包含瘧原蟲msp－1的c－末端片段的重組蛋白的製作方法

2023-07-28 01:29:51 1

專利名稱：包含瘧原蟲msp－1的c－末端片段的重組蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的來自感染哺乳動物尤其是人的瘧原蟲裂殖子形式中的主要表面蛋白的疫苗活性成分，一般稱為MSP-1。
MSP-1已成為許多研究的主題。它在瘧原蟲類寄生蟲尤其是惡生瘧原蟲的裂殖體階段合成，並在瘧原蟲的肝階段和細胞階段(1,2,3,4)以裂殖子的一種主要表面成分的形式表達。因為該蛋白的顯著特徵並且在所有已知的瘧原蟲屬的種類中保守，因此推測它可能是構建抗瘧原蟲疫苗(5、6)的一個候選物。
該蛋白的片段尤其是被觀察到在例如寄生蟲進入被感染宿主的紅細胞的侵入期間形成的天然裂解產物也是如此。這樣的裂解產物有分子量為42kDa的C-末端片段的(7、8)，其本身再次被裂解為具有通常表觀分子量為33kDa的N-末端片段和具有通常表觀分子量為19kDa的C-末端片段(9)，後者在藉助於糖基磷脂醯肌醇(GPI)基團進行修飾後，通常仍保持固定在寄生蟲膜上(10,11)。
還在紅細胞內發育周期的早期階段發現該片段(15,16)，從而作出這樣的觀察結論，即19kDa片段可起到仍然未知，但毫無疑問在再侵入過程中為必需的作用，這構成了過去形成的該蛋白可構成疫苗的尤其有效的耙標的假設基礎。
應理解下面經常提及的來自瘧原蟲屬的一些種類的p42和p19蛋白是指相應的該瘧原蟲的MSP-1蛋白的C-末端裂解產物，或廣義地說指通過基因重組，或通過使用常規技術，如使用「AppliedSystem」合成儀的化學合成，或通過「Merrifield」型固相合成而獲得的包含基本上相同的胺基酸序列的產物。為了方便，所提到的「重組p42」和「重組p19」指通過包含至少一個基因工程步驟的方法而獲得的「p42」和「p19」。
面對獲得大量惡性瘧原蟲寄生蟲的困難以及不可能體外培養間日瘧原蟲，很清楚生產抗瘧原蟲疫苗的唯一方法是求助於使用重組蛋白或肽的方法。然而，由於其具有200kDa的很大的大小，生產全部MSP-1非常困難。這引導研究者研究其C-末端部分，它的(仍然未知的)作用可能更為重要。
已製備出並在猴中測試過的涉及惡性瘧原蟲MSP-1的C-末端部分的重組蛋白(12,40,41)為·大腸桿菌(40)中產生的與穀胱甘肽-S-轉移酶融合的p19；·大腸桿菌(12)中產生的與穀胱甘肽-S-轉移酶融合的p40；·與來自破傷風類毒素的多肽融合的並帶有在釀酒酵母中產生的輔助T細胞表位的p19(12)；·在杆狀病毒系統中產生的p42(41)。
包含大腸桿菌中產生的與穀胱甘肽-S-轉移酶融合的p19蛋白，並混合有明礬或脂質體的組合物在六個接種的Aotus nancymal猴中沒有一個顯示出保護性效果(40)。
包含大腸桿菌中產生的與穀胱甘肽-S-轉移酶融合的p42蛋白，並混合有弗氏完全佐劑的組合物當給予兩類Aotus猴(A.nancymai和A.vociferans)時沒有顯示出保護性效果。釀酒酵母中產生的p19蛋白在兩個A.nancymai種類的Aotus猴中顯示出保護性效果(12)。而在兩個A.vociferans種類的Aotus猴中沒有保護性效果。
一些研究者(Chang等)還報導了在兔中使用在杆狀病毒系統中產生的含有惡性瘧原蟲(18)中共有的胺基酸序列的重組p42蛋白進行的免疫試驗。後邊這些作者指出在兔中重組p42基本上以與完整重組MSP-1蛋白(gp195)相同的方式起作用。該p42蛋白結合弗氏完全佐劑已成為在易被惡性瘧原蟲感染的非人靈長類Aotus、狐猴(lemurinus grisemembra)中進行的疫苗接種試驗中的主題(40)。結果表明3個動物中的2個被完全保護，第三個雖然顯示出與對照類似的寄生蟲血症，但是具有較長的潛伏期。然而推出如此誘導的抗寄生蟲本身的抗體的保護性是冒險的。應該記住目前對於間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲，在靈長類中沒有非常滿意的實驗模型。對於惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲開發出的松鼠猴模型，對惡性瘧原蟲開發的Aotus模型，是需要寄生蟲種類適應並通常需要切除動物的脾以獲得顯著的寄生蟲血症的人工系統。結果，來自該模型的疫苗接種對於人類僅具有有限的預測價值。
無論如何，用該重組蛋白可能獲得的實際接種比例為多少仍是一個問題，記住下面報導的發現，即在來自瘧原蟲屬相同種類的p42，尤其是在相應的p33中在許多情況下存在高可變區，這使得在用來自瘧原蟲屬種類的p42接種的個體中所誘導的抗體抗相同種類其它個體感染的免疫保護性功效不確定(13)。
甚至可假設p42的N-末端部分的高多態性在通常觀察到的對這類寄生蟲的免疫逃避中起著明顯的作用。
本發明的目的是生產可避免這些困難、其保護性效果在真正重要的實驗模型或甚至直接在人中可驗證的接種用重組蛋白。
更具體地說，本發明提供一種抗感染人的瘧原蟲型寄生蟲的接種用組合物，它包含可能被或可能未被糖基化的重組蛋白作為活性成分，其必需的組成性多肽序列為·感染人的瘧原蟲型寄生蟲的裂殖子形式表面蛋白1的19千道爾頓的C-末端部分(p19)的序列，其中所述C-末端片段在感染周期的進入人紅細胞的穿透階段末期通常仍然被錨定在寄生蟲表面；·或仍能誘導在體內可抑制由於相應的寄生蟲而導致的寄生蟲血症的免疫應答的所述片段之部分的序列；·或與所述p19片段或該片段的所述部分免疫學等價的多肽的序列；和所述重組蛋白進一步包括在還原性介質中不穩定並優選組成被抗相應瘧原蟲所形成的人抗血清所識別的大部分表位的構象表位。
該構象表位的存在可在疫苗活性成分的保護性功效中起重要的作用。當它們在杆狀病素系統中產生時，特別可在顯示上面定義的其它特性的活性成分中發現它們。如果需要，下面將提到的「杆狀病毒載體系統」是指由杆狀病毒型載體本身和細胞系組成的整體，尤其是可被將要轉化到這些細胞系的序列修飾的杆狀病毒轉化，並導致該轉化序列表達的昆蟲細胞系。在Longacre等(19)的文章中已描述了杆狀病毒系統中這兩種成分的優選實例。在下面的實施例中使用相同的系統。當然，不言而喻，杆狀病毒和可被杆狀病毒感染的細胞的變體可用來代替選擇的那些。
尤其是，當它為非還原狀態或為非不可逆還原的狀態時，該重組蛋白被抗相應的瘧原蟲或抗類似的瘧原蟲所形成的人抗血清所識別，但當它被不可逆地還原時，則不被或僅在很小程度上被這些相同的抗血清所識別。
在還原介質，尤其是在存在β-巰基乙醇時，這些構象表位的不穩定特性可通過下面在實施例中描述的試驗來證實。類似地，下面的實施例描述了可適用於用來獲得本發明蛋白質的不可逆還原的實驗條件。
從這點上來看，由Longacre等(14)生產的重組蛋白可用於該組合物。應該記住S.Longacre等成功地在含有編碼間日瘧原蟲的p19的核苷酸序列的杆狀病毒載體系統中，生產出來自間日瘧原蟲的MSP-1的重組p19，尤其是通過在多角體蛋白啟動子的控制下，用包含編碼下面定義的肽序列的序列的杆狀病毒載體轉染昆蟲細胞〔草地夜蛾(sf9)細胞系〕的培養物，其中在所用的杆狀病毒載體中序列以下面的順序排列·多角體蛋白信號肽的35個鹼基對的5′末端片段，其中用於啟動該蛋白表達的甲硫氨酸密碼子已突變(為ATT)；·編碼對應於MSP-1N-末端部分的32個胺基酸肽的5′-末端核苷酸片段，包括MSP-1信號肽；·編碼p19的核苷酸序列，或編碼間日瘧原蟲的MSP-1蛋白的p42的序列，根據情況，以帶有(被「錨定」形式)或失去(可溶形式)這些核苷酸序列的3′末端區的形式來提供這些序列，其最終C-末端表達產物被認為在將最終p19蛋白錨定在寄生蟲膜上起著實質性作用；·2TAA終止密碼子。
對於p42，來自MSP-1的C-末端區的序列從胺基酸Asp1325延至胺基酸Leu1726(錨定形式)或至胺基酸1705(可溶形式)，對於p19，序列從胺基酸Ile1602延至胺基酸Leu1726(錨定形式)或至胺基酸Ser1705(可溶形式)，應理解其起始和終止胺基酸已在上面描述的p42和p19的全部胺基酸序列是根據已測序的間日瘧原蟲的Belem分離物的基因(20)得來的。
使相同的載體系統中，使用編碼猴瘧原蟲的p42和p19的核苷酸序列獲得類似結果。對於猴瘧原蟲的興趣是雙重性的，它是感染恆河猴的與間日瘧原蟲極其接近的寄生種類。它還可感染人。而且，猴瘧蟲的天然宿主恆河猴和高帽猴(toque macaque)的可接近性也使得可檢測來自猴瘧原蟲的MSP-1在天然系統中的保護功效。對於在人類中的反應，恆河猴被認為是最具代表性的一個種類。
尤其是，在使用高帽猴和兩種重組多肽可溶性的p42和尤其是來自猴瘧原蟲的可溶性p19進行的接種試驗中已獲得了極好的結果，其中該兩種重組多肽分別在杆狀病毒系統中產生並在具有識別天然MSP-1蛋白的相應區域的單克隆抗體的親和柱上純化。進行下面觀察在攻擊感染後，僅用p19(三隻猴子)及用p19和p42一起(三隻猴子)免疫的六隻猴子事實上均顯示出幾乎無效的免疫性。在用p42免疫的三隻猴子中獲得的結果是不顯著的。它們中的兩個如上所述，但是由於第三個顯示出比在存在弗氏佐劑時用PBS緩衝液免疫的對照(3隻猴子)或未免疫(3隻猴子)時低的寄生蟲血症，因此不甚清楚。
第二次攻擊感染表明僅獲得p19的猴子被保護了至少六個月。在該系統中(高帽猴，猴瘧原蟲)用p19及明礬進行的第二次接種試驗顯示出對於3隻猴子中的2隻猴子的明顯保護。這是首次證實在存在明礬時MSP-1或其它重組抗原的保護性效果(42)。
使用恆河猴，用在杆狀病毒系統、採用來自猴瘧原蟲的重組p19產生的重組多肽進行的特別有效的試驗結果表明，各自包含來自其它瘧原蟲的重組p19的重組多肽必定以相同方式起作用。對於在人類中的瘧原蟲，它們比來自在「人工宿主」中用間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲進行的試驗的結果更有意義。
來自C-末端MSP-1部分(p19)的杆狀病毒重組蛋白在天然系統中具有極其顯著的抗瘧原蟲保護性效果，這構成了用於評價MSP-1對人的保護性效果的最具代表性的模型。
如果p19形式失去p42的N-末端部分的高可變區，則獲得的保護性效果可選一步提高，它的效果在被接種的個體面臨許多多態性的自然情況下可以是有害的。而且，p19看來擁有在p42中不存在的特定表位。
19kDa C-末端片段(其序列存在於疫苗活性成分中)在不存在通常位於相應的MSP-1蛋白中的p19序列的上遊的任何多肽序列時，可以被限制在p19本身的序列。可是很顯然，如果其存在不改變疫苗的活性成分的免疫學特性，則活性成分的必需組成性多肽序列還可包含屬於p42自然裂解之前仍與相應的p19相連的33kDa(p33)N-末端片段的C-末端一側的多肽序列。如從下面尤其是在實施例的描述中將看到的，瘧原蟲屬的相同種類的各個株中p33的C-末端序列(參見圖4中「區Ⅲ」肽序列的C-末端部分)也具有一定程度的同源性或基本保守的序列，例如在感染人的瘧原蟲的不同變種中程度為至少80％，這樣它們基本上不改變活性成分的接種性質(圖4中其序列相當於區Ⅳ)，尤其是使用從該圖中得到的假設時；在p19和p33的區Ⅲ之間的推測的裂解位點位於特別保守區(LNVQTQ)中的亮氨酸和天冬醯胺殘基之間。
當存在時，p33的C-末端多肽序列通常包含少於50個胺基酸殘基，或甚至少於35，優選少於10個胺基酸殘基。
相反，疫苗的活性成分的必需組成性多肽序列不需要包含編碼p19的全部序列，當然前提是保持誘導抗寄生蟲的抗體的能力。尤其是，「片段部分」的分子量為10-25kDa，尤其是10-15kDa。優選地，該多肽片段部分包含兩個EGF(表皮生長因子)區的至少一個。
顯然，技術人員可區分活性片段和不再有活性的那些片段，尤其通過實驗產生含具有不同長度來源於p19的插入物的修飾載體，分別通過與適宜的限制性酶反應，或通過外切核酸酶與編碼p19的片段接觸不同時間，從編碼p19的序列獲得所述插入片段；可接著檢測來自由相應修飾的載體轉化的相應真核細胞，尤其是昆蟲細胞中的這些插入物的表達產物產生保護性效果的能力，尤其是在下面實施例中描述的實驗條件下。特別地，這些插入物的表達產物必須能抑制體內由相應的完整的寄生蟲所引導的寄生蟲血症。
因此，本發明包括所有接種用組合物，其中活性成分的必需組成性多肽序列由可誘導與由p19或上面定義的片段產生的等價細胞和/或體液免疫應答的肽構成，前提是在序列中加入、缺失一些胺基酸或被其它的胺基酸取代將不導致被修改的肽的抑制所述寄生蟲血症的能力的大的改變-下文稱為「免疫等價肽」。
p19片段自然也可以在N-末端側或C-末端側或藉助於肽鍵與具有接種潛力的其它胞質蛋白片段相連(如來自間日瘧原蟲(29)的Duffy結合蛋白或來自惡性瘧原蟲的EBA-175(30)和(31)，它的一個區特異性地富含半胱氨酸)，前提是它抑制體內通常由相應寄生蟲所誘導的寄生蟲血症的能力不發生變化，除非被增大。
在p19的N-末端最後的上遊，編碼p19或其部分的片段還可包含例如所採用的信號肽的C-末端片段的不同肽序列，如MSP-1蛋白的信號肽片段。該序列優選包含少於50個胺基酸，例如10-40個胺基酸。
這些評述類似地適合於來自其他瘧原蟲尤其是惡性瘧原蟲的p19，惡性瘧原蟲是寄生蟲中主要的種類，引起一種最嚴重瘧疾形式。
然而，如果要獲得能進行免疫保護性試驗的可觀數量，非常難於將上面總結的在杆狀病毒系統中產生間日瘧原蟲或猴瘧原蟲的重組p19的方法不加改變地更換到的產生惡性瘧原蟲的重組p19中，而產生令人滿意的產率。
本發明還提供在很大程度上克服這個問題的方法。這樣在杆狀病毒系統的表達載體中還可以使用替代天然核苷酸序列的編碼惡性瘧原蟲p19的合成核苷酸序列來獲得更高產率的惡性瘧原蟲p19和面臨類似困難的其它瘧原蟲的p19，其中該合成核苷酸序列編碼相同的p19，但其特徵在於具有比天然核苷酸序列更高的G和C核苷酸比例。
換句話說，本發明是依據下面發現而得出的，即在杆狀病毒系統中編碼p19的核苷酸序列的表達明顯與待表達核苷酸序列中的連續密碼子與可被杆狀病毒轉化的宿主細胞的「細胞機器」的提高的相容性相關，這在通常包含在這些杆狀病毒中並在被感染宿主細胞中表達的天然核苷酸序列中可觀察到；因此天然惡性瘧原蟲核苷酸序列的表達不好或甚至完全沒有表達；因此也可能解釋了由Longacre等(14)觀察到的在杆狀病毒系統中間日瘧原蟲的p19的更為有效的表達，以及發明人已證明的來自相應的天然p19核苷酸序列的猴瘧原蟲的序列，因為它們比編碼惡性瘧原蟲p19的天然核苷酸序列具有相對更大量的G和C核苷酸。
因此本發明更一般地提供一種重組杆狀病毒類型的修飾載體，在包含於所述載體中並被所述載體轉化的細胞識別的啟動子的控制下，其包含編碼可被杆狀病毒系統利用的信號肽的第一核苷酸序列，其特徵在於第二核苷酸序列位於第一核苷酸序列下遊，也受所述啟動子的控制並編碼肽序列·感染人類的非間日瘧原蟲的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19千道爾頓(p19)的C-末端片段的序列，在感染周期中，該C-末端片段在進入紅細胞的穿透階段的末期通常仍然被錨定在寄生蟲表面；·或該肽片段的一部分，前提是來自杆狀病毒系統中的第二序列的表達產物仍能誘導可抑制體內由於相應寄生蟲導致的寄生蟲血症的免疫應答；·或通過胺基酸的加入、缺失或取代但不導致其誘導類似於由所述p19肽片段或所述片段的所述部分產生的細胞和/或體液免疫應答能力發生大的改變的所述C-末端肽片段(p19)或所述肽片段部分的免疫等價肽；和如果需要，所述核苷酸序列具有構成它的全部核苷酸的40％-60％範圍的G和C核苷酸含量，優選至少50％。可通過構建合成基因獲得該序列，其中天然密碼子已被變化為不改變它們翻譯(保持肽序列)的富含G/C的密碼子。
由合成DNA提供的核苷酸序列相對於天然基因序列或cDNA，可能具有至少10％改變的密碼子，但仍保留了天然翻譯序列的特徵，即保持胺基酸序列。
不能排除G和C核苷酸含量可進一步增加，前提是由此導致產生的重組肽，或免疫等價肽的胺基酸序列的改變尤其是在下面將描述的試驗中不導致形成的重組蛋白的免疫性質或保護性性質的喪失。
這些評述自然適用於感染人類的其它瘧原蟲，尤其是其中編碼相應p19的天然核苷酸序列具有與杆狀病毒系統中的有效表達相容不好的T和A核苷酸含量的那些。
編碼所使用信號的序列可為通常與有關的瘧原蟲的天然序列相關的那些。如果可被識別作為杆狀病毒系統中的信號時，則它還可來源於其它瘧原蟲，如間日瘧原蟲或猴瘧原蟲或其它生物。
在一種情況下，所述載體中的編碼p19或其片段的序列失去將天然蛋白錨定在為其來源寄生蟲上的序列，在這種情況下，表達蛋白通常被分泌至培養基中(可溶形式)。在這方面也很明顯，即在本發明的條件下，產生的重組蛋白的可溶和錨定形式，尤其是當它們來自惡性瘧原蟲或猴瘧蟲或間日瘧原蟲時，趨於形成寡聚體，這個性質可能作為所形成重組蛋白的增加的免疫原性的原因。
本發明還涉及這樣的載體，其中編碼序列包含編碼通常參與誘導將天然蛋白錨定在表達它的宿主的細胞膜上的p19的疏水性C′-末端的最後序列的最後的3′-末端序列。該3′-末端的最後序列對於編碼可溶性p19部分的序列也可以是異源的，例如當它編碼將產生的整個重組蛋白錨定在所採用的杆狀病毒系統的宿主的細胞膜上的序列時，相當於來自間日瘧原蟲或來自其它生物的3′-末端序列。該錨定序列的一個實例為可在草地夜蛾(32)類型的昆蟲細胞中表達的CD59抗原的GPI或CD14人蛋白(33)的GPI。
本發明自然還涉及重組蛋白，這些蛋白包括被抗相應的瘧原蟲所形成的人血清所識別的構象表位。
通常，本發明還涉及上述類型的任何重組蛋白，前提是它包含例如在杆狀病毒系統中產生的那些構象表位，尤其是在還原介質中不穩定的那些。
本發明自然還涉及所述重組蛋白，不論它們為可溶形式或被具有錨定區，尤其是錨定至杆狀病毒系統所採用的細胞宿主上的形式。
本發明還包括在所採用的杆狀病毒系統中自發產生的或使用常規蛋白質寡聚體化方法隨後產生的寡聚體。最常用的方法包括戊二醛法。然而，可使用任何用於橋接蛋白中各個胺與羧基官能團的常規系統。作為實例，可使用描述在歐洲專利申請EP-A-0602079中的任何方法。
術語「寡聚體」指包含2-50個單體單元的分子，每個單體單元包含如上所定義的能形成聚集物的p19或其片段。本發明還包括如上定義的p19或p19片段與用於生產疫苗的載體分子，如聚賴氨酸-丙氨酸，藉助於共價或非共價鍵形成的任何結合產物。利用它們的接種用組合物也形成了本發明的一部分。
本發明還進一步涉及採用這些寡聚或結合重組蛋白，包括來自間日瘧原蟲的蛋白的疫苗組合物，其中這些評述也延伸至這些重組蛋白寡聚體。
本發明還包括這樣的組合物，其中上面定義的重組蛋白與佐劑如明礬結合。包含允許它們錨定至產生它們的細胞的膜上的C-端末端區的重組蛋白可有利地與可形成適於生產疫苗的脂質體的脂質一起結合使用。非限制性地，可使用描述在J.Delattre等，INSERM,1993的題目為「Les liposomes aspects technologique biologique etpharmacologlque」〔脂質體工藝學、生物學和藥理學狀況〕的出版物中脂質。
無論對於適當的接種部分為同源或異源的錨定區，重組蛋白中的錨定區的存在促進親細胞抗體的產生，尤其是在鼠中可具有特別高的保護性活性的IgG2a和IgG2b類型，這樣可省去將這樣構建的疫苗活性成分與用來產生脂質體形式的非脂質佐劑結合。這相當於一個很大的優點，因為在使其能被貯存和運輸的條件下，脂質體可被冷凍乾燥，而不需要一系列的冷貯存措施。
本發明的其它特徵從下面對本發明重組蛋白及可產生它們的條件的實施例的描述中將變得很清楚。這些實施例不限制本發明的範圍。
PfMSP1p19S(可溶)(來自惡性瘧原蟲的可溶性p19)的構建的描述重組構建物pfMSP1p19S包含對應於8個鹼基對的前導序列和來自間日瘧原蟲MSP-1的頭32個胺基酸即從Met1-Asp32(Belem分離物；Del Portillo等，1991,P.N.A.S.,88,4030)，接著是GluPhe(由於連接兩個片段的EcoR1位點)的DNA。這後面是

圖1描述的編碼惡性瘧原蟲MSP1p19從Asn1613-Ser1705的合成基因(Uganda-Palo Alto分離物；Chang等，1988，實驗寄生蟲學，67,1)。構建物由兩個TAA終止密碼子終止。該構建物產生的重組蛋白從昆蟲細胞中分泌在培養物上清中。
為了比較，用相同方法在類似於用來產生上面p19的條件下產生重組構建物，但是使用由Chang等，實驗寄生蟲學67,1；1989描述的惡性瘧原蟲株(FUP)的相應DNA的直接拷貝構成的編碼序列。天然的基因拷貝(從天冬醯胺1613-絲氨酸1705)通過PCR從天然基因形成。
圖1A表明合成基因(Bac19)和「天然基因」(pF19)的序列。
可以看出編碼來自惡性能瘧原蟲的p19的天然序列的93個密碼子中的57個密碼子發生了改變(它們中的55個的第三個核苷酸和其它2個密碼子中的第一和第三個核苷酸)。在上述條件下，將新的密碼子加入到5′末端以導入肽信號並導入用於克隆的EcoRⅠ位點，類似地加入在惡性瘧原蟲p19中不存在的兩個終止密碼子以獲得表達終止信號。位於連續密碼子上面的各個字母對應於各個連續的胺基酸。星號(*)表示終止密碼子。垂直線表明在兩個序列中相同的核苷酸。PfMSP1p19A構建(錨定的GPI)(惡性瘧原蟲的錨定p19)的描述PfMSP1p19A構建物具有上面的特徵，只是合成序列(圖1B)編碼惡性瘧原蟲的MSP1p19(Uganda-palo alto分離物)從Asn1613到Ile1726，接著是兩個TAA終止密碼子。該構建物產生通過糖基磷脂醯肌醇(GPI)類型的結構錨定在感染細胞的質膜上的重組蛋白。
圖1C代表在切除信號序列之前的PfMSP1p19S重組蛋白序列。
圖1D代表在切除信號序列之後的PfMSP1p19S重組蛋白序列。
圖1C和1D中下劃線的胺基酸來自於用來連接來源於間日瘧原蟲的MSP-1的N-末端部分的核苷酸序列(具信號肽)和惡性瘧原蟲的MSP-1p19的EcoRⅠ位點。
圖2通過免疫印跡，在存在(還原)或不存在(非還原)B-巰基乙醇時，使用SDS-PAGE分析通過免疫親和純化的可溶性重組PfMSP1p19抗原。在2％SDS存在下，加熱至95℃後，將樣品上樣至凝膠中。在這些條件下，僅有共價鍵(二硫橋)可以抵抗解聚作用。左手邊的印跡用與天然p19的線性表位反應的單克隆抗體來顯示。右手邊的印跡用來自由於惡性瘧原蟲而具有對瘧原蟲的獲得性免疫的個體的13份人抗血清的混合物來顯示。這些結果表明重組杆狀病毒分子可重現其大部分被人抗血清識別的聚合物形式的構象表位。
圖2B在非還原(NR)，僅在帶電介質中還原(R)和被不可逆還原(IR)條件下，用來自間日瘧原蟲和猴瘧原蟲的純化的重組MSP-1p19的人抗血清進行的免疫印跡分析本項工作是基於這樣一種想法，即杆狀病毒表達系統大量正確重現在體內存在於MSP-1的C-末端部分的構象表位。測定這種性質的最好方法(在不存在相當於p19的天然純化的蛋白時，它可能是唯一可能的方法)是研究重組蛋白與暴露於瘧原蟲的個體抗血清的反應性，這反映出如人免疫系統「看見」的天然蛋白。
因此，在存在(還原的)或不存在(非還原的)DTT時，使用SDS-PAGE(15％)，通過免疫印跡分析免疫親和純化的可溶性重組PvMSP-1p19和PcMSP-1p19抗原。在2％SDS存在下，加熱至95℃後，將樣品上樣至凝膠中。如下進行不可逆的還原將蛋白重新懸浮於0.2M Tris-HCl,pH8.4,100mM DTT,1.0％SDS中，並在70℃加熱30分鐘。在用水稀釋後，加入丙烯醯胺至最終濃度為2M,37℃下，在氮氣氛中在黑暗中將混合物保溫1小時。用來自由於間日瘧原蟲而具有對瘧原蟲的獲得性免疫的個體的25份人抗血清的混合物來顯示免疫印跡。V和C分別指來自間日瘧原蟲和猴瘧原蟲的MSP-1的蛋白。應該注意到不可逆還原的重組蛋白未顯示出與人抗血清的反應性，而非不可逆還原的蛋白或未還原的蛋白顯示出良好的反應性。(由於在其糖基化狀態時與硝酸纖維素紙結合不好，所以未還原的Pv MSP-1p19有些弱)。這些結果表明人抗血清對杆狀病毒MSP-1p19分子的識別大部分取決於(如果不是完全)對還原作用敏感的在該系統中被重製的構象表位。
圖3-37℃下，在存在來自惡性瘧原蟲裂殖子並用等電聚集分離的蛋白級分時，將可溶性PvMSP1p42重組抗原(Longacre等，1994，同上)保溫5小時。接著在存在(還原的)或不存在(未還原的)β-巰基乙醇時，通過免疫印跡分析樣品。將等電聚焦級分5-12和在存在(Tex)或不存在(T)去汙劑時製備的兩個全裂殖子提取物進行分析。用對間日瘧原蟲的MSP1p42和MSP1p19特異性的單克隆抗體顯示免疫印跡，結果表明在可用去汙劑提取的惡性瘧原蟲裂殖子中具有蛋白水解活性。在一些級分中的對p42的消化看來導致消化產物(p19)的聚合作用；這種聚合作用可能與二硫橋的形成相關，因為在存在β-巰基乙醇時，高分子量形式消失而有利於分子量為約19kDa的分子(Tex-R)。因此在這些實驗中觀察到的p19的聚合作用可以是該分子在體內的固有性質。
圖3B:p42和p19抗原對間日瘧原蟲抗-MSP-1人應答的不同分布使用如下的ELISA抑制方法，比較對間日瘧原蟲具有獲得性免疫的個體的抗血清對間日瘧原蟲MSP-1p42和p19抗原的識別。將來自由於間日瘧原蟲而具有對瘧原蟲的獲得性免疫的個體的25份人抗清血的混合物稀釋至1∶5000，室溫下，單獨地或在存在1mM純化的間日瘧原蟲重組p42或p19時保溫4小時。將混合物轉移至已在4℃下用500ng/ml純化的吸附重組p42或p19包被18小時的微量滴定孔中，並在室溫下保溫30分鐘。在用含0.1％Tween 20的PBS洗滌後，加入與過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgG,37℃下，將混合物保溫1小時。通過在492nm下讀取光密度來獲得酶活性。根據不存在競爭性抗原時對微量滴定平板上覆蓋抗原的100％抗血清活性的值來計算抑制百分數。使用Statview程序來計算統計數據。每一個柱代表根據4-12次測定的競爭/吸附抗原對的平均抑制百分數；豎線相當於95％置信區間。星號(*)指在存在衣黴素時產生的抗原，因此沒有N-糖基化。這些測定的重要參數為對抗血清在ELISA曲線敏感區域內的1∶5000稀釋，以及包括低親和性表位競爭的1mM競爭性抗原濃度。因此這些數據反映出兩個被比較抗原之間的最大相似性。結果表明大多數(如果不是所有)被人抗血清識別的p42表位存在於p19中，因為在存在後者時，人抗血清抗p42的反應性的抑抑制與被p42抗原本身的抑制一樣多。然而，相反，由於人抗血清抗p19的反應性被p42的抑制比被p19本身的抑制小得多，因此約20％由人抗血清識別的p19表位不存在於p42或在p42上不可接近。僅在將p42裂解為p19和p33後者才形成或釋放該p19的特異性表位。這些結果不受糖基化作用的影響表明這種作用確實是由於p19和p42的肽成分之間的差異而不是由於糖基化作用的差異。這些結果預示這樣一個事實，即p19具有與p42截然不同的免疫性質。PcMSP1p19S(可溶性)構建物(猴瘧蟲的可溶性p19)的描述從猴瘧原蟲株(P.cynomolgi ceylonesis)(22-23)的克隆獲得用於上面構建物的DNA。該蟲株通過其天然宿主(Macaca sinica)連續傳代和藉助於蚊子的循環傳播(27)而得以保持。
處於成熟裂殖體階段的血液寄生蟲從當寄生蟲血症達到5％水平時的被感染的猴子中獲得。接著使用在(25)中描述的方法對它們進行純化。按在(26)中所描述的提取DNA。
使用圖4中劃線的來自間日瘧原蟲的寡核苷酸，藉助於PCR反應產生1200個鹼基對的片段。5′寡核苷酸包含EcoRⅠ限制性位點，3′寡核苷酸包含兩個合成TAA終止密碼子，其後是BgⅢ位點。藉助於這些EcoRⅠ和BgⅢ位點以及連接反應將該片段導入已包含間日瘧原蟲MSP-1蛋白信號序列的pVLSV200質粒(19)中。該新質粒(pVLSV200C42)被用來分析DNA序列。
比較猴瘧原蟲和相應的間日瘧原蟲的序列。黑色箭頭表示推測的第一和第二個裂解位點。通過從惡性瘧原蟲的已知位點類推來確定它們(27,28)。豎線和水平箭頭定位所研究約4個區域的界限。區域4相當於編碼猴瘧原蟲p19的序列、糖基化位點加框，保守的半胱氨酸下劃線。圖4的下面部分表明間日瘧原蟲和猴瘧原蟲的兩個分離物之間的相同的百分數。
重組構建物PcMSP1p19S包含相當於如下的DNA前導序列的8個鹼基對和間日瘧原蟲的MSP-1的從Met1至Asp32頭32個胺基酸(Belem分離物；Del Portillo等，1991,P.N.A.S.,88,4030)，其後為連接這兩個片段的GluPhe(由於EcoRⅠ位點)，這後面是編碼猴瘧原蟲MSP1p19的從Lys276至Ser380(Ceylon株)的序列。該構建物由兩個終止密碼子終止，該構建物產生分泌在被感染細胞的培養物上清中的重組蛋白。通過使用特異性識別惡性瘧原蟲p19的單克隆抗體的免疫親和層析純化重組PfMSP1p19蛋白通過使用詳細描述在Pharmacia採用的方法中的標準方法，將70mg單克隆抗體(從G17.12雜交瘤獲得，該雜交瘤於1997年2月14日保藏在CNCM〔國家微生物培養物保藏中心〕(法國巴黎)，其保藏登記號為I-1846；該G17.12雜交瘤從產生識別惡性瘧原蟲p19的IgG 2a/k的X63Ag8 653骨髓瘤構建)結合至3g活化的CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)來製備層析樹脂。4℃下，將包含可溶性PfMSP1p19的培養上清與層析樹脂分批保溫16小時。將柱用20體積的含0.05％ NP4O,0.5M NaCl的PBS洗滌一次；用5體積的PBS洗滌一次並用2體積10mM磷酸鈉(pH6.8)洗滌一次。用30ml 0.2M甘氨酸(pH2.2)進行洗脫。洗脫液用1M磷酸鈉(pH7.7)中和，接著通過超濾和對PBS透析將其濃縮。為了純化被錨定的PfMSP1p19，所有洗滌和洗脫溶液均包含0.1％的3-(二甲基-十二烷基銨基)丙烷磺酸鹽(Fluka)。在松鼠猴Saimiri sciureus中的重組間日瘧原蟲(p42和p19)MSP1接種試驗。
該接種試驗在雄性脾未被切除的2-3歲的松鼠猴(Saimirisciureus boliviensis)中進行。用約50-100μg經免疫親和純化的每種重組可溶性PvMSP1p42和p19(19)以3周的間隔對3隻猴肌肉內注射3次。如下使用完全和不完全弗氏佐劑第1次注射1∶1FCA/FIA；第2次注射1∶4 FCA/FIA；第3次注射FIA。將這些佐劑組合物與抗原的PBS溶液以1∶1混合。使用相同方法使五隻對照猴子接受在大腸桿菌中產生的穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)抗原。在最後感染2.5周後，通過注射2×108被適應的間日瘧原蟲種類(Belem)感染的紅血細胞來進行攻擊感染。通過檢查被Giemsa染色的塗片來每天確定所有動物中的寄生蟲血症來評價保護作用。
圖5中的曲線表明以作為感染後時間(天)的函數的每微升血中的被寄生的紅血細胞數目(縱坐標，對數比例)測定的寄生蟲血症中的差異。曲線A相當於在三隻接種猴子中觀察到的平均值；曲線B相當於在五隻對照猴子中的平均值。
對圖的研究表明接種的效果是極大地降低了寄生蟲血症。在高帽猴Macaca sinica中的重組猴皮瘧原蟲(p42和p19)MSP1接種試驗如下使用15隻捕獲的猴子(1)3隻動物被注射100μg可溶性PcMSP1p42；(2)3隻動物被注射35μg(第一次注射)或50μg(第二次和第三次注射)可溶性PcMSP1p42；(3)三隻動物被注射PcMSP1p42和p19的混合物；(4)三隻動物被注射佐劑加PBS；(5)三隻動物未被注射。在上述方案中使用了弗氏完全和不完全佐劑。以4周的間隔進行肌肉內注射。在最後注射4周後，通過注射2×105被猴瘧原蟲感染的紅血細胞來進行攻擊感染。通過用Giemsa檢測寄生蟲血症來每天確定所有動物中的寄生蟲血症來評價保護作用。僅在計數400個塗片範圍後才將寄生蟲血症劃分為陰性。寄生蟲血症以被寄生的紅血細胞的百分數來表示。
圖6A-6G表明所獲得的結果，其中每一個均顯示作為感染後的時間函數(沿橫坐標，天數)的在攻擊動物中觀察到的寄生蟲血症(沿縱坐標，以對數比例的被寄生細血細胞的百分數表示)。
結果涉及·在圖6A中；未接種的對照動物；·圖6B涉及接受了包含弗氏佐劑的鹽溶液的動物；·圖6C是為了突出從對動物施用弗氏佐劑產生的相對結果(變化顯然是不明顯的)，將圖6A和6B進行疊加；·圖6D提供在用p42接種結束時所獲得的結果；·圖6E涉及僅用p19接種的動物；·最後，圖6F涉及用p19和p42的混合物接種的動物。
p42當然誘導一定水平的保護。然而，如圖6E和6F所示，由本發明的重組p19產生的保護相對更好。
可提出這樣的假設，即提高的保護作用來自p42的第二次裂解，伴隨裂解的是釋放游離的半胱氨酸，結果形成分子內橋而導致在三種試驗的重組蛋白中極具特徵的p19多聚體。
用來產生圖(6A-6F)的數據在圖6G中給出。
猴瘧原蟲的高帽恆河猴接種試驗，僅用p19接種的猴的第二次攻擊感染和對照(圖8)
6個月後，未進行其它接種，接受了p19 MSP-1及FCA/FIA的3隻猴(圖6E)和接受了包含弗氏佐劑的鹽溶液的3隻恆河猴(圖6B)和2隻新的未受影響的未被接種的猴子通過注射1×106個感染猴瘧原蟲的紅血細胞接受新的攻擊感染。通過檢查Giemsa染色每天確定所有動物中的寄生蟲血症來評價保護作用。僅在計數400個染色範圍後才將寄生蟲血症劃分為陰性。寄生蟲血症以被寄生的紅血細胞的百分數表示(在圖8D中提供了用來得出圖8A-C的數據)。各組中除開1隻動物有1天顯示0.008％寄生蟲血症外，早在6個月前經歷了攻擊感染的6隻免疫動物沒有可檢測的寄生蟲血症(圖8A和8B)。兩個未受影響的對照顯示具有最大為0.8％並持續21天的通常的寄生蟲血症(圖8C)。因此，儘管在第一次攻擊感染後不存在寄生蟲血症或非常輕微，接種了MSP-1p19的3隻動物比在第一次攻擊感染後顯示出全部通常感染的3隻對照晚6個月還受保護。這些結果提示p19的保護期為至少6個月。在猴瘧原蟲高帽恆河猴系統中用p19和明礬進行的接種試驗(圖9)使用完全(FCA)或不完全(FIA)弗氏佐劑獲得前面的陽性保護結果。然而，目前唯一在人中被允許的佐劑為明礬。出於這個原因，我們在存在明礬作為佐劑時，在高帽恆河猴中用猴瘧原蟲MSP-1p19進行接種試驗。如下使用6隻捕獲的恆河猴(1)3隻動物被注射4個劑量的50mg重組猴瘧原蟲MSP-1p19和20mg明礬；(2)3隻動物被4次注射生理鹽水和10mg明礬。以4周的間隔進行肌肉注射。在最後注射4周後，通過注射2×105個被猴瘧原蟲感染的紅血細胞進行攻擊感染。通過檢查Giemsa染色塗片每天確定所有動物中的寄生蟲血症來評價保護作用。僅在計數400個塗片範圍之後才將寄生蟲血症劃分為陰性。以被寄生的紅血細胞的百分數來表示寄生蟲血症。該實驗結果如下。用重組p19和明礬免疫的3隻恆河猴中的2隻攻擊感染後在感染期總寄生蟲血症(圖9A和9B)比用生理鹽水和明礬(圖9D)免疫的3隻對照恆河猴少約30倍。用p19免疫的第三隻恆河猴(圖9C)與對照沒有明顯不同。對於描述在圖9中的在高帽恆河猴macaca sinica中使用猴瘧原蟲p19的接種試驗，用來產生圖(9A-9D)的數據提供在(圖9E)中。雖然結果沒有以前的結果驚人(圖6、8)，但這是首次觀察到重組MSP-1和明礬的顯著的保護作用。圖10在松鼠猴中用重組惡性瘧原蟲p19進行的接種試驗。
如下使用囚禁中飼養的20隻約3歲Saimiri sciureus guyanensis(松鼠猴)如下在存在弗氏佐劑時，4隻動物被注射50mg可溶性PfMSP-1p19第一次注射1∶1 FCA/FIA；第二次注射1∶4FCA/FIA；第三次注射FIA。接著以1∶1將這些佐劑組合物與抗原的PBS溶液混合；(2)2隻對照動物接受如(1)所描述的弗氏佐劑和僅PBS；(3)在存在10mg明礬時，4隻動物被注射50mg可溶性PfMSP-1p19(Alu-Gel-S,Serva)；(4)2隻對照動物接受10mg明礬和僅PBS；(5)4隻動物被注射約50-100mg如下被重構到脂質體中的GPI錨定的PfMSP-1p19真空乾燥300mmol膽固醇和300mmol磷脂醯膽鹼，並被重新懸浮在含1.4mg PfMSP-1p19,GPI的330mM.N-辛基葡糖苷的PBS溶液中。用吸附劑Bio-Beads SM-2(Bio-Rad)將溶液對PBS滲析，通過離心濃縮形成的脂質體，並重新懸浮在PBS中。用保存在4℃的新制脂質體進行第1次注射，用已冷凍貯存的脂質體進行第2和第3次注射；(6)2隻動物被注射不存在如(5)中描述的p19,GPI的以相同方式製備的對照脂質體；(7)2隻動物被注射了生理鹽水。以4周的間隔進行三次肌肉內注射。通過注射1×106個被惡性瘧原蟲感染的紅血細胞來進行攻擊感染。通過檢查Giemsa染色塗片每天確定所有動物中的寄生蟲血症評價保護作用。寄生蟲血症以被寄生的紅血細胞的百分數來表示。該接種試驗的結果示於圖10,A-G中。
在攻擊感染後，用弗氏佐劑或脂質體中的p19免疫的組被證明具有與對照組類似的寄生蟲血症(一隻被接種弗氏佐劑中p19的動物(29號)由於與接種無關的原因(心臟疾病)，在攻擊感染後幾天死亡)。在這兩組中抗原的施用不規(弗氏佐劑的不良乳化，被凍凝的脂質體)未能使這些結果的重要性被完全評價。在明礬組中，2隻動物在感染期間顯示的全部寄生蟲血症比對照少約4倍，1隻動物比對照少約3倍，1隻動物類似於對照。由於對照的可變性，可能由於用於攻擊感染的寄生蟲株未很好地適應僅僅最近在Cayenme開發的非脾切除的松鼠猴模型，解釋該實驗有些困難。然而，雖然不太完美，但使用明礬的實際效果卻是令人鼓舞的，因為我們的抗原看來是目前與明礬結合已顯出一定效果的唯一的重組惡性瘧原蟲MSP-1形式。在松鼠猴中用重組惡性瘧原蟲p19進行的接種試驗(如圖10的相同試驗)如下以4周的間隔將囚禁飼養的猴子經肌肉內注射兩次1mL接種物(1)在存在如下弗氏佐劑時，4隻動物被注射50μg可溶性PfMSP1p19第一次注射1∶1 FCA/FIA；第2次注射1∶4 FCA/FIA；接著以1∶1與抗原的PBS溶液混合；(2)在存在10mg明礬時，4隻動物被注射50μg可溶性PfMSP1p19；(3)4隻動物被注射約50μg GPI錨定的重構在由1∶1摩爾膽固醇和磷脂醯膽鹼組成的脂質體中的PfMSP1p19。在第二次注射後，將動物飼養17天。
將來自由於惡性瘧原蟲(成熟形式佔大多數)導致帶有30％寄生蟲血瘧的松鼠猴的紅細胞用PBS洗滌，在存在2％SDS和2％二硫蘇糖醇時，將殘留物稀釋8倍，在上樣至7.5％(分離膠)和4％(濃縮膠)聚丙烯醯胺凝膠之前加熱至95°。在轉移至硝酸纖維素上之後，如下使用抗血清進行免疫印跡分析(1)將用弗氏佐劑中可溶性PfMSP1p19接種的4隻猴子的抗血清收集物稀釋20倍；(2)將用明礬佐劑中可溶性PfMSP1p19接種的4隻猴子的抗血清收集物稀釋20倍；(3)將用脂質體中的錨定PfMSP1p19接種的4隻猴子的抗血清收集物稀釋20倍；(4)50mg/ml與PfMSP1p19的線性表位反應的單克隆抗體；(5)將來自約20隻重複感染惡性瘧原蟲並變得可不受任何後繼惡性瘧原蟲感染的猴子SH190抗血清收集物稀釋500倍；(6)將未受影響的猴子(從未暴露在惡性瘧原蟲中)的抗血清收集物稀釋20倍。
結果表明用PfMSP1p19接種的猴子的3份抗血清收集物強烈及特異性地與非常高分子量的複合物(擴散在濃縮膠中)反應，這些複合物存在於含更多成熟形式的寄生蟲提取物中。這些結果支持了這樣的假設，即在體內存在PfMSP1p19的特異性聚集物，尤其是其寡聚體形式，其包含被重現於在杆狀病毒系統中合成的重組pfMSP1p19分子中的表位。
圖7也說明這些結果。它顯示在凝膠上產生的免疫印跡。頭三個凝膠泳道說明猴子對注射p19的體內應答〔(1)與弗氏佐劑，(2)與明礬，(3)以脂質體形式〕，尤其是高分子量複合物的存在支持了在體內成熟階段(當p42被裂解為p19和p33)特有的寡聚體形式的p19聚集的假設。
該接種試驗還包括與前面注射相同的第三次注射。使用弗氏佐劑的注射僅包含FIA。
對於每組有兩隻動物對照，即注射了PBS和弗氏佐劑的2隻對照動物注射PBS和明礬的2隻對照動物；注射了脂質體而沒有蛋白的2隻對照動物；和注射了PBS而沒有佐劑的2隻對照動物。如上面描述的來評價保護作用。
圖7B該圖的數據來自松鼠猴/惡性瘧原蟲接種試驗(下面的圖10)。數目相當於圖10中提到的各只猴子。用於該圖中的技術和方法與圖7中的一樣，只是在三次注射後攻擊感染那天檢測各只猴子的每份抗血清，並將SHI抗血清以1∶250稀釋。結果表明用p19和明礬接種的4隻猴子的抗血清強烈並特異性地與非常高分子量的複合物反應，而用p19和弗氏佐劑或脂質體接種的其它組的猴子僅顯示出與這些複合物很小的反應性。由於用p19和明礬接種的猴子也是被保護得最好的，因此與高分子量複合物的反應性看來指示了保護性效果，儘管該組中一隻猴子相對於對照組沒有被保護且另一隻僅被部分保護。
當然本發明還涉及其它應用，如在下面根據一些實例描述的那些，雖然這些本質上是非限制性的。治療用途該重組分子PfMSP1p19可被用來產生特異性抗體，該抗體可通過被動轉移用作由於惡性瘧原蟲導致的具有死亡危險的嚴重瘧疾的治療劑。診斷用途來自杆狀病毒的重組分子PvMSP1p42、PvMSP1p19和PfMSP1p19可以並且已被用來產生特異性的鼠單克隆抗體，這些抗體與來自其它種的如兔或山羊的多克隆抗-MSP1p19抗血清結合可形成瘧疾的半定量診斷試驗的基礎，用於區別可致死的由惡性瘧原蟲導致的瘧疾和通常為非致命的由間日瘧原蟲導致的瘧疾。該試驗的原理是捕獲和定量血液中包含p19部分的任何MSP-1分子。
此處，MSP1p19分子的優點如下(ⅰ)它在相同種中極其保守，而在不同種之間具有足夠的不同，使得易於產生種類特異的反應物。在來自PfMSP1p19和PvMSP1p19的抗體之間未觀察到交叉反應；(ⅱ)雖然不準確地知道，但MSP1p19的作用看來是足夠地重要，因為該分子不會顯著變化或被刪除而對寄生蟲無致死效果。(ⅲ)它是在所有裂殖子中發現的主要抗原，因此原則上它必定在甚至是低的寄生蟲血症時可被檢測並與寄生蟲血症成比例。(ⅳ)由於來自杆狀病毒的重組MSP1p19分子看來重現了MSP1p19天然結構的大部分，因此針對該蛋白產生的抗體將很好地適應於診斷用途。
1996年2月1日根據布達佩斯條約Rule 6.1條，下面指出的微生物已以下面的登記號被保藏指稱代號 登記號PvMSP1p19A1-1659PvMSP1p19S1-1660
PfMSP1p19A1-1661PfMSP1p19S1-1662PcMSP1p19S1-1663本發明還涉及這些抗體尤其是固定在固體載體上(例如用於親和層析)的抗體用於純化起初包含在混合物中的p19類肽的用途。
純化指將該混合物與抗體接觸，解離抗原-抗體複合物並回收純化的p19類型的肽。
本發明還涉及疫苗組合物，其也包括蛋白或片段的混合物，尤其是這類混合物·惡性瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p19；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42，如果需要，後者失去其最可變的區域；·間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要，後者失去其最可變的區域；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42，如果需要，後者失去其最可變的區域，和間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要，後者失去其最可變的區域。
在這種情況中，最可變的區域被定義為區域Ⅰ或區域Ⅱ及區域Ⅲ的全部或一部分，優選除去的區域Ⅲ的部分是與區域Ⅱ並列的部分(保守部份位於p33 C-末端這一側，與p19靠近)。區域Ⅱ和Ⅲ示於圖4中。
本發明不局限於生產人疫苗。它還可適用於使用來自感染哺乳動物的寄生蟲的相應蛋白或抗原及在相同條件下的產物生產獸醫疫苗組合物。已知相同類型的感染巴貝蟲病還出現在牛、豬和馬中。巴貝蟲屬種類的一種抗原與MSP-1的蛋白部分有高度的構象一致性(尤其是在兩個EFG樣和富含半胱氨酸區)和功能一致性〔(36),(37)和(38)〕。
已描述了使用抗這些寄生蟲的可溶性抗原的獸醫疫苗(39)。
不言而喻用於這些混合物中的p19在分別考慮時也可如前面所述地進行修飾。
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本發明還涉及分泌選擇性識別感染人的非間日瘧原蟲的瘧原蟲屬類寄生蟲的裂殖子形式中的MSP-1蛋白的p19而不識別間日瘧原蟲的特異性抗體的雜交瘤。
尤其是，這些雜交瘤分泌不識別間日瘧原蟲p19並特異性識別惡性瘧原蟲p19的單克隆抗體。
本發明還涉及一種雜交瘤，其特徵在於它產生特異性識別間日瘧原蟲的p19和猴瘧原蟲的p19的特異性抗體。F10-3雜交瘤從產生識別間日瘧原蟲p42糖蛋白的IgG 2b/k的X63 Ag8653骨髓瘤構建。
權利要求
1．一種重組蛋白，其必要組成性多肽序列為·感染哺乳動物尤其是人的非間日瘧原蟲的瘧原蟲屬類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)C-末端片段的序列，該C-末端片段通常在感染周期中其進入人紅細胞的穿透階段末期仍然錨定在寄生蟲表面；·或仍能誘導可在體內抑制由於相應的寄生蟲導致的寄生蟲血症的免疫應答的該片段的一部分的序列；·或能誘導與由所述p19片段或該片段的所述部分產生的等價的細胞和/或體液免疫應答的肽的序列；和所述重組蛋白可能進一步包含在還原介質中不穩定的並組成對抗相應瘧原蟲而形成的人抗血清所識別的大部分表位的構象表位。
2．根據權利要求1的重組蛋白，其特徵在於當它為非還原狀態或非不可逆還原狀態時，它可被抗相應瘧原蟲或抗同源的瘧原蟲而形成的人抗血清識別，但當它為不可逆還原狀態時，它不能被這些相同的抗血清識別或僅在很小程度上被識別。
3．根據權利要求1或2的蛋白，其特徵在於它抑制人抗血清與在相同條件下產生的相應的p42以及p42本身的免疫反應性，而p42僅可部分抑制所述人抗血清對p19的反應性。
4．根據權利要求1-3任一項的重組蛋白，其特徵在於它基本上失去了正常位於p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上遊的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相應p42中p33該側與p19相連，所述p33的最後C-末端多肽序列當存在時包含少於50個胺基酸殘基。
5．根據權利要求1-3任-項的重組蛋白，其特徵在於它基本上失去了正常位於p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上遊的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相應p42中p33該側與p19相連，所述p33的最後C-末端多肽序列當存在時包含少於10個胺基酸殘基。
6．根據權利要求1-3任一項權利要求的重組蛋白，其特徵在於它基本上失去了正常位於p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上遊的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相應p42中p33該側與p19相連，所述p33的最後C-末端多肽序列當存在時限於保留感染人的瘧原蟲如惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲中的相當程度的保守性的序列。
7．根據權利要求1-6任一項的重組蛋白，其特徵在於p19片段的所述部分包含通常包含在該p19中的兩個EGF區域中的至少一個。
8．根據權利要求1-7任一項的重組蛋白，其特徵在於所述p19片段或p19片段的所述部分的分子量為10-25kDa，尤其是10-15kDa。
9．根據權利要求1-8任一項的重組蛋白，其特徵在於它還包含使p19片段能錨定在表達所述重組蛋白的宿主細胞上的糖基磷脂醯肌醇(GPI)基團，其中宿主細胞尤其是真核細胞，優選可被杆狀病毒感染的昆蟲細胞。
10．根據權利要求1-8任一項的重組蛋白，其特徵在於它失去了極其疏水的C-末端部分，該C-末端部分參與誘導將所述重組蛋白錨定至表達它的宿主的細胞膜上，其中宿主細胞尤其是真核細胞，優選為可被杆狀病毒感染的昆蟲細胞。
11．根據權利要求10的重組蛋白，其特徵在於它為水溶性的。
12．根據權利要求1-11任一項的重組蛋白，其特徵在於它包含惡性瘧原蟲的MSP-1蛋白的p19序列或相應片段的所述部分。
13．根據權利要求1-12任一項的重組蛋白，其特徵在於它包含猴瘧原蟲的MSP-1蛋白的p19序列或相應片段的所述部分。
14．根據權利要求1-13任一項的重組蛋白的寡聚體。
15．根據權利要求14的寡聚體，其特徵在於它包含如權利要求1-13任一項中定義的重組蛋白的所述多肽序列的2-50個單體單位。
16．根據權利要求1-14任一項的重組蛋白，其特徵在於它與用於生產疫苗的載體分子結合。
17．一種抗感染人的瘧原蟲類寄生蟲的接種組合物，它包含作為活性成分的重組蛋白，該重組蛋白的必要組成性多肽序列為·感染人的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)的C-末端片段的序列，其中在感染周期中的進入人紅細胞的穿透階段的末期，所述C-末端片段通常仍錨定在寄生蟲表面；·或任能誘導可在體內抑制由於相應的寄生蟲導致的寄生蟲血症的免疫應答的該片段的一部分的序列；·或能誘導與由所述p19片段或該片段所述部分產生的等價的細胞和/或體液免疫應答的肽的序列；和所述重組蛋白進一步包含在還原介質中不穩定，並組成由抗相應瘧原蟲而形成的人抗血清所識別的大部分表位的構象表位。
18．根據權利要求17的接種組合物，其特徵在於其活性成分由根據權利要求2-13任一項或16的重組蛋白，或根據權利要求14或權利要求15的寡聚體組成。
19．一種抗感染人的瘧原蟲類寄生蟲的接種組合物，其包含作為活性成分的根據權利要求17或權利要求18的重組蛋白的寡聚體。
20．一種抗體，其特異性識別感染人的非間日瘧原蟲的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的MSP-1蛋白的p19，並且它不識別間日瘧原蟲。
21．根據權利要求20的抗體，其特徵在於它為單克隆的。
22．根據權利要求20的抗體，其特徵在於它為單克隆抗體，並且在於它特異性識別惡性瘧原蟲的p19。
23．根據權利要求20的單克隆抗體，其特徵在於它特異性識別間日瘧原蟲的p19。
24．一種區分由間日瘧原蟲導致的寄生蟲感染和由其它瘧原蟲導致的寄生蟲感染的區別診斷方法，其特徵在於將被瘧原蟲感染的生物樣品與根據權利要求23的抗體和與根據權利要求21或權利要求22的抗體接觸，並依情況檢測免疫反應的產生或未產生。
25．一種重組杆狀病毒類型的修飾載體，其在包含於所述載體中並被所述載體轉化的細胞識別的啟動子的控制下，包含編碼可與杆狀病毒系統中的表達相容的信號肽的第一核苷酸序列，其特徵在於第二核苷酸序列位於第一核苷酸序列下遊，也受所述啟動子的控制並編碼肽序列·感染人類的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19千道爾頓(p19)的C-末端片段的序列，在感染周期中，該C-末端片段在進入紅細胞的穿透階段的末期通常仍然被錨定在寄生蟲表面；·或該肽片段的一部分，前提是第二序列在杆狀病毒系統中的表達產物仍能誘導可抑制體內由於相應寄生蟲導致的寄生蟲血症的免疫應答；·或能誘導等價於由所述p19肽片段或所述肽片段部分產生的應答的細胞和/或體液免疫應答的肽；和所述核苷酸序列具有構成它的全部核苷酸的40％-60％範圍的G和C含量，優選至少50％。
26．根據權利要求25的修飾載體，其特徵在於所述第二個多肽序列與在權利要求2-13任一項中定義的一致。
27．根據權利要求2S的修飾載體，其特徵在於第二個核苷酸序列為合成序列。
28．根據權利要求25-27任一項的修飾載體，其特徵在於第一核苷酸序列編碼來自間日瘧原蟲並通常與瘧原蟲MSP-1蛋白相連的信號肽。
29．根據權利要求25-28任一項的修飾載體，其特徵在於第二核苷酸在3′末端失去疏水性的C-末端的最後序列，該序列參與誘導將所述重組蛋白錨定至表達它的宿主的細胞膜上，尤其是可被杆狀病毒感染的昆蟲細胞。
30．根據權利要求25-29任一項的修飾載體，其特徵在於它由修飾的杆狀病毒組成。
31．一種生物體，尤其是Sf9型昆蟲細胞，其可被並且已被根據權利要求25-29任一項的修飾載體轉染。
32．含有第一核苷酸序列的合成DNA，其中第一核苷酸序列的至少一部分編碼下列肽序列·惡性瘧原蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1)的19kDa(p19)的C-末端片段的序列，其中在感染周期中的其進入人紅細胞的穿透階段的末期，所述C-末端片段通常錨定在寄生蟲表面；·或該肽片段的一部分的序列，前提是所述DNA在杆狀病毒系統中的表達產物仍能誘導在體內可抑制由於相應寄生蟲而導致的寄生蟲血瘧的免疫反應；·或能誘導與由所述p19肽片段或該片段的所述部分產生的等價的細胞和/或體液類型的免疫應答的肽的序列；和所述核苷酸序列還具有佔組成所述合成DNA的核苷酸總量的40-60％，優選至少50％的G和C核苷酸含量。
33．根據權利要求32的合成DNA序列，其特徵在於其第一核苷酸序列在其3′末端失去了編碼疏水C-末端最後區域的序列，該疏水性C-末端最後的區域通常參與誘導將p19蛋白錨定至表達它的宿主的細胞膜上，尤其是可被杆狀病毒轉化的昆蟲細胞。
34．根據權利要求32或權利要求33的合成DNA序列，其特徵在於第一核苷酸序列之前是編碼通常與瘧原蟲MSP-1蛋白相連的信號肽的信號核苷酸序列，其與主要序列同源或異源。
35．根據權利要求34的合成DNA序列，其特徵在於信號序列來自間日瘧原蟲。
36．根據權利要求32-35任一項的合成DNA，其特徵在於所述第一核苷酸序列包括編碼多肽細胞膜錨定區的3′-末端序列，所述錨定區將表達的重組蛋白固定至用含所述合成DNA的載體轉化的宿主細胞的膜表面，其中所述3′-序列與主要核苷酸序列同源，或是異源的，尤其是來自間日瘧原蟲的序列。
37．根據權利要求36的合成DNA，其特徵在於3′-末端序列來自間日瘧原蟲。
38．根據權利要求32-36任一項的合成DNA序列，其特徵在於它失去了所述3′-末端序列。
39．根據權利要求25的杆狀病毒類型的載體，其特徵在於它選自·以登記號I-1659保藏在CNCM〔全國微生物培養物保藏中心〕的病毒；·以登記號I-1660保藏在CNCM的病毒；·以登記號I-1661保藏在CNCM的病毒；·以登記號I-1662保藏在CNCM的病毒；·以登記號I-1663保藏在CNCM的病毒。
40．分泌具有權利要求21-23任一項的抗體的特徵的單克隆抗體的雜交瘤。
41．一種從肽混合物中分離具有指定特異性的p19肽的方法，其特徵在於通過將所述肽混合物與根據權利要求20-23任一項的相應抗體接觸，優選為已固定在不可溶載體上的抗體，接著解離所形成的抗原-抗體複合物，並回收純化的p19肽。
42．根據權利要求1-13任一項的蛋白質或根據權利要求15或16的寡聚體在製備可誘導抗瘧原蟲感染的免疫應答的免疫原組合物中的用途。
43．一種疫苗組合物，包含作為活性成分的根據權利要求1-13任一項的蛋白與需要時至少除去了保守性較差部分的相應的p42，或來自與產生所述蛋白同源的寄生蟲的另一重組p19或p42類蛋白的混合物。
44．根據權利要求23的疫苗組合物，其特徵在於活性成分的混合物選自下面的混合物·惡性瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p19；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42；·間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要，去除了其最可變區；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42，如果需要，去除了其最可變區，和間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要去除了其最可變區。
45．根據權利要求40的雜交瘤，其特徵在於它已於1997年2月14日保藏在CNCM(巴黎，法國)，登記號為I-1846。
全文摘要
本發明涉及一種在杆狀病毒系統中製備的重組蛋白,其必要組成性多肽序列為感染人的瘧原蟲屬類寄生蟲尤其是惡性瘧原蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP－1蛋白)的19kDa(p19)C－末端片段的序列,該C－末端片段通常在感染周期中其進入人紅細胞的穿透階段末期仍然錨定在寄生蟲表面。所述重組蛋白可用於生產抗瘧疾的疫苗。
文檔編號C12N5/10GK1222936SQ97193033
公開日1999年7月14日 申請日期1997年2月14日 優先權日1996年2月14日
發明者S·朗加克裡-安德裡, C·羅斯, F·納託, J·W·巴恩維爾, K·曼迪斯 申請人:巴斯德研究所, 紐約大學