結合膜結合的IgE的凋亡性抗IgE抗體的製作方法

2023-08-09 20:06:36

專利名稱：：結合膜結合的IgE的凋亡性抗IgE抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及凋亡性抗IgE抗體、其編碼核酸、其治療組合物、及其在IgE介導的病症的治療中的用途。
背景技術：
：變態反應/變應性/過敏(allergy)指其中針對環境抗原的免疫應答引起組織炎症和器官功能障礙的某些疾病。每一種變應性疾病的臨床特徵反映了所涉及器官或組織中免疫學誘導的炎症應答。這些特徵一般獨立於抗原的化學或物理特性。變應性應答的多樣性源於不同免疫學效應器途徑的參與，每一種生成獨特的炎症型式。變應性在全世界都是常見的。然而，具體疾病的偏好在不同年齡組、性別和種族間變化。對具體變應原的敏感性的流行性由遺傳偏好及由對變應原暴露負有責任的地理和文化因素二者決定。變應性的臨床狀態只影響遭遇每一種變應原的一些個體。變應原暴露時變應性疾病的發生不^f又要求在先"致敏"，而且要求決定反應定位於特定器官的其它因素。在變應原暴露誘導的變應性疾病之前的一個生物學過程是稱作"致敏"或致敏期的免疫應答。一旦發生致敏，個體直到後續變應原暴露才會變得有症狀。致敏的效果也稱作免疫記憶。誘導炎症的主要途徑之一是經由免疫球蛋白E(IgE)。依靠其作為肥大細胞和嗜鹼性細胞表面上變應原受體的作用，IgE在變應性中發揮重要作用。通過分子的Fc部分結合至稱作FcsRI的高親和力細胞表面受體，IgE抗體固定至肥大細胞和嗜鹼性細胞的表面。在多價變應原分子結合佔據這些受體的抗體時，變應性反應啟動。結果是FceRI的橋接，其繼而在胞內發信號，引起炎症介導物的釋放和活化，所述炎症介導物為組胺，白三烯，趨化因子，血小板活化因子，和蛋白酶。這些被活化的介導物局部地發揮作用並引起升高的血管通透性、血管舒張、平滑肌收縮和粘液腺分泌。此類事件在臨床上稱作立即期或早期，而且在變應原暴露後的前15-30分鐘內發生。在隨後的12小時裡，應答尚未完全了解的其它化學介導物，產生炎症細胞的漸進性組織浸潤，自嗜中性細胞進行至嗜曙紅細胞再至單個核細胞。變應原暴露後6-12小時的這段時間稱作晚期且以細胞炎症的臨床表現為特徵。鑑於晚期反應，尤其是在肺中，是在早期反應缺失的情況中發生的，仍然尚未完全了解晚期反應是否必然是IgE介導的。IgE以膜結合形式及以分泌形式存在。這些不同形式似乎是剪接變體。通過下調IgE來實現治療效果的先前辦法主要靶向分泌形式(例如XOLAIR⑧omalizumab),用以阻止或解除免疫系統的進一步"武裝"。IgE的分泌形式是較短的形式，基本是位於CH4結構域的Fc區末端(圖l)，而較長的形式包括額外的C端殘基，包括由稱作M1/M1，和M2的外顯子編碼的肽。雖然已經有人報告了兩種不同形式的膜結合IgE，二者均有和無稱作M1，的52個胺基酸的區段[Batista等，J.Exp.Med.184:2197-2205(1996)]，但是發明人不能驗證任何膜結合形式都缺乏此M1，區段。使用與分泌形式IgE結合的抗IgE抗體進行的常規療法導致游離血清IgE的降低，但不降低總血清IgE[Casale等，J.AllergyClin.Immunol.100(1):110-121(1997)]。已經注意到，在抗原信號缺失的情況中，交聯的B細胞受體(即免疫球蛋白)傾向於凋亡。令人驚訝的是，申請人已經發現，用抗IgE抗體靶向IgE的M1，區段能導致誘導B細胞凋亡。由於活化的B細胞的後代能導致生成和分泌分泌形式IgE的漿細胞，因此經由凋亡來消減生成IgE的B細胞為變應性/變態反應(allergy)的治療提供了一種新的治療辦法。發明概述本發明提供了凋亡性抗IgE抗體或其功能性片段，及其在IgE介導的病症的治療中的用途。本發明進一步提供了抑制B細胞生成和分泌IgE的組合物和方法。本發明進一步提供了特異性消減生成IgE的B細胞和降低總血清IgE的組合物和方法。在一個實施方案中，本發明提供了抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。在一個具體的方面，所述抗體特異性消減生成IgE的B細胞。在另一個具體的方面，所述抗體降低總血清IgE。在另又一個具體的方面，所述抗體降低總血清IgE和游離血清IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述^t體結合起源為人、恆河浙吳(rhesusmonkey)和獼浙吳(cynomolgusmonkey)的IgE。在又一個具體的方面，所述抗體是嵌合的。在又一個具體的方面，所述抗體是人源化的。在又一個方面，所述抗體是人的。在另一個實施方案中，本發明提供了抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合與圖5中所鑑定的肽對應的任一M1，表位。在一個具體的方面，所述抗體特異性結合與選自下組的抗體所結合的表位相同的表位47H4，7A6,26A11,47H4v5，7A6vl和26Allv6。在另一個具體的方面，所述抗體結合與選自下組的肽對應的表位肽4(SEQIDNO:8)，肽5(SEQIDNO:9)，肽7(SEQIDNO:ll)或肽8(SEQIDNO:12)。在另又一個具體的方面，所述抗體結合肽4(SEQIDNO:8)。在又另一個實施方案中，本發明提供了IgE的Ml，表位，其選自下組肽4(SEQIDNO:8)，肽5(SEQIDNO:9)，肽7(SEQIDNO:ll)或肽8(SEQIDNO:12)。在一個具體的方面，所述Ml，肽是肽4(SEQIDNO:8)。在又一個實施方案中，本發明提供了抗IgE抗體，其以鼠抗IgE/Ml，抗體47H4或其人源化變體對人IgE的Scatchard結合親和力相當的對人IgE的Scatchard結合親和力特異性結合IgE的Ml，區段。在一個具體的方面，所述親和力相當於47H5的結合親和力。在另一個具體的方面，所述親和力介於0.30和0.83nm之間。在另又一個具體的方面，所述親和力相當於47H4v5的結合親和力。在又一個具體的方面，所述親和力為約1.5nm。在又一個實施方案中，本發明提供了抗IgE/Ml，抗體，其包含在圖6A-6F和圖20-25任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在一個具體的方面，所述抗體進一步包含在圖6A-6F和圖20-25任一中出現的抗體序列的重鏈和輕鏈的可變區。在另一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的全長重鏈和輕鏈。在另又一個具體的方面，所述抗體序列的重鏈和輕鏈在圖6A-6F任一中顯示。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16,7A6，7A6vl，47H4，47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體為47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體是無巖藻糖基化的(afucosylated)。在又一個實施方案中，本發明提供了組合物，其包含與至少一種藥學可接受載體組合的抗IgE/Ml，抗體，該抗IgE/Ml，抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4,47H4vl-6。在另一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在另又一個具體的方面，所述抗體是無巖藻糖基化的。在又一個實施方案中，本發明提供了組合物，其包含與一種或多種選自下組的藥物組合的抗lgE/M1，抗體，該抗lgE/M1，抗體包含在圖8-13任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR:抗IgE抗體，抗組胺劑(antihistamine),支氣管擴張藥(bronchodilator),糖皮質激素(glucocorticoid),NSAID,TNF拮抗劑，整耳關蛋白拮抗劑，免疫抑制劑(immunosuppressiveagent),IL-4拮抗劑，IL-13拮抗劑，雙重IL-4/IL-13拮抗劑，DMARD,與B細胞表面標誌物結合的抗體和BAFF拮抗劑。在一個具體的方面，所述組合物進一步包含至少一種藥學可接受載體。在又一個實施方案中，本發明提供了分離的核酸，其編碼在圖6A-6F任一中出現的抗IgE/Ml，抗體的重鏈HVR。在一個具體的方面，所述分離的核酸進一步包含編碼在圖6A-6F任一中出現的抗體的輕鏈HVR的核酸。在另一個具體的方面，所述抗體是嵌合的。在另又一個具體的方面，所述抗體是人源化的。在又一個方面，所述抗體是人的。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16，7A6,7A6vl，47H4，47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體是無巖藻糖基化的。在又一個方面，所述核酸進一步構成對於所述核酸的表達合適的載體。在又一個具體的方面，所述載體進一步構成對於所述核酸的表達合適的宿主細胞。在又一個具體的方面，所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞。在又一個具體的方面，所述真核細胞是哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)。在又一個實施方案中，本發明提供了製備特異性結合IgE的Ml，區段的抗IgE/Ml，抗體或其功能性片段的方法，包括在適合於生成此類抗體或片段的條件下培養含有對於表達合適的形式的、編碼此類抗體或片段的核酸的宿主細胞，並回收所述抗體或片段。在又一個實施方案中，本發明提供了製品，其包含封裝本文中所公開的組合物的容器和指明用於IgE介導的病症的治療的用途的包裝插頁。在一個具體的方面，所述製品是管形瓶(vial)。在另一個具體的方面，所述製品是預裝填注射器(pre-filledsyringe)。在另又一個具體的方面，所述預裝填注射器被進一步包含在注射裝置(injectiondevice)內。在又一個具體的方面，所述注射裝置是自我注射器(auto-injector)。在又一個實施方案中，本發明提供了特異性消減生成IgE的B細胞的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。在一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在另一個具體的方面，所述方法降低總血清IgE。在另又一個具體的方面，所述方法降低游離血清IgE和總血清IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16，7A6,7A6vl，47H4，47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體具有ADCC活性。在又一個實施方案中，本發明提供了治療IgE介導的病症的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。在一個具體的方面，所述抗體特異性消減生成IgE的B細胞。在另一個具體的方面，所述抗體降低總血清IgE。在另又一個具體的方面，所述抗體降低總IgE和游離IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕4連HVR。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16,7A6,7A6vl，47H4,47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體具有ADCC活性。在又一個具體的方面，所述IgE介導的病症選自下組變應性鼻炎(allergicrhinitis),哞喘(asthma)(例如變應性哮喘(allergicasthma)和非變應性詳喘(non-allergicasthma))，淨爭應'l"生皮炎(atopicdermatitis),變應'l"生胃腸病(allergicgastroenteropathy)，超每文反應(hypersensitivity)(i"列長口過壽丈反應(anaphylaxis),蕁麻滲(urticaria),食物過敏(foodallergies)等)，變應性支氣管肺麴黴病(allergicbronchopulmonaryaspergillosis),寄生蟲病(parasiticdiseases),間質性膀胱炎(interstitialcystitis),高IgE症候群(hyper-IgEsyndrome),共濟失調性毛細血管擴張症(ataxia-telangiectasia)，威斯科特-奧爾德裡奇症候群10(Wiskott-Aldrichsyndrome),無胸&泉'淋巴組織增生(athymiclymphoplasia)，IgE骨骨逸瘤(IgEmyeloma)和移才直物抗宿主反應(graft-versus國hostreaction)。在還有又一個方面，所述IgE介導的病症是食物過敏(foodallergy),過敏反應(anaphylaxis),接觸性皮炎(contactdermatitis)和變態反應性紫癜(allergicpurpura)。在又一個實施方案中，本發明提供了治療IgE介導的病症的方法，包括與治療有效量的至少一種選自下組的藥物組合地施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡抗IgE抗體，抗組胺劑，支氣管擴張藥，糖皮質激素，NSAID,解充血藥(decongestant),鎮咳齊寸(coughsuppressant),鎮痛藥(analgesic),TNF4吉4元齊寸，整聯蛋白拮抗劑，免疫抑制劑，IL-4拮抗劑，IL-13拮抗劑，雙重IL-4/IL-13拮抗劑，DMARD，與B細胞表面標誌物結合的抗體和BAFF拮抗劑。在一個具體的方面，所述抗體特異性消減生成IgE的B細胞。在另一個具體的方面，所述抗體降低總血清IgE。在另又一個具體的方面，所述抗體降低總IgE和游離IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4,47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體具有ADCC活性。在又一個實施方案中，本發明提供了治療IgE介導的病症的方法，包括在變應性病症(變態反應性病症)的已知治療方法的施用之前、同時或之後施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體的組合治療，所述抗IgE/Ml，抗體特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。在一個具體的方面，所述組合包含抗IgE抗體、抗組胺劑、支氣管擴張藥、糖皮質激素、非類固醇抗炎藥、免疫抑制劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、雙重IL-4/IL-13拮抗劑、解充血藥、鎮咳劑或鎮痛藥的施用。在另一個具體的方面，所述抗IgE/Ml，抗體是與變應原脫敏的治療方案組合施用的。在一個具體的方面，所述抗體特異性消減生成IgE的B細胞。在另一個具體的方面，所述抗體降低總血清IgE。在另又一個具體的方面，所述抗體降低總IgE和血清IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4，47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體具有ADCC活性。在又一個實施方案中，本發明提供了預防變應原誘導的IgE生成的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。在一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在另一個具體的方面，所述方法特異性消減生成IgE的B細胞。在另又一個具體的方面，所述方法降低總血清IgE。在又另一個具體的方面，所述方法降低游離血清IgE和總血清IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4,47H4vl-6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體具有ADCC活性。在又一個實施方案中，本發明提供了降低變應原誘導的IgE生成的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。在一個具體的方面，所述抗體包含在圖6A-6F任一中出現的抗體的重鏈和輕鏈HVR。在另一個具體的方面，所述方法特異性消減生成IgE的B細胞。在另又一個具體的方面，所述方法降低總血清IgE。在又一個具體的方面，所述方法降低游離血清IgE和總血清IgE二者。在又一個具體的方面，所述血清IgE是變應原特異的。在又一個具體的方面，所述抗體選自下組26A11,26Allvl匿16，7A6,7A6vl，47H4,47H4vl隱6。在又一個具體的方面，所述抗體是47H4v5。在又一個具體的方面，所述抗體具有ADCC活性。在又一個實施方案中，本發明提供了對於任何先前所述方法有用的組合物。在又一個實施方案中，本發明提供了組合物用於任何先前所述方法的用途。在又一個實施方案中，本發明提供了於2007年3月21日保藏於ATCC的鼠雜交瘤，其名稱選自下組7A6.18,1C11.10.20,47G4.6.2,47H4.12.10,42H4.6.9,42A5.20.il，26A11.6.5,51D2.22,15，45C1.6.14,26B11.3.12,28E9.12.9。在一個具體的方面，本發明提供了由所保藏的雜交瘤分泌的抗體。在又一個實施方案中，本發明提供了表達IgE的人Ml，區段的轉基因動物。附圖簡述圖1A-B是人(SEQIDNO:1)、恆河猴(SEQIDNO:2)和獼猴(SEQIDNO:3)的IgE的選定恆定鏈區的比對。顯示了CH2、CH3、CH4、Ml'、跨膜和胞內域的大致位置。圖2A-2C是顯示了各種抗M1，抗體的特異性的FACSScatchard圖。圖2A-1至2A-6顯示了針對短型IgE(缺失M1，)的結合，而圖2B-l至2B-6顯示了針對長型(具有M1，)的結合。圖2C-l至2C-6顯示了針對由U266細胞系表達的IgE的結合。帶陰影的曲線顯示對照抗體的螢光強度，而不帶陰影的曲線顯示測試抗體的相對螢光。圖2D-F顯示了鼠抗IgE/Ml，抗體47H4、26A11和7A6的結合特異性。圖2D顯示了47H4結合人、恆河猴、和獼猴IgE/Ml',但不結合缺乏Ml，的IgE。圖2E顯示了47H4結合U266，而26A11和7A6不然。圖2F顯示了47H4和7A6結合恆河猴和獼猴M1，二者，而26A11隻結合恆河猴的。圖2G-I顯示了人源化抗IgE/Ml，抗體47H5v5、26Allv6和7A6vl的結合特異性。圖2G顯示了所有三種人源化變體47H4v5、26Allv6和7A6vl都是對IgE-Ml，特異性的，但對缺乏Ml，的IgE不然。圖2H顯示了變體47H4v5和26Allv6結合U266,而7A6vl不然。圖2I顯示了47H4v5和7A6vl結合恆河猴和獼猴M1，，而26A11v6隻結合恆河猴M1'。圖3A-L是顯示各種抗M1，抗體(使用圖3M中指示的連續稀釋度)的相對結合親和力的FACS圖。圖3N顯示了每種抗體的相對親和力。圖30總結了鼠抗體47H4、26A11和7A6的親和力，如通過針對人、恆河猴和獼猴M1，的Scatchard分析所測量的。除非另有說明，所報告的數值是平均值均值。圖3P總結了所指明的抗體47H4和26A11人源化變體的親和力，如通過針對人、恆河猴和獼賓吳M1，的Scatchard分析所測定的。圖4A-D顯示了抗Ml，抗體的相對結合/阻斷研究。圖4A-l至4A-20是顯示阻斷或部分阻斷結合的抗體的FACS圖。圖4B是顯示阻斷其它抗體結合的相對能力(部分地或完全地，使用l:l摩爾比)的二維圖。圖4C是更加關注具體指明的抗體的二維圖，其中以10:1的摩爾比重複了阻斷研究。圖4D是顯示源自表位結合/阻斷研究的分組的示意圖。圖5A-C顯示了使用47H4、7A6和26A11實施的表位結合研究。圖5A顯示了用於測定表位結合的包括毗鄰N端和C端殘基的M1，區段(SEQIDNO:3)及Ml，肽l-5(SEQIDNO:5-19)。圖5B和5D顯示了親本鼠抗體47H4結合肽4，7A6結合肽4和5，而26A11結合肽7和8。圖5C和5E顯示了人源化變體47H4v5結合肽4，而7A67vl結合肽4和5，而26A1lv6結合肽7和8，由此保留親本鼠抗體的表位特異性。圖6A-F顯示了鼠抗體26A11、7A6和47H4及其各種人源化變體的可變輕鏈和重鏈序列。各位置是依照Kabat編號的，而且框示了嫁接至可變共有網絡(network)(用於輕鏈的Kl，用於重鏈的亞組III)的高變區。圖6A相對於人Kl輕鏈(SEQIDNO:20)顯示了26A11(SEQIDNO:21)和人源化變體1，4(SEQIDNO:22)、變體2,5(SEQIDNO:23)、變體3,6(SEQIDNO:24)、變體13，15(SEQIDNO:25)和變體14，16(SEQIDNO:26)的可變輕鏈。圖6B相對於NO:28)的可變輕鏈。圖6C相對於人Kl輕鏈(SEQIDNO:20)顯示了47H4(SEQIDNO:29)和人源化變體1,3(SEQIDNO:30)和變體2，4-6(SEQIDNO:31)的可變輕鏈。圖6D相對於人III重鏈(SEQIDNO:32)顯示了26A11(SEQIDNO:33)和人源化變體l-3，13，14(SEQIDNO:34)和變體4-6，15,16(SEQIDNO:35)的可變重鏈。圖6E相對於人重鏈(SEQIDNO:34)顯示了7A6(SEQIDNO:26)和人源化變體l(SEQIDNO:37)的可變重鏈。圖6F相對於人III重鏈(SEQIDNO:32)顯示了47H4(SEQIDNO:38)和人源化變體1,2(SEQIDNO:39)、變體3-4(SEQIDNO:40)、變體5(SEQIDNO:41)和變體6(SEQIDNO:41)的可變重《連。圖7A-G顯示了親本抗M1，抗體在受IgE-Ml，轉染的Daudi細胞中的凋亡活性。圖7A是基本上顯示IgM以高於IgE的水平表達的FACS圖。圖7B顯示了交聯抗IgM[F(ab，)2]抗體和應用喜樹鹼分別在誘導凋亡中的影響。對膜聯蛋白染色呈陽性但對PI染色呈陰性的細胞正在死去，而對膜聯蛋白和PI二者染色都呈陽性的細胞是死的。圖7C是總的觀察到的凋亡的圖示，其中淺色柱顯示膜聯蛋白呈(+)和PI呈(-)的細胞，而暗色柱顯示膜聯蛋白呈(+)和PI呈(+)的細胞。圖7D-7G是抗M1，在25、10、1、0.1、0.01和0.001jig/ml的濃度誘導的凋亡的圖示。圖7D顯示了應用A1表位組的M1，抗體的結果，包括7A6、47H4、47G4、42A5、42H4(以及對照MAE-11和GP120)，沒有交聯。圖7E顯示了應用A2表位組(包括1C11、26A11、51D2、45C1)和B/C表位組(包括26B11和28E9)的M1，抗體的結果，沒有交聯。圖7F顯示了有交聯的表位組A1，而圖7G顯示了有交聯的表位組A2和B/C。圖8A-B顯示了人源化抗M1，變體在用IgE-Ml，轉染的、用各種人源化抗Ml，抗體變體在25、10、1、0.1、0.01和0.001嗎/ml的濃度處理的Daudi細胞中的凋亡活性。圖8A顯示了人源化變體47H4v5、26A1lv6和7A6vl在30-40。/o的較高濃度水平範圍內誘導凋亡(即10-25嗎/ml47H4和26A11變體，1、IO和25嗎7A6變體)。圖8B顯示了相同抗體對IgE-Ml，轉染的、在存在山羊抗人IgGF(ab，)2交聯抗體的情況中處理的Daudi細胞的凋亡活性。所有抗體誘導70-90°/。的最大限度凋亡水平，其中凋亡活性在高濃度有一些降低(例如47H4-vl、-v2、26A11-vl、-vl4)。圖8C顯示了野生型和無巖藻糖基化47H4v5二者能夠在相似水平誘導凋亡。圖9A-B1-2顯示了鼠抗M1，抗體在Daudi-IgE/M1，細胞中誘導釣流的能力。圖9A是顯示抗IgM和MAEll的效果的對照，而圖9B1-B2顯示應用所示鼠抗M1'抗體的效果。圖10顯示了人源化抗IgE/Ml，抗體47H4v5野生型和無巖藻糖基化變體誘導ADCC的能力。雖然野生型和無巖藻糖基化變體誘導類似的最大限度細胞毒性，但是無巖藻糖基化變體("AF，)比野生型更有效力(EC50AF0.83nM，EC50wt6.6nM)。圖11A-l1F是鼠抗IgE/Ml，抗體的重鏈和輕鏈的全長序列。可變區以斜體顯示，而HVR(高變區)標有下劃線。圖11A顯示了鼠抗體7A6的重鏈和輕鏈(分別為SEQIDNO:43和44)。圖11B顯示了鼠抗體47H4的重鏈和輕鏈(分別為SEQIDNO:45和46)。圖IIC顯示了鼠抗體26A11的重鏈和輕鏈(分別為SEQIDNO:47和48)。圖IID顯示了鼠抗體45C1的重鏈和輕鏈(分別為SEQIDNO:49和50)。圖IIE顯示了鼠抗體28E9的重鏈和輕鏈(分別是SEQIDNO:51和52)。圖11F顯示了鼠抗體1C11的重鏈和輕鏈(分別是SEQIDNO:53和54)。圖12A-I演示了鼠抗IgE/Ml，抗體在特應性hu-SCID模型中抑制生成血清IgE和IgE的漿細胞的生成所述IgE的能力。圖12A是實驗設計的圖示。圖12B-C顯示了鼠抗IgE/Ml，抗體處理將IgE水平降低65-840/。。圖12D-E顯示了在體內IgE生成細胞的減少為19-69%。圖12F-G顯示了其它免疫球蛋白(例如IgG1-4、IgA、IgM)的水平相對不受影響。圖12H-I顯示了沒有觀察到脾的漿細胞總數的減少。圖13A-H顯示了人源化變體47H4v5對特應性hu-SCID模型中免疫球蛋白水平的影響。圖13A是實驗設計的圖示。圖13B-D顯示血清IgE降低了790/。，而且生成IgE的漿細胞降低了75%。圖13E-F顯示了其它血清免疫球蛋白的水平沒有降低。圖13G-H顯示了總漿細胞水平沒有降低，如此證明了47H4特異性減少生成IgE的漿細胞，其佔總漿細胞的很小比例。圖14A-D圖示了huMl，敲入小鼠的生成。圖14A顯示了Ml，外顯子在小鼠IgE基因座上的定位。圖14B顯示了小鼠IgE基因座中導致目標等位基因創建的重組的示意圖。圖14C顯示了野生型小鼠中668bp條帶和Ml，敲入小鼠中457bp條帶的PCR基因分型。圖14D顯示了Southern印跡，其中野生型小鼠的7.4kBHindin片段變成hu-Ml，敲入小鼠中的3kB片段，而14.1kBBamHI片段變成hu-Ml，敲入等位基因中的18.1片段。顯示了野生型和雜合兩種小鼠。圖15A-I顯示了抗lgE/Ml，抗體在初次(primary)免疫應答中阻止IgE生成的能力。圖15A是顯示實驗設計的時間線的示意圖，包括施用TNP/OVA和抗IgE/Ml，抗體。圖15B是抗原特異性IgE水平隨時間的圖，顯示了雖然對照動物中的抗原特異性IgE水平(即gpl20)在第8天和第14天之間達到峰水平，但是抗IgE/Ml，阻止任何升高，而且測量到的抗原特異性IgE水平與未免疫小鼠沒有顯著差異。圖15C-D顯示了抗IgE/Ml，處理阻止第8天和第14天抗原特異性血清IgE的升高，而且與未免疫小鼠沒有統計學差異(圖15E)。圖15F-I顯示了在實驗的28天裡抗原特異性IgGl水平不受抗IgE/Ml，的顯著影響(除了第15天的適度差異)。圖16A-K顯示了抗lgE/Ml，抗體在記憶或再次(second)免疫應答中阻止抗原特異性IgE生成的能力。圖16A是顯示二次加強免疫TNP-OVA和施用抗IgE/Ml，抗體(其在第28天首次施用)的時間線的示意圖。圖16B是抗原特異性IgE水平隨時間的圖，顯示了針對第28天TNP-OVA加強免疫的再次IgE應答更加快速，在4天後而非初次應答中的8-9天後達到峰值。圖16C-D顯示了抗IgE/Ml，處理的動物中的抗原特異性IgE水平與同種型對照相比顯著降低，到第32天降低了59-65%，而到第35天降低了90-93%。圖16E顯示了到第42天(初始施用抗IgE12天)，抗原特異性IgE水平降低至與未接觸抗原的對照小鼠沒有統計學差異的水平。圖16F-H顯示了在第28天和第49天之間，施用抗16IgE/Ml，將血清IgE水平降低了74-84%，抗原特異性IgE的平均日水平也降低了74-83%。圖16I-K顯示了抗原特異性IgGl水平不受抗IgE/Ml，的顯著影響。圖17A-D圖示了抗IgE/Ml，抗體預防性降低IgE應答巴西鉤蟲(Nippostrongylusbrasiliensis)("NB")感染而生成的能力。圖17A是顯示實驗設計的示意圖。自第0天開始，直至第21天，每周三次處理動物。圖17B顯示了隨時間的應答NB感染及抗IgE/Ml，和對照抗體的IgE水平。圖17C-D顯示了在第15天，抗lgE/Ml，處理的動物具有降低的血清IgE水平，與未感染小鼠沒有統計學顯著差異。圖18A-1圖示了抗lgE/M1，抗體治療性處理應答巴西鉤蟲("NB，，)感染的峰IgE的能力。圖18A是顯示實驗設計的示意圖。動物在第11天和第21天之間每周處理三次。圖18B顯示了隨時間的應答NB感染及抗IgE/M1，和對照抗體的IgE水平。圖18C-D顯示了抗lgE/Ml，在處理4天內將血清IgE水平降低了82-89%。圖18E顯示了到第21天抗IgE/M1，處理動物中的IgE水平降低了97-98%,達到與未感染對照組沒有統計學顯著差異的水平。圖18F-G顯示了淋巴結和脾中的生成IgE的漿細胞(如通過Elispot定量的)分別減少了88-94%和57-66%。圖18H-I顯示了所有處理組中淋巴結和脾中的總漿細胞(CD138+)與未感染小鼠相比增加，而且抗IgE/Ml，處理不顯著改變任一器官中的漿細胞總數。這些結果證明了抗IgE/Ml，抗體在體內通過消減IgE生成細胞來降低血清IgE水平的能力。圖19A-G圖示了抗lgE/Ml，抗體治療性處理巴西鉤蟲("NB")感染的感染周期的晚期發生的IgE應答的能力。圖19A是顯示實驗設計的示意圖，其中自第40天開始每周三次處理動物。圖19B顯示了峰IgE生成在第15天左右發生，而且所有抗IgE/Ml，抗體均降低血清IgE。圖19C-D顯示了抗lgE/Ml，抗體在絕對和標準化IgE水平兩個方面都顯示相對於處理開始時的顯著降低。圖19E-G顯示了在第48天和第55天之間與抗gp120mlgGl同種型對照相比抗IgE/Ml，處理顯著降低血清IgE水平。發明詳述通過述及明確收錄本文中所提到的所有參考文獻。通用技術除非另有說明，本發明的實施會採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些都在本領域的技術範圍內。文獻中充分闡述了這些技術，諸如MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(Sambrook等，1989);OligonucleotideSynthesis(M丄Gait編，1984);AnimalCellCulture(R丄Freshney編，1987);MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等編，1987，及定期更新)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等編，1994);APracticalGuidetoMolecularCloning(PerbalBernardV"1988》PhageDisplay:ALaboratoryManual(Barbas等，2001)。淋巴細胞發育和活化人類中的兩大類淋巴細胞是T(胸腺衍生的)和B(骨髓衍生的)。這些細胞衍生自骨髓和胎肝中交付淋巴樣發育途徑的造血幹細胞。這些幹細胞的後代沿著有不同的途徑，發育成B淋巴細胞或T淋巴細胞。人類B淋巴細胞發育完全在骨髓內發生。另一方面，T細胞自未成熟前體發育而成，所述未成熟前體離開骨髓並通過血流移動至胸腺，在那裡它們增殖並分化成成熟T淋巴細胞。自胸腺或骨髓出現的成熟淋巴細胞是處於休眠或"靜止"狀態的，即它們是沒有有絲分裂活性的。當被分配入血流時，這些"未接觸抗原的，，或"處女"淋巴細胞移動入各種次級或周圍淋巴樣器官，諸如脾、淋巴結或扁桃體。大多數處女淋巴細胞具有內在的短壽命且在離開骨髓或胸腺後幾天就死亡。然而，如果這樣的細胞接受到指示抗原存在的信號，它們可活化和經歷連續多輪細胞分裂。然後，一些所得後代細胞恢復成靜止狀態，以變成記憶淋巴細胞-為下一次遭遇所述刺激性變應原而本質上已被激發的B和T細胞。被活化的處女淋巴細胞的其它後代是效應細胞，其只存活幾天，但是執行特異性防禦活性。淋巴細胞活化指一系列有序事件，即靜止的淋巴細胞在它受到刺激以分裂和生成後代時所經歷的，其中有些後代變成效應細胞。完全應答包括對細胞增殖(有絲分裂)的誘導和免疫學功能的表達二者。當特定配體結合至淋巴細胞表面上的受體時，該淋巴細胞變成活化的。針對T細胞和B細胞的配體是不同的，但是所致胞內生理學機制是相似的。雖然外來抗原自身能誘導淋巴細胞活化，尤其是交聯B細胞上的表面免疫球蛋白或T細胞上的其它糖蛋白的大型多聚體抗原。然而，大多數抗原不是多聚體的，而且甚至在直接結合大量B細胞而未能導致活化時。當B細胞受到近乎活化的輔助T淋巴細胞的共刺激時，B細胞是被這些更常見的抗原活化的。此類刺激可以是因T細胞所分泌的淋巴因子而發生的，但是通過B細胞與T細胞表面蛋白質(它們與某些B細胞表面受體相互作用以生成二級信號)的直接接觸而最有效傳播的。B細胞B細胞的定義性特徵是合成免疫球蛋白的能力。免疫球蛋白(Ig)是極端多樣的蛋白質家族，由稱作重鏈和輕鏈的相關類型的多肽構成。每一種Ig以高親和力特異性結合它自己的特定抗原。產生B細胞能表達兩種不同類型的免疫球蛋白，其中每一種承擔獨特的功能。在靜止B淋巴細胞(處女或記憶)中，免疫球蛋白只在細胞表面上表達，在那裡它們本質上作為特定抗原的膜結合受體起作用。相反，B細胞效應細胞(漿細胞)將免疫球蛋白分泌入周圍環境。此類分泌的免疫球蛋白保留識別和結合的能力(相對於靜止B細胞上的膜結合形式)，而且通常稱作抗體。當活化的B淋巴細胞分裂時，它的一些後代變成記憶B細胞，而剩餘後代分化成漿細胞。由於漿細胞具有相對較短的壽命，除非生成新的漿細胞，該群體很快死去且不再分泌免疫球蛋白。因此，B細胞的活化通常導致瞬時的增殖波，接著是在數天或幾周裡升高然後減退的抗體分泌爆發。B細胞是涉及體液免疫或經由組織液介導的保護效應的主要細胞類型。因為本發明的抗lgE/Ml，抗體實際上消減B細胞，包括記憶B細胞，所以它們可用於"重設，，記憶。如此，這樣的效果可以是能削弱(如果不是消除的話)在個體中驅動變應性應答的B細胞成分。T細胞T淋巴細胞不表達免疫球蛋白，但是改為經由稱作T細胞受體的表面蛋白質來探測外來物質的存在。這些受體或是通過直接接觸或是經由影響其它免疫細胞的活性來識別抗原。與巨噬細胞一起，T細胞是涉及細胞介導的免疫的主要細胞類型。與B細胞不同，T細胞只能在特定環境中探測外來物質。具體而言，只有外來蛋白質首先被切割成小肽，其繼而展示在稱作抗原呈遞細胞(APC)的第二宿主細胞的表面上，T淋巴細胞才會識別外來蛋白質。許多類型的宿主細胞能在一些條件下呈遞抗原，但是某些類型更特異性地適應此目的且在控制T細胞活性中是特別重要的，包括巨噬細胞和其它B細胞。抗原呈遞作用部分依賴於呈遞細胞表面上稱作主要組織相容性複合物(MHC)蛋白質的特定蛋白質。如此，為了刺激細胞介導的免疫，必須將外來肽與MHC肽組合地呈遞給T細胞，而且這種組合必須受到T細胞受體的識別。有兩個重要的T細胞子集細胞毒性T淋巴細胞(Tc細胞或CTL)和輔助T細胞(Th細胞)，它們粗略地能根據標誌物CD8和CD4的細胞表面表達來鑑定。Tc細胞在病毒防禦中是重要的，而且能通過識別某些細胞表面表達的病毒肽而直接殺死病毒。丁h細胞促進其它細胞類型的增殖、成熟和免疫學功能(例如淋巴因子分泌)以控制B細胞、巨噬細胞和細胞毒性T細胞的活性。處女和記憶T淋巴細胞二者通常保持在靜止狀態，而且在這種狀態中它們不展示顯著的輔助或細胞毒活性。當活化時，這些細胞經歷數輪有絲分裂以生成子細胞。這些子細胞中的一些作為記憶細胞恢復成靜止狀態，但是其它變成積極表達細胞毒活性輔助物的效應細胞。這些子細胞像它們的親本CD4+細胞只能生成CD4+後代，而CD8+細胞只產生CD8+後代。效應器T細胞表達在靜止T細胞上不表達的細胞表面標誌物，諸如CD25、CD28、CD29、CD40L、運鐵蛋白受體和II類MHC蛋白。當活化性刺激消退時，隨著效應細胞死亡或恢復靜止狀態，細胞毒或輔助活性在數天的時間段裡逐漸減退。與B細胞活化類似，對大多數抗原的T淋巴細胞應答也需要兩類同時刺激。第一個是抗原，其在由MHC蛋白適當地展示在抗原呈遞細胞上時能被T細胞受體所識別和結合。雖然此抗原-MHC複合物確實將信號傳遞至細胞內部，但是這通常不足以導致T細胞活化。完全活化(諸如輔助T細胞所發生的)激。另一方面，細胞毒性T細胞的活化一般需要IL-2，即由活化的輔助T細胞分泌的一種細胞因子。免疫應答哺乳動物免疫系統使之區別於身體其它防禦的三項主要功能特性包括(1)特異性-在大量的耙分子中個別地識別和應答或不應答的能力；(2)辨別-確定自身與非自身，從而與所有的無數種蛋白質和其它有機物質和平共處，但仍針對進入身體的外來物質強烈應答的能力；和(3)記憶-根據經驗鑄模，使得後續遭遇特定外來病原體時會引起比初次遭遇時所發生的更加迅速且強烈的響應的能力。因為本發明的IgE拮抗劑在攜帶IgE的B糹田月包中誘導凋亡，所以預期它們削弱或甚至消除對特定抗原的免疫記憶。當對常見變應原的強烈免疫應答是病理性的時候，諸如特應性病症的情況中，預期這是特別有益的。處女淋巴細胞不斷地自初次淋巴樣器官釋放入周圍，每一個攜帶能夠進行抗原結合的表面受體。B細胞中的抗原結合是經由表面結合的免疫球蛋白介導的，而在T細胞中這是由T細胞受體介導的。當處女淋巴細胞沒有活化的時候，它們在進入周圍後幾天內死亡。那些被活化的存活並增殖，產生子細胞，它們然後可經歷更多輪活化和增殖。對給定抗原的應答的速度和強度主要取決於克隆選擇對特定抗原特異性的子細胞或克隆群體越大，能識別和參與免疫應答的細胞的數目就越大。每一次免疫應答都是複雜的，而且錯綜複雜地調節涉及數種細胞類型的事件的順序。當免疫原進入身體並遭遇稱作抗原呈遞細胞(APC)的專門化類別的細胞時，免疫應答被觸發。這些APC捕捉微量的免疫原並以能被抗原特異性輔助T淋巴細胞識別的形式展示它。然後，輔助T細胞變成活化的，並繼而促進其它類別的淋巴細胞活化，諸如B細胞或細胞毒性T細胞。然後，活化的淋巴細胞增殖並執行它們的特定效應器功能。在此過程中的每個階段，淋巴細胞和APC經由直接接觸或通過分泌調控性細胞因子而;f皮此通訊交流。被APC捕獲的外源抗原經歷稱作抗原加工的一系列改變。此類加工(尤其是蛋白質性質的免疫原)涉及變性和部分蛋白水解消化，使得免疫原被切割成短肽。然後，有限數目的所得肽與II類MHC蛋白非共價結合併轉運至APC表面，即稱作抗原呈遞的過程。與APC直接接觸的CD4+輔助T淋巴細胞可變成活化的，但是它只在它表達能識別和結合APC所呈遞的特定肽-MHC複合物的T細胞受體蛋白時才會這樣做。輔助T(TH)細胞是免疫應答的主要協調者，因為它們是兩種其它淋巴效應細胞的活化所需要的細胞毒性T(Tc)細胞和分泌抗體的漿細胞。Th活化在免疫應答早期發生，而且需要至少兩種信號。一種信號是由T細胞抗原受體結合APC表面上的抗原肽-MHC複合物提供的，經由CD3蛋白複合物傳播，而認為第二種，經由APC的共刺激信號源自T細胞表面上分開的信號傳播蛋白與APC上的特定配體結合。一種已知的此類相互作用是T細胞蛋白CD28和稱作B7的APC表面蛋白家族。其它表面蛋白對也可介導共刺激。21總之，這兩種信號誘導輔助T細胞開始分泌稱作白介素-2(IL-2)的細胞因子，還有開始在其表面上表達特異性高親和力IL-2受體。IL-2是對T淋巴細胞高度有力的促有絲分裂因子，而且對應活化的T細胞的增殖應答是至關重要的。IL-2對分泌它的細胞起作用-一種稱作自分泌效應的現象。已經進一步顯示了，即使T細胞接受到這兩種信號，如果它自己的表面IL-2受體被阻斷，那麼它也不會增殖。IL-2還能在所謂的旁分泌效應中作用於緊鄰的細胞。這種效應對於活化Tc細胞尤其重要，Tc細胞一般不生成足夠的IL-2來刺激它們自己的增殖。在IL-2之外，活化的TH細胞分泌其它細胞因子並促進B細胞、巨噬細胞和其它細胞類型的生長、分化、和功能。APC與抗原特異性TH細胞之間的接觸對APC也有影響-其中最重要的一條是釋放IL-1。認為這種細胞因子以自分泌方式起作用，以提高II類MHC蛋白和多種粘附分子的表面表達，由此加強丁H細胞的結合和增強抗原呈遞。同時，IL-1以旁分泌方式作用於TH細胞以促進IL-2分泌和IL-2受體表達。在TH細胞以先前所述方式活化期間，有些B細胞也可經由它們的抗原受體結合免疫球蛋白，其中所述抗原受體是B細胞稍後會分泌的抗體的模結合形式。與T細胞不同，B細胞識別游離的、未加工的形式的免疫原。特異性抗原結合提供了能導致B細胞活化的一類信號。第二類由活化的TH細胞提供，其表達通過結合B細胞表面上的非免疫球蛋白受體而有助於活化B細胞的蛋白質。這些不管B細胞的抗原特異性而作用於任何B細胞的、Th衍生的信號稱作輔助因子。這些輔助因子包括IL-2、IL-4和IL-6。然而，輔助經由細胞-細胞接觸而更加有效地實現，其中細胞_細胞接觸容許T細胞表面上的蛋白質直接接觸B細胞上的蛋白質。最有效形式的、接觸介導的輔助在稱作CD40配體(CD40L)的蛋白質結合B細胞上稱作CD40的蛋白質時發生，其中CD40L只在TH細胞變成活化的TH細胞後在TH細胞上表達。在稱作旁路活化(by-standeractivation)的過程中，與活化的B細胞的接觸甚至能足以活化靜止B細胞，即使其表面免疫球蛋白尚未結合抗原。Tc淋巴細胞發揮根除在其表面上表達外來抗原的細胞的功能，諸如受到病毒感染的宿主細胞。大多數Tc細胞表達CD8而不是CD4，並因此識別與I類而不是II類MHC蛋白結合的抗原。當體細胞受到表達感染時，有些免疫原性病毒蛋白質可以在細胞內發生加工，然後所得肽可以作為與I類MHC分子的表面複合物出現。然後，這些肽-MHC複合物可以受到抗原特異性克隆的T22細胞受體的識別，提供Tc細胞活化所必需的兩種信號之一。此第一信號單獨在Tc細胞上誘導高親和力IL-2受體。第二信號由自附近的活化的Th淋巴細胞分泌的IL-2提供。在接受到這兩種信號時，活化的Tc細胞獲得了細胞毒性活性，使之能夠殺死它所結合的細胞，以及攜帶相同肽-MHCI類複合物的任何其它細胞。在有些情況中，殺死是因為Tc將特定毒素釋放到靶細胞上而發生的；在其它情況中，Tc誘導靶細胞通過凋亡進行自殺。活化的Tc細胞還增殖，產生具有相同抗原特異性的別的Tc細胞。IgE/肥大細胞/調解途徑通過分子的Fc部分結合至稱作FceRI的高親和力細胞表面受體，IgE抗體固定至肥大細胞和嗜鹼性細胞的表面。在多價變應原分子結合佔據這些受體的抗體時，變應性反應啟動。結果是FcsRI的橋接，其繼而在胞內發信號，引起炎症介導物的釋放和活化組胺，白三烯，趨化因子，血小板活化因子，和蛋白酶。這些被活化的介導物局部地發揮作用並引起升高的血管通透性、血管舒張、平滑肌收縮和粘液腺分泌。此類事件在臨床上稱作立即期或早期事件，而且在變應原暴露後的前15-30分鐘內發生。在隨後的12小時裡，應答尚未完全了解的其它化學介導物，發生炎症細胞的漸進性組織浸潤，自嗜中性細胞進行至嗜曙紅細胞再至單個核細胞。變應原暴露後6-12小時的這段時間稱作晚期且以細胞炎症的臨床表現為特徵。鑑於晚期反應，尤其是在肺中，是在早期反應缺失的情況中發生的，仍然尚未完全了解晚期反應是否必然是IgE介導的。這種機制主要引起過敏反應、蕁麻滲和特應性(變態反應性)疾病，諸如變應性鼻炎、變應性哮喘、特應性皮炎和變應性胃腸病。效應器T淋巴細胞/'淋巴因子途徑某些變應性疾病是由變應原反應介導的，其中效應器T淋巴細胞對來自在先暴露的特定變應原致敏。當遭遇變應原時，CD4+T細胞變成活化的，以生成淋巴因子，該結果持續數天，並伴有單個核細胞浸潤物累計。I.定義"變應原"或"免疫原"指任何能觸發免疫應答的分子。如本文中所使用的，該術語覆蓋抗原性分子自身或其來源，諸如花粉粒、動物毛髮皮屑、昆蟲毒液或食品。這與術語抗原形成對比，後者指能^皮免疫球蛋白或T細胞受體特異性識別的分子。任何能夠誘導免疫應答的外來物質是潛在的變應原。已知，天然的和合成的這兩種來源的許多不同化學製品是變應原性的。複雜的天然有機化學製品，尤其是蛋白質，有可能引起抗體介導的變態反應，而簡單的有機化合物、無機化學製品、和金屬更優先引起T細胞介導的變態反應。在有些情況中，相同的變應原可負責超過一種變態反應。暴露於變應原可以經由吸入、注射、注射、或皮膚接觸實現。術語"抗體"包括單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區的全長抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、雙抗體、和單鏈分子，以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2、和Fv)。在本文中，術語"免疫球蛋白"(Ig)與"抗體"可互換使用。基本的4鏈抗體單元是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元及稱作J鏈的另外多肽組成，而且包含10個抗原結合位點，而lgA抗體包含與J鏈組合的2-5個能聚合而形成多價裝配物的基本4鏈單元。在IgG的情況中，4鏈單元通常是約150,000道爾頓。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而兩條重鏈通過一個或多個二硫鍵彼此相連，二硫鍵的數目取決於重鏈的同種型。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫4建。每條重鏈在N-末端具有一個可變區(VH),接著是三個(對於a和Y鏈)或四個(對於ii和e同種型)恆定區(Ch)。每條輕鏈在N-末端具有一個可變區(VO，接著是其另一端的一個恆定區(CL)。Vl與Vh排列在一起，而CL與重鏈第一恆定區(CHl)排列在一起。認為特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區之間形成界面。一個VH和一個VL—起配對而形成一個抗原結合位點。關於不同類別抗體的結構和性質，參見例如BasicandClinicalImmunology,第8版,DanielP.Sties,AbbaI.TerrandTristramGParsolw(編),Appleton&Lange，Norwalk，CT,1994，page71andChapter6。根據其恆定區胺基酸序列，來自任何脊推動物物種的L鏈可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(k)和拉姆達(人)。根據其重鏈恆定區(CH)胺基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類別或同種型。有五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有稱作a、S、e、Y和P的重鏈。根據Qi序列和功能的較小差異，Y和a類可進一步分為亞類，例如人類表達下列亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。"分離的"抗體指已經鑑定，自其生成環境(例如天然的或重組的)的一種成分分開和/或回收的抗體。優選地，分離的多肽與來自其生成環境的所有其它成分沒有關聯。其生成環境的汙染性成分(諸如源自重組轉染細胞的)指通常會干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將多肽純化至(l)根據例如Lowry法的測定，抗體重量超過95%，而在有些實施方案中，內部胺基酸序列的程度，或(3)根據非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優選的銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少一種成分不會存在，那麼分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的多肽或抗體通常將通過至少一個純化步驟來製備。抗體的"可變區"或"可變域"指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結構域。重鏈可變域和輕鏈可變域分別可以稱為"VH"和"VL"。這些結構域一般是抗體的最易變部分(相對於同一類的其它抗體而言)且包含抗原結合位點。術語"可變的，，指可變域中的某些區段在抗體間序列差異廣泛的實情。V結構域介導抗原結合且限定每種特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，變異性並非均勻分布於可變域的整個跨度。而是，它集中於輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(HVR)的三個區段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區，它們大多採取|3-摺疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成P-摺疊片結構一部分的三個HVR連接。每條鏈中的HVR通過FR區非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的HVR—起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabata/.,S^wewceso//m臓"o/og7'ca//"tems/;第5版,NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞的細胞毒性中的參與。術語"單克隆抗體，，在用於本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變和/或翻譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體的優勢在於它們是由雜交瘤培養物合成的，未受到其它免疫球蛋白的汙染。修飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特徵，不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括例如雜交瘤法(例如KohlerandMilstein.，Nature,256:495-97(1975》Hongo"a/.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlowao/.，Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988);Hammerlingda/.，in:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA法(參見例如美國專利No.4,816,567)、噬菌體展示技術(參見例如Clacksonaa/.，7V"/w廠e352:624-628(1991);Marks"a/.,/Mo/.222:581-597(1992);Sidhua/"JMo/.Ao/.338(2):299-310(2004);Lee""/.,/Mo/.祝o/.340(5):1073-1093(2004);Fellouse，Proc,A^.Jcad101(34):12467-12472(2004);Lee"a/.,/國歸/.M"Ws284(1-2):119-132(2004))、及用於在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits"a/.，戶rac.iVaf/.爿<%^.園90:2551(1993);JakobovitsWa/.，胸騰362:255-258(1993);Bruggemanna/.，Fear/"/wmwm/.7:33(1993);美國專矛jNo.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks&a/.,AV/7fec/z"o/ogy10:779-783(1992);Lonberg""/.，A^ww368:856-859(1994);Morrison,胸騰368:812-813(1994);Fishwild^a/,，淑騰腸&c/wo/.14:845-851(1996);Neuberger,淑訓腺ec/zwo/.14:826(1996);LonbergandHuszar,/她rw.Tev./mw柳o/.13:65-93(1995》。術語"棵抗體(棵露的抗體)"指未偶聯細胞毒性模塊或放射性標記物的抗體。術語"全長抗體"和"完整抗體"可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與抗體片段不同。具體而言，完整抗體包括那些具有重鏈和輕鏈(包括Fc區)的。恆定域可以是天然序列恆定域(例如人天然序列恆定域)或其胺基酸序列變體。在有些情況中，完整抗體可具有一項或多項效應器功能。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優選完整抗體的抗原結合和/或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(參見美國專利5,641，870,實施例2;Zapata"a/,,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱作"Fab"片段，和一個殘餘"Fc"片段，其名稱反映了它易於結晶的能力。Fab片段由一條完整輕鏈及一條重鏈的可變區(VH)和第一恆定區(CHl)組成。每個Fab片段對於抗原結合是單價的，即它具有一個抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生一個較大F(ab')2片段，它大體相當於兩個通過二硫鍵相連的Fab片段，具有不同抗原結合活性且仍能夠交聯抗原。Fab，片段因在Ch1結構域的羧基末端增加了少數殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab，-SH是本文中對其中恆定區半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab，的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為成對Fab，片段生成的，在Fab，片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學偶聯。Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條H鏈的羧基末端部分。抗體的效應器功能由Fc區中的序列來決定，該區域也受到在某些類型的細胞上找到的Fc受體(FcR)識別。"Fv"是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。此片段由緊密、非共價結合的一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的二聚體組成。從這兩個結構域的摺疊中生發出六個高變環(重鏈和輕鏈各3個環)，貢獻出抗原結合的胺基酸殘基並賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或只包含對抗原特異的三個HVR的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，儘管親和力低於完整結合位點。"單鏈Fv"，也縮寫成"sFv"或"scFv"，是包含連接成一條多肽鏈的VH和VL抗體結構域的抗體片段。優選的是，sFv多肽在VH與Vi結構域之間進一步包含多肽接頭，其使得sFv能夠形成結合抗原的期望結構。關於sFv的綜述參見Pluckthun，於《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，第113巻，Rosenburg和Moore編，Springer隱Verlag,NewYork,第269-315頁，1994。本發明抗體的"功能性片段"包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合或可變區或抗體的保留或具有改良FcR結合能力的Fc區。抗體片段的例子包括線性抗體、單鏈抗體分子和自抗體片段形成的多特異性抗體。術語"雙抗體"指通過在VH和Vt結構域之間使用短接頭(約5-10個殘基)構建sFv片段(見上一段)而製備的小型抗體片段，由於接頭短，使得V結構域實行鏈間而非鏈內配對，由此導致二價片段，即具有兩個抗原結合位點的片段。雙特異性雙抗體是兩個"交叉"sFv片段的異二聚體，其中兩種抗體的VH和Vj吉構域存在於不同多肽鏈上。雙抗體更詳細的描述於例如EP404,097;WO93/11161;Hollinger&Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No.4,816,567;Morrison"a/.，屍rac.Ato/.血W.81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括"靈長類化"抗體，其中抗體的抗原結合區衍生自通過用感興趣抗原免疫短尾猴(macaquemonkey)而生成的抗體。如本文中所使用的，"人源化抗體，，是"嵌合抗體"的一個子集。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類動物)的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環對應於非人免疫球蛋白序列的高變環，且所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的FR區，儘管FR區可包含一處或多處改進抗體性能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)的個別FR殘基替代。FR中這些胺基酸替代的數目，H鏈中通常不超過6處，L鏈通常不超過3處。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。更多細節參見例如Jones"a/.，AWw321:522-525(1986);Riechmann"a/.，淑匿332:323-329(1988);及Presta,C匿Qp.說o/.2:593-596(1992)。還可參見例i口VaswaniandHamilton,j〃ergy,爿W/zm"c&/m薩wo/.1:105-115(1998》Harris,5/oc/ze附.5"oc.rrawsacf/ora23:1035-1038(1995);HurleandGross,C匿G>p.跑d5:428-433(1994);及美國專利No.6,982,321和7,087,409。28"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列和/定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生成，包括噬菌體展示文庫(HoogenboomandWinter,/Mo/.Ao/.227:381(1991);Marksd"/.，J!Mo/.222:581(1991》。還可用於製備人單克隆抗體的是以下文獻中記載的方法Cole"a/.，Mo"oc/o"a/」""力oa^sawdQwcer77zera/_y，AlanR.Liss，p.77(1985》Boernera/"/mwwwo/,147(1):86-95(1991)。還可參見vanDijkandvandeWinkel，qp/".屍/z"rmaco/.，5:368-74(2001)。可通過給已經修飾以應答抗原性刺激而生成人抗體但其內源基因組已經失去能力的轉基因動物例如經過免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來製備人抗體(參見例如6,075，181和6，150,584,關於XENOMOUSETM技術)。還可參見例如Lida/.，屍rac.Ato/.Acadt/S^,103:3557-3562(2006)，關於經人B-細胞雜交瘤技術生成的人抗體。術語"高變區"、"HVR"或"HV"在用於本文時指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個HVR:三個在VH中(Hl、H2、H3)，三個在VL中(Ll、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發揮獨特作用。參見例如Xu"a/,/mm""//);13:37-45(2000);JohnsonandWu於A/o/ecw/ar5/。/o^248:1-25(Lo糹扁，HumanPress,Totowa，NJ,2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩定的。參見例如Hamers-Casterman&a/.,A^w363:446-448(1993);及Sheriffaa/.，A^w6Vra".S/o/.3:733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(CDR)的HVR是以序列變異性為基礎的，而且是最常用的(Kabat"a/.，^丄X)。Chothia改為指結構環的位置(ChothiaandLesk/Mo/.所o/.196:901-917(1987))。AbMHVR代表KabatCDR與Chothia結構環之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟體的使用。"接觸"HVR是以對可獲得的複合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。環KabatAbMChothia接觸LlL24-L34L24-L34L26-L34L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L56L46-L55L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96HIH31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B(Kabat編號)HIH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35(Chothia編號)H2H50-H65H50-H58H53-H56H47-H58H3H95-H102H95-H102H95-H102H93-H101HVR可包括如下"延伸的HVR":VL中的24-36或24-34(Ll)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(Hl)、50-65或47-65(優選的實施方案)(H"和9:3-102(H3)。對於這些延伸的HVR定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的。"框架"或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的HVR殘基外的那些殘基。表述"依照Kabat的可變域殘基編號方式"或"依照Kabat的胺基酸位置編號方式"及其變體指Kabatda/.,見上文中的抗體編輯用於重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際的線性胺基酸序列可包含較少或另外的胺基酸，對應於可變域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52後的單一胺基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82後的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與"標準，，Kabat編號序列對比同源區來確定。就本文目的而言，"受體人框架"是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之胺基酸序列的框架。"衍生自，，人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可包含與之相同的胺基酸序列，或者可包含預先存在的胺基酸序列變化。在有些實施方案中，預先存在的胺基酸變化的數目是IO個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少。"人共有框架，，指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常見的胺基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變區序列亞型。通常，序歹'J亞型是^口Kabatefa/.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)中的亞型。在一個實施方案中，對於VL，亞型是如Kabat等人，見上文中的亞型Kl。在一個實施方案中，對於VH，亞型是如Kabat等人，見上文中的亞型in。"VH亞型III共有框架"包含從Kabat等，見上文的可變重鏈亞型III中的胺基酸序列獲得的共有序列。在一個實施方案中，VH亞型III共有框架胺基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個全部EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(HI)(SEQIDNO:55),WVRQAPGKGLEWVA(SEQIDNO:56)(H2)，RFTISRDDSKNTLYLQ廳SLRAEDTAVYYCAR(SEQIDNO:57)(H3),WGQGTLVTVSS(SEQIDNO:58)(H4)。"VL亞型I共有框架，，包含從Kabat等，見上文的可變輕鏈K亞型I中的胺基酸序列獲得的共有序列。在一個實施方案中，VL亞型I共有框架胺基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNO:59)(LI),WYQQKPGKAPKLLIY(SEQIDNO:60)(L2)，GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQIDNO:61)(L3),FGQGTKVEIKR(SEQIDNO:62)(L4).指定位置(例如Fc區的)處的"胺基酸修飾"指指定殘基的替代或刪除，或指定殘基附近至少一個胺基酸殘基的插入。指定殘基"附近"的插入意味著其一個至兩個殘基內的插入。插入可以在指定殘基的N端或C端。本文中優選的胺基酸修飾是替代。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改抗體。在一個實施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知^見程來生成。例如，Marksda/.,S/o/rec/wo/o^10:779-783(1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了HVR和/或框架殘基的隨機誘變例^口，Barbasd/Voc.A^AJcat/.5b/.91:3809-3813(1994);Schiera"/.,169:147-155(1995);Yelton"a/.，J/mm""o/.155:1994-2004(1995);Jackson"a/.,J/mmtmo/.154(7):3310匿9(1995);Hawkinsa/.，《/iV^o/.226:889-896(1992)。"特異性結合"特定多肽或特定多肽上的表位或者對其"特異"的抗體指結合該特定多肽或特定多肽上的表位且基本上不結合任何其它多肽或多肽表位的抗體。例如本發明的Ml，特異性抗體是對在B細胞上結合的IgE上找到的、但在分泌型IgE上不存在的IgEMl，胞外區段特異性的。"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。在有些實施方案中，阻斷性抗體或拮抗性抗體實質性地或完全地抑制抗原的生物學活性。本發明的凋亡性抗IgE抗體以降低游離血清IgE和總血清IgE二者的方式阻斷IgE介導免疫應答的活性。"誘導凋亡"的或"凋亡性的"抗體指那些根據標準凋亡測定法的測定，誘導程序性細胞死亡的抗體，所述測定法諸如膜聯蛋白V結合、DNA斷裂、細胞收縮、內質網膨脹、細胞破裂、和/或膜嚢(稱作凋亡小體)形成。例如，本發明抗IgE抗體的凋亡活性可通過膜聯蛋白V對表面結合的IgE的細胞染色來顯示。術語"總血清IgE，，指樣品中存在的IgE的總量，包括游離的或結合的二者，以及與結合配偶(例如抗IgE抗體、攜帶IgE的B細胞)複合的IgE。"游離血清IgE，，指未結合至結合配偶的IgE。術語"變應原特異性IgE"指對特定抗原特異性的，源自稱作變應原致敏的過程中對變應原的初始暴露的，結合肥大細胞和嗜鹼性細胞的表面且能在對相同變應原的後續暴露時導致肥大細胞和嗜鹼性細胞活化的IgE。病毒(例如巨細胞病毒(CMV))、細菌(例如葡萄球菌)、蠕蟲(例如蛔蟲、血吸蟲)中的數種促有絲分裂因子和空氣汙染中的輔助因子(例如煙、和柴油機廢氣)在不啟動任何變應原特異性IgE致敏的情況下刺激IgE分子的生成。如此，因為IgE水平可以以不必然使宿主傾向於變成對IgE介導的病症更加易感的方式升高，所以有時在臨床評估中使用變應原特異性IgE水平。術語"特異性消減生成IgE的B細胞"意指特異性減少/降低專門分泌IgE的B細胞(即漿細胞)的群體或效力，但不顯著影響分泌其它免疫球蛋白(諸如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM)的B細胞的群體或效力的能力。術語"固相，，描述本發明的抗體可粘著其上的非水性基質。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚矽氧烷(silicone)製成的固相。在某些實施方案中，根據語境，固相可包括測定板的孔；在其它實施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。此術語還包括離散顆粒的不連續固相，諸如美國專利No.4,275，149中所記載的。抗體"效應器功能"指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基斷列變體Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細月包活化。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"指其中結合到某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。該抗體"武裝，，(arm)細胞毒性細胞，而且是通過此機制殺死耙細胞所要求的。介導ADCC的主要細胞，nk細胞，只表達FcyRIII,而單核細胞表達FcyRI、FcyRII和FcyRIII。RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5,500，362或5,821，337中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另夕卜，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物^^莫型中，諸如Clynes"a/.，PNASUSA95:652-656(1998)中所披露的。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號方式是如Kabat"a/.，見上文中的EU索引的編號方式。"如Kabat中的EU索引，，指人IgGlEU抗體的殘基編號方式。術語"Fc區"在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區，包括天然序列Fc區和變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為自其Cys226或Pro230位置的胺基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸(殘基447，依照EU編號系統)可以消除，例如在生產或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程改造。因而，完整抗體的組合物可包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無一K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有和無K447殘基的抗體的抗體群。對於在本發明的抗體中使用而言合適的天然序列Fc區包括人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。"Fc受體，，或"FcR，，描述結合抗體Fc區的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR(y受體)，包括FcyRI、Fc丫RII和FcYRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的胺基酸序列，區別主要在其胞質結構域中。活化受體FcYRIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見M.Da6ron，力ww.Wev./mmw朋/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet，Aev./畫畫/.9:457-492(1991);Capel"a/"Imm腦methods4:25-34(1994);deHaas"a/.,乂MCY,".126:330-41(1995)。術語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來將會鑑定的。術語"Fc受體"或"FcR"還包括新生兒受體，FcRn,它負責將母體IgG轉移糹合月臺JL(GuyerJTwwwwo/.117:587(1976)和Kima/.，/www"o/.24:249(1994))。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如GhetieandWard:/mw畫/7b18(12):592-8(1997);Ghetie"淑,腸欣/zw(9/ogy,15(7):637-40(1997);Hinton"a/"JS/o/.C7zem279(8):6213-6(2004);andWO2004/92219(Hinton"可測定人FcRn高親和力結合多肽與FcRn的體內結合和血清半衰期，例如在表達人FcRn的轉基因小鼠或經轉染的人細胞系中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中。WO2000/42072(Presta)記載了對FcR的結合得到改良或消除的抗體變體。還可參見例如Shields"J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。"人效應細胞"指表達一種或多種FcR並行使效應器功能的白細胞。優選的是，該細胞至少表達FcyRIII並行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優選PBMC和MNK細胞。效應細胞可以從其天然來源分離，例如血液。"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑的激活是由補體系統第一組分(Clq)結合其關聯抗原所結合的抗體(適宜亞類的)起始的。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如34Gazzano-Santoro""/，J.Immunol,Methods202:163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區胺基酸序列及提高或降低的Clq結合能力的多肽變體記載於美國專利No.6,194,551Bl和WO99/51642。在此明確收入那些專利出版物的內容作為參考。還可參見Idusogie^a/.，//wmwo/.164:4178-4184(2000)。IgG中的N-糖基化位點位於CH2結構域中的Asn297。本發明還提供了具有Fc區的結合CD20的人源化抗體的組合物，其中組合物中大約80-100%(優選大約卯-99%)的抗體包含缺少巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構，附著於糖蛋白的Fc區。此類組合物在本文中證實展現出與FcYRIIIA(F158)結合方面驚人的改善，在與人IgG相互作用方面FcyRIIIA(F158)不像FcyRIIIA(V158)那樣有效。如此，預期本文中的組合物優於先前記載的抗CD20抗體組合物，尤其是用於表達FcYRIIIA(F158)的人類患者的治療。在正常的、健康的非洲裔美國人和高加索人中FcyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常見。參見Lehrnbecher&a/.,94:4220(1999)。本申請進一步證明了組合本文中的糖基化變異與糖蛋白Fc區中的胺基酸序列修飾而引起的FcyRIII結合和/或ADCC功能的協同性升高。"結合親和力"通常指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在用於本文時，"結合親和力"指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間l:l相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(Kd)來表述。親和力可通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且趨於容易解離，而高親和力抗體通常更快速地結合抗原且趨於保持更長時間的結合。本領域知道測量結合親和力的多種方法，其中任一種都可用於本發明的目的。下文描述了關於測量結合親和力的具體的示例性和例示性實施方案。在一個實施方案中，依照本發明的"Kd"或"Kd值"是通過如下測定法所述使用Fab型式的目的抗體及其抗原進行的放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量的通過在存在未標記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的(125i)標記抗原平衡Fab，然後用抗Fab抗體包被的平板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的;容液結合親和力(參見例如Chen，"a/.,JMolBiol293:865-881(1999))。為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5嗎/ml捕捉用抗Fab抗體(CappelLabs)包被微量滴定板(DYNEXTechnologies,Inc.)過夜，隨後用PBS中的2。/。(w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23。C)封閉2-5小時。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將100pM或26pM[l"I]-抗原與連續稀釋的目的Fab混合(例如與Prestae/a/.，CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗體，Fab-12的評估一致)。然後將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續更長時間(例如約65個小時)以保證達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板以進行室溫保溫(例如l小時)。然後除去溶液，並用含0.1。/。TWEEN-2tm表面活性劑的PBS洗板8次。平才反乾燥後，力。入150(^1/孔閃爍液(MICROSCINT-20;Packard),然後在TOPCOUN丁tm伽馬計數器(Packard)上對平板計數10分鐘。選擇各Fab給出小於或等於最大結合之20%的濃度用於竟爭性結合測定法。依照另一實施方案，Kd是通過表面等離振子共振測定法使用BIACORE⑧-2000或BIACORE⑧-3000儀器(BIAcore,Inc.,Piscataway，NJ)在25。C使用固定化抗原CM5晶片在約10個響應單位(RU)測量的。簡而言之，依照供應商的說明書用鹽酸JV-乙基-iV'-(3-二曱基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和iV-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖普生物傳感器晶片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5juig/ml(約0.2iuM)，然後以5(al/分鐘的流速注入至獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原後，注入1M乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，在25。C以約25(^1/分鐘的流速注入在含0.05%TWEEN-20TM表面活性劑的PBS(PBST)中兩倍連續稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIAcore⑧EvaluationSoftwareversion3.2)通過同時擬合結合和解離傳感圖計算結合速率(k。n)和解離速率(k0ff)。平衡解離常數(Kd)以比率koff/k。n計算。參見例如Chenda/.,JMolBiol293:865-881(1999)。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過106M-1s-1,那麼結合速率可使用螢光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(astop-flowequippedspectrophometer)(AvivInstruments)或8000系歹寸SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS、pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的焚光發射強度(激發495nm;發射-340nm，16nm帶通)的升高或降低。依照本發明的"結合速率，，(on-mte，rateofassociation,associationrate)或"k。n"也可如上所述使用BIACORE⑧-2000或BIACORE⑧-3000系統(BIAcore,Inc.,Piscataway，NJ)來測定。短語"實質性降低"或"實質性不同，，在用於本文時表示兩個數值(通常一個與某分子有關而另一個與參照/比較分子有關)之間足夠高的差異程度，以致本領域技術人員將認為在用所述數值(例如Kd值)所測量的生物學特性背景內兩個數值之間的差異具有統計學顯著性。作為參照/比較分子該數值的函數，所述兩個數值之間的差異例如大於約10%,大於約20°/。，大於約30%，大於約40%,和/或大於約50%。短語"基本上相似"或"基本上相同"在用於本文時表示兩個數值(例如，一個涉及本發明的抗體而另一個涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領域技術人員將認為在用所述數值(例如Kd值)所測量的生物學特性背景內兩個數值之間的差異具有很小的或沒有生物學和/或統計學顯著性。作為參照/比較值的函數，所述兩個數值之間的差異例如小於約50%，小於約40%，小於約30%，小於約20%，和/或小於約10%。關於肽、多肽或抗體序列的"百分比(。/。)胺基酸序列同一性"和"同源性"定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與特定肽或多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以本領域技術範圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可決定用於測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，%胺基酸序列同一性值是使用由Genentech公司編寫的序列比較電腦程式ALIGN-2獲得的。ALIGN-2的原始碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyrightO傷ce,WashingtonD.C.，20559)，並以美國版權註冊號TXU510087註冊。公眾可通過Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX作業系統，優選數碼UNIXV4.0D上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)、或針對(against)給定胺基酸序列B的。/。胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一。/。胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算分數X/Y乘100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的胺基酸殘基數，且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。可以領會，若胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等，則A相對於B的％胺基酸序列同一性將不等於B相對於A的。/。氨基S^列同一性。除非另有具體說明，本文中所使用的所有°/。胺基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。"分離的"編碼本文中抗體的核酸分子指已經鑑定且與生成它的環境中通常與之關聯的至少一種汙染性核酸分子分開的核酸分子。優選地，分離的核酸與同生成環境有關的所有成分沒有關聯。分離的編碼本文中多肽和抗體的核酸分子處於不同於在自然界中發現它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與細胞中天然存在的編碼本文中多肽和抗體的核酸有區別。術語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適於原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處於功能性相互關係中，則它是"可操作連才妾的"。例嗦口，若前序列(presequence)或分泌前導(secretoryleader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導的情況中意味著相鄰且處於閱讀狀態。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現。若沒有此類位點，則依照常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。術語"表位標記的"在用於本文時指包含本文中所描述的多肽或抗體且其與"標籤多肽，，融合的嵌合多肽。標籤多肽具有足夠殘基以提供表位而可製備針對其的抗體，但又足夠短使得其不幹擾與其融合的多肽的活性。標籤多肽優選還是相當獨特的，使得其抗體基本上不與其它表位發生交叉反應。合適的標籤多肽通常具有至少6個胺基酸殘基，通常在約8個和約50個胺基酸殘基之間(優選在約10個和約20個胺基酸殘基之間)在用於本文時，術語"免疫粘附素"指將異源蛋白質("粘附素")的結合特異性與免疫球蛋白恆定域的效應器功能聯合起來的抗體樣分子。在結構上，免疫粘附素包括不同於抗體的抗原識別和結合位點(即是"異源"的)、具有期望結合特異性的胺基酸序列和免疫球蛋白恆定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配體的結合位點的連續胺基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恆定域序列可以從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-l和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合體優選在Ig分子的至少一個可變域中包含本文中所描述的多肽或抗體的結構域的替代。在一個特別優選的實施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3，或鉸鏈、CH1、CH2和CH3區。關於免疫球蛋白融合物的生成，還可參見1995年6月27日公告的美國專利No.5,428,130。例如，作為對於本文中的組合療法有用的第二藥物的有用免疫粘附素包括包含BLyS受體的BLyS結合部分且BR3、TACI或BCMA的跨膜沒有融合至免疫球蛋白序列恆定域的多肽。"融合蛋白，，和"融合多肽"指兩個部分共價連接到一起的多肽，其中每個部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物學特性，諸如體外或體內活性。所述特性還可以是簡單的化學或物理特性，諸如結合靶分子、催化反應等。所述兩個部分可以通過單一肽鍵或者經由肽接頭直接相連，它們彼此會在同一讀碼框內。"穩定的"配製劑指在貯存後其中的蛋白質基本上保持其物理和化學穩定性和完整性的配製劑。本領域有用於測量蛋白質穩定性的多種分析技術，綜述見Pe/"'(ieaw/戶rato'"i>wgZ)e//ve/j,247-301,VincentLee編，MarcelDekker，Inc.,NewYork,NewYork,Pubs,(1991)及Jones,A.i>wgZ)e//ve/^iev.29-90(1993)。可以在選定的溫度對選定的時間段測量穩定性。對於快速篩選，可以將配製劑於40。C保持2周至1個月，那時測量穩定性。若配製劑要於2-8。C貯存，則一般配製劑應於30。C或40。C穩定至少1個月和/或於2-8。C穩定至少2年。若配製劑要於30。C貯存，則一般配製劑應於30。C穩定至少2年和/或於40。C穩定至少6個月。例如，可以使用貯存期間的聚集程度作為蛋白質穩定性的指標。如此，"穩定的"配製劑可以是其中少於約10%且39優選少於約5%的蛋白質以聚集物存在的配製劑。在其它實施方案中，可以測定配製劑5!i存期間聚集物形成的任何增加。"重建的"配製劑指如下製備的配製劑，即在稀釋劑中溶解凍幹的蛋白質或抗體配製劑，使得蛋白質到處散布。重建的配製劑適合於施用(例如胃腸外施用)於要用感興趣蛋白質治療的患者，而且，在本發明的某些實施方案中，可以是適用於皮下施用的。"等滲的"配製劑指具有與人血液基本上相同的滲透壓的配製劑。等滲的配製劑一般會具有約250-350mOsm的滲透壓。術語"低滲的，，描述滲透壓低於人血液的配製劑。相應地，術語"高滲的，，用於描述滲透壓高於人血液的配製劑。可以使用例如蒸氣壓或結冰(ice-freezing)型滲壓計來測量等滲性。本發明的配製劑因添加了鹽和/或緩沖劑而是高滲的。"載體"在用於本文時包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是pH綾沖水溶液。生理學可接受載體的例子包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICStm。"包裝插頁，，指通常包括在藥物的商業包裝中的說明書，它們包含有關涉及此類藥物應用的適應徵、用法、劑量、施用、禁忌症、與該包裝產品聯合的其它藥物和/或警告等的信息。"藥學可接受的酸"包括在配製它們的濃度和方式無毒的無機和有機酸。例如，合適的無機酸包括氫氯酸、高氯酸、氫溴酸、氬碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、對氨基苯磺酸(磺胺酸)、磷酸、碳酸、等。合適的有機酸包括直鏈和支鏈烴基的(alkyl)、芳香族的、環狀的、環狀脂肪族的、芳基脂肪族的、雜環的、飽和的、不飽和的、單羧酸的、雙羧酸的和三羧的，包括例如曱酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三曱基乙酸、叔丁基乙酸、鄰氨基苯曱酸(氨茴酸)、丙酸、2-羥基丙酸、2-氧丙酸、丙二酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、硬脂酸、粘康酸、苦杏仁酸(扁桃酸)、琥珀酸、embonicacid、富馬酸、蘋果酸、馬來酸、羥基馬來酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸(羥基乙酸)、葡糖酸(glyconicacid)、葡糖酸(gluconicacid)、丙酮酸、乙醛酸、草酉交、mesylicacid、玻玉白酸、7jc才勿酸、敞酸、palmoicacid、palmeicacid、石克氰酸、曱磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、對甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-曱基二環[2.2.2]-辛-2-烯-l-羧酸、葡庚糖酸、4,4，-曱叉雙-3-(羥基-2-烯-l-羧酸)、羥基萘曱酸。"藥學可接受的鹼"包括在配製它們的濃度和方式無毒的無機和有機鹼。例如，合適的鹼包括那些自無機鹼形成金屬形成的，所述金屬諸如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁、N-曱基葡糖胺、嗎啉、哌啶，及有機無毒鹼，包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、環胺和鹼離子交換樹脂(例如N(R，)4+,其中R，獨立地為H或C,-4烴基，例如銨、Tris)，例如異丙胺、三曱胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、trimethamine、二環己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、hydrabamine、膽鹼、甜菜i鹹、乙二胺、葡糖胺、曱基葡糖胺、可可i鹹、。票呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺樹脂諸如此類。特別優選的有機無毒鹼是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine、二環己基胺、膽石鹹、和咖啡因。本發明可用的別的藥學可接受的酸和鹼包括那些自胺基酸衍生的，例如組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸和天冬醯胺。"藥學可接受的，，緩衝劑和鹽包括那些自上文所示酸和鹼的酸和鹼加成鹽衍生的。具體的緩衝劑和/或鹽包括組氨酸、琥珀酸鹽/酯和乙酸鹽/酯。"藥學可接受的糖"指在與感興趣的蛋白質組合時顯著阻止或降低蛋白質在貝i存後的化學和/或物理不穩定性的分子。當配製劑意圖要凍幹，然後重建時，"藥學可接受的糖"也可以稱作"防凍劑，，(lyoprotectant)。例示性的糖及其相應的糖醇包括胺基酸，諸如穀氨酸或組氨酸單鈉；曱胺，諸如甜菜鹼；易溶鹽，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三氫的或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖(dextran)、赤蘚糖醇、甘油(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS;及其組合。別的例示性防凍劑包括甘油(glycerin)和明膠，及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇四糖。還原糖的例子包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖的例子包括選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。優選的糖醇是單糖香，尤其是那些通過二糖(諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖)還原獲得的化合物。糖苷側基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的別的例子是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優選的藥學可接受的糖是非還原糖海藻糖或蔗糖。將藥學可接受的糖以"保護量)添加至配製劑(例如凍幹前)，這意謂著蛋白質在貯存期間(例如在重建和貯存後)基本上保持其物理和化學穩定性和完整性。本文中感興趣的"稀釋劑"指藥學可接受的(對於給人施用而言安全的且無毒的)且對於製備液體配製劑(諸如在凍幹後重建的配製劑)而言有用的。例示性的稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。在一個備選的實施方案中，稀釋劑可以包括鹽和/或緩衝劑的水溶液。"防腐劑，，指能添加至本文中的配製劑以降低細菌活性的化合物。防腐劑的添加可以例如促進多次使用(多劑量)配製劑的生成。潛在防腐劑的例子包括十八烷基二曱基苯曱基銨氯化物、氯己雙胺、苯扎氯銨(烴基苯曱基二曱基銨氯化物的混合物，其中烴基是長鏈化合物)、和苄索氯銨。其它類型的防腐劑包括芳香族醇(諸如酚、丁醇和苯曱醇)、對羥基苯曱酸烴基酯(諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯)、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、和間甲酚。本文中最優選的防腐劑是苯曱酸。"治療"或"處理"指設計用於改變所治療個體或細胞的自然進程的臨床幹預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期望效果包括預防疾病的發生或復發、預防轉移、減緩疾病進展的速率、改善或減輕疾病狀態、及免除或改善預後。在有些實施方案中，本發明的抗體用於試圖延遲疾病或病症的發生/發展。如果一種或多種與IgE介導的病症有關的症狀得到減輕，那麼說例如使用本發明的凋亡性抗IgE抗體成功"治療，，了受試者。"有效量"指至少在必需的劑量和時間上有效實現期望的或指定的效果(包括治療或預防結果)的量。"治療有效量"至少指實現特定病症的可測量改善或預防所需要的最小濃度。本文中的治療有效量可才艮據諸如患者的疾病狀態、年齡、性別和體重及該抗體在個體中引發期望應答的能力等因素而變化。治療有效量還指該抗體的治療有益效果勝過任何有毒或有害後果的量。"預防有效量，，指在必需的劑量和時間上有效實現期望的預防效果的量。通常而非必然，由於預防劑量是在疾病發作之前或在疾病的早期用於受試者的，因此預防有效量可低於治療有效量。"長期，，施用指與短期模式相反，以連續模式施用藥物，從而將初始治療效果(活性)維持較長一段時間。"間歇"施用指不是無間斷連續進行的治療，而是本質上周期性的。為了治療目的，"哺乳動物"指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、家兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、貓等。優選的是，哺乳動物指人。術語"藥物配製劑，，指其形式容許活性成分的生物學活性是有效的，且不含對會施用該配製劑的受試者產生不可接受的毒性的別的成分的製備物。此類配製劑是無菌的。"無菌"配製劑是無菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。如本文中所使用的，術語"約，，或"大約，，指本
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的技術人員容易知道的、相應數值的通常誤差範圍。如本文中所使用的，"抗組胺藥"指拮抗組胺的生理學效應的藥劑。組胺對其受體H,和H2的結合導致特徵性的變應性症狀和效應或搔癢、發紅、腫脹等。許多抗組胺藥通過阻斷組胺對其受體H1和H2的結合來起作用；然而，認為其它抗組胺藥通過抑制組胺的釋放來起作用。抗組胺藥的例子有氯苯那敏(chlorpheniramine)、苯海拉明(diphenhydramine)、異丙漆(promethazine)、色普酸納(cromolynsodium)、阿絲。米峻(astemizole)、阿4L^也定馬來酸鹽(azatadinemaleate)、溴苯那每丈馬來酸鹽(bropheniraminemaleate)、卡比沙明馬來酉交鹽(carbinoxaminemaleate)、西替利口秦鹽酸鹽(cetirizinehydrochloride)、氣馬斯汀延胡索酸鹽(clemastinefumarate)、賽庚。定鹽酸鹽(cyproheptadinehydrochloride)、右溴苯那敏馬來酸鹽(dexbrompheniraminemaleate)、右氯苯刃卩每l馬來酉交鹽(dexchlorpheniraminemaleate)、茶苯海日月(dimenhydrinate)、苯海拉明鹽酸鹽(diphenhydraminehydrochloride)、多西拉敏琥珀酸鹽(doxylaminesuccinate)、fexofendadine鹽酸鹽、terphenadine鹽酸鹽、羥口秦鹽酸鹽(hydroxyzinehydrochloride)、loratidine、美克洛口秦鹽酸鹽(meclizine43hydrochloride),曲吡那敏4寧檬酸鹽(tripelannaminecitrate)、曲吡那敏鹽酸鹽(tripelennaminehydrochloride)、曲普利口定鹽酸鹽(triprolidinehydrochloride)。如本文中所使用的，"支氣管擴張藥"描述拮抗或逆轉支氣管收縮的藥劑，支氣管收縮是在早期譯喘反應中典型發生的生理學事件，導致肺容量降低和呼吸短促。支氣管擴張藥的例子包括腎上腺素(一種廣泛作用的a和卩-腎上腺素能藥)，和P-腎上腺素能藥，albuterol,吡布特羅(pirbuterol)、metaproterenol、沙美特羅(salmeterol)、和isoetharine。支氣管擴張還可以通過施用黃嘌淋來實現，包括氨茶鹼(aminophylline)和茶石鹹(theophylline)。如本文中所使用的，"糖皮質激素"描述基於類固醇的、具有抗炎活性的藥劑。糖皮質激素常用於減輕晚期哮喘反應。糖皮質激素的例子包括潑尼松(prednisone)、4咅氯米+〉二丙酉臾鹽(beclomethasonedipropionate)、曲安奈《急(triamcinoloneacetonide)、氟尼縮+》(flunisolide)、倍4也米^^(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松曲安西龍(desamehasonetramcinolone)、氟氬可的^^乙酸鹽(fludrocortisoneacetate)、氟尼縮松(flunisolide)、氟替卡松丙酸鹽(fluticasonepropionate)、氫化可的+〉(hydrocortisone)、潑尼+〉龍(prednisolone)[包4舌曱潑尼龍(methylprednisolone)，例如SOLU-MEDROL⑧曱潑尼龍琥珀酸鈉]、和曲安西龍(triamcinolone)。如本文中所使用的，"非類固醇抗炎藥"或"NSAID"描述不是基於類固醇的、具有抗炎活性的藥劑。NSAID的例子包括阿西美辛(acematacin)、醋氨酚(acetaminophen)、阿司匹林(aspirin)、阿丙宗(azapropazone)、貝i若酉旨(benorylate)、溴芬酸鈉(bromfenacsodium)、環氧合酶(COX)-2抑制劑(諸如GR253035、MK966、塞來考昔(celecoxib)(CELEBREX;4畫(5-(4-曱基苯基)_3-(三氟曱基)-lH-吡唑-1-基)苯磺醯胺)和伐地考昔(valdecoxib)(BEXTRA))、雙氯芬酸(diclofenac)、雙氯芬酸遲緩劑(diclofenacretard)、雙氯芬酸鈉(diclofenacsodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、芬布芬(fenbufen)、一一i若;^各芬4丐(fenoprofencalcium)、氣t匕》各芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬遲緩劑(ibuprofenretard)、。引咮美辛(indomethacin)、酉同洛芬(ketoprofen)、甲氯滅酸鈉(meclofenamatesodium)、曱滅酸(mefenamicacid)、美洛昔康(meloxicam)(MOBIC⑧)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生4內(naproxensodium)、^:布宗(oxyphenbutazone)、j呆泰4^(phenylbutazone)、p比羅昔康(piroxicam)、舒才木酸(sulindac)、替i若昔康(tenoxicam)、p塞洛芬酸(tiaprofenicacid)、託美丁(tolmetin)、託美丁鈉(tolmetinsodium),包括其鹽和衍生物等。術語"IgE介導的病症"包括特應性病症，其特徵在於對許多常見的、天然存在的吸入的和攝入的抗原產生免疫學應答的一般遺傳傾向和持續生成IgE抗體。具體的特應性病症包括變應性哮喘、變應性鼻炎(結膜炎)、特應性皮炎、食物過敏、過敏反應、接觸性皮炎、變應性胃腸病、變應性支氣管肺麴黴病和變應性紫癜(Henoch-Sch6nlein)。特應性患者常常具有多種變態反應，意味著他們具有針對許多環境變應原的IgE抗體和來自許多環境變應原的症狀，所述環境變應原包括季節性的、終年性的和職業性的變應原。季節性變應原的例子包括花粉(例如草、樹、黑麥(rye)、貓尾草(timothy)、豚草(ragweed))，而終年性變應原的例子包括真菌(例如黴菌、黴菌孢子)、羽毛、動物(例如寵物或其它動物毛髮皮屑)和昆蟲(例如塵蟎)碎屑。職業性變應原的例子還包括動物(例如小鼠)和植物抗原以及藥物、去汙劑、金屬和免疫增強劑諸如異氰酸鹽/酯。能導致IgE介導的反應的非抗原特應性刺激包括感染、刺激物(諸如吸菸、燃燒煙霧、柴油機廢氣微粒和二氧化硫)、運動、冷和情緒壓力。具有某種遺傳背景的特應性和非特應性個體中的特定超敏感性反應可源自對食物(例如豆、花生)中蛋白質、毒液(例如昆蟲、蛇)、疫苗、激素、抗血清、酶、膠乳、抗生素、肌肉鬆弛劑、維生素、細胞毒素、鴉片劑、和多糖諸如糊精、鐵右旋糖苷和聚明膠肽的暴露。其它與升高的IgE水平有關的病症(它們表現為IgE介導的且能用本發明的配製劑治療的)包括共濟失調性毛細血管擴張症、丘-施二氏症候群、溼滲、腸炎、胃腸病、移植物抗宿主反應、高IgE(喬布)症候群、超敏感性(例如過敏性超敏反應、假絲酵母病、血管炎)、IgE骨髓瘤、炎性腸病(例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、不確定的結腸炎和傳染性結腸炎)、黏膜炎(例如口腔黏膜炎、胃腸黏膜炎、鼻黏膜炎和直腸炎)、壞死性小腸結腸炎和食管炎、寄生蟲病(例如錐蟲病)、超敏感性血管炎、蕁麻疹和維-奧二氏症候群。另外，不管病症自身是否與升高的IgE有關，可以通過降低IgE水平來治療，如此應當認為在"IgE介導的病症"的範圍內的病症包括阿狄森氏病(慢性腎上腺皮質功能減退)、脫髮、遺傳性血管性水腫、血管性水腫(班尼斯特氏病、血管神經性水腫)、強直性脊柱炎、再生障礙性貧血、動脈炎、澱粉樣變、免疫性病症(諸如自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性多內分泌腺衰竭、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性細胞減少、自身免疫性腎小球腎炎、貝切特氏病、支氣管炎、伯格氏病、大皰性類天皰瘡、卡普蘭氏症候群(類風溼性塵肺)、心臟炎、口炎性腹瀉、切-東二氏症候群、慢性梗阻性肺病(COPD)、科-李二氏症候群(虹膜角膜內皮症候群)、CREST症候群、皰疹樣皮炎(杜林氏病)、糖尿病、嗜酸細胞性筋膜炎、嗜酸細胞性腎炎、鞏膜外層炎、外源性變應性肺泡炎、家族性陣發性多漿膜炎、費爾4是氏症候群、纖維化肺泡炎、腎小J求腎炎、古德帕斯丘氏症候群、粒細胞減少症、肉芽腫、肉芽腫病、肉芽腫肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏症候群(多神經炎)、橋本氏曱狀腺炎(淋巴結樣曱狀腺腫)、血色素沉積症、組織細胞增多症、嗜酸細胞增多症候群、腸易激症候群、幼年型關節炎、角膜炎、麻風、紅斑狼瘡、萊爾氏病、萊姆病、混合性結締組織病、單神經炎、多發性單神經炎、穆-韋二氏症候群、黏膜皮膚淋巴樣症候群(川崎氏病)、多中心網狀組織細胞增多症、多發性硬化、重症肌無力、蕈樣肉芽腫病、panninculitis、類天皰痴、天皰瘡、心包炎、多神經炎、結節性多動脈炎、銀屑病、銀屑病關節炎、肺關節炎、肺腺瘤病、肺纖維化、復發性多軟骨炎、風溼熱、類風溼性關節炎、鼻竇炎症(鼻竇炎)、結節病、鞏膜炎、硬化性膽管炎、血清病、塞扎裡綜合症、斯耶格倫氏症候群、史-約二氏症候群、系統性肥大細胞增多症、移植排斥、血小板減少性紫癜、胸腺淋巴發育不全、葡萄膜炎、白癜風、韋格納氏肉芽腫病。"自身免疫性病症"在本文中指源於且針對個體自身組織或器官的疾病或病症或其共分離現象(co-segregation)或表現或由其導致的疾患。在這些自身免疫性和炎性病症的許多病症中，可以存在許多臨床和實驗室標誌，包括但不限於高丙種球蛋白血症、高水平自身抗體、組織中抗原-抗體複合物沉積、得益於皮質類固醇或免疫抑制治療、及受侵害組織中的淋巴樣細胞集合體。不限於任意一種有關B細胞介導的自身免疫性病症的理論，認為B細胞通過眾多機制在人自身免疫病中表現出致病作用，包括自身抗體產生、免疫複合物形成、樹突細胞和T細胞活化、細胞因子合成、直接趨化因子釋放和提供用於異位新淋巴生成的巢。這些途徑中的每一種可以以不同程度參與自身免疫病的病理學。"自身免疫性疾病，，可以是器官特異性疾病(即免疫應答特異性針對一種器官系統，諸如內分泌系統、造血系統、皮膚、心肺系統、胃腸和肝系統、腎系統、曱狀腺、耳、神經肌肉系統、中樞神經系統等)或系統性疾病(其能影響多種器官系統，例如系統性紅斑狼瘙(systemiclupuserythematosus,SLE)、類風溼性關節炎(rheumatoidarthritis,RA)、多肌炎(polymyositis)等)。優選的此類疾病包括自身免疫性風溼病學病症(諸如例如RA、斯耶襠一侖氏症候群(Sj6gren'ssyndrome)、硬皮病、狼裔(諸如SLE和狼療腎炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗體症候群、和銀屑病關節炎)、自身免疫性胃腸和肝病症(諸如例如炎性腸病(例如潰痴性結腸炎和克羅恩氏病(Crohn'sdisease))、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、和乳糜瀉)、血管炎(諸如例如ANCA陰性血管炎和ANCA相關血管炎，包括丘施二氏血管炎(Churg-Straussvasculitis)、韋格納氏肉芽月中病(Wegener'sgranulomatosis),和微觀多脈管炎)、自身免疫性神經病學病症(諸如例如多發性硬化、視性眼陣攣肌陣攣症候群、重症肌無力、視神經脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer，sdisease)、和自身免疫性多神經病)、腎病症(諸如例如腎小球腎炎、古德帕斯丘氏症候群(Goodpasture，ssyndrome)、和貝4各爾氏病(Berger，sdisease))、自身免疫性皮膚病學病症(諸如例如銀屑病、蕁麻疹、hives、尋常型天皰齊、大皰性類天皰痴、、和皮膚紅斑狼痴)、血液學病症(諸如例如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜、和自身免疫性溶血性貧血)、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自身免疫性聽覺疾病(諸如例如內耳病和聽力損失)、貝切特氏病(Behcet'sdisease)、雷諾氏症候群(Raynaud'ssyndrome)、器官移植、和自身免疫性內分泌病症(諸如例如糖尿病相關自身免疫病諸如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison，sdisease)、和自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯氏病(Graves'disease)和曱狀腺炎))。更優選的此類疾病包括例如RA、潰瘍性結腸炎、ANCA相關血管炎、狼瘡、多發性硬化、斯耶格倫氏症候群、格雷夫斯氏病、IDDM、惡性貧血、曱狀腺炎、和腎小球腎炎。術語"細胞毒劑"在用於本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素)、和毒素諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素或其片段。"化療劑"指可用於治療癌症的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylatingagents)，諸如塞替派(thiotepa)和環磷醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN);磺酸烷基酯類(alkylsulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和底泊舒凡(piposulfan);氮丙。定類(aziridines),諸長口笨佐替》泉(benzodepa)、卡》皮酉昆(carboquone)、美妥替》泉(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包4舌六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐石粦醯胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐疏代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatadn)和布拉他辛酮(bullatacinone));5-9-四氬大麻(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARJNOL);卩-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);4火水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜樹石鹹(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙醯喜樹鹼、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin);培美曲塞(pemetrexed);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;TLK-286;CDP323,—種口服a-4整聯蛋白抑制劑；sarcodictyin;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards),"i者如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽石粦醯胺(cholophosphamide)、對,莫司汀(estramustine)、異環石粦醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧。定氮齊(uracilmustard);亞確'脲類(nitrosoureas),i者如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素yll和加利車黴素coll(參見例如NicolaouWAngew，Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽環類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;埃斯波黴素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白彿二炔類抗生素髮色團)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴黴素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地託比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN⑧、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星鹽酸脂質體注射液(DOXIL⑧和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycins)諸如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolicacid)、諾拉黴素(nogalamycin)、揪欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、噤呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegaftir)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA)、埃坡黴素(epothilone);和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蝶呤、蝶醯三穀氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);。票呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、石克咪。票呤(thiamiprine)、石危鳥嘌呤(thioguanine);嘧咬類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖月包香(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿芬(floxuridine)、和imatinib(—種2-苯基氨基嘧啶衍生物)，以及其它c-Kit抑制劑；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic:acid);醋葡醛內酯(aceglatone);醛磷醯胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙醯丙酉交(aminolevulinicacid);恩尿。密口定(eniluracil);安吖咬(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地石粦醯胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋按(elliptiniumacetate);依託格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香蒜多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物鹼類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol);安絲菌素(ansamitocin);米4乇胍月宗(mitoguazone);米託'葸、酉昆(mitoxantrone);莫艱達醇(mopidamol);二胺硝吖口定(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基醯肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖複合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根黴素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);螺旋4者(spirogermanium);糹田交4連孢菌酉同酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2，2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疾孑包菌素(verrucarin)A、杆孑包菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);口底泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苦(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids)，例如⑧帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他塞(ABRAXANETM)、和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE⑧)；苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-碌u鳥嘌呤(thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);曱氨蟲萊p令(methotrexate);4白類似4勿，i者3口"頃4白(cisplatin)和卡4白(carboplatin);長春鹼(vinblastine)(VELBAN);柏；依託泊苷(etoposide)(VP-16);異環磷醯胺(ifosfamide);米託蒽醌(mitoxantrone);長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利鉑(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道i若黴素(daunomycin);氨基蟲萊p令(aminopterin);4尹本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids),諸如維A酸(retinoicacid);任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上迷物質的組合，諸如CHOP(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼和潑尼松龍聯合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATIN)聯合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調節、降低、阻斷、或抑制可促進癌生長的激素效果的抗激素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調節劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和託瑞米芬(toremifene)(FARESTON);抗孕酮類；雌激素受體下調劑類(ERD);雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX);功能為抑制或關閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)(LUPRON⑧和ELIGARD⑧)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞;f木(buserelinacetate)和曲普瑞4木(triptorelin);抗名,激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RIVISOR)、來曲唑(letrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BOHEFOS或OSTAC)、依替膦酸鈉(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、卩坐來膦酸/峻來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)(ZOMETA)、阿倫膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及粘著細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE⑥疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑥疫苗和VAXID⑧疫苗；拓樸異構酶l抑制劑(例如LURTOTECAN⑧)；抗雌激素，諸如氟維司群(fulvestrant);Kit抑制劑，諸如伊馬替尼(imatinib)或EXEL-0862(—種酪氨酸激酶抑制劑)；EGFR抑制劑，諸如erlotinib或西妥昔單抗(cetuximab);抗VEGF抑制劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab);arinotecan;rmRH(例如ABARELIX⑧)；lapatinib和lapatinibditosylate(—種ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱作GW572016);17AAG(格爾德黴素(ge!danamycin)衍生物，其是熱休克蛋白(Hsp)90毒物)；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。"生長抑制劑"指在體外或在體內抑制其生長依賴於受體活化的細胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑包括顯著降低處於S期的受體依賴性細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處於S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導G1停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)和長春花生物-威類(vincaalkaloids)(長春新石威(vincristine)和長春鹼(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構酶II抑制齊'J諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依託泊苷(etoposide)和博來黴素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴噪(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等人，WBSaunders,Philadelphia,1995，尤其是第13頁。紫杉烷類(帕利他塞(paclitaxel)和多西他塞(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他塞(TAXOTERE,Rhone陽PoulencRorer)是巾白利他塞(TAXOL,Bristol-MyersSquibb)的半合成類似物。術語"細胞因子"是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子；白介素(IL),諸如IL-1、IL-la、IL陽2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-15，包括PROLEUKIN⑧rIL-2;腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用於本文時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物，包括通過人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。術語"激素，，指多肽激素，其一般由具有導管的腺器官分泌。激素包括例如生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨醯人生長激素、和牛生長激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；雌二醇；激素代替療法；力#;敫素類，i者詿口卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈寸也i#酉同(dromostanolonepropionate)、環石危雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)或睪內西旨(testolactone);松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);促乳素、胎盤催乳激素、小鼠促性腺激素相關肽、促性腺激素釋放激素；抑制素；激活素；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；及血小板生成素。在用於本文時，術語激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質和天然序列激素的生物學活性等效物，包括通過人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。術語"生長因子"指促進生長的蛋白質，包括例如肝生長因子；成纖維細胞生長因子；血管內皮生長因子；神經生長因子，諸如NGF-(3;血小板衍生生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-(3;胰島素樣生長因子-I和-II;促紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductivefactor);幹擾素，諸如幹擾素-a、-卩和-r，及集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨p藍細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF)。在用於本文時，術語生長因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質和天然序列生長因子的生物學活性等效物，包括通過人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。術語"整聯蛋白"指容許細胞結合和應答胞外基質且涉及多種細胞功能諸如傷口癒合、細胞分化、腫瘤細胞歸巢和凋亡的受體蛋白質。它們是涉及細胞-胞外基質和細胞-細胞相互作用的細胞粘附受體大家族的一部分。功能性整聯蛋白由非共價結合的兩個跨膜糖蛋白亞基組成，稱為a和l3。a亞基彼此都享有一定同源性，(3亞基也是如此。受體總是包含一條a鏈和一條p鏈。例子包括ot6(31、a3pi、a7pi、LFA-1等。在用於本文時，術語"整聯蛋白"包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質和天然序列整聯蛋白的生物學活性等效物，包括通過人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。"TNF拮抗劑"在本文中定義為在體外、原位、和/或在體內降低、阻斷、抑制、消除、或幹擾TNFot活性的分子。合適的TNF拮抗劑還能降低、阻斷、消除、幹擾、阻止和/或抑制TNFRNA、DNA或蛋白質合成，TNFa釋放，TNFa受體信號傳導，膜TNFa切割，TNFa活性，TNFa生成和/或合成。此類TNF拮抗劑包括但不限於抗TNFa抗體、其抗原結合片段、其特異性結合TNFa且在結合至TNFa時破壞或消減哺乳動物中表達TNPa的細胞和/或幹擾那些細胞的一項或多項功能的指定突變體或結構域、可溶性TNF受體(例如p55、p70或p85)或片段、其任何多肽、小分子TNF拮抗劑例如TNF結合蛋白I或II(TBP-I或TBP-II)、nerelimonmab、CDP-571、英夫利昔單抗(infliximab)、依那西普(enteracept)(ENBRELTM)、阿達木單抗(adalimulab)(HUMIRATM)、CDP-571、CDP-870、阿非莫單抗(afelimomab)、來那西普(lenercept)、諸如此類、其抗原結合片段、和特異性結合TNFa的受體分子；阻止和/或抑制TNFa合成、TNFa釋放或其對靶細胞的作用的化合物，諸如沙利度胺(thalidomide)、替尼達普(tenidap)、磷酸二酯酶抑制劑(例如己酮可可鹼(pentoxifylline)和咯利普蘭(rolipram))、A2b腺苷受體激動劑和A2b腺苷受體增強劑；阻止和/或抑制TNFa受體信號傳導的化合物，諸如絲裂原活化的蛋白質(MAP)激酶抑制劑；阻斷和/或抑制膜TNFa切割的化合物，諸如金屬蛋白酶抑制劑；阻斷和/或TNFa活性的化合物，諸如血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑(例如卡託普利(captopril));及阻斷和/或抑制TNFa生成和/或合成的化合物，諸如MAP激酶抑制劑。優選的拮抗劑包括抗體。"腫瘤壞死因子-a"或"TNF-a"指包含Pennicada/.，A^w"312:721(1984)或AggarwalWa/.,J5C260:2345(1985)的胺基酸序列的人TNF-a分子。"TNF-a抑制劑"在本文中指在一定程度上抑制TNF-a的生物學功能的藥劑，一般通過結合TNF-a並中和其活性。本文中的TNFa抑制劑的例子包括依那西普(etanercept)(ENBREL)、英夫利昔單抗(infliximab)(REMICADE⑧)、和阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRATM)。本文中"整聯蛋白拮抗劑或抗體"的例子包括LFA-1抗體，諸如可以從Genentech購買的efalizumab(RAPTIVA),或a4整聯蛋白抗體，諸如可以從Biogen購買的natalizumab(ANTEGREN),或二氮雜環苯丙氨酸衍生物(WO2003/89410)、苯丙氨酸衍生物(WO2003/70709、WO2002/28830、WO2002/16329和WO2003/53926)、苯基丙酸衍生物(WO2003/10135)、烯胺衍生物(WO2001/79173)、丙酸書t生物(WO2000/37444)、鏈烷酸衍生物(WO2000/32575)、取代苯基衍生物(美國專利No.6,677,339和6,348，463)、芳香胺衍生物(美國專利No.6,369,229)、ADAM解聯蛋白結構域多肽(US2002/0042368)、av卩3整聯蛋白的抗體(EP633945)、氮橋二環胺基酸衍生物(WO2002/02556)等。術語"免疫抑制劑"指起抑制或掩蓋本文中所治療受試者的免疫系統作用的物質。這將包括抑制細胞因子生成、下調或抑制自身抗原表達、或掩蓋MHC抗原的物質。此類藥劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶類(見U.S.4,665,077);非類固醇抗炎藥類(NSAID);更昔洛韋(ganciclovir),他克莫司(tacrolimus)、糖皮質激素類諸如皮質醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎劑類諸如環加氧酶抑制劑、5-脂加氧酶抑制劑或白三蹄受體拮抗劑；嘌呤拮抗劑類，諸如硫峻噪呤(azathioprine)或黴酚酸嗎乙西旨(mycophenolatemofetiLMMF);託卡特(trocade)(Ro32-355);外周西4各馬(cj)受體拮抗劑諸如ISR-31747;烷化劑類，諸如環磷醯胺(cyclophosphamide)、溴隱亭(bromocryptine)、達那峻(danazol)、氨苯石風(dapsone)、戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如U.S.4，120,649中所記載的)；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢黴素A;類固醇類，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物，例如潑尼木>(prednisone)、曱潑尼龍(methylprednisolone)包4舌SOLU-MEDROL⑧甲潑尼龍琥珀酸鈉、利美索龍(rimexolone)、和地塞米松(dexamethasone);二氫葉酸還原酶抑制劑類，諸如曱氨蝶呤(methotrexate)(口月艮或皮下)；"l元疾劑類，i者長口氯p奎(chloroquine)和輕氯p奎(hydroxycloroquine);柳氮磺吡啶(sulfasalazine);來氟米特(leflunomide);細胞因子釋放抑制劑諸如SB-210396和SB-217969單克隆抗體及MHC1I拮抗劑諸如ZD2315;PG1受體拮抗劑諸如ZD4953;VLA4粘附阻斷劑諸如ZD7349;抗細胞因子抗體或抗細胞因子受體抗體，包括抗幹擾素-a、-p或-y抗體，抗TNF-a抗體(英夫利昔單抗(infliximab)(REMICADE⑧)或阿達木單抗(adalimumab)),抗TNF-a免疫粘附素(依那西普(etanercept))，抗TNF-P抗體，白介素-1(IL-1)阻斷劑諸如重組HuIL-lRa和IL-1B抑制劑，抗白介素-2(IL-2)抗體和抗IL-2受體抗體；IL-2融合毒素；抗L3T4抗體；來氟米特(leflunomide);異源抗淋巴細胞球蛋白；OPC-14597;NISV(免疫應答^f奮飾劑)；必需脂肪酸諸如y-亞麻酸或二十碳五烯酸；CD-4阻斷劑；泛(pan)T抗體，優選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；共刺激修飾劑(例如CTLA4-Fc融合物，也稱作ABATACEPTtm;抗白介素-6(IL-6)受體抗體和拮抗劑；抗LFA-1抗體，包括抗CDlla和抗CD18抗體；包含LFA-3結合域的可溶性肽(WO1990/08187);鏈激酶；IL-10;抗IL-4拮抗劑，抗IL-13拮抗劑和雙特異性抗IL-4/IL-13拮抗性抗體，轉化生長因子-13(TGF-(3);鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;恩莫單抗(enlimomab);CDP-855;PNP抑制劑;CH-3298;GW353430;4162W94;苯丁酸氮芥(chlorambucil);脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕黴素(rapamycin);T細胞受體(U.S.5,114,721);T細胞受體片段(Offnerda/,,Science251:430-2(1991);WO1990/11294;Janeway,iVafw化，341:482-483(1989);WO1991/01133);BAFF拮抗劑，諸如BAFF抗體和BR3抗體；zTNF4拮抗劑(MackayandMackay，7>e"A/mwwwo/.23:113-5(2002));幹擾T輔助細胞信號的生物製劑，諸如抗CD40受體或抗CD40配體(CD154),包括CD40-CD40配體的阻斷性抗體(例如Durieda/"5We"ce,261:1328-30(1993);Mohanaa/.，《//wwww/"154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck"a/.，5We"ce,265:1225-7(1994));及T細胞受體抗體(EP340,109),諸如T10B9。本文中的一些優選免疫抑制劑包括環磷醯胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、來氟米特、MMF、或曱氨蝶呤(MTX)。"緩解病情的抗風溼藥"或"DMARD"包括例如氯喹(chloroquine)、羥氯喹(hydroxycloroquine)、myocrisin、金i若芬(auranofin)、杉卩氮石黃p比口定(sulfasalazine)、曱氨蝶呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔單抗(infliximab)(及口服和皮下MTX)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青黴胺、金鹽(口服)、金鹽(肌肉內)、米諾環素(minocycline),環孢黴素(cyclosporine)例如環孢黴素A和表面環孢黴素、葡萄球菌蛋白A(GoodyearandSilverman，J五xp.M^/.197:1125-39(2003)),包括其鹽和衍生物，等。"B細胞，，指在骨髓中成熟的淋巴細胞，包括幼稚B細胞、記憶B細胞、或效應B細胞(漿細胞)。本文中的B細胞可以是正常的或非惡性的。"B細胞表面標誌物，，或"B細胞表面抗原，，在本文中指在B細胞表面上表達的抗原，可以用能結合它的拮抗劑來靶向它。例示性的B細胞表面標誌物包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白細胞表面標誌物(有關說明參見《TheLeukocyteAntigenFactsBook》，第2版，1997,Barclay等編，AcademicPress,HarcourtBrace&Co.，NewYork)。其它B細月包表面才示志物包括RP105、FcRH2、B-cellCR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRHl、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA、和239287。優選的B細胞表面標誌物是在B細胞上較之哺乳動物的其它非B細胞組織優先表達的，而且可以是在前體和成熟B細胞二者上都表達的。最優選的此類標誌物是CD20和CD22。"CD20，，抗原或"CD20"是在超過90。/。來自外周血或淋巴樣器官的B細胞表面上找到的約35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在於正常B細胞以及惡性B細胞二者上，但在幹細胞上不表達。CD20在文獻中的其它名稱包括"B淋巴細胞限制抗原"和"Bp35"。CD20抗原記載於例如Clarkda/.,iVoc.A^f/.^cad5W.卩固」82:1766(1985)。"CD22"抗原或"CD22"，也稱為BL-CAM或Lyb8，是分子量約130(縮短的)至140kD(未縮短的)的l型整合膜糖蛋白。它在B淋巴細胞的細胞質和細胞膜二者中表達。CD22抗原在B細胞淋巴細胞分化的早期出現，大約在與CD19抗原相同的階段。與其它B細胞標誌不同，CD22膜表達局限於成熟B細胞(CD22+)與漿細胞(CD22-)之間包含的分化晚期。CD22抗原記載於例:i口Wilsonefa/.,Afec/.173:137(199l)和WilsonWo/.，J/mmwwo/.150:5013(1993)。"結合B細胞表面標誌的抗體"指在結合B細胞表面標誌後破壞或消減哺乳動物中的B細胞和/或幹擾一種或多種B細胞功能(例如通過降低或阻止由B細胞引發的體液反應)的分子。優選的是，該抗體能夠在用其處理的哺乳動物中消減B細胞(即降低循環中的B細胞水平)。這種消減可通過各種機制來實現，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDQ、抑制B細胞增殖、和/或誘導B細胞死亡(如通過凋亡)。CD20抗體的例子包括"C2B8"，現在稱作"rituximab"(RITUXAN)(美國專利No.5,736,137);釔[90]標記的2B8鼠抗體，稱作"Y2B8"或"IbritumomabTiuxetan，，(ZEVALIN),可從IDECPharmaceuticals公司購買(美國專利No.5,736,137;2B8於1993年6月22日保藏於ATCC，編號HB11388);鼠lgG2a"B1",也稱作"Tositumomab",任選用1311標記以產生'""I-B1"或"碘131tositumomab，，抗體(BEXXAR)，可從Corixa購買(還可參見美國專利No.5,595,721);鼠單克隆抗體"1F5"(PressS/oW69(2):584-591(1987》及其變體，包括"框架修補的"或人源化的1F5(WO2003/002607,Leung，S.;ATCC保藏物1_96450);鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國專利No.5,677,180);人源化2H7(WO2004/056312，Lowman"a/.及下文所列)；而MAX-CD2tm完全人的高親和力抗體，靶向B細胞細胞膜中的CD20分子(Genmab,Denmark;參見例^口GlennieandvandeWinkel,Z>wgD^cove^y7bt/qy8:503-510(2003);Cragg"a/.,101:1045-1052(2003));WO2004/035607(TeelingWa/.)中所列出的人單克隆抗體；AME-133TM抗體(AppliedMolecularEvolution);A20抗體或2003/0219433，Immunomedics);及單克隆抗體L27、G28陽2、93-lB3、B-C1或NU-B2,可,人國際白細月包分類研究組(InternationalLeukocyteTyping^Vorkshop)獲;f尋(Valentineefa/"In:丄ei/A:oc;^e2);/7/"gMcMichael糹扁,p.440,OxfordUniversityPress(1987))。本文中優選的CD20抗體是人源化的、嵌合的或人的CD20抗體，更優選rituximab、人源化2H7、嵌合的或人源化的A20抗體(Immimomedics)、及HUMAX-CD20TM人CD20抗體(Genmab)。術語"利妥昔單抗"(rituximab)或"RITUXAN⑧"在本文中指針對CD20抗原的遺傳工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利No.5，736，137中稱為"C2B8",包括其保持結合CD20能力的片段。純粹為了本發明且除非另有說明，"人源化2H7"指人源化CD20抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體在體內有效消減靈長類B細胞，該抗體包括US2006/0062787及其附圖中所列舉的那些，而且包括型式114，其序列見US2006/0188495。還可參見US2006/0034835和US2006/0024300。在本發明的各種優選實施方案的匯總中，除了下表中指明的胺基酸替代位置，基於us2006/0062787中所披露的2H7型式16的變體的V區具有vl6的胺基酸序列。除非另有說明，2H7變體具有與vl6相同的L鏈。_tableseeoriginaldocumentpage58一種優選的人源化2H7是具有型式16的序列的完整抗體或抗體片段。另一種優選的人源化2H7具有型式l14的序列。"BAFF拮抗劑"是任何阻斷BAFF或BR3活性的分子。它們包括包含BR3、TACI或BCMA或其結合BAFF的變體中結合BAFF的一部分的免疫粘附素。在其它方面，BAFF拮抗劑是BAFF抗體。"BAFF抗體"是結合BAFF的抗體，優面，BAFF拮抗劑是BR3抗體。"BR3抗體"是結合BR3，優選在人BR3中包含人BR3的殘基23-38的區域內結合BR3的抗體。人BAFF和人BR3的序列可見於例如US2006/0062787。BAFF結合多肽或BAFF抗體的其它例子可見於例如WO2002/092620;WO2003/014294;Gordon"g/.,所oc/^m"^v42(20):5977-83(2003);Kelleyea/.，《/扁.C7zew,279:16727-35(2004);WO1998/18921;WO2001/12812;WO2000/68378;WO2000/40716。"抗IgE抗體，，包括任何在IgE結合至肥大細胞和嗜鹼性細胞上的高親和力受體時以不誘導交聯的方式特異性結合IgE的抗體。例示性的抗體包括本發明的抗體以及rhuMabE25(E25，XOLAIR)、E26、E27，以及CGP-5101(Hu-901)和HA抗體。人源化抗IgE抗體E25、E26和E27的重鏈和輕鏈可變域胺基酸序列披露於例如U.S.P.6,172，213和W099/01556。CGP-5101(Hu-901)抗體記載於CorneWa/"(1997)J.Clin.Invest.99(5):879-887;WO92/17207;及ATCC保藏號BRL-10706、BRL-11130、BRL-11131、BRL-11132和BRL-11133。HA抗體記載於USSN60/444,229;WO2004/070011和WO200術0010。II.實施本發明的模式A.重組製備本發明還提供了編碼凋亡性抗IgE抗體的分離的核酸、包含所述核酸的載體和宿主細胞、及用於生產所述抗體的重組技術。為了重組生產抗體，分離編碼抗體的核酸，並插入可複製載體，用於進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼單克隆抗體的DNA易於使用常規規程分離和測序(例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。可以獲得許多載體。載體構件通常包括但不限於下列一種或多種信號序列、複製起點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列。本發明的抗IgE抗體不僅可以直接重組生產，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽優選是成熟蛋白質或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列優選是受到宿主細胞識別並加工(即受到信號肽酶切割)的。對於不識別和加工天然哺乳動物信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列的原核信號序列取代。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉化酶前導序列、a因子前導序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡萄糖澱粉酶前導序列、或WO90/13646中記載的信號取代。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疹gD信號。將此類前體區(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼IgE結合抗體的DNA連接。0復浙啟^溝伴表達和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴於宿主染色體DNA而複製的序列，包括複製起點或自主複製序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質粒pBR322的複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，2(a質粒起點適合於酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動物表達載體不需要複製起點構件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早期啟動子)。0)遂#差^溝伴表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標誌。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青黴素、新黴素、曱氨蝶呤或四環素；(b)補足營養缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由複合培養基獲得的必需營養物，例如用於芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而倖免於選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新黴素、黴酚酸和潮黴素。適於哺乳動物細胞的選擇標誌的另一個例子是那些能夠鑑定有能力攝取IgE結合抗體核酸的細胞的選擇標誌，諸如DHFR、胸香激酶、金屬硫蛋白-i和-n優選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一種竟爭性拮抗劑的培養基中進行培養來鑑定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在採用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如ATCCCRL-9096)。或者，可以通過細胞在含有針對選擇標誌的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那黴素、新黴素或G418的培養基中的生長來選擇經編碼IgE結合抗體、野生型DHFR蛋白質、和另一種選擇標誌諸如氨基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4,965,199。適用於酵母的選擇基因是存在於酵母質粒YRp7中的&p7基因(Stinchcomb"a/.,Atow282:39(1979))。^7基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變抹，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選擇標誌。Jones,Ge"e"cs85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中存在&;7損傷隨之提供了用於通過在缺少色氨酸時的生長來檢測轉化的有效環境。類似的，用攜帶LeM2基因的已知質粒補^Lew2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6jim環狀質粒pKDl的載體可用於轉化克魯維氏酵母屬酵母。或者，報導了用於在乳酸克魯維氏酵母中大規;漢生產重組小牛凝乳酶的表達系統。VandenBerg,歷o/rec/z"o/ogy8:135(1990)。還披露了用於由克魯維氏酵母屬的工業用菌株分泌成熟重組人血清清蛋白的穩定多拷貝表達載體。FleerWa/"所o/rec/z"o/ogv9:968-975(1991)。啟動子溝伴表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼IgE結合抗體的核酸可操作連接。適用於原核宿主的啟動子包括//20」啟動子、(3-內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子諸如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用於細菌系統的啟動子還將包含與編碼IgE結合抗體的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區，它位於起始轉錄的位點上遊大約25至30個鹼基處。在許多基因的轉錄起點上遊70至80個鹼基處找到的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核香酸。在大多數真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信號。所有這些序列合適地插入真核表達載體。適用於酵母宿主的啟動子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉錄的額外優點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。適用於酵母表達的載體和啟動子進一步記載於EP73,657。酵母增強子也可以有利地與酵母啟動子一起使用。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄IgE結合抗體受到例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B肝病毒和最優選的猿猴病毒40(SV40)基因組，從異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，及從熱休克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒複製起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4,419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。美國專利No.4,601,978中記載了該系統的一種改良。關於在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人(3-幹擾素cDNA還可參見Reyesea/.,297:598-601(1982)。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。(5」增強f汔伊溝伊常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發明IgE結合抗體的DNA的轉錄。現在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40複製起點晚期一側的增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒複製起點晚期一側的增強子、和腺病毒增強子。關於激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，Atowe297:17-18(1982)。.可以將增強子剪接到載體中，位於IgE結合抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優選位於啟動子的5'位點。問餘^終jA溝伴用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。此類序列通常可以從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區域包含在編碼IgE結合抗體的mRNA的非翻譯部分中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中披露的表達載體。(7)諒i細應的逸舉和脊化適於克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適於此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Esc/zen'c/7/a)例如大腸埃希氏菌(￡.co//)、腸桿菌屬(五"&raZ)acer)、歐文氏菌屬CErvWm'a)、克雷伯氏菌屬(K/e/wW/a)、變形菌屬(屍ra&w力、沙門氏菌屬(5b/mo"e〃a)例如鼠傷寒沙門氏菌(&r/wo"e〃fl/)///h>ww7'w/w)、沙雷氏菌屬(&rra"a)例如粘質沙雷氏菌(&rra"ama/r&ycara)、志賀氏菌屬(57n'ge〃a)、以及芽孢桿菌屬(Sa"，)諸如枯草芽孢桿菌(及^Z^7/》和地衣芽孢桿菌(及//c/^ra/w7m》(例如1989年4月12日公布的DD266，710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(/^ew(io附o"as)^i者3口4同糹錄，支單月包菌Cf！aerwg/wosa)、和鏈黴菌屬(5^e/^ow7ces)。一種優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，儘管其它菌抹諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。可以在細菌中生產全長抗體、抗體片段和抗體融合蛋白，特別是在不需要糖基化和Fc效應器功能時，諸如在將治療用抗體與細胞毒劑(例如毒素)偶聯及免疫偶聯物自身顯示出破壞腫瘤細胞方面的效力時。全長抗體在循環中具有更長的半衰期。在大腸桿菌中的生產更快速且更低廉。關於在細菌中表達抗體片段和多肽，參見例如U.S.5,648,237(Carteraa/.),U.S.5,789,199(Jolya/.)和US.5,840,523(Simmons"它們記載了用於優化表達和分泌的翻譯起始區(TIR)和信號序列。表達後，在可溶性級分中從大腸桿菌細胞糊分離抗體，可以通過例如根據同種型選擇蛋白A或G柱進行純化。最終的純化可以與用於純化例如在CHO細胞中表達的抗體的過程類似的進行。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼IgE結合抗體的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母CSacc/^ra^yc^f用的麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可獲得許多其它屬、種和菌抹且可用於本發明，諸如粟酒裂殖糖酵母CSc/2/zo^cc/wraw;;c^pom6e);克魯維酵母屬(《/w"era^yc^)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K/ac&)、脆壁克魯維酵母(尺./ra&fc)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(i:.Z)w/wn'cw)(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(《.vWc&raw")(ATCC24,178)、Iwa/故(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K(ATCC36，906)、酵母屬(7^ravWa)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母CP/c/n'a/aWon、)(EP183,070);假絲酵母屬(C朋&Wa);瑞氏木黴(7Hc/c^erwGew'a)(EP244,234);粗糙脈孢菌(7Vewmsporacra^a);許旺酵母屬(5b/wcr"m'o^yce"，諸如許旺酵母(Sc/wawrn'omycesoc"We"to/^);和絲狀真菌，i者如例如月，:K孑包菌屬(A^wras/ora！)、青黴屬(Pem'c/〃fwm)、彎《員黴屬(7b/_y;oc/a<i/ww)、和麴黴屬C4s屍e^〃/w力宿主諸如構巢麴黴G4.wVMa"力和黑麴黴G4.m'ger)。適於表達糖基化IgE結合抗體的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊推動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了許多杆狀病毒抹和變體及相應的允許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾S/7。(io;^ra/n^;perab(毛蟲)、埃及j尹蟲iL/4ecfe(蚊子)、白紋l尹蟲iJecfesa/6o;/c^y(蚊子)、黑月復果蟲黽ZVayop/zz7c7me/a"ogawter(果蟲€)和家蠶5ow6yxmon'等宿主。公眾可獲得多種病毒林用於轉染，例如苜蓿尺iC4wtograp/wM/z/om/caNPV的L-1變體和家蠶^wxmor/NPV的Bm-5株，而且此類病毒可依照本發明用作本文中的病毒，特別是用於轉染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和菸草的植物細胞培養物作為宿主。然而，脊推動物細胞得到最多關注，而且培養(組織培養)中脊推動物細胞的繁殖已經成為常規規程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉化的猴腎CVl系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培64養中生長而亞克隆的293細胞，Graham".，Wra/.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO，Urlaubefa/.，屍rac.7Va//.Jcad5W,77:4216(1980));小鼠塞託利(sertoli)細胞(TM4Mather,所o/.23:243-251(1980));猴腎細胞(CVl,ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Mather"a/.,/l朋a/siVUcad383:44-68(1982);MRC5細胞；FS4細胞；和人肝瘤系(HepG2)。用上文所述用於生產IgE結合抗體的表達或克隆載體轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規營養培養基中進行培養。(5)潛麥涼i劍可以在多種培養基中培養用於生產本發明IgE結合抗體的宿主細胞。商品化培養基諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM,Sigma)適於培養宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養基作為宿主細胞的；夯養基Hama/.，Me仇￡"z.58:44(1979);Barnesd"/.,5/oc/iem.102:255(1980);美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利覆審30，985。任何這些培養基可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苦酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾範圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養條件，諸如溫度、pH等，就是先前為表達而選擇用於宿主細胞的，這對於普通技術人員而言是顯而易見的。f力拔傳的銷化在使用重組技術時，可以在細胞內、在周質空間中生成抗體，或者直接分泌到培養基中。如果在細胞內生成抗體，那麼作為第一步，通過例如離心或超濾除去宿主細胞或裂解片段的微粒碎片。Carterag/.，5z'o/rec/2"o/ogy10:163-167(1992)記載了用於分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的規程。簡單的說，在存在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯曱基磺醯氟(PMSF)時使細胞糊融化約30分鐘。可通過離心除去細胞碎片。如果將抗體分泌到培養基中，那麼一般首先使用商品化蛋白質濃縮濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元濃縮來自此類表達系統的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來汙染物的生長。可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細胞製備的抗體組合物，優選的純化技術是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用於純4匕基於人yl、Y2或y4重《連的4元體(Lindmarke,a/"//mmw"o/.il/e仇62:1-13(l兆3))。蛋白G推薦用於所有小鼠同種型和人Y3(Gussda/.,五M^9J5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含CH3結構域，則可使用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進行純化。根據待回收的抗體，也可使用其它蛋白質純化技術，諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉澱、反相HPLC、矽土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和碌b酸銨沉澱。在任何預備性純化步驟後，包含目的抗體和汙染物的混合物可進行低pH疏水相互作用層析，使用pH大約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優選在低鹽濃度進行(例如大約0-0.25M鹽)。B.抗體製備多克隆抗體一般通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來醯亞胺苯曱醯磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R!NONR,其中R和R'是獨立的低級烴基，將相關抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質偶聯可能是有用的，例如匙孑U戚血藍蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷醯脂質A、合成二棒分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可以由本領域技術人員無需過度試驗就選出。通過將例如100嗎或5嗎蛋白質或偶聯物(分別用於兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和並將該溶液皮內注射於多個部位，將動物針對抗原、免疫原性偶聯物或衍生物進行免疫。一個月後，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量l/5-l/10的肽或偶聯物對動物進行加強免疫。7-14天後，採集動物的血液，並測定血清的抗體滴度。對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺(plateau)。偶耳關物還可在重組細胞培養中作為蛋白質融合物來製備。同樣，凝聚劑諸如明礬對於增強免疫應答是合適的。單克隆抗體是由一群基本上同質的抗體獲得的，即構成群體的各個抗體相同，除了可以以極d、量存在的可能的天然存在突變和/或翻譯後修飾(例如異構化、醯胺化)。由此，修飾語"單克隆"指明抗體的特徵，即不是分立的抗體的混合物。例如，單克隆抗體可使用最初由KohlerefA^we256:495(1975)記載的雜交瘤方法來製備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)來製備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠，以引發生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用於免疫的蛋白質。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然後，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,Mowoc/owa/v4"//6<%//&s:/V7>7">/es/V<a;c"ce，pp.59-103,AcademicPress,1986)。免疫劑通常會包括抗原性蛋白質或其融合變體。通常，或是使用外周血淋巴細胞("PBL，，)，若希望人起源的細胞，或是使用脾細胞或淋巴結細胞，若希望非人哺乳動物來源。然後，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細胞與永生化細胞系融合以形成雜交瘤細胞(Goding，Mo"oc/o"a/J/7.6o<i/esv屍n.wc^/asawd/Vac/7'ce,AcademicPress(1986),pp.59-103)。永生化細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類、牛和人起源的骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。將如此製備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基優選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃。票呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤的培養基典型的將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)，即阻止HGPRT缺陷細胞生長的物質。優選的永生化骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成抗體、並對諸如HAT培養基的培養基敏感的。在這些細胞中，優選的是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲得的MOPC-21和MPC-ll小鼠肺瘤及可從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia,USA)獲得的SP-2細胞(及其書t生物，例如X63-Ag8-653)所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已記載用於生成人單克隆抗體(Kozbor,J133:3001(1984);Brodeur"a/.,Mwoc/om/v4"Z/6o辦/Vo(iwc"o"rec/2m々was朋d^p/fc加'ww,pp.51-63,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)。對雜交瘤細胞正在其中生長的培養液測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優選的是，通過免疫沉澱或通過體外結合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA),測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。對雜交瘤細胞在其中培養的培養液測定針對期望抗原的單克隆抗體的存在。優選的是，通過免疫沉澱或通過體外結合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，可測定單克隆抗體的結合親和力和特異性。此類技術和測定法是本領域已知的。例如，結合親和力可通過MunsoneW/.Jm/.S/oc/zem.107:220(1980)的Scatchard分析來測定。在鑑定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，該克隆可通過有限稀釋規程進行亞克隆並通過標準方法進行培養(Goding,見上文)。適於這一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在哺乳動物中作為腫瘤進行體內培養。通過常規免疫球蛋白純化規程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養液、腹水或血清適當分開。單克隆抗體還可通過重組DNA方法來生成，諸如美國專利No.4,816,567中所記載的及上文中所描述的。編碼單克隆抗體的DNA易於使用常規規程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞作為此類DNA的優選來源。一旦分離，可將DNA置於表達載體中，然後將該表達載體轉染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在此類重組宿主細胞中合成單克隆抗體。關於編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性論文包括Skerrad<a/.，Cwr./www"o/.5:256-262(1993)和Pliickthun,/www"o/.130:151-188(1992)。在又一個實施方案中，可以從使用McCafferty"a/.,A^ww348:552-554(1990)所記載的技術構建的噬菌體抗體庫分離抗體。Clackson""/.，A^wre352:624-628(1991)和Marksefa/.,/7Wb/.Ao/.222:581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。後續出版物記載了通過鏈改組(Marks""，歷o/Tec/2"f/ogy10:779_783(1992)),以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouseefa/"^c/AL21:2265-2266(1993))，生成高親和力(nM範圍)的人抗體。如此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恆定域的編碼序列代替同源鼠序列(美國專利No.4,816,567;Morrison"a/.，屍rac.7VW/.爿cadUSA81:6851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接。典型的是，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恆定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變域，以產生嵌合二價抗體，其包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。本文中所描述的單克隆抗體可以是單價的，其製備是本領域公知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經修飾重鏈的重組表達。重鏈通常在Fc區中的任何點處截短，從而防止重鏈交聯。或者，相關半胱氨酸殘基可以用另一種胺基酸殘基替代或者刪除，從而防止交聯。體外方法也適於製備單價抗體。消化抗體以生成其片段，特別是Fab片段，可使用本領域已知的常規技術來實現。還可以使用合成蛋白質化學中的已知方法，包括那些涉及交聯劑的，在體外製備嵌合或雜合抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。適合於此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巰基丁醯亞氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。"人源化戎體本發明的抗體可以進一步包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠源)抗體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它抗原結合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)中的互補決定區(CDR)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基替換的抗體。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應的非人殘基替換。人源化抗體還可包含在受體抗體和輸入CDR或框架序列中都沒有發現的殘基。通常，人源化抗體會包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區，其中所有或基本上所有CDR對應於非人免疫球蛋白的CDR，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗體任選還會包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc),通常是人免疫3求蛋白的恆定區(Jonesefa/.,Nature321:522-525(1986);Riechmann"a/.,Nature332:323-329(1988);及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992》。用於人源化非人抗體的方法是本領域公知的。通常，人源化抗體中引入了一個或多個來自非人來源的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常稱作"輸入"殘基，它們通常取自"輸入，，可變區。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法(Jones&Nature321:522-525(1986);Riechmann&a/.，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen"a/.,Science239:1534-1536(1988》，或通過用嚙齒類CDR或CDR序列替代人抗體的相應序列來進行。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4，816,567),其中基本上少於整個人可變區用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用於構建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對於降低抗原性非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。然後選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(FR)(Sims^a/.，乂/m/m/"o/.151:2296(1993);Chothiae/a/.，《/Mo/.B/o/.196:901(1987))。另一種方法^f吏用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用於數種不同的人源化抗體(Carterao/.，A^/.Jew/.5W.USA89:4285(1992);PrestaWa/.，《//mww"o/.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化後保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特性。為了實現這一目標，依照一種優選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的方法來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可荻得的，且為本領域技術人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基並進行組合，從而獲得期望抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力提高。一般而言，CDR殘基直接且最實質的涉及對抗原結合的影響。涵蓋各種形式的人源化抗體。例如，人源化抗體可以是抗體片段，諸如Fab，它任選與一種或多種細胞毒劑偶聯以產生免疫偶聯物。或者，人源化抗體可以是完整抗體。力人戎體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫後生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊後生成人抗體。參見例^口Jakobovitsa/.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovitsda/"Nature362:255-258(1993);Bruggerma皿"a/.,YearinImmuno.7:33(1993);美國專利No.5,591,669和WO97/17852。變(V)域基因全集生成人抗體和抗體片#殳(McCaffertyWa/.,Nature348:552-553(1990);HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.227:381(1991))。依照這種技術，將抗體V結構域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，並在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種格式進行；綜述參見例i口Johnson,KevinS.andChiswell，DavidJ.,Curr.OpinStruct.Biol.3:564-571(1993)。V基因區段的數種來源可用於噬菌體展示。Clackson&a/.,Nature352:624-628(1991)從衍生自經免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗口惡唑酮抗體。可本質上遵循MarksJ.Mol.Biol.222:581-597(199l)或Griffitha/.，EMBOJ.12:725-734(1993)所記載的技術，自未免疫人供體構建V基因全集和分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No.5，565,332和5,573，905。Cole等和Boemer等的技術也可用於製備人單克隆抗體(Cole^a/.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)及Boerner&a/.，J.Immunol.147(1):86-95(1991))。類似地，可以如下生成人抗體，即將人免疫球蛋白基因座導入轉基因動物，例如內源免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活的小鼠。在攻擊後，觀察到人抗體的生成，在所有方面與在人中看到的密切相似，包括基因重排、裝配、和抗體全集。這種方法記載於例如美國專利No.5,545,807;5，545，806,5,569,825，5,625,126，5,633,425,5，661，016，及下列科學出版物Marks"a/.,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg"a/.，Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994)，Fishwild"a/.，NatureBiotechnology14:845-51(1996)，Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996)及LonbergandHuszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。最後，還可以在體外由激活的B細胞來生成人抗體(參見美國專利No.5，567，610和5，229,275)。在某些情況中，使用抗體片段有優勢，而不是完整抗體。較小的片段尺寸容許快速清除，而且可導致更易於接近實體瘤。已經開發了用於生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化72完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto&a/.，JBiochemBiophys.Method.24:107-117(1992);Brennan^a/.,Science229:81(1985》。然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達及由大腸桿菌分泌，如此容許容易的生成大量的這些片段。可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段並化學偶聯以形成F(ab')2片段(Carteraa/.,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab')2片段。具有延長的體內半衰期的Fab和F(ab')2記載於美國專利No.5,869,046。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利No.5,571,894;及美國專利No.5,587,458。抗體片段還可以是"線性抗體"，例如如美國專利No.5，641，870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。在沐該/4躇介爭的;^沐i^^^f法^4Z^P7)通過將抗體與前體藥物活化酶偶聯，本發明的抗體還可用於ADEPT,所述前體藥物活化酶將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO81/01145)轉變為活性抗癌藥。參見例如WO88/07378和美國專利第4，975,278號。可用於ADEPT的免疫偶聯物的酶組分包括能夠以這樣一種方式作用於前體藥物從而將其轉變為更有活性的細胞毒性形式的任何酶。可用於本發明方法的酶包括但不限於糖苷酶，葡萄糖氧化酶，人溶菌酶，人葡糖醛酸糖苷酶，可將含磷酸鹽/S旨的前體藥物轉變為游離藥物的鹼性磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉變為游離藥物的芳基^^酸酯酶；可將無毒5-氟胞嘧啶轉變為抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉變為游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶G2和羧肽酶A)和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L);可轉化含D-胺基酸替代的前體藥物的D-丙氨醯羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉變為游離藥物的碳水化合物切割酶，諸如p-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；可將用p-內醯胺衍生的藥物轉變為游離藥物的p-內醯胺酶；及可將在其氨基氮處分別用苯氧乙醯基或苯乙醯基衍生的藥物轉變成游離藥物的青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗體，本領域也稱作"抗體酶"，將本發明的前體藥物轉變為游離活性藥物(參見例如Massey,Nature328:457-458(1987))。可如本文所述製備抗體-抗體酶偶聯物，用於將抗體酶投遞至腫瘤細胞群。可通過本領域眾所周知的技術將上述酶與本文所述多肽或抗體共價結合，諸如使用上文所討論的異雙功能交聯劑。或者，可使用本領域眾所周知的重組DNA技術構建包含與本發明酶的至少功能活性部分連接的本發明抗體的至少抗原結合區的融合蛋白(參見例如Neubergerefa/.,Nature312:604-608(1984))。7)雙#弄#和/#並#我沐雙特異性抗體(BsAb)指對至少兩種不同表位(包括那些在相同或另一蛋白質上的)具有結合特異性的抗體。或者，一條臂可以武裝成結合靶抗原，而另一條臂可以與結合白細胞上觸發分子諸如T細胞受體分子(例如CD3)、或IgG的Fc受體(FcYR)諸如FcyRI(CD64)、Fc丫RII(CD32)和FcyRI11(CD16)的臂聯合在一起，使得細胞防禦機制聚焦和定位於表達靶抗原的細胞。此類抗體可衍生自全長抗體或抗體片段(例如F(ab，)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體還可用於將細胞毒劑定位於表達靶抗原的細胞。此類抗體擁有結合期望抗原的一條臂和結合細胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗幹擾素-a、長春花生物鹼類、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的另一條臂。已知的雙特異性抗體的例子包括抗ErbB2/抗FcgRHI(WO96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI(U.S.P.5,837,234)、抗ErbB2/抗CD3(U.S.R5,821,337)。用於構建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生產基於兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等，A^w"305:537-539(1983))。由於免疫王求蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產量低。類似的規程披露於WO93/08829及Traunecker"a/,，五M萬(9J10:3655-3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。優選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域進行融合。優選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恆定區(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，並共轉染到合適的宿主生物體中。在用於構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個優選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了容易的分離途徑，因此發現這種不對稱結構便於將期望的雙特異性複合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露於wo94/04690。關於生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Sureshd"/.，飽Ws/"121:210(1986)。依照WO96/2701l或U.S.P.5，731,168中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含至少部分抗體恆定域CH3區。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈相同或相似大小的補償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產物諸如同二聚體提高異二聚體產量的機制。文獻中記載了自抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來製備雙特異性抗體。Brennan"a/.，5We"ce229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩定鄰近的二硫醇並防止分子間二硫鍵的形成。然後將產生的Fab，片段轉變為硫代硝基苯甲酸S旨(TNB)衍生物。然後將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab'-硫醇，並與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。可以從大腸桿菌直接回收Fab'片段，並化學偶聯以形成雙特異性抗體。ShalabyWa/.,乂￡x/.Med,175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，並在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離二價抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成二價異二聚體。Kostelnyda/.，乂/www"o/.148(5):1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，然後重新氧化以形成抗體異二聚體。Hollingeref"/.,A^/.^c^/.5W.t/5L490:6444-6448(1993)記載的"雙抗體，，技術提供了構建雙特異性/二價抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈恆定域(VH)和輕鏈恆定域(V.)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和Vi結構域與另一個片段上的互補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報導了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體構建雙特異性/二價抗體片段的另一種策略。參見Gruberda/.，/wmw"o/.152:5368(1994)。設想了具有超過兩價的抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt"a/.,7:/mw畫/.147:60(1991)。例示性的雙特異性抗體可結合給定分子上的兩種不同表位。或者，一條抗蛋白質臂可以與結合白細胞上觸發分子諸如T細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)、或lgG的Fc受體(FcYR)諸如Fc7RI(CD64)、FqRII(CD32)和FcyRIII(CD16)的一條臂聯合在一起，使得細胞防禦機制聚焦於表達特定蛋白質的細胞。雙特異性抗體還可用於將細胞毒劑定位於表達特定蛋白質的細胞。此類抗體擁有結合蛋白質的一條臂和結合細胞毒劑或放射性核素螯合劑(諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的一條臂。興趣的另一種雙特異性抗體結合感興趣蛋白質且進一步結合組織因子(TF)。》^#絲多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化(和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四i^介抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體將包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗本文中優選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個，^旦優選四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變域。例如，多肽《逄可包含VD1-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，X1和X2代表胺基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條(且優選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文設想的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。^弄源偶聯我#異源偶聯抗體也在本發明的範圍內。異源偶聯抗體由兩種共價連接的抗體構成。例如，可以將異源偶聯物中的一種抗體與親合素偶聯，而將另一種抗體與生物素偶聯。此類抗體建議例如用於將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利4,676,980)及用於治療HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;及EP0308936)。可以在體外使用合成蛋白質化學的已知方法製備抗體，包括那些涉及交聯劑的方法。例如，可以使用二碌^建交換反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。適於此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽(iminothiolate)和4-3克基丁醯亞氨酸曱酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國專利4，676,980中所公開的。異源偶聯抗體可以使用任何方便的交聯方法來製備。合適的交聯劑連同許多交聯技術是本領域眾所周知的，而且披露於美國專利No.4,676,980。/6>」^t^器^激工在化炎造可能希望在效應器功能方面^f多飾本發明的抗體，例如用以增強抗體的抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過向抗體的Fc區中引入一處或多處胺基酸替代來實現。或者/另外，可以向抗體的Fc區中引入半胱氨酸殘基，由此使得在該區中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內在化能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)。參見Caron"J!￡;c/.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.，J/wm歸/.148:2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可4吏用如Wolff"a/.,Owe"53:2560-2565(1993)中記載的異雙功能交聯劑來製備。或者，抗體可改造成具有雙重Fc區，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevensona/.，v4油'-C"膨rZ)n^De—3:219-230(1989)。為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利No.5，739,277中記載的將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用於本文時，術語"補救受體結合表位，，指IgG分子(例如IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區中負責延長IgG分子體內血清半衰期的表位。本發明還關於包含偶聯有細胞毒劑的抗體的免疫偶聯物或抗體-藥物偶聯物(ADC)，所述細胞毒劑諸如化療劑、毒素(如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯物)。此類ADC必須顯示可接受的安全性概況。ADC在癌症治療中用於局部投遞毒害細胞劑或抑制細胞試劑(例如用於殺死或抑制月中瘤細月包的藥物)的用途(SyrigosandEpenetos，AnticancerResearch19:605-614(1999);Niculescu-DuvazandSpringer,Adv.DrugDel-Rev.26:151-72(1997);美國專利4,975,278)理論上能將藥物部分靶向投遞至腫瘤，並在那兒進行細胞內積累，而系統施用這些未經偶聯的藥物試劑可能在試圖消除的肺瘤細胞以外導致不可接受的對正常細胞的毒性水平(Baldwina/"Lancet603-05(1986);Thorpe,(1985)"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",在《MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications》中，A.Pinchera等人編，第475-506頁)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報導可用於這些策略(RowlandCancerImmunol.Immunother.21:183-87(1986))。這些方法中所-使用的藥物包括道諾黴素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、曱氨蝶呤(methotrexate)和長春地辛(vindesine)。抗體-毒素偶聯物中所使用的毒素包括細菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素"i者長口才各爾德、黴素(geldanamycin)(Mandlera/,,J.Nat.CancerInst.92(19):1573-81(2000);Mandlerda/"Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-28(2000);Mandlera/.,BioconjugateChem.13:786-91(2002))、美登木素生物鹼類(EP1391213;Liu"a/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-23(1996))、和加利車黴素(Lode"a/.,CancerRes.58:2928(1998);及Hinman"a/.，CancerRes.53:3336-42(1993))。毒素可通過包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制在內的機制發揮其毒害細胞和抑制細胞的效果。有些細胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質受體配體偶聯時趨於失活或活性降低。上文已經描述了可用於生成此類免疫偶聯物的化療劑，包括BCNU、鏈佐星、長春新鹼、長春鹼、阿黴素和5-氟尿嘧啶。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa),蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚麴黴素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草(sapaonariaofficinalis)才中制物、白杉於毒蛋白(gelonin)、絲沐木黴素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依i若黴素(enomycin)和單3耑孢菌素(trichothecenes)。多種i丈射性核素可用於生成》欠射偶耳關抗體。實例包括^Bi、131I、131In、90y和^Re。抗體和細胞毒劑的偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備，諸如N-琥珀醯亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二醯亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀醯亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯曱醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯曱醯基)己二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如VitettaeM/.,Science238:1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見例如WO1994/11026。抗體和細胞毒劑的偶聯物使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備，諸如N-琥珀醯亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二醯亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀醯亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯曱醯基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science,238:1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的l-異硫氰酸苄基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑(參見W094/11026)。接頭可以是便於在細胞中釋放細胞毒性藥物的"可切割接頭，，。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接頭、二曱基接頭或含二硫化物接頭(Chari等，CancerRes.52:127-131(1992))。另外，還涵蓋抗體與小分子毒素，諸如加利車黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(U.S.P.5,208,020)、單端孢菌毒素(trichothene)和CC1065作為與本發明配製劑一起使用的可偶聯毒素。在一個實施方案中，可以將全長抗體或其抗原結合片段與一個或多個美登木素生物^鹼類分子偶聯(例如每個抗體分子偶聯約1個至約10個美登木素生物鹼類分子)。美登木素生物鹼類是通過抑制微管蛋白聚合來發揮作用的有絲分裂抑制劑。自自然來源分離的或合成製備的美登木素生物鹼類(包括美登素、美登醇及其衍生物和類似物)已有記載，參見例如美國專利No.5，208,020及其中引用的參考文獻(見第2欄第53行-第3欄第10行)及美國專利3,896,111和4,151,042。製備抗體-美登木素生物鹼類偶聯物的方法還記載於美國專利No.5,208,020。在一個優選的實施方案中，美登木素生物鹼類是經二硫化物或其它含硫接頭基團連接至抗體的。例如，可將美登素轉變為May-SS-Me,後者可還原為May-SH3並與經修飾抗體反應以生成美登木素生物鹼類-抗體免疫偶聯物(Chari"a/.,Owcerie化arc/752:127-131(1992))。可通過已知方法來修飾抗體，然後使含有游離或受保護的石克醇基的抗體與含有二石克化物的美登木素生物i鹹類起反應以生成偶聯物。抗體-美登木素生物鹼類偶聯物的細胞毒性可通過已知方法在體外或在體內測量，並可測定IC50。加利車黴素是另一種感興趣的免疫偶聯物。加利車黴素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。可用的加利車黴素結構類似物包括但不限於Y、a,ci31、N-乙醯基-i1、PSAG和e1,(Hinman等，CancerRes.53:3336-3342(1993)及Lode等，CancerRes.58:2925-2928(1998))。可以與抗體偶聯的其它抗腫瘤藥物包括QFA，它是一種抗葉酸藥。加利車黴素和QFA都具有胞內作用位點，且不易穿過質膜。因此，這些試劑的經由抗體介導的內在化的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒效應。還涵蓋抗體和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶、DNA酶)之間形成的免疫偶聯物。在本發明的ADC中，抗體(Ab)經接頭(L)偶聯有一個或多個藥物模塊(D),例如大約l個到大約20個藥物^t塊每個抗體。可以採用本領域技術人員知道的有機化學反應、條件、和試劑通過數種路徑來製備通式I的ADC,包括(1)抗體的親核基團經共價鍵與二價接頭試劑反應形成Ab-L,接著與藥物模塊D反應；和(2)藥物模塊的親核基團經共價鍵與二價接頭試劑反應形成D-L，接著與抗體的親核基團反應。Ab-(L-D)p式I抗體的親核基團包括但不限於(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如賴氨酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。胺、硫醇、和羥基基團是親核的，能夠與接頭模塊上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、滷代曱酸酯、和酸性卣化物；(ii)烴基和千基卣化物，諸如卣代乙醯胺；和(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來醯亞胺基團。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋。可通過還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理，從而具有與接頭試劑偶聯的反應性。每個半胱氨酸橋理論上會形成兩個反應性硫醇親核體。可將額外親核基團引入抗體中，經由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應，導致胺轉變為>5克醇。還可通過修飾抗體以導入能與接頭試劑或藥物上的親核取代基起反應的親電子模塊來生成本發明的ADC。可以用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可與接頭試劑或藥物模塊的胺基團反應的醛或酮基團。所得亞胺Schiff成基可形成穩定的連接，或者可以用例如硼氫化物試劑還原而形成穩定的胺連接。在一個實施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可以在蛋白質中生成羰基(醛和酮)，其能與藥物上的適宜基團反應(Domenda/.,J.Chromatog.，510:293-302(1990))。在另一個實施方案中，包含N-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質能與偏高硤酸鈉反應，導致在第一個胺基酸處生成醛(GeogheganandStroh,BioconjugateChem.3:138-46(1992);US5,362,852)。此類醛能與藥物模塊或接頭親核體反應。類似的，藥物模塊上的親核基團包括但不限於胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，它們能夠與接頭模塊上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性卣化物；(ii)烴基和千基滷化物，諸如滷代乙醯胺；和(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來醯亞胺基團。或者，可通過例如重組技術或肽合成來製備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可以包含各自編碼偶聯物的兩部分的區域，彼此或是毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分開，該接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。在又一個實施方案中，可以將抗體與"受體，，(諸如鏈黴親合素)偶聯從而用於腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由循環中清除未結合的偶聯物，然後施用與細胞毒劑(例如放射性核苦酸)偶聯的"配體"(例如親合素)。本文中的ADC任選用下列交聯接頭試劑來製備BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、s函-GMBS、sulfo畫KMUS、sulfo-纖S、s函-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀醯亞氨基-(4-乙烯基碸)苯曱酸酯)，它們可通過商業途徑獲得(例如PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.)。抗體還可偶聯高度放射性原子。多种放射性核素可用於生成放射偶聯抗體。例子包括At211、Bi212、I131、In131、Y90、Re186、Re188、Sm153、P32、和Pb212及Lu的放射性同位素。在將偶聯物用於診斷時，它可包含放射性原子用於閃爍照相研究，例如Tc"或I123,或是包含自旋標記物用於核磁共振(nmr)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。可以以已知方式將放4tW^^^其它標記物糹參入偶聯物。例如，可生物合成肽，或是通過化學胺基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氬的合適胺基酸前體。可以經肽中的半胱氨酸殘基來附著標記物，諸如Tc99或I123、Re186、Re"s和In111。可以經賴氨酸殘基來附著釔-90。10DOGEN⑧法可用於才參入石典-123(FrakerWa/.,Biohem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))。《MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress,1989)中記載了偶聯放射性核酸的其它方法。或者，可通過例如重組技術或肽合成來製備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可以包含各自編碼偶聯物的兩部分的區域，彼此或是毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分開，該接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。在另一個實施方案中，可將抗體與"受體，，(諸如鏈黴親合素)偶聯從而用於腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由82設想了本文所述抗體的氨基S交序列修飾。例如，可能希望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。通過將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或者通過肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構建物具有期望特性，可進行刪除、插入和替代的任意組合以獲得最終的構建物。胺基酸變化還可改變抗體的翻譯後加工，諸如改變糖基化位點的數目或位置。可用於鑑定抗體中作為優選誘變位置的某些殘基或區域的一種方法稱作"丙氨酸掃描誘變"，如CunninghamandWells，5We"ce244:1081-1085(1989)中所記載的。在此，鑑定了一個殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和穀氨酸)，並用中性或帶負電荷的胺基酸(最優選丙氨酸或聚丙氨酸)替換，以影響胺基酸與抗原的相互作用。然後通過在或對替代位點引入更多或其它變體，推敲那些對替代展現出功能敏感性的胺基酸位置。如此，雖然引入胺基酸序列變異的位點是預先決定的，但是突變本身的性質不需要預先決定。例如，為了分析給定位點處的突變的後果，在耙密碼子或區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，並對所表達的抗體變體篩選期望活性。胺基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度範圍從一個殘基至包含上百個或更多殘基的多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨醯殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是胺基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個胺基酸殘基用不同殘基替換。最感興趣進行替代誘變的位點包括高變區，但也設想了FR改變。保守替代在下文表A中顯示在標題"優選替代"下。如果此類替代導致生物學活性的變化，那麼可以引入表A中稱為"例示替代"的更實質性變化，或者如下文中關於胺基酸種類的進一步描述，並篩選產物。表A:胺基酸替代原始殘基例示替代優選替代tableseeoriginaldocumentpage84對抗體生物學特性的實質性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區域的多肽主鏈的結構，例如作為摺疊片或螺旋構象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積。基於共同的側鏈特性，將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威性的Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;和(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代將需要用這些類別之一的成員交換另一個類別的。任何不涉及保持抗體正確構象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改善分子的氧化穩定性和防止異常交聯。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩定性(特別是當抗體是抗體片段諸如Fv片段時)。特別優選的一類替代變體涉及替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的84一個或多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步開發的所得變體相對於產生它們的親本抗體將具有改良的生物學特性。產生此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡單的說，將數個高變區位點(例如6-7個位點)突變，在每個位點產生所有可能的胺基酸替代。如此產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個顆粒內包裝的M13基因in產物的融合物。然後如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學活性(例如結合親和力)。為了鑑定用於修飾的候選高變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑑定對抗原結合具有重要貢獻的高變區殘基。或者/另外，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑑定抗體和IgE之間的接觸點可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術進行替代的候選位點。一旦產生此類變體，就如本文所述對該組變體進行篩選，可選擇在一種或多種相關測定法中具有優良特性的抗體用於進一步的開發。抗體的另一類胺基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在抗體中找到的一個或多個碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位點。抗體的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著於天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何胺基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著於天冬醯胺側鏈的識別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存在產生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指將糖類N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著於羥基胺基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點是通過改變胺基酸序列使其包含一個或多個上述三肽序列而便利地完成的(用於N-連接的糖基化位點)。還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行改變(用於O-連接的糖基化位點)。編碼抗IgE抗體的胺基酸序列變體的核酸分子可通過本領域知道的多種方法製備。這些方法包括但不限於從天然來源分離(在天然存在胺基酸序列變體的情況中)，或者通過對早期製備的變體或非變體型式的抗IgE抗體進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來製備。J3」其它我體修謬可進一步修飾本發明的抗體以包含本領域知道的且易於獲得的額外非蛋白質性質模塊。優選的是，適於抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l，3-二氧戊環、聚-l，3，6-三0惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)、和右旋糖苦或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由於其在水中的穩定性，聚乙二醇丙醛在製造中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如果附著了超過一個聚合物，那麼它們可以是相同或不同的型，包括但不限於待改進抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的療法等。此類技術和其它合適的配製劑披露於i^m'"gtow.'T7ze5Wewceawd屍rac/7'ceo/屍/zor麵cy，第20版,AlfonsoGennaro編,PhiladelphiaCollegeofPharmacyandScience(2000)。C.藥物配製劑通過將具有期望純度的活性成分與任選的藥學可接受載體、賦形劑或穩定齊寸(Remington:TheScience和PracticeofPharmacy,第20片反，LippincottWilliams&Wiklins,Pub.，Gennaro編，Philadelphia,PA2000)混合來製備治療配製劑，供貯存用。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸、甲石克氨酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉；防腐劑；等滲調節劑(isotonicifier);穩定劑；金屬複合物，例如Zn-蛋白質複合物；螯合劑，諸如EDTA;和/或非離子表面活性劑。當治療劑是抗體片段時，優選特異性結合靶蛋白質結合結構域的最小抑制性片段。例如，基於抗體的可變區序列，可以設計保留結合靶蛋白質序列的能力的抗體片段或甚至肽分子。此類肽可以化學合成和/或通過重組DNA技術來生成(參見例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893[1993])。使用緩衝劑來將pH控制在優化治療功效的範圍內，尤其在穩定性依賴於pH的情況中。緩衝劑優選以範圍為約50mM至約250mM的濃度存在。適於與本發明一起使用的緩衝劑包括有機酸和無機酸兩者及其鹽，例如檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外，緩沖劑可以由組氨酸和三曱胺鹽諸如Tris構成。添加防腐劑來延遲樣i生物生長，而且通常以0.2%-1%(w/v)的範圍存在。適於與本發明一起使用的防腐劑包括氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙銨；苯扎卣銨(例如苯扎氯銨、苯扎溴銨、苯扎碘銨)、卡索氯銨；硫柳汞；酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯甲酸烴基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間曱酚。存在等滲劑(有時稱為"穩定劑")以調節或維持組合物中液體的等滲性本發明的液體組合物的張性/張力。當與大的、帶電荷的生物分子諸如蛋白質和抗體一起使用時，它們常常稱作"穩定劑"，因為它們能與胺基酸側鏈的帶電荷基團相互作用，由此減輕分子間和分子內相互作用的勢(potential)。等滲劑可以以0.1%至25%(以重量計)、優選1-5%之間的任何量存在，其中考慮了其它成分的相對量。優選的等滲劑包括多羥基糖醇，優選三羥基的或更高級的糖醇，諸如甘油、赤蘚糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。別的賦形劑包括能承擔以下一項或多項功能的藥劑(1)填充劑(bulkingagent);(2)增溶劑；(3)穩定劑；和(4)防止變性或對容器壁的粘著的藥劑。此類賦形劑包括多羥基糖醇(上文列舉的)；胺基酸，諸如丙氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸等；有積4唐或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌肉肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫的還原劑，諸如尿素、穀胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、a-—硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明膠或其它免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；三糖，諸如棉子糖；和多糖，諸如糊精或葡聚糖(dextran)。存在非離子型表面活性劑或去汙劑(也稱為"溼潤劑，，)以幫助溶解治療劑以及以保護治療用蛋白質免於攪動誘導的聚集，其還容許配製劑在暴露於剪切表面應力時不引起活性治療用蛋白質或抗體變性。非離子型表面活性劑以約0.05mg/ml至約1.0mg/ml，優選約0.07mg/ml至約0.2mg/ml的範圍存在。合適的非離子型表面活性劑包括Polysorbate(20,40，60,65,80等)，Polyoxamer(184，188等)，PLURONIC⑧多元醇，TRITON,聚氧乙烯山梨聚糖單醚(TWEEN-20，TWEEN⑧-80等)，Lauromacrogol400,Polyoxyl40硬脂酸酯，聚氧乙烯氫化蓖麻油IO,50和60,甘油單硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，曱基纖維素和羧曱基纖維素。可使用的陰離子去汙劑包括十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉和十六烷基磺酸鈉。陽離子去汙劑包括苯扎氯銨或苄索氯銨。為了配製劑用於體內施用，它們必須是無菌的。通過無菌濾膜過濾，可以使得配製劑變成無菌的。一般將本文中的治療性組合物置入具有無菌存取口的容器中，例如具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶。施用路徑依照已知的和可接受的方法，諸如通過合適方式的一次或多次推注或一長段時間裡的輸注，例如通過皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病變內或關節內路徑的注射或輸注，表面施用，吸入或通過持續釋放或延長釋放手段。本文中的配製劑還可以含有超過一種的、所治療特定適應症所必需的活性化合物，優選那些活性互補且彼此沒有不利影響的。或者/另外，組合物可包含細胞毒劑、細胞因子或生長抑制劑。此類分子合適地以對於預定目的有效的量組合存在。活性成分還可包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠嚢(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠嚢)、膠狀藥物投遞系統(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或粗滴乳狀液。此類技術披露於Remington'sPharmaceuticalSciences第18片反，見上文。通過使用無毒的"水溶性多價金屬鹽"，可以增強本文中所描述的蛋白質和抗體的穩定性。例子包括Ca"、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+、和A產。能與上述多價金屬陽離子形成水溶性鹽的例示性陰離子包括那些自無機酸和/或有機酸形成的。此類水溶性鹽在水中(於20。C)具有至少約20mg/ml、或至少約.100mg/ml、或至少約200mg/ml的溶解度。能用於形成"水溶性多價金屬鹽"的合適無機酸包括氫氯酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。能使用的合適有機酸包括脂肪族羧酸和芳香族酸。此定義內的脂肪族酸可以定義為飽和的或不飽和的(:2.9羧酸(例如脂肪族單、雙或三羧酸)。例如，此定義內的例示性單羧酸包括飽和的C2-9單羧酸，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonicacid,及不飽和的C2力單羧酸，丙烯酸、丙炔酸、曱基丙烯酸、巴豆酸和異巴豆酸。例示性的二羧酸包括飽和的C2—9二羧酸，丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不飽和的C2.9二羧酸包括馬來酸、延胡索酸、檸康酸和中康酸。例示性的三羧酸包括飽和的C2.9三羧酸，丙三羧酸和l，2，3-丁烷三羧酸。另外，屬於此定義的羧酸還可以含有一個或多個羥基以形成羥基羧酸。例示性的羥基羧酸包括乙醇酸/羥基乙酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸/羥基丙二酸、蘋果酸、酒石酸和檸檬酸。此定義內的芳香族酸包括苯曱酸和水楊酸。可用於幫助裝嚢的本發明多肽穩定的常用水溶性多價金屬鹽包括例如(1)屬於卣化物(例如氯化鋅、氯化鈣)、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫氰酸鹽的無機酸金屬鹽；(2)脂肪族羧酸金屬鹽(例如乙酸鈣、乙酸鋅、丙酸鈣、乙醇酸鋅、乳酸鈣、乳S吏鋅和酒石酸鋅)；和(3)屬於苯曱酸鹽(例如苯曱酸鋅)和水楊酸鹽的芳香族羧酸金屬鹽。D.治療方法為了疾病的預防或治療，活性劑的適宜劑量會取決於所要治療的疾病的類型(如上文所定義的)、疾病的嚴重程度和進程、施用藥劑是出於預防目的還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對藥劑的響應、及主治醫師的判斷。所述藥劑適合於在一次或一系列的治療中施用於患者。一種優選的治療方法是IgE介導的病症的治療。IgE介導的病症包括特應性病症，其特徵在於對許多常見的、天然存在的吸入的和攝入的抗原產生免疫學應答的遺傳傾向和持續生成IgE抗體。具體的特應性病症包括變應性哮喘、變應性鼻炎、特應性皮炎和變應性胃腸病。特應性患者常常具有多種變態反應，意味著他們具有針對許多環境變應原的IgE抗體和來自許多環境變應原的症狀，所述環境變應原包括花粉、真菌(例如黴菌)、動物和昆蟲碎屑及某些食物。然而，與升高的IgE水平有關的病症不限於那些具有遺傳(特應性)病因學的病症。其它與升高的IgE水平有關的病症(它們表現為IgE介導的且能用本發明的配製劑治療的)包括超敏感性(例如過敏性超敏感性)、溼滲、蕁麻疹、變應性支氣管肺麴黴病、寄生蟲病、高IgE症候群、共濟失調性毛細血管擴張症、威斯科特-奧爾德裡奇症候群、胸腺淋巴發育不全、IgE骨髓瘤和移糹直物抗宿主反應。變應性鼻炎(也稱作變應性鼻結膜炎或乾草熱)是對吸入的變應原的特應性反應的最常見表現，其嚴重程度和持續時間常常與對變應原的暴露的強度和時間長度有關。它是一種慢性病，可首次出現於任何年齡，但是通常在兒童期或青少年期發作。典型發作包括大量水樣鼻漏，陣發性打噴嚷，鼻塞，及鼻和顎的搔癢。鼻後粘液引流也引起咽喉痛，清嗓和咳嗽。還可以有變應性瞼緣結膜炎的症狀，帶有結膜和眼瞼的強烈搔癢、發紅、流淚、和畏光。嚴重發作常常伴有全身不適，虛弱，疲勞，和有時，強烈噴嚏期後的肌肉酸痛。哮喘(也稱作可逆阻塞性氣道疾病)的特徵在於氣管支氣管樹對呼吸刺激和支氣管收縮性化學藥品的高應答性，產生哞鳴、呼吸困難、胸部緊迫感、和咳嗽的發作，它們是自發可逆的或藉助治療可逆的。它是一種涉及整個氣道的慢性病，但是嚴重程度自偶見的輕度暫時發作至重度、長期、危及生命的支氣管梗阻而變化。哮喘和特應性可共存，但是只有大約一半的哮喘病人也是特應性的，而且甚至更小百分比的特應性患者也具有啤喘。然而，特應性和哮喘並非是完全獨立的，因為與非特應性個體相比，哮喘更加頻繁地在特應性個體中發生，尤其是在兒童期。嗜喘在組織學上進一步地被分成兩個亞組，即外源性譯喘和內源性哮喘。外源性哮喘(也稱作變應性、特應性或免疫學嗜喘)描述一般在生命早期，通常在嬰兒期或兒童期發生哞喘的患者。特應性的其它表現(包括溼滲或變應性鼻炎)常常共存。哞喘發作可在花粉季期間，在存在動物的情況中，或在暴露於室塵、羽毛枕、或其它變應原時發生。皮試顯示對致病變應原的陽性風團和潮紅反應。有趣的是，總血清IgE濃度常常是升高的，但是有時是正常的。內源性哮喘(也稱作非變應性或特發性哞喘)通常首次發生於成人期，在表觀呼吸道感染之後。症狀包括與花粉季或暴露於其它變應原無關的慢性或復發性支氣管梗阻。對常見特應性變應原的皮試是陰性的，血清IgE濃度是正常的。別的症狀包括痰血和嗜酸粒細胞增多。將哮喘歸入亞組(像阿司匹林敏感性的、運動誘發的、感染性的和心理性的)的其它方案僅僅限定了比其它因素更多地影響某些患者的外部觸發因素。最後，重要的是要注意，雖然有些分類在組織學上只將變應性哞喘與IgE依賴性聯繫起來，但是現在有強烈的統計學顯著數據顯示IgE與哮喘(變應性的和非變應性的二者)之間的關聯。第27章，"TheAtopicDiseases",A丄Terr於MedicalImmunology,第9版，Simon和Schuster，Stites等編(1997)。結果是，為本專利申請的目的，術語"IgE介導的病症"包括變應性和非變應性這兩種哮喘。哮喘發作的體徵包括呼吸急促、聽得到的哮鳴、和使用輔助呼吸肌。通常還存在脈速和血壓升高，正如鼻分泌和外周血中升高的嗜酸性細胞水平。肺功能顯示流量(flowrate)和l秒鐘用力呼吸量(FEV1)的降低。肺總量和功能殘氣量通常是正常的或略微升高的，但是可以降低且帶有極度支氣管痙攣。哮喘的病理學可以區分為早期和晚期反應。早期的特徵在於平滑肌收縮、水肺和分泌過多，而晚期反應的特徵在於細胞炎症。譯喘可以由多種非特異性觸發物來誘發，包括感染(例如病毒性呼吸道感染)、生理因素(例如運動、通氣過度、深呼吸、心理因素)、大氣因素(例如二氧化硫、氨、冷空氣、臭氧、蒸餾水蒸氣)、食入物(例如普萘洛爾、阿司匹林、非類固醇抗炎藥)、實驗吸入物(例如高張溶液、檸檬酸、組胺、乙醯曱膽鹼(methacholine)、前列腺素F2a)和職業吸入物(例如異氰酸鹽/酯)。引起變應性哮喘的各種別的職業性或環境性變應原可以包括動物產品、昆蟲塵、海洋生物、植物產品、果實、種子、葉和花粉、有機染料和墨水、微生物媒介物、酶、治療劑、殺菌劑、和無機和有機化學藥品。特應性皮炎(也稱作溼滲、神經性皮炎、特應性溼疹或貝尼埃氏(Besnier)痒疹)是對一個患者亞群特異的常見慢性皮膚病症，該患者亞群具有家族性和免疫學特徵的特應性。本質特徵是搔癢性皮膚炎症應答，其誘導特徵性的、對稱性分布的皮膚斑疹，對某些部位有偏愛。B淋巴細胞還常常過度生成IgE。雖然特應性皮炎被歸為皮膚形式的特應性(因為它與變應性鼻炎和津喘和高IgE水平有關)，但是皮試時皮炎的嚴重程度並非總是與變應原暴露有關，而且脫敏(與其它變應性疾病不同)不是有效治療方法。雖然高血清IgE能證實變應性哞喘的診斷，但是正常水平也不能排除變應性譯喘的診斷。該疾病的發作可發生於任何年齡，而且病變開始急，有紅斑水腫丘疹或帶有脫皮的性苔蘚樣變。在細胞水平，急性病變是水肺性的，而且真皮浸潤有單個核細胞，即CD4淋巴細胞。嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞和嗜鹼性粒細胞是罕見的，但是存在脫粒的肥大細胞。慢性病變的特徵為表皮增生、過度角化和角化不全，而且真皮浸潤有單個核細胞、朗格漢斯氏(Langerhans)細胞和肥大細胞。還可以有纖維化的病灶區，包括小神經的神經束膜的參與。變應性胃腸病(也稱作嗜酸細胞性胃腸病)是一種不常見的特應性表現，其中多種IgE食物敏感性與局部胃腸道黏膜反應有關。它在成人中罕見，但是在嬰兒中更加常見，但是是暫時的。當所攝入的食物變應原與局部IgE抗體反應時，該疾患導致空腸黏膜釋放肥大細胞介導物，在餐後不久導致胃腸症狀。持續暴露產生慢性炎症，導致胃腸蛋白質丟失和低蛋白血症性水腫。經由發炎腸黏膜的失血可以是嚴重的，足以引起缺鐵性貧血。變應性反應在變應原暴露後在上胃腸道黏膜中局部發生，但是隨避開變應原而解決。過敏反應和蕁麻滲顯然是IgE介導的，但是它們缺乏遺傳決定子，而且沒有對特應性個體的偏愛。過敏反應是一種急性、全身性(generalized)變應性反應，同時涉及數種器官系統，通常是心血管、呼吸、皮膚和胃腸。該反應是免疫學介導的，而且它在暴露於受試者先前致敏的變應原時發生。蕁麻疹和血管性水腫指身體腫脹、紅斑和搔癢(其源自淺表皮膚血管中受組胺刺激的受體)，而且是系統性過敏反應的標誌性皮膚特徵。系統性過敏反應是源自藥物、昆蟲毒液或食物，在多種器官中同時發生的IgE介導的反應。它是由變應原誘導、肥大細胞加載IgE而突然引起的，導致深刻的和危及生命的、多種生命器官的機能的改變。血管塌陷、急性氣道阻塞、皮膚血管舒張和水腫、及胃腸和泌尿生殖肌肉痙攣幾乎同時發生，雖然並非總是相同程度。過敏反應的病理學包括血管性水腫和肺充氣過度，帶有氣道粘液填塞和局灶性肺不張。在細胞水平，肺的表現與急性哞喘發作期類似，帶有支氣管黏膜下層腺分泌過多、黏膜和黏膜下層水腫、支氣管周圍血管淤血/充血(congestion)和支氣管壁中的嗜酸粒細胞增多。可存在肺水腫和出血。也可以存在支氣管肌肉痙攣、充氣過度、和甚至肺泡破裂。人過敏反應的主要特徵包括水腫、血管淤血/充血、及喉、氣管、會厭和下咽的固有層中的嗜酸粒細胞增多。對變應原的暴露可以經由攝食、注射、吸入或皮膚或黏膜接觸。反應在暴露於變應原後數秒或數分內開始。可以有厄運迫近的初始畏懼或感覺，緊接著是一個或多個靶器官系統心血管、呼吸、皮膚或胃腸中的症狀。食物、藥物、昆蟲毒液或膠乳是常見來源。食物變應原包括那些在曱殼動物、軟體動物(例如龍奸、奸、蟹)、魚、豆(例如花生、豌豆、菜豆(bean)、甘草)、種子(例如芝麻、棉籽、葛縷子(caraway)、芥子、亞麻子、向日葵)、堅果、漿果、蛋白、蕎麥粉和乳中找到的。藥物變應原包括那些在異源蛋白質和多肽、多糖和半抗原藥物中找到的。昆蟲變應原包括膜翅目昆蟲，包括蜜蜂、小黃蟲奪(yellowjacket)、大黃蟲奪(hornet)、黃蜂(wasp)和火蟻。雖然腎上腺素是過敏反應的典型治療，但是抗組胺劑或其它組胺阻斷劑通常在處方中用於減輕嚴重的蕁麻滲或血管水腫反應。E.聯合療法本發明的方法可以與治療IgE介導的病症的已知方法組合，或是作為組合的和另外的治療步驟，或是作為治療配製劑中另外的成分。例如，可以在本發明的抗IgE抗體之前、之後、或同時施用抗組胺劑，尤其是非鎮靜的抗組胺劑。合適的抗組胺劑包括屬於烴基胺(例如氯苯那敏(chlorpheniramine))、乙醇胺(例如苯海拉明(diphenhydramine))和吩。塞噪(例如異丙,(promethazine))的抗組胺劑。雖然許多抗組胺劑通過阻斷組胺在效應細胞上的受體位點來拮抗組胺的藥理學效應，但是其它常見抗組胺劑藥物通過阻斷已經被變應原特應性IgE(例如色苷酸納)致敏和武裝的肥大細胞釋放組胺來運作。例示性的抗組胺劑包括阿絲咪唑(astemizole)、馬來酸阿扎^(也定(azatadinemaleate)、馬來酉交馬來酸;臭苯刃卩壽文(bropheniraminemaleate)、馬來酉交卡比沙明(carbinoxaminemaleate)、鹽酉臾西替利°秦(cetirizinehydrochloride)、延胡索酸氯馬斯汀(clemastineflimarate)、鹽酸賽庚咬(cyproheptadinehydrochloride)、馬來酸右溴苯那每丈(dexbrompheniraminemaleate)、馬來酉臾右氯苯刃卩每丈(dexchlorpheniraminemaleate)、茶苯f每明(dimenhydrinate)、鹽酸苯海4立明(diphenhydraminehydrochloride)、琥詢酸多西拉敏(doxylaminesuccinate)、fexofendadinehydrochloride、terphenadinehydrochloride、鹽酸羥口秦(hydroxyzinehydrochloride),loratidine、鹽酸美克洛口秦(meclizinehydrochloride)、4寧鬥蒙酸曲p比那每文(tripelannaminecitrate)、鹽酸曲外匕那壽文(tripelennaminehydrochloride)、鹽酉吏曲普利""定(triprolidinehydrochloride)。擬交感神經藥或具有支氣管舒張效果的藥物能改善IgE介導的病症(例如早期反應)的具體症狀。腎上腺素是一種廣泛作用的cc和P-腎上腺素能藥，常常以0.2-0.5mL1:100水溶液的劑量皮下施用。當想要效果的持續時間更長時，也使用更長作用形式的、l:200懸浮液中的腎上腺素(即特布他林(terbutaline))。合適的別的P-腎上腺素能藥包括沙丁胺醇(albuterol)、吡布特羅(pirbuterol)、奧西那4木(metaprotereno1)、沙美特羅(salmeterol)、乙基異丙腎上腺素(isoetharine)和福美特羅(formeterol),其用於經鼻(例如手持式霧化器、間歇加壓呼吸裝置、或劑量計量式增壓吸入器)或經口施用。支氣管擴張也可通過施用黃嘌啉來實現，尤其在它們與上述擬交感神經藥物組合施用時。例示性的黃嘌啉包括氨茶鹼(aminophylline)(靜脈內，250-500mg)和茶鹼(theophylline)(口服，10-20jxg/ml血清濃度)。通過用糖皮質激素或具有抗炎效果的其它藥物進行的治療，能減輕各種IgE介導的病症(例如晚期反應)的其它症狀。對嚴重發作系統性施用潑尼松(每天30-60mg)，而以霧化形式施用倍氯米+>二丙酸鹽(beclomethasonedipropionate)、曲安萘德(triamcinoloneacetonide)和氟尼縮松(flunisolide)作為長期維持療法。具有抗炎效果的別的皮質類固醇包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、i也塞米+》(dexamethasone)、醋酸氟氫可的松(fludrocortisoneacetate)、氟尼縮松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate)、氫4匕可的(hydrocortisone)、曱潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone)。也可以與本發明的治療方法組合使用的非類固醇抗炎藥包括醋氨酚(acetaminophen),阿司匹4木(aspirin)、溴芬酸4內(bromfenacsodium)、只又氯芬酸鈉(diclofenacsodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬4丐(fenoprofencalcium)、氟比》各芬(flurbiprofen)、布》各芬(ibuprofen)、。引口朵美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、曱氯滅酸鈉(meclofenamatesodium)、甲滅酸(mefenamicacid)、萘丁美酉同(nabumetone)、萘普生(naproxen),萘普生4內(naproxensodium)、^:布宗(oxyphenbutazone)、苯基寸呆泰^^(phenylbutzone)、口比羅昔康(piroxicam)、舒4木酉臾(sulindac)、#6美丁《內(tometinsodium)。另外，通過施用解充血藥(例如苯腎上腺素(phenylephrine)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、"f為麻黃石威(pseudoephadrin))、鎮咳齊寸(例i口右美沙芬(dextromethorphan)、可4寺因(codeine)、或氫可酉同(hydrocodone))或鎮痛藥(例如醋氨酚、阿司匹林)，也可實現最大治療收益。變應原脫敏指其中出於降低或消除變應性應答的目的將變應原注射入患者中的治療形式。它也稱作變應原免疫療法、降敏(hyposensitization)或變態反應注射療法。它常常與其它變態反應治療組合使用，但是並非經常作為主要治療。已經在不可能實現規避變應原時成功地採用了這種療法。典型的變應原脫敏治療包括每周一次或兩次以漸增劑量皮下注射無菌變應原，直至達到在注射部位產生暫時的、局部的小面積炎症的劑量。然後每2-4周一次以維持日程表給予劑量。變應性脫敏最常見地用於變應性譯喘和變應性鼻炎的治療，但是它已經在治療過敏反應中獲得成功。通過使用佐劑，諸如弗氏佐劑，即水性抗原在礦物油中的乳狀液，也已經有效地使用了脫敏療法。生理效應產生不溶性液體儲庫，自此逐漸釋放變應原微滴。另一種形式的變應變應性應答)、同時保留有效程度免疫原性的分子。F.藥物劑量本發明藥物組合物的劑量和期望藥物濃度可以隨所設想的特定用途而變化。適宜施用劑量或路徑的確定完全在普通技術人員的技術範圍內。動物實驗為人體治療的有效劑量的確定提供了可靠指導。可以遵循Mordenti，J.和Chappell,W."TheUseofInterspeciesScalinginToxicokinetics,"於ToxicokineticsandNewDrugDevelopment,Yacobi等編，PergamonPress,NewYork1989,pp.42-46中所述原理進行有效劑量的物種間定標。當採用體內施用本文所述多肽或抗體時，正常劑量的範圍可以是每天約10ng/kg至高達約100mgZkg哺乳動物體重或更多，優選約lmg/kg/天至10mg/kg/天，取決於施用路徑。文獻中提供了有關具體劑量和投遞方法的指導；參閱例如美國專利No.4,657,760;5,206,344;或5，225,212。在本發明的範圍內的是，不同配製劑會對不同治療和不同病症有效，而且意圖治療一種特定器官或組織的施藥可能必須以不同於另一器官或組織的方式投遞。此外，可以通過一次或多次分開的施用，或者通過連續輸注來施用藥劑。對於根據狀況，在數天或更長時間裡進行重複施用來說，持續進行治療，直到出現期望的疾病症狀^^皮抑制。然而，其它劑量方案可能也是有用的。此療法的進展易於通過常規技術和測定法來監測。G.配製劑的施用依照已知方法，諸如靜脈內施用，像推注或通過持續一段時間的連續輸注，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口腔、表面、或吸入路徑，將本發明的配製劑(包括但不限於重建的配製劑)施用於需要用蛋白質治療的哺乳動物，優選人。在優選的實施方案中，所述配製劑是通過皮下(即在皮膚之下)施用而施用於哺乳動物的。為了此類目的，可以使用注射器來注射配製劑。然而，可得到用於施用配製劑的其它裝置，諸如注射裝置(例如INJECT-EASEtm和GENJECTtm裝置)；注射筆(諸如genpentm);自我注射器裝置，無針頭裝置(例如MEDIJECTORtm和BIOJECTORtm);和皮下貼片投遞系統。在一個具體的實施方案中，本發明致力於單劑施用單位的試劑盒。此類試劑盒包含治療性蛋白質或抗體的水性配製劑的容器，包括單室或多室預裝填注射器。例示性預裝填注射器可以自Vetter股份有限公司(Ravensburg,Germany)獲得。蛋白質的適宜劑量("治療有效量")將取決於例如要治療的疾患、疾患的嚴重程度和進程、施用蛋白質是用於預防目還是治療目的、先前的療法、患者臨床史和對該蛋白質的響應、所使用的蛋白質的類型、及主治醫生的判斷。適合地在一次或在一連串治療中將蛋白質施用於患者，而且可以在診斷之後的任何時間將蛋白質施用於患者。可以作為唯一的治療或與在治療所討論疾患方面有用的其它藥物或療法組合地施用所述蛋白質。若所選擇的蛋白質是抗體，則約0.1-20mg/kg是給患者施用的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開的施用。然而，其它劑量方案也可能是有用的。此療法的進展易於通過常規技術來監測。抗IgE配製劑(例如rhuMAbE-25、rhMAbE-26、Hu-901)的用途包括例如IgE介導的變應性疾病、寄生蟲感染、間質性膀胱炎和哮喘的治療或預防。取決於要治療的疾病或病症，將治療有效量(例如約l-15mg/kg)的抗IgE抗體施用於患者。H.製品在本發明的另一個實施方案中，提供了製品，該製品含有配製劑且優選提供關於其使用的說明書。所述製品包含容器。合適的容器包括例如瓶、管形瓶(例如雙室管形瓶)、注射器(諸如單室或雙室注射器)和試管。所述容器可以用各種材料諸如玻璃或塑料製成。該容器裝有配製劑。所述容器上的或與所述容器相連的標籤可指明關於重建和/或使用的說明。所述標籤可進一步指明所述配製劑可用於或意圖用於皮下施用。所述裝有配製劑的容器可以是多次使用的管形瓶，其容許重建配製劑的重複施用(例如2-6次施用)。所述製品可進一步包含第二容器，其中裝有合適的稀釋劑(例如BWFI)。在混和稀釋劑和凍幹配製劑後，重建的配製劑中的最終蛋白質濃度一般會是至少50mg/ml。所述製品可進一步包括從商業和使用者立場看想要的其它物質，包括其它緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說明書的包裝插頁。通過參照以下實施例會更加完全地理解本發明。然而，它們不應解釋為在另一個實施方案中，本發明提供了製品，該製品包含本文中所描述的配製劑，其用於在自我注射器裝置中施用。自我注射器可以描述成在開動後無需別的來自患者或施用者的必需動作就會投遞其內容物的注射裝置。當投遞速率必須恆定且投遞時間大於少許片刻(afewmoment)的時候，它們特別適於治療性配製劑的自我藥療。實施例實施例l:靈長類IgE的分離自人IgE骨髓瘤細胞系U266(ATCC，Manassas,VA,TIB#196)克隆了人IgE。通過自衍生自恆河猴和獼猴外周血單個核細胞(它們已經受到剌激以生成IgE轉換的細胞(PBMC))的cDNA對IgE的克隆和測序，測定了恆河猴和獼猴IgE序列。自人IgE序列設計了正向和反向引物(在下文中顯示)。上遊正向引物是剛好在CH2結構域的上遊設計的。反向引物是在跨膜結構域的末端處設計的。自加利福尼亞國家靈長類研究中心(CaliforniaNationalPrimateResearchCenter,Davis,CA)獲得了恆河猴和獼猴PBMC。將5x16個PBMC用IL-4(100ng/ml)和CD40L(3fig/ml)(R&DSystems,Minneapolis,畫，分別為存204-IL和糾17-CL)培養4天。然後收穫細胞，製備RNA(RNeasyMiniKit,#74106,Qiagen，Valencia,CA)，並使用BDSprintPowerscript寡dT《I發試劑盒(BDBiosciences,SanJose,CA,弁639558)製備cDNA。然後實施RT-PCR[94°C2分鐘；94°C15秒鐘；60°C30秒鐘；68°C2分鐘；30個循環；68°C10分鐘]。在指定循環後添加Taq聚合酶(IO分鐘72°C)以添加A突出端，供TA克隆用(Invitrogen,Carlsbad,CA，#45-0641)。通過TOPO-TA克隆來克隆PCR產物，並且然後檢驗克隆的序列(Genentech,Inc.)。使用公司內部的分析程序(Genentech，Inc.)比對人、恆河猴和獼猴序列。以下同源性是關於CH2和跨膜結構域之間的序列的。在恆河猴(432個胺基酸)與獼猴(431個胺基酸)之間，有6處不同，大約98.6%的同源性。在人與恆河猴之間，有53處不同，等於87.7。/。的同源性。在人與獼猴之間，有56處不同，等於87%的同源性(見圖l)。用於克隆的引物CH2序列上遊的正向引物5'-ccgcccaccgtgaagatcttacagtc跨膜結構域末端處的反向引物5,-cggctcgagact鄉cgtggggctggaggacgttg實施例2:抗lgE/Ml，抗體的分離M'/Fc融合奢47的^:成如下生成了人IgECH3-CH4-MlVFc融合蛋白，即自製備自U266細胞(ATTCManassas,VA,TIB存196)的cDNAPCR擴增人IgECH3-CH4-M1，結構域，加上剛好在M1，結構域下遊的另外的15個胺基酸。自U266細胞(RNeasyMiniKit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)製備RNA，並使用BDSprintPowerscript寡dT引發試劑盒(BDBiosciences,SanJose,CA，#639558)製備cDNA。實施RT-PCR,並通過TOPO-TA克隆(Invitrogen,Carlsbad,CA，弁45-0641)來克隆PCR產物。通過PCR"i秀變添加N-端信號序列，供在哺乳動物細胞中表達用，並將信號序列+CH3+CH4+Ml，+15個胺基酸克隆入表達載體(pRKhulgGIFc;Genentech)以生成與人IgGlFc區的C-端融合物。最終蛋白質(SEQIDNO:63)(SEQIDNO:64)的序列(包括信號序列和人IgGlFc)如下MGWSCIILFLVATATGVHSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSEEAEGEAPWRAQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV麗AKTKPREEQYNSTYR(SEQIDNO:65)通過瞬時感染CHO細胞來生成蛋白質(Genentech)，並使用標準蛋白ASepharose柱層析技術自細胞培養物上清液純化蛋白質。名瘦f口染X^的奇建使用CH3-CH4-M1'/Fc蛋白生成了一組選擇性結合人IgE-M1，的Ml，部分的泛特應性抗體。以3-4天間隔給BALB/c小鼠的每個後足墊注射在單磷醯-脂質A和二棒分枝菌酸海藻糖(MPIJM+TDM)佐劑(Corixa,Hamilton,MT)中重懸的l(igCH3-CH4-MlVFc。8次加強注射後採集血清，並通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和焚光激活細胞分揀和流式細胞術(FACS篩選，見下一個部分)滴定以確保小鼠具有好的對CH3-CH4-M17Fc的免疫應答。最後一次加強注射後3天，將胭(淋巴)結細胞與小鼠骨髓瘤細胞系P3X63Ag.U.1(參見例如Chuntharapai等，1997,MethodsEnzymol.288:15-27)融合。使用來自ClonaCell⑧雜交瘤選4奪試劑盒(StemCe11Technologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)的培養基D中的次黃噪呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)選擇，自未融合的胭結或骨髓瘤細胞選擇出融合的雜交瘤細胞，導致4224個克隆的生成。乂,泛^^^我入Af/'戎伴的^^遂對如先前所述生成的雜交瘤克隆篩選結合CH3-CH4-MlVFc蛋白的Mr區、在A20小鼠B細胞淋巴瘤細胞系的表面上穩定表達的人IgE-Ml，的Ml，區(IgE-Ml，/A20)、和在BJAB人B細胞淋巴瘤細胞系的表面上穩定表達的人IgE-M1，的M1，區(IgE-M17BJAB)的單克隆抗體的生成。陰性對照包括人CD-4/Fc、在A20小鼠B細胞淋巴瘤細胞系的表面上穩定表達的人IgE(IgE/A20)、A20小鼠B細胞淋巴瘤細胞系(A20)、在BJAB人B細胞淋巴瘤細胞系的表面上穩定表達的人IgE(IgE/BJAB)、和BJAB人B細胞淋巴瘤細胞系(BJAB)。ELISA篩選為了篩選這4224個克隆，實施了酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，大體上如Baker等，2002，TrendsBiotechnol.，20:149-156中所述。測定法是在384孔和96孔兩種板中實施的。簡言之，將384孔(或96孔)板用50^il在包被緩衝液(0.05M碳酸鹽緩衝液，pH9.6)中濃度為2[ig/ml的山羊抗人IgGFc(MPBiomedicals,Irvine,CA)包被，密封，並於4。C保存過夜。除去包被液後，向每個孔添加80|11(或200pl，用於96孔板)在PBS(pH7.4)(ELISA稀釋劑)中含有0.5%牛血清清蛋白和0.05%Tween⑧-20的測定/封閉液，並將板在搖動中於室溫溫育l小時。然後將孔用100^1(或300pl，用於96孔板)含0.05%Tween⑧-20的PBS(清洗緩沖液)清洗3次。清洗步驟後，向每個孔添加50(11(或100pl,用於96孔板)在ELISA稀釋劑中含有0.4嗎/mlCH3-CH4-Ml，/Fc或人CD-4/Fc的抗原溶液，並將板在搖動中於室溫溫育l小時。像之前那樣將孔用清洗緩沖液清洗3次。添加來自各個雜交瘤克隆的上清液，使得加有CH3-CH4-Ml，/Fc的一個孔和加有人CD-4/Fc的一個孔各接受50pl(或100pl，用於96孔板)來自單個雜交瘤克隆的上清液。將板在搖動中於室溫溫育1小時，並像之前那樣將孔用清洗緩衝液清洗3次。清洗後，向每個孔添加50^d(或100ial，用於96孔板)在ELISA稀釋劑中的1:1000稀釋的偶聯有辣根過氧化物酶的綿羊抗小鼠IgG(對人IgG沒有交叉反應性(MPBiomedicals))。將板在搖動中於室溫溫育l小時，像之前那樣用清洗緩沖液清洗3次，並拍幹。如下對孔進行顯色，即向每個孔添加50pl(或100^1,用於96孔板)四曱基聯苯胺(TMB)微孔過氧化物酶底物(BioFXLaboratories,OwingMills,MD,產品目錄弁TMBW-0100-01)並於室溫溫育5-10分鐘或直至觀察到好的顏色反應。通過向每個孔添加50pl(或lOO(il，用BioFXLaboratories,產品目錄弁BSTP-0100-01)來終止顯色。用Sunrise讀板儀(TecanUS,Inc.,ResearchTrianglePark,NC)於650nm分析板。使用預採血(prebleed)和多血清(polysera)作為對照。預採血樣品含有免疫之前的小鼠血清，而多血清樣品含有10次免疫後獲得的小鼠抗血清。FACS篩選為了篩選實施例1中生成的3221個克隆，-使用IgE-Ml，/A20和IgE-M17BJAB細胞系實施了焚光激活細胞分揀(FACS)。IgE/A20、IgE/BJAB、A20、和BJAB細胞系充當陰性對照。將細胞重懸，並於4。C以500g離心5分鐘。吸掉培養基，並將細胞重懸於4。C含l。/。胎牛血清的FACSFlow(BDBiosciences:SanJose,CA)緩衝液(細胞染色緩衝液)。像之前那樣將細胞離心，吸掉培養基，並將細胞以2xl(^個細胞/ml細胞染色緩沖液(於4。C)重懸。將細胞以50ji1/孔(lxlS個細胞/孔)添加至96孔圓底板，並向每個孔添力口100jil來自各個雜交瘤克隆的上清液，使得每種雜交瘤上清液與含有每一種細胞系的一個孔一起溫育。將板在冰上孵育30分鐘。將板於4。C以500g離心5分鐘，並吸掉上清液。將每個孔重懸於4。C200(il細胞染色緩沖液，並像之前那樣將板離心。吸掉細胞染色緩沖液。清洗步驟後，將每個孔中的細胞重懸於4。C10(Hil在細胞染色緩衝液中的1:1000稀釋的偶聯有R-藻紅蛋白的山羊抗小鼠IgGFc(JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA)，和將板在黑暗中在水上孵育30分鐘。將板於4。C以500g離心5分鐘，並吸掉上清液。將每個孔重懸於4。C200pl細胞染色緩衝液，並像之前那樣將板離心。吸掉細胞染色緩衝液。將每個孔中的細胞重懸於4。C200jil細胞染色緩沖液，並轉移至1.2ml微量滴定管(QualityScientificPlastics,Petaluma,CA)。在FACScan或FACSCalibur(BDBiosciences)上實施FACS。iV-端豸^/RA^的分庠/^/,和義^自抗lgE/Ml，雜交瘤的上清液純化了抗體，並在磷酸鹽緩沖鹽水分析了N-端測序，以確定克隆性(clonality)。在Precast4-20%TrisHClSDS-PAGE(Invitrogen,Carlsbad,CA)上在還原性條件下分開每一種抗體。使用Procise494N端測序儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA),使用20分鐘循環，如Henzel等，AnalyticalBiochemistry267,148-160(1999)所述，將每一種解析出的重鏈(HC)和輕鏈(LC)進行N端測序。對前25個殘基測序以確立單克隆性。當抗體的HC或LC鏈被焦穀氨醯基封閉，使得Edman測序無法觸及N端胺基酸殘基時，在測序之前消除封閉基團。焦穀氨醯基是用焦穀氨酸氨肽酶(PGAP，Sigma，StLouis,MO)消除的，使用Pham等，Electrophoresis2005,264243-4251記載的方案。經測定，M1，抗體7A6、1C11、47H4、26A11、45C1和28E9的重鏈(HC)和輕鏈(LC)序列如下7A6HCQVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKAS(SEQIDNO:66)LCDIVMSQSPSSLTVSVGEKVTLSCKS(SEQIDNO:67)1C11HCQVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKAS(SEQIDNO:68)LCDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKS(SEQIDNO:69)47H4HCEVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAAS(SEQIDNO:70)LCDVVLTQTPLSLPVSLGDQASI(SEQIDNO:71)26A11HCEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS(SEQIDNO:72)LCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRS(SEQIDNO:73)45C1HCQIQLVQSGPELKKPGETVK(SEQIDNO:74)LCDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCK(SEQIDNO:75)28E91HCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATS(SEQIDNO:76)LCDIQMTQSPASLSVSVGETVTFTCR(SEQIDNO:77)為了測定全長序列，自N端胺基酸序列和已知的Ig基因區段設計了5，簡併引物，並用簡併下遊重鏈和輕鏈保守序列實施了PCR。正向引物7A6HCFOR.BsiWILCFOR.EcoRV1C11HCFOR.BsiWILCFOR.EcoRV47H45，-tcgacgta^gete^ggttcagctgcagcaatctggggctgagctgg(SEQIDNO:78)5，-gatcgatatcgtgatgtcccagtctccctcctccctaac(SEQIDNO:79)5，-tcga^gti^gctcaggttcaattgcagcagtctggggctgagctgg(SEQIDNO:80)5，匿gatcgatatcgtaatgtctcagtctccttcctccctagc(SEQIDNO:81)HC9.1HCF.BsiWI5，-tcgacgtacgctgaggtgaagttggtggagtctgggggaggcttag(SEQIDNO:82)LC47H4LCF.EcoRV5，-gatcgatatcgtgctgactcagactccactctccctgcc(SEQIDNO:83)26A11HCC7F7HCF.BsiWI5，-tcga^g^gctgaggtccagctccagcagtctggacctgagc(SEQIDNO:84)LC2B4LCF.EcoRV5，-gatcgatatccagatgacccaaactacatcctccctg(SEQIDNO:85)45C1HC2G6HCF.BsiWI5，-tcga^g^gctcagatccagttggtgcagtctggacctgagctg(SEQIDNO:86)LC9C10LCF.EcoRV5'-gatcgatatcgtgatgacgcagactccactcactttgtcgg28E9HC9.1HCFBsiWILC5E10丄CF.EcoRV反向引物重鏈引物(HCR)輕鏈引物(LCR)(SEQIDNO:87)5，-tcga^5gctgaggtgaagctggtggagtctgaaggaggcttgg(SEQIDNO:88)5，-gatcg^i^cagatgacccagtctccagcctccctatc(SEQIDNO:89)5'-ctggacagggatccagagttccaggtcactgtcactggctcaggg(SEQIDNO:90)5'-ctgtaggtgctgtctttgctgtcctgatcagtccaactg(SEQIDNO:91)自抗lgE/Ml，雜交瘤(RNeasyMiniKit,#74106，Qiagen,Valencia,CA)收穫RNA，並使用BDSprintPowerscript寡dT引發試劑盒(BDBiosciences,SanJose，CA,弁639558)製備cDNA。使用上述引物實施PCR，並使用TOPO-TA試劑盒(lnvitrogen,Carlsbad,CA,#45-064l)克隆PCR產物。使用白金級Pfk高保真聚合酶(PlatinumPfxHighFidelityPolymerase)(Invitrogen,Carlsbad,CA,#11708-039)進行PCR，PCR條件為[94。C2分鐘；94°C15秒鐘；60°C30秒鐘；68。C2分鐘；30個循環；68°CIO分鐘]。對克隆篩選插入物，並對多個克隆測序(Genentech，Inc.)以4企驗初始抗lgE/Ml，重鏈和輕4連基因序列。將抗M1，抗體可變域與不同Fc區一起亞克隆入表達載體以生成含不同物種和/或同種型Fc的嵌合抗體。設計引物，用以將可變域(CDR+框架)克隆入小鼠lgG2a、小鼠lgG2a-DANA、和人IgGlFc區。設計引物，用以與重鏈和輕鏈序列一起摻入限制性位點。重鏈是使用BsiWI和Apal克隆的。輕鏈是使用EcoRV和KpnI克隆的。然後消化新的PCR產物，並連接入mlgG2a(LPG10)、mlgG2a畫DANA(pErk畫E27DANA)、或huIgGl(這些用於重鏈)，或mK(LPG2)或huK表達載體(Genentech,Inc.)。檢驗最終克隆的序歹'KGenentech,Inc.)。用於克隆可變CDR^列的3，引物及正向與反向引物組合如下反向引物7A6HCREV.ApaI5'-accgatgggcccttggtggaggctgaagagactgtgag(SEQIDNO:92)LCREV.KpnI5，-ccttggtaccccctccgaacgtgtacggatagctataatattg(SEQIDNO:93)1C11HCREV.ApaI5'-gaccgatgggcccttggtggaggctgaggagac眺(SEQIDNO:94)LCREV.KpnI5，-ccttggtaccccctccgaacgtgtacggatagctataa(SEQIDNO:95)47H4HC47H4HCR,Apal5'4gggcccttggtggaggctgaggagacggtgactgag(SEQIDNO:96)LC47H4LCR.Kpnl5,-ttccaacttggtacctccacc(SEQIDNO:97)26A11HC7G8HCR.Apal5'-gaccgatgggcccttggtggargctgcagagacagtgaccagag(SEQIDNO:98)LC47H4LCR,Kpnl5'-ttccaacttggtacctccacc(SEQIDNO:99)45C1HC45ClHCR.Apal5,-cgatgggcccttggtggargckgaggagacggtgagaatg(SEQIDNO:100)LC5C2LCR.Kpnl5'隱agcttggtaccccctccg(SEQIDNO:101)28E9HC28E9.HCREV.ApaI5，-cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggcgactgag(SEQIDNO:102)LClD5.2LCR,Kpnl5'-ttccaacttggtacccgagccg(SEQIDNO:103)引物組合正向7A6:HC7A6.FOR.BsiWILC7A6.FOR.EcoRV反向7A6.REV.ApaI7A6.REV.KpnI1C11:HClCll.FOR.BsiWILClCll.FOR.EcoRVlCll.REV,ApaIlCll.REV,KpnI47H4:HC9丄HCRBsiWILC*47H4丄CF.EcoRV7H4HCR,Apal47H4丄CR,Kpnl26A11HCC7F7.HCF.BsiWI—7G8.HCR.ApalLC2B4丄CREcoRV…47H4丄CR.Kpnl45C1HC2G6.HCF.BsiWI—畫45Cl.HCR.ApaILC9C10丄CF.EcoRV—5C2丄CR.Kpnl28E9HC9丄HCF.BsiWI—-28E9.HCR.ApaILC5E10丄CF.EcoRV—lD52丄CR.Kpnl47H4輕鏈具有一個內部KpnI位點，這妨礙直接將mKappa和huK叩pa克隆入表達載體。使用快速變化XL定點誘變試劑盒(Stratagene，CedarCreek,Texas,#200517-5)突變了這個內部Kpnl位點[95。Cl分鐘；95°C50秒鐘；60°C50秒鐘；68。C4.5分鐘；68。C7分鐘]。依照試劑盒的要求來設計引物以突變KpnI位點內的單個核香酸且不改變胺基酸序列。將TAC突變成TAT，這在該位置保留了酪氨酸(Y)。檢驗最終克隆的序列(Genentech，Inc.)。106用於誘變的引物為FOR5，-cctatttacattggtatctgcagaagccaggcc(SEQIDNO:104)REV5，-ggcctggettctgcagataccaatgtaaatagg(SEQIDNO:105)實施例2A:抗lgE/Ml，抗體的人源化此實施例描述了鼠抗IgE/Ml，抗體26A11、7A6和47H4的人源化。材料和方法在CHO細胞中以Fc融合物的形式表達膜結合型人IgE的Ml，結構域，並通過常規手段來純化。表達抗體26A11、7A6和47H4的雜交瘤是通過用重組Ml，-Fc融合蛋白免疫小鼠獲得的，並通過使用經M1，-Fc包被的板進行的ELISA鑑定的。功能性抗體是通過它們結合表達M1，的細胞和促進凋亡的能力而鑑定的。處26」//、Z46^^7好4^"^r試時^i發-使用標準方法自生成26A11、7A6或47H4的雜交瘤細胞提取總RNA。使用RT-PCR用針對重鏈和輕鏈的簡併引物擴增輕鏈可變域(VL)和重鏈可變域(VH)。正向引物是對VL和VH區的N端胺基酸序列特異性的。相應地，LC和HC反向引物設計成與輕鏈恆定域(CL)和重鏈第一恆定域(CH1)(它們在物種中是高度保守的)中的區域退火。使用常規測序方法測定了插入物的多核苷酸序列。26A11、7A6和47H4VL和VH胺基酸序列分別顯示於圖6A和6D、6B和6E、及6C和6F。^^足J:凝媒接封^伴入共^"蕃束丄-用於此項工作的噬菌粒是單價Fab-g3展示載體，由在單一phoA啟動子控制下的2個可讀框組成。第一可讀框由與受體輕鏈的VL和CH1結構域融合的stll信號序列組成，而第二可讀框由與受體重鏈VH和CH1結構域及隨後的次要噬菌體外殼蛋白P3融合的stll信號序列組成。將來自鼠26A11、7A6或47H4抗體(mu26A11、mu7A6或mu47H4)的VL和VH結構域與人VLid(huKI)和人VH亞組III(huIII)共有序列比對。為了製備CDR嫁接物，將來自mu26Al1、mu7A6或mu47H4的高變區嫁接到huid和huIII共有受體框架中以生成直接CDR-嫁接物(26All.vl、7A6.vl或47H4.vl)(圖6A-6F)。在VL結構域中，將下述區域嫁接至人共有受體第24-34位(Ll)、第50-56位(L2)和第89-97位(L3)。在VH結構域中，嫁接第26-35位(Hl)、第49-65位(H2)和第94-102位(H3)。MacCallum等[MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996)]已經分析了抗體和抗原複合物晶體結構，並發現重鏈的第49位和第94位是接觸區的一部分，如此當人源化抗體時在CDR-H2和CDR-H3的限定中包括這些位置似乎是合理的。使用針對每個高變區分開的寡核苷酸通過LC和HC表達載體的Kunkel誘變生成了IgG抗體形式的人源化抗IgE/Ml，抗體26All.vl、7A6.vl和47H4.vl。還使用Kunkel誘變進行了用以提高穩定性的胺基酸變化。Kunkel等，J.Biol.Chem.263(29):14784-14789(1988)。通過DNA測序鑑定了正確的克隆。/^7Jt^'-出於篩選目的，最初在293細胞中生成IgG變體。使用FuGene系統將編碼VL和VH的載體(25pg)轉染入293細^^中。將500)ilFuGene與4.5ml不含FBS的DMEM培養基混和，並於室溫溫育5分鐘。將每條鏈(25嗎)添加至混合物，並於室溫溫育20分鐘，然後轉移至五個T-150燒瓶，在5。/。C02中於37。C轉染過夜。次日，除去含有轉染混合物的培養基，並更換成23ml含0.1ml/L痕量元素(A0934)和10mg/L胰島素(A0940)的PS04培養基。將細胞再溫育5天，之後以1000rpm5分鐘收穫培養基，並使用0.22pm低蛋白質結合濾器無菌過濾。在每125ml培養基添加2.5ml0.1%PMSF後，樣品可以保存於4。C。親和力^W;t-通過Scatchard分析、細胞結合ELISA和通過使用BIAcoreTM-2000或A1OO進行的表面等離振子共振實施親和力測定。Scatchard分析-製備Daudi-人、恆河猴和獼猴IgE/Ml，細胞供冷結合緩衝液中的結合用，所述冷結合緩衝液由基礎培養基及10mMHEPESpH7.4和2。/oFBS以及40iig/ml人IgG構成。將細胞稀釋至1.7x106個細胞/011的濃度，並保持在冰上，直至將它們添加至測定體系。用lodogen法^e典化蛋白質/抗體。一式三份地製備各種濃度的冷蛋白質，使用1:2稀釋，從飽和濃度開始，以零濃度結束，總共14個濃度。將單一濃度的熱蛋白質添加至所有稀釋度，以與冷蛋白質竟爭。最後，將細胞添加至熱和冷蛋白質混合物，每份樣品使用250，000個細胞。將測定體系在搖動中於4。C保持4小時。然後收集每份樣品並在膜上過濾，用結合緩衝液清洗至少3次，讓它們乾燥，然後使用PerkinElmerWizard1470自動伽馬計lt器計ltl分鐘。竟爭性電化學發光細胞結合測定法-使用竟爭性電化學發光細胞結合測定法測量人源化變體的相對結合親和力。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗表達lgE-Ml，的經轉染BJAB細胞(BJAB-IgE/Ml，)(長)或不表達M1，的對照轉染細胞(BJAB-IgE)(短)，並以25，000個細胞/孔在25(^1PBS中在96孔多陣列高結合板(MesoScaleDiscovery)上接種。將細胞在板上於室溫溫育一小時，讓細胞附著至孔。為了封閉非特異性結合，向每個孔添加25|11含30°/。FBS的PBS。然後將板在溫和搖動中於室溫溫育30分鐘。倒掉封閉液，並添加25(xl含2%FBS的PBS(測定緩衝液)中補充有固定量的生物素化抗IgEMl，抗體(33.3nM26All或47H4)的連續稀釋度的人源化變體(0.022-1333nM)。在溫和搖動中於室溫溫育一'h時後，使用微量板清洗儀(ELx405Select,Bio-TekInstruments,Inc.,Winooski,VT)將板用PBS(300jal/孔)清洗三次。為了檢測結合的抗體，添加25)al含0.25嗎/ml釕標記的鏈黴親合素的測定緩沖液。於室溫溫育一'J、時後，清洗板並添加(15(Vl/孔)基於Tris的讀數緩衝液T(lx，不含表面活性劑)(MesoScaleDiscovery)。使用SectorImager6000讀數儀(MesoScaleDiscovery)記錄電化學發光信號。Bia畫2000-使用兩種方向；將M1，-Fc或特定抗體變體固定化(大約100RU，在10mM乙酸鈉pH4.8中，在CM5傳感器晶片上)，而相應的配體(分別是抗體變體或Ml，Fc)充當分析物(以30(iL/min的流速注射，4吏用PBST中0.5-1000nM的2倍連續稀釋度)。對每份樣品分析3分鐘結合和10分鐘解離。每次注射後，使用10mM甘氨酸pH1.7再生晶片。BiacoreA-100-將M1，固定化(大約100RU，在10mM乙酸鈉pH4.8中，在CM-5傳感器晶片上)，而抗體變體充當分析物(以3(^L/min的流速注射，使用PBST中0.5-1000nM的2倍連續稀釋度)。對每份樣品分析5分鐘結合和5分鐘解離。每次注射後，使用10mM甘氨酸pH1.7再生晶片。通過自18F7變體IgG流動室減去對照流動室來修正結合響應。使用同時擬合k。n和k。ff的1:1朗格繆爾(Languir)模型來進行動力學分析。結果和討論26JW、Z46和47J^的OW^"接^-用於人源化的人受體框架基於共有人kIVL結構域和共有人亞組IIIVH結構域。比對了mu26A11、mu7A6和mu47H4的VL和VH結構域與人Kl和亞組III結構域；鑑定出每一個互補決定區(CDR)並嫁接到人受體框架中，生成了能作為IgG表達的CDR嫁接物(圖6A國6F)。^和力^估-使用細胞結合ELISA和通過表面等離振子共振評估了26All.vl,7A6.vl和47H4.vl(表l)。這些測定法指出了CDR嫁接物具有與它們的相應雜交瘤抗體非常相似的親和力。26^47/和47AW"CD/-丄7尹廖在應應麼和並天冬凌^多成位,《時薦餘一為了避免潛在的製造問題，消除了潛在的異天冬氨酸形成位點，即47H4.vl的CDR-L1中的Asn28-Gly29和26All.vl的CDR-Ll中的Asn31-Ser32，這是通過嘗試(sampling)在其它抗體中發現位於這些位置的殘基而實現的(圖6A、6C,表I)。發現將47H4.v1的CDR-L1中的Gly29變成Ala29(47H4.v2和47H4.v5)和將26All的CDR-Ll中的Ser32變成Tyr32(26All.v3和26All.v6)或Ala32(26All.v2或26All.v5)是合適的置換。另外，將Asn31變成Ser31(26All.vl3或26All.v15)或Gln31(26All.vl4或26All.v16)也有助於消除潛在的脫醯胺和異天冬氨酸形成，並提供了具有與它們的相應雜交瘤抗體相似的親和力的候選者。通過將26A11.v1或47H4.v1的CDR-H1中的Met34變成lle34,避免了這兩種抗體中的此殘基的潛在氧化，且不影響M1，結合。實施例3:抗M1，抗體的特異性在經帶有Ml，序列的IgE("長型，，)或缺乏Ml，序列的IgE("短型")轉染的人B細胞系BJAB(ATCCManassas，VA，弁HB-136)上測試了抗lgE/Ml，抗體克隆的特異性。IgEBJAB細胞系是通過使用pMSCV表達載體(WashingtonUniversity,St.Louis,MO)進行的BJAB細胞的逆轉錄病毒轉導而生成的。自人IgE骨髓瘤細胞系U266(ATCC,Manassas，VA，TIB弁196)獲得人IgEB細胞受體的全長重鏈和輕鏈的cDNA,並與IRES(內部核糖體進入序列)組合地亞克隆入逆轉錄病毒載體中，以容許抗體重鏈和輕鏈的雙順反子共轉染和共表達。下文提供了逆轉錄病毒轉導方法的進一步描述。將PG13包裝細胞(ATCCCRL-10686)在10cm組織培養板上以2x106個細胞/板(DMEM高葡萄糖、10%FBS、青黴素、鏈黴素、2mML-穀氨醯胺)接種24小時。使用FuGENE6用pMSCVDNA構建物轉染細胞，並於37。C、5°/0C02培養2天。收穫含有逆轉錄病毒顆粒的細胞培養物上清液，並通過0.4微米濾器過濾。添加無菌硫酸魚精蛋白至終濃度10)ig/ml，並如下所述使用4ml上清液來感染大約lx1(^個BJAB細胞，即將感染體系於32。C旋轉90分鐘，接著在逆轉錄病毒上清液中於37。C在5。/。C02中繼續培養3-4小時。收穫受感染的BJAB細胞，轉移至RPMI細胞培養培養基(RPMI、10%FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素、鏈黴素、2mML-穀氨醯胺)，並擴增，供分選用。通過流式細胞術來鑑定陽性轉染細胞，其中使用MAEll(Genentech)抗人IgE抗體來檢測表面IgE。根據BJABIgE短型和長型細胞系的流式細胞術染色的測定，抗lgE/Ml，抗體是對長型而不是短型膜IgE特異性的。由於抗人IgE(Maell)抗體(Genentech,Inc.)結合長型和短型IgE二者的能力，使用其作為陽性對照。使用抗gpl20mlgGl或抗豚草mlgG2a抗體作為同種型對照(Genentech，Inc)。在RPMI10%FBS(Hyclone，Logun，UT,#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素、2mML-穀氨醯胺(Genentech,Inc.)中培養BJAB細胞。將0.5x16個BJAB-長或BJAB-短細胞用小鼠(10fil)(VWR，弁RLD108-0100)和人血清(10^1)(Sigma,St.Louis，MO,存S-2257)在100plFACS清洗緩衝液(含2%FBS的1XPBS(Genentech,Inc.))中在水上封閉15分鐘。然後將細胞用1i!g/ml每種抗Ml，抗體在冰上染色20分鐘，然後用lmlFACS清洗緩衝液清洗，並以1200rpm離心5分鐘。將細胞重懸於100^dFACS清洗緩衝液，然後用山羊抗小鼠IgG-PE(5(il)(Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA，弁M30004-4)在水上染色20分鐘。像之前那樣清洗細胞，並重懸於lmlFACS清洗緩沖液，供FACSCalibur儀器(BD，Inc,FranklinLakes,NJ)上的分析用。所測試的所有抗體都是對長型IgE特異性的，且不以超過同種型對照的程度結合BJAB-IgE/短細胞。基於染色強度，我們觀察到廣泛的相對親和力。我們還評估了抗M1，抗體對在細胞表面上天然表達低水平的含M1，的人IgE的U266細胞系(ATCC,Manassas,VA,弁TIB196)的結合。在雜交瘤培養基[RPMI1640、15%胎牛血清、2mML-穀氨醯胺、10mMHEPES、4.5g/L葡萄糖、1,5g/L碳酸氬鹽]中以高密度(l-2xl06/ml)維持U266細胞。將U266細胞用l嗎/ml的抗Ml，抗體染色。47H4、47G4和42A5以與Maell類似的水平將U266染色。抗體42H4、45C1和28E9以很低的水平將U266染色。7A6、1C11、26A11、51D2、和26B11不對U266染色(圖2C)。實施例3A:鼠抗IgE/Ml，結合特異性圖2D-F顯示鼠抗IgE/Ml，抗體47H4、26A11和7A6對一組表達人、恆河猴或獼猴IgE/M1，的細胞系的結合。在經逆轉錄病毒感染以表達帶有Ml，序列的長型IgE或缺乏Ml，序列的短型IgE的人B細胞系BJAB(ATCCManassas,VA,弁HB-136)和Daudi(ATCC弁CCL-213)上測試了抗lgE/Ml，抗體克隆的特異性。在RPMI、10%FBS(Hyclone,Logun，UT，#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素、2mML-穀氨醯胺(Genentech，Inc.)中培養BJAB細胞。將0.5xl6個BJAB-長或BJAB-短細胞用小鼠(lOfil)(VWR,#RLD108-0IOO)和人血清(10^1)(Sigma,St.Louis,MO，弁S-2257)在100plFACS清洗緩衝液(含2%FBS的IXPBS(Genentech,Inc.))中在冰上封閉15分鐘。然後將細胞用l嗎/ml每種抗Ml，抗體在冰上再染色20分鐘，然後用lmlFACS清洗緩沖液清洗，並以1200rpm離心5分鐘。將細胞重懸於lOOplFACS清洗緩沖液，然後用山羊抗小鼠IgG-PE(5|il)(Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA,弁M30004-4)在冰上染色20分鐘。{象之前那樣清洗細胞，並重懸於lmlFACS清洗緩衝液，供FACSCalibur儀器(BD，Inc,FranklinLakes,NJ)上的分析用。所測試的所有抗體都是對長型IgE特異性的，且不以超過同種型對照的程度結合BJAB-IgE/短細胞。基於染色強度，我們觀察到廣泛的相對親和力。在經逆轉錄病毒感染以表達帶有Ml，序列的膜IgE(長型)或缺乏序列的膜IgE(短型)的人B細胞系Daudi上測試了抗IgE/Ml，抗體克隆的特異性。抗IgE/Ml，抗體(47H4、26A11、7A6)是對長型而非短型特異性的(圖2D)。使用抗gpl20mlgGl抗體作為同種型對照(Genentech,Inc)。用含有恆河猴或獼猴或人IgE/Ml，之人IgE/靈長類Ml，盒的逆轉錄病毒轉導人B細胞系Daudi。轉導後，在3-4次分選的過程裡通過FACS分選儀將表達人、恆河猴、或獼猴IgE/Ml，的細胞分選至純度〉980/0。圖2F演示了抗lgE/Ml'抗體結合恆河猴和獼猴Mr的能力。47H4和7A6結合恆河猴和獼猴M1，二者，而26A11隻結合恆河猴M1，。在Daudi轉染子細胞系之外，我們評估了抗IgE/Ml，抗體對U266，即一種人IgE骨髓瘤細胞系(ATCC,Manassas，VA，弁TIB196)的結合。在雜交瘤培養基[RPMI1640、15%胎牛血清、2mML-穀氨醯胺、10mMHEPES、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氬鹽]中以高密度(l-2xl06/ml)維持U266細胞。將U266細胞用l昭/ml的抗Ml，抗體染色。抗lgE/Ml，抗體47H4結合U266,而26A11和7A6不然(圖2E)。實施例3B:人源化抗IgE/Ml，結合特異性實施例3B顯示人源化抗IgE/Ml，抗體對一組表達人、恆河猴或獼猴IgE/Ml，的細胞系的結合。使用實施例3A中所討論的相同的過表達人、恆河猴和獼猴Ml，的Daudi或BJAB人B細胞系，在經逆轉錄病毒感染以表達帶有Ml，序列的長型IgE或缺乏M1，序列的短型IgE的人B細胞系Daudi上測試了人源化抗IgE/Ml，抗體克隆的特異性。人源化抗IgE/Ml，抗體(47H4v5、26Allv6、7A6vl)是對長型而非短型(無M1，)特異性的(圖2G)。使用HERCEPTIN⑧抗Her2單抗huIgGl作為同種型對照(Genentech,Inc.)。另外，人源化抗IgE/Ml，抗體(47H4v5和26Allv6)結合U266細胞系(圖2H)。圖21顯示了人源化抗IgE/Ml，抗體結合恆河猴和獼猴M1，二者的能力。抗體47H4v5和7A6vl結合恆河猴和獼猴M1，二者，而26A11v6隻結合恆河猴Ml'。實施例4:抗M1，抗體的相對結合親和力我們在l嗎/ml觀察到寬範圍的抗IgE/Ml，抗體結合強度。為了評估這些抗體對IgE長受體的相對親和力，我們用連續稀釋的抗M1，抗體(1，0.1,0.01，0.001(ig/ml)將BJAB-長細胞染色。將BJAB-長細胞用小鼠和人血清(10(al)在冰上封閉20分鐘。將細胞用適宜量的抗M1，抗體、或抗gpl20mlgGl或抗豚草mlgG2a同種型對照再染色20分鐘。然後將細胞在FACS清洗緩沖液(lml)中清洗，離心(1200rpm，5分鐘)，並重懸於100(xl含山羊抗小鼠IgG-PE抗體(5nl)(CALTAG/Invitrogen,Carlsbad,CA弁M30004-4)的FACS清洗緩沖液，供檢測用。如上所述再次清洗細胞，然後在FACSCalibur儀器(BD，Inc,FranklinLakes,NJ)上分析。電壓設置基於0.001嗎/ml同種型對照。根據這些結果，依照相對結合親和力將抗IgE/Ml，抗體候選者排序42H4>7A6，47H4,47G4>42A5，26A11,45C1>51D2,26B11〉1C11〉28E9在通過抗體滴定和FACS檢測測定相對親和力之外，我們還使用Scatchard分析測定了選定抗Ml，抗體對表達IgE長型的BJAB細胞系的親和力。製備BJAB-長細胞，供冷結合緩衝液中的結合用，所述冷結合緩沖液由基礎培養基及10mMHEPESpH7.4和2%FBS以及40ng/ml人IgG構成。將細胞稀釋至1.7x1(^個細胞/ml的濃度，並保持在水上，直至將它們添加至測定體系。用Iodogen法碘化抗體。一式三份地製備各種濃度的未標記抗體，使用1:2稀釋，以飽和濃度開始，以零濃度結束，總共14個濃度。將單一濃度的碘化抗體添加至竟爭者未標記抗體的所有稀釋度。最後，將250,000個BJAB-長細胞添加至每份碘化和未標記抗體混合物。將樣品在搖動中於4。C溫育4小時。然後收集每份樣品並在膜上過濾，用結合緩衝液清洗至少3次，讓它們乾燥，然後使用PerkinElmerWizard1470自動伽馬計數器測量l分鐘。實施例4A:鼠抗IgE/Ml，抗體的Scatchard親和力製備表達各種形式的帶有或沒有M1，(人、恆河猴、獼猴)的IgE的BJAB或Daudi細胞，供冷結合緩沖液中的結合用，所述冷結合緩衝液由基礎培養基及10mMHEPESpH7,4和2%FBS以及40嗎/ml人IgG構成。將細胞稀釋至1.7x1(^個細胞/ml的濃度，並保持在冰上，直至將它們添加至測定體系。用1odogen法碘化蛋白質/抗體。一式三份地製備各種濃度的冷蛋白質，使用1:2稀釋，以飽和濃度開始，以零濃度結束，總共14個濃度。將單一濃度的熱蛋白質添加至所有稀釋度，與冷蛋白質竟爭。最後，將細胞添加至熱和冷蛋白質混合物，每份樣品使用250，000個細胞。將測定體系在搖動中於4。C保持4小時。然後收集每份樣品並在膜上過濾，用結合緩衝液清洗至少3次，讓它們乾燥，然後使用PerkinElmerWizard1470自動伽馬計lt器計數l分鐘。圖30總結了通過Scatchard分析測量得到的鼠抗M1，抗體的親和力。鼠抗體47H4mlgGl分別以0.79、0.77和0.97nM的親和力結合人、恆河猴、獼猴Ml'。鼠抗體26A11mlgGl和7A6mlgGl分別以2.3和0.64nM的親和力結合人Ml'。圖3P總結了人源化抗IgE/Ml，抗體對人、恆河猴和獼猴M1，的結合親和力。人源化抗體47H4v5huIgGl分別以1.5、1.3和2.5nm的親和力結合人、恆河猴和獼猴M1，。人源化抗體47H4v2、47H4vl、26A11v6、26A11vl4和26Allvl分別以0.54、0.37、1.85、1.5和1.06的親和力結合人M1'。實施例5:抗lgE/Ml，表位結合/阻斷研究在抗IgE/Ml，抗體候選者之間實施了阻斷研究以測定交疊的或獨特的結合表位。當阻斷和檢測抗體屬於不同同種型時(即lgGl對IgG2a)，利用這些同種型差異，通過用同種型特異性二抗(CALTAG/Invitrogen，Carlsbad,CA，行檢測來測定阻斷程度。當阻斷和結合抗體屬於同一同種型時，將抗體偶聯至生物素(Pierce,Rockford，IL，EZ-link匿sulfo-NHS-LC-Biotin#CAS127062-220)，並用鏈黴親合素-PE(BD#55406l)一企測，或者偶聯至Alexa-647(MolecularProbes/Invitrogen,Carlsbad,CA,#A20173)。最初以l:l的比例(10|iig/ml)使用阻斷和檢測抗體(圖4A-4B)。使用10:1的阻斷抗體對檢測抗體比進一步測試最初不給出阻斷或只給出部分阻斷的抗體組合。將BJAB-長細胞用小鼠和人血清封閉(如上所述)，然後用阻斷抗體(10嗎/ml)在FACS清洗緩衝液(2%FBS/1XPBS)中在冰上染色20分鐘。將細胞在FACS清洗緩沖液中清洗，然後用^f企測抗體以l:l(10嗎/ml)或10:1的比例(l|ig/ml)在水上染色20分鐘。如上所述再次清洗細胞，然後在FACSCalibur儀器(BD,Inc，FranklinLakes，NJ)上分析。將染上色的細胞與同種型對照抗體，即抗gpl20mlgGl(Genentech,Inc.)或抗豚草mlgG2a(Genentech,lnc.)比較(圖4C)。為了比較，在可能時，通過用未偶聯的相同抗體染色來測定完全阻斷。阻斷研究揭示了三個主要結合群，即A和B和C。基於部分交疊表位，A群進一步分成兩組，即A1(47H4、47G4、42H4、42A5)和A2(45C1、51D2、26A11)(圖4D)。C群(26B11)與其它抗體候選者具有很少的交疊。三種候選者比其它候選者更廣泛地交疊。1C11表現出與A1和A2組具有交疊表位，而且只被B群(28E9)部分阻斷。7A6主要屬於A1組，但是與A2組候選者具有部分相互作用。28E9屬於只有它一個的一個群。28E9與A2組候選者只有部分相互作用。實施例5A:表位作5A-E顯示使用抗IgE/Ml，抗體實施的表位結合研究。鼠抗體47H4、7A6和26A11顯示於圖5B和5D，而人源化變體47H4v5、7A6vl和26Allv6顯示於圖5C和5E。衷/i殺恩^^;:處候遞者生成了跨越圍繞並包含人Ml，(CliffordQuan)的序列的15種肽(圖5A)。將肽重懸於(^20或50%DMSO。以包被緩衝液(0.05M碳酸鹽/碳酸氬鹽pH9.6)中1)ig/ml將肽包被到96孔板(NUNCMaxisorp高蛋白質結合容量F丄ISA板弁44-2404)上(IOO[J每孔)。使用M1，-Fc融合蛋白作為結合的陽性對照。陰性對照包括用人IgE(U266)包被的孔和未包被的孔。讓肽於4。C包被過夜。次日上午，將板用清洗緩衝液(PBS/0.05%Tween-20(pH7.4))清洗3次。然後將板在溫和搖動中在封閉緩衝液(PBS,0.5%BSA(pH7.4))封閉1小時。在Magic緩沖液[PBS(pH7.4)、0.5%BSA、0.05%Tween-20、10ppmProclin、0.2%BgG、0.25%Chaps、5mMEDTA、0.35MNaCl]中製備要測試的抗體(47H4mlgGl、47H4v5huIgGl、26A11mlgGl、26Allv6huIgGl、7A6mlgGl、7A6vlhuIgGl)的稀釋液(40ng/ml和lng/ml)。分別使用抗gp120mlgGl和HERCEPTIN⑧huIgGl抗體作為鼠和人抗IgE/Ml，抗體的對照。一旦板充分封閉(0.5。/。BSA/lXPBS)，將板清洗3次，然後一式三份地將抗體添加至板(IO(VI每孔)。然後將板於室溫溫育2小時。將鼠抗體板清洗3次，然後添加抗小鼠IgGl-生物素(BDBiosciences(A85-l)#553441)(1:10,000，100^1每孔)，並於RT溫育l小時。3次清洗後，添加SA-HRP(BDBiosciences#554066)(1:20,000,100jul每孔),並溫育1小時。像之前那樣清洗人IgGl抗體板，添加抗huIgG.Fc-HRP(JacksonImmunoResearch(#109-036-098))(1:10,000，100^1每孔)並於RT溫育1小時。一旦第二溫育完成，將板清洗6次，並添加TMB底物(BDOptEIA#555214)(100(xl每孔)。約4分鐘後用1M^^>04終止底物-HRP反應。然後在450/650讀板。數據表述為相對OD(OD450/CD650)。圖5B和5D圖示了鼠47H4、26All和7A6抗IgE/Ml，候選者對Ml，肽的結合。這些候選者的結合與表位分組限定的抗體阻斷研究相關。47H4mlgGl結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQIDNO:8)。7A6mlgGl結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQIDNO:8)和肽5(RAPDRVLCHSGQQQG)(SEQIDNO:9)。26A11mlgGl結合肽7(GQQQGLPRAAGGSVP)(SEQIDNO:11)和肽8(PRAAGGSVPHPRCH)(SEQIDNO:12)。圖5C和5E圖示了人源化抗IgE/Ml，抗體對M1，肽的結合。如上文關於相應鼠抗體所述實施表位作圖，只是使用不同的二抗。像之前那樣清洗人IgGl抗體板，並添加抗IgG.Fc-HRP二抗(JacksonImmunoResearch,#109-036-098)(1:10,000，100pl每孔)，並於RT溫育1小時。表位結合與對親本鼠抗體所觀察到的平行。47H4v5結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQIDNO:8)。7A6vl結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQIDNO:8)和肽5(RAPDRVLCHSGQQQG)(SEQIDNO:9)。26A11mlgGl結合肽7(GQQQGLPRAAGGSVP)(SEQIDNO:ll)和肽8(PRAAGGSVPHPRCH)(SEQIDNO:12)。實施例6:鼠抗IgE/Ml，在Daudi-IgE/長細胞中對凋亡的誘導使用Daudi-長(IgE/Ml，)細胞來測試交聯表面IgE對誘導凋亡的影響。Daudi細胞(ATCC,Manassas,VA，弁CCL-213)是一種已知對應答BCR交聯而發生的凋亡易感的人伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤細胞系。如上文關於BJABIgE長細胞的生成所描述的，通過帶有M1，的IgE的U266重鏈和輕鏈的逆轉錄病毒轉導生成了表達長型IgE的Daudi細胞。使用針對內源IgM和經轉染IgEB細胞受體的抗體進行的Daudi-IgE/長細胞的流式細胞術分析指示IgM的表達高於IgE。在培養基[RPMI,10%FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#15140-122)、2mM穀氨醯胺(Genentech,Inc.)、10mMHEPES(7.2)(Genentech,Inc.)、lmM丙酮酸鈉(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#11360)、1.59g/L石友酸氫鈉溶液(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#25080-094)]中培養至0.2x106/1.5ml密度的細胞中研究了Daudi-IgE/長細胞的凋亡。在開始凋亡測定法之前，在Ficoll梯度(GEHealthcare#17-1440-03)上除去死細胞以降低測定法中細胞死亡的背景水平。一式三份地將0.2x1(^個細胞在有和沒有抗Mr抗體或對照抗體的情況中在溶液中培養72小時。然後收穫細胞，並使用膜聯蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒I(BDBiosciences,SanJose,CA#556547)分析凋亡水平。將細胞在冷PBS(Genentech,Inc.)中清洗兩次，然後重懸於100filIX結合緩沖液(0.1MHepes/NaOH(pH7.4)、1.4MNaCl、25mMCaCl2)(BDBiosciences,SanJose,CA,#51-66121E)。然後將細胞用2.5iil膜聯蛋白V-FITC抗體(BDBiosciences,SanJose,CA弁51-65874X)和5ixl石典化丙啶(PI)(BDBiosciences,SanJose,CA弁51-66211E)在黑暗中染色。15分鐘後，向每個管添加400ial1X結合緩衝液，並在FACSCalibur流式細胞術儀器(BD,Inc.FranklinLakes,NJ)分析細胞。為每份樣品收集到大約10-20,000例事件。正在死去的細胞定義為膜聯蛋白-V呈陽性且PI呈陰性。死細胞是膜聯蛋白-V和PI二者都呈陽性。使用FlowJoFACS分析軟體(TreeStar,Inc.,Ashland,Oregon)計算每種群體(死的和正在死去的)的百分比。對三份重複的數據取平均值和計算標準偏差。使用Excel(Microsoft,Inc.)以死的和正在死去的細胞之和計算百分比凋亡並繪圖。使用喜樹鹼(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO,弁C9911-100mg)和抗IgM抗體(JacksonlmmunoResearch,WestGrove,PA，#109-006-120)作為在Daudi-IgE/長細胞系中誘導凋亡的陽性對照。使用抗gpl20mlgGl或抗豚草mlgGl抗體(Genentech，Inc.)作為此測定法的陰性對照。將Daudi-IgE/長細胞與一定範圍的抗IgE/Ml，或同種型對照抗體濃度(25、10、1、0.1、0.01、0.001)ag/ml)一起培養。所測試的抗IgE/Ml，抗體是7A6、47H4、47G4、42A5、42H4、1C11、26A11、51D2、45Cl、26B11和28E9(Genentech，Inc.)。還使用抗人IgE抗體(Mae11-mIgG1)進行比較。同種型對照抗gpl20和抗豚草抗體不以超過未處理細胞的程度誘導凋亡。每次實驗的凋亡背景水平在10-15%範圍中。抗lgE/Ml，抗體7A6(〉10嗎/ml)、47H4(〉10pg/ml)、和47G4(25|ig/ml)誘導DaudiIgE長細胞凋亡。26All誘導在低得多的濃度(>0.1(ig/ml)誘導程度類似的凋亡(約30-50%)。42A5、51D2、45C1、26B11、和28E9不以超過背景水平的程度誘導凋亡。Maell也不以超過背景水平的程度誘導凋亡。我<門還在存在山羊4元小鼠IgGF(ab，)2二4元(JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA#115-006-062)(用以超交聯Daudi細胞系上的IgEB細胞受體)的情況中實施了凋亡測定法。交聯實驗是在存在山羊抗小鼠IgGF(ab，)2抗體(30jig)(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,#115-006-062)的情況中進行的。除了26B11(30%)以外，所有抗體都誘導70-80%的最大凋亡水平，但是在不同的濃度發生。這些抗體可分成兩組。7A6、ICII、26A11、51D2、45C1、和28E9在最高濃度誘導最大凋亡。另一組，即47H4、47G4、42A5、和42H4、及MAE11在較高濃度展現漸減的凋亡。實施例6A:人源化抗IgE/Ml，抗體在Daud/IgE-長細胞中對凋亡的裔導使用Daudi-長(IgE/Ml，)細胞來測試交聯表面IgE對在此細胞系中誘導凋亡的影響。Daudi細胞(ATCC，Manassas，VA,弁CCL-213)是一種已知對應答BCR交聯而發生的凋亡易感的人伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤細胞系。前夜以0.2x106/1.5ml的密度在培養基[RPMI、10%FBS(Hyclone,Logun,UT，#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素(Gibco/Invitrogen，Carlsbad,CA#15140-122)、2mM穀氨醯胺(Genentech，Inc.)、10mMHEPES(7.2)(Genentech,Inc.)、lmM丙酮酸鈉(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#11360)、1.59g/L石友酸氬鈉溶液(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#25080-094)]中培養Daudi-IgE/長細胞，然後次日在Ficoll梯度(GEHealthcare#17-1440-03)上除去死細胞。這降^氐測定法中細胞死亡的背景水平。一式三份地將0.2x1(^個細胞在有和沒有抗M1，抗體或對照抗體的情況中在溶液中培養72小時。然後收穫細胞，並使用膜聯蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒I(BDBiosciences,SanJose，CA#556547)分析凋亡水平。將細胞在冷PBS(Genentech,Inc.)中清洗兩次，然後重懸於100(il1X結合緩衝液(0.1MHepes/NaOH(pH7.4)、1.4MNaCl、25mMCaCl2)(BDBiosciences,SanJose，CA,#51-66121E)。然後將細胞用2.5pl膜聯蛋白V-FITC抗體(BDBiosciences,SanJose,CA弁51-65874X)和5jil碘化丙咬(PI)(BDBiosciences,SanJose,CA弁51-66211E)在黑暗中染色。15分鐘後，向每個管添加400(al1X結合緩衝液，並在FACSCalibur流式細胞術儀器(BD,Inc.FranklinLakes,NJ)分析細胞。為每份樣品收集到大約10-20,000例事件。正在死去的細胞定義為膜聯蛋白-V呈陽性且PI呈陰性。死細胞是膜聯蛋白-V和PI二者都呈陽性。使用FlowJoFACS分析軟體(TreeStar,Inc.,Ashland，Oregon)計算每種群體(死的和正在死去的)的百分比。對三份重複的數據取平均值和計算標準偏差。使用Excel(Microsoft,Inc.)以死的和正在死去的細胞之和計算百分比凋亡並繪圖。70%純的CD56+NK細胞。連續滴定抗IgE/M1，抗體和HERCEPTIN抗Her2單抗huIgGl同種型對照。將這些抗體(50|al)與在細胞表面上過表達人IgE/Ml，的BJAB細胞在含10/。FBS的RPMI-1640(無酚紅)(BioWhitaker#12-918F)中於室溫溫育30分鐘(細胞系是如上文所概述的那樣生成的)。然後將NK細胞(50^1)以15:1的比例(150,000個NK細胞對10,000個耙(BJAB-長))添加至細胞系。一式三份地進行測定。然後將BJAB-人長、抗體、和NK細胞於37。C溫育4小時。培養後，將96孔U底板離心，並收穫上清液(100|il)。然後使用LDH反應測定法(Roche#1644793)對上清液測試LDH釋放。使用單獨的耙物和溶解的靶物來計算百分比細胞毒性。如製造商所概述的那樣，將上清液以等體積與LDH反應混合液一起溫育30-60分鐘。然後在490nm處讀板。如下計算％細胞毒性=(實驗值-單獨的耙)/溶解的靶-單獨的靶)。使用Kaleidagraph將數據繪圖，並使用最佳擬合曲線來生成ED50值。在圖10中，HERCEPTINhulgGI同種型對照抗體誘導低水平的細胞毒性。抗lgE/Ml，抗體誘導特異性細胞毒性。野生型和無巖藻糖基化形式的抗IgE/Ml，47H4v5誘導相似的最大。/。細胞毒性(約70-80%)。無巖藻糖基化47H4v5比野生型更有效力(無巖藻糖基化47H4v5的EC50為約0.83nM;野生型47H4v5的EC50為約6.6nM)。實施例9:鼠抗IgE/Ml，抗體在特應性hu-SCID小鼠中的效果圖12A和13A演示了抗IgE/Ml，抗體(分別為鼠的和人源化的二者)在特應性hu-SCID模型中抑制血清IgE和生成IgE的漿細胞的生成所述IgE的能力。實驗l(#07-0377)測試鼠抗IgE/Ml，候選者，而實驗2(#07-1232)測試人源化抗IgE/Ml，候選者。來自我們公司內部的Leukopack血液供體程序的對供體篩選血清IgE水平。被選出來為特應性hu-SCID模型提供細胞的兩名供體自身鑑定為具有變態反應和具有1696和1152ng/ml的血清IgE水平。正常供體通常具有範圍為<100-300ng/ml的IgE。hu-SCID實驗概述於圖12A和13A。通過Leukophoresis和Ficoll密度梯度(GEHealthcare#17-1440-03)分離PBMC並計數。在第0天將18個PBMC細胞(108個每100(11)腹膜內注射入經照射的SCID-米色小鼠。為了使應答偏向IgE生成，在第0天和第3天用抗IFNy(BDBiosciences,SanJose，CA,#554698)和抗IL12抗體(100嗎/劑)(BDBiosciences,SanJose，CA,#554659);及在第2、3、4天用rhlL-4(100ng/劑)(R&DSystems,Minneapolis,MN，弁204-IL-010)處理小鼠。在第0天開始，每周三次(大約每三天)用實驗抗體(即抗IgE/Ml，)處理小鼠，直至研究結束。讓人細胞擴增7-14天，此時對小鼠處以安樂死。在第7天和研究結束時採集血液。在實驗的最後一天，對小鼠處以安樂死，並分離脾細胞。將單細胞懸浮液用於IgEElispot測定法和FACS,以測定人細胞重建和IgE漿細胞消減的程度。數據表述成均值+標準偏差。使用JMP統計軟體計算p值。Dunnett氏檢驗比較組均值，其中針對參照組檢驗了所有測試組。每對Student氏t使用Student氏t檢驗比較每個組對。然後應用Bonferroni修正來調整每對Student氏t的p值，以避免(safeguardagainst)成對比較。所有p值閾值為0.05。在沒有相對於基線水平標準化的情況下，在治療組與對照組之間計算圖12A-I和13A-H中所報告的數據的百分比變化。使用人ELISA規程測定游離IgE水平，其中將Maxisorp384孔ELISA板(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)用1ixg/ml單克隆抗體MAEll在50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6中於4。C包被過夜，並用0.5。/。牛血清清蛋白PBS中於室溫封閉l小時。將含0.5°/。牛血清清蛋白、0.05%聚山梨酯20、10ppmProclin300(Supelco,Bellefonte,PA)、0.25%CHAPS(Sigma,St.Louis,MO)、0.2%牛g球蛋白(Biocell,RanchoDominguez,CA)和5mMEDTA的PBS中的標準品(0.098-12.5ng/ml)和三倍連續稀釋樣品(最小稀釋度I:IO，以避免任何血清效應)在板上於室溫溫育l小時。如下檢測結合的IgE,即將過氧化物酶標記的山羊抗人IgE抗體(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg，MD)在孔中溫育1小時。添加底物3,3',5,5'-四曱基聯苯胺(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)，並通過添力口1M磷酸來終止反應。在各步驟間清洗板。在Titertek疊式讀數儀(ICN,CostaMesa,CA)在450nm處讀取吸光度。使用四參數非線性回歸曲線擬合程序(在Genentech開發的)擬合標準曲線。將落在標準曲線的線性範圍中的數據點用於計算樣品中的IgE濃度。如下實施人免疫球蛋白同種型組，即將針對人IgGl的小鼠單克隆抗體(單抗)(克隆2C11,AbeamInc.,Cambridge,MA)在0.05M碳酸鈉緩沖液pH9.6中稀釋至4嗎/ml，並在4。C過夜溫育過程中包^皮到ELISA板(384孔，高結合板，GreinerBioOne,Monroe,NC)上。用清洗緩沖液(PBS/0.05%Tween-20)清洗3次後，將板用PBS/0.5。/。牛血清清蛋白(BSA)封閉l-2小時。此溫育和所有其它溫育都是於室溫在定軌搖床上實施的。使用測定緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.05%Tween20/0.25%CHAPS/5mMEDTA/15PPMProclin)，將小鼠血清樣品1:100稀釋，接著連續1:3稀釋。使用相同的緩沖液，製備連續稀釋的IgGl,供標準曲線用(12.20-1560ng/ml)。融化在標準曲線的高、中、和低區預稀釋的冷凍對照。封閉步驟後，清洗板，並將樣品、標準品、和對照添加至384孔板，並溫育2小時。清洗板，並將生物素化的針對人IgGl的小鼠單抗(ZymedLaboratories,SouthSanFrancisco,CA)在測定緩沖液中1:500稀釋，並添加至清洗後的板，溫育1小時。將鏈黴親合素-辣根過氧化物酶(SA-HRP)(GEHealthcare,Piscataway,NJ)在測定緩衝液中l:40,000稀釋，並添加至清洗後的板。溫育30分鐘和最後的清洗步驟後，添加四曱基聯苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD),並顯色10-15分鐘。通過添加1M磷酸來終止反應。使用微量板讀數儀(450nm，650nm參照波長)獲得光密度，並自標準曲線的4參數擬合計算樣品濃度。小鼠血清樣品中人IgGl的最小可計量濃度為1.22(xg/ml。上文所述這種總體ELISA法還用於分析其它Ig同種型。將小鼠抗人IgG2單抗(丫2鏈特異性的)(SouthernBiotech,Birmingham,AL)以4昭/ml包被到ELISA板上。人lgG2標準曲線的範圍為12.20-1560ng/ml。將生物素化的小鼠抗人IgG2單抗(丫2鏈特異性的)(SouthernBiotech)稀釋至0.5|ag/ml，並用作檢測抗體。將SA-HRP以1:10，000的稀釋度添加至384孔板。小鼠血清樣品中人IgG2的最小可計量濃度為1.22(Xg/ml。腿將小鼠抗人IgG3單抗(ZymedLaboratories)稀釋至1pg/ml,並包被到ELISA板上。人lgG3標準曲線的範圍為0.78-100ng/ml。將生物素化的小鼠抗人lgG3單抗(i鏈特異性的)(SouthernBiotech)稀釋至0.1嗎/ml，並用作檢測抗體。將SA-HRP以1:20,000的稀釋度添加至384孔板。小鼠血清樣品人IgG3的最小可計量濃度為78.1ng/ml。腿將純化的小鼠抗人IgG4單抗(BDPharmingen，SanJose,CA)稀釋至0.25叱/ml，並包被到ELISA板上。人lgG4標準曲線的範圍為0.20-25ng/ml。將生物素偶聯的小鼠抗人IgG4單抗(BDPharmingen)稀釋至0.25嗎/ml，並用作衝企測抗體。將SA-HRP以1:20，000的稀釋度添加至384孔板。小鼠血清樣品中人IgG4的最小可計量濃度為39.1ng/ml。將純化的小鼠抗人IgAl/A2單抗(BDPharmingen)稀釋至2jig/ml，並包被到ELISA板上。人lgA標準曲線的範圍為0.20-25ng/ml。將生物素偶聯的小鼠抗人IgAl/A2單抗(BDPharmingen)稀釋至ljig/ml，並用作檢測抗體。將SA-HRP以1:80，000的稀釋度添加至384孔板。小鼠血清樣品中人IgA的最小可計量濃度為39.1ng/ml。國將純化的小鼠抗人IgM單抗(BDPharmingen)稀釋至0.5iLig/m1,並包被到ELISA板上。人lgM標準曲線的範圍為0.78-100ng/ml。將生物素偶聯的小鼠抗人IgM單抗(BDPharmingen)稀釋至0.5(ig/ml，並用作檢測抗體。將SA-HRP以1:40，000的稀釋度添加至384孔板。小鼠血清樣品中人IgM的最小可計量濃度為156ng/ml。在FACSCalibur流式細胞儀(BD(SanJose,CA))上使用FluoresbriteYG微球(Polysciences,Inc.弁18862)對Hu-SCID脾細胞、小鼠脾細胞或淋巴結細胞計數。使用Elispot測定法來測定用rhuIL-4、抗IFNy和抗IL-12抗體處理15天後hu-SCID小鼠中生成IgE的漿細胞的頻率。將Elispo討反(Millipore，Billerica,MA:#MSIPS4510,透明的)用l:500稀釋的未偶聯的抗人IgE抗體(AXXORA,SanDiego,CA，弁BET-A80-108A)在包被緩沖液[Genentech,Inc.(A3323)]中以100pl/孔於4。C包被過夜。然後倒掉一抗溶液，並將板用清洗緩衝液(1XPBS,0.05%Tween-20)清洗兩次。將膜用200[11/孔含0.5%BSA的IXPBS於37。C封閉0.5-l小時。除去封閉液，並將陽性對照細胞或hu-SCID脾細胞添加至板。使用人骨髓瘤生成IgE的U266細胞系(ATCC,Manassas,VA，弁TIB196)作為測定法的陽性對照。將U266細胞添加至板，以3000個細胞/0.1ml(=0.032x106/ml)雜交瘤培養基[RPMI1640、15%胎牛血清、2mML-穀氨醯胺、1OmMHEPES、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氫鹽]的濃度開始，然後進行七個連續稀釋(1:2)。將全脾單細胞懸浮液重懸於lml培養基。將100ial添加至第一個孔。然後實施七次1:2連續稀釋。將U266雜交瘤和脾細胞於37。C溫育過夜。次日，將板用清洗緩衝液(1XPBS，0.05%Tween-20)清洗三次，然後向每個孔添加100(il/孔在0.5%BSA/IXPBS中1:2000稀釋的二抗，即抗人IgE-鹼性磷酸酶偶聯物(Sigma,St.Louis，MO，A-3525),並於37。C溫育2小時。將板清洗三次，然後用ddH20(Genentech，Inc.)漂洗一次。向每個孔添加100^il/孔BCIP/NBT溶液(R&DSystems,Minneapolis,麗，ElispotBlueColorModule,#SEL002),並在黑暗中溫育30分鐘。然後將板用ddH20漂洗一次，並讓板於室溫乾燥。將板送達BDBiosciences進行計數(BD，Inc.,FranklinLakes,NJ)。使用4企測到的點的數目、稀釋倍數(細胞輸入)、和總脾細胞計數來計算漿細胞的數目。如下製備人漿細胞，即在第15天自抗體處理的hu-SCID小鼠取出脾。製備單細胞懸浮液，並過濾。將5xl6個細胞用人(Sigma，St.Louis,MO,#S-2257)和小鼠血清(VWR,#RLD108-0100)封閉，然後用抗人CD38PE(BDBiosciences,SanJose,CA,#555460)和才元人PCFITC(Dakocytomation,Glostmp，Denmark,#K231l)抗體在FACS清洗緩衝液(2%FBS，IXPBS)中在冰上染色20分鐘。然後清洗細胞，並在FACSCalibur儀器(BD,Inc.,FranklinLakes,NJ)上分析。使用人CD38表達作為人PBMC轉移成功的陽性對照。漿細胞定義為CD38高、PC+。在實驗#07-0377中(圖12A)，針對同種型對照抗gpl20-muIgGl測試了三種抗IgE/Ml，抗體(47H4、26A11、和7A6)。到第9天，同種型對照處理的小鼠生成高水平的人IgE。抗lgE/Ml，候選者處理將IgE水平降低65-84。/。(圖12B-C)。抗lgE/Ml，處理在體內也將IgE生成細胞降低19-69。/c)(圖12D-E)。其它血清Ig相對不受抗IgE/Ml，處理的影響(用有些抗Ml，抗體觀察到huIgl、IgG3和IgG4的約30。/。降低)(圖12F-G)。用抗lgE/Ml，處理沒有觀察到脾的總漿細胞百分比的降低(圖12H-I)。在實驗#07-1232中(圖13A)，針對同種型對照抗體HERCEPTIN⑧-huIgGl測試了人源化抗IgE/Ml，(47H4v5)。到第8天，同種型對照處理的小鼠生成高水平的血清IgE。抗lgE/Ml，huIgGl處理將IgE水平降低了79。/。(圖13B-D)，將生成IgE的漿細胞降低了75。/。(圖13C-D)。沒有觀察到其它血清Ig(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA)(圖13E-F)或脾中總漿細胞百分比的降低(圖13G-H)。這些研究證明了抗lgE/Ml，抗體特異性降低血清IgE和IgE生成細胞，但是不降低其它同種型的免疫球蛋白。實施例10:人M1，轉基因小鼠/7WM廠餘差^"教入"V、武的蘭成因為小鼠在正常情況下不表達與人相似的M1，結構域，所以我們生成了在小鼠IgE基因座中"敲入，，了人M1，結構域的小鼠(圖14A)。所述人M1，序列利用上遊小鼠M1剪接受體位點，然後融合至下遊小鼠M1序列(圖14B)。還將IRES-EGFPpA-Neo盒敲入小鼠M2序列的3'。此敲入會容許在IgE十B細胞的表面上表達具有人Ml，結構域的小鼠IgE。所述M1，序列不會在分泌型IgE上表達。M7'蔬入,秀的謬逸廣屍CT^通過PCR使用對小鼠IgE基因座和人Ml，序列特異性的引物對人M1，敲入小鼠進行基因分型。所使用的引物如下WT正向5，-GGCCAAAGACCCTAAGACAGTC(SEQIDNO:106)huMl，正向5，-GGGCTGGCTGGCGGCTCCGC(SEQIDNO:107)WT反向5，-CTATGCCCTGGTCTGGAAGATG(SEQIDNO:108)使用32個循環的如下程序[94。C4分鐘；94°Cl分鐘；60。C30秒鐘；72°Cl分鐘(30個循環)；72。C10分鐘]，用上述引物分析純化的基因組DNA。然126後在2。/。瓊脂糖0.5XTBE凝膠上運行PCR產物。野生型PC驢因型給出668bp的產物，而hu-Ml，敲入生成457bp的產物(圖14C)。'茲入屑的謬遂(^o^/zewJ通過Southern印跡篩選和檢驗huMl，敲入ES細胞和最終的小鼠系。用HindIII(用於左臂)和BamHI(用於右臂)消化10嗎純化的ES細胞或尾基因組DNA過夜。然後在0.8。/。瓊脂糖lXTAE凝膠上運行經過消化的DNA。然後使用變性緩沖液(1.5MNaCl;0.5MNaOH)將DNA轉移至尼龍膜(Roche#1417240)過夜。將膜漂洗，UV交聯，然後在旋轉中在DIG簡易雜交液(Roche#1585762)中於46。C浸泡4小時。使用PCRDIG探針合成試劑盒(Roche弁11636090910)如製造商指導的那樣通過PCR生成探針。用於左臂的引物為正向5，-TGTCTGGTGGTGGACCTGGAAAGCG(SEQIDNO:109)反向5，-TCCTCGCTCTCCTCCTCTGGTGGTG(SEQIDNO:llO)用於右臂的引物為正向5，-CCATGCAACCTAGTATCCTATTCTC(SEQIDNO:lll)反向5，-CTTTATACAGGAGAACCTAGCCCAG(SEQIDNO:112)針對未標記的PCR產物測試探針，以確保增加的大小和好的DIG標記。然後在旋轉中於46。C用煮沸過夜過的探針探查印跡過夜。次日，清洗印跡，並用抗DIG抗體依照製造商的指示顯色。將印跡對膠片曝光15-20分鐘。圖14D圖示了Southern結果。野生型小鼠生成左臂7.4kBHindIII片段，其在hu-Ml，敲入等位基因中變成3kB片段。野生型小鼠生成右臂14.1kBBamHI片段，其在hu-Ml，敲入等位基因中變成18.1kB片段。顯示了野生型和雜合小鼠(圖14D)。實施例ll:Hu-Ml，轉基因模型TNP-OVA免疫此實施例例示抗IgE/Ml，候選者在針對TNP-OVA的初次免疫應答(實驗#07-0234F;圖15A-I)或記憶應答(實驗糾7-0234B;圖16A-K)兩種免疫應答中阻止由TNP-OVA刺激的IgE生成的能力。TNP-OVA或三硝基苯基-卵清蛋白是高度有力的免疫原，常常用於產生有力的抗體免疫應答。數據表述成均值士標準偏差。使用JMP統計軟體計算p值。Dunnett氏檢驗比較組均值，其中針對參照組檢驗了所有測試組。每對Student氏t使用Student氏t檢驗比較每個組對。然後應用Bonferroni修正來調整每對Student氏t的p值，以避免(safeguardagainst)成對比較。所有p值閾值為0.05。通過自每個小鼠值減去未感染或未免疫組均值，計算為初次應答(圖15A-I)和記憶免疫應答(圖A-K)報告的數據的百分比變化，再次計算組均值，然後對每個時間點相對於對照組計算百分比變化。用TNP-OVA免疫人IgE/Ml，敲入小鼠(C57BL/6)在體內誘導平衡的Thl/Th2應答。初次免疫和攻擊後的抗原特異性IgE水平達到約10-200ng/ml的水平。在實驗糾7-0234F中，在第O天給huMl，敲入小鼠(C57B1/6)免疫TNP-OVA(BiosearchTechnologies,Novato，CA)(i.p.，每隻小鼠100jag,在2mg明礬(alum)中)(圖15A)。然後在第0天和第28天之間每周三次用0.1mg/kg抗體處理小鼠(圖15A)。在實驗糾7-0234B中，在第0天給huMl，敲入小鼠(C57B1/6)免疫TNP-OVA/明礬(向之前那樣)，然後在第28天用TNP-OVA(i.p.,每隻小鼠100嗎)攻擊(圖16A)。在第28天和第49天之間用10mg/kg抗體處理小鼠(圖16A)。在免疫應答的過程裡對小鼠採血，以監測抗原特異性血清IgE和IgGl水平。如下測量TNP-OVA特異性IgEIgGl，用25iliL/孔TNP-OVA(TNP:OVA比例為13:1)(BiosearchTechnologies,Novato，CA)(在50mM碳酸鈉/碳酸氬鈉pH9.6中稀釋至0.5pg/mL)將ELISA板(384孔，具有MaxiSorpTM表面，Nunc,Neptune,NJ)於2-8。C包被12-18小時。然後將板倒空並扣幹。將封閉緩衝液(PBS,0.5%BSA,pH7.2，50pL/孔)添加至板l-2小時。此溫育和所有後續溫育均於室溫在溫和搖動中實施。將樣品在測定稀釋劑(PBS,0.5%BSA,0.05%Tween-20，0.01%Proclin300)中l/50稀釋，接著在ll個點上連續1/3稀釋。將標準品在測定稀釋劑中在7個點上連續兩倍稀釋，抗TNPOVAIgGl自lng/ml開始，而抗TNPOVAIgE自3ng/ml開始。經板用清洗緩沖液(PBS，0.05%Tween-20，pH7.2)清洗3次，將標準品、樣品和對照一式兩份地添加(25pL/孔)至板，用於分開檢測IgGl和IgE同種型。溫育1.5-2小時後，將板用清洗緩衝液清洗6次。將生物素化的大鼠抗小鼠IgGl和IgE單抗(BDBiosciences,SanDiego,CA)在測定稀釋劑中稀釋至0.5)ig/mL(IgGl)或1.0jag/mL(IgE)，並添加至適宜的板(25pL/孔)。將板溫育1-1.5小時，並用清洗緩衝液清洗6次。將鏈黴親合素-辣根過氧化物酶偶聯物(AMDEX，GEHealthcare,Piscataway,NJ)1/80,000(用於IgGl)或1/5,000(用於IgE)稀釋，並添加至板(25pL/孔)30分鐘。用清洗緩衝液清洗6次後，將板顯色，即添加25pL/孔四曱基聯苯胺(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)並溫育15分鐘(用於IgGl)或25分鐘(用於IgE)。通過添加25pL/孔lMH3P04來終止反應，並讀取450nm處的吸光度，以620nm為參照。未知樣品的結果通過內插法自標準曲線的4參數擬合獲得。首先通過分離CD138+細胞來鑑定來自脾或淋巴結的小鼠漿細胞。通過Elispot法對這些生成IgE的漿細胞定量。對於總IgE生成細胞，以50nl/孔使用ELISA包被緩沖液以l:2稀釋度將抗IgE抗體(來自BDOpffiIAmlgE套裝#555248)包被到MultiScreenHTS板(Millpore弁MSIPS4W10)上。包被於4。C實施過夜。次日上午，在組織培養櫥中使用多道移液器將板用200jil無菌PBS-Tween20(0.05%)清洗5次。然後將板在300plPBS/5%BSA或細胞培養基(RPMI-1640，10%FBS)中於室溫封閉2小時。自脾或淋巴結製備單細胞懸浮液，並通過FACS(如上文所概述的)對細胞計數。將細胞準備好鋪板，以107個細胞開始，接著3-4倍稀釋(用於TNP-OVA免疫模型)，或者以4xl06個細胞開始，接著2倍稀釋(用於鉤蟲Nippostrongylus感染模型)。使用小鼠A20B細胞系作為陰性對照，並使用TIB-141細胞系作為陽性對照。細胞稀釋物是在細胞培養基(RPMI-1640+10%FBS)中製備的。封閉步驟後，將板用細胞培養基清洗一次，並吸乾。以100pl每孔鋪細胞。然後將板於37。C、5%C02溫育過夜。次曰，使用SkanWasher300(MolecularDevices(Sunnyvale,CA))將板用PBS-Tween20(0.05%)清洗6次。然後以製造商註明的濃度使用生物素化的二抗(來自BDOp伍IAmlgE套裝弁555248),通常在1:250-l:500之間，所述二抗在PBS/1。/。BSA中配製。然後將板於室溫溫育l小時，然後使用SkanWasher300用PBS-Tween20(0.05%)清洗6次。然後以1:60的稀釋度添加100pl/孔鏈黴親合素AP(R&D#SEL002),同樣是在PBS/1%BSA中配製的，並於室溫溫育l小時。然後像之前那樣將板清洗3次，然後用DI水漂洗2次。在紙巾上扣掉任何剩餘的液體。然後添加顯色試劑即BCIP/NBT(100|il/孔)，並將板在黑暗中於室溫溫育30分鐘。然後倒掉底物，並將板用DI水漂洗2次。將板倒轉以除去任何過量的水，並讓其乾燥。使用解剖顯微鏡對點定量。實驗#07-0234F測試抗IgE/Ml，阻止針對TNP-OVA初次免疫(primaryimmunization)的IgE應答的能力。抗gp120同種型對照處理的小鼠產生血清IgE,在第8天和第14天之間達到峰水平(約25ng/ml)(圖15B)。抗lgE/Ml，處理到第8天(98。/。)和第14天(99。/。)阻止了血清IgE的升高(圖15C-D)。此降低顯著不同於同種型處理的動物，而且顯著不同於未免疫的小鼠(圖15C-E)。貫穿實驗的28天，抗原特異性IgGl的水平只受到抗IgE/Ml，的適度影響(圖15F-I)。實驗糾7-0234B測試抗IgE/Ml，阻止針對TNP-OVA的再次IgE應答/記憶IgE應答的能力。針對第28天TNP-OVA加強免疫的再次IgE應答是更加快速的，在4天後達到峰值，而不是初次應答中的8-9天(圖16B)。自第28天的加強免疫開始的抗IgE/Ml，候選者處理縮小了第28天和第35天之間IgE的升高(圖16B)。與同種型對照相比，抗lgE/Ml，處理的IgE水平顯著降低，到第32天降低59-75%，而到第35天降低90-93%(圖16C-D)。到第35-42天，IgE水平與未免疫小鼠沒有顯著差異(圖16E)。第28天和第49天之間這些處理組的曲線下面積分析進一步證明了抗lgE/Ml，將血清IgE水平降低了74-84%，而且還將抗原特異性IgE的平均日水平降低了74-83%(圖16F-H)。用抗IgE/Ml，處理後沒有觀察到抗原特異性IgGl的顯著降低(圖16I-K)。實施例12:Hu-Ml，轉基因模型巴西鉤蟲(A》，/ww^wig^"s^""w7/^w/s)感染模型此實施例例示了抗lgE/Ml，抗體阻止IgE生成(圖17A-D),以及在先前誘導的巴西鉤蟲感染中治療性降低IgE生成的能力。IgE生成的降低是通過在免疫應答的峰值IgE水平時(圖18A-I)和在免疫應答晚期應用時(圖19A-G)兩個時間施用抗lgE/M1，抗體來評估的。巴西鉤蟲是一種感染大鼠和小鼠的胃腸線蟲。它的卵在糞便中孵化，並成熟成感染期幼蟲L3。L3幼蟲經皮膚進入宿主，並移動至血管，然後在l-2天後行進至肺。在肺中發育成L4期幼蟲後，它們沿宿主的氣管和食管行進，並在第2-3天到達空腸。幼蟲成熟成成體蠕蟲並交配，並在第5天前後產卵。巴西鉤蟲的卵隨糞^f更一起排出宿主。感染了巴西鉤蟲的小鼠展示出初始先天免疫應答，接著是強烈的2型免疫以清除感染。在感染的早期發現補體和纖連蛋白沉積以促進白細胞募集和粘附。效應細胞(諸如嗜曙紅粒細胞、嗜^威性粒細胞、和CD4+Th2細胞)被募集至肺以抗擊感染。Th2細胞因子、IL-4和IL-13在肺中維持免疫應答中發揮至關重要的作用，而且是腸中清除蠕蟲所需要的。2型應答的特徵在於高水平的抗體生成，包括IgE。人lgE/Ml，敲入小鼠(C57BL/6)產生強烈的針對巴西鉤蟲感染的IgE應答，在第15-20天達到峰值(圖17B、18B、19B)。然後血清IgE水平下降至較低的，但是升高的維持水平。在第O天用巴西鉤蟲感染小鼠。用10mg/kg抗IgE/Ml，mlgGl抗體或抗gp120mlgGl同種型對照處理所有3項巴西鉤蟲感染實驗。在預防研究中(圖17A)，在第0天至第21天每周三次處理huMl，敲入小鼠。在峰生成研究中(圖18A)，在第ll天和第21天之間每周三次處理huMl，敲入小鼠。在晚期幹預研究中(圖19A)，在第41天和第62天之間每周三次處理huMl，敲入小鼠。數據表述成均值+標準偏差。使用JMP統計軟體計算p值。Dunnett氏檢驗比較組均值，其中針對參照組檢驗了所有測試組。每對Student氏t使用Student氏t檢驗比較每個組對。然後應用Bonferroni修正來調整每對Student氏t的p值，以避免(safeguardagainst)成對比較。所有p值閾值為0.05。通過自每個小鼠值減去未感染或未免疫組均值，計算在預防和峰生成研究中報告的數據的百分比變化，再次計算組均值，然後對每個時間點相對於對照組計算百分比變化。在晚期幹預研究中，通過將第48天和第55天與第41天進行比較來計算每個處理組內的百分比變化。生成IgE的漿細胞是通過Elispot來定義和評估的，如實施例12先前所描述的。預防研究測試抗IgE/M1，阻止IgE應答初次鉤蟲感染而升高的能力。對照(同種型處理的)小鼠到感染後第15天達到高水平的IgE生成(約3000ng/ml)。抗lgE/Ml，處理的小鼠在感染後具有降低的IgE生成(與抗gpl20mlgGl相比降低93-94%),與未感染小鼠沒有顯著差異(圖17B畫D)。峰生成研究測試抗IgE/Ml，在針對巴西鉤蟲感染的IgE應答的峰值時治療性降低IgE水平的能力。所有處理組到鉤蟲感染後第11天達到高IgE水平(約2000ng/ml)(圖18B)。抗lgE/Ml，處理在此應答達到峰值時的第ll天開始。抗lgE/Ml，mlgGl候選者在處理的4天內將血清IgE水平降低了82-89。/0(圖18C-D)。到第21天，抗lgE/Ml，處理小鼠中的IgE水平降低了97-98。/。，達到與未感染對照組沒有顯著差異的水平(圖18E)。生成IgE的漿細胞是通過抗IgEElispot來定量的。巴西鉤蟲感染誘導了腸繫膜淋巴結(約30個細胞每4xl06;圖18F)和脾(約10個細胞每4x10、圖18G)二者中顯著數目的生成IgE的細胞。到第21天，抗lgE/Ml，處理將腸繫膜淋巴結和脾中的生成IgE的細胞分別降低了88-94%和57-66%。與未感染小鼠相比，所有處理組中腸繫膜淋巴結和脾中的總漿細胞(CD138+細胞)頻率均升高，而且由於抗IgE/Ml，處理，這兩種器官中的總漿細胞頻率沒有顯著變化(圖18H-I)。這些結果證明了抗lgE/Ml，抗體通過在體內消減IgE生成細胞而將血清IgE降低至額定水平(甚至在IgE生成達到峰水平時應用的情況中)的能力。晚期幹預研究測試抗IgE/Ml，降低在感染周期晚期達到的低水平維持的IgE的能力。到第15天前後，所有處理組均達到IgE生成峰值。在第41天啟動抗lgE/Ml，處理後，血清IgE水平在各處理組間有一些差異(圖19B-C)，其通過參照作為100%的第41天水平進行標準化(圖19D)。與抗gpl20mlgGl同種型對照相比，在第48天和第55天之間，抗lgE/Ml，處理顯著降低血清IgE水平(圖19E-G)。到第48天和第55天，IgE水平分別降低了64-75%和75-84%，比較而言，同種型對照(抗gpl20mlgGI)分別降低了20。/o和37。/0(圖19F-G)。在開始抗IgE/Ml，療法之前，各處理組間IgE水平均值的差異沒有顯著不同於同種型對照組(gpl20)(圖19E)。然而，到第48天(圖19F)和第55天(圖19G)，抗lgE/Ml，抗體處理顯示出比在對照組中所觀察到的要更加突出和顯著的血清IgE水平降低。通過將每個處理組的第48天或第55天與同一組在處理前即第41天的起始值比較，計算了百分比變化和p值(d41)。實施例13:抗lgE/Ml，抗體在哺乳動物細胞中的表達此實施例例示了通過哺乳動物細胞中的重組表達來製備潛在糖基化形式的期望蛋白質或抗體。採用載體pRK5(參見1989年3月15日公布的EP307,247)作為表達載體。任選地，用選定的限制酶將編碼抗IgE/Ml'抗體輕4連和/或重鏈的DNA連接入pRK5，以容許使用連接法(諸如Sambrook等(見上文)所記載的)插入此類DNA。在一個實施方案中，選定的宿主細胞可以是293細胞。將人293細胞(ATCCCCL1573)在組織培養板中在諸如補充有胎牛血清和任選的營養成分和/或抗生素的DMEM的培養基中培養至匯合。將約10嗎連接入pRK5的編碼抗lgE/Ml，抗體的DNA與約ljig編碼VARNA基因的DNA[Thimmappaya等,Cell,31:543(1982)〗混和，並溶解於500(allmMTris畫HCl,O.lmMEDTA,0.227MCaCl2。向此混合物中逐滴添力口500(il50mMHEPES(pH7.35)，280mMNaCl，1.5mMNaP04,並容許於25。C形成沉澱10分鐘。將沉澱物重懸並添加至293細胞，並容許於37。C沉降約4小時。吸掉培養基，並添加2ml含20。/o甘油的PBS，達30秒鐘。然後用無血清培養基清洗293細胞，添加新鮮的培養基，並將細胞溫育約5天。轉染後約24小時，取出培養液，並更換成培養基(單獨的)或含有200(iCi/ml35S-半胱氨酸和200iiCi/ml"S-曱硫氨酸的培養基。溫育12小時後，收集條件培養基，在離心濾器上濃縮，並加載到15。/。SDS凝膠上。可以將處理後的凝膠乾燥，並對膠片曝光選定的一段時間以揭示抗IgE/Ml，抗體的存在。可以對含有經轉染細胞的培養物進行進一步溫育(在無血清培養基中)，並在選定的生物測定法中測試培養液。在另一種技術中，使用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.，12:7575(1981)記載的硫酸葡聚糖法，可以將抗IgE/Ml，抗體瞬時導入293細胞。將293細胞在旋轉燒瓶中培養至最大密度，並添加700jig連接入pRK5的編碼抗IgE/Ml，抗體的DNA。首先通過離心自旋轉燒瓶濃縮細胞，並用PBS清洗。將DNA-葡聚糖沉澱物在細胞沉澱物上溫育4小時。將細胞用20%甘油處理90秒鐘，用組織培養基清洗，並重新裝入裝有組織培養基、5嗎/ml牛胰島素和0.1嗎/ml牛運鐵蛋白的旋轉燒瓶。約4天後，將條件培養基離心並過濾以除去細胞和碎片。然後通過任何選定的方法，諸如透析和/或柱層析，可以濃縮和純化含有所表達的抗lgE/M1，抗體的樣品。在另一個實施方案中，可以在CHO細胞中表達抗IgE/Ml，抗體。使用已知的試劑，諸如〔304或0￡八￡-葡聚糖，可以將連接入pRK5的編碼抗IgE/M1，抗體的DNA轉染入CHO細胞。如上文所描述的，可以將細^^培養物溫育，並用培養基(單獨的)或含有放射性標記物諸如"S-曱硫氨酸的培養基更換所述培養基。在測定到抗IgE/Ml，抗體的存在後，可以用無血清培養基更換所述培養基。優選地，將培養物溫育約6天，然後收穫條件培養基。然後通過任何選定的方法，可以濃縮和純化含有所表達的抗IgE/Ml，抗體的培養液。抗lgE/Ml，抗體的帶表位標籤的變體也可以在宿主CHO細胞中表達。可以將連接入pRK5的編碼抗lgE/M1，抗體的DNA亞克隆出pRK5載體。可以對亞克隆插入物進行PCR，以符合讀碼框的方式與選定的表位標籤諸如聚His133標籤一起融合入杆狀病毒表達載體。然後可以將帶聚His標籤的編碼抗IgE/M1，抗體插入物的DNA亞克隆入含有用於選4奪穩定克隆的選擇標誌諸如DHFR的SV40驅動載體。最後，可以用SV40驅動載體轉染CHO細胞(如上文所描述的)。可以如上所述實施標記，以4企驗表達。然後通過任何選定的方法，諸如通過N產-螯合物親和層析，可以濃縮和純化含有所表達的帶聚His標籤的抗lgE/M1，抗體的培養液。通過另一種穩定表達規程在CHO細胞中表達。使用如下規程實施CHO細胞中的穩定表達。將蛋白質表達成IgG構建體(免疫粘附素)(其中將相應蛋白質的可溶形式(例如胞外結構域)的編碼序列融合至含有鉸鏈、CH2和CH2結構域的IgGl恆定區序列)和/或是帶聚His標籤的形式。PCR擴增後，使用標準技術，如Ausubel等，CurrentProtocolsofMolecularBiology,單元3.16，JohnWiley和Sons(1997)中所記載的，將相應的DNA亞克隆到CHO表達載體中。CHO表達載體構建成在目的DNA的5，和3，具有相容限制性位點，以容許cDNA的方便穿梭。用於在CHO細胞中表達的載體如Lucas等，Nucl.AcidsRes.24:9(1774-1779(1996)中所記載的，而且利用SV40早期啟動子/增強子來驅動目的cDNA和二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達。DHFR表達容許在轉染後選擇穩定維持的質粒。使用商品化的轉染試劑SUPERFECT(Quiagen)、DOSPER或FUGENE(BoehringerMannheim),將12pg期望質粒DNA導入約lxl(^個CHO細胞。如Lucas等(見上文)所記載的那樣培養細胞。在安瓿中冷凍約3x107個細胞，供培養和生產用，如下文所描述的。將裝有質粒DNA的安瓿通過放置在水浴中來融化，並通過旋渦震動來混勻。將內容物轉移入裝有10mL培養基的離心管，並以1000rpm離心5分鐘。吸掉上清液，並將細胞重懸於10mL選擇培養基(0.2(im過濾的PS20,含5%0.2(im滲濾的胎牛血清)。然後將細胞等分入裝有90mL選擇培養基的100mL旋轉燒瓶。l-2天後，將細胞轉移入裝有150mL選擇培養基的250mL旋轉燒瓶，並於37。C溫育。又過了2-3天後，以3x1S個細胞/mL接種250mL、500mL和2000mL旋轉燒瓶。通過離心和重懸，將細胞培養基更換成生產培養基的新鮮培養基。雖然可以採用任何合適的CHO培養基，但是實際上可使用1992134年6月16曰公告的美國專利No.5，122,469中記載的生產培養基。以1.2x106個細胞/mL接種3L生產旋轉燒瓶。第0天，測定細胞數和pH。第1天，對旋轉燒瓶採樣，並開始用經過過濾的空氣鼓泡。第2天，對旋轉燒瓶採樣，將溫度改成33。C，並添加30mL500g/L葡萄糖和0.6mL10%消泡劑(例如35%聚二曱基矽氧烷乳液，DowCorning365醫用級乳液)。在整個生產過程中，根據需要調節pH以保持在7.2左右。IO天后，或直至生存力下降至70%以下，通過離心來收穫細胞培養物，並經由0.22pm濾器過濾。濾出液或是保存於4。C或是立即加載到柱上純化。對於帶聚His標籤的構建體，使用Ni-NTA柱(Qiagen)來純化蛋白質。純化前，將咪唑添加至條件培養基至5mM的濃度。以4-5ml/min的流速將條件培養基泵到6mlNi-NTA柱上，該柱於4。C在含有0.3MNaCl和5mM咪唑的20mMHepes,pH7.4緩衝液中平衡過。加載後，用另外的平tf緩衝液清洗柱，並用含有0.25M咪唑的平衡緩衝液洗脫蛋白質。隨後用25mlG25Superfine(Pharmacia)柱將高度純化的蛋白質脫鹽入含有10mMH印es，0.MMNaCl和4%甘露醇，pH6.8的貯存緩衝液，並儲存於-80。C。如下所述自條件培養基純化免疫粘附素(含Fc的)構建體。將條件培養基泵到5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，該柱已經在20mM磷酸鈉緩衝液pH6.8中平衡過。加載後，將柱用平衡緩沖液大量清洗，之後用100mM檸檬酸pH3.5洗脫。通過將lml級分收集到裝有275pL1MTris緩衝液pH9的管中，立即中和洗脫的蛋白質。如上文關於帶聚His標籤的蛋白質所描述的，隨後將高度純化的蛋白質脫鹽到貯存緩衝液中。通過SDS聚丙烯醯胺凝膠和通過N端胺基酸測序(通過Edman降解)來評估同質性(homogeneity)。以下材料已經保藏於美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.，Manassas,VA20110-2209，USA)(ATCC):材料保藏材料ATCC保藏號保藏曰47G4.6.247H4.12.107A6.181C11,10.20PTA-8268PTA-8267PTA-8266PTA-82702007年3月21日2007年3月21日2007年3月21日2007年3月21日45C1.6.1442A5.20.il28E9.12.942H4.6.926A11.6.526B11.3.1251D2.22.15PTA-8269PTA-8265PTA-8260PTA-8263PTA-8264PTA-8261PTA-82622007年3月21曰2007年3月21曰2007年3月21日2007年3月21日2007年3月21日2007年3月21日2007年3月21日這些保藏是依據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約(BudapestTreaty)及其(布達佩斯條約)實施細則的規定進行的。這保證了自保藏之日起保存保藏的存活培養物三十(30)年，和最近一次要求樣品後至少五(5)年。保藏物可根據布達佩斯條約的條款通過ATCC獲得，並服從Genentech公司與ATCC之間的協議，它保證了在有關美國專利授權後或者在任何美國或外國專利申請向公眾公開後，以兩者中居先者為準，公眾可永久且不受限制的獲得保藏培養物的後代，而且保證了依據35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14,特別要提及8860G638)由美國專利和商標局長批准的個人將有資格獲得保藏培養物的後代。本申請的受讓人已同意，若保藏材料的培養物在合適條件下培養時死亡、丟失或遭到破壞，則他將在接到通知後迅速用同一培養物的另一份材料所授予的權利實施本發明的許可。認為前述書面描述足以使本領域技術人員能夠實施本發明。本發明並不限於本文所呈現實施例的範圍。實際上，根據上面的描述，在本文所顯示和描述之外，本發明的多種修飾對於本領域技術人員是顯而易見的，而且在所附權利要求的範圍內。權利要求1.一種抗IgE/M1』抗體，其特異性結合IgE的M1』區段且其在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。2.權利要求l的抗體，其中所述抗體結合起源為人、恆河猴和獼猴的IgE。3.—種抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合IgE的Ml，區段且在以治療有效量體內施用於哺乳動物時特異性消減生成IgE的B細胞。4.權利要求3的抗體，其降低總血清IgE。5.權利要求4的抗體，其降低游離血清IgE。6.權利要求4的抗體，其中所述IgE是變應原特異的。7.權利要求3的抗體，其是嵌合的。8.權利要求3的抗體，其是人源化的。9.權利要求3的抗體，其是人的。10.—種抗IgE/Ml，抗體，其特異性結合與選自下組的抗體所結合的表位相同的表位47H4,7A6,26A11,47H4v5,7A6vl和26Allv6。11.權利要求10的抗體，其中所述表位對應於選自下組的肽肽4(SEQIDNO:8)，肽5(SEQIDNO:9),肽7(SEQIDNO:ll)或肽8(SEQIDNO:12)。12.權利要求ll的抗體，其中所述表位對應於肽4(SEQIDNO:8)。13.—種肽，其選自下組肽4(SEQIDNO:8)，肽5(SEQIDNO:9)，肽7(SEQIDNO:ll)或肽8(SEQIDNO:12)。14.一種抗IgE/Ml，抗體，其以與鼠抗IgE/Ml，抗體47H4的Scatchard結合親和力相當的Scatchard結合親和力特異性結合IgE的Ml，區段。15.權利要求14的抗體，其中所述親和力介於0.30和0.83nm之間。16.—種抗IgE/Ml，抗體，其以與人源化抗IgE/Ml，抗體47H4v5的Scatchard結合親和力相當的Scatchard結合親和力特異性結合IgE的Ml'區段。17.權利要求16的抗體，其中所述親和力為約1.5nm。18.—種抗IgE/Ml，抗體，其包含選自下組的抗體和其抗原結合片段的重鏈和輕鏈HVR:26A11,26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4，47H4vl-6。19.權利要求18的抗體，其包含選自下組的抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕4連可變區26A11,26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4，47H4vl-6。20.權利要求18的抗體，其包含47H4vl-6的抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈。21.權利要求18的抗體，其是無巖藻糖基化的。22.—種組合物，其包含與至少一種藥學可接受載體組合的權利要求1-21任一項的抗體。23.—種組合物，其包含與至少一種藥學可接受載體和一種或多種選自下組的藥物組合的權利要求1-21任一項的抗體抗IgE抗體，抗組胺劑，支氣管擴張藥，糖皮質激素，NSAID，TNF拮抗劑，整聯蛋白拮抗劑，免疫抑制劑，IL-4拮抗劑，IL-13拮抗劑，雙重IL-4/IL-13拮抗劑，DMARD,與B細胞表面標誌物結合的抗體和BAFF拮抗劑。24.—種分離的核酸，其編碼包含選自下組的凋亡性抗IgE/Ml，抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈HVR的抗體或其抗原結合片段26A11，26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4,47H4vl-6。25.權利要求24的核酸，還包含編碼選自下組的抗體序列的重鏈和輕鏈可變區的核酸26A11,26Allvl畫16，7A6，7A6vl，47H4，47H4vl-6。26.權利要求25的核酸，其中所編碼的抗體是無巖藻糖基化的。27.—種載體，其中可操作連接了權利要求25的核酸。28.—種宿主細胞，其包含權利要求27的載體。29.權利要求28的宿主細胞，其是哺乳動物的。30.權利要求29的宿主細胞，其是中國倉鼠卵巢的。31.—種用於生成凋亡性抗IgE/Ml，抗體或功能性片段的方法，包括在適合於所述抗體或片段表達的條件下培養權利要求28的宿主細胞，並回收所述抗體或片段。32.—種製品，其封裝權利要求22的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁指明用於IgE介導的病症的治療的用途。33.權利要求32的製品，其為管形瓶。34.權利要求32的製品，其為預裝填注射器。35.權利要求34的製品，還包含注射裝置。36.權利要求35的製品，其是自我注射器。37.—種用於特異性消減生成IgE的B細胞的方法，包括給哺乳動物施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，該抗體特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。38.權利要求37的方法，其中所述抗體包含選自下組的抗體的重鏈和輕鏈HVR:26A11，26Allvl-16，7A6，7A6vl，47H4,47H4vl-6。39.權利要求38的方法，還包括總血清IgE的降低。40.權利要求39的方法，還包括游離血清IgE的降低。41.權利要求39的方法，其中所述IgE是變應原特異的。42.權利要求38的方法，其中所述抗體具有ADCC活性。43.—種治療IgE介導的病症的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，該抗體特異性結合IgE的Ml，區段且在表達IgE的B細胞中誘導凋亡。44.權利要求43的方法，其中所述抗體特異性消減表達IgE的B細胞。45.權利要求43的方法，其中所述抗體降低總血清IgE。46.權利要求45的方法，其中所述抗體降低游離血清IgE。47.權利要求45的方法，其中所述IgE是變應原特異的。48.4又利要求43的方法，其中所述抗體包含選自下組的抗體的重鏈和輕鏈HVR:26A11,26Allvl陽16，7A6,7A6vl，47H4,47H4vl-6。49.權利要求43的方法，其中所述IgE介導的病症選自下組變應性鼻炎，變應性嗜喘，非變應性哮喘，特應性皮炎，變應性胃腸病，過敏反應，蕁麻滲，食物過敏，變應性支氣管肺麴黴病，寄生蟲病，間質性膀胱炎，高IgE症候群，共濟失調性毛細血管擴張症，威斯科特-奧爾德裡奇症候群，無胸腺淋巴組織增生，IgE骨髓瘤，移植物抗宿主反應和變應性紫癜。50.—種治療IgE介導的病症的方法，包括與治療有效量的至少一種選自下組的藥物組合地施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，該抗IgE/Ml，抗體特異性結合IgE的Ml，區段且誘導表達IgE的B細胞凋亡抗IgE抗體，抗組胺劑，支氣管擴張藥，糖皮質激素，NSAID，解充血藥，鎮咳劑，鎮痛藥，TNF拮抗劑，整聯蛋白拮抗劑，免疫抑制劑，IL-4拮抗劑，IL-13拮抗劑，雙重IL-4/IL-13拮抗劑，DMARD，與B細力包表面標誌物結合的抗體和BAFF拮抗劑。在一個具體的方面，所述抗體特異性消減生成IgE的B細月包。51.—種治療IgE介導的病症的方法，包括在變應性病症的已知治療方法的施用之前、同時或之後施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體組合治療方案，所述抗IgE/Ml，抗體特異性結合IgE的Mr區段且誘導表達IgE的B細胞凋亡。52.權利要求51的方法，其中所述變應性病症的已知治療方法包括抗IgE抗體、抗組胺劑、支氣管擴張藥、糖皮質激素、非類固醇抗炎藥、免疫抑制劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、雙重IL-4/IL-13拮抗劑、解充血藥、鎮咳劑或鎮痛藥的施用。53.權利要求51的方法，其中所述變應性病症的已知治療方法包括變應原脫敏的治療方案。54.—種用於預防變應原誘導的IgE生成的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，該抗體特異性結合IgE的Ml，區段且誘導表達IgE的B細胞凋亡。55.—種用於降低變應原誘導的IgE生成的方法，包括施用治療有效量的抗IgE/Ml，抗體，該抗體特異性結合IgE的Ml，區段且誘導表達IgE的B細胞凋亡。56.—種鼠雜交瘤，其於2007年3月21日保藏於ATCC,該雜交瘤選自下組PTA-8260,PTA-8261，PTA隱8262，PTA-8263,PTA-8264,PTA-8265,PTA-8266,PTA-8267,PTA-8268，PTA畫8269，PTA-8270。57.—種抗體，其是由權利要求52的雜交瘤分泌的。58.—種轉基因動物，其表達IgE的人Ml，區段。全文摘要本申請涉及凋亡性抗IgE抗體、其編碼核酸、其治療組合物、及其在IgE介導的病症的治療中的用途。文檔編號C07K16/42GK101679528SQ200880016908公開日2010年3月24日申請日期2008年3月21日優先權日2007年3月22日發明者伊馮娜·陳,勞倫·吳,安德魯·陳,梅塞德絲·巴拉茲,漢斯·布賴特比爾,特倫斯·王,阿南·丘恩撒拉佩,馬克·丹尼斯申請人:健泰科生物技術公司