA的約1015條不同序列)進行篩選和富集過程。通過重複循環的親和層析
119和PCR擴增與柱上的配體相結合的分子，Ellington和Szostak (1990)估計 l(TRNA分子之一以與小分子染料結合的方式摺疊。也分離了具有這種配體結合 行為的DNA分子(Ellington和Szostak， 1992; Bock等，1992) 。 X寸於小有 機分子、蛋白質、抗體和其它本領域技術人員已知的大分子來說，存在類似目 標的技術。篩選具有所需活性的分子組，不論基於小有機文庫、寡核苷酸、或 抗體，被廣泛稱為組合化學。組合技術特別適用於鑑定分子之間的結合相互作 用和分離具有特定結合活性的分子，當大分子是核酸時，這種分子常被稱為適 體。
有許多分離具有原始活性或具有改變的活性蛋白質的方法。例如，已用噬 菌體展示文庫分離了許多與特定靶標相互作用的肽(見例如美國專利 6, 031,071; 5,824,520; 5， 596， 079;和5， 565， 332，在此引入至少它們與噬菌 體展示相關的物質和與組合化學有關的方法以供參考)。
分離具有給定功能的蛋白質的優選方法如Roberts和Szostak所述 (Roberts R. W.和Szostak J. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (23) 12997-302 (1997))。該組合化學方法結合蛋白質的功能力和核酸的遺傳力。 產生RNA分子，其中將嘌呤黴素與RNA分子的3'末端共價結合。該修飾RNA分 子的體外翻譯得到由要翻譯的RNA編碼的正確的蛋白質。另外，由於嘌呤黴素 (一種不能延伸的肽醯基受體)的結合，延伸的肽鏈與和RNA結合的嘌呤黴素 結合。因此，蛋白質分子與編碼它的遺傳物質結合。此刻，可進行正常體外選 擇程序來分離功能性肽。 一旦肽功能的選擇程序完成，進行常規核酸操縱程序， 來擴增編碼所選功能性肽的核酸。遺傳物質擴增後，轉錄新RNA， 3'末端帶有 嘌呤黴素，翻譯新RNA，進行另一輪功能性選擇循環。如此，可以重複方式， 就和核酸選擇技術一樣進行蛋白質選擇。翻譯出的蛋白質由與嘌呤黴素結合的 RNA序列控制。該序列可以是任何經最佳翻譯(即沒有終止密碼子等)工程改 造的隨機序列，或可以是已知RNA分子的簡併序列，以尋求已知蛋白的改進或 改變的功能。核酸擴增和體外翻譯的條件是本領域技術人員熟知的，優選如 Roberts和Szostak所述(Roberts R.W.禾口 Szostak J. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 94 (23) 12997-302 (1997))進行。
另一種優選的設計分離肽的組合方法的優選方法如Cohen等(Cohen B. A.， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (24) :14272-7 (1998))所述。該方 法利用和改變了雙雜交技術。酵母雙雜交系統用於檢測和分析蛋白蛋白相互作用。雙雜交系統最初在酵母釀酒酵母(5"acc力arc^Fcescerew、/ae)中公開， 是一種鑑定新調控分子，特別是對於感興趣蛋白的強大分子遺傳技術(Fields and Song, A^a&re 340:245-6 (1989) ) 。 Cohen等修改了這種技術，從而能 鑑定出合成或工程改造的新肽序列之間的相互作用，這些肽與選定的分子結 合。這類技術的益處是在胞內環境中進行篩選。該方法利用肽分子文庫，這些 分子與酸性活化域結合。用本領域技術人員熟知的方法，聯合各種組合文庫， 人們能夠分離和表徵與所需靶標結合或相互作用的小分子或大分子。可用競爭 性結合研究(本領域技術人員熟知的)比較這些化合物的相對結合親和力，鑑 定最佳化合物。
製備組合文庫和篩選組合文庫以分離與所需耙標結合的分子的技術是本 領域技術人員熟知的。代表性的技術和方法可見(但不限於)美國專利
5， 084，824，5，288，514，5，449，754，5，506，337:,5，539,083，5，545， 568，
5， 556'762，5,565，324,5'565,332,5，573,905:,5，618，825，5,619， 680，
5， 627，210，5,646，285,5，663,046，5，670,326,,5，677，195，5，683, 899，
5,688，696，5,688，997,5，698，685,5，712,146',5，721，099，5,723， 598，
5， 741，713，5，792，431，5，807，683，5，807，754,,5，821'130，5，831， 014，
5, 834，195，5,834,318，5，834，588，5，840,500，,5,847,150，5，856， 107，
5， 856，496，5，859，190，5，864，010，5，874，443,,5，877，214，5，880' 972，
5， 886，126,5,886，127,5，891，737,5，916，899，,5,919,955,5，925， 527，
5， 939，268，5，942，387，5，945，070,5，948，696:,5，958，702，5，958， 792，
5,962，337，5，965，719，5，972，719,5，976,894:,5，980,704，5，985， 356，
5, 999,086，6，001，579，6,004,617'6，008，321:,6，017,768，6，025， 371,
6， 030，917,6, 040， 193,6， 045, 671，6， 045, 755，6, 060， 596，和6, 061， 636。可用許多不同合成技術，從廣泛的分子陣列製備組合文庫。例如，稠合的
2,4-嘧啶二酮(美國專利6,025,371) 二氫苯並吡喃(美國專利6,017,768 和5,821,130)，醯胺醇(美國專利5， 976， 894),羥基-胺基酸醯胺(美國 專利5,972,719) 糖類(美國專利5, 965， 719) , 1， 4-苯並二吖庚因-2， 5-二 酮(美國專利5,962,337)，環化物(美國專利5， 958， 792) , 二芳基胺基酸 醯胺(美國專利5,948,696)，噻吩(美國專利5， 942， 387)，三環四氫喹啉(美 國專利5,925,527)，苯並呋喃(美國專利5,919,955)，異喹啉(美國專 利5,916,899)，乙內醯脲和硫代乙內醯脲(美國專利5，859，190)， B引哚(美
121國專利5， 856， 496)，咪唑-吡啶-B引哚和咪唑-吡啶-苯並噻吩(美國專利 5,856,107) 取代的2-亞甲基-2， 3-二氫噻唑(美國專利5， 847， 150)，喹 啉(美國專利5,840， 500) , PNA (美國專利5， 831， 014),含標籤(美國 專利5,721,099),聚酮化合物(美國專利5,712， 146)， 嗎啉代亞基(美 國專利5, 698， 685和5, 506， 337),磺醯胺(美國專利5, 618， 825)，和苯並 二吖庚因(美國專利5，288，514)。
如本文所用的，組合方法和文庫包括常規篩選方法和文庫，以及重複過程 中使用的方法和文庫。
b)計算機輔助藥物設計
可用公開的化合物作為任何分子建模技術的靶標，來鑑定公開的組合物的 結構，或鑑定可能或實際分子，例如小分子，它們與公開的組合物以理想方式 相互作用。本文公開的核酸、肽、和相關分子可用作任何分子建模程序或方法 的靶標。
應理解，當在建模技術中應用公開的組合物時，可鑑定具有特定所需性質 (例如已知或刺激或靶向分子功能)的分子(例如大分子)。當用於公開的組 合物(例如公開的細胞)時，還公開了鑑定和分離出的分子。因此，本文也視 為公開了與公開的組合物(例如公開的細胞)有關的用分子建模法產生的產品。
因此， 一種分離與所選分子結合的分子的方法是通過合理設計。這是通過 結構信息和計算機建模實現的。計算機建模技術使得所選分子的三維原子結構 可視化，而合理設計與分子將相互作用的新化合物。三維構建通常依賴於來自 所選分子的X光晶體分析或醒R顯影得到的數據。分子動力學需要力場數據。 計算機圖形系統能預測新化合物會如何與靶分子連接，並能夠實驗性操縱化合 物和靶分子的結構，來優化結合特異性。當在其中之一或兩種中產生微小改變， 預測分子-化合物相互作用會怎樣，需要分子機制軟體和計算增強計算機，通 常與分子設計程序和用戶之間的方便用戶使用的菜單控制界面結合。
分子建模系統的例子是CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham， MA。 CHARMm進行能量最小化和分子動力學操作。QUANTA進行構建、 圖形建模和分子結構分析。QUANTA能實現分子之間行為的互動構建、修飾、可 視化和分析。
許多文章回顧了與特定蛋白質互相作用的藥物的計算機建模，例如Rotivinen等，1988爿"a屍力ar鵬cei/z^'ca Fe朋ica 97， 159-166; Ripka， 7Ve(r 5"cie72Z^st 54—57 (June 16， 1988) ; McKinaly禾口 Rossmann, 1989 ^w w. Wer. 屍力ar船co丄一7W"'o義29, 111-122; Perry和Davies， QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R, Liss, Inc. 1989) ; Lewis禾口 Dean， 1989屍roc. Z。W. 236, 125-140
和141-162;以及有關核酸組分的模式酶，Askew,等，1989 / J瓜C力e瓜5bc. 111， 1082-1090。其它篩選和圖形描述化合物的電腦程式可購自下列公司， 例如BioDesign, Inc., Pasadena, CA. ， Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada,禾口 Hypercube， Inc. ， Cambridge, 0nt,ario。雖然這些主要是設計用於 對特定蛋白質有特異性的藥物的，它們也可適應設計與已鑑定出的DNA或RNA 的特定區域相互作用的分子。
雖然以上描述了設計和產生可改變結合的化合物，人們還可篩選已知化合 物(包括天然產物或合成化合物)、生物活性物質(包括蛋白質)的文庫，以 獲得改變底物結合或酶活性的化合物。
2.試劑盒
本文公開了試劑盒，它們涉及可用於實施本文公開的方法的試劑。試劑盒 可包含任何本文所述的試劑或試劑組合，或可理解在實施所公開的方法時需要 或有益的任何試劑。例如，試劑盒可包括在方法的一些實施方式中所述的進行 擴增反應的引物，以及如所需使用引物必需的緩衝液和酶。
IV.製備組合物的方法
除非另外說明，本文所述的組合物和進行所述方法所需的組合物可用任何 本領域技術人員已知的用於特定試劑或化合物的方法製備。
1.核酸合成
例如，用作引物的核酸(如寡核苷酸)可用標準化學合成方法製備，或可 用酶法或任何其它己知方法製備。這些方法包括從標準酶消化，然後核苷酸片 段分離(見例如，Sambrook #■， i/c^/ec"Jsr CJo/ J'"f爿Za/ orator—第 二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.， 1989) 第5、 6章)到純合成方法，例如通過使用Milligen或Beckman System
1231Plus DNA合成儀(例如Milligen-Biosearch， Burlington, MA的8700型自 動化合成儀或或ABI Model 380B)氰基乙基亞磷醯胺法。用於製備寡核苷酸的 合成、法如Ikuta等，v4tm. y er. A 'oc/ e瓜53:323-356 (1984)所述(磷酸三 酯和亞磷酸三酯法)和Narang等，ife^w^ f/^輝o丄，65:610-620 ( 1980)
(磷酸三酯法)。可用已知方法，如Nielsen等，Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994) 所述的那些製備蛋白質核酸分子。
2.肽合成
製備所述蛋白質(例如SEQ IDN0:23)的方法之一是通過蛋白質化學技術 連接兩條或多條肽或多肽。例如，可用目前可得的實驗儀器，使用Fmoc (9-芴甲氧羰基)或Boc (叔丁氧羰基)化學來化學合成肽或多肽(Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA)。本領域技術人員可輕易理解，對應 於所述蛋白質的肽或多肽可以用標準化學反應合成。例如，可合成肽或多肽， 但不將其從合成樹脂上切下，而肽或多肽的另一部分可合成，隨後從樹脂上切 下，從而暴露出在其它片段上功能性封閉的端基。通過肽縮合反應，這兩個片 段可以通過羧基和氨基末端的肽鍵共價結合，形成抗體或其片段(Grant GA
(1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W. H. Freeman and Co. ， N. Y.
(1992) ; Bodansky M.禾口 Trost B.編(1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (在此至少引入有關肽合成的部分以供參考))。 另外，肽或多肽可在體內如所述單獨合成。 一旦被分離後，這些獨立的肽或多 肽各自通過類似的肽縮合反應連接形成肽或其片段。
例如，克隆或合成肽區段的酶連接能使短肽片段連接產生大肽片段、多肽 或完整的肽結構域(Abrahmsen L等，Biochemistry, 30:4151 (1991))。 此外，合成肽的天然化學連接可用於從較短的肽片段合成性構建大肽或多肽。 該方法包括兩歩化學反應(Dawson等，Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994))。第一步是未保護的 合成性肽-硫酯和另一種含有氨基末端Cys殘基的未保護的肽區段的化學選擇 反應，得到硫酯連接的中間物作為最初共價產物。不改變反應條件，該中間物 經過自發快速的分子間反應，在連接位點形成天然肽鍵(Baggiolini M.等
(1992 ) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I等，J. Biol. Chem.， 269:16075 (1994) ; Clark-Lewis I等，Biochemistry, 30:3128 (1991);
124Rajarath薩K等，Biochemistry 33:6623-30 (1994))。
此外，未保護的肽區段化學連接，其中肽區段之間形成的鍵是化學連接的 結果，它是非天然(非肽)鍵(Schnolzer， M等，Science, 256:221 (1992))。 該技術用於合成蛋白質結構域的類似物以及大量具有完全生物活性的較純的 蛋白質 (deLisle Milton RC 等，Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992))。
3.製備組合物的方法權利要求
公開了製備組合物的方法和製備形成組合物的中間物的方法。有許多方法 可用於製備這些組合物，例如合成性化學方法和標準分子生物學方法。應理解， 製備這些和其它公開的組合物的方法已被具體公開。公開了用任何公開的核酸 轉化細胞產生的細胞。公開了用任何非天然存在的公開的核酸轉化細胞產生的 細胞。
公開了任何由任一公開的核酸表達產生的肽。公開了任何通過表達任何公 開的核酸產生的公開的肽。公開了任何通過表達任一非天然存在的公開的核酸 產生的公開的肽。
公開了通過用任何本文所述核酸分子轉染動物內細胞獲得的動物。公開了 通過用任何本文所述的核酸分子轉染動物內的細胞獲得的動物，其中所述動物 是哺乳動物。還公開了通過用任何本文所述的核酸分子轉染動物內的細胞獲得 的動物，其中所述哺乳動物是小鼠、大鼠、家兔、乳牛、綿羊、豬和靈長類。
還公開了通過將本文公開的任何細胞加入動物而產生的動物。
V. 使用組合物的方法
1.使用組合物作為研究工具的方法
如本文所述，可用所述組合物作為微陣列試劑或作為檢測或分析現存微陣 列的試劑。可在任何己知方法中用公開的組合物分離或鑑定單核苷酸多形性。 組合物還可用於任何與晶片/微陣列相關的已知篩選分析方法。組合物還可以 任何使用組合物的計算機可讀實施方式的已知途徑使用，例如，研究相關性或 進行與所述組合物有關的分子建模分析。
VI. —些實施方式的說明公開了一種測試細胞上的剌激事件的作用的方法，包括提供無標記生物傳 感器，在生物傳感器上培養細胞，對培養的細胞提供刺激事件，收集來自生物 傳感器的生物傳感器輸出數據。
還公開了一種篩選影響細胞存活或增殖的化合物的方法，該方法基於生物 傳感器表面細胞的不均一性。
一種篩選影響對細胞的刺激事件作用的調節劑的方法，包括提供無標記生 物傳感器，在生物傳感器上培養細胞，與含有化合物的溶液孵育一段特定和預 定的時間，對培養的細胞提供刺激事件，收集來自生物傳感器的生物傳感器輸 出數據。
還提供了包括提供檢測系統的分析細胞的方法，提供多個生物傳感器，將 細胞置於培養基中，在生物傳感器上培養細胞至至少70%鋪滿度，加入化合物 溶液，測定生物傳感器中出現耦合的入射角或波長，其中測量發生在10分鐘 以內。
還公開了監測化合物毒性的方法，包括(a)提供基於光學的無標記生 物傳感器；(b)將細胞置於培養基中，其中細胞附著於生物傳感器表面；(c) 在細胞培養基中加入含有化合物的溶液；(d)監測生物傳感器上培養的細胞 的反應。
還公開了監測化合物對細胞的作用的方法，包括(a)孵育細胞和化合物， 其中細胞結合於無標記生物傳感器，(b)鑑定化合物對細胞的作用，其中該 鑑定步驟包括觀察和分析無標記生物傳感器的輸出。
還公開了一種監測化合物對細胞的作用的方法，包括(a)孵育細胞和化 合物，其中細胞結合於無標記生物傳感器，(b)鑑定化合物對細胞的作用， 其中該鑑定步驟包括觀察和分析無標記生物傳感器的輸出，其中將輸出與特徵 輸出比較。
還提供了一種實時監測化合物吸收和毒性的方法，包括步驟(a)提供 基於光學的生物傳感器；(b)將一定數量的細胞置於培養基中，以覆蓋生物 傳感器，從而使細胞結合在生物傳感器表面上；(c)在細胞培養基上加上含 有化合物的溶液；(e)監測在生物傳感器上培養的細胞的時間依賴性響應。
還公開了一種鑑定細胞狀態的方法，包括步驟(a)在生物傳感器表面 培養細胞，形成細胞-生物傳感器組合物，(b)分析細胞-生物傳感器組合物， 其中分析步驟包括鑑定細胞培養表面的不均一性。還公開了用生物傳感器在細胞上高通量篩選化合物毒性的方法，包括步驟(a)提供生物傳感器；(b)將細胞置於每個孔中，覆蓋生物傳感器，從而使細胞附著於生物傳感器表面，並達到高鋪滿度；(C)在每個孔的細胞培養基中加入化合物溶液；(d)在某一時間收集光學波導光模式譜，(e)將各化合物的P冊M和對照孔(其中細胞沒有接觸任何化合物)比較，用單數據點評估化合物毒性。
還公開了一種評估化合物毒性的方法，包括(a)提供基於光學的無標記生物傳感器，它與具有孔的微量滴定板結合；(b)將細胞和細胞培養基置於每孔內，其中細胞覆蓋生物傳感器，從而使細胞附著於生物傳感器表面；(c)將化合物溶液加到每孔的細胞培養基中；(d)在指定的時間，收集各孔全部傳感器面積上TM。模式共振角帶的圖像。
還公開了使用光學生物傳感器，高通量篩選化合物對細胞增殖的作用的方法，包括(a)提供生物傳感器；(b)使細胞與生物傳感器接觸，形成細胞-生物傳感器組合物，從而在一段時間的細胞生長後，細胞鋪滿度達到45%-55%，(c)孵育化合物和細胞-生物傳感器組合物，形成化合物-細胞-生物傳感器複合物，(d)收集生物傳感器的輸出，(d)從輸出獲得PWHM， (e)將各化合物-細胞-生物傳感器複合物的PW麗和對照比較，對照中細胞-生物傳感器組合物不接觸化合物，其中PWHM的下降表明化合物對細胞有影響。
還公開了一種實時監測細胞內配體結合和隨後信號傳遞事件的方法，包括(a)提供基於光學的無標記生物傳感器；(b)將具有受體酪氨酸激酶(RTK)的細胞置於傳感器表面；細胞懸浮在含有一定濃度(細胞在生物傳感器表面附著和生長必需的)血清的培養基中；(c)可任選的在不含血清或其它生長因子、或不含任何血清或其它生長因子的培養液中孵育細胞過夜，以達到細胞的休眠狀態；(d)將具有一層細胞的生物傳感器置於檢測系統中，監測應答；
(e)監測在加入含有刺激物的溶液，或隔開一段特定的時間依次加入兩種溶液(第一種含有化合物，第二種含有配體或標記物)之前和之後，粘附細胞層的時間依賴反應。
還公開了一種測量或測定細胞中受體酪氨酸激酶(RTK)的表達水平和細胞-表面表達水平的方法，包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，每個孔含有嵌入底部的基於光學的無標記生物傳感器；(b)提供多種細胞；(C)將一類細胞懸浮在至少一個孔的培養基中；(d)在合適的培養基中培育細胞，使其附著和生長，直到達到一定程度的鋪滿度；(e)將具有生物傳感器，每個生物傳感器被一層細胞覆蓋的微量滴定板置於檢測系統中，監測反應；(f)在培養基中加入含有RTK配體的溶液；(g)監測和比較不同類型細胞層的時間依賴反應。
還公開了一種檢測配體與RTK (結合)能力的方法，包括(a)提供具有多孔的微量滴定板，每個孔含有嵌入底部的基於光學的無標記生物傳感器；(b)在培養基中提供一定數目具有較高RTK表達水平的細胞，使細胞以所需鋪滿度度附著在各生物傳感器上；(C)交換培養基，以使粘附細胞飢餓一段時間；
(d)將具有生物傳感器，每個生物傳感器被一層細胞覆蓋的微量滴定板置於檢測系統中，監測反應；(f)在覆蓋每個生物傳感器的培養基中加入含有不同濃度配體的溶液；(g)監測和比較細胞的劑量和時間依賴反應。
還公開了篩選影響受體酪氨酸激酶(RTK)信號傳遞的調節劑的方法，包括(a)提供基於光學的無標記生物傳感器；(b)將一定數量的具有感興趣的RTK的細胞置於培養基中，以覆蓋生物傳感器，使得細胞附著在生物傳感器表面上；(C)用生物傳感器監測細胞反應；(d)在細胞培養基中加入含一定濃度的化合物的溶液；(e)加入含有RTK配體的溶液，連續監測在生物傳感器上培養的細胞的時間依賴反應。
還公開了一種分析細胞中細胞骨架排列的方法，包括提供光學標記非依賴檢測(LID)生物傳感器，監測附著於光學LID生物傳感器表面的細胞的生物物質釋放。
還公開了一種分析細胞骨架重排的方法，包括提供光學LID生物傳感器；
將活細胞置於細胞培養基中，以覆蓋光學LID生物傳感器，從而使活細胞附著於光學LID生物傳感器表面；在位於光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有成孔試劑的溶液；和詢問光學LID生物傳感器，以獲得指示細胞的生物物質喪失的時間依賴性光學反應。
還公開了一種分析細胞骨架結構的方法，包括提供光學LID生物傳感器；
將活細胞置於細胞培養基中，以覆蓋光學LID生物傳感器，從而使活細胞附著於光學LID生物傳感器表面；在位於光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有化合物的溶液；在位於光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有成孔試劑的溶液；和詢問光學LID生物傳感器，以獲得指示細胞的生物物質喪失的時間依賴性光學反應，從而使人能篩選能干涉細胞內細胞骨架結構的
128調節劑。
還公開了分析細胞骨架結構的方法，包括提供光學LID生物傳感器；將活細胞置於細胞培養基中，以覆蓋光學LID生物傳感器，從而使活細胞附著於光學LID生物傳感器表面；在位於光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加
入含有成孔試劑的溶液；在位於光學LID生物傳感器表面的細胞培養基中加入含有化合物的溶液；和詢問光學LID生物傳感器，以獲得指示細胞的生物物質喪失的時間依賴性光學反應，從而使人能篩選能干涉細胞內細胞骨架結構的調節劑。
公開了測試刺激事件對細胞的作用的方法，包括提供無標記生物傳感器，在生物傳感器上孵育細胞，對孵育的細胞提供刺激事件，收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出。
還公開了鑑定細胞狀態的方法，該方法包括在無標記生物傳感器表面培養細胞，形成細胞-生物傳感器組合物，分析細胞-生物傳感器組合物，其中該分析包括鑑定培養細胞的表面的不均一性。
還公開了方法，其中孵育細胞涉及培養細胞，其中刺激作用是通過生物傳感器輸出鑑定的。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞培養到20-99%鋪滿度，其中細胞培養到30-80%鋪滿度，其中細胞培養到40-65%鋪滿度，其中細胞培養到70-99%鋪滿度，其中細胞培養到80-95%鋪滿度。
還公開了可包括一些方法的方法，其中細胞是粘附細胞，其中細胞與生物傳感器接觸，其中細胞附著於生物傳感器。
還公開了方法，其中刺激事件包括在細胞培養物中加入化合物，其中化合物調節細胞的細胞信號途徑，其中調節激活細胞信號途徑，其中調節抑制細胞信號途徑，其中化合物調節細胞上的細胞表面受體，其中化合物是受體的激動劑，和其中化合物是受體的拮抗劑。
還公開了方法，可包括其中細胞表面受體是離子通道、受體酪氨酸激酶、細胞因子受體、整聯蛋白受體、化+^+交換蛋白受體、或免疫受體，其中細胞表面受體是G蛋白偶聯受體(GPCR)、表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGF)、或血管內皮生長因子受體(VEGFR)，其中化合物調節細胞內的細胞骨架成分，其中化合物使細胞骨架結構去穩定，其中化合物穩定細胞骨架結構，其中化合物調節胞內
129酶、胞內激酶、胞內細胞器、胞內蛋白質、或胞外基質，其中化合物在化合物溶液中加入。
還公開了還能包括測定是否化合物對細胞有毒的方法。
還公開了方法，可包括一些方法，其中測試多種化合物，以篩選對細胞有毒的化合物，其中通過生物傳感器輸出監測化合物的毒性水平。
還公開了方法，可包括其中通過生物傳感器輸出監測細胞，以檢測化合物的作用。
還公開了方法，可包括一些方法，其中通過生物傳感器輸出監測化合物吸收。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器可穿透細胞至100nm深，其中生物傳感器可穿透細胞至100nm、 200nm、 300或500nm深，其中生物傳感器可接受來自胞內不同穿透深度的數據，其中穿透深度達500nm。
還公開了方法，可包括一些方法，其中用生物傳感器輸出鑑定細胞狀態。
還公開了方法，還包括測定是否刺激事件影響細胞存活或增殖。
還公開了方法，可包括一些方法，其中測試多種化合物來篩選對細胞有毒的化合物，其中監測化合物對細胞的作用，其中化合物是抗癌化合物。
還公開了方法，可包括一些方法，其中收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出包括收集生物傳感器輸出參數。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數是與生物傳感器輸出動力學有關的參數。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數包括分析生物傳感器輸出的總體動力學，其中分析總體動力學包括分析在完成相變時從一個相變為另一個相的速度，其中分析總體動力學包括分析完成生物傳感器輸出的時間長度，其中分析總體動力學包括分析生物傳感器輸出的整個時期的時間長度，其中分析總體動力學包括分析P-DMR階段的總持續時間，其中分析總體動力學包括分析N-DMR階段的總持續時間，其中分析總體動力學包括分析獲得P-DMR的總振幅的速率，其中分析總體動力學包括分析獲得N-薩R的總振幅的速率，其中分析總體動力學包括分析從N-DMR到P-DMR的速率，其中分析總體動力學包括分析從P-D服階段到N-DMR階段、淨零到N-DMR階段、淨零到P-DMR階段、P-DMR到淨零相、N-DMR到淨零、或P-DMR到淨零的過渡時間t。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數包括分析生物傳感器輸出相，其中分析相包括分析相變，其中分析相包括分析正向物質再分 布(P-DMR)信號，其中分析相包括分析反向物質再分布(N-畫R)信號，其中 分析相包括分析淨零向物質再分布(淨零DMR)，其中分析相包括分析正向物 質再分布(P-DMR)信號的形狀，其中分析相包括分析正向物質再分布(P-DMR) 信號的振幅，其中分析相包括分析反向物質再分布(P-DMR)信號的形狀，其 中分析相包括分析反向物質再分布(P-腿R)信號的振幅。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數包括生物傳感 器輸出的全面動力學，其中分析全面動力學包括分析生物傳感器輸出產生的整 條曲線的形狀。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數是與共振峰有
關的參數。
還公開了方法，可包括一些方法: 耦合生物傳感器時，光強vs入射角。
還公開了方法，可包括一些方法, 耦合生物傳感器時的光強vs光波長。
還公開了方法，可包括一些方法，
其中生物傳感器輸出參數包括分析在光 其中生物傳感器輸出參數包括分析在光 其中生物傳感器輸出參數包括分析峰位 其中分析峰位置包括分析在最大強度位 其中分析峰位置包括分析在最大強度位 其中生物傳感器輸出參數包括分析共振 其中生物傳感器輸出參數包括分析最大
還公開了方法，可包括一些方法 置之前的半最大峰強度位置。
還公開了方法，可包括一些方法 置之後的半最大峰強度位置。
還公開了方法，可包括一些方法 峰上一點的強度。
還公開了方法，可包括一些方法 強度的強度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中分析共振峰強度包括分析在共振峰 上，峰值強度之前發生的半最大峰強度的強度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中分析共振峰強度包括分析在共振峰 上，峰值強度之後發生的半最大峰強度的強度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中該方法還包括收集第二生物傳感器 輸出參數。
131還公開了方法，可包括一些方法，其中第二生物傳感器輸出參數包括分析 峰位置。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數包括分析峰形。 還公開了方法，可包括一些方法，其中分析峰形包括測定共振峰下面積。 還公開了方法，可包括一些方法，其中共振峰下面積僅包括在共振峰上存
在的半最大強度點之間連線以上的面積。
還公開了方法，可包括一些方法，其中分析峰形包括分析半最大強度點的
共振峰寬度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出參數是與共振帶圖 像有關的參數。
還公開了方法，可包括一些方法，其中共振帶圖像是通過用穿過生物傳感 器的光點對生物傳感器進行光照，並對穿過生物傳感器的入射耦合光強分布作 圖。
還公開了方法，可包括一些方法，其中入射耦合光強度分布由CCD照相機 顯像。
還公開了方法，可包括一些方法，其中有關共振帶圖像的參數是帶形、帶 位置、帶強度或光強分布。
還公開了方法，可包括一些方法，其中分析了半最大峰寬(PWHM)聯合最 大強度位置。
還公開了方法，還進一步包括將培養的細胞與化合物一起孵育。 還公開了方法，可進一步包括確定是否化合物影響刺激事件對細胞的作用。
還公開了方法，可進一歩包括測定化合物對刺激事件對細胞作用的影響。 還公開了方法，可包括一些方法，其中篩選一種或多種額外化合物來測定
是否化合物影響剌激事件對細胞的作用。
還公開了方法，可包括一些方法，其中收集生物傳感器輸出短於IO分鐘，
其中生物傳感器輸出的收集短於5分鐘、l分鐘、30秒、10秒、5秒或1秒。 還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出的收集時間基本與
刺激作用的生物擴散限制時間相同。
還公開了方法，可包括一些方法，其中包括提供檢測系統。 還公開了方法，可包括一些方法，其中提供多個無標記生物傳感器，其中在每兩個或多個生物傳感器上培養細胞，其中對兩個或多個生物傳感器提供刺 激事件，其中從兩個或多個生物傳感器收集生物傳感器輸出。
還公開了方法，可包括一些方法，其中監測細胞穿透深度的多樣性。 還公開了方法，可包括一些方法，其中每個生物傳感器具有一種穿透深度。 還公開了方法，可包括一些方法，其中同時收集來自兩個或多個生物傳感 器的生物傳感器輸出。
還公開了方法，可包括一些方法，其中同時培養細胞。
還公開了方法，可包括一些方法，其中對兩個或多個生物傳感器同時提供 刺激事件。
還公開了方法，可包括一些方法，其中在多個生物傳感器上孵育多種不同 的細胞。
還公開了方法，可包括一些方法，其中多種細胞包括至少兩個不同的細胞，
因為至少細胞之一經遺傳工程改造。
還公開了方法，可包括一些方法，其中多種細胞類型中的各細胞類型由多
個生物傳感器中的不同生物傳感器檢測。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞培養到至少70%鋪滿度。 還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞包括多個細胞。 還公開了方法，還包括在細胞中加入緩衝液，其中緩衝液與細胞類型和刺
激事件類型兼容。
還公開了方法，可包括一些方法，其中收集生物傳感器輸出包括使生物傳 感器與可變入射角的光接觸，在光入射耦合時測量入射角。
還公開了方法，可包括一些方法，其中收集生物傳感器輸出包括使生物傳 感器與可變波長的光接觸，在光入射耦合時測量波長。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞是增殖期、休眠期、分化期、 或在特定的細胞周期狀態。
還公開了方法，可包括一些方法，其中通過在生長培養基中培養細胞，使 細胞為增殖期。
還公開了方法，可包括一些方法，其中通過在飢餓培養基中培養細胞，使 細胞為休眠期。
還公開了方法，還包括分析生物傳感器輸出。
還公開了方法，可包括一些方法，其中監測以l秒、3秒、5秒、10秒、
13320秒、30秒、l分鐘、或5分鐘的採樣速率連續進行。
還公開了方法，還包括鑑定刺激事件對細胞的作用。 還公開了方法，可包括一些方法，其中鑑定作用包括將生物傳感器輸出與 特徵輸出比較。
還公開了方法，可包括一些方法，其中特徵輸出包括至少以下相之一的動
態物質再分布正-DMR、反-DMR和淨零-D服階段。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞是從一細胞系產生的。 還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞系是遺傳工程改造的變體細胞系。
還公開了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括在細胞培養物中加入 一種化合物，其中作用是化合物對細胞吸收、分布、代謝或毒性的作用。
還公開了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括在細胞培養物中加入 一種化合物，其中測定化合物的作用包括功能性評估化合物對細胞的作用，和 鑑定化合物對細胞吸收、分布、代謝或毒性的作用。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出與細胞物質再分布 的改變有關。
還公開了方法，可包括一些方法，其中可觀察作為生物傳感器反射光束的 角度或光譜變化的生物傳感器輸出。
還公開了方法，可包括一些方法，其中收集生物傳感器輸出包括監測培養 細胞的時間依賴性響應。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞達到至少80%鋪滿度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器嵌入微量滴定板。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞在生物傳感器上生長至少1小 時、5小時、IO小時、16小時、24小時、36小時、l周或2周。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器能分辨在與存活細胞接 觸的生物傳感器表面的一定區域、與被刺激事件影響的細胞接觸的生物傳感器 表面的一定區域、和不接觸細胞的生物傳感器表面的一定區域。
還公開了方法，可包括一些方法，其中被影響的細胞釋放出一部分胞內成 分或是死細胞。
還公開了方法，還包括將細胞-生物傳感器與化合物一起孵育。 還公開了方法，可包括一些方法，其中化合物是化學物質、生物化學物質、
134生物分子、藥物或聚合物。
還公開了方法，可包括一些方法，其中分析是在與化合物一起孵育後進行的。
還公開了方法，可包括一些方法，其中分析是在少於或等於60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、或l秒中發生的。
還公開了方法，可包括一些方法，其中不均一性是通過從生物傳感器收集生物傳感器輸出測定的，其中生物傳感器輸出包括具有最大強度的導向模式共振峰，和比較半最大強度的峰寬(P冊M)。
還公開了方法，可包括一些方法，其中導向模式是橫向磁場模式。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器是單數形式或多路(multiplexed)形式。
還公開了方法，可包括一些方法，其中當生物傳感器是複數形式，其中生物傳感器嵌於微量滴定板的一個或多個孔中。
還公開了方法，可包括一些方法，其中在微量滴定板的一個孔中有一個生物傳感器。
還公開了方法，可包括一些方法，其中在微量滴定板的一個孔中有多個生物傳感器，其中生物傳感器用或不用屏障物理分隔。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器用屏障物理分隔，其中在孔中確定區室的屏障比確定微量滴定板孔的屏障要低。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器是光學波導生物傳感器。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器是光學波導光柵生物傳感器。
還公開了方法，可包括一些方法，其中在兩個或多個孔的每一個中培養細胞，其中對兩個或多個孔提供剌激事件，其中刺激事件包括在兩個或多個孔中加入化合物，其中從兩個或多個孔中收集生物傳感器輸出，其中將兩個或多個孔的PWHM與對照孔比較，其中對對照孔不提供刺激事件。
還公開了方法，可包括一些方法，其中以每孔高於1、 2、 3、 4、 5、 10、15、 30、 45、或60秒的速率收集生物傳感器輸出。
還公開了方法，可包括一些方法，其中以每分鐘多於60、 30、 15、 10、 7、5、 4、 3、 2或l孔的速率收集生物傳感器輸出。
還公開了方法，可包括一些方法，其中以每孔高於1、 2、 3、 4、 5、 10、
13515、 30、 45、或60秒的速率比較孔的PWHM。
還公開了方法，可包括一些方法，其中以每分鐘多於60、 30、 15、 10、 7、
5、 4、 3、 2或1孔的速率比較孔的PW腿。
還公開了方法，可包括一些方法，其中可用單數據點評估化合物毒性。還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出是時間依賴性PW麗
改變'
還公開了方法,還公開了方法，
可包括一些方法，其中生物傳感器是光學生物傳感器。可包括一些方法，其中生物傳感器是基於光學的生物傳感
還公開了方法,還公開了方法,還公開了方法，還公開了方法，還公開了方法，還公開了方法，
可包括一些方法，其中生物傳感器是無標記生物傳感器。可包括一些方法，其中生物傳感器結合於培養細胞的系統。可包括一些方法，其中系統是平板。可包括一些方法，其中平板是多孔平板。可包括一些方法，其中平板是微量滴定板。可包括一些方法，其中在兩個或多個孔的每個中培養細胞，其中微量滴定板由孔組成，其中生物傳感器輸出是在指定時刻每孔總傳感器區域的TMO模式共振角帶的圖像。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞達到70%鋪滿度。還公開了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括在兩個或多個孔中加入化合物，其中將加入化合物的孔的TMO模式共振角帶的寬度與未加化合物的TMO模式共振角帶寬度比較，比較TMO模式共振角帶的寬度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器是基于波導的生物傳感
還公開了方法，可包括一些方法，其中基于波導的生物傳感器是基於Nb205
的光學生物傳感器。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞是粘附細胞。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞生長到30%、 40%、 50%或90%
鋪滿度。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出是光學波導光模式譜(OWLS)，導向模式的共振峰、或導向模式的共振帶圖像。
還公開了方法，可包括一些方法，其中PWHM的下降表示化合物對細胞有
136影響
還公開了方法, 還公開了方法, 還公開了方法, 還公開了方法, 還公開了方法，
還公開了方法， 還公開了方法，
可包括一些方法，其中PWHM變寬表示化合物對細胞有毒。 可包括一些方法，其中PWHM分裂表示化合物對細胞有毒。 可包括一些方法，其中共振帶變寬表示化合物對細胞有毒。 可包括一些方法，其中細胞達到至少70%鋪滿度。 可包括一些方法，其中PWHM的下降表示化合物對細胞有
可包括一些方法, 可包括一些方法，
其中生物傳感器與微量滴定板結合。 其中生物傳感器嵌入微量滴定板各孔底
部,
還公開了方法,
物傳感器。
還公開了方法, 還公開了方法, 還公開了方法，
減少的分析。
還公開了方法，
到30-70%鋪滿度。 還公開了方法, 還公開了方法， 還公開了方法, 還公開了方法，
可包括一些方法，其中生物傳感器是基於光學的無標記生
可包括一些方法, 可包括一些方法,
可包括一些方法，
其中細胞-生物傳感器被化合物覆蓋。
其中化合物在溶液中。
其中起始細胞數能實現增殖增加或增殖
可包括一些方法，其中細胞數在不存在化合物的情況下達
可包括一些方法， 可包括一些方法， 可包括一些方法， 可包括一些方法，
其中細胞數達到40-60%鋪滿度。 其中細胞數達到45-55%鋪滿度。 其中細胞數達到50%鋪滿度。 其中在生物傳感器上培養的細胞器在和 化合物孵育之前含有至少1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10， 000、 11,000、 12,000、 13,000、 14,000、 15,000、 16,000、 17,000、 18,000、 19,000、 20,000、 21,000、 22,000、 23,000、 24,000、 25,000、 30,000、 35,000、 40,000、 45,000、 50,000、 55,000、 60,000、 65,000、或70,000個 細胞。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出在單個時間點收集。 還公開了方法，可包括一些方法，其中收集的生物傳感器輸出是一種譜。 還公開了方法，可包括一些方法，其中收集的生物傳感器輸出是各生物傳 感器全部面積的TM0模式共振角帶圖像。還公開了方法，可包括一些方法，其中收集的生物傳感器輸出是各生物傳
感器全部面積的TM0模式共振角帶圖像。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出包括總角度漂移，
其中總角度漂移的下降表明化合物是細胞增殖的抑制劑。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出包括總角度漂移，
其中總角度漂移的上升表明化合物是細胞增殖的抑制劑。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出包括入射耦合光的
強度，其中入射耦合光的強度對入射光角度作圖。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞在生物傳感器上培養至少1小
時、5小時、IO小時、16小時、24小時、36小時、l周或2周。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出包括耦合模式。 還公開了方法，可包括一些方法，其中耦合模式是橫向磁場模式(TM0)。 還公開了方法，可包括一些方法，其中TMO模式對最初細胞接種數作圖。 還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞含有受體酪氨酸激酶(RTK)，
其中細胞懸浮在含血清的培養基中，血清濃度使得細胞在生物傳感器表面附著
並生長，其中細胞附著在生物傳感器表面。還公開了方法，還包括通過將細胞在37"C飢餓培養基中培養，飢餓粘附細
胞，其中飢餓培養基是含有低濃度血清的培養基。
還公開了方法，還包括在培養基中至少加入一次緩衝液。
還公開了方法，可包括一些方法，其中刺激事件包括將RTK配體加入到培
養基中。
還公開了方法，可包括一些方法，其中培養基缺乏PDGF (血小板衍生生長 因子)、EGF、胰島素、TGF-oc、胰島素樣生長因子I (IGF-I)、和神經生長因 子(NGF)。
還公開了方法，可包括一些方法，其中飢餓培養基具有濃度低於約0.1% 的血清或胎牛血清(FBS)。
還公開了方法，可包括一些方法，其中時間依賴性響應發生至少1， 2， 3, 4， 5, 6， 7, 8， 9, 10, 11， 12， 13， 14， 15， 16, 17， 18， 19， 20, 21' 22， 23， 24, 36，或48小時。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器嵌入具有多個孔的微量 滴定板底部，其中在兩個或多個孔的各孔中培養不同類型的細胞，其中對兩個或多個孔提供刺激事件，其中刺激事件是在兩個或多個孔中加入RTK配體，其中從兩個或多個孔中收集生物傳感器輸出，其中生物傳感器輸出是不同類型細胞的時間依賴性響應。
還公開了方法，可包括一些方法，其中不同類型的細胞需要不同培養條件。
還公開了方法，可包括一些方法，其中在不同類型的細胞中測量或測定RTK的表達水平或細胞表面表達水平。
還公開了方法，還包括將培養的細胞與一種化合物一起孵育，測定化合物是否調節RTK信號傳遞。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞具有相對高表達水平的RTK，其中生物傳感器嵌入具有多個孔的微量滴定板底部，其中在兩個或多個孔的各孔中培養細胞，其中對兩個或多個孔提供刺激事件，其中刺激事件是在兩個或多個孔中加入RTK配體，其中在兩個或多個孔中加入不同濃度的RTK配體，其中從兩個或多個孔中收集生物傳感器輸出，其中生物傳感器輸出是不同類型細胞的劑量和時間依賴性響應。
還公開了方法，可包括一些方法，其中比較了細胞的劑量和時間依賴性響應。
還公開了方法，可包括一些方法，其中測定了配體的能力。
還公開了方法，還包括分析生物傳感器輸出，以獲得來自細胞的生物物質釋放，從而分析細胞中細胞骨架的狀態。
還公開了方法，可包括一些方法，其中細胞的生物物質釋放依賴於細胞的成孔試劑誘導的通透性。
還公開了方法，還包括在細胞培養物中加入成孔試劑。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器輸出是時間依賴性光學反應。 .
還公開了方法，可包括一些方法，其中所述成孔試劑是化學試劑或生物化合物，可導致細胞表面膜中形成孔。
還公開了方法，可包括一些方法，其中成孔試劑是皂苷、毛地黃皂苷、菲律賓菌素或鏈球菌溶血素0。
還公開了方法，還包括在細胞培養物中加入成孔試劑後在細胞培養物中加入化合物。
還公開了方法，可包括一些方法，其中篩選一種或多種化合物，以確定是
139否化合物能干涉細胞內的細胞骨架結構。
還公開了方法，還包括在細胞培養物中加入成孔試劑前在細胞培養物中加入化合物。
還公開了方法，可包括一些方法，其中篩選一種或多種化合物，以確定是
否化合物能干涉細胞內的細胞骨架結構。
還公開了方法，還包括步驟用能檢測標記的裝置檢測標記。還公開了方法，可包括一些方法，其中標記是螢光標記、放射性標記、或
磷光標記。
還公開了方法，可包括一些方法，其中檢測標記的步驟與監測生物傳感器的步驟同時發生。
還公開了方法，可包括一些方法，其中生物傳感器具有兩個區，第一個沉積有不含物質的混合物，第二個沉積有含物質的混合物，從而當細胞在傳感器上孵育時，覆蓋第二個區域的細胞被物質轉染。
還公開了方法，可包括一些方法，其中物質是靶基因、靶蛋白、靶蛋白和
標記蛋白的融合蛋白、針對靶標的脂Ai、針對耙標的抗體、反義寡核苷酸及其衍生物、反基因寡核苷酸及其衍生物。
還公開了方法，可包括一些方法，其中標記蛋白是His-標記、GFP蛋白或其衍生物。
還公開了方法，可包括一些方法，其中物質與試劑複合，從而使當細胞附著在傳感器存在物質的區域時，細胞能攝取該物質。
還公開了方法，可包括一些方法，其中通過將含有物質的混合物選擇性沉積在沿光柵結構的傳感器表面一半形成區域。
還公開了測定活細胞狀態的方法，包括觀察細胞內含物的動態物質再分布，其中觀察步驟在共振波導光柵生物傳感器上發生。
還公開了測試化合物對細胞的作用的方法，包括在生物傳感器上培養細胞，首先洗滌細胞，飢餓細胞，'將化合物與細胞孵育，並用生物傳感器記錄信號。
還公開了方法605，還包括在飢餓步驟後用緩衝液漂洗步驟，或其中細胞生長至高於90%鋪滿度，或其中洗滌細胞兩次，或其中飢餓細胞包括將其僅在DMEM中培養，或其中飢餓細胞進行l， 2， 3， 4, 5， 6, 7, 8， 9， 10， 11， 12，13， 14， 15， 16， 17, 18' 19， 20' 21， 22, 23, 24， 25' 30， 35, 40小時，
140或其中飢餓細胞進行過夜，或其中漂洗緩衝液包含lx常規Hank' s平衡鹽緩衝液，20mM HEPES緩衝液，在2. 5mM丙磺舒的存在下，pH7. 0，或其中信號是鈣信號，或其中在6分鐘內每隔6秒記錄鈣信號，或其中生物傳感器包括HTS7000BioAssay讀數儀，或其中方法在室溫下進行，或其中生物傳感器是Corning Epic 角度訊問系統，或其中生物傳感器以橫向磁場模式使用，或其中生物傳感器以p-極化TM。模式使用，或其中化合物用漂洗緩衝液稀釋，或其中漂洗緩衝液含有lx常規Hank's平衡鹽緩衝液，20mM HEPES緩衝液，pH7. 0，或其中飢餓細胞發生在不含FBS的緩衝液中，或其中化合物是在溶液中，該溶液含有低於0. 05%的DMS0，或其中飢餓步驟在37'C下發生，或其中飢餓步驟還在空氣/5呢c02下發生，或其中在化合物溶液和細胞孵育之前，細胞用不含化合物的化合物溶液預處理，直到達到穩態，或其中生物傳感器識別共振帶中央位置的像素密度改變，或其中生物傳感器測量共振帶的角度漂移，或還包括將生物傳感器數據對時間作圖的步驟，或其中增加的信號(P-DMR)意味著傳感體積(sensing volume)內生物分子量的增加，減弱的信號(N-DMR)意味著傳感體積內生物分子量的下降，或該方法識別細胞和化合物的特徵，或其中特徵包括P-D服階段，然後是N-DMR階段，其中P-DMR階段的發生速率比N-D服階段的衰變速率要高，或其中特徵包括P-DMR階段，直到P-DMR階段達到評估平臺，或其中特徵包括兩個連續的p-DMR事件，其中升高水平的第一個P-DMR階段的發生速率比對第二個升高水平的P-DMR階段的速率要高，或其中特徵不包括高於噪聲水平的任何dmr信號，或還包括將生物傳感器的信號對化合物濃度作圖
的步驟。
可將細胞培育到20-99%鋪滿度，30-80%鋪滿度，40-65%鋪滿度，70-99%鋪滿度，和80-95%鋪滿度。細胞可以是粘附細胞。粘附細胞是可附著在生物傳感器表面的細胞。刺激事件可包括在細胞培養物中加入化合物。化合物可調節細胞的細胞信號途徑。調節可活化細胞信號途徑。調節可抑制細胞信號途徑。化合物可調節細胞上的細胞表面受體。化合物調節可以是受體的激動劑。化合物調節可以是受體的拮抗劑。細胞表面受體可以是G蛋白偶聯受體(GPCR)、離子通道、受體酪氨酸激酶、細胞因子受體、整聯蛋白受體、Na+Ai+交換蛋白受體、和免疫受體。受體酪氨酸激酶可以是表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGF)、胰島素受體、血管內皮生長因子受體(VEGFR)。化合物可以調節細胞內的細胞骨架成分。調節物使細胞骨架結構去穩定。 調節物穩定細胞骨架結構。化合物可以調節胞內酶、胞內激酶、胞內細胞器、 或胞內蛋白。化合物可調節胞外基質。
收集來自生物傳感器的生物傳感器輸出數據步驟包括收集生物傳感器輸 出數據參數。生物傳感器輸出數據參數是與刺激事件的動力學有關的參數。生 物傳感器輸出參數可以包括分析生物傳感器輸出數據的總體動力學。分析總體 動力學可包括分析相變完成的速率。分析總體動力學可包括分析完成數據輸出 所需的時間。分析總體動力學可包括分析數據輸出總相所需的時間長度。分析
總體動力學可包括分析p-DMR階段的總持續時間。分析總體動力學可包括分析 N-DMR階段的總持續時間。分析總體動力學可包括分析獲得P-DMR全幅值的速 率。分析總體動力學可包括分析獲得N-DMR全幅值的總時間長度。分析總體動 力學可包括分析獲得P-D服全幅值的總時間長度。分析總體動力學可包括分析 從P到N-DMR階段的過渡時間t 。
生物傳感器輸出參數可包括分析生物傳感器輸出數據的相。分析相可包括 分析相變。分析相可包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號。分析相可包括 分析反向物質再分布(N-薩R)信號。分析相可包括分析淨零向物質再分布(淨 零DMR)。分析相可包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的形狀。分析相可 包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的振幅。分析相可包括分析反向物質 再分布(N-匿R)信號的形狀。分析相可包括分析反向物質再分布(N-DMR)信 號的振幅。
生物傳感器輸出參數可包括生物傳感器輸出數據的全面動力學。分析全面 動力學可包括分析生物傳感器輸出產生的整條曲線的形狀。生物傳感器輸出參 數是與共振峰有關的參數。生物傳感器輸出參數可包括分析在光耦合生物傳感 器時，光強對入射角。生物傳感器輸出參數可包括分析在光耦合生物傳感器時 的光強對光波長。生物傳感器輸出參數可包括分析峰位置。分析峰位置可包括 分析在峰值強度位置之前的半最大峰強度位置。分析峰位置可包括分析在峰值 強度位置之後的半最大峰強度位置。
生物傳感器輸出參數可包括分析共振峰上一點的強度。分析共振峰強度可 包括分析峰強度的強度。分析共振峰強度可包括分析在共振峰上，峰值強度之 前發生的半最大峰強度的強度。分析共振峰強度可包括分析在共振峰上，峰值 強度之後發生的半最大峰強度的強度。該方法還可包括收集第二生物傳感器輸出參數。第二生物傳感器輸出參數可包括分析峰位置。生物傳感器輸出參數可包括分析峰形。分析峰形可包括測定共振峰下面積。共振峰下面積可僅包括在共振峰上存在的半最大強度點之間連線以上的面積。分析峰形可包括分析半最大強度點的共振峰寬度。生物傳感器輸出參數可以是與共振帶圖像有關的參數。可通過用穿過生物傳感器的光點對生物傳感器進行光照，並用接收系統對穿過生物傳感器的入射耦合光強分布作圖收集共振帶圖像。接收系統可以是CCD照相機。有關共振帶圖像的參數可以是帶形、帶位置、帶強度或光強分布。
可分析半最大峰寬(PWHM)聯合最大強度位置。可同時分析生物傳感器。從各孔的生物傳感器收集數據點的時間可小於1小時、30分鐘、5分鐘、l分鐘、30秒、10秒、5秒、2秒、l秒，而且是生物擴散限制的。可通過在生長培養基中培養細胞，使細胞為增殖期，或可通過在飢餓培養基中培養細胞，使細胞為休眠期，或是分化狀態，或特定的細胞周期狀態。飢餓培養基是任何降低細胞培養物細胞增殖能力的培養基。
方法還可包括在細胞培養基中至少一次加入緩衝液的步驟，其中所用的緩衝液可基於根據細胞類型和耙標-化合物相互作用的性質的最佳分析。可以連續方式，以1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、1分鐘、或5分鐘、30分鐘的採樣速率進行監測。特徵輸出可包括動態物質再分布反應，包括三個相中的至少一個正-DMR、反-畫R、和淨零-D服階段。可從細胞系產生細胞，或是遺傳工程改造的變體細胞系。可分析化合物在細胞上的吸收、分布、代謝和毒性來測定化合物的作用。作用可包括化合物在細胞上的功能評估，並鑑定對細胞的吸收、分布、代謝、排出和毒性的作用。
生物傳感器輸出與細胞物質再分布的改變有關。可觀察作為生物傳感器反射光束的角度或光譜變化的生物傳感器輸出。該方法還包括在細胞培養基中至少一次加入緩衝液。化合物可以是抗癌化合物，或可能的抗癌化合物。在生物傳感器上可有至少10xlS個細胞。細胞可達到至少80%鋪滿度。生物傳感器可嵌入微量滴定板。細胞可在生物傳感器上生長至少1小時、5小時、IO小時、16小時、24小時、36小時、l周或2周。生物傳感器能分辨與存活細胞接觸的生物傳感器表面的一定區域。被影響的細胞可釋放出一部分胞內成分或是死細胞。
該方法還包括將細胞-生物傳感器與化合物一起孵育。化合物是化學物質、
143生物化學物質、生物分子、藥物或聚合物。該方法還包括在與化合物一起孵育 後進行分析。可在少於或等於60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒、4秒、 3秒、2秒、或1秒中內進行分析。不均一性可通過從生物傳感器收集輸出測 定(其中該輸出產生具有最大強度的導向模式共振峰)，和比較半最大強度的 峰寬(PWHM)來測定。導向模式是橫向磁場模式。
生物傳感器可以是單數形式或複數形式。當生物傳感器是複數形式，生物 傳感器可嵌於微量滴定板的一些孔中。在微量滴定板的一個孔中可有一個生物 傳感器。在微量滴定板的一個孔中可有多個生物傳感器，其中生物傳感器可用 或不用屏障物理分隔。當生物傳感器用屏障物理分隔時，確定區室的屏障可比 確定微量滴定板孔的屏障要低。生物傳感器可以是光學波導生物傳感器。生物 傳感器是光學波導光柵生物傳感器。
該方法還可進一步包括收集時間依賴性PWHM改變。光學波導光模式譜可 以是導向橫向磁場模式的共振峰。生物傳感器可以是光學生物傳感器。生物傳 感器可以是基於光學的生物傳感器。生物傳感器可以是無標記生物傳感器。生 物傳感器可與培養細胞的系統結合。系統可以是平板。平板可以是具有多孔的 平板。平板可以是微量滴定板。細胞可達到70%鋪滿度。
方法還可包括步驟獲得TMO模式共振角帶的寬度，將加入化合物的孔的 TMO模式共振角帶的寬度與未加化合物的TMO模式共振角帶寬度比較，比較TMO 模式共振角帶的寬度。生物傳感器可以是基于波導的生物傳感器。基于波導的 生物傳感器可以是基於NbA的光學生物傳感器。細胞可以是粘附細胞。細胞可 生長到30%、 50%或90%鋪滿度。生物傳感器輸出可以是光學波導光模式譜 (OWLS)、或導向模式的共振峰、或導向模式的共振帶圖像。PWHM的變化可表 示化合物對細胞有毒。PWHM變寬可表示化合物對細胞有毒。PWHM分裂可表示 化合物對細胞有毒。共振帶變寬可表示化合物對細胞有毒。細胞可達到至少70% 鋪滿度。生物傳感器可與微量滴定板結合。生物傳感器可嵌入微量滴定板各孔 底部。生物傳感器可以是基於光學的無標記生物傳感器。細胞-生物傳感器可 被化合物覆蓋。化合物可在溶液中。起始細胞數能實現增殖增加或增殖減少的 分析。細胞數在不存在化合物的情況下可達到30-70%鋪滿度。細胞數可達到 40-60%鋪滿度。細胞數可達到45-55°/。鋪滿度。細胞數可達到50%鋪滿度。在生 物傳感器上培養的細胞器在和化合物孵育之前可含有至少1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10，000、 11，000、 12,000、 13,000、
14414， 000、 15, 000、 16， 000、 17， 000、 18, 000、 19， 000、 20， 000、 21， 000、 22, 000、 23,000、 24,000、 25,000、 30,000、 35,000、 40,000、 45,000、 50,000、 55,000、 60,000、 65,000、或70，000個細胞。
輸出可在單個時間點收集。收集的生物傳感器輸出可以是一種譜。收集的 生物傳感器輸出可以是各生物傳感器全部面積的TMO模式共振角帶圖像。收集 的生物傳感器輸出可以是各生物傳感器全部面積的TMO模式共振角帶圖像。該 方法還包括獲得提供總角度漂移的輸出，其中總角度漂移的下降表明化合物是 細胞增殖的抑制劑。該方法還包括獲得提供總角度漂移的輸出，其中總角度漂 移的上升表明化合物是細胞增殖的抑制劑。收集的輸出可獲得入射耦合光的強 度，其中入射耦合光的強度對入射光角度作圖。細胞在生物傳感器上培養至少 1小時、5小時、IO小時、16小時、24小時、36小時、或過夜。
輸出可以是耦合模式。耦合模式可以是橫向磁場模式(TMO) 。 TMO模式還 可對最初細胞接種數作圖。該方法還包括37。C在含有低濃度血清的培養基中飢 餓粘附的細胞一定時間。該方法還包括在細胞培養基中加入至少一次緩衝溶液 一定的時間。該方法還可包括在培養基中加入含有RTK配體的溶液。細胞培養 基可缺乏PDGF (血小板衍生生長因子)、EGF、胰島素、TGF-a、胰島素樣生長 因子I (IGF-1)、和神經生長因子(NGF)。飢餓培養基可具有濃度低於約0. 1% 的血清或牛血清白蛋白(BSA)。時間依賴性響應可發生至少1, 2, 3, 4, 5, 6, 7， 8, 9， 10， 11， 12, 13， 14, 15, 16, 17， 18， 19, 20， 21， 22， 23， 24， 36，或48小時。不同類型的細胞可需要不同培養條件。監測的細胞生物物質 釋放可依賴於細胞的成孔試劑誘導的通透性。成孔試劑是化學試劑或生物物 質，可導致細胞表面膜中形成孔。成孔試劑可以是皂苷、毛地黃皂苷、菲律賓 菌素或鏈球菌溶血素0。
VII.實施例
列出下列實施例是為了給本領域一般技術人員提供有關於本文所要求的 化合物、組合物、製品、裝置和/或方法是如何製備和評估的完整公開和描述， 純粹是示範性的，不意味著限制公開內容。已常識確保數據(例如量、溫度等) 的準確性，但仍可能存在一些錯誤和誤差。除非另外說明，份是重量份，溫度 是'c，或在環境溫度下，壓力是或接近大氣壓。
1451.實施例l基於生物傳感器的細胞毒性篩選
常根據化合物的細胞毒性和抗增殖作用來表徵化合物，以表徵可能的抗癌 藥。此類的一種表型是當細胞接觸細胞毒性劑(包括二甲基亞碸(DMS0))時， 質膜完整性受損。使用基于波導的生物傳感器技術，可檢測監測DMSO對中國 倉鼠卵巢(CH0)和A431細胞的作用是否可行。約10X105個細胞置於Corning Epic LID微板的各孔中。這些細胞在血清培養基中培養過夜，以確保細胞附著 在基材表面，並達到至少80%鋪滿度。檢測了細胞對不同濃度DMSO (1%、 2%、 5%、 10%、 15%、 18%、和20%)的反應。高濃度的(約》25°/。) DMSO導致體積指 數改變，超過了所用傳感器的最大動態範圍，信號喪失。對每種細胞系進行至 少兩組實驗。
a) 材料和方法
所有細胞系購自美國典型培養物保藏中心。DMSO獲自SigraaChemical Co. (St. Louis, M0)。動物細胞的活/死細胞存活試劑盒獲自Molecular Probes (Eugene, Oregon)。
在補充有10。/。胎牛血清、100ng/ml青黴素和100pg/ml鏈黴素的Dulbecco' s 改良Eagle's培養基(DMEM)中培養A431和CHO-Kl細胞。對於細胞培養，將 約10xl(f個細胞(A431或CHO-Kl)懸浮在200jil培養基中，置於96孔Corning Epic生物傳感器微量滴定板的各孔中，37°C，空氣/5%(]02培養過夜。分析前， 細胞用對應培養基洗滌一次。分析中，IO(HU培養基中的細胞中加入兩個含有 20mM HEPES， pH7. 4的25|^1 HBSS緩衝液，各分離至少15分鐘，然後加入50(il 麗SO溶液。在所有這些步驟中，用平行角訊問系統監測細胞反應的實時動力學。
分析後，立刻用供應商推薦的方案對相應得到的細胞進行活/死染色。染 色後，用螢光顯微鏡檢(Zeiss Axioplan螢光顯微鏡)觀察處理和未處理細胞 的形態和螢光分布。
b) 結果
結果顯示，附著在生物傳感器上的細胞產生類似的反應曲線。如圖29所 示，CHO細胞層的畫SO誘導的劑量響應和時間依賴性響應曲線表明，DMSO濃 度小於20%時，反應基本無特徵，除了在引入DMSO溶液後反應逐漸下降。注意 到有最初和迅速的增加時期，這是由於引入所有濃度的DMSO後體積指數改變。
146然而，當DMS0濃度達到20%,觀察到4個事件(A)由於DMS0溶液加入之後 立即發生的由於體積指數的變化而產生的大的響應信號；(B)可能由於兩種 液體在孔中的混合而產生的小的減弱的信號；(C)可能由於DMSO在某些濃度 下滲入並替代細胞內的生物液體而導致的緩慢而穩定的增強的信號；和(D) 由於高濃度DMSO的毒性引起的細胞蛋白質或其它生物分子的喪失並因此導致 的細胞表面膜喪失完整性而產生的長時間的減弱的信號。已知折射率值是對 於該研究中使用的水相緩衝液系統，1.3328; DMSO， 1.437;和蛋白質約1.5。 另外，在細胞中有約70% (重量)的生物液，它主要有水組成，具有1.3328的 折射指數。另外30%含有蛋白質、DNA、 RNA、脂類分子。還已知當DMSO濃度低 於10%時，細胞膜在實驗持續過程中不受DMSO顯著影響；然而當服SO濃度在 10%-20%之間時，受損細胞膜百分數增加。在較高濃度，幾乎所有細胞膜都受 損 (Beske， 0., 等， "A novel encoded particle technology that enables simultaneous interrogation of multiple cell types" ， J. Biomol. Screening. 2004， 9, 173-185))。
類似的劑量響應曲線在作用於A431細胞的畫S0中也觀察到(圖30) 。 CH0 細胞和A431細胞系之間的事件B的不同行為可能是由於兩種類型的細胞在基 材上的粘附和形態不同。CH0細胞傾向於比A431細胞鋪開少，導致A431粘附 在基材上的層更薄，意味著當組成事件D的受影響細胞的物質喪失在兩種細胞 系中相似時，生物液交換事件(事件C)比生物再分布事件要較不明顯。
2.實施例2用光學傳感器HT篩選化合物毒性 a)高通量篩選化合物毒性的方法
技術領域：
本發明的一個方面提供了適合用無標記光學傳感器高通量篩選化合物毒 性和凋亡的方法。該方法使人能夠在幾秒鐘內檢測整個平板的化合物毒性。
該方法的原理基於一個事實，即給定化合物的毒性能導致細胞滲漏，甚至 死亡。這因而導致培養細胞的傳感器表面的不均一性。在毒性研究過程中，生
物傳感器感應三種區域具有活細胞的區域，具有死亡或正在死亡細胞的區域 (其中死細胞傾向喪失其胞內成分，導致折射率改變)，和無細胞區域。不均
一性的形成可導致給定導向模式的共振峰的PWHM改變，或共振帶圖像的寬度
和分布的改變，這都依賴於細胞密度。在特定情況(在膜表面培養的細胞具有 朝向，或具有某類優選結構，或某些區域的細胞對毒性化合物敏感)下，化合物毒性可導致產生精細結構，例如肩部(shoulders)(導致共振峰和帶變寬)， 甚至分裂共振峰。
考慮細胞在波導傳感器平板上預培養並達到高度鋪滿度(>75%)，傳感器 大部分感應折射指數約為1. 37的活細胞以及折射指數約為1. 33的覆蓋的培養 基。TMO峰的PWHM較低。在加入毒性化合物後，細胞開始受到影響。受影響的 細胞同時產生物理和生理改變(即形態學、形狀和胞內成分重排)。最終受影 響細胞死亡。在化合物處理一段時間後，有混合群的細胞活細胞、受影響細 胞和死亡細胞。因此，隨著化合物處理後時間增加，TMO峰的PWHM開始從其較 低水平上升，在某一時刻達到其最大值，並開始再次衰減到其原始的較低水平， 而且總體響應(即角度或波長漂移)也下降。達到其最大值的動力學視細胞系 和化合物作用於細胞的機制而定。該過程是細胞粘附和鋪開過程的逆向過程。
在一個實施例中，本發明提供了一種使用光學生物傳感器高通量篩選對細 胞的化合物毒性的方法，包括(a)提供在每孔底部嵌入有基於光學的無標 記生物傳感器的微量滴定板；(b)將細胞置於每孔中，以覆蓋生物傳感器， 從而使細胞附著在生物傳感器表面，並達到高度鋪滿度；(c)在每孔的細胞 培養基中加入化合物溶液；(e)在某一時刻收集光學波導光模式譜。將各化 合物的PWHM與對照孔比較，該孔中細胞不接觸任何化合物溶液，可用單數據 點評估化合物的毒性。如必需，還可記錄時間依賴性PWHM改變以研究動力學。
在另一個實施例中，本發明提供了另一種評估化合物毒性的方法，包括 (a)提供在每孔底部嵌入有基於光學的無標記生物傳感器的微量滴定板；(b) 將細胞置於每孔中，以覆蓋生物傳感器，從而使細胞附著在生物傳感器表面， 並達到所需的鋪滿度；(c)在每孔的細胞培養基中加入化合物溶液；(e)在 某一時刻收集各孔的整個傳感器區域的TMO模式共振角帶圖像。將用化合物溶 液處理的傳感器的共振帶寬度與對照孔的比較，對照孔中細胞不接觸任何化合 物溶液；可評估化合物毒性。
根據細胞毒性和抗增殖效果描述化合物常用於描述可能的抗癌藥。 一種表 型是當細胞接觸細胞毒性劑(包括二甲亞碸(DMS0))時，質膜完整性受損。 使用基于波導的生物傳感器技術，用高通量方法檢測了在中國倉鼠卵巢(CH0) 和A431細胞上監測DMS0的效果的可行性。
圖31A顯示培養於Nb205基光學波導生物傳感器上具有不同鋪滿度度(30 %、 50%和90%)的CHO細胞層的入射耦合光的強度，它是入射角的函數。耦合模式是橫向磁場(TMO)模式。圖31B顯示了計算TMO模式的半最大峰寬 (PWHM)，並對CHO細胞鋪滿度度作圖。隨著細胞鋪滿度度增加，PWHM增加， 在約50%鋪滿度時達到最大值，然後開始下降到起始值。值得注意的是，在所 有鋪滿度水平上，細胞的入射耦合峰具有小肩峰，但對於沒有細胞附著的傳感 器來說並沒有。這可能是由於CHO細胞傾向於附著於具有優選朝向的光柵傳感 器表面(見圖35A)。
圖32顯示在波導光柵傳感器上培養的具有兩種不同鋪滿度度，5% (左) 和75% (右)的CHO細胞層的TMO模式共振峰。在加入DMSO後(最終濃度為 18%)，在不同時刻記錄共振峰譜。對於小於約25%的細胞密度，P冊M值不隨 時間改變。然而，當傳感器上細胞鋪滿度度高(>70%)時，PWHM起初上升，隨 後下降。不僅共振峰變寬，在DMSO處理後約25分鐘時出現肩部等細微結構， 甚至共振峰分裂。有趣的是，響應DMSO處理的共振峰變寬和峰形改變是動態 過程，提示DMSO誘導的細胞響應與某些細胞信號途徑，例如凋亡一致。
圖33顯示了不同鋪滿度度的CH0細胞層覆蓋的整個傳感器的TM0模式共 振帶圖像。在用緩衝液(2欄)、18% DMS0 (l欄)處理25分鐘後取得圖像。 圖像提示(i)用緩衝液處理的細胞不導致整個傳感器的共振帶有任何改變， 不論細胞的鋪滿度度如何；(ii)用18% DMS0處理的細胞產生鋪滿度度依賴 性的共振帶變寬。當細胞鋪滿度度高於70%， DMSO-誘導的共振帶變寬。這些結 果提示，可用共振帶變寬作為化合物毒性的特徵；細胞密度或鋪滿度度對於使 得這類評估有效是重要的。與共振峰譜相似，響應DMSO處理的共振帶圖像變 寬或形狀改變是動態過程，提示DMSO-誘導的細胞響應可能與某些細胞信號途 徑，例如凋亡有關。更重要的是，微量滴定板中的所有96個傳感器的共振帶 圖像可在3秒內收集，提示基於共振帶圖像或譜的本發明方法提供了細胞毒性 評估和化合物毒性篩選的超高通量技術。
圖34顯示了以相同鋪滿度度(約95%)的CH0細胞層覆蓋整個傳感器的 TM。模式共振帶圖像。在用緩衝液(欄2的6個孔)和不同濃度的DMSO (l欄中 的6個孔，3欄中的6個孔，如圖34所示)處理25分鐘後獲得圖像。結果顯 示，DMSO的毒性作用依賴於濃度；僅較高濃度導致顯著的細胞毒性，如帶形改 變所示。特別有趣的發現是當所用的DMSO濃度為約15%時，出現第二條共振帶， 可能是由於CHO細胞培養物在傳感器上的優選朝向。CHO細胞似乎在培養條件 下與光柵結構的排列一致(見圖35)。發現這些結果與常規活/死細胞染色法一致，並用該方法驗證(數據未顯示)。
3. 實施例3高通量增殖分析
圖36A顯示當三種不同接種數的細胞用於在常規培養條件下培養36小時， 在波導光柵傳感器表面培養的CHO細胞作為入射角函數的入射耦合光強度。耦 合模式是橫向磁場(TM。)模式。圖36B顯示計算TM。模式的半最大峰寬(PWHM) 並對CH0最初接種數量作圖。隨著細胞的最初接種數增加，PW麗增加，在 20000-30000最初接種細胞處達到最大值(對應鋪滿度度約為50%)，並開始 下降到起始值。值得注意的是，在所有鋪滿度水平，細胞的入射耦合峰有明顯 肩峰，但對於沒有細胞附著的傳感器沒有。這也可能是由於CHO傾向於以優選 朝向附著在光柵傳感器表面(見圖35)。有趣的是，這裡所示的結果與在固定 時間段後，用不同接種數的細胞以達到不同細胞密度獲得的一致(見圖31)， 提示該方法是可再現的。
圖37顯示在波導光柵傳感器上培養36小時(不同的孔含有不同起始接種 數的細胞)後，CHO細胞覆蓋的整個傳感器的TM。模式共振帶圖像。觀察整個傳 感器的TM。模式共振帶圖像的形狀和位置依賴於最初接種的細胞數，提示傳感 器對細胞密度敏感；CHO細胞的增殖速率依賴於最初接種的細胞數，如在用 Molecular Probes的活/死細胞試劑盒染色後，用螢光顯微鏡進行細胞密度分 析驗證的。對最初接種數為10000、 20000、 30000、 40000和50000個細胞， 對應的鋪滿度度分別是5%、 30°/。、 55%、 75%、 95%。
4. 實施例4用生物傳感器進行細胞信號途徑研究 a)材料和方法
所有細胞系購自美國典型培養物保藏中心。所有化學物質購自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)， 或Tocris Chemical Co. (St. Louis, MO)。
在補充有10。/。胎牛血清、10(Hig/ml青黴素和100pg/ml鏈黴素的Dulbecco' s 改良Eagle's培養基(DMEM)中培養A431和CH0-K1細胞。對於細胞培養，將 一定數量的細胞(2xl05-lxl6個細胞，A431或CHO-Kl)懸浮在200|il培養基 中，置於96孔Corning Epic生物傳感器微量滴定板的各孔中，37°C,空氣/5% C02培養一段時間，直到細胞密度達到約90%或以上(除非另外說明)。得到的 細胞被稱為"增殖性"細胞。通過將所需鋪滿度度的增殖性細胞在不含或很少
150(約0. 1%胎牛血清(FBS))的培養基中培養至少16小時獲得"休眠性"細胞。 直接將增殖性或休眠性細胞用於分析，或用對應的培養基洗滌一次再用於 分析(兩者都不導致細胞響應中的明顯差異)。在分析過程中，將100pl培養 基中的細胞中加入兩個含有20mM HEPES， pH7. 4的25|il HBSS緩衝液中，各分 離至少15分鐘，然後加入50ial含有刺激物的溶液。在所有步驟中，使用平行 角度訊問系統監測細胞反應實時動態。為了化合物作用研究，使用改變的方案， 即用50nl培養基開始，然後進行如下依次處理25plHBSS緩衝液兩次(每次 分離至少15分鐘)、50pl化合物溶液、和最後50)il含剌激物的溶液。
所用的傳感器是96孔Corning Epic生物傳感器微量滴定板(如圖1和圖 2a所示)，並直接用於細胞培養物。所用的檢測系統是06-24-2003提交的美 國專利申請號10/602， 304(於12-30-2004出版，公開號為US-2004-0263841)、 12-21-2004提交的美國專利申請號11/019， 439、和N. Fontaine等於2005年 3月31日提交的美國專利申請 "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS"中的那些，在此完整引入以供參考，至少是生物傳 感器及其用途的部分。
b)結果
(1)實時監測配體結合和隨後的RTK信號傳遞事件
圖6A顯示休眠或飢餓A431細胞層在加入8nM EGF之前和之後的時間依賴 性響應(用光學生物傳感器監測)。A431細胞系是癌細胞系，內源過度表達 EGFR。將含有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco's改良Eagle， s培養基(DMEM) 中的A431細胞加到微量滴定板的各孔中，在各孔底部具有波導生物傳感器。 細胞37'C培養過夜，用僅含0. 1%血清的培養基交換血清培養基，繼續培養細 胞另18小時。在室溫下(約20°C)進行整個時間過程。加入EGF (A)後，EGF 處理休眠A431細胞(通過在O. 1%胎牛血清(FBS)中培養18小時獲得)，產 生由三個不同的依次相組成的時間依賴性響應(i)信號增加的正相(P-DMR) (圖6A的點C到D) ， (ii)淨零相(點D到E),和(iii)具有下降信號 的衰變相(N-DMR)(點E至ljF至ljG)。注意到信號有迅速的響應改變，持續小 於20秒(圖6A的點B到C)，它在孔中加入50ml EGF時發生。該迅速改變主 要是由於體積指數(bulk index)改變，臨時覆蓋了任何D服信號。測得的P-DMR 信號主要是由於胞內成分向活化的EGFR募集，以及由於在EGFR活化後質膜內
151陷造成細胞扁平，而細胞脫離和受體內化是N-DMR事件的兩個主要原因。然而 P-DMR事件可能還與和細胞功能無關的事件有關，包括細胞培養基和化合物溶 液之間的溶液擴散和溫度差異。
上述步驟在響應曲線中的動力學與文獻中所報導的EGF-誘導的EGFR信號 傳導的配體結合、磷酸化和運輸事件(B. Schoeberl， C. Eichler-Jonsson， E. D. Gilles， G. Muller， "Computational Modeling of the Dynamics of the MAP Kinase Cascade Activated by Surface and Internalized EGF Rec印tors， " A'otec力.20， 370 (2002)) —致。生物學和生物化學
研究已顯示在37°C， EGF-結合受體可在5-20分鐘內內化入位於靠近細胞膜內 面的早期內含體。然後，這些EGFR與其它成分複合，被運輸到晚期內含體(20-60 分鐘)和溶酶體(〉60分鐘)降解，兩者都與細胞膜的內面相對較遠(即在運 輸過程中，這些受體朝離開傳感器表面的方向移動)。受體和配體通過不同區 室存在連續流動；多個步驟顯示它們的完全動態分布。由於迅速內化，EGF結 合的受體僅在細胞表面停留相對較短的時間(約3分鐘)。
(2)測定EGFR表達水平和細胞表面表達的方法
內源過度表達表皮生長因子受體(EGFR，約1， 700， 000拷貝/細胞)的A431 細胞是EGFR信號傳導的廣泛研究的模型(A. Glading, P. Chang, D. A. Lauffenburger,禾口 A. Wells, "Epidermal growth factor receptor activation of calpain is required for fibroblast motility and occurs via an ERK/MAP kinase signaling pathway, ，，J. Biol. Chem. 2000， 275:2390 - 2398)。用EGF在室溫或37。C刺激休眠A431細胞最終導致受體內 吞，折射形態學改變和細胞從胞外基質上脫離(Z. Lu， G. Jiang, P. Blume-Jensen， 禾口 T. Hunter, "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase, ，， Mol. Cell Biol. 2001， 21， 4016 - 4031)。因此，EGF刺激導致A431細胞中顯著的物質再分布，如用陣列 訊問系統實時測量的(見圖6A、圖18)。結果顯示了 A431細胞的EGF-誘導的 DMR響應強烈依賴於培養條件。在0. 1°/。FBS中培養20小時的A431細胞的EGF 處理產生了由三個不同的依次相組成的時間依賴性響應(i)信號增加的正
相(P-DMR)(圖6A的點C到D) ， (ii)淨零相(點D到E)，和(iii)具
152有下降信號的衰變相(N-DMR)(點E到F)。然而，與休眠A431細胞相比， 用0. 1%FBS處理僅4小時的A431細胞產生類似響應，但動力學改變，幅度小 得多。相反的，增殖性A431細胞(用10%FBS培養)僅產生響應EGF刺激的P-DMR 事件。此外，休眠或增殖性中國倉鼠卵巢(CH0)細胞都未觀察到顯著響應， 與CHO細胞不內源性表達EGFR的事實一致(E. Livneh， R. Prywes， 0. Kashle, N. Reiss， I. Sasson， Y. Mory, A. Ullrich, and J. Schlessinger， "Reconstitution of human epidermal growth factor receptors and its deletion mutants in cultured hamster cells, ，， , "/o丄 C6e瓜 1986， 261, 12490 - 12497)。這些結果提示EGF-誘導的腿R信號依賴於EGFR。
圖39總結了這三種類型細胞的P-DMR和N-DMR。結果顯示，當CH0細胞與 EGF孵育時，沒有清楚的P-DMR或B-DMR信號，與CH0細胞不表達EGFR的事實 一致。相反，對於休眠A431細胞，用EGF刺激誘導的P-D服和N-DMR信號分 別是3.08和2.34。然而，未飢餓(即增殖性)A431細胞產生小得多的P-D服 信號，沒有明顯N-DMR。這些結果確認了血清生長培養基影響EGFR細胞表面表 達水平這一事實；由於血清含有EGF和許多其它生長因子，較高血清培養基得 到較低細胞表面EGFR表達。
(3)測定配體對RTK的能力的方法
如圖7所示，用不同濃度的EGF刺激都導致類似的響應(圖7A);然而， 三種限定響應的主要參數顯示明顯傾向於所用的EGF濃度。EGF濃度越高，(i) P-DMR和N-DMR信號的幅度越大，(i i) P-DMR和N-DMR事件越快，禾卩(i ii ) 從P-DMR到N-D服事件的過渡時間t越短。P-DMR事件涉及細胞功能相關和其 它影響。可能的影響包括但不限於由於處理引起的細胞扁平、細胞膜內陷、胞 內成分募集和細胞骨架重建，和EGF結合(程度較小)。非細胞功能相關事件 (包括細胞培養基和化合物溶液的溶液擴散和溫度差異)也可能影響分析。因 此，我們觀察到總P-D服幅度與EGF濃度的複雜關係。當P-DMR事件的幅度顯 示與EGF濃度有複雜關係時，N-D服信號的幅度清楚的對EGF濃度飽和，得到 約1. 45nM的EC5。(圖7B)。發現過渡時間t (秒)跟隨EGF的遞增濃度C指 數下降(圖7C):
t (C) =946*e—° 144t+1130
另外，N-DMR信號的衰變可與非線性回歸擬合。獲得的一相衰變常數K也是可飽和的，得到Kd5. 76nM (圖7D)。結果表明(i) EGF誘導的DMR信號依賴 於EGFR活化；(ii)可用光學生物傳感器基於配體誘導的物質再分布信號測 定配體能力。
(4)篩選在不同階段影響RTK信號傳導的調節物的方法
圖40顯示用不同化合物預處理對飢餓的A431細胞層8nM EGF誘導的信號 傳導的時間依賴性響應的影響。圖41總結了不同情況下結合和DMR信號的淨 變化。結果顯示，細胞可通透的發動蛋白抑制肽(DIP) (Burke, P.,等，
"Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking" ， Mol. Biol. Cell. 2001, 12:1897 - 1910)完全封閉N-D服信號，但以慢得多的動力學使P-麗R信號輕 微增加。DIP是一種GTPase發動蛋白的細胞可通透抑制劑，競爭性抑制發動蛋 白與突觸特異性蛋白質(amphiphysin)的結合，防止胞內吞(Burke， P.,等，
"Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking" ， Mol. Biol. Cell. 2001, 12: 1897 - 1910)。這些觀察結果提示，N-醒R信號涉及受體移位及其相關細胞形 態學改變，因為EGF-誘導的EGFR內化主要是通過發動蛋白依賴性途徑發生的， 並涉及細胞骨架重排，而發動蛋白與活化EGFR的偶聯影響EGF結合親和力。 DIP存在下，總P-DMR信號比不存在DIP時高50%，提示在P-DMR期間(圖6A 的C到D)，有一些活化的EGFR已被內化。已知EGF結合的受體由於迅速內化， 37'C下僅在細胞表面停留較短時間(約3分鐘)。此外，估計在運輸過程中， 形成的各48. 7%包被的(coated)和96. 2%的光滑小窩(smooth pit)的EE循 環回到細胞表面，即通過披有網格蛋白的小窩使受體內化足夠引起大部分內 吞。因此，通過包被的小窩EE小泡進行受體內化是受體在細胞內聚集的主要 機制，當配體存在於系統中時，情況尤其如此。
用渥曼青黴素預處理飢餓的A431細胞對P-DMR和N-DMR信號及其動力學 沒有任何明顯影響。渥曼青黴素是磷酯醯肌醇3-激酶(PI 3-激酶)的一種強 選擇性細胞可通透的不可逆抑制劑，其ICs。是2-4nM(Powis，等，"Wortmannin， a potent and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase"，
(1994) Cancer Res. 54 2419)。這提示PLC-y^徑的封閉不影響細胞響應 EGF刺激的兩種事件。
154用生長激素(GH) 、 PD98059和PP1預處理飢餓的A431細胞(也見圖43) 不顯著降低結合和DMR信號，但也導致P-DMR和N-DMR事件的動力學下降。 PD98059是特異性的有絲分裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK)，通過與 MEK的無活性形式結合起作用，因此防止它被cRAF或MEK激酶磷酸化(IC5。=2-7 yM) (Alessi, 等,'(PD 98059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo"， November 17， 1995， J. Biol. Chem. ， Vol. 270, No. 46， pg. 27489—27494)。 用PD98059封閉MAPKK可能減少信號大小以及有EGFR和EGF結合的細胞響應 的持續時間。PP1是Src家族酪氨酸激酶的強抑制劑，抑制p561ck和p59fynT (IC5。分別為5和6nM)，也中度抑制p38、 CSK、 PDGF受體、RET衍生的癌蛋 白、c_Kit禾口 Bcr-Abl (Liu等，Structural basis for selective inhibition of Src family kinases by PP1" ， ( 1999) Chem. Biol. 6， 671)。表皮 生長因子(EGF)與其受體結合，導致網格蛋白重鏈在酪氨酸1477處(位於控 制網格蛋白裝配的結構域中)快速磷酸化。EGF介導網格蛋白磷酸化，隨後網 格蛋白重分布到細胞周質，是EGF受體(EGFR)信號傳導下遊活化SRC激酶的 產物。在缺乏SRC激酶的細胞、或用特異性SRC家族激酶抑制劑處理過的細胞 中，網格蛋白磷酸化和再分布的EGF刺激沒有發生，EGF胞內吞延遲。這都和 目前的觀察一致。
生長激素(GH)是四螺旋束蛋白，它和許多類激素和細胞因子具有結構相 似性，包括促乳素和各種白介素以及集落刺激因子(Huang， Y.，等，"Growth hormone—induced phosphorylation of epidermal growth factor (EGF) rec印tor in 3T3-F442A cells", J. Biol. Chem. 278， 18902-18913) 。 GH 通過與GH受體(GHR)(—種細胞因子受體超家族的細胞表面糖蛋白成員)相 互作用，發揮其複雜的體細胞和代謝調節作用。近來的研究提示，在GHR和EGFR 家族成員之間有交集，信號傳遞受體似乎全異類型的例子(分別是細胞因子受 體和酪氨酸激酶受體家族)。GH導致表皮生長因子受體(EGFR; ErbB-1)及其 家族成員ErbB-2磷酸化。顯示GH-誘導的EGFR酪氨酸磷酸化需要JAK2，但不 是EGFR的激酶活性。GH導致基底水平和EGF-誘導的ErbB-2酪氨酸激酶活化 和酪氨酸磷酸化的減少，提示GH導致ErbB2的ERK途徑依賴性磷酸化，從而 使其對響應EGF的活化去敏化。螢光顯微鏡研究表明，EGFR-氰基螢光蛋白嵌 合體的EGF-誘導的胞內再分布由於GH共處理顯著減少。這也與目前的觀察結果一致 (Huang, Y.， 等,"Growth hormone-induced phosphorylation of epidermal growth factor ( EGF)receptor in 3T3—F442A cells" , J". Biol.Chem. 278， 18902-18913)。
(5) AG1478對休眠A431細胞中EGF-誘導的響應的劑量依賴性抑制
圖42顯示了 AG1478誘導的對休眠A431細胞中EGF-誘導的響應的劑量依 賴型抑制。為了確認這些DMR事件依賴於受體磷酸化，使用強的特異性EGFR 激酶抑制劑一一酪氨酸磷酸化抑制劑AG147S。 A431在不含任何FBS的培養基 中預先飢餓20小時，與在0. 1%FBS培養基中飢餓相同時間的細胞相比，P-DMR 事件的動力學顯著加快，過渡時間更短(圖42A)。用不同濃度的AG1479預處 理A431細胞1小時，導致對EGF-誘導的響應的劑量依賴型抑制，用N-DMR信 號的幅度對AG1478作圖，得到ICs。為約194nM的典型抑制曲線(圖42a和b)。 然而，用0. 5%二甲亞碸預處理A431對EGF誘導的響應影響很小(數據未顯示)。 這些數據表明，EGFR激酶磷酸化是EGF-誘導的DMR改變所需的；用光學生物 傳感器獲得的D服信號可用於測定在所測定的簡R事件起到重要作用的調節劑 的能力。
(6) Ras/MAPK途徑調節劑對休眠A431細胞中32nM EGF-誘導的響應的影
響
EGF調節細胞增殖和分化，用(至少部分)有絲分裂原活化的蛋白激酶作 為下遊信號。另外，ERK活化似乎代表EGFR活化下遊的全局負信號，這對於去 粘附是重要的。因此，檢測了靶向Ras-MAPK途徑的抑制劑，包括MEK抑制劑 U0126、 p38 MAPK抑制劑SB203580和SB20219和JNK抑制劑SP600125的作用 (見圖44) 。 U0126顯著抑制P-DMR和N-DMR信號的幅度，延遲時間為t 。這 提示MEK1/2抑制妨礙了導致N-DMR信號的細胞脫離和運動，與先前研究一致。 然而，當MEKl/2抑制時，活化EGFR的胞內吞還會發生。由於胞內吞與細胞脫 離和運動相比，遠離傳感器表面，胞內吞應對整體響應的影響小得多。因此， 用MEKl/2抑制劑預處理的休眠A431的EGF誘導的響應與受體胞內吞一致。這 還得到響應動力學的支持，它與計算機建模的結果一致。相反，SB203580和 SB20219都僅導致部分弱化，而SP600125幾乎對EGF-誘導的反應沒有影響。 這些結果表明，在休眠A431中，DMR響應的EGF刺激涉及Raf-MEK途徑，並通
1過MEK發展。
(7) 蛋白激酶抑制劑對休眠A431細胞用32nM EGF誘導的響應的影響
由於EGFR信號傳導涉及各種其它的蛋白質激酶，檢測了蛋白質激酶抑制 劑對EGF-誘導的響應的影響。用luM渥曼青黴素(強選擇性PI3K抑制劑)、 llxM KT5720 (強選擇性蛋白激酶A抑制劑)、10wM KT5823 (蛋白激酶G的 選擇性抑制劑)、和IOpM KN62 (CaM激酶II的選擇性抑制劑)預處理A431 對響應幾乎沒有影響。相反，用GF109203x (蛋白激酶C的選擇性抑制劑)顯 示部分弱化響應(圖45)。這些結果表明，是蛋白激酶C，而不是PI3K、蛋白 激酶A和CaM II改變了 EGF剌激DMR改變的能力。
(8) 細胞骨架調節劑對休眠A431細胞用32nM EGF誘導的響應的影響
由於在響應EGF刺激的細胞中靶標的運輸和形態改變需要細胞骨架結構的 重建，檢測了細胞骨架調節劑對EGF誘導的DMR響應的作用(見圖46)。用肌 動蛋白絲破壞劑(松胞菌素B或紅海海綿素A)，預處理A431，完全消除了 N-DMR 信號，並導致動力學顯著緩慢的延長的P-DMR階段。兩種毒素以不同機制擾亂 組裝和分解松胞菌素B捕獲肌動蛋白絲，並最終導致肌動蛋白絲分解，而紅 海海綿素A隔絕肌動蛋白單體，導致肌動蛋白絲分解。然而，穩定性聚合F-肌動蛋白劑鬼筆環肽或微管破壞劑長春新鹼和噻氨酯噠唑(數據未顯示)對於 EGF-誘導的響應幾乎沒有影響。這些結果確認，導致N-DMR信號的細胞運動並 不是由於先前存在的肌動蛋白的重組織，而是由於肌動蛋白聚合，不依賴於微 管裝配。相反，由於胞內蛋白的運輸需要肌動蛋白絲，P-DMR信號至少部分是 由於胞內成分募集到活化受體上引起的。額外證據來自細胞膜可通透性發動蛋 白抑制肽(DIPC)的作用。用50"M DIPC預處理A431導致用松胞菌素B和紅 海海綿素A預處理的細胞相似的響應，但動力學較快。
(9) 磷酸二酯酶抑制劑對休眠A431細胞用32nM EGF誘導的響應的影響
環AMP (cAMP)作為胞內第二信使的一個例子，調節無數細胞功能，例如 代謝、收縮性、運動性、和幾乎全部細胞類型中的轉錄。先前研究顯示，cAMP 途徑與依賴於細胞背景的生長因子刺激的MAP激酶活性有交集並弱化該活性。 由於磷酸二酯酶(PDE)調節細胞內的cAMP水平，用PDE抑制劑cilostamride、米利酮、Ro 20-1724、 R (-)-咯利普蘭和扎達維林(各10uM)研究PDE在 EGF-誘導的響應中的作用。這些抑制劑都對響應沒有明顯的作用(見圖47), 提示cAMP與總DMR響應無關。先前的研究顯示，蛋白激酶A可拮抗Raf-l活 性，因此通過調節PDE活性而調節Ras-MAPK。然而，在休眠細胞中，Raf-l顯 示組成型磷酸化，對PKA抑制劑不敏感，和我們的觀察結果一致，即PKA抑制 劑KT5720 (圖45)和PDE4抑制劑Ro 20-1724和R (-)-咯利普蘭對EGF-誘 導的DMR信號幾乎沒有影響。
(10) 室溫下(22'C) ， A431細胞中EGF誘導的EGFR內化，細胞形態學 改變，和定向物質再分布
在室溫下，用EGF刺激A431細胞觸發通過受體二聚化和隨後的自磷酸化 的EGFR活化，最終導致受體內吞(見圖48A-C)，折射形態改變(見圖48D)， 和定向物質再分布(見圖2A、圖18等)。通過用酸剝離法選擇性除去表面結 合的四甲基rhodimine標記的EGF (TMR-EGF),檢測了 EGFR內化的程度，並 發現依賴於細胞培養條件。在休眠細胞中比增殖細胞中發現高得多的細胞表面 和內化受體。固定後用德克薩斯紅-鬼筆環肽染色觀察休眠細胞EGF-誘導的形 態改變。先前研究顯示，37。C的A431顯示EGF處理後時間依賴性折射形態改 變，並從胞外基質上脫落。與這些研究一致，肌動蛋白重建在EGF處理後約15 分鐘開始改變，該改變在刺激延長時變得更劇烈，如細胞邊緣的纖絲肌動蛋白 的邊緣所示。
(11) 示範性作圖顯示EGF-誘導DMR信號的一種可能機制-受體內吞
肌動蛋白細胞骨骼在胞內吞中的可能作用。圖49的模型描述了皮質肌動 蛋白細胞骨架是如何參與內吞過程的不同步驟的，這些步驟涉及內吞界面和細 胞骨架組織的分子的可能功能。受體被其同源配體(例如EGF)活化後，在受 體內吞中有三個主要步驟(1)胞內機械的空間組織。細胞骨架結構可組織 或抑制內吞機械的側向運動。質膜的變形和內陷可由細胞骨架支持。2)可能 需要溶解質膜下的皮質肌動蛋白屏障。肌動蛋白聚合可提供在胞內小泡形成時 驅動膜分裂的力。和(3)肌動蛋白聚合可促進新形成的胞內小泡通過形成彗 星狀的尾部移動入胞質。5.實施例5篩選細胞骨架調節劑的方法
成孔試劑包括去汙劑(例如皂甙和菲律賓菌素)、或毒素(例如毛地黃皂 苷或鏈球菌溶血素0)。熟知用這些試劑處理細胞可導致在細胞表面膜中形成 孔；得到的通透的細胞可釋放一定量的胞內物質，主要是可溶性蛋白質。然而， 有許多生物物質仍然留在這些通透的細胞中，因為它們被細胞骨架結構直接結 合或聯合而阻止了。事實上，這些通透的細胞仍然具有活細胞的許多生物功能， 例如蛋白質合成。用能破壞細胞骨架結構的化合物處理細胞能導致這些通透的 細胞釋放顯著更多的生物物質。
細胞骨架是蛋白質纖絲的複雜和動態網絡，伸展在整個真核細胞的細胞質 內。細胞骨架與執行多種細胞內的活動有關。它通過對細胞提供張力強度維持 細胞形狀。它還能使一些細胞運動(使用例如鞭毛和纖毛等結構)，並在胞內 運輸(例如小泡和細胞器運動)和細胞分裂中起到重要作用。通過提供細胞能 移動細胞器、染色體和其它物質的"軌道"，細胞骨架參與胞內信號傳導和運 輸。
圖50提供了附著在LID傳感器表面的CHO細胞響應皂甙，作為時間函數 的劑量依賴型應答。在不同濃度下加入皂甙，明顯響應不同。在低濃度下，幾 乎沒有響應。當皂甙濃度高於約20ug/ml時，信號降低，然後響應增加。最 初增加的信號很可能是由於細胞在傳感器表面展平，導致傳感器的感應體積內 的質量增加；而下降的信號很可能反映了細胞喪失生物物質；另一種可能性是 由於細胞成分的重排和/或形態改變，導致傳感器感應體積內質量淨下降。在 測試的最高濃度，沒有最初增加的信號；相反，僅有具有比其它較低濃度要強 得多的響應的下降信號。
用較高濃度皂苷處理的細胞的通透性可用Texas紅-鬼筆環肽染色不同濃 度的皂苷處理後的CHO細胞，用螢光圖像驗證(數據未顯示)。Texas紅-X鬼 筆環肽是一種F-肌動蛋白的高親和探針，是用偶聯的蘑菇毒素製備的。用Texas 紅-鬼筆環肽染色需要細胞是可通透的，通常是在甲醛固定後進行的。這是由 於螢光鬼筆環肽偶聯物不能滲透入大部分活細胞，雖然未標記的鬼筆環肽能穿 透細胞膜。用高濃度皂苷處理後的細胞內的強螢光表明孔形成，以及細胞是通 透的。基於該研究，選擇67ng/ml濃度的皂苷用於化合物篩選。
圖51顯示了在用不同化合物預處理後，CHO細胞的皂苷誘導和時間依賴性 響應。結果顯示這些化合物可主要分成四類(i)導致生物物質喪失的化合
159物(例如松胞菌素B)，如N-DMR信號增加的動力學和幅度驗證的；(ii)對
皂苷誘導的響應沒有作用的化合物(例如發動蛋白抑制肽、布雷菲德菌素A)';
(iii)在皂苷處理的細胞中延遲生物物質喪失，但在較長時間後有相似總改 變的化合物(例如鬼筆環肽)；和(iv)阻止生物物質由於皂苷引起的喪失的 化合物(例如長春新鹼)。這些觀察結果與這些化合物的己知性質一致。松胞 菌素B捕獲肌動蛋白絲，防止裝配，並由於肌動蛋白絲的動態性質，最終導致 肌動蛋白絲分解。相反，鬼筆環肽與F-肌動蛋白結合，促進肌動蛋白聚合。長 春新鹼通過與微管蛋白結合抑制微管裝配，並誘導螺旋聚集物的自我結合。發 動蛋白抑制肽(DIPC)和布雷菲德菌素A不和肌動蛋白或其它纖絲結合。這些 結果也提示肌動蛋白絲，而不是其它纖絲提供了大部分生物大分子螯合位點。
皂苷處理後，用德克薩斯紅-鬼筆環肽染色揭示，松胞菌素B預處理的細 胞和用其它化合物預處理的細胞相比，有相似的染色模式(數據未顯示)。這 可能是由於可得的螢光解析度有限。然而，鬼筆環肽預處理的細胞的染色顯著 更低。這是由於未標記的鬼筆環肽阻礙標記的鬼筆環肽對F-肌動蛋白的染色。
6.實施例6:用無標記光學生物傳感器進行G蛋白偶聯受體(GPCR)細胞
試驗的系統和方法
圖52-60以多幅圖表顯示了用來證明光學LID系統可用於監測活細胞內物 質再分布(例如CPCR移位)的數項不同實驗的結果。如本文所述，可在一光 學LID生物傳感器表面上對這些移位進行定位。圖52-60中的數據是用一光學 波導光柵傳感系統和LID微板(恥205板)(Corning Incorporated製造)獲得 的。圖52顯示據光學LID系統1000監測，中國倉鼠卵巢細胞108 (CH01008) 中數種激動劑誘導的應答。已知，CH0細胞1008內源性表達3-腎上腺素能受 體、(x2-腎上腺素能受體、P2Y-受體以及e-抑制蛋白抑制蛋白和GRK。還已知， CH0細胞1008內毒蕈鹼受體內源性表達水平很低。本實驗中，在微板的每孔中 加入約5X1(^個CH0細胞1008，該微板上具有光學LID生物傳感器陣列1004。 然後，CHO細胞1008在150(il血清培養基中培養24小時以確保CH0細胞1008 粘附到基片表面1010上。該圖顯示CHO細胞對4種不同被檢化合物的光學反 應，所述4種被檢化合物是(1) ATP (100pM) ， P2Y受體激動劑；(2)可 樂定(Clonidine) (10pM)，a2-腎上腺素能受體激動劑；(3)腎上腺素(100pM)， P-腎上腺素能受體激動劑；和(4)氧化震顫素(oxotremorine)(10|iM)，
160毒蕈鹼受體激動劑。由於毒蕈鹼受體在CH0細胞1008內的內源性表達水平很 低，氧化震顫素M (毒蕈鹼受體激動劑)被作為對照。各激動劑直接加入含 有不同的含有血清培養基的孔中。然後用光學LID系統採集光學反應信息。
結果，根據加入ATP、可樂定和腎上腺素這三種激動劑後的光學反應顯示， 這些貼壁CH0細胞表現出相似的動力學特徵和轉變。圖53中，該過程後期的 動力學分析顯示三種激動劑(ATP、可樂定和腎上腺素)都導致一個類似、 緩慢的過程。圖54中顯示了由這些激動劑引起的圖16所示第3期(Stage 3) 的轉變。這些類似的轉變可能反應了這樣一個事實作為GPCR移位的關鍵組 分的抑制蛋白移位可能是CHO細胞者的限制性因素，因為網格蛋白包塗的 小窩的大小與抑制蛋白的相似。圖55所示是波導生物傳感器上CH0活細胞 單層的配體-和時間-依賴性反應的實驗結果。所用激動劑包括(1)可樂定； (2) 氧化震顫素M; (3) NECA;還用了太蘭澤平(telenz印ine)， 一種 Ml受體拮抗劑。
圖56所示是波導生物傳感器104上，穩定地過表達大鼠毒蕈鹼受體亞型1 (Ml)的CHO活細胞單層108的配體-和時間-依賴性反應的實驗結果。所用激 動劑包括(1)可樂定；(2)氧化震顫素M; (3) NECA;還用了太蘭澤 平(telenz印ine)， 一種M1受體拮抗劑。圖57顯示波導生物傳感器104上， 沒有(CHO)或過表達大鼠毒蕈鹼受體亞型1的CHO活細胞(Ml CHO)內配體 誘導的總變化。圖52和54-56所示的結果表明(1) CHO細胞和M1-CHO細 胞內都有a2-腎上腺素能受體表達；並且，它們的激動劑(可樂定)誘導了物 質再分布信號；(2) Ml受體表達在CHO細胞內很低或幾乎沒有，但在M1-CH0 細胞內很高，因為其激動劑(氧化震顫素M)在M1-CH0細胞內導致明顯更大 的反應，而其拮抗劑(太蘭澤平)則沒有。
圖58中的實驗結果顯示，發動蛋白磷酸化抑制劑(發動蛋白抑制肽，DIP) 預孵育對於氧化震顫素M誘導的波導生物傳感器上不表達或穩定過表達大鼠毒 蕈鹼受體亞型1 (Ml CHO)的CHO活細胞單層的時間依賴性響應的影響。結果 顯示，DIP預孵育在兩種細胞系中都幾乎完全消除了氧化震顫素M誘導的物質 再分布，提示氧化震顫素M誘導的物質再分布是發動蛋白依賴性的。大多數 激動劑誘導的GPCR移位都具有這樣的發動蛋白依賴性。
圖59中的實驗結果顯示，發動蛋白磷酸化抑制劑(發動蛋白抑制肽，DIP) 預孵育對於可樂定誘導的波導生物傳感器上不表達或穩定過表達大鼠毒蕈鹼受體亞型l (Ml CH0)的CHO活細胞單層的時間依賴性響應的影響。結果顯示， DIP預孵育在兩種細胞系中都幾乎完全消除了可樂定誘導的物質再分布，提示 可樂定誘導的物質再分布也是發動蛋白依賴性的。
圖60中的實驗結果顯示，發動蛋白磷酸化抑制劑(發動蛋白抑制肽，DIP) 預孵育對於NECA誘導的波導生物傳感器104上不表達或穩定過表達大鼠毒蕈 鹼受體亞型1 (Ml CHO)的CHO活細胞單層108的時間依賴性響應的影響。結 果顯示，DIP預孵育對NECA誘導的響應幾乎沒有影響，NECA在兩種細胞系中 通過非發動蛋白依賴性途徑誘導物質再分布信號。圖61顯示靜息A431細胞貼 層中GPCR激動劑誘導的定向物質再分布。與EGF (8nM)的誘導結果相比，三 種GPCR激動劑緩激肽(lOOnM)、卡巴唑(lOmM)和可樂定(ImM)在靜息 A431細胞中誘導時間依賴性響應。(F)以10mMAG1478預處理A431細胞對於 GPCR激動劑-和EGF-誘導的響應的影響。
圖62圖示了 EGF-誘導的EGFR激活和GPCR激動劑誘導的EGFR的轉活化。 己知，EGFR是多種信號傳遞系統中一個重要的下遊元素，所述信號傳遞系統包 括促有絲分裂G蛋白偶聯受體(GPCR)、細胞因子受體、整合素和膜去極化劑 和應力誘導劑所用的那些。此前的研究已證明，A431內源性表達緩激肽B2 (Bradykinin B2)受體、毒蕈鹼受體和a2-腎上腺素能受體。用GPCR激動劑、 緩激肽、可樂定和卡巴可(carbachol)刺激靜息態的A431產生了兩條不同的 DMR曲線。卡巴可刺激和可樂定刺激所致反應與低濃度(2-8nM) EGF所致反應 的特徵幾乎相同。不出所料，用lO(iM AG1478預處理A431完全消除了 N-DMR 階段(phase)，並且顯著降低P-函R階段的動力學特徵。相反，緩激肽刺激 導致一個極快的P-DMR階段(100秒之內)和短得多的過渡時間t 。，用AG1478 預處理A431隻能部分削弱反應。與此前他人的研究結果一致的是，(i) GPCR 激動劑刺激能夠通過不同的機制與Ras-MAPK串話(crosstalk)，但這取決於 特定的細胞環境，(2) GPCR激動劑誘導的EGFR轉激活可利用產生的Ras/MAPK 激活特徵信號來檢測。由於GPCR激動劑引發的EGFR轉激活所引起的DMR信號 堪與EGF刺激引起的相比，這種轉激活可作為一種信號傳遞放大機制，由此可 以在其天然環境中研究GPCR信號傳遞和篩選內源性靶GPCR的激動劑和拮抗 劑。不同GPCR激動劑所致D服反應的不同動力學特徵表明，不同的GPCR可能 通過不同的機制轉激活Ras/MAPK通路，這可能依賴於受體所偶聯的G蛋白和 細胞環境。圖62顯示錶皮生長因子受體(EGFR)信號傳遞途徑。EGFR家族成員具有 胞質酪氨酸激酶結構域、單個跨膜結構域和一個參與配體結合和受體二聚化的 胞外域。配體與EGFR的結合導致受體與其它家族成員形成均二聚體或異二聚 體。每個二元受體複合物將通過聚集不同的含Src同源(SH2)效應蛋白引發 不同的信號傳遞途徑。二聚化的結果是自磷酸化啟動一系列下遊細胞信號傳遞 途徑。被激活的EGF-R 二聚體與鳥苷酸釋放因子S0S偶聯的銜接蛋白Grb結合。 Grb-SOS複合物能夠直接結合或通過She間接結合受體的磷酸酪氨酸位點。這 些蛋白質間的相互作用將SOS帶至Ras附近，使得Ras被激活。接著，ERK和 JNK信號傳遞途徑因此被激活，繼而激活諸如c-fos、 AP-1和Elk-1等促進基 因表達和細胞增殖的轉錄因子。EGF二表皮生長因子，EGFR二表皮生長因子受 體，Shc = src同源結構域共有序列，grb2二生長因子受體結合蛋白2， S0S二哺 乳動物"無七之子"(son of sevenless) ， Raf = Ras激活因子，MEK = MAP 激酶激酶，MAPK二促分裂原活化蛋白激酶，Pl3K二磷脂醯肌醇-3，激酶，PIP2 =磷脂醯肌醇3,4-二磷酸酯，PIP3^磷脂醯肌醇3，4,5-三磷酸酯，PLCy^磷 酯酶-Y， DAG二二醯基甘油，IP3二肌醇3，4，5-三磷酸酯，PKC二蛋白激酶C。圖 61顯示GPCR誘導的EGFR轉激活。Src家族激酶被GPCR激發的受體酪氨酸激 酶轉激活作用所激活。最易理解的GPCR與受體酪氨酸激酶之間串話的機制包 括繼膜相關AD細家族MMP被激活後，GPCR激發蛋白質水解而釋放諸如HB-EGF 等配體。被轉激活的EGF受體(EGFR1/2)聚集She和Grb2/mSos複合物，令 它們成為GRCR誘導的Ras活化複合物的組裝平臺。EGF受體的轉激活可解釋許 多系統中GPCR引發的cRaf-1、 MEK1/2、 ERK1/2 MAP激酶級聯活化。Src家族 激酶應EGF受體活化而被激活，在此種形式GPCR信號傳遞的下遊起著重要作 用。此外，有證據表明，Src參與不甚了解的GPCR激發的畫P活化，尤其是 GPY亞基依賴途徑。
7.實施例7:多模式檢測方法
光柵耦合器生物傳感器是攸逝波傳感器，是基於通過衍射光柵將光與波導 共振耦合(參考本文關於不同生物傳感器的論述)。例如，作為生物傳感器的 光柵耦合器傳感器通常由導向多層組合和衍射光柵構成。通常， 一四層波導生 物傳感器的組成包括高折射率(/7》材料(例如折射率約2. 36的他205)薄膜， 薄膜厚度為dF，該薄膜之下是折射率(仏)低於薄膜但高於覆蓋介質的基底(例
163如1737玻璃，Corning編號，折射率約1. 50)，覆蓋介質是折射率約為1.35 (&)的生物溶液。優選透明基底，以便使入射光可從基底一側進入。 一層生 物物質粘附層，固定化在波導膜上，折射率約1.4 (仏)，厚度為dA。固定化 的生物物質包括但不限於抗體、抗原、受體、肽、噬菌體、"單鏈"DNA (RNA) -片斷、基因、基因片斷、靶、蛋白質、結合蛋白、酶、抑制劑、核酸、核苷 酸、寡核苷酸、變應原、病原、糖、代謝物、激素、活性成分、低分子量分子、 脂質、信號、細胞和細菌。
平面波導中的導波或導向模式是TE (橫向電場或s-極化波)和TMm (橫 向磁場或p-極化波)，其中，m=0、 1、 2……，表示模式編號。雷射從不同角 度照射波導，光只在特定角度與波導耦合，這些角度決定於導向模式的有效折 射率。被耦合的雷射平行于波導膜平面的表面傳播，在與界面相鄰的液體中產 生電磁場。只有在滿足兩項條件時，給定模式類型才以導波的形式傳播(a) 波導膜的折射率必須比其周圍的基底和覆蓋介質的折射率高至少1%; (2)波 導膜的厚度大於一既定值，即閾值厚度dc。
波導光柵生物傳感器由至少一個波導光柵結構單元或至少一個傳感器位 置構成。生物傳感器可與一微板相連，板上各孔內含有至少一個波導光柵結構。
在此揭示的方法中，樣品中的分析物或被標記或未被標記。當分析物被標 記時，可以各種方式標記，例如使分析物帶上能夠因光(具有寬和/或窄的激 發光譜)激發或化學/電化學激活而發螢光、化學發光、生物發光、發磷光或 電光的部分。當分析物本身未被標記，用被標記的結合伴侶作為參比配體，所 述結合伴侶能夠以適當的親和力結合固定化探針分子的特異性結合位點。參比 配體用來測定分析物對探針分子的相對活性或親和力。
非標記依賴性檢測分析物和/或參比配體與光柵區域內固定化探針分子結 合的方法是基於折射率改變造成的反射光波長或角度變化(參考US4815843或 US5479260)。標記依賴性檢測參比配體與探針分子結合或分析物和參比配體 與探針分子競爭性結合的方法是基於顏色的變化(例如螢光、化學發光、生物 發光、發磷光或電光等)。
可採用兩種不同的示例性方法實現標記依賴性檢測。方法之一中，用波導 光柵基片在波導膜內傳播光，同時產生透過固定化探針分子所在側的攸逝波。 透過的攸逝波以不同效率激發被標記的分析物或被標記的參比配體，所述效率 取決於被標記分子與波導膜表面之間的距離。被標記分子距離所述表面越近，激發效率越高。特別是，攸逝場激發提高了整個平面波導表面上表面-結合熒 光團的激發機率/效率(Budach, W. : Abel, A. P. ; Bruno, A. E. ; Neuschafer， D.;"平面波導-用於多點寡核苷酸雜交螢光試驗的高效傳感平臺"，Anal. Chem. 1999， 71 (16) : 3347-3345;和P丄；Lee, J. E. ; Wood, L. L. ; Saavedra, S. S.，"波導線性二向色性和螢光各向異性引起的Langmuir-Blodgett膜內 的二極分布"，J. Phys. Chem. ， 1996， 100:775-784)。這與基於聚焦顯微 鏡的發光檢測原理相反，後者中，光源聚焦於具有一定體量的元件，由此產生 局部強電場(即落射螢光)。這樣，波導光柵結構成為兩種檢測中的核心部件 基於傳感器表面特定分子吸附所致攸逝場傳播介質中折射率變化的非標記依 賴性檢測和基於顏色變化(強度、強度分布、內部反射螢光總強度等)的標記 依賴性檢測，它們具有超高靈敏度，因為攸逝波隨著靶標或靶標複合物(不論 標記與否)距離的增加指數性衰減。
這種方法，在以基於螢光的檢測為目的時，要求將傳感器特別設計為在將 光與波導耦合的同時激發螢光團。具有獨特結構(例如光柵結構、周期、深度、 波導膜的性能和厚度、傳感器構造等)的給定傳感器往往使特定波長的雷射以 近乎垂直角耦合進入傳感器。這種垂直耦合對於細胞傳感來說尤其適宜，因為 細胞被介質所覆蓋，而大多數涉及液體處理的設備都希望液體改變的角度是垂 直的。然而，有待激發的螢光分子通常需要具有特定波長範圍的特定光源。例 如，Cy3要求激發光在530-560nm波長範圍。為了用同一光源檢測DMR信號和
螢光，需將傳感器調整為能夠將同一光源與波導耦合。這樣，傳播光的攸逝波 就能夠被用來激發穿透深度或傳感體積以內的螢光分子。
第二種方法採用單獨的激發光源來專門激發已結合的被標記分析物或參
比配體，用一單獨的發射檢測裝置來採集發射光。該方法對于波導傳感器設計 的要求相對寬鬆，適用於多種不同的傳感器設計。
8.實施例8:內源性GPCR在A431細胞內的特徵分析
細胞組分的動態再分布，即動態物質再分布(DMR)，常見於許多細胞過 程中，例如刺激引起的通過G蛋白偶聯受體(GPCR)進行的信號傳遞。DMR可 用共振波導光柵(RWG)生物傳感器來放大，所得DMR信號提供了一種新的已 整合的信息以用於感測實際生理環境中的活細胞。用RWG生物傳感器和一組 GPCR激動劑激活內源GPCR，通過研究由此介導的靜息A431細胞的D服信號確定了各類GPCR (基於受體偶聯的G蛋白Gq， Gs和Gi)的獨特DMR特徵。DMR 信號取決於激動劑的劑量和內源受體的表達水平。就一小組GPCR激動劑觀測 到這種由一種DMR信號到另一種的劑量依賴性轉變。結合其製作GPCR信號傳 遞網絡相互作用和調節圖譜的能力，無標記和非侵入性生物傳感器能夠進行實 時動力學測定，因而可用於GPCR藥物開發和脫孤化。
G蛋白偶聯受體(GPCR)是一超家族膜蛋白，其成員蛋白具有相同的結構 基元，該基元具有七個跨膜結構域， 一個胞外N末端和一個胞內C末端。GPCR 被認為與諸如心血管病、呼吸、胃腸道、神經、精神和代謝紊亂等大多數疾病 的發展和演化有關。GPCR代表著人類基因組中最大的可藥靶(druggable target)家族，且已被證明是小分子藥物開發最具有前景的領域，因為GPCR 佔目前藥物靶的約50% ， 2000年的相關銷售額超過六百億美元。鑑於目前GPCR 類藥物只針對已知的約200種CPCR中的近25%，而且還有約140種新近鑑定 的孤立受體，因此，GPCR作為一類靶分子為藥物開發提供了廣泛的機會。
包括光、離子、神經遞質和激素在內的多種外源刺激通過GPCR調節細胞 的生理學和病理生理學過程。激動劑介導的GPCR活化引發與它們所偶聯的G 蛋白及其它調節蛋白的動態相互作用，由此控制胞內反應級聯。根據偶聯的G 蛋白亞型，可將GPCR分成三族G,， Gs和G,。通過GPCR介導的由配體誘導的 細胞事件通常由受體構象和寡聚狀態的改變開始，接著是G蛋白活化(Ga亞基 上的GDP-GTP轉換，Ga和G^解離，G蛋白從受體上解偶聯，Ga-和Gp廠信號傳遞 複合物的生成)以及導致第二信使生成的下遊信號傳遞途徑活化(Ga2+激活， 肌醇三磷酸的生成和/或胞內cAMP水平調節)。然後，GPCR信號傳遞引起特定 基因的表達，並通過內吞作用使細胞表面上的GPCR失敏；其中許多涉及到大 量胞內蛋白質的動態轉運。最終，靶細胞的表型、形態和物理特徵被改變。這 些信號傳遞和調節機制通常行使著及時而準確的控制，由此控制著各種細胞反 應。結果，所有GPCR信號傳遞在這一點上幾乎都是相同的，即在信號傳遞 周期中，細胞成分發生了有序且受到調節的動態再分布。監測細胞成分的動態 再分布就能夠看清楚GPCR信號傳遞過程，並且是進行GPCR篩選的高效手段。
a)材料與方法 (1)材料
月泉昔胺類(Adenosine amine cogener， ADAC)， 大麻素(anadamide)ATP，白介素-8 (IL-8)，幹擾素-r可誘導蛋白-10 (IP-10)，油醯-L-a-溶 血磷脂酸(LPA) ， NECA，諾考達唑(Nocodazole)，凝血酶，胰蛋白酶和UK14304 購自Sigma Chemical Co. (St. Louis, M0) 。 A-77636， BRL54443，可樂定， 腎上腺素，HTMT馬來酸氫酯(HTMT dimaleate) ， Isoprenternol，氧化震顫 素M，羥甲唑啉(Oxymetazol ine )禾口 SKF38392購自Molecular Probes (Eugene, OR)。血管緊張素II， Apelin 1-17， Apelin 1-13，鈴蟾月太(Bombesin)，緩 激肽(bradykinin) ， DAMG0,強啡肽A，內皮素-1，甘丙肽(Galanin) ， GLIGKV-醯胺，GLIGLR-醯胺，胰高血糖素，oc-黑色素細胞刺激因子(oc-MSH)，莫替林， 神經激肽A，神經介肽N，神經肽Y，神經降壓素，孤菲肽(nocic印tin)， SFFLR-醯胺，物質P,尾加壓素II和YFLLNRP-醯胺得自Bachem(King of Prussia, PA)。 Corning Epic 96孔和384孔生物傳感器微板得自Corning Inc (Corning, NY)，使用前用高強度UV消毒(UVO-清洗機，Jelight Company Inc. ， Laguna Hills, CA) 6分鐘。
將人表皮癌A431細胞(美國典型培養物保藏中心)培養在含10%胎牛血 清(FBS) 、 4. 5g/L葡萄糖、2mM谷胺醯胺和抗生素的Dulbecco改進Eagle' s 培養基(DMEM)中。將第3至第5代的細胞(約3-7.5Xl(/細胞)在200^1含 10%FBS的DMEM培養基中形成的懸液加入96孔微板的各孔中。類似地，將50jil 生長培養基中 1一2X1(T個細胞加到384孔微板中。37°C、空氣/5%0)2條件 下培養，直至覆蓋率達約95% (約2-4天)。
(2) Fluo-3 Ca2+激活試驗
將第3至第5代A431細胞在Costar 96孔微板上培養至覆蓋率約95% ， 洗滌兩次，純用DMEM餓養過夜，用含2.5mM丙磺舒(probenicid)的1XHBSS (1倍常規Hank平衡鹽溶液，20mM HEPES緩衝液，pH7. 0)洗滌，在含有4|iM Fluo-3的同一緩衝液中室溫下標記l小時。然後，用緩衝液洗滌細胞兩次，將 細胞維持在含有2. 5mM丙磺舒的100(il 1XHBSS中。向細胞平板添加100(^1 GPCR 激動劑溶液，從而開始檢測，用HTS7000 BioAssay Reader (PerkinElmer Life Science, Boston, MA)記錄6分鐘的鈣信號，每隔6秒記錄一次。試驗在室 溫下進行，以便直接與光學傳感數據進行比較。
(3) 動態物質再分布(DMR)光學生物傳感器試驗
167各項研究均採用配備有橫向磁場或p-極化TM。模式的Corning Epic 角 度訊問系統。增加了數步操作來儘可能減少非期望結果。首先，為了儘可能消 除加入化合物溶液時的整體折射率改變，用不含丙磺舒的1XHBSS緩衝液稀釋 化合物，但餓養細胞時佔用DMEM緩衝液。第二，當在室溫下將含有細胞的傳 感器培養板放入系統時，為了促進細胞響應並迅速達到穩定狀態，先用不含FBS 的DMEM緩衝液將細胞餓養一段時間(通常20土2小時)，並且，不洗滌細胞， 直接將靜息態細胞用於試驗。第三，儘可能將各化合物溶液中DMS0的濃度降 低到低於0. 05%，但在指定試驗中可使用較高濃度DMSO。
在動力學特徵測定中，37°C、空氣/5%0)2條件下純用DMEM餓養培養的細 胞(覆蓋率約95%) 20小時。然後，將含有細胞的傳感器微板放入光學系統， 記錄室溫下加入溶液之前和之後的細胞響應。在化合物研究中，各孔中的細胞 先用50^1的化合物溶液或1XHBSS預處理直至其達到穩定的狀態(即沒有明 顯的物質再分布，通常在l小時之內)，然後才添加50|al的GPCR激動劑。全 部研究在室溫下進行，微板上始終加蓋，僅在添加溶液時短時(數秒)打開， 這是為了儘可能減少溫度波動和蒸發冷卻。本文所述響應單位指據CCD相機 成像，各傳感器共振帶中心位以像素計的變化；據採用甘油和二甲亞碸的濃度 依賴性響應曲線的一實驗標定方法，1個單位等於飛.82X10—4折射率變化。應 理解，根據操作參數和試驗的需要，也可以確定其它單位。
b)結果與討論 (1) A431細胞的內源性GPCR和它們的信號傳遞
用A431細胞作為模型系統研究配體誘導的三種主要GPCR (Gq、 Gs和Gi 偶聯受體)在實際生理條件下的光學特徵。該方法主要以A431中已知的內源 受體為基礎，並結合了用許多其它不同類型GPCR的己知激動劑小文庫進行的 隨機篩選。某特定GPCR很可能能夠通過一種以上受體偶聯的G蛋白進行信號 轉換，甚至通過其它非G蛋白信號傳遞途徑轉換。
A431細胞中的己知內源性GPCR包括緩激肽B2受體，|32腎上腺素能受體， 腺苷受體A:、 A幼和A2B，組胺受體比，蛋白酶活化受體PA&和PAR2，嘌呤能受 體P2Y,、 P2Y4、 P2Y6、和P2Y ， LPA受體LPA!、 LPA2和LPA3，和鈴蟾肽受體BRS,。 其他人的RT-PCR研究顯示，A431內源性表達至少四個P2Y受體家族成員P2Y, (較低)、P2Y4、 P2Y6、和P2Yn，但也有研究提出也有P2Y2內源性表達。這些受體中，B2受體、P2Y受體、PAR受體、LPM和LPA3、以及BRS!是主 要的G「偶聯受體，A2A、 &8和&則是Gs-偶聯受體。對於A431中Hi受體的信號 傳遞途徑知之甚少。有趣的是，關於A431中內源性Gi-偶聯受體的文獻報導很 少。 一個例子是Ai受體。雖然已知LPAi主要通過Gi途徑傳遞信號，但沒有關於 A431中LPA,信號傳遞機制的文獻報導。
(2) A431中內源性GPCR活化的光學特徵
用一組激動劑分別刺激靜息A431細胞。記錄並分析劑量依賴性動力學響 應。在典型的動力學測定中，實時監測每個傳感器的激動劑誘導的共振光角位 移，並作為時間的函數製圖。信號(P-腿R)增強表示傳感體積( 120mn)內 生物分子量增加；相反，信號(P-腿R)減弱表示傳感體積( 120腦)內生物 分子量減少。傳感體積，即穿透深度，是波導膜內耦合光的固有特性，它產生 延伸進入細胞層和介質的攸逝波。
圖63顯示了 GPCR激動劑誘導的4種A431細胞光學響應。如圖63a所示， 第一種光學特徵展示兩個主要階段 一個信號迅速增強(圖63a，點A至B) 的P-DMR階段和此後一個信號緩慢衰減(圖63a，點B至C)的N-DMR階段。 產生這種光學特徵的激動劑包括B2受體激動劑緩激肽，P2Y受體激動劑ATP和 PAR激動劑凝血酶、胰蛋白酶、GLIGLR-醯胺、GLIGKV-醯胺和SFFLR-醯胺。用 Fluo-3進行的傳統Ca2+激活試驗顯示，根據細胞內Fluo-3螢光強度的改變， 所有這些激動劑都劑量依賴性地提高胞內Ca"水平。結合關於緩激肽介導的 A431響應的細胞機制的詳細分析，這些結果提示這種光學特徵是Gq-偶聯受 體活化的結果，該活化導致Ca2+的迅速激活以及下遊信號傳遞事件。
第二種光學特徵展示一個主要階段(圖63b) : P-DMR階段，其中，信號
緩慢增強至一高位平臺(63b:點B至點C)。許多時候會有一個初期階段，期 間，信號緩慢減弱並小幅振蕩，這在加入激動劑溶液之後(63b:點A至點B) 就出現。完成初期階段的時間通常比加入化合物溶液所誘導的長得多( 數 秒)。當加入化合物溶液時，化合物溶液與DMEM介質(如果存在)之間折射 率不匹配導致產生一個與整體折射率(bulk index)改變相關的快速階段。產 生這種光學特徵的激動劑包括^激動劑腎上腺素和Isoprenternol以及A^和 A2B激動劑NECA。傳統Ca2+激活試驗顯示，所有這些激動劑都不引起胞內Ca"水 平的明顯改變(數據未顯示)。另一方面，毛喉素和NKH447這兩種腺苷酸環化酶活化劑都產生與p2和A2激動劑所誘導的相似的光學特徵(圖64)。已知這 兩種化合物都能激活腺苷酸環化酶，提高胞內cAMP (Gs-偶聯受體信號傳遞中 的第二信使)的水平。用10j^M毛喉素或NKH447預處理靜息細胞完全消除了腎 上腺素介導的DMR響應(圖65)，這表明，這兩種化合物引起的細胞響應與所 述激動劑共享相同的下遊信號傳遞途徑。這些結果提示這種光學特徵是Gs-偶聯受體活化的結果，該活化引起胞內cAMP累積及下遊信號傳遞事件。
第三種光學特徵展示兩次連續的P-D服事件(圖63c): —個升至高水平 的快速P-DMR階段(圖63c: A點到B點)，和後一個信號升至另一個高位平 臺的P-D服階段(圖63c: B點到C點)。在靶向已知內源性GPCR的這些激動 劑中，只有LPA受體激動劑LPA當其劑量低於約500nM時產生這種光學特徵。 其它也引發這種響應的激動劑包括MC受體oc-MSH。可將這種光學特徵認為是Gi-偶聯受體活化的結果，因為，不出所料，它與Gs-偶聯受體的光學特徵相似。 Gi和Gs信號傳遞都會調節胞內cAMP水平，但調節方向相反。
第四種光學特徵沒有任何明顯的畫R信號(圖63d)，這與單用HBSS誘導 的相似。按照典型方法，每種激動劑在lnM至10,的五個劑量接受監測，並 且，至少進行兩次獨立實驗確保結果正確。這一類別的激動劑包括A-77636， SCH23390和SKF38392(DRD1)，大麻素(CNR1和CNR2)，血管緊張素II(AGTRl)， Apelin 1-17和Apelin 1-13(AGTRLl) ， BRL54443 (HTR1E/F)，可樂定和UK14304 (ADRA2A、 B和C) ， DAMGO和強啡肽A (0P固1禾卩0PRK1)，內皮素-1 (EDNRA 和EDNRB)，甘丙肽(GALR1和GALR2)，胰高血糖素(GCGR)，白介素-8 (CXCR1)， IP-IO (CXCR3)，莫替林(motilin) (MOTR) ， P物質(TACR1)，神經激肽 A (TACR2)，神經介肽N和神經降壓素(NTSE1)，神經肽Y (NPY1、 2、 4、 5、 6R)，孤菲肽(0PRL1)，羥甲唑啉(ADRA1A)和尾加壓素II (GRP14)。括號 內是這些肽所靶向的受體。這些激動劑沒有產生明顯的DMR信號表明，它們的 相應受體在A431細胞中無表達或低表達。IL-8剌激幾乎無DMR信號(數據未 顯示)提示內源性CXCR1在A431細胞內的表達水平比較低。另一種可能性 是，A431細胞的IL-8組成性分泌水平很低。
鈴蟾肽受體亞型l (BRSi)也曾被報導在A431細胞中內源性表達。Fluo-3 試驗顯示，鈴蟾肽引起20±5% (n=5，數據未顯示)的最大胞內Ca"水平提高， 這表明鈴蟾肽引發Gq信號傳遞。不出所料，用鈴蟾肽刺激靜息A431引起劑量 依賴性Gq型光學特徵(數據未顯示)，但振幅比緩激肽、ATP或任一種PAR激
170多。據測定，表觀ICs。約為lnM。鈴蟾肽誘導的小幅DMR信 號提示服S1在A431細胞內表達水平較低。
(3)測定激動劑激活A431中內源性GPCR的效力
接著，測定了產生明顯DMR信號的激動劑的效力。由於有時候A431中表 達一個以上亞族受體，並且，某個激動劑能夠以不同的效力激活多個亞族受體， 所以，先用激動劑溶液的5倍濃度系列來測定細胞響應。大多數情況下，再用 一個激動劑溶液兩倍濃度系列來準確測定激動劑的EC5。值。將DMR信號的振幅 繪製成與激動劑濃度相關的圖，並用Prism分析，計算ECs。。
圖66匯總了靶向內源性Gq-偶聯受體的各激動劑的劑量依賴性響應。由於 對與激動劑濃度相關的P-D服和N-DMR信號振幅分析獲得的ECs。幾乎相同，只 繪製了 P-DMR信號並就得出的激動劑效力進行了討論。所有飽和曲線與單結合 位點非線性回歸擬合良好，得到一個表觀ECs。。據測定，ATP、緩激肽和凝血酶 的表觀EC5。分別為2. 2±0. 6pM (n=3) ， 10. 0±1. 2nM (n=3)和9. 6±2. 0單位/ml (n=3)。作為比較，還用Ca2+通量試驗測定了這些激動劑的ECs。值(數據未顯 示)，發現與光學生物傳感器試驗所得的一致。已知胞外ATP是離子型P2X和 G蛋白偶聯P2Y受體的強激動劑。因為RWG生物傳感器對於細胞生物大分子而 非離子的再分布最敏感，並且，ATP-介導的光學特徵與緩激肽和PAR激動劑所 誘導的相似，所以推斷內源性P2Y主要導致ATP介導的鹿R信號。另一方面， 132而非Bi受體在A431中內源性表達，並且，B2受體導致緩激肽的大多數生理活 性和病理生理活性。凝血酶是PAR,的激動劑，SLIGLR-醯胺和SLIGKV-醯胺是 PAR廠特異性激動劑。然而，SFFLR-醯胺和胰蛋白酶似乎既可激活PARi又可激活 PAR2。
圖67匯總了激活內源性G「偶聯受體的激動劑的劑量依賴性響應。此處， 將緩慢增強的P-畫R信號的振幅作為激動劑函數的濃度作圖。NECA和腎上腺素 的表觀ECs。分別為2L5土1.2nM (n=3)和6. 0土1.4nM (n=3) 。 NECA是A2A、 A2B 和Ai受體的激動劑，與它們的親和力分別為20、 330和14nM。已有報導在數 個細胞系(包括A431)中，A和A2腺苷受體共存並對腺苷環化酶具有相反的作 用。在A431中，腺苷激發兩階段性響應低劑量(<~10|iM)通過八1受體抑制 集落形成，高劑量(至IOOjiM)通過A2受體逐漸逆轉這種抑制。這樣，這種雙 重效應為實現對信號傳遞途徑的互逆控制和微調提供了可能。由於NECA對A,
m和A2A的親和力相近，NECA誘導的光學特徵顯示Gs-信號傳遞佔優。用腺苷胺類 (ADAC)進一步區分效應，ADAC是一種腺苷受體選擇性激動劑，對A,、 A2A和 A3的親和力分別為0.85、 210和285nM。我們特別關注的是高劑量ADAC。結果 顯示，在高劑量(〉50nM) ， ADAC劑量依賴性地激發典型的Gs-型光學特徵，表 觀有效ECs。為3.7±1. lpM (n=3)。另一方面，由於A431內源性表達大量卩2受 體( 40， 000拷貝/細胞)，觀測到的腎上腺素誘導的DMR信號專一指向P2活化。 腎上腺素結合(32的ECs。為5-20nM。
圖68顯示a-MSH誘導的劑量依賴性響應。此處，繪製兩個P-D服活動與激 動劑濃度相關的圖。據測定，oc-MSH的表觀ECs。為9. 0土1.6nM (n=3)，與文獻 記載的一致。
我們系統地研究了大量不同GPCR的激動劑刺激靜息A431細胞產生的光學 特徵。激動劑的選擇一定程度上是以已知的A431內源性GPCR為基礎的。結果 顯示，所選激動劑介導的光學特徵可歸入三大類(見圖63a、 b和c)，此外， 還有與僅用載體(即冊SS)處理所得相似的第四種光學特徵(圖63d)。三種 不同的特徵被用於清楚地區分導致這些光學特徵產生的細胞信號傳遞機制。首 先，用傳統的第二信使試驗(Fluo-3試驗)將激動劑根據其引起Ca2+激活的能 力進行分類。第二，用兩種腺苷酸環化酶(AC)活化劑(毛喉素和NKH447)刺 激靜息態的A431細胞。研究GPCR激動劑介導的光學特徵與腺苷酸環化酶活化 劑介導的光學特徵之間的相似度，據此相似度指認Gs-介導的信號傳遞。第三， 對一組己知調節劑對於特定激動劑所誘導光學特徵的作用進行全面鑑定，從而 揭示其細胞機制和信號傳遞網絡相互作用。根據這些研究，確定了以下三類 GPCR信號傳遞的三大類光學特徵Gq-、 Gs-和Gi-信號傳遞。由於關於A431細 胞內源性G廣偶聯受體的信息很少，雖然HTMT誘導的劑量依賴性響應提供了有 力的支持，但Gr型光學特徵有待進一步確認。
除IL-8之外，所有靶向A431內已知GPCR的激動劑都產生了明顯的D服 響應。用RWG生物傳感器測定的它們的效力與Fluo-3試驗(如果可以進行或 有此文獻記錄)的結果一致，這提示MRCAT可用於準確測定激動劑的效力。
(4)激動劑介導的細胞響應的特徵轉變
CPCR信號傳遞是複雜的，取決於細胞狀態和環境、激動劑的選擇性和受體 的表達水平和類型。根據細胞狀態和環境，某特定GPCR的激活可能通過一種以上G蛋白引發細胞響應。例如，用緩激肽誘導的內源性緩激肽B2受體活化在 A431細胞內通過G,-和Gs-兩種途徑介導細胞信號傳遞；這兩種信號傳遞途徑交 互調節。本發明發現，通過B2受體介導的信號傳遞既依賴於A431細胞的狀態， 又依賴於緩激肽的劑量。在增殖狀態下，低劑量(〈100nM)緩激肽優先引發Gs-介導的信號傳遞，高劑量(〉100nM)則優先引發Gq-信號傳遞。另一方面，用 於刺激靜息A431細胞(用0. 1%FBS處理約20小時)時，0. 5nM至約100nM的 緩激肽既介導Gs-途徑又介導Gq-途徑。相反，完全靜息的A431細胞(用不含 任何FBS或其它生長因子的DMEM培養基處理約20小時)對各種劑量的緩激肽 都有響應，且都以G,-信號傳遞為主(數據未顯示)。
可確定，包括LPA和HTMT在內的某些激動劑引發的D服信號具有較為復 雜的劑量依賴性。圖69顯示LPA誘導的劑量依賴性響應。在低劑量LPA，完全 靜息的A431細胞對LPA刺激的響應為典型的G「型光學特徵，並在高劑量LPA 逐漸轉變為Gq-型光學特徵。 一種可能是，LPA在低劑量優先激活產生Gr型光 學特徵的LPAi受體。隨著LPA濃度升高，內源性LPA2和LPA3受體被激活，於是 發生Gq-介導的信號傳遞。
圖70顯示HTMT誘導的劑量依賴性光學特徵。HTMT是HjB &受體的激動 劑。在低劑量(〈 40nM) ， HTMT劑量依賴性地產生典型的Gi-型光學特徵(圖 70b)。隨著HTMT濃度升高至80nM， D服相關光學特徵減弱並變得幾乎穩定(即 沒有明顯的DMR) 。 HTMT濃度進一步升高使特徵轉變成了典型的Gs-型光學特 徵(圖70b)。將作為HTMT濃度的函數的P-D腿信號振幅作圖，該圖清楚地顯 示了這一轉變(圖73c)。由於Gs-信號傳遞導致胞內cAMP累積，而Gr信號測 定引起相反的效果，可以想見，HTMT可能通過不同的受體以不同的效力激活 G,-和Gi-兩種信號傳遞。至少，就RWG生物傳感器監測到的動態物質再分布而 言，Gs-和Gi-信號傳遞之間的微妙平衡決定了最終的細胞響應。
9.實施例9:探測不同靶之間的交叉通話
不同的耙之間常會發生交叉通話，這在亞族成員靶之間更為常見。例如，
EGFR可由某些GPCR激動劑轉激活。而且， 一個靶(例如GPCR)的活化劑可以 激活另一密切相關的靶。
蛋白酶激活受體(PAR)包含一新的G蛋白偶聯受體(GPCR)家族，該基 組迄今為止包括PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4。 PAR採用一種獨特的蛋白水解機制來活化，而非通過可逆的配體結合來激活。凝血酶和胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶以位點特異性方式剪切受體的胞外N末端外結構域(exodomain)。在人類中，PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4的活化剪切位點分別是殘基41-42 (R丄SFLLRN)，36-37 (R丄SLIGKV) ， 38-39 (K丄TFRGAP)和47—48 (R化YPGQV)。剪切暴露出一個新的N末端，然後由該末端作為限制(tethered)配體序列。該限制配體結構域與受體分子內結合併激活受體，由此引發信號傳遞。激活PAR的蛋白酶包括凝血因子(例如凝血酶，凝血因子VIIa和Xa)，炎性細胞的蛋白酶(肥大細胞胰蛋白酶(Tryptase)，中性粒細胞組織蛋白酶G)和表皮組織的酶(胰蛋白酶)。四種PAR中，三種(PAR1、 PAR3和PAR4)主由由凝血酶激活，PAR2則由胰蛋白酶樣蛋白酶(例如肥大細胞胰蛋白酶和凝血因子Xa)激活。對應於限制配體序列前5個或前6個胺基酸的合成肽(PAR活化的肽或PAR-AP)可直接激活除PAR3之外的PAR。由於這些合成肽的受體激動劑功能不涉及蛋白水解，PAR-AP可用於研究PAR的生理學和病理生理學功能。
PAR存在於大量正常和患病組織和細胞中，包括皮膚、血小板、內皮細胞、胃腸道、腦和肺。大多數細胞表達多種PAR。例如， 一個例子是A431細胞，該細胞內源性表達PAR1和PAR2。然而，對於A431細胞內的PAR信號傳遞途徑卻知之甚少，雖然表皮癌細胞表達可能是潛在PAR活化劑的包括人呼吸道(airway)胰蛋白酶樣蛋白酶在內的多種絲氨酸蛋白酶。
a)材料與方法(1)試劑
凝血酶、胰蛋白酶、紅海海綿素A、松胞菌素B、鬼筆環肽(phalloidin)、諾考達唑(nocodazole)、甲基-(3-環糊精(m卩CD) 、 oc-環糊精(aCD) 、 N-苯甲醯基-L-精氨酸乙酯(BAEE)和表皮生長因子(EGF)購自Sigma ChemicalCo. (St. Louis, MO) 。 KN-62和GF 109203x得自Tocris Chemical Co. (St.Louis， MO) 。 Fluo-3和德克薩斯紅(Texas red)-鬼筆環肽(TR-鬼筆環肽)得自Molecular Probes (Eugene, OR) 。 SFFLR-醯胺、GLIGKV-醯胺、GLIGLR-醯胺、緩激肽和YFLLNRP-醯胺得自Bachem (King of Prussia, PA) 。 Corning Epic 96孔生物傳感器微板得自Corning Inc (Corning, NY)，使用前用高強度UV消毒(UVO-清洗機，Jelight Company Inc., Laguna Hills, CA) 6分鐘。(2) 細胞培養物
將人表皮癌細胞A431細胞(美國典型培養物保藏中心)培養在含有10%胎牛血清(FBS) 、 4.5g/L葡萄糖、2mM谷胺醯胺和抗生素的DMEM培養基中。將第3至第5代的細胞(約3-7. 5X1(^細胞)在200^1含10%FBS的DMEM培養基中形成的懸液加入96孔微板的各孔中，37'C、空氣/5%(]02條件下培養，直至覆蓋率達約95% (約2-4天)。
(3) Fluo-3 Ca2+激活試驗
將第3至第5代A431細胞在Costar 96孔微板上培養至覆蓋率約95%，洗滌兩次，純用DMEM餓養過夜，用含2.5mM丙磺舒(probenicid)的1XHBSS(1倍常規Hank平衡鹽溶液，20mM HEPES緩衝液，pH7. 0)洗滌，在含有叫MFluo-3的同一緩衝液中室溫下標記1小時。然後，用緩衝液洗滌細胞兩次，將細胞維持在含有2. 5mM丙磺舒的lOOpl 1XHBSS中。通過向細胞培養板添加50^1 PAR激動劑從而開始了試驗，用HTS7000 BioAssay Reader (PerkinElmerLife Science, Boston, MA)記錄6分鐘的轉信號，每隔6秒記錄一次。試驗在室溫下進行，以便直接與光學傳感數據進行比較。
(4) 動態物質再分布(DMR)光學生物傳感器試驗
各項研究均採用配備有橫向磁場或p-極化TM。模式的Corning Epic 角度訊問系統。培養後，純用DMEM餓養細胞(覆蓋率約95%) 20小時，洗滌兩次後維持於lOOpl DMEM中。然後，將含有細胞的傳感器微板放入光學系統，記錄加入溶液之前和之後的細胞響應。在化合物研究中，細胞先用50^1的化合物溶液或1XHBSS預處理各孔中的細胞直至其達到穩定期(即沒有明顯的物質再分布，通常在l小時之內)，然後才添加50^1的PAR激動劑。用1XHBSS配置化合物溶液或PAR激動劑溶液以使細胞培養基與化合物溶液的折射率相互匹配，從而儘可能減小加入溶液致整體折射率變化造成的非期望效應，當這種效應發生時可能會暫時遮蔽所有DMR信號。全部研究在室溫下進行，微板上始終加蓋，僅在添加溶液時短時(數秒)打開，這是為了儘可能減少溫度波動和蒸發冷卻。本文所述效應單位指據CCD相機成像，各傳感器共振帶中心位置以像素計的改變；據採用甘油和二甲亞碸的濃度依賴性效應曲線的一實驗標定方法，1個單位等於 5. 82X10—4的折射率改變。(5)螢光成像
將細胞接種在Corning Epic 96孔微板上，用無血清DMEM培養基餓養一夜，用胰蛋白酶或凝血酶處理一定時間以示蹤，用4%仲甲醛定影，在含0.2%Triton的磷酸鹽緩衝液(PBS)中透化，用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。然後，用0.5^M德克薩斯紅標記的鬼筆環肽室溫下培養細胞1小時，洗滌。最終洗滌並計數後，用Zeiss Axioplan螢光顯微鏡的40倍目鏡觀察細胞。
b)結果
(1) PAR激動劑在A431細胞中介導胞內C,升高根據Fluo-3螢光強度增加，靜息A431細胞內，凝血酶、胰蛋白酶、PAR1-AP(SFFLR-醯胺)和PAR2-AP (GLIGKV-醯胺和GLIGLR-醯胺)都濃度依賴性地誘導胞內〔&2+ 〔[Ca21,)迅速的瞬時性升高。根據非線性回歸和Scatchar分析，全部PAR激動劑介導的飽和曲線非常符合單結合位點。據測定，凝血酶、SFFLR-醯胺、胰蛋白酶、SLIGLR-醯胺和SLIGKV-醯胺的ECs。分別為6±1單位/ml (相當於60土10nM) ， 5.0±0. 4(iM， 45. 7±5. 8nM， 2. 5±0. 3jaM和3. 8±0. 4pM。凝血酶、SFFLR-醯胺、胰蛋白酶、SLIGKV-醯胺和SLIGLR-醯胺誘導的最大[Ca"]i升幅分別48. 2±3. 5%， 74. 3±3. 9%， 100±6. 3%， 52±6. 3%和64±3. 7% (圖71)。胰蛋白酶引起的最大[Ca2+]i升幅約為凝血酶的兩倍。另一方面，胰蛋白酶引起的最大[Ca"]i升幅也比兩種PAR2-AP引起的高得多。而且，用SFFLR-醯胺(20!iM)與SLIGKV-醯胺(20(xM)的混合物刺激A431所誘導的[Ca2+]i升幅為102±5. 4%，與單用200nM胰蛋白酶的效果相似。有意思的是，濃度高達160pM的PARI特異性部分激動劑YFLLRNP也沒有誘導任何明顯的[Ca21升高，但用80,YFLLRNP預處理細胞抑制200nM胰蛋白酶介導的[Ca2+] i升高(48. 3±4. 5%， n=5)。發現YFLLRNP在適當濃度(<Tl00^M)選擇性地通過PARI激活G加3信號傳遞級聯，造成血小板形狀改變，但不刺激人血小板中的Gq或Gs信號傳遞途徑。以上結果提示，胰蛋白酶能激活除PAR2之外的PAR。凝血酶、SFFLR-醯胺、胰蛋白酶、SLIGKV-醯胺和SLIGLR-醯胺誘導最大響應所需的濃度分別為40單位/ml，20jiM， 400nM， 20nM禾卩20jiM。
176(2) PAR激動劑介導A431細胞中肌動蛋白絲的重構
已知，PAR活化在諸如LNCaP等數種細胞系中可能是通過Rho家族蛋白的活化而引起細胞骨架結構重構。由於本發明光學傳感系統的獨特設計採用一光帶(200X3000)im的維度，注意這是目前本發明角度訊問中的配置；用來照射的光通常在約5(^m至5mm範圍內)照射各生物傳感器(這意味著，DMR相關光學特徵是該照明區域內的所有細胞的平均值)，研究了PAR激動劑對高覆蓋率(〉90%)細胞的細胞骨架結構的影響。據德克薩斯紅-X-鬼筆環肽染色圖案(數據未顯示)顯示，用凝血酶或胰蛋白酶刺激覆蓋率約95%的靜息A431細胞誘導了肌動蛋白絲的重構。靜息A431細胞顯示典型的染色圖案一肌動蛋白絲表現為被最大程度拉長並均勻分布於整個細胞質。用100nM胰蛋白酶或40單位/ml凝血酶處理細胞在約10分鐘後引發顯著的細胞骨架重構，並在約30分鐘後變得明顯。凝血酶或胰蛋白酶刺激後30分鐘，肌動蛋白絲變得主要集中在細胞邊緣。以上結果表明凝血酶和胰蛋白酶都在A431細胞內介導肌動蛋白絲重構。
(3) PAR激動劑在A431細胞中介導顯著的動態物質再分布
本發明證明5種受檢PAR激動劑都產生Gq-型光學特徵，都會在一定的激動劑濃度達到飽和。基於非線性回歸和Scatchard分析，與Ca"激活結果相似，用光學生物傳感器試驗獲得的PAR激動劑介導DMR信號的飽和曲線也非常符合單位點結合模式。值得注意的是，對於胰蛋白酶，關注的是其在低劑量
C〈2000nM)誘導的函R信號，因為其在高濃度(〉2000nM)引起明顯的細胞從生物傳感器表面脫附(數據未顯示)。
由於細胞活性的許多重要方面，包括轉運、信號傳遞和形態改變，都以細胞骨架結構重排為前提，所以對細胞骨架調整在PAR激動劑誘導的光學特徵響應中的作用進行研究(圖72)。紅海海綿素A預處理A431細胞徹底抑制凝血酶或胰蛋白酶介導的DMR信號，但松胞菌素B抑制效應的效力弱得多。已知，這兩種試劑採用不同的機制引起肌動蛋白解體松胞菌素B給肌動蛋白絲加帽
(cap)，紅海海綿素A則封鎖隔離肌動蛋白單體。這一區別可能使毒素各具不同的能力來調節受體信號傳遞，通過或者影響內吞作用或者影響信號傳遞元件的組裝。相反，穩定性聚合F-肌動蛋白試劑鬼筆環肽和微管幹擾劑諾考達唑對凝血酶和胰蛋白酶介導的響應都沒有顯著作用。引起調節細胞骨架重構的Rho活化的PAR胞內信號傳遞似乎涉及兩條主要的信號傳遞途徑引起磷酸肌醇水解和轉依賴性Rho活化的Gq-偶聯途徑，和通過G12/13-偶聯pll5Rho-GEF的非鈣依賴性Rho直接活化。因此，對靶向Ca2+信號傳遞的調節劑的作用進行了研究。所用調節劑是強PKC抑制劑GF109203x和強Ca27鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II (CaMKII)抑制劑KN-62 (圖73)。GF109203x對於凝血酶和胰蛋白酶介導的DMR都沒有明顯影響。但是，KN-62預處理對凝血酶和胰蛋白酶介導的DMR信號有不同的影響。KN-62輕度抑制凝血酶介導的麗R信號，但幾乎徹底消除了胰蛋白酶介導的DMR信號。為了調查KN-62直接抑制胰蛋白酶活性的可能性，採用了BAEE水解試驗。結果顯示，KN-62
對胰蛋白酶的活性沒有任何明顯的影響(數據未顯示)。
724.還研究了 PARI特異性部分激動劑YFFLRNRP的作用，此前顯示該激動劑激活612/13，引起細胞形態改變但不激活人血小板中"-介導的Ca2+信號傳遞。YFFLRNRP只在高劑量刺激產生明顯的DMR信號(數據未顯示)。YFFLRNRP劑量依賴性地抑制凝血酶、SFFLR-醯胺和胰蛋白酶介導的D服信號(圖74)。在最高試驗濃度，YFFL脂RP幾乎徹底阻斷了凝血酶介導的畫R信號，但只部分減弱SFFLR-醯胺和胰蛋白酶介導的DMR信號。相反，YFFLRNRP對PAR2-AP GLIGKV介導的DMR信號幾乎沒有影響。總之，以上結果提示，細胞骨架重構主要是由通過PAR2活化的Gf介導Ca"信號傳遞引起的，而不是通過PARI活化的非Ca2+依賴性機制。
(4)受體失敏和PAR激動劑的交叉失敏
由於A431至少內源性表達PAR1和PAR2，而且，凝血酶和胰蛋白酶都能高效激活一種以上受體，所以對多種PAR激動劑組合的後續刺激引起的受體失敏和交叉失敏進行了研究，用Fluo-3檢測的[Ca2+L升高程度或用光學生物傳感器測定的D服信號來評價。Ca"激活試驗的間隔為6分鐘，D服光學實驗為1小時左右。
圖75匯總了依次受到多種PAR激動劑組合刺激的A431中[Ca2+]i的主要結果。 一旦A431受到胰蛋白酶的刺激，此後使用其它PAR激動劑(40單位/ml凝血酶，20|xM SFFLR-醯胺，20pM GLIGKV-醯胺，20pM GLIGLR-醯胺或200nM胰蛋白酶)都幾乎不誘導[Ca2+]i升高(圖75a-c，數據未顯示)。相反，受檢的PAR激動劑都不影響緩激肽在後刺激介導[Ca2+]i升高，緩激肽是A431內源性表達的B2受體激動劑(圖79d)，這提示胰蛋白酶在先刺激抑制PAR激動劑 響應不是因為膜蛋白的非特異性消化。另一方面，40單位/ml凝血酶在先刺激 徹底阻抑40單位/ml凝血酶介導的[Ca2+]i升高，但只輕度抑制胰蛋白酶誘導 [Ca"i升高，但是，SFFLR-醯胺、GLIGKV-醯胺或GLIGLR-醯胺的在先刺激顯著 削弱但不完全消除胰蛋白酶誘導的[Ca2+]i升高(圖79e-g;數據未顯示)。而 且，先用凝血酶刺激後，PAR2-APSFFLR-醯胺誘導的[Ca2+]i升高(48.5±3.8%) 與沒有在先刺激時的(52.0±6.3%)相近。相反，先用凝血酶刺激只部分阻抑 SFFLR-醯胺誘導的[Ca2+],升高(32±4.3%)，這與此前其它研究人員的以下觀 察結果一致SFFLR-醯胺能夠激活PARI和PAR2 (Blackhart， B. D. ; Emilsson， K. ; Nguyen, D. ; Teng， G. W. ; Martelli， A.丄；Nysted, S. ; Sundelin， J.; Scarborough, R. M. J. Biol. Chem. ， 1996, 271, 16466-16471)。因此， 胰蛋白酶可導致對PARI-AP和PAR2-AP的響應性失敏，但凝血酶不會使對 PAR2-AP的響應性失敏。
圖76匯總了 RWG生物傳感器實時觀測所得依次受到多種PAR激動劑組合 刺激的A431的DMR響應主要結果。胰蛋白酶在先刺激完全消除胰蛋白酶(數 據未顯示)或凝血酶誘導的DMR信號(圖76a)，顯著抑制三種PAR-AP (SFFLR-醯胺、GLIGKV-醯胺或GLIGLR-醯胺)介導的DMR信號(圖76b-c，數據未顯示)。 相反，胰蛋白酶預處理對緩激肽介導的DMR幾乎沒有影響(圖76d)。另一方 面，先用凝血酶、SFFLR-醯胺、GLIGKV-醯胺或GLIGLR-醯胺刺激顯著抑制但不 完全消除胰蛋白酶誘導的D服信號(圖76e-g，數據未顯示)。而且，先用凝 血酶剌激後，兩種PAR2-AP (SLIGKV-醯胺和SLIGLR-醯胺)誘導的DMR信號與 沒有在先剌激時的相似(數據未顯示)。總之，以上結果顯示，凝血酶主要激 活PARI ，胰蛋白酶激活PARI和PAR2兩者。
(5)凝血酶和胰蛋白酶介導的[Ca2+]i升高和DMR信號對細胞內膽固醇水 平敏感
由於細胞膽固醇水平對包括GPCR信號傳遞在內的許多細胞功能具有重要 意義，所以對m(3CD引起的膽固醇降低對凝血酶和胰蛋白酶介導的胞內Ca"升高 和DMR信號的影響進行了研究。用m(3CD預處理靜息A431細胞劑量依賴性地抑 制胰蛋白酶或凝血酶介導的[Ca2+L升高(數據未顯示)。兩者的劑量依賴性抑 制曲線都與單相衰減非線性回歸擬合良好；與以下事實一致mpCD引起膽固醇分子透過細胞膜迅速外排。另一方面，非活性環糊精立體異構體ocCD高達8mM 也不影響胰蛋白酶和凝血酶介導的響應(數據未顯示)。
類似的，用mpCD預處理A431也劑量依賴性地改變了凝血酶或胰蛋白酶誘 導的光學特徵(圖77)。與Ca2+激活試驗測得的相似，mpCD劑量依賴性地抑制 凝血酶介導的DMR，但與之不同的是，mpCD對胰蛋白酶介導的DMR的抑制表現 出複雜的特徵隨著mpCD劑量升高，信號的減弱逐漸衰減。這一區別提示 胰蛋白酶介導的DMR比凝血酶所介導的具有更為複雜的細胞機制。相反，非活 性環糊精立體異構體ocCD高達8mM時對兩種激動劑誘導的DMR信號的影響仍然 微乎其微。然而，高劑量的aCD (〉10mM)引起大量細胞從生物傳感器表面脫附 (數據未顯示)。還研究了用m(3CD降低膽固醇後PAR的功能回復。該實驗以 經mpCD處理的細胞在去除含m(3CD的培養基後細胞表面膽固醇的及時恢復為基 礎。為此，用5mM mpCD處理靜息A431細胞15分鐘以確保去除所有細胞表面 膽固醇，然後純用DMEM培養基洗滌經處理的細胞三次。然後，用100|il培養 基維持細胞，並放入光學系統。培養15分鐘使細胞達到適度穩定的狀態後， 在特定時間向各孔加入IO(HU凝血酶溶液(80單位/ral)。記錄整個試驗期間 的光學響應。如圖78所示，結果顯示，凝血酶誘導的DMR信號依賴於細胞表 面膽固醇去除後的時間。凝血酶誘導的DMR信號逐漸恢復直至原先的水平(不 去除膽固醇所得的水平)。凝血酶誘導的光學特徵的這種時間依賴性恢復強烈 暗示膽固醇輔助微結構域的形成是動態的和可逆的，細胞膜上膽固醇的濃度 在PAR信號傳遞調節中具有重要作用。
(6) EGFR與PAR之間的交叉通話
由於某些GPCR轉激活EGFR，所以研究了 EGF對PAR信號傳遞的影響。EGF 在先剌激對胰蛋白酶(圖79a)或凝血酶(數據未顯示)介導[Ca"]i升高的影 響微乎其微。然而，在EGF充分激活EGFR的100nM， EGF完全阻抑胰蛋白酶(圖 79b)或凝血酶(圖79c)介導的麗R反應中的N-DMR，但僅減弱P-DMR。以上 結果顯示，EGFR和PAR之間可能存在交叉通話，至少就調節肌動蛋白絲重構而 言是這樣。
總之，為了搞清楚A431細胞中PAR信號傳遞的機制，用5種PAR激動劑 (凝血酶、PARI-AP FLLLR-醯胺、胰蛋白酶、PAR2-AP GLIGLR-醯胺和GLIGKV-醯胺)和1種PARI特異性部分激動劑YFLLRNP刺激A431細胞。檢測包括[Ca2+]i
180水平和動態物質再分布在內的細胞響應。有三項證據支持這樣的結論凝血酶 主要激活PAR1，胰蛋白酶激活PAR1和PAR2兩者。第一，兩種被檢PAR激動劑 引起的[Ca2+]i升高和DMR都具有劑量依賴性和飽和性，這提示A431細胞內存在 PAR1和PAR2信號傳遞。與其它PAR激動劑所介導的相比，胰蛋白酶介導更強 的[Ca"i升高和DMR信號，這提示胰蛋白酶可能激活非PAR2受體。SFFLR-醯胺和GLIGKV-醯胺混合物介導的[Ca2+]i升高與單用胰蛋白酶所介導的相似， 進一步強化了這一可能性胰蛋白酶在A431細胞中既激活PARI又激活PAR2。
第二項證據來自這樣的觀測結果先用胰蛋白酶刺激機會完全阻抑除緩激肽(B2
受體激動劑)之外任一PAR激動劑介導的[Ca2+]i升高，由此提示和PAR2 —樣， PARI也被胰蛋白酶剪切和激活。另一方面，先用凝血酶處理僅輕度抑制[Ca2+]i 升高，但顯著抑制胰蛋白酶介導的DMR信號。有意思的是，延長胰蛋白酶在先 處理時間( 1小時)完全抑制凝血酶介導的A431細胞的D服響應，這提示 在胰蛋白酶持續刺激1小時後，沒有完整的凝血酶活化受體恢復。然而，與 [Ca2+L測定不同，延長胰蛋白酶在先刺激只部分抑制全部三種PAR-AP介導的 D服信號，這暗示可能有部分PAR2受體被恢復。己知SFFLR-醯胺能夠活化 PAR1和PAR2兩者。還已知，受體蛋白水解和磷酸化通過受體內化作用和抑制 胞內信號轉導調節PAR的活性。根據細胞環境，細胞表面功能性受體的恢復可 能需要數十分鐘至數小時。第三項證據來自YFFLRNP的效果。先用YFFLRNP進 行的刺激劑量依賴性地抑制凝血酶、SFFLR-醯胺或胰蛋白酶介導的D服信號， 但不抑制PAR2-AP SLIGKV-醯胺介導的信號。在最高劑量(729pM) ， YFFLRNP 完全阻抑凝血酶介導的DMR信號，但只部分抑制SFFLR-醯胺或胰蛋白酶介導的 信號。總之，以上結果顯示，在A431細胞中，胰蛋白酶不僅激活PAR2還激活 PAR1。據報導，PAR1、 PAR3和PAR4是凝血酶受體，而胰蛋白酶除PAR2之外還 能夠激活PAR1和PAR4。德克薩斯州紅-X-鬼筆環肽染色的肌動蛋白絲和RWG生物傳感器顯示 的動態物質再分布支持PARI和PAR2活化在A431細胞細胞骨架重構中的作用。 PARl活化已被證明在包括血小板和LNCaP在內的多種類型細胞中引起細胞骨架 重構。用凝血酶或胰蛋白酶剌激A431細胞引起顯著的肌動蛋白絲重排由拉 長肌動蛋白絲無規分布變為集中在細胞邊緣附近。而且，被檢PAR激動劑都誘 導生物傳感器表面上貼附細胞底部明顯的物質再分布。肌動蛋白幹擾劑紅海海 綿素A和松胞菌素B能夠選擇性削弱凝血酶或胰蛋白酶所介導的DMR信號，但
181肌動蛋白聚合促進劑鬼筆環肽或微管調節劑諾考達唑則不能，這提示了在A431 細胞中肌動蛋白絲重排在DMR響應中的作用，也由此提示了 PAR信號傳遞在細 胞骨架重構中的作用。人血小板受凝血酶作用會發生多種分布和形態改變，在 其中，PARI已被證明能夠通過pll5Rho-GEF活化RhoA， pll5Rho-GEF是一種 GTP轉換因子(GEF)，它結合PARl-偶聯的G蛋白，G12/13。在A431細胞中，YFFLRNP
(一種PARI特異性部分激動劑，據報導，其特異性活化&2/13但不活化Gq)被 發現能夠誘導與其它PAR激動劑相似的DMR信號(數據未顯示)。而且，YFFLRNP 預處理A431細胞劑量依賴性地減弱凝血酶和SFFLR-醯胺介導的DMR信號，但 對PAR2-AP GLIGKV-醯胺的信號沒有影響。以上結果提示，A431中PARI的活 化可能還通過G,2,'3引發細胞骨架重構。另一方面，胰蛋白酶介導的細胞骨架重 構可能是由G⑧3依賴性和G,依賴性兩種途徑引起的，因為胰蛋白酶介導的DMR 信號對CaMKII抑制劑KN-62和PARI特異性部分激動劑YFFLRNP都敏感。 一種 可能性是，胰蛋白酶依賴於通過PAR2活化的GJ言號傳遞途徑而不是通過PARI 活化的G^3信號傳遞途徑誘導細胞骨架重構。
細胞表面的膽固醇傾向於與包括鞘脂類和飽和磷酯在內的其它脂類一起 形成微結構域，選擇性地將眾多信號傳遞蛋白區室化。用mpCD而不是其非活 性立體異構體0^0處理細胞削弱了？八1 信號，包括凝血酶和胰蛋白酶誘導的。32+ 激活和動態物質再分布。EGF在先刺激的效果提示膽固醇損耗轉激活EGFR至 少引起凝血酶或胰蛋白酶介導的N-DRM事件的減弱。此外，膽固醇損耗能夠減 弱Ca2+激活暗示質膜中的膽固醇通過Gq-信號傳遞途徑調節PARI和PAR2信號 傳遞兩者。已知，膽固醇抽提導致PAR信號傳遞中兩種重要分子Ptdlns4，5-P2 和GJ勺區室化缺失。膽固醇損耗引起的Ca2+激活抑制可能是Ptdlns和G,離域
(delocalization)的直接結果。如前所述，PAR介導的DMR信號可能還涉及 與Gq途徑無關的其他途徑。然而，去除膽固醇能夠完全阻抑胰蛋白酶和凝血酶 介導的畫R提示膽固醇損耗可能還削弱其它信號傳遞途徑，例如G^3途徑。 以上發現與其它研究人員此前的以下觀測結果一致A4. 1細胞的膜邊緣波動
(membrane raffling)需要膽固醇。有意思的是，功能恢復實驗顯示，膽固 醇裝配的微結構域是動態和可逆的。
胰蛋白酶、凝血酶或PAR-AP介導的&2+信號傳遞和動態物質再分布提示 在A431細胞中，凝血酶介導PARI信號傳遞，胰蛋白酶激活PARI和PAR2兩者。 PARI和PAR2兩者的激活引起細胞骨架結構重構，但可能是通過不同的機制。G,和Ca2+-依賴性機制被認為是PAR2-介導的細胞骨架重排的機制，而包括G12/13 在內的其它信號傳遞途徑則可能引起PARl-介導的重排。而且，在A431中，細 胞表面的膽固醇在調節PAR信號傳遞方面具有重要作用。以上發現提示PAR 信號傳遞可能對腫瘤浸潤和轉移具有重要意義。本發明強烈增強了 RWG生物傳 感器在揭示細胞信號傳遞及其網絡交互作用方面的巨大潛力。
實施例10:活性氧類信號傳遞和細胞氧化還原狀態的研究
R0S在不同水平調節大量從受體到細胞核的信號傳遞途徑。在過去十年中， 已經鑑定到了細胞靶，並在不斷增加，雖然對它們尚知之甚少。受體激酶和磷 酸酶可能是氧化應激的目標(靶)。生長因子受體，最常見的，是被配體誘導 的二聚化或寡聚化所誘導，所述二聚化或寡聚化引起其胞質激酶結構域的自磷 酸化。還已很好證明了紫外線引起受體的非配體依賴性簇化和活化，而這一效 果似乎是由ROS介導的。有數據顯示，外源性HA (通常以mM計)誘導PDGF-受體和EGF受體的酪氨酸磷酸化和活化。溶血磷脂酸誘導的EGF受體轉激活似 乎是由ROS的即時形成介導的。因為大多數生長因子和細胞因子似乎在質膜或 其附近產生R0S，磷脂代謝物是氧化還原信號傳遞潛在的重要靶標。例如，氧 化態的二醯基甘油激活PKC比其非氧化態更有效。此外，PKC活化和蛋白質酪 氨酸磷酸化似乎是內皮細胞和成纖維細胞內1￥)2-誘導的PLD活化所必需的。屬 於Src家族(Src激酶)和Janus激酶(JAK)家族的非RTKs也是靶標，至少 是外源性加入的氧化劑的靶標。
此項研究中，所有光學響應都是用波長訊問系統監測的。RWG生物傳感器 的構成包括用於生化試驗的三個主要部件EpicTM傳感器微板，RWG檢測器，和 液體作業系統。傳感器微板的構成包括裝在一給定SBS格式(例如96孔或384 孔)塑料孔板上的玻璃底板，這樣的微板能夠進行高通量的篩選。在一 96孔 EpicTM傳感器微板中，每孔有一個約3X3mm2的RWG傳感器。RWG傳感器的構成 包括一層介電材料薄膜，該薄膜位於呈現光柵的玻璃基片上。
波長訊問檢測器系統位於集成光纖的正中。用通過光纖和準直透鏡以公稱 垂直入射角透過微板底部而產生的一寬帶光源照射光柵表面的一個小區域。將 用於記錄反射光的檢測光纖與照射光纖捆綁在一起。 一系列8個照射/探測頭 線形排開，這樣，可以一次採集同一微板上同一列內8個孔的反射波譜。通過 空間-控制的移動，整個微板移動通過各照射/探測頭，使得每個傳感器被多次
183經過，各一列依次通過。由此採集到一系列反射光譜，並用其進行分析。由於 該檢測系統測定細胞響應刺激而誘導的反射光波長改變，該方法被稱為波長訊 問系統。
圖80顯示用角度訊問系統監測所得，lmM 11202引起的靜息A431細胞的多 項光學輸出參數。11202刺激引發傳感器傳感體積內顯著的物質再分布(圖84A)。 DMR信號由兩個主要事件組成 一個包括以下三個階段的初峰物質信號增強
(P-DMR),過渡階段和衰減物質信號(N-DMR);和長時間的增強物質信號， 直至達到一平臺水平。另一方面，H202刺激還稍微增強TM。模式共振峰的P冊M， 這表明細胞層底部物質再分布的不均勻性增加。與P冊M —致的是，刺激後， 峰強度隨時間略微降低，積分面積則基本保持不變。
圖81顯示不同劑量HA引起的A431細胞的動態物質再分布信號，用波長 訊問系統監測波長改變所得。如圖81a和b所示，HA刺激的光學特徵非常依 賴於其劑量。當HA的濃度約為8mM或以下，細胞對HA的響應是一典型的兩 事件曲線 一個初峰和一個長時間的增強物質信號。然而，當&02的濃度約為 16mM或以上時，細胞對&02的響應具有獨特特徵初期的增強物質信號，然後 是相對穩定的過渡階段，最後是衰減物質信號。後期的衰減物質信號與活/死 細胞染色結果非常符合(數據未顯示)，這表明經高劑量^02處理的細胞發 生了細胞凋亡一一個造成細胞物質流失的過程。
圖82顯示src激酶調節劑對lmM &02介導的細胞響應的作用。結果顯示， 兩種特異性src激酶抑制劑，PP1和PP2，顯著抑制HA介導的細胞響應，但是 作為陰性對照的PP3不影響響應。由此提示，Src激酶參與HA介導的DMR信 號；以及，光學生物傳感器可用來篩選影響ROS信號傳遞的調節劑。
圖83顯示靜息A431細胞不同氧化還原狀態對HA介導的D服信號的影響。
用不同的初始接種細胞數量和不同的培養時間形成不同的氧化還原狀態。如下 製備低氧化還原活性細胞每孔75，000個細胞，普通條件下培養3天，然後 用0%胎牛血清(FBS)餓養一夜，如下製備高氧化還原活性細胞每孔10，000 個細胞，普通條件下培養10天，然後用0% FBS)餓養一夜。根據光學顯微鏡 鏡檢，細胞密度相近( 95%)。如圖83所示，兩種不同氧化還原狀態的細胞 對4mM &02具有不同的響應。在低氧化還原活性狀態細胞中，&02引發典型的 DMR信號，最終增加細胞底部的物質。然而，在高氧化還原活性狀態細胞中， 相同濃度的^02介導凋亡(即，最終，細胞物質流失)細胞的特徵性DMR信號。以上結果顯示，光學生物傳感器可用於區分培養的細胞的氧化還原狀態，並可 用於篩選細胞氧化還原狀態的調節劑。
實施例ll:細胞檢測中多項光學輸出參數的分析
實時、平行記錄數種已知細胞響應和過程(包括貼壁、鋪展、脫附和通過 EGFR或緩激肽B2受體的細胞信號傳遞)的多項光學輸出參數。這些光學數據 包括入射角變化和描述共振峰的三個參數強度、PWHM和面積。由於TM。模式 的高靈敏度和信息含量，只用它進行全部信息採集和分析。
a) TM。峰的形狀
如圖31所示，CHO細胞TM。峰的形狀和位置取決於細胞覆蓋率。隨著細胞 覆蓋率的提高，共振峰向高入射角方向移動。PWHM值，描述峰的形狀狀的參數 之一，也表現為細胞覆蓋率依賴性(圖31b)。當細胞覆蓋率約為50%時，PWHM 達到最大值；PWHM最大值比高於75%的高密度時(有或沒有細胞單層)的PWHM 值高約35%。值得注意的是，以上數據是在細胞在生長培養基培養約2天後、 充分鋪展後測得的。
貼壁CH0細胞的TM。峰還對DMS0 (高劑量時具有毒性)敏感。如圖32a所 示，用18% DMS0處理增殖細胞(用10% FBS誘導)時，TM。峰的形狀和位置表 現出動態改變。用DMS0處理後，在監測期間(約3小時)，峰的強度和面積 都增加。然而，峰的位置(即入射角)表現出動態特徵入射角起初向物質增 加的方向移動(例如25分鐘)，然後向物質減少方向移動(例如40和120min)。 類似的，峰的形狀起初變寬且顯示出複雜的細微結構(例如25分鐘)，最後 收窄(例如40和120分鐘)。已將出現複雜的峰結構表示為傳感器表面或其 附近出現大規模的物質無規不均勻性，由此表明，在DMS0處理後的特定時期 內，生物傳感器探測到了表面不均勻性的升高。DMS0處理後25分鐘的CHO細 胞活/死亡染色結果顯示存在混合細胞群活細胞、死細胞和受影響細胞(圖 32b)，表明CHO細胞似乎對應SO處理有不同的響應。以上結果顯示，TM。峰的 形狀可用於研究傳感體積內不均勻的橫向物質再分布。
(b)細胞貼壁和鋪展
185用光學成像技術，用SPR和RWG之類光學生物傳感器很好地研究了細胞在 表面上的貼壁和鋪展。細胞開始與表面相互作用是通過最初的接觸和附著，此 時，細胞通常仍然是懸浮狀態時的圓形。然後，附著細胞發生形態改變，即已 知的鋪展一細胞擴大其與表面的接觸面積的過程。附著和鋪展都有賴於表面的 性質和細胞懸浮於其中的培養基的性質。由於細胞貼壁和鋪展都引起傳感體積 內明顯的縱向和橫向物質再分布，我們首先鑑定沒有和有長春新鹼條件下，5% FBS中，A431細胞的貼壁和鋪展。長春新鹼是一種植物鹼(plant alkaoid)， 通過結合微管蛋白抑制微管組裝。
我們研究了室溫下(25°C)，沒有和有長春新鹼條件下，5。/。FBS中，A431 細胞的貼壁和鋪展。結果顯示，沒有長春新鹼時，入射角改變表現出三個主要 階段(數據未顯示)。加入細胞溶液後，信號立即、迅速增強，這可能是三個 事件造成的細胞溶液的加入引起整體折射率改變，血清蛋白質在傳感器表面 的固定化，以及細胞沉澱後與表面接觸。此後，出現一個長時間的增強信號， 反映緩慢的細胞鋪展過程。最後達到一飽和水平。該飽和水平(16. 8±0. 6單位， n二3)比類似密度充分鋪展細胞的水平(22.6±1.0單位，n=3)低得多。另一方 面，歸一後的PW服也是動態的，具有獨特的特徵(數據未顯示)。加入細胞 溶液後，PWHM值開始升高。約20分鐘後，PWHM開始回落，在2小時內回落至 其原點水平，然後是緩慢的持續增長，直至達到一平臺水平。P冊M的終點值比 起點值高約25%，表明細胞尚未完全鋪展，即使是在環境條件下用生物傳感器 進行了 20小時的檢測之後。光學顯微鏡成像證實了這一點(數據未顯示)。 以上數據提示(i)室溫下，A431 cells似乎不能達到最佳程度的貼壁；(ii) 細胞通過多個步驟與表面相互作用，每一步都具有其獨特的特徵；和(iii) 鋪展步驟明切增加傳感體積內的物質，表明細胞與表面的接觸增加。
100nM長春新鹼顯著改變光學特徵。長春新鹼不僅抑制初始響應和總響應， 而且降低細胞鋪展的動力學特徵(數據未顯示)。有長春新鹼時，入射角的總 變化比沒有長春新鹼時小約20%。有意思的是，長春新鹼還改變P冊M值的動態 特徵(數據未顯示)。與沒有長春新鹼時不同，PWHM—開始先降低，並在低值 維持約3小時，然後升高，直至到達一平臺，這表明長春新鹼主要影響細胞 貼壁和鋪展過程中的初期步驟。以上結果顯示，生物傳感器不僅能夠揭示細胞 與表面的相互作用，而且能夠區分改變細胞貼壁和鋪展過程的能力不同的化合 物。
186(c ) EGFR信號傳遞
如前所述，通過分析多種已知調節劑對EGF所介導DMR信號的調節己獲得 了豐富的信息。結果顯示，在靜息A431細胞中，EGF介導的DMR需要EGFR酪 氨酸激酶活性、肌動蛋白聚合和發動蛋白(dynatnin)活性，並且主要通過MEK 進行。通過平行多項參數測定，鑑定了EGF介導的EGFR信號傳遞的光學特徵。 如圖84a所示，特別有意義的是高劑量EGF誘導的體現為角度變化的細胞響應。 用超過的32 nM的高劑量EGF刺激時，靜息A431細胞出現一個新的DMR信號 階段。最初的快速P-DMR (增強信號)之後是短暫的過渡階段和長時間的衰減 N-DMR (信號減弱)，除此之外，在細胞最終達到平臺值(與16nM或32nM誘 導的水平相似)之前，還有一個部分回復RP-腿R階段(增強信號)。 一種可 能性是，在高劑量EGF刺激後，細胞經歷了一段脫附過程，然後是一段部分再 附著過程。
因為EGF介導某些細胞靶標(例如PI3K，EGF-誘導的細胞遷移的重要因素) 的不對稱橫向再分布，平行監測了描述共振峰的多項參數。然而，不同劑量的 EGF刺激後，三項參數似乎都保持不變(圖85b;僅顯示P冊M)，這表明EGF 刺激不增加細胞底部橫向物質再分布的不均勻性。這與肌動蛋白絲的TR-鬼筆 環肽染色結果不一致(圖85c和d)。這些圖像顯示，在橫向上，EGF介導肌 動蛋白絲明顯重排。無法測到EGF引發的橫向物質再分布不均勻性表明，不對 稱再分布可能主要在探測容積之外發生。
b)緩激肽B2受體信號傳遞
緩激肽B2受體是一種G蛋白-偶聯受體，並引起緩激肽(BK)的大多數生 理學和病理生理學作用。緩激肽(BK)似乎是包括促有絲分裂和抗促有絲分 裂效應等多種生理學和病理生理學響應介體。A431細胞內源性表達緩激肽B2 受體，但不表達B,受體。在此鑑定了 BK刺激產生的靜息A431細胞光學特徵， 結果顯示，BK刺激引起A431細胞的動態物質再分布；其動力學特徵、振幅和 持續時間取決於細胞培養條件、BK劑量和細胞環境。如圖86所示，對靜息A431 細胞的BK刺激產生PWHM的快速升高，然後緩慢回落至原點水平，而峰強度則 產生與PWHM和角度變化的相反的動態響應。而且，這兩項參數的變化也是BK 劑量依賴性的，而且，其動態特徵和動力學特徵與此前報導的DMR信號相似。以上結果提示與EGF-介導的細胞響應相比，BK刺激引起細胞成分更顯著的
不對稱再分布，這繼而增加了細胞底部橫向物質再分布的不均勻性。
總之，RWG生物傳感器為探測活細胞提供了豐富的信息。理論分析揭示
測得的光學特徵是綜合響應，可作為顯示結果，用於研究天然環境中的細胞而
不需要標記。已經對數種細胞響應和過程，包括貼壁、鋪展、脫附、通過EGFR和緩激肽B2受體的細胞信號傳遞進行了全面研究。通過對多項光學輸出參數的平行動力學測定鑑定了細胞底部縱向和橫向上刺激誘導的動態物質再分布的獨特特徵。已發現，細胞貼壁和鋪展涉及多個步驟；長春新鹼能夠通過幹擾初期步驟來調節細胞貼壁和鋪展。出乎意料的是，EGF不引發明顯的不對稱橫向物質再分布，至少在細胞底部是這樣。這提示，EGF誘導的細胞成分不對稱再分布(細胞遷移的重要過程)發生在細胞上部而非底部。然而，增加生物傳感器的穿透深度(例如反向波導構型)應能允許檢測這樣的橫向再分布。但是，多參數監控必將增加多個維度，從而能夠區分刺激誘導的細胞事件。
有意思的是，緩激肽在A431細胞中誘導的B2受體活化引發了縱向和橫向兩個方向的物質再分布。
Example 12:用終點測定高通量篩選作用於內源性GPCR的化合物
此處所述為適用於高通量篩選調節或影響細胞中、細胞增殖中或細胞死亡中一種或多種信號傳遞途徑的化合物的方法。這些高通量方法是基於這樣的理
解如本文中所述，可用多種不同的參數來分析生物傳感器的輸出數據。而且，如本文所述，特定細胞、細胞內的特定受體或特定細胞事件例如死亡或增殖或信號傳遞途徑調節可具有特定的特徵。如本文所述，該特徵可由一個或多個生物傳感器輸出參數構成。重要的是，對於高通量方法來說，在方法過程中有一個時間點，在該時間點採集的生物傳感器輸出參數將可反映出細胞的狀態，艮口，某信號傳遞途徑被激活或關閉，細胞已死亡或正在增殖。該個點可以是有可用於構成特徵的一組生物傳感器輸出數據特徵的時刻。
配體誘導的D服信號通常延續較長時間(數十分鐘)。因此，動力學測定
似乎不適合高通量(HT)篩選類應用。然而，基於某特定配體誘導的DMR信號的總體動態學特徵和很好表徵的動力學特徵，可以容易地開發出用於HTS應用的終點測定方法。基於兩種GPCRs (A431細胞內的緩激肽B2受體和CH0細胞內
188蛋白酶活化受體亞型1 (PARI))的光學特徵，用兩種終點測定開發了高通量 篩選方法。
圖86顯示試驗期間作為化合物的函數的兩個時間點之間的波長改變。這
兩個時間點是臨加入化合物前(基線點)和加入化合物後5分鐘(測定點)。
兩點間的差別反映緩激肽(緩激肽B2受體激動劑)介導的P-DMR過程的總振幅。 B2受體在A431細胞內內源性表達。在緩激肽剌激前，該細胞已轉入靜息態。本 實施例採用384孔Coring Epic生物傳感器平板。每孔含有A431細胞，覆蓋 率約為90%。半數孔用100nM的緩激肽處理，另半數孔只用HBSS緩衝液處理。 結果顯示，經100nM緩激肽處理細胞的波長總變化為約800pm，經HBSS緩衝 液處理細胞響應的振幅小得多(約-10pm)。該試驗窗口非常大( 810pra)， 而該試驗的波動性卻很小(經緩激肽處理細胞的CV約為 6%)。
圖87顯示試驗期間作為化合物函數的兩個時間點之間的波長改變。這兩 個時間點是臨加入化合物前(基線點)和加入化合物後5分鐘(測定點)。 兩點間的差別反映緩激肽(緩激肽B2受體激動劑)介導的P-DMR過程的總振幅。 兩點間的差別反映凝血酶(PARI受體激動劑)介導的P-DMR過程的總振幅。 此處使用另一細胞系一CHO細胞。PARI受體在CHO細胞中內源性表達。在凝血 酶刺激前，通過在DMEM培養基中培養細胞4小時使部分細胞轉入靜息態。本 實施例採用384孔Coring Epic生物傳感器平板。每孔含有CHO細胞，覆蓋率 約為90%。半數孔用40單位/ml的凝血酶處理，另半數孔只用HBSS緩衝液處 理。由於激動劑在A431細胞中誘導的B2活化和在CH0誘導的PARI活化都引發 Gq信號傳遞，該試驗結果的重要性在於Gq-型光學特徵至少在這兩種細胞系 中是普遍存在的。用相同的終點測定就能夠篩選作用於不同細胞內不同內源性 靶標的CPCR調節劑。
圖88顯示試驗期間作為化合物函數的兩個時間點之間的波長改變。這兩 個時間點是臨加入化合物前(基線點)和加入化合物後5分鐘(測定點)。 用不同劑量的凝血酶處理CH0細胞。結果顯示，用終點測定法，細胞劑量依賴 性地對凝血酶刺激做出響應，產生的表觀EG。為12.5單位/ml。該試驗結果提 示終點測定不僅能夠高通量地篩選GPCR調節劑，而且能夠確定實際生理學 條件下，GPCR激動劑對內源性GPCR的激動活性和效力。與對單個細胞響應或 特定標記靶標進行試驗的傳統方法不同，基於生物傳感器的細胞試驗適用於大 規模、基於多個靶標地選擇強效配體。 一旦鑑定到一個獨特的D服特徵並確定
189了其通過特定狀態細胞內的一類特定靶標與一特定的信號傳遞相關聯，就可對 化合物文庫進行篩選。可根據它們的光學特徵對化合物進行分類。這樣的篩選 可用於化合物分類。
或者，因為產生給定類型光學特徵的化合物可能是同一類內源性受體例如 Gq偶聯受體的激動劑。可對此類化合物在先刺激對受體特異性激動劑誘導的 DMR信號的作用進行研究，並用來指示靶標特異性。這樣的篩選可用於基於靶 標的篩選。
鑑定正確的主要結構(lead structure)是藥物開發中的關鍵步驟。 一旦 選定了主要結構，就可用本文所述光學生物傳感器來系統地研究其對活細胞的 作用。例如，可用信號傳遞途徑中一組靶標的多種已知調節劑來研究所述主要 結構所誘導麗R信號的調節特徵，從而使該主要結構與特定的靶標或信號傳遞 途徑相關聯。 一旦確立了所述關聯，就可用生物傳感器對主要結構進行優化。 因為通過某個靶標的細胞信號傳遞是複雜的，還可進一步將主要結構優化成只 選擇性調節某受體的某一種特定聚合狀態，或某一特定途徑或某種細胞狀態途徑。
190
權利要求
1. 一種測定刺激事件對細胞產生的影響的方法，包括提供無標記生物傳感器，在所述生物傳感器上孵育細胞，對所培養的細胞實施刺激事件，採集生物傳感器的生物傳感器輸出。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述孵育細胞包括培養細胞。
3. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，根據生物傳感器的輸出確定刺激的影響。
4. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，將細胞培養至20-99%覆蓋率。
5. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，將細胞培養至30_80%覆蓋率。
6. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，將細胞培養至40-65%覆蓋率。
7. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，將細胞培養至70-99%覆蓋率。
8. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，將細胞培養至80-95%覆蓋率。
9. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述細胞是貼壁細胞。
10. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞與所述生物傳感器相接觸。
11. 如權利要求IO所述的方法，其特徵在於，所述細胞連接於所述生物傳感器。
12. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述刺激事件包括向細胞培養物中加入化合物。
13. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述化合物調節細胞的細胞信號傳遞途徑。
14. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述調節激活細胞信號傳遞途徑。
15. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述調節抑制細胞信號傳遞途徑。
16. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述化合物調節細胞表面受體。
17. 如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述化合物是所述受體的激動劑。
18. 如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述化合物是所述受體的拮抗劑。
19. 如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述細胞表面受體的G蛋白偶聯受體、離子通道、受體酪氨酸激酶、細胞因子受體、整合蛋白受體、^+/8+交換劑受體或免疫受體。
20. 如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述細胞表面受體是Gq-偶聯受體、Gs-偶聯受體、Gi-偶聯受體、G12/13-偶聯受體、表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGF)或血管內皮生長因子受體(VEGFR)。
21. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述化合物調節細胞內的細胞骨架組分。
22. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述化合物導致細胞骨架結構去穩定化。
23. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述化合物穩定細胞骨架結構。
24. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述化合物調節胞內酶、胞內激酶、胞內細胞器、胞內蛋白質或胞外基質。
25. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述化合物以化合物溶液形式加入。
26. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括測定所述化合物是否具有細胞毒性。
27. 如權利要求26所述的方法，其特徵在於，測試多種化合物，以篩選出具有細胞毒性的化合物。
28. 如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述化合物的毒性水平通過生物傳感器輸出來監測。
29. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，根據生物傳感器輸出監測化合物對細胞的產生的影響。
30. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，根據生物傳感器輸出監測化合物的吸收。
31. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器可穿透細胞至100咖的深度。
32. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器可穿透細胞至100nm、 200nm、 300nm或500nm的深度。
33. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器可接收來自細胞內不同穿透深度的數據。
34. 如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述穿透深度至多500nm。
35. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，用生物傳感器輸出確定細胞狀態。
36. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括測定刺激事件是否影響細胞生存能力或增殖。
37. 如權利要求36所述的方法，其特徵在於，測試多種化合物，以篩選具有細胞毒性的化合物。
38. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，監測化合物對細胞產生的影響。
39. 如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述化合物是抗癌化合物。
40. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述採集生物傳感器輸出包括採集生物傳感器輸出參數。
41. 如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數是生物傳感器輸出信號動力學特徵相關參數。
42. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數包括對生物傳感器輸出整體動力學特徵的分析。
43. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析階段轉變完成時由一階段變為另一階段的速度。
44. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析完成生物傳感器信號輸出所需的時間。
45. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析生物傳感器輸出一個完整階段的信號所需的時間。
46. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析P-DMR階段的總持續時間。
47. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括N-DMR階段的總持續時間。
48. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析達到P-服R階段總振幅的速度。
49. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析達到N-DMR階段總振幅的速度。
50. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析由N-DMR階段到P-DMR階段的速度。
51. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述對整體動力學特徵的分析包括分析由P-DMR階段到N-DMR階段、由淨零階段到P-DMR階段、由淨零階段到N-DMR階段、由P-DMR階段到淨零階段或由N-DMR階段到淨零階段所需的過渡時間t 。
52. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器的輸出參數包括對生物傳感器輸出數據中階段的分析。
53. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析階段轉變。
54. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號。
55. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析逆向物質再分布(N-DMR)信號。
56. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析淨零物質再分布(淨零-歷R)信號。
57. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析正向物質再分布(P-DMR)信號的形狀。
58. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析正向物質再分布(P -DMR)信號的振幅。
59. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析逆向物質再分布(N-DMR)信號的形狀。
60. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述對階段的分析包括分析逆向物質再分布(N-DMR)信號的振幅。
61. 如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器的輸出參數包括生物傳感器輸出中的總體動態學特徵。
62. 如權利要求61所述的方法，其中，分析總體動態學特徵包括分析生物傳感器輸出產生的完整曲線的形狀。
63. 如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數是與共振峰相關的參數。
64. 如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數包括分析光強度與入射角，所述入射角為光與生物傳感器耦合的入射角。
65. 如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數包括分析光強度與光的波長，所述波長為光與生物傳感器耦合的波長。
66. 如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數包括分析峰的位置。
67. 如權利要求66所述的方法，其特徵在於，分析峰的位置包括分析在最大強度所在位置之前的半最大峰值強度的位置。
68. 如權利要求66所述的方法，其特徵在於，分析峰的位置包括分析在最大強度所在位置之後的半最大峰值強度的位置。
69. 如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數包括分析共振峰上某點的強度。
70. 如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述分析共振峰強度包括分析最大強度的強度。
71. 如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述分析共振峰強度包括分析達到峰值強度之前共振峰上半最大峰值強度的強度。
72. 如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述分析共振峰強度包括分析達到峰值強度之後共振峰上半最大峰值強度的強度。
73. 如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括採集第二生物傳感器輸出參數。
74. 如權利要求73所述的方法，其特徵在於，所述第二生物傳感器輸出參數包括分析峰的位置。
75. 如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數包括分析峰的形狀。
76. 如權利要求75所述的方法，其特徵在於，所述分析峰的形狀包括測定共振峰下的面積。
77. 如權利要求76所述的方法，其特徵在於，所述共振峰下的面積只包括共振峰上兩個半最大強度點連線之上的面積。
78. 如權利要求75所述的方法，其特徵在於，所述分析峰的形狀包括分析半最大強度點處共振峰的寬度。
79. 如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出參數 是與共振帶圖像相關的參數。
80. 如權利要求79所述的方法，其特徵在於，所述共振帶圖像是通過用 點光源照射並透過生物傳感器並對穿透生物傳感器的入射耦合光強度分布進 行成像獲得的。
81. 如權利要求80所述的方法，其特徵在於，用CCD相機進行所述入射 耦合光強度分布成像。
82. 如權利要求79所述的方法，其特徵在於，所述與共振帶圖像相關的 參數是帶的形狀、帶的位置、帶的強度或光強分布。
83. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述分析半最大值處的峰寬 和最大強度所在的位置。
84. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用化合物培 育培養的細胞。
85. 如權利要求84所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括確定所述 化合物是否影響刺激事件對細胞產生的影響。
86. 如權利要求84所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括確定化合 物對於刺激事件對細胞產生的效應的影響。
87. 如權利要求85所述的方法，其特徵在於，對一種或多種其它化合物 進行篩選，確定化合物對於刺激事件對細胞產生的效應的影響。
88. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，採集少於10分鐘、5分鐘、 l分鐘、30秒、10秒、5秒或1秒的生物傳感器輸出。
89. 如權利要求88所述的方法，其特徵在於，採集生物傳感器輸出的時 間基本上等於刺激效應的生物擴散時間極限值。
90. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括提供檢測系統。
91. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，提供多個無標記生物傳感器， 在兩個或多個生物傳感器上培養細胞，在所述兩個或多個生物傳感器上施加剌 激事件，採集所述兩個或多個生物傳感器的生物傳感器輸出。
92. 如權利要求91所述的方法，其特徵在於，對多種細胞穿透深度進行
93. 如權利要求92所述的方法，其特徵在於，每個生物傳感器具有一個穿透深度。
94. 如權利要求91所述的方法，其特徵在於，同時採集兩個或多個生物傳感器的生物傳感器輸出。
95. 如權利要求91所述的方法，其特徵在於，同時進行細胞培養。
96. 如權利要求91所述的方法，其特徵在於，同時對兩個或多個生物傳 感器施加剌激事件。
97. 如權利要求91所述的方法，其特徵在於，在多個生物傳感器上培養 多種類型的細胞。
98. 如權利要求97所述的方法，其特徵在於，所述多種細胞包括區別在 於其中之一經過遺傳改造的至少兩種細胞。
99. 如權利要求98所述的方法，其特徵在於，多種細胞類型中的各種細 胞類型用多種生物傳感器中的不同生物傳感器檢測。
100. 如權利要求l所述的方法蓋率。
101. 如權利要求l所述的方法
102. 如權利要求l所述的方法 加入緩衝液，所述緩衝液與細胞類型和刺激事件類型相容。
103. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述採集生物傳感器輸出 包括以不同入射角的光照射生物傳感器，測定入射光耦合時的入射角。
104. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述採集生物傳感器輸出 包括用不同波長的光照射生物傳感器，測定入射光耦合時的波長。
105. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞處於增殖狀態、 靜息狀態、已分化狀態、特定的氧化還原/氧化狀態或特定的細胞周期狀態。
106. 如權利要求105所述的方法，其特徵在於，通過用生長培養基培養 細胞使細胞處於增殖狀態。
107. 如權利要求105所述的方法，其特徵在於，通過用飢餓培養基培養 細胞使細胞處於靜息狀態。
108. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括分析生物 傳感器輸出。
109. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，進行連續監測，取樣速度 為1秒、3秒、5秒、10秒、20秒、30秒、l分鐘或5分鐘。，其特徵在於，將細胞培養至至少70%覆，其特徵在於，所述細胞包括很多細胞。 ，其特徵在於，所述方法還包括在細胞中
110. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括鑑定刺激 事件對細胞產生的影響。
111. 如權利要求iio所述的方法，其特徵在於，所述鑑定影響包括將生 物傳感器輸出與特徵輸出比較。
112. 如權利要求lll所述的方法，其特徵在於，所述特徵輸出包括動態 物質再分布響應，所述動態物質再分布響應包括至少一個以下階段正-DMR、 負-DMR和淨零-DMR。
113. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞來自細胞系。
114. 如權利要求113所述的方法，其特徵在於，所述細胞系是經遺傳改 造的突變細胞系。
115. 如權利要求110所述的方法，其特徵在於，所述刺激事件包括向細 胞培養物中添加化合物，所述影響是在以下方面的影響化合物對細胞吸收、 分布、代謝或毒性影響。
116. 如權利要求110所述的方法，其特徵在於，所述刺激事件包括向細 胞培養物中添加化合物，所述確定化合物的影響包括對於化合物對細胞產生的 影響的功能性評價和鑑定化合物對於細胞吸收、分布、代謝或毒性的影響。
117. 如權利要求l所述的方法，將生物傳感器輸出與細胞內物質再分布 相關聯。
118. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器的輸出是 可觀察的生物傳感器的反射光的角度或光譜變化。
119. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述採集生物傳感器輸出 包括監測所培養細胞的時間依賴性響應。
120. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞達到至少80%覆 蓋率。
121. 如權利要求119所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器埋在微 板內。
122. 如權利要求119所述的方法，其特徵在於，所述細胞在所述生物傳 感器上生長至少1小時、5小時、IO小時、16小時、24小時、36小時、l周 或2周。
123. —種鑑定細胞狀態的方法，該方法包括在無標記生物傳感器表面上 培養細胞，由此形成細胞-生物傳感器組合，檢測該細胞-生物傳感器組合，其中所述檢測包括鑑定培養細胞所在表面的不均勻性。
124. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器能夠區 分生物傳感器表面與活細胞接觸的區域、與受到刺激事件影響的細胞接觸的區 域和不接觸任何細胞的區域。
125. 如權利要求124所述的方法，其特徵在於，所述受影響的細胞洩漏 了部分胞內組分或者是死細胞。
126. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用化合 物孵育所述細胞-生物傳感器組合。
127. 如權利要求126所述的方法，其特徵在於，所述化合物是化學物質、 生物化學物質、生物分子、藥物或聚合物。
128. 如權利要求126所述的方法，其特徵在於，所述檢測在用化合物孵 育後進行。
129. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，所述檢測時間短於或等 於60、 45、 30、 15、 10、 5、 3、 2或1秒。
130. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，如下所述測定不均勻性 採集生物傳感器輸出，其中所述生物傳感器輸出包括具有最大強度的導向共振 峰，並比較半最大強度(P冊M)處的峰寬。
131. 如權利要求130所述的方法，其特徵在於，所述導向模式是橫向磁 場模式。
132. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器成單個 或複合樣式。
133. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，當所述生物傳感器成復 合樣式，它埋在微板的一個或多個孔內。
134. 如權利要求133所述的方法，其特徵在於，在微板的一個孔內有一 個生物傳感器。
135. 如權利要求133所述的方法，其特徵在於，在微板的一個孔內有多 個生物傳感器，這些傳感器物理上通過隔斷物分開或者相互之間沒有隔斷物。
136. 如權利要求135所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器被隔斷 物理地間隔開來，其中界定孔內區室的隔斷物低於界定微板上各孔的隔斷物。
137. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器是光學 波導生物傳感器。
138. 如權利要求123所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器是光學 波導光柵生物傳感器。
139. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在兩個或多個孔中培養細 胞，其中，對這兩個或多個孔施加刺激事件，所述刺激事件包括向這兩個或多 個孔中添加化合物，採集這兩個或多個孔的生物傳感器輸出，將這兩個或多個 孔的PWHM與對照孔的比較，其中不對對照孔施加刺激事件。
140. 如權利要求139所述的方法，其特徵在於，以高於每孔l、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 30、 45或60秒的速度採集生物傳感器輸出。
141. 如權利要求139所述的方法，其特徵在於，生物傳感器輸出的速度 高於每分鐘60、 30、 15、 10、 7、 5、 4、 3、 2或1孑L。
142. 如權利要求139所述的方法，其特徵在於，比較各孔PWHM的速度高 於每孔l、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 30、 45或60秒。
143. 如權利要求139所述的方法，其特徵在於，比較各孔PWHM的速度高 於每分鐘60、 30、 15、 10、 7、 5、 4、 3、 2或1孑L。
144. 如權利要求139所述的方法，其特徵在於，用單數據點評價化合物的毒性。
145. 如權利要求139所述的方法， 時間依賴性PWHM變化。
146. 如權利要求139所述的方法， 生物傳感器。
147. 如權利要求139所述的方法， 光學的生物傳感器。
148. 如權利要求139所述的方法， 記生物傳感器。
149. 如權利要求139所述的方法， 細胞培養系統上。
150. 如權利要求149所述的方法，
151. 如權利要求150所述的方法，
152. 如權利要求151所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出是其特徵在於，所述生物傳感器是光學其特徵在於，所述生物傳感器是基於其特徵在於，所述生物傳感器是無標其特徵在於，所述生物傳感器安裝在其特徵在於, 其特徵在於， 其特徵在於,所素系統是平板。所述平板是多孔板,所述匹配是微板。
153.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在兩個或多個孔內培養細 胞，其中微板有多個孔，生物傳感器輸出是各孔在指定時間的全傳感器區域TM。模式共振角度帶圖像。
154. 如權利要求153所述的方法，其特徵在於，細胞達到70%覆蓋率。
155. 如權利要求153所述的方法，其特徵在於，剌激包括向所述兩個或 多個孔中添加化合物，其中將加化合物孔的TM。模式共振角度帶寬度與不加化 合物的孔的TM。模式共振角度帶寬度比較。
156. 如權利要求153所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器是基於 波導的生物傳感器。
157. 如權利要求156所述的方法，其特徵在於，所述基于波導的生物傳 感器是基於唚205的光學生物傳感器。
158. 如權利要求153所述的方法，其特徵在於，所述細胞是貼壁細胞。
159. 如權利要求153所述的方法，其特徵在於，所述細胞生長至30%、 50%或90%覆蓋率。
160. 如權利要求153所述的方法，生物傳感器輸出是光學波導光模式光 光譜(OWLS)，導向模式的共振峰或導向模式的共振帶圖像。
161. 如權利要求140所述的方法，其特徵在於，最大強度共振峰位置的 降低表明化合物具有細胞毒性。
162. 如權利要求140所述的方法，其特徵在於，PWHM變寬表示化合物具 有細胞毒性。
163. 如權利要求140所述的方法，其特徵在於，PWHM分裂表示化合物具 有細胞毒性。
164. 如權利要求140所述的方法，其特徵在於，共振帶變寬表示化合物 具有細胞毒性。
165. 如權利要求164所述的方法，其特徵在於，細胞覆蓋率達到至少70%。
166. 如權利要求140所述的方法，其特徵在於，PWHM改變表示化合物對 細胞具有影響。
167. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，生物傳感器裝在微板上。
168. 如權利要求167所述的方法，其特徵在於，生物傳感器埋在微板上 各孔的底部。
169. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器是基於 光學的無標記生物傳感器。
170. 如權利要求166所述的方法， 生物傳感器上。
171. 如權利要求170所述的方法，
172. 如權利要求166所述的方法, 行增殖增強分析或增殖減弱分析。
173. 如權利要求172所述的方法, 量達到30-70%覆蓋率。
174. 如權利要求172所述的方法， 蓋率。
175. 如權利要求172所述的方法， 蓋率。
176. 如權利要求172所述的方法，其特徵在於，用化合物覆蓋所述細胞-其特徵在於， 其特徵在於,所述化合物配在溶液中。 起始細胞的數量足以進其特徵在於，在無化合物時，細胞數其特徵在於，細胞數量達到40-60%覆其特徵在於，細胞數量達到44-55%覆其特徵在於，細胞數量達到50%覆蓋
177. 如權利要求171所述的方法，其特徵在於，在用化合物孵育之前， 培養在生物傳感器上的細胞數量為至少1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000、 10000、 11000、 12000、 13000、 14000、 15000、 16000、 17000、 18000、 19000、 20000、 21000、 22000、 23000、 24000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000或70000個細胞。
178. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，在單個時間點採集生物 傳感器輸出。
179. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，採集的生物傳感器輸出 是光譜。
180. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，採集的生物傳感器輸出 是各生物傳感器全區域TM。模式共振角度帶的圖像。
181. 如權利要求179所述的方法，其特徵在於，採集的生物傳感器輸出 是各生物傳感器全區域TM。模式共振角度帶的圖像。
182. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，生物傳感器輸出包括總 角度變化，其中總角度變化減小表示化合物是細胞增殖抑制劑。
183. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，生物傳感器輸出包括總 角度變化，其中總角度變化增大表示化合物是細胞增殖抑制劑。
184. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，生物傳感器輸出包括入射耦合光強度，將入射耦合光強度繪製成光入射角的函數的圖。
185. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，細胞在生物傳感器上培 養至少1小時、5小時、IO小時、16小時、24小時、36小時、l周或2周。
186. 如權利要求166所述的方法，其特徵在於，生物傳感器輸出包括耦 合模式。
187. 如權利要求186所述的方法，其特徵在於，所述耦合模式是橫向磁 場模式(TM。)。
188. 如權利要求187所述的方法，其特徵在於，將所述TM。模式繪製成最 初接種細胞數量的函數的圖。
189. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞具有受體酪氨酸 激酶(RTK)，其中所述細胞懸浮在含有血清的培養基中，血清在培養基中的 濃度允許細胞在生物傳感器表面上附著和生長，其中所述細胞貼壁在生物傳感 器表面。
190. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括在37。C 用飢餓培養基餓養貼壁細胞，其中所述飢餓培養基是含有低濃度血清的培養 基。
191. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括在培養 基中至少加一次緩衝液。
192. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述刺激事件包括向培 養基中添加RTK的配體。
193. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述培養基不含PDGF(血 小板衍生生長因子)、EGF、胰島素、TGF-a、胰島素樣生長因子I (IGF-1)和 神經生長因子(NGF)。
194. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述飢餓培養基中的血 清或胎牛血清(FBS)的濃度低於約O. 1%。
195. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述時間依賴性響應持 續至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 36或48小時。
196. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器埋在多 孔微板底部，在兩個或多個孔中培養不同類型的細胞，對這兩個或多個孔施加 剌激事件，所述刺激事件包括向這兩個或多個孔中添加RTK的配體，採集這兩個或多個孔的生物傳感器輸出，所述生物傳感器輸出是不同類型細胞的時間依 賴性響應。
197. 如權利要求196所述的方法，其特徵在於，所述不同類型的細胞需 要不同的培養條件。
198. 如權利要求196所述的方法，其特徵在於，測定或確定所述不同類 型細胞的RTK的表達水平或細胞表面表達水平。
199. 如權利要求196所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用化合 物孵育細胞，和確定該化合物是否調節RTK信號傳遞。
200. 如權利要求189所述的方法，其特徵在於，所述細胞具有較高的RTK 表達水平，訴輸生物傳感器埋在多孔微板底部，在兩個或多個孔中培養細胞， 對這兩個或多個孔施加刺激事件，所述刺激事件包括向這兩個或多個孔中添加 RTK的配體，其中向這兩個或多個孔中添加不同濃度的RTK配體，採集這兩個 或多個孔的生物傳感器輸出，所述生物傳感器輸出是不同孔中細胞的劑量依賴 性響應和時間依賴性響應。
201. 如權利要求200所述的方法，其特徵在於，比較所述細胞的劑量依 賴性響應和時間依賴性響應。
202. 如權利要求200所述的方法，其特徵在於，測定配體強度。
203. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括分析細胞 的生物物質釋放的生物傳感器輸出，據此分析細胞中細胞骨架的狀態。
204. 如權利要求203所述的方法，其特徵在於，所述細胞的生物物質釋 放依賴於成孔試劑誘導的細胞透性。
205，如權利要求203所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括向細胞 培養物中添加成孔試劑。
206. 如權利要求205所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器輸出是 時間依賴性的光學響應。
207. 如權利要求205所述的方法，其特徵在於，所述成孔劑是能夠在細 胞表面膜中形成孔的化學或生物化合物。
208. 如權利要求207所述的方法，其特徵在於，所述成孔劑是皂苷、毛 地黃皂苷、菲律賓菌素或鏈球菌溶血素O。
209. 如權利要求205所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括在向細 胞培養物中添加成孔試劑之後向細胞培養物中添加化合物。
210. 如權利要求209所述的方法，其特徵在於，對一種或多種其它化合 物進行篩選，確定化合物是否能夠幹擾細胞內的細胞骨架結構。
211. 如權利要求205所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括在向細 胞培養物中添加成孔試劑之前向細胞培養物中添加化合物。
212. 如權利要求211所述的方法，其特徵在於，對一種或多種其它化合 物進行篩選，確定化合物是否能夠幹擾細胞內的細胞骨架結構。
213. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用能夠檢 測標記的儀器檢測標記的步驟。
214. 如權利要求213所述的方法，其特徵在於，所述標記是螢光標記、 放射性標記或磷光標記。
215. 如權利要求213所述的方法，其特徵在於，所述檢測標記的步驟與 監測生物傳感器的步驟同時進行。
216. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器有兩個區 域，第一個區域沒有含物質混合物沉積，第二個區域有含物質混合物沉積，在 將細胞孵育於所述傳感器上時，第二區域上的細胞被所述物質轉染。
217. 如權利要求216所述的方法，其特徵在於，所述物質是靶基因、靶 蛋白、靶蛋白與標籤蛋白的融合蛋白、靶的RNAi，靶的抗體、反義寡核苷酸及 其衍生物、反基因寡核苷酸及其衍生物。
218. 如權利要求217所述的方法，其特徵在於，所述標籤蛋白是His-tag、 GFP蛋白或衍生物。
219. 如權利要求218所述的方法，其特徵在於，所述物質與一種試劑復 合從而使得細胞在與傳感器的物質提呈區域上貼壁時能夠攝取該物質。
220. 如權利要求216所述的方法，其特徵在於，所述區域是按照光柵結 構在半個傳感器表面選擇性沉積含物質混合物形成的。
221. —種確定活細胞狀態的方法，該方法包括觀測細胞成分的動態物質 再分布，所述觀測步驟在共振波導光柵生物傳感器中進行。
222. —種測定化合物對細胞產生的影響的方法，所述方法包括在生物 傳感器上培養細胞，首次洗滌細胞，餓養細胞，將化合物與細胞共孵育和用生 物傳感器記錄信號。
223. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括在餓養 步驟後用緩衝液洗滌的步驟。
224. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，細胞生長至覆蓋率超過 90%。
225. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，洗滌細胞兩次。
226. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，餓養細胞包括僅在DMEM 中培養細胞。
227. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，餓養時間為l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、
228. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，餓養進行一夜。
229. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，洗滌緩衝液含1X常規 Hank平衡鹽溶液、20mM HEPES緩衝液，pH7. 0，並含有2. 5mM丙磺舒。
230. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述信號是鈣信號。
231. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，記錄6分鐘的鈣信號， 以6秒為間隔。
232. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器具有 HTS7000 BioAssay Reader。
233. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述方法在室溫下進行。
234. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述生物傳感器是Corning⑧ EpicTM角度訊問系統。
235. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，在橫向磁場模式中使用 所述生物傳感器。
236. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，在p-極化TM。模式中使用 所述生物傳感器。
237. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，用洗滌緩衝液稀釋化合物。
238. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述洗滌緩衝液含有l X常規Hank平衡鹽溶液、20mM HEPES緩衝液，pH7. 0。
239. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，餓養細胞在不含胎牛血 清的培養基中進行。
240. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，化合物溶液中二甲亞碸 的含量低於O. 05%、 0.1%、 0.5%、 1%、 2%或5%。
241. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，餓養在37C進行。
242. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，餓養在空氣/5%0)2中進行。
243. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，在用化合物溶液孵育細 胞之前，用不含化合物的溶液預處理細胞，直至達到穩定期。
244. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，生物傳感器鑑定共振帶 心中位置的像素密度變化。
245. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，生物傳感器測定共振帶 的角度變化。
246. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將生物 傳感器數據繪製成與時間相關的圖。
247. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，信號增強(P-躍R)表示 傳感體積內生物分子的量增加，信號減弱(N-DMR)表示傳感體積內生物分子 的量減少。
248. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，該方法鑑定細胞和化合 物的特徵。
249. 如權利要求248所述的方法，其特徵在於，所述特徵包括P-畫R階 段和其後的N-DMR階段，P-DMR階段出現的速度高於N-DMR階段的衰減速度。
250. 如權利要求248所述的方法，其特徵在於，所述特徵包括一個直至 到達一高位平臺的P-DMR階段。
251. 如權利要求248所述的方法，其特徵在於，所述特徵包括兩個連續 的P-DMR事件，其中第一個P-DMR階段升至一高水平的的速度高於第二個P-DMR 階段升至第二個高水平的的速度。
252. 如權利要求248所述的方法，其特徵在於，所述特徵沒有任何高於 幹擾信號水平的DMR信號。
253. 如權利要求222所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將生物 傳感器的信號繪製成與化合物濃度或化合物種類相關的圖。
254. 如權利要求105所述的方法，其特徵在於，所述氧化還原/氧化狀態 是通過用化合物處理一定時間形成的。
255. 如權利要求254所述的方法，其特徵在於，細胞用化合物處理l小 時、4小時、8小時、16小時、24小時、48小時或64小時。
256. 如權利要求105所述的方法，其特徵在於，如下監測所述氧化還原/氧化狀態向細胞添加外源氧化劑，監測氧化劑誘導的光學輸出。
257. 如權利要求256所述的方法，其特徵在於，所述氧化劑選自H202、Mn04 _、 Cr03、 Cr2072—、 0s04。
258. 如權利要求254所述的方法，其特徵在於，所述化合物來自隨機化 合物文庫或是天然生物物質。
全文摘要
公開了使用無標記光學生物傳感器進行細胞檢測的組合物和方法。在某些實施方式中，所述檢測可用高通量方法進行，且可以是多路的。
文檔編號A61B5/05GK101500481SQ200680019857
公開日2009年8月5日 申請日期2006年4月5日 優先權日2005年4月5日
發明者A·M·菲裡, J·拉希瑞, N·H·方丹, 曄 方, 阮寶祺 申請人:康寧股份有限公司