抗癌及抗感染性疾病組合物及其使用方法
2023-07-10 03:40:51
專利名稱：抗癌及抗感染性疾病組合物及其使用方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤治療領域，更具體地說，本發明涉及非致病性病毒作為有效抗癌藥物的應用。
背景技術：
縮寫單詞表A549 -人肺上皮腫瘤細胞系AcNPV-苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒BMDC -骨髓衍生的樹突細胞BV422-表達CCL21的重組杆狀病毒BV762-表達Raf的重組杆狀病毒CCL21-C-C基序配體21趨化因子；次級淋巴組織趨化因子CD86 -樹突細胞成熟的標記物CR -完全有效CTL -細胞毒T細胞溶解DC -樹突細胞FACS -螢光激活細胞分選GM-CSF -粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子GV -顆粒體病毒HIV -人免疫缺陷病毒i.t. -腫瘤內mCCL21 -鼠CCL21MHC -主要組織相容性複合物MHCII-MHCII類分子MLA-DR -MHCI類分子抗原MOI -感染複數NPV -核型多角體病毒
PBMC-外周血單核細胞PFU -噬斑形成單位qd -每天每天(每日給藥)rhCCL21 -重組人CCL21s.c.-皮下注射Sf(Sf9) -草地夜蛾Tn(Tn5) -粉紋夜蛾UV -紫外線VLP -病毒樣顆粒發明背景調節免疫應答已經成為一種重要的腫瘤治療策略。目前在設計腫瘤疫苗及免疫治療措施時注意力主要集中在鑑定腫瘤細胞特異性的抗原上。利用腫瘤特異性抗原或表達腫瘤特異性抗原的基因所具有的獨特的腫瘤免疫原性可以通過疫苗免疫來誘導出腫瘤特異性的免疫應答。疫苗接種方法也包括適應性細胞免疫治療方法，其中抗原提呈細胞經改造後可提呈腫瘤相關抗原。其他的腫瘤免疫治療措施包括給予細胞因子和趨化因子，這些因子在抗腫瘤治療中可作為佐劑或藥物產生療效，因為它們具有擴增和補充免疫效應細胞的能力。見Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2175-84；Parmiani等，(2002)J Natl Cancer Inst 94805-18；Bronte(2001)Curr Gene Ther153-100；以及Fehniger等，(2002)Cytokine Growth Factor Rev 13169-83。
免疫治療措施雖然具有上述優點，但是要想取得成功還受到下列因素的限制(1)腫瘤特異性的抗原性，因此這種治療方法還只限於某些類型的腫瘤；(2)腫瘤細胞提呈抗原的能力弱；以及(3)腫瘤細胞可以產生免疫抑制因子來逃避免疫監視。因此，在本領域中一直需要找到一種有效而廣譜的腫瘤治療措施。為了滿足這一需求，本發明提供了新型的免疫刺激方法以治療和預防腫瘤。
發明概述本發明提供了誘導動物產生免疫應答的方法，該方法包括給予動物一定量的組合物，該組合物包含能有效誘導動物產生免疫應答的滅活的非致病性病毒。
本發明還提供了導致細胞死亡的方法，該方法包括將含有一定量的非致病性病毒的組合物給予細胞以導致細胞的死亡。
另外，本發明還提供了在動物體內刺激CTL反應的方法，該方法包括將含有一定量的非致病性病毒的組合物給予動物以刺激動物體內的CTL反應，其中非致病性的病毒是昆蟲特異性病毒。
本發明提供了抑制動物體內腫瘤生長的方法，該方法包括將一定量的含有昆蟲特異性的非致病性病毒的組合物給予動物以有效抑制動物體內腫瘤的生長。
本發明還提供了影響動物體內腫瘤緩解的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動物以有效地影響腫瘤的緩解。
本發明還提供了抑制動物體內腫瘤轉移的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動物以有效地抑制腫瘤在動物體內的轉移。
本發明提供了使動物對再次接種的腫瘤耐受的方法，該方法包括將含有非致病性病毒的組合物給予動物。
另外，本發明還提供了抑制動物體內的非腫瘤性增生性疾病的方法，該方法包括將含有非致病性病毒的組合物給予動物。
本發明還提供了抑制動物體內的異常增生或化生的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動物以有效地抑制動物體內的異常增生。
本發明還提供了抑制患病個體的一種或多種腫瘤症狀的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予患病個體以有效地抑制其體內的一種或多種腫瘤症狀。
另外，本發明還提供了保護動物不受感染性疾病感染的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性滅活病毒的組合物給予動物以有效地保護動物不受感染性疾病的感染。
本發明還提供了抑制動物體內感染性疾病的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動物以有效地防止動物發生感染性疾病。
本發明提供了導致一群細胞發生死亡的方法，該方法包括使細胞群中的部分細胞與含有一定量的非致病性病毒的組合物接觸以有效地導致該細胞群發生細胞死亡。
本發明提供了治療疾病患者疾病的方法，該方法包括滅活非致病性病毒，其中非致病性病毒通過加入濃度約為5-10μg/ml的trioxalen並在約365nm和6W的紫外線下照射15分鐘加以滅活，將滅活的非致病性病毒製備成藥物組合物；以及將藥物組合物給予患者。
本發明還提供了預測一種化合物在體內的抗腫瘤活性的方法，該方法包括使化合物與腫瘤細胞和外周血單核細胞接觸；以及測定腫瘤細胞的死亡率。能引起被接觸腫瘤細胞死亡的化合物被認為是具有體內活性的化合物。
另外，本發明提供了阻止個體產生腫瘤的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予個體以有效地防止個體發生腫瘤。
另外，本發明提供了包含非致病性病毒和外周血單核細胞(PBMC)的組合物。
本發明還提供了包含非致病性病毒的組合物，其中的非致病性病毒至少通過兩種不同的方法滅活。
本發明還提供了包含非致病性病毒和至少一種PBMC的組合物，其中的非致病性病毒用選自如下一組的兩種或兩種以上的方法滅活基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
本發明提供了製備包含非致病性病毒的抗腫瘤或抗感染性疾病組合物的過程。該過程包括將病毒暴露於第一滅活劑以有效地滅活活性病毒，將病毒暴露於第二滅活劑以有效地滅活活性病毒，將病毒與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合，以及用體外試驗證明病毒是無活性的。
本發明還提供了包含一種非致病性的滅活病毒和至少一種抗原以及至少一種佐劑的藥物組合物，其中的抗原與非致病性的滅活病毒明顯不同。
另外，本發明還提供了包含佐劑組合物的免疫刺激組合物。佐劑組合物含有非致病性的滅活病毒和至少一種抗原。該抗原與佐劑組合物不同，另外，免疫刺激組合物還能夠提高機體對抗原的免疫應答。
本文所描述的方法涉及人體的治療，但是這些方法也可用於治療需要治療的任何哺乳動物。在某些實施方式中，可用本發明的方法治療或預防的腫瘤和非腫瘤性疾病包括而不限於肺、乳腺和皮膚的腫瘤和非腫瘤性疾病。在某些實施方式中，感染性疾病也可被治療或預防，其中包括病毒感染。
本發明還提供了可用於本文所描述的抗癌方法中的非致病性病毒，這些非致病性病毒包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。在某些實施方式中，病毒成分包括肽、蛋白、核酸、脂質、糖及其混合物。在某些實施方式中，病毒成分是gp16。
在某些實施方式中，非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。在某些實施方式中，昆蟲特異性病毒是杆狀病毒科的病毒。例如，本發明的非致病性病毒包括核型多角體病毒或顆粒體病毒。在某些實施方式中，非致病性的病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
在某些實施方式中，為了治療腫瘤將非致病性病毒以及選擇添加的抗原和/或佐劑通過瘤內注射和/或瘤旁註射給予哺乳動物受試者。在某些實施方式中，為了治療非腫瘤性增生性疾病將非致病性病毒以及選擇添加的抗原和/或佐劑通過病變部位內注射和/或病變部位旁註射給予哺乳動物受試者。治療方案可以是多次注射非致病性病毒，還可以選擇添加其他抗癌治療措施。
附圖簡述
圖1是一個線形圖，描述的是表達CCL21的杆狀病毒可在3LL肺癌鼠模型內抑制腫瘤的生長以及誘導腫瘤的完全緩解。如實施例2所描述，CCL21給藥方案包括以所示的濃度在瘤內注射6次。隨著注射劑量的增加腫瘤被抑制的程度及完全有效發生的機率也增加。24天時採集數據進行單因子變異數分析(One way ANOVAanalysis)。白蛋白組與治療組相比P＜0.001；25μg mCCL21組與6μg/Alb mCCL21組相比P＜0.01；25μg mCCL21組與25μg rhCCL21組相比P＞0.05。mCCL21，鼠CCL21；rhCCL21，重組人CCL21；B Gold，杆狀病毒表達的重組鼠CCL21，作為參考點(「GoldStandard」)；Alb，白蛋白；qd，每天(每日給藥)；CR，完全有效。
圖2是一個線形圖，描述的是注射表達CCL21的杆狀病毒後4T1乳腺癌鼠模型中腫瘤生長的抑制，如實施例3所描述。rhCCL21，重組人CCL21；qd，每天(每日給藥)。
圖3是一個柱形圖，描述的是注射表達CCL21的杆狀病毒後自發性4T1肺癌轉移的抑制，如實施例6所描述。實心柱，未進行腫瘤手術切除的動物；陰影線柱，最末一次注射CCL21後1天進行腫瘤手術切除的動物。
圖4是一個線形圖，描述的是給予表達CCL21的杆狀病毒可以使動物對再次接種的腫瘤耐受，如實施例5所描述。簡言之，在Balb/c小鼠體內建立4T1腫瘤，其中一部分小鼠通過在瘤內注射表達CCL21的杆狀病毒進行治療。最後一次注射CCL21後1天，通過手術切除腫瘤。切除腫瘤後1天，在原腫瘤部位的對側皮下注射4T1細胞給小鼠再次接種腫瘤。空白鼠是指未進行腫瘤接種也未進行CCL21處理的小鼠；Alb+Surg+Re-chlg，先接種T41腫瘤再進行白蛋白處理的小鼠；hCCL21+Surg+Re-chlg，先接種T41腫瘤再進行CCL21處理的小鼠。在Alb+Surg+Re-chlg組中，10隻小鼠中有1隻對腫瘤具有完全的抵抗力。在hCCL21+Surg+Re-chlg組，10隻小鼠中有6隻對腫瘤具有完全的抵抗力。
圖5A-5B說明了杆狀病毒誘導的對再接種腫瘤的抵抗力。在3LL腫瘤模型中，用表達CCL21的杆狀病毒成功處理的動物對同種腫瘤的再次接種具有抵抗力，生存期延長。圖5A總結了一個試驗的結果，在該試驗中，用表達鼠重組CCL21的杆狀病毒處理後動物體內的腫瘤完全緩解(見圖1)，在最後一次給予表達CCL21的杆狀病毒後60、70和80天在原腫瘤位置的對側給小鼠再次接種同種腫瘤。在至少70天內動物對再次接種的腫瘤具有抵抗力。圖5B總結了另一個試驗的結果，在該試驗中，用表達CCL21的杆狀病毒處理誘導腫瘤完全緩解(″腫瘤加強″)後30天給動物接種腫瘤，然後在最後一次給予表達CCL21的杆狀病毒後80、120、160和200天在原腫瘤位置的對側給小鼠再次接種同種腫瘤。這些結果表明利用腫瘤加強可使動物在至少200天內對再次接種的腫瘤具有抵抗力。
圖6是一個線形圖，描述的是酵母或大腸桿菌產生的CCL21在3LL肺癌模型中不能誘導腫瘤緩解。hCCL21-B(HBPG1)，杆狀病毒表達的重組人CCL21，lot#HBPG1；hCCL21-B 1/2(HBPG1)，杆狀病毒表達的重組人CCL21，lot#HBPG1，稀釋到hCCL21(HBPG1)濃度的一半；hCCL21-B conc.(HBPG1)，來源於濃縮溶液(10mg/ml)的杆狀病毒表達的重組人CCL21，lot#HBPG1；hCCL21-Y(HYPG4)，酵母表達的重組人CCL21，lot#HYPG4；hCCL21-E(HEDS4)，大腸桿菌表達的重組人CCL21，lot#HEDS4；qd，每天(每日給藥)。用白蛋白處理的小鼠與用hCCL21-B或hCCL21-B new處理的小鼠相比，其腫瘤的生長受到抑制，P＜0.01；與用hCCL21-B conc或hCCL21-B1/2處理的小鼠相比，其腫瘤的生長也受到抑制，P＜0.05。
圖7是一個線形圖，描述的是在體內無活性的杆狀病毒表達的CCL21製劑在體外的趨化活性。趨化活性的分析基本按照PCT國際專利文獻WO 00/38706描述的方法進行。體內活性的評價描述於實施例2-6。HBDS2.p，杆狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBDS2.p；MBDS2.c，杆狀病毒來源的重組鼠CCL21，lot#MBDS2.c；HBPG1，杆狀病毒來源的重組人CCL21，lot# HBPG1；HBPG1+HBDS2.vp，用乙烯吡啶處理的等比例的HBPG1和HBDS2混合物；HYPG4，酵母來源的重組人CCL21，lot#HYPG4；HEDS4，大腸桿菌來源的重組人CCL21，lot#HEDS4。
圖8描述的是一個蛋白質印跡試驗結果，其中所示的樣品與抗gp64抗體雜交。條帶1，純化的杆狀病毒；條帶2，未感染的Tn5細胞培養物的條件培養基；條帶3，感染野生型杆狀病毒的Tn5細胞培養物的條件培養基；條帶4，感染表達重組人CCL21的BV422的Tn5細胞培養物的條件培養基；條帶5，未感染的Tn5細胞團；條帶6，感染野生型杆狀病毒的Tn5細胞團；條帶7，感染BV422的Tn5細胞團；條帶8，杆狀病毒來源的人重組CCL2，lot#HBPG1過濾液，去掉＞50kDa(5μg蛋白質)的雜蛋白；條帶9，含有＞50kDa(5μg蛋白質)雜蛋白的條帶8的樣品過濾液殘留物；條帶10，含有雜蛋白(10μg蛋白質)的條帶8的樣品過濾液殘留物；條帶11，5μg未過濾的杆狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBPG1；條帶12，5μg未過濾的杆狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBDS4；條帶13，5μg未過濾的杆狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBMCl；條帶14，5μg未過濾的杆狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBDS1。
圖9是一個線形圖，描述的是經過過濾去掉高分子雜蛋白後的杆狀病毒表達的CLL21的抗腫瘤活性。純化的杆狀病毒是CCL21製備物的汙染物(圖8)，與杆狀病毒表達的CCL21製備物具有一樣的腫瘤抑制活性。
圖10A是一個線形圖，描述的是當腫瘤細胞在體外與所示的組合物接觸後PBMC介導的對腫瘤細胞的毒性，如實施例8所描述。細胞團所誘導的細胞毒反應比細胞上清液所誘導的細胞毒反應要高很多。感染表達CCL21的杆狀病毒或對照杆狀病毒BV762的細胞都表現出明顯的細胞毒活性。GAM，未用細胞培養物調整的生長分析培養基(對照)；BV422，表達CCL21的杆狀病毒；V762，表達Raf的杆狀病毒。
圖10B是一個線形圖，描述的是當腫瘤細胞在體外與所示的經0.2μm濾膜過濾的組合物接觸後PBMC介導的對腫瘤細胞的毒性，如實施例8所描述。通過過濾去掉高分子物質可使細胞毒活性顯著下降。細胞團樣品顯示出殘留的低度到中度的細胞毒活性。
圖11A是一個柱形圖，描述的是樹突細胞經所示的刺激後CD86和MHC II表達的變化。實施例9描述了鼠骨髓衍生的樹突細胞的製備方法和分析方法。表達HIV gag蛋白(VLP)的痘苗病毒作為陽性對照。與VLP一樣，活的杆狀病毒可誘導CD86和MHC II的表達，這兩個分子是DC成熟的標誌。黑色柱，CD86的表達；灰色柱，MHC II的表達。
圖11B是一個柱形圖，描述的是樹突細胞經所示的刺激後CD86和MHC II表達的變化。實施例9描述了人單核細胞來源的樹突細胞的製備方法和分析方法。表達HIV gag蛋白(p55 VLP)的痘苗病毒作為陽性對照。與p55 VLP一樣，活的杆狀病毒可誘導DC的成熟。黑色柱，CD86的表達；灰色柱，HLA-DR的表達。
圖12描述的是鉻釋放試驗的結果，試驗方法見實施例10的描述。表達HIV gag蛋白(VLP)的痘苗病毒作為陽性對照。與VLP一樣，活的杆狀病毒可作為一種高效的佐劑誘導細胞毒T細胞的殺傷活性。
圖13描述的是當腫瘤細胞在體外與所示的組合物接觸後PBMC介導的對腫瘤細胞的毒性，如實施例8所描述。
圖14描述的是PBMC細胞毒活性與體內抗腫瘤活性的關係。
圖15描述的是用抗gp64單克隆抗體阻斷杆狀病毒的腫瘤細胞殺傷效應。見實施例13。
圖16描述的是滅活杆狀病毒在體外誘導的PBMC介導的腫瘤細胞殺傷作用。見實施例14。
圖17表明腫瘤細胞是杆狀病毒的主要靶位。見實施例15。
圖18描述的是杆狀病毒在肺癌動物模型中的腫瘤生長抑制效應。見實施例16。
圖19描述的是杆狀病毒在體內和體外誘導的對致病性病毒感染的保護作用。細胞在體外和體內用水泡性口炎病毒(VSV)感染。見實施例17。
圖20描述的是旁觀者效應。當腫瘤細胞群中20％的細胞與杆狀病毒接觸後就可以達到最大殺傷效應。
發明詳述A1.非致病性病毒的抗腫瘤活性治療腫瘤的免疫學方法包括以趨化因子作為治療性藥物。趨化因子是一族同源性蛋白質，其功能包括(a)介導淋巴細胞的遷移和活化；(2)調節血管生成；(c)以及維持免疫平衡和次級淋巴器官的結構。見Baggiolini等，(1997)Annu Rev Immunol 15675-705；Jung Littman(1999)Curr Opin Immunol 11319-25；以及Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2175-84。
如實施例1-6所描述，在研究利用次級淋巴組織趨化因子(本文稱為「CCL21」；本領域中也被稱為SLC、Exodus-2和6C-kine)進行腫瘤的免疫治療的過程中，本發明的發明者驚奇地發現非致病性的病毒是具有高活性的抗腫瘤因子。見實施例7。
因此，本發明提供了方法以治療需進行抗癌治療的患者，其中包括通過給予患者非致病性的病毒以抑制腫瘤的生長，抑制腫瘤的轉移以及誘導對腫瘤抵抗力。值得注意的是，本文所描述的腫瘤治療方案不需要鑑別出腫瘤特異性的抗原。因此，非致病性病毒的應用範圍很寬，對多種類型的腫瘤都有療效。見實施例2-6。
雖然發明者不希望固定於特定的操作模式，但是發明者認為非致病性病毒的抗癌活性應該歸功於，至少部分歸功於其免疫刺激活性。例如，杆狀病毒在體外和體內都可誘導樹突細胞的成熟和細胞毒T細胞(CTL)反應。見實施例9-10。另外參見Gronowski等，(1999)J Virol.739944-51。
本文所用的術語「病毒」用於描述一種有效的抗腫瘤組合物，包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒體、病毒樣顆粒、病毒成分及其混合物。
病毒體和病毒樣顆粒(VLPs)通常包含非致病性病毒的一種或多種蛋白質，還可以選擇添加磷脂。在某些實施方式中，病毒體和VLPs是非複製型的，不含有任何的天然病毒基因組。病毒蛋白可以是通過重組方法製備的，也可以是從完整病毒中分離的。VLPs在下面的文獻中還有進一步描述WO 03/024480，WO 03/024481，Niikura等，(嵌合重組戊型肝炎病毒樣顆粒作為提呈外源表位的口服疫苗載體「ChimericRecombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle PresentingForeign Epitopes」，Virology(2002)293273-280)；Lenz等，(乳頭狀瘤病毒樣顆粒誘導樹突細胞的急性活化「Papilloma rivurs-Like Particles Induce Acute Activation ofDendritic Cells」，Journal of Immunology(2001)5246-5355)；Pinto等，(人乳頭狀瘤病毒(HPV)-16 L1誘導的細胞免疫應答，用重組HPV-16 L1病毒樣顆粒免疫健康志願者「Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 HealthyVolunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles」，Journal ofInfectious Diseases(2003)188327-338)；以及Gerber等，(人乳頭狀瘤病毒樣顆粒與大腸桿菌熱穩定性的外毒素突變體R192G或CpG聯合使用時是一種有效的口服免疫原「Human Papillomavirus Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens whenCoadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG」，Journal of Virology(2001)75(10)4752-4760)。病毒體在下面的文獻中有進一步的描述Gluck等，(未來開發疫苗的新技術平臺「New Technology Platforms in theDevelopment of Vaccines for the Future」，Vaccine(2002)20B10-B16)。
術語「活病毒」是指感染性與天然病毒相似或一樣的病毒。活病毒尤其可以感染其天然的宿主細胞。
術語「滅活病毒」是指在天然宿主細胞內無法複製的病毒，下文有進一步的描述。例如，非致病性的病毒在哺乳動物宿主細胞內不能複製，同樣被滅活後在其天然宿主細胞內也無法複製。使用滅活病毒可降低人們對使用活病毒安全性的擔心。「滅活劑」是指用於滅活病毒的試劑。
術語「病毒顆粒」是指天然形式經改造或修飾後的病毒，因而在天然宿主細胞內無複製能力。製備病毒顆粒的方法是本領域所熟知的。可通過電鏡、免疫原性分析和標準噬菌斑形成試驗來評價病毒樣顆粒的結構完整性和功能完整性。例如，Hamakubo等，WO 02/06305描述了去核杆狀病毒樣顆粒的製備方法。
美國專利No.5,750,383描述了利用標記獲救系統製備杆狀病毒顆粒的方法。該方法利用了遺傳修飾的杆狀病毒，這種病毒缺乏病毒複製所必需的基因(如gp64)，只能在能彌補其遺傳缺陷的細胞內繁殖。
術語『病毒包含體」是指包含多個包被在病毒編碼蛋白晶體內的病毒顆粒的結構。蛋白晶體一旦裂解，多個病毒顆粒就會釋放出來，每個病毒顆粒隨後都可以感染宿主細胞。
病毒，特別是杆狀病毒可用本領域熟知的技術製備。在體外用培養基培養克隆細胞系，接種病毒後在適於病毒複製的條件下孵育足夠的時間。培養條件如細胞密度、感染複數、時間、溫度、培養基等都不是關鍵的因素，本領域的技術人員可以很容易地確定選用何種條件。
製備杆狀病毒的典型方法見實施例1的描述，該方法利用了草地夜蛾(Sf)細胞。其他有代表性的宿主細胞及擴增方法見美國專利Nos.5,405,770(Heliothis subflexa細胞系)和6,379,958(草地夜蛾細胞系，該細胞系可提高杆狀病毒的產量)的描述。
經過孵育以後，產生出的病毒用本領域常規的技術回收，其中包括聚乙二醇(PEG)沉澱、超速離心以及色譜純化，例如利用離子交換樹脂、排阻層析、親和層析或結合使用。見美國專利申請No.2002/0015945(色譜純化)；美國專利No.6,194,192(病毒吸附到含硫酸巖藻糖的多糖上)。
術語「病毒成分」用於本文中是指非致病性病毒來源的保留了其親本活病毒的抗腫瘤和/或抗感染性疾病活性的分子。在某些實施方式中，病毒成分抗腫瘤活性的大小及特異性與其親本活病毒一樣。術語「病毒成分」包括病毒的任何成分，如蛋白、肽、核酸、脂質、糖及其他生物活性分子及其混合物。在某些實施方式中，病毒成分是gp64。
例如，病毒成分可以是病毒外殼蛋白或病毒核蛋白核心的DNA相關蛋白。典型的杆狀病毒外殼蛋白見如下文獻的描述Pearson等，(1988)Virology 167407-13；Summers Smith(1978)Virology 84390-402；Thiem Miller(1989)J Virol 632008-18以及Vialard Richardson(1993)J Virol 675859-66。典型的杆狀病毒DNA相關蛋白見Tweeten等(1980)J Virol 33866-876；Wilson等(1987)J Virol 61661-6以及Rohrmann(1992)J Gen Virol73(Pt 4)749-61的描述。
病毒成分還可以是存在於病毒包含體內的蛋白和多糖，其中包括成熟包含體的包含體基質以及花萼外層。典型的杆狀病毒包含體蛋白包括多角體和花萼。
本文說明非致病性病毒具有很高的抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性，本領域的技術人員在閱讀本說明書後可以很容易地鑑定、純化或者製備和使用具有親本活病毒抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性的病毒成分。例如，美國專利No.6,001,806描述了一種生物化學方法，該方法首先裂解杆狀病毒感染的昆蟲細胞並分離其中的不同組分，然後利用其中的洗脫組分鑑定可被親本活病毒識別的具有抗病毒活性的糖蛋白。
另外，利用本領域熟知的重組方法可以很容易地製備病毒蛋白和核酸，並且同樣可以檢測其抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性。例如，病毒核酸可被克隆、合成、改變、突變等。用於分離核酸的標準重組DNA和分子克隆技術在下列參考書中有描述Sambrook等(編)(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Silhavy等，(1984)基因融合試驗技術(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover Hames(1 995)DNA克隆操作方法(DNA CloningA Practical Approach)，第二版，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford/New York；以及Ausubel(編)(1995)分子生物學簡明手冊(ShortProtocols in Molecular Biology)，第三版，Wiley，New York。重組製備的多肽也可以用本領域技術人員所熟知的多種標準方法純化和鑑定，見Schrder Lübke(1965)肽(The Peptides)，Academic Press，New York；Schneider Eberle(1993)肽1992第22界歐洲多肽論壇論文集(Peptides，1992Proceedings of the Twenty-SecondEuropean Prptide Symposium)，9月13-19日，1992，Interlaken，Switzerland.Escom，Leiden；Bodanszky(1993)肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，第二版，Springer-Verlag，Berlin，New York；以及Ausubel(編)(1995)分子生物學簡明手冊(Short Protocois in Molecular Biology)，第三版，Wiley，New York。
特別是AcNPV完整序列已經清楚(Kool和Vlak，1993)，因此利用已知的方法可以很容易地系統分析所有的AcNPV蛋白，包括重組表達和抗腫瘤活性的檢測。
為了更容易地鑑定具有活性的病毒成分，本發明還提供了一種體外分析方法用於篩選候選病毒成分。見實施例8。該分析方法包括用外周血單核細胞(PBMC)誘導細胞毒活性。如本文所描述，非致病性病毒可誘導PBMC對腫瘤細胞的細胞毒活性，這種活性與其在體內所觀察到的抗腫瘤活性是相關的。候選病毒成分包括非致病性病毒的生化組分、純化的或重組的病毒蛋白、純化的或合成的核酸、病毒體、病毒樣顆粒等。
本文所用的術語「非致病性的」用於描述病毒，是指該病毒不能感染其哺乳動物宿主，在某些實施方式中，非致病性病毒不能感染任何哺乳動物宿主。在某些實施方式中，非致病性病毒對人沒有感染性。為了便於描述，除非特別說明，術語「非致病性的」病毒包括滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒體、病毒樣顆粒、病毒成分及其混合物。
術語「感染性」通常是指對宿主細胞或生物體有害的特性，例如通過基因的表達和/或通過在宿主內的複製對宿主細胞或生物體造成損傷。與此定義相一致的是，非致病性並不排除可以進入哺乳動物細胞，但是進入以後對宿主細胞或生物體的健康沒有影響。然而在某些實施方式中，非感染性的病毒不能進入哺乳動物細胞。
非致病性病毒如杆狀病毒在哺乳動物宿主細胞內是轉錄靜止的。因此，在某些實施方式中，非致病性病毒是一類被目前的基因治療方法排除在外的病毒，因為其攜帶的外源基因也不表達。
非致病性病毒的例子包括而不限於昆蟲特異性病毒、兩棲動物特異性病毒以及植物特異性病毒。可用於本文所描述的方法中的典型病毒包括杆狀病毒家族的病毒(例如核型多角體病毒(NPV)，其中包括苜蓿銀紋夜蛾NPV，以及顆粒體病毒(GV)，其中包括草地夜蛾顆粒體病毒)，多分DNA病毒科的病毒(如姬蜂病毒(ichnoviruses)，其中包括Campoletis sonorensis virus，以及繭蜂病毒(bracoviruses)，其中包括CotesiaMelanoscela virus)，囊泡病毒，四病毒科和羅達病毒科(如野田村病毒，其中包括日本庫蚊病毒和禽獸棚病毒(Flock House Virus))。可用於本發明的許多非致病性病毒在昆蟲中都可以找到。見Fields等編，(1996)，Virology，Lippincott-Rave Publishers，Philadelphia，Pennsylvania。
術語「感染性疾病」是指對其宿主有害的因子(如病毒、真菌或細菌)。在某些實施方式中是指對人有害的因子。「抗感染性疾病」的措施是指可預防、改善或根除感染性疾病和/或其致病因子的治療措施。
感染性疾病的例子包括而不限於HIV、西尼羅河病毒、甲型、乙型、C型肝炎、天花、結核、水泡性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、SARS、流感、伊波拉病毒、病毒性腦膜炎、皰疹、炭疽、萊姆病以及大腸桿菌等。
在某些實施方式中，非致病性病毒是杆狀病毒。如下面實施例所描述的，本發明證明杆狀病毒是一種高活性的腫瘤生長抑制因子，可促進腫瘤的完全緩解。本發明還證明杆狀病毒可用於抑制腫瘤的轉移，提高動物對再次接種腫瘤的抵抗力，如實施例5-6的描述。
如本文所述，術語「腫瘤再次接種」是指癌或腫瘤已被治療或切除的動物再次接種新的腫瘤。與本文上面所提供的定義相一致的是，術語「杆狀病毒」包括杆狀病毒顆粒和杆狀病毒成分。
杆狀病毒的宿主特異性已得到徹底研究。雖然已知杆狀病毒可感染30多種鱗翅類昆蟲，但是它不能感染已經研究過的其他昆蟲細胞和超過35種哺乳動物細胞系。見Tjia等，(1983)Virology 125107-17；Volkman Goldsmith(1983)Appl EnvironMicrobiol 451085-1093；以及Mdntosh Shamy(1980)Intervirology 13331-41。但是，杆狀病毒確實可以進入哺乳動物細胞，在宿主細胞核內也可以檢測到病毒DNA。見Groner等，(1984)Intervirology 21203-9；Tjia等，(1983)Virology 125107-17；以及Volkman Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 451085-93。
術語「非致病性的」病毒還可以指天然形式是具有致病性的但是經修飾後是非致病性的病毒。這種修飾包括基因修飾(如打斷病毒複製所必需的基因，如本文所描述的杆狀病毒基因gp64；和/或打斷病毒啟動子使其在宿主內無轉錄活性)。例如，杆狀病毒物種特異性的致病性部分是由於杆狀病毒啟動子在鱗翅類昆蟲以外的物種內保持靜默。當異源啟動子插入到杆狀病毒基因組時，被修飾的病毒就可以在非鱗翅類昆蟲細胞系內啟動基因的表達，其中包括各種哺乳動物細胞系。見Boyce Bucher(1996)Proc Natl Acad Sci USA 932348-52；Carbonell等，(1985)J Virol 56153-60；Carbonell Miller(1987)Appl Environ Microbiol 531412-7；以及Hofmann等，(1995)Proc Natl Acad Sci USA 9210099-103。在哺乳動物細胞內原本有活性的病毒啟動子同樣也可以被修飾成無活性的啟動子，這樣病毒在哺乳動物細胞內就是非致病性的。製備鹼基對改變、缺失或小片段插入的位點特異性突變方法也是本領域所熟知的，例如本文上面所提到的參考文獻所描述的方法。
確定經修飾的病毒和未經修飾的病毒是否是非致病性的可以通過本領域所熟知的確定病毒感染性和複製能力的方法很容易地加以分析。典型的方法見Tjia等，(1983)Virology 125107-17；Volkman Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 451085-93；Mdntosh Shamy(1980)Intervirology 1333 1-41；以及美國專利No.6,248,514等的描述。
本發明還提供了具有抗癌活性和/或抗感染性疾病活性和/或佐劑活性的非致病性病毒，其中包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、VLPs、病毒包含體以及病毒成分。本發明還提供了篩選可用於本文所描述的治療方法中的非致病性病毒的方法。
為了篩選具有抗癌活性的非致病性病毒，候選非致病性病毒用實施例8所描述的體外或體內腫瘤細胞溶解試驗和/或實施例所描述的體內抗癌活性試驗模型來檢測。在某些實施方式中，先用體外試驗進行初步篩選，然後在相關的動物模型內評價那些具有體外活性的病毒在體內是否也具有抗癌活性。
為了篩選具有佐劑活性的非致病性病毒，需要檢測候選非致病性病毒增強抗原免疫原性的能力。免疫原性可通過檢測T細胞介導的反應來確定。檢測T細胞反應的經典方法包括體外細胞毒性試驗或體內延遲型超敏試驗。在某些實施方式中，CCL21聯合非致病性病毒可在體外誘導PBMC對腫瘤細胞的細胞毒活性，這種活性與其在體內的抗腫瘤活性相關。另外也可以用其他抗原來代替CCL21。另外還可以通過檢測受試者血清中抗原特異性的抗體和/或證明抗原特異性的抗血清或免疫細胞具有保護作用來分析免疫原性。在某些實施方式中，非致病性病毒可使抗原的免疫原性至少提高約2倍、約5倍、約10倍、約25倍或約100倍。
在某些實施方式中，非致病性的病毒是被滅活的，如下文將要進一步描述的。具有抗癌活性的非致病性病毒可用各種滅活方法使其不再具有感染天然宿主細胞的能力。利用本文所描述的試驗，本領域的技術人員可選擇能保持病毒抗癌活性的滅活方法。在某些實施方式中，滅活方法可以保持病毒進入細胞的能力但是病毒基因組卻失去了轉錄和/或複製能力。在某些實施方式中，對病毒進行基因修飾使其能進入細胞但是不能進行正常的轉錄和/或複製。
A2.非致病性病毒的抗感染性疾病活性目前所用的治療感染性疾病的方法包括使用一些能引起副作用的藥物。另外，許多有效的治療措施包括疫苗只對單一的感染因子或其密切相關的因子具有特異性。本發明的發明者驚奇地發現非致病性病毒也具有很高的抗感染性疾病的能力。見實施例17。
為了篩選具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒，利用本領域技術人員所熟知的體外或體內抗感染性疾病檢測方法來檢測候選非致病性病毒。例如，對於結核來說，可用TB模型或體外巨噬細胞模型來檢測病毒的抗感染性疾病活性。Abe等，(Joumalof Immunology，2003，1711133-1139)描述了適於檢測化合物抗感染性疾病活性的其他方法。
在某些實施方式中，先用體外試驗進行初步篩選，然後在相關的動物模型內評價那些具有體外活性的病毒在體內是否也具有抗感染性疾病活性。
因此，本發明還提供了通過給予患者非致病性病毒對需要進行抗感染性疾病治療的患者進行治療的方法。值得注意的是，本文所描述的具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒並不依賴於感染因子特異性抗原的鑑定。而且非致病性病毒具有很寬的使用範圍。
雖然發明者不希望固定於特定的操作模式，但是發明者認為非致病性病毒的抗感染性疾病活性應該歸功於，至少部分歸功於其免疫刺激活性。例如，杆狀病毒在體外和體內都可誘導樹突細胞的成熟和細胞毒T細胞(CTL)反應。見實施例9-10。
B.治療方面的應用本發明提供了通過給予受試者非致病性病毒以治療荷瘤哺乳動物受試者的方法。本文所描述的方法可用於抑制癌的生長，包括癌的完全緩解，抑制癌的轉移以及提高受試者對癌的抵抗力。
本發明提供了通過給予受試者非致病性病毒以治療患有一種或多種感染性疾病的動物的方法。本文所描述的方法可用於抑制病毒的複製、抑制真菌的生長。
術語「癌的生長」通常是指預示癌向更高階段發展的多個指數中的任意一個指數。因此，用於評價癌生長抑制效應的指數包括而不限於存活癌細胞數量的減少、癌體積的縮小或形態的改變(如通過CT、超聲或其他影像方法確定)、腫瘤生長的延遲、腫瘤血管的破壞、遲髮型超敏皮膚試驗結果的改善、細胞毒T細胞活性的升高以及腫瘤特異性抗原表達水平的下降。
術語「腫瘤生長的延遲」是指腫瘤生長到特定大小所需要的時間減少。例如，治療可以延遲腫瘤體積增加到測量開始時(第0天)體積的3倍所需要的時間或者腫瘤生長到1cm3所需要的時間。
術語「對癌的抵抗力」是指受試者對癌生長抵抗能力的提高，特別是已有癌的生長。另外，術語「對癌的抵抗力」也指受試者體內癌生長易感性的降低。對癌的抵抗力與獲得性免疫應答的誘導有關，如下文所描述。
本文所用的術語「受試者」包括任何哺乳動物種。在某些實施方式中，本發明的方法優選用於治療哺乳動物的癌和/或感染性疾病，如人以及那些瀕臨滅絕的對人類具有經濟價值和/或社會價值的哺乳動物。
術語「癌」通常是指腫瘤，包括原發腫瘤和轉移瘤。在某些實施方式中，腫瘤是實體瘤。術語「腫瘤」包括實體瘤和任何組織的癌，其中包括而不限於乳腺癌；結腸癌；直腸癌；肺癌；鼻咽癌；喉癌；食管癌；胃癌；胰腺癌；肝癌；膽囊癌；膽管癌；小腸癌；泌尿道腫瘤包括腎癌、膀胱癌和尿路上皮癌；女性生殖道腫瘤包括宮頸癌、子宮癌、卵巢癌(如絨毛膜癌和妊娠滋養細胞疾病)；男性生殖道腫瘤包括前列腺癌、精囊癌、睪丸和生殖細胞腫瘤；內分泌腺腫瘤包括甲狀腺癌、腎上腺癌和腦下垂體癌；皮膚癌(如血管瘤和黑色素瘤)；骨癌或軟組織癌；血管癌(如卡波西肉瘤)；腦腫瘤、神經腫瘤、眼腫瘤和腦脊膜腫瘤(如星形細胞瘤、膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤和腦膜瘤)。
術語「腫瘤」還包括造血系統惡性腫瘤來源的實體瘤，如白血病，其中包括綠色瘤、漿細胞瘤、血小板瘤和蕈樣肉芽腫病和皮膚T細胞淋巴瘤/白血病、多發性骨髓瘤以及淋巴瘤，其中包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。
本文所用的術語「癌」還包括非腫瘤性的增生性疾病。因此，本發明的方法還可用於治療或預防增生、化生，或者更特殊的發育異常(對這些異常增生性疾病的綜述見Robbins Angell(1976)基礎病理學(Basic Pathology)，第二版，68-79頁，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pennsylvania)。
增生是一種受控形式的細胞增殖，其中包括組織或器官內細胞數量的增加，但是其結構或功能沒有改變。作為一個非限定性的例子，子宮內膜增生通常先發於子宮內膜癌。化生是另一種受控形式的細胞生長，其中一種類型的成年細胞或完全分化的細胞被另一種類型的成年細胞所替代。化生發生於上皮或結締組織。不典型的化生包含某些無序的化生上皮。發育異常通常是癌的前兆，主要見於上皮；它是一種最常見的無序形式的非腫瘤性細胞生長，包括細胞一致性的喪失以及細胞結構定位的喪失。發育異常的細胞通常具有異常巨大而深染的細胞核，呈現多形性。發育異常通常見於慢性刺激或慢性炎症時，常見於宮頸、呼吸道、口腔和膽囊。雖然癌前病變可以發展成惡性腫瘤，但是它可以穩定相當長一段時間，甚至在刺激因素消失後或損傷受到宿主免疫系統攻擊後可以復原。
因此，如本文所述給予受試者非致病性病毒可以激發固有的抗癌免疫應答或癌特異性的適應性免疫應答。術語「免疫系統」包括所有的細胞、組織、系統、結構和過程，其中包括非特異性的部分和特異性的部分，可以提供一種防衛機制來抵抗含抗原性分子的細胞，抗原性分子包括而不限於腫瘤、致病原以及自身反應細胞。因此免疫應答包括固有的免疫應答、獲得性免疫應答或者二者的結合。
術語「固有的免疫系統」包括吞噬細胞如中性粒細胞、單核細胞、組織巨噬細胞、庫弗細胞、肺泡巨噬細胞、樹突細胞和小膠質細胞。固有的免疫系統可介導非特異性的免疫應答。固有的免疫系統在起始和指導適應性免疫系統的反應中扮演重要角色。見Janeway(1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 541-13；Romagnani(1992)Immunol Today 13379-381；Fearon Locksley(1996)Science 27250-53；以及Fearon(1997)Nature 388323-324。固有的反應包括樹突細胞的成熟、巨噬細胞的活化、細胞因子或趨化因子的分泌和/或NFκB信號通路的活化。
術語「適應性免疫系統」是指對宿主體內的特異性免疫具有影響的細胞和組織。這些細胞包括自然殺傷細胞(NK)和淋巴細胞(如B淋巴細胞和T淋巴細胞)。術語「適應性免疫系統」還包括抗體產生細胞及其產生的抗體。
術語「適應性免疫應答」是指對抗原的特異性反應，包括體液免疫應答(如抗原特異性抗體的產生)和細胞介導的免疫應答(如淋巴細胞的增殖)，如下文所定義的。適應性免疫應答還包括系統免疫和體液免疫。
術語「細胞介導的免疫」和「細胞介導的免疫應答」是指淋巴細胞提供的免疫防衛機制，如T淋巴細胞接近其靶細胞時所產生的防衛反應。細胞介導的免疫應答還包括淋巴細胞的增殖。測定「淋巴細胞的增殖」就是測定淋巴細胞接觸特異性抗原後的增殖能力。淋巴細胞增殖是指B細胞、T輔助細胞或CTL的增殖。
本文所用的術語「CTL反應」是指抗原特異性細胞溶解和殺傷表達特異性抗原的細胞的能力。如本文所描述，本領域熟知的標準CTL分析方法可用於測定CTL的活性。
術語「系統免疫應答」用於本文中是指淋巴結、脾或腸道相關淋巴組織內的免疫應答，其中免疫系統的細胞，如B細胞被活化。例如，系統免疫應答包括血清免疫球蛋白(IgGs)的產生。另外，系統免疫應答是指血流中循環的抗原特異性的抗體以及系統免疫器官如脾和淋巴結中的抗原特異性的細胞。
術語「體液免疫」或「體液免疫應答」是指獲得性免疫，其中經抗原刺激後可分泌抗體分子。
本文所用的術語「癌特異性的」是用於描述適應性免疫應答，是指受試者內細胞介導的免疫應答或體液免疫應答，其中發生的反應是受試者內已有的癌特異性的。如果固有免疫應答和適應性免疫應答所包含的免疫細胞類型是唯一的，那麼就不要期望激發固有免疫應答的方法也能激發適應性免疫應答。但是在某些實施方式中，給予非致病性病毒既可以激發固有免疫應答，又可以激發適應性免疫應答。
在某些實施方式中，本文所描述的利用非致病性病毒進行治療的方法可以和其他一種或多種腫瘤治療方法一起使用。例如，在給予非致病性病毒之前或之後可以將腫瘤或異常增生的細胞手術切除。同樣，本發明的非致病性病毒也可以和其他的藥劑一同給藥或製成一種製劑，例如抗血管生成因子、化療藥和/或其他的免疫刺激因子。可與非致病性病毒聯合使用的典型藥劑包括而不限於甲氨蝶呤、他莫昔芬、nelandron、尼魯米特、阿黴素、5氟尿嘧啶(5FU)、細胞因子如幹擾素α(IFN-α)、幹擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素2(IL2)、白細胞介素4(IL4)、白細胞介素6(IL6)、以及腫瘤壞死因子(TNF)。感染性疾病還可以通過給予抗病毒藥物、抗生素或抗真菌藥物治療。
本發明還涉及用於在哺乳動物受試者包括人體內誘導細胞毒T細胞介導的免疫應答的方法和組合物。在某些實施方式中，本發明涉及利用非致病性病毒誘導細胞毒T細胞介導的免疫應答。因此，本發明提供了製備含有非致病性病毒和抗原的抗原性製劑的方法。術語「抗原」是指能通過與T細胞或B細胞受試者相互作用而活化淋巴細胞(正性或負性)的物質。正性活化可導致免疫應答，負性活化導致免疫耐受。抗原可以是蛋白質、脂質、核酸或其混合物。抗原可以是異源抗原(如在宿主體內一般情況下不存在的抗原)或自身抗原(自體抗原)。
本發明還提供了使用本文所描述的抗原製劑作為治療性和/或預防性藥物的方法。例如，這種抗原製劑可給予哺乳動物受試者以治療疾病，其中對於HIV感染或流感來說CTL反應是很重要；另外，這種抗原製劑還可用於治療或預防細菌感染、寄生蟲感染等。
在某些實施方式中，本發明提供了在需要治療的個體體內抑制腫瘤的一種或多種症狀的方法。該方法包括給予個體一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制癌症的一種或多種症狀。
癌症症狀是本領域技術人員所熟知的，包括生理指標和物理指標。生理指標包括而不限於腫瘤的生長、異常的細胞增生、腫瘤的轉移、血管生成、細胞死亡或細胞浸潤。物理指標包括而不限於體重下降、出血、呼吸困難、骨折、免疫力下降或疲乏。
如本文所描述，給予受試者非致病性病毒還可以激發抗感染性疾病免疫應答。如上所述，所激發的免疫應答包括固有免疫應答、適應性免疫應答或者二者都存在。
本發明還提供了保護動物不受感染性疾病影響的方法，該方法包括給予動物有效量的包含非致病性病毒的組合物。在某些實施方式中，非致病性病毒是用任何方法或本文所描述的方法滅活的。根據下面所描述的實施例可以看到給予無活性的非致病性病毒可產生抗感染性因子(如病毒、真菌或細菌)的保護作用。非致病性病毒還可以和其他疫苗、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗細菌藥物或其混合物一起使用。
C.治療性組合物和方法本發明還提供了藥物組合物及其使用方法。本發明的非致病性病毒可製備成安全有效的具有本文所描述的抗腫瘤和/或抗感染性疾病和/或佐劑活性的製劑。
本發明還提供了用於治療或預防感染性疾病和/或癌的組合物。在某些實施方式中，組合物包含非致病性病毒和外周血單核細胞(PBMC)。在某些實施方式中，PBMC是從動物或人體內分離出來的，在體外與非致病性病毒接觸，然後再以混合物或組合物的形式輸入到動物或人體內。在某些實施方式中，PBMC是從被治療動物或人體外的其他動物或人體內分離的，或者本發明的組合物被輸入到被治療動物或人體內。
在某些實施方式中，組合物包含非致病性病毒以及至少一種腫瘤細胞。腫瘤細胞可以是被治療個體或動物自身的，也可以是同種異體的。
在某些實施方式中，組合物包含非致病性病毒、至少一種腫瘤細胞以及至少一種PBMC。在某些實施方式中，非致病性病毒是無活性的病毒。
C.1.病毒滅活在某些實施方式中，本發明的方法所用的非致病性活病毒可在給予受試者前被滅活。如上面所定義的，非致病性病毒在哺乳動物宿主內不能複製。滅活可使病毒在其天然宿主細胞內失去複製能力，從而增加了其安全性。
病毒滅活可用任何適宜的方法完成，其中包括而不限於破壞病毒包被的脂質或蛋白組分、對病毒進行改造以使其無法識別靶細胞、破壞病毒的核酸和/或改造病毒使其失去複製能力。典型的病毒滅活方法包括而不限於巴氏消毒法、用去汙劑(如Triton-X100)處理、用二乙烯亞胺(BEI)進行烷基化、光化學滅活、紫外線滅活、輻射滅活、物理裂解(如超聲、電子束)；基因滅活以及上述方法的聯合。見Rueda等，(2000)Vaccine 19726-34和Henzler Kaiser(1998)Nat Biotechnol 161077-9。在某些實施方式中，滅活並不能顯著降低病毒的抗原性和/或活性。病毒滅活以後可用標準的方法來確定其感染性。
「基因滅活」用於本文中是指對病毒的核酸(如基因)進行改造。這種改造包括刪除一個或多個基因、突變至少一個基因；創造溫度敏感突變株、滅活基因等。溫度敏感突變株是指該突變株在某個溫度下是允許的，而在另一個溫度下是受限的(如抑制病毒的複製)。對於杆狀病毒來說，製備溫度敏感突變株可用於使病毒在室溫(約25℃)下繁殖和製備，而進入到具有更高內部溫度的動物體內時病毒就變成了無活性的。在某些實施方式中，溫度敏感突變株在約16-28℃、約20-28℃、約25-28℃或27℃的範圍內是允許的，而在約30-45℃、約32-40℃、約35-38℃、約37℃溫度下是受限的。在某些實施方式中，受限溫度是約28℃、約29℃、約30℃、約31 ℃、約32℃，、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃或約37℃以上的任何溫度。在某些實施方式中，溫度敏感突變株在動物或人體內是無活性的。在某些實施方式中，當病毒處於受限溫度時溫度敏感突變株與野生型病毒相比其活性降低約100％、約90％、約80％、約70％、約60％、約50％、約40％、約30％、約20％或約10％。
穩定敏感突變株可包含任何突變的基因，該基因的突變可使病毒在一種溫度下的活性比另一種溫度下的活性降低。可被突變的基因或蛋白包括而不限於鳥苷醯基轉移酶、RNA三磷酸酶、ATP酶、蛋白激酶(如PK-1)等。下面的文獻中描述了一些溫度敏感突變株的例子Jin等，Journal of Virology，(1998)，卷72，pp.10011-10019和McLachlin等，Virology，(1998)，卷246，pp.379-391，本文都已納入作為參考。
如果病毒經加熱處理後足以被滅活則巴氏消毒法是一種簡單的滅活方法。在某些實施方式中，在保證可滅活病毒的情況下加熱的持續時間應該儘量短以使對病毒蛋白的損傷降到最低。另外，可通過使用穩定劑和檸檬酸鈉、蔗糖和/或甘氨酸使對病毒的損傷降到最低。
另外，化學滅活，如用溫和的胃蛋白酶在低pH條件下處理或者用去汙劑處理，可用於破壞脂雙層，因此可用於滅活包膜病毒，其中包括杆狀病毒。見美國專利Nos.4,820,805和4,764,369。氮丙啶二元乙烯亞胺是一種強力烷化劑，可通過與核酸而不是蛋白上的親核基團相互作用而滅活病毒。
在本發明的某些實施方式中，病毒滅活可通過光化學反應進行。按照這種方法，將輻射致敏的化合物加到非致病性病毒的脂質懸液中，然後將混合物在紫外燈下照射或者用離子化射線(γ射線或X射線)照射。
補骨脂素及其衍生物以及具有與補骨脂素類似的線性三環結構的化合物可誘發光敏作用。補骨脂素是一種雙功能的光反應分子，在長波紫外線的照射下可與核酸形成共價鍵。補骨脂素可嵌入到DNA雙螺旋內，然後通過光反應使DNA分子的兩條鏈發生交聯。見Hwang等，(1996)Biochem Biophys Res Commun 219191-7。交聯使DNA分子無法複製或被轉錄。商品化的補骨脂素化合物有8-甲氧補骨脂素(甲氧沙林)和4，5′，8三甲基補骨脂素(trioxalen)。使用補骨脂素進行光化學滅活最有效的波長在320nm到380nm之間，最大有效波長在33nm到360nm之間。見Pathak，M(1974)，陽光與人類(Sunlight and Man)，Pathak，M Fitzpatrick，T編，Universityof Tokyo Press，Tokyo。
其他光致敏試劑包括滷代補骨脂素、異補骨脂內脂、呋喃並色酮和香豆素，這些化合物都含有一個滷素取代基和一個水溶性基團，如第四氨離子或磷離子。據信在補骨脂素分子上加入滷原子取代基，特別是溴原子取代基可以提高致敏劑與DNA的結合常數，因為溴原子可提供疏水特性。在某些實施方式中，可以使用溴化光致敏劑，因為只需要一個光子就可以活化溴化致敏劑，而用非溴化的補骨脂素需要兩個光子才能使DNA交聯。見美國專利No.5,418,130。
光化學滅活的典型方法見實施例11的描述，該方法聯合使用trioxalen和長波紫外線照射。見Weightman Banks(1999)J Virol Methods 81179-82和Cotton等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 896094-8。
為了保持病毒的抗原性，用補骨脂素滅活活病毒時應在非氧化的環境下進行。通過去除滅活培養基中的氧和其他氧化物，由於紫外線照射而引起的抗原降解可得到最大限度的避免。見美國專利No.5,106,619。同樣，通過使用抗氧化劑/淬滅劑可使短波紫外線照射時產生的自由基和其他活性氧成分降到最少，從而可以使蛋白的損傷大大減少。見Marx等，(1996)Photochem Photobiol 63541-6。
在本發明的某些實施方式中，病毒滅活可以通過改造病毒的基因來完成，從而使病毒受到損傷或無法複製。例如，對病毒進行基因改造使病毒的必需基因發生一個或多個溫度敏感型的突變。在允許溫度(如25℃)下用Sf9或Tn5細胞製備和擴增病毒。當病毒在治療時被導入到哺乳動物受試者內時，溫度不再是允許溫度了，這樣溫度敏感基因就很難表達，或者表達的基因產物沒有功能，因此病毒是殘缺的。
可被製備的典型溫度敏感突變可在病毒感染所必需的基因上進行。例如，編碼PKIP的基因發生溫度敏感型的突變，這個蛋白可與病毒編碼的蛋白激酶相互作用，調節病毒晚期基因的轉錄。在非允許溫度下，攜帶這種突變的病毒在感染宿主時是有缺陷的。見McLachlin等(1998)Virology 246379和Partington等，(1990)Virology17591。
病毒是否被滅活可通過證明其在天然宿主細胞內的複製能力是否喪失來確定。可利用標準的噬菌斑試驗來證明一個樣品的感染性。在沒有合適的方法來證明某種病毒是否具有感染性時，就需要通過滅活一個具有相似的生物物理特性和結構特性的模型病毒來證明其是否被滅活。見Henzler Kaiser(1998)Nat Biotechnol 161077-9。為了使病毒完全滅活，本發明所用的滅活方法可以包括使病毒與滅活刺激物連續接觸。
C.2.載體如本文所描述，非致病性病毒可以是活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒成分或其混合物。為了促進非致病性病毒向受試者癌細胞內的轉移，可以給予一種能在受試者體內激發抗癌和/或抗感染性疾病反應的組合物，該組合物包含(a)有效量的非致病性病毒；以及(b)藥學上可接受的載體。在適當的條件下可同時使用兩個或兩個以上的載體。
本文所用的術語「載體」是指可用於將病毒、病毒樣顆粒、病毒成分、病毒蛋白轉運到細胞的漿膜或穿過細胞的漿膜的化合物或一組化合物。
用於轉運非致病性病毒或病毒成分的典型載體包括脂質體、納米微球(Manome等，1994；Saltzman和Fung，1997)、氨基葡糖多聚糖(見美國專利No.6,106,866)、脂肪酸(見美國專利No.5,994,392)、脂肪乳劑(見美國專利No.5,651,991)、脂質和脂質衍生物(見美國專利No.5,786,387)、膠原(見美國專利No.5,922,356)、多糖及其衍生(見美國專利No.5,688,931)、納米懸液(見美國專利No.5,858,410)、聚合微膠粒或聚合物(見美國專利Nos.4,551,482、5,714,166、5,510,103、5,490,840和5,855,900)以及多核糖體(見美國專利No.5,922,545)。
為了轉錄病毒成分，載體還可以用基因治療載體，其中包括病毒載體和質粒載體。適於基因表達的病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒(AAVs)、逆轉錄病毒、假型逆轉錄病毒、皰疹病毒、痘苗病毒和Semiliki森林病毒。載體還可以包含病毒樣顆粒、蛋白運送載體，其中包括Pro-Ject(Pierce Biotechnology，INC.)和Profect(TargetingSystems)以及Chariot(Active Motif)等。
可以選擇載體使非致病性病毒在需要治療部位達到穩定的生物利用度。術語「穩定的生物利用度」涉及的因素包括而不限於非致病性病毒從載體內的延遲釋放、非致病性病毒的代謝穩定性、包含非致病性病毒的組合物的系統轉運以及非致病性病毒的有效劑量。
能達到穩定的生物利用度的典型組合物包括而不限於基質聚合物，其中包括膨脹的可生物降解的基質聚合物(美國專利Nos.6,335,035；6,312,713；6,296,842；6,287,587；6,267,981；6,262,127和6,221,958)，聚合物包被的微粒子(美國專利Nos.6,120,787和6,090,925)，多元醇油懸液(美國專利No.6,245,740)，多孔顆粒(美國專利No.6,238,705)，乳膠/蠟包被顆粒(美國專利No.6,238,704)，殼聚糖微膠囊，以及微球乳劑(美國專利No.6,190,700)。
C.3.劑型、劑量和給藥途徑本發明組合物的適宜給藥劑型包括水性的和非水性的無菌注射液，其中包含抗氧化劑、緩衝物質、抑菌劑、抗生素和抗真菌藥(如parabens，氯代丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞)、將製劑的滲透壓調整到與受試者體液一致的溶質(如糖，鹽和多元醇)，懸浮劑和增厚劑。製劑可置於單次劑量的包裝內，也可置於多次劑量的包裝內，如密封的安瓿和小玻璃瓶，可以儲存在冷凍條件下活凍幹條件下，在使用前只需加入無菌液體載體就可以注射了。
注射到宿主體內的組合物包括無菌水溶液或分散液以及可製備成無菌注射液或分散液的無菌粉末。可注射的組合物應當是液體的，其流動性應當達到可以很容易地用注射器注射的程度。適宜的溶劑包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其混合物。可以使用包被如卵磷脂和/或通過降低顆粒的直徑來維持組合物的流動性。
本發明的非致病性病毒可通過瘤內注射、瘤旁註射、系統注射、胃腸外途徑(如靜脈注射、肌肉注射、動脈內注射和輸液)、口服、透真皮注射(局部給藥)、鼻內途徑(吸入)以及黏膜內注射的方式給藥。選擇何種給藥方式要根據載體的類型、組合物的療效、需治療的部位以及患者的狀況而定。
本文所用的術語「蛋白運送載體」是指可促使蛋白質轉運到細胞膜或跨過細胞膜的物質。
在某些實施方式中，非致病性病毒是被直接注射到腫瘤內或腫瘤旁部位。術語「腫瘤旁部位」是指離腫瘤外緣約15cm以內的部位、約10cm以內的部位、約5cm以內的部位、約1cm以內的部位或者約0.1cm以內的部位。本發明的非致病性病毒可以注射到一個或多個腫瘤或腫瘤旁部位內。在某些實施方式中，本發明的非致病性病毒可以注射到腫瘤和/或腫瘤周圍的多個位點內。
在某些實施方式中，如果癌的生長是非腫瘤性的，那麼非致病性病毒可以注射到病變部位或病變周圍部位。術語「病變周圍部位」是指非腫瘤性增生外緣約15cm以內的部位、約10cm以內的部位、約5cm以內的部位、約1cm以內的部位或者約0.1cm以內的部位。本發明的非致病性病毒可以注射到一個或多個病變和/或病變旁部位內。在某些實施方式中，本發明的非致病性病毒可以注射到非腫瘤性增生部位和/或非腫瘤性增生部位周圍的多個位點內。
在組合物是用於治療感染性疾病的實施方式中，非致病性病毒可通過系統途徑給藥。在某些實施方式中，非致病性病毒被局部注射到損傷部位內。
本發明涉及給予患者有效量的非致病性病毒。術語「有效量」用於本文中是指足以激發出抗癌活性，包括抗腫瘤活性和/或抗非腫瘤性增生活性的非致病性病毒的量。如本文所描述，典型的抗癌活性包括而不限於癌細胞的溶解、癌生長的抑制、癌轉移的抑制和/或對癌的抵抗力。在某些實施方式中，「有效量」是指體外試驗中可有效抑制癌的生長、轉移、誘導對癌的抵抗力、誘導細胞溶解、細胞死亡等所需要的一種藥物的量。在某些實施方式中，「有效量」的藥物抑制癌的生長、轉移、誘導對癌的抵抗力、誘導細胞溶解、細胞死亡至少提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70、80％、90％、2倍、5倍、10倍或100倍。
本文中的術語「有效量」是用於描述足以激發抗感染性疾病活性的非致病性病毒的量。在某些實施方式中，與對照相比，「有效量」的非致病性病毒可以使病毒的複製至少被抑制10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍或100倍。
本發明的治療性組合物中實際包含的活性成分的量可以是不同的，只要該劑量的組合物在特定的患者體內可以達到預期的治療效果。為了激發出預期的活性，可以選擇不同的給藥方案。可以進行單次注射，也可以進行多次注射。劑量和給藥方案的選擇要根據不同的因素來確定，其中包括治療性組合物的活性、劑型、給藥途徑、與其他藥物或治療措施的聯合、被治療的疾病類型以及被治療患者的健康狀況及用藥史。確定和調整有效給藥劑量以及確定何時和如何調整都是醫學領域技術人員所熟知的。
可用各種方法來計算非致病性病毒的給藥劑量。對非致病性活病毒來說，可用噬菌斑形成單位來計算劑量。對於無活性的非致病性病毒來說，由於不能形成噬菌斑，其劑量用PFU的等價量來表示。本文所用的術語「PFU等價量」是指非致病性病毒的量。PFU等價量定義為1 PFU的病毒被滅活後所得到的病毒的量。另一種確定病毒給藥量的方法是基於樣品中存在的病毒顆粒數目。可用任何方法對顆粒進行計數，如電鏡。也可以通過體外試驗所得到的有效量來推算出非致病性病毒，包括滅活病毒的給藥量。體外試驗可以是本領域技術人員所熟知的測定抗癌活性或抗感染性疾病活性的任何試驗，其中包括而不限於測定細胞毒性、細胞死亡、細胞在軟瓊脂上的生長能力等的試驗。在某些實施方式中，劑量是指可使細胞毒活性或細胞死亡比對照組增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的量。在某些實施方式中，劑量是指可使細胞在軟瓊脂上的生長能力比對照組至少降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的量。
其他有關劑型、劑量和給藥方案的指導原則描述於Berkow等，(1997)Merck醫學情報手冊(The Merck Manual of Medical Information)，Home編，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，New Jersey；Goodman等，(1996)Goodman Gilman治療學的藥理基礎(Goodman Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics)第9版，McGraw-Hill Health Professions Division，New York；Ebadi(1998)CRC臨床藥理學手冊(CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology)，CRC Press，Boca Raton，Florida；Katzung(2001)基礎和臨床藥理學(Basic Clinical Pharmacology)，第8版，Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division，New York；Remington等，(1975)Remington藥物學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Pub.Co.，Easton，Pennsylvania；Speight等，(1997)Avery藥物治療疾病管理中藥物特性、選擇、治療用途和經濟價值指導手冊(Avery’s Drug TreatmentA Guide to thePropertie，Choice，Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in DiseaseManagement)，第4版，Adis International，Auckland/Philadelphia，Pennsylvania。
在某些實施方式中，通過體外或體內試驗來檢測組合物以確定其「有效量」。例如，在本文所描述的誘導細胞死亡的方法中，適用的試驗包括而不限於細胞體外存活能力分析試驗，其中包括TUNEL分析或其他螢光分析方法如Cell-Titer Blue(Promega Corp)；監測DNA片段化的試驗；以及細胞色素C釋放試驗、軟瓊脂生長試驗、接觸抑制試驗和及腫瘤在裸鼠體內的生長試驗；給動物注射本發明的組合物後接種腫瘤並監測腫瘤緩解情況的試驗和轉基因小鼠試驗，其中轉基因小鼠被接種了腫瘤並監測其緩解情況；本文所描述的體內試驗；測定細胞穿過屏障的體外試驗如Matrigel試驗(見Cancer Res.2003 Aug 1；63(15)4632-40；Am J Chin Med.2003；31(2)235-46)；Yang等，(Cancer Res.61，5284-5288，July 1，2001)所描述的體外侵襲性和體內轉移性分析試驗。
本發明包含非致病性病毒的組合物還可以包含一種或多種用於增強藥物組合物療效的佐劑。這些佐劑包括而不限於(1)鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳劑(其中含有或不含有其他特異性的免疫刺激因子如胞壁醯肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，如(a)MF59(國際公開號No.WO 90/14837)，其中含有5％角鯊烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(雖然不是必須的，但是還可以添加不同劑量的MTP-PE(見下文))，用微射流勻質儀如Model 110Y微射流勻質儀(Microfluidics，Newton，Mass.)製備成亞微粒，(b)SAF，其中含有10％角鯊烯、0.4％Tween 80、5％Pluronic封閉的聚合物L121和thr-MDP(見下文)，或者經過微射流勻質化製備成亞微粒，或者激烈攪拌成大顆粒乳劑，以及(c)RibiTM.佐劑系統(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)，其中含有2％角鯊烯、0.2％Tween 80和一種或多種選自以下細胞壁成分monophosphorylipid A(MPL)、雙分枝菌酸海藻糖(TDM)和細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(DetoxTM)(在1999年6月24日公開的國際申請WO 99/30739中有關於適宜亞微粒水包油乳劑的進一步描述)；(3)皂甙佐劑，如StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或從它衍生的顆粒如ISCOMs(免疫刺激複合物)；(4)完全福氏佐劑(CFA)和不完全福氏佐劑(IFA)；(5)細胞因子如白細胞介素(IL-1、IL-2等)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細菌ADP核糖醯化毒素的脫毒突變株，如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌的熱穩定毒素(LT)，特別是LT-K63(其中野生型蛋白上的63位胺基酸被賴氨酸替代)、LT-R72(其中野生型蛋白上的72位胺基酸被精氨酸替代)、CT-S109(其中野生型蛋白上的109位胺基酸被絲氨酸替代)，CpG家族分子來源的佐劑，CpG二核苷酸和包含CpG基序的合成寡核苷酸(見Krieg等，Nature，374546(1995)和Davis等，J.Immunol.，160870-876(1998))以及PT-K9/G129(其中野生型蛋白上的第9位胺基酸被賴氨酸替代，129位胺基酸被甘氨酸替代)(見國際專利申請Nos.WO93/13202和WO92/19265)；以及(7)可作為免疫刺激因子增強組合物療效的其他物質。
胞壁醯肽包括而不限於N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯-正胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(nor-MDP)、N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯-L-丙氨酸-2-(1』-2』-dipahitoyl-sn-甘油-3-huydroxyphosphoryloxy)-乙基醯胺(MTP-PE)等。
國際專利公開號No.WO 98/50071描述了病毒樣顆粒(VLPs)可以作為佐劑用於增強與VLP共同注射的抗原的免疫應答。St.Clair等描述了蛋白結晶在增強體液免疫應答和細胞免疫應答方面的應用(St.Clair，N.等，Applied Biol.Sci.，969469-9474，1999)。
通過閱讀本發明的說明書，本領域的技術人員可以很容易地理解通過給予非致病性病毒進行治療的方法可以加以變通以激發出抗癌反應和/或抗感染性疾病反應。
根據長久以來形成的慣例，術語「一個」、「一種」和「這種」可用於指單數，也可用於指複數。當本文所用的術語「約」和可測量數值聯用時，如腫瘤周圍的距離或病變周圍的距離，是指特定數值上下20％、10％、5％、1％或0.1％的變化，只要這種變化的數值能夠實施本發明描述的方法或者說能夠實施本發明。在某些實施方式中，「約」是指特定數值上下10％的變化。
D1.預測體內的活性要預測體內的抗腫瘤活性常常是困難而偶然的。本發明提供了預測體內抗腫瘤活性的方法。在某些實施方式中，該方法包括使化合物與腫瘤細胞和外周血單核細胞接觸，然後測定腫瘤細胞的死亡率。在某些實施方式中，化合物是非致病性病毒或非致病性的昆蟲特異性病毒。任何方法都可用於測定細胞的死亡率，例如測定細胞調亡情況、壞死情況、細胞的存活能力等。可用於本發明的腫瘤細胞包括而不限於肺癌細胞(如A549細胞、3LL-HM細胞)、乳腺癌細胞(如4T1細胞；MT901細胞；MAT BIII細胞)、前列腺癌細胞、結腸癌細胞、皮膚癌細胞(如B16黑色素瘤細胞)、胰腺癌細胞、肝癌細胞、腦癌細胞、骨癌細胞(如MG-63細胞)、胃癌細胞或食管癌細胞等。
E.1釋放試驗在一種藥物上市以前，政府的有關機構，如食品藥品監督管理局(FDA)，通常需要對這種藥物進行嚴格的質量控制以確保該藥物所含有的成分與其被FDA或其他政府機構批准的藥物所含有的成分一樣。這種質量控制通常通過釋放試驗來完成以確保該藥物符合監督者制定的法規。
本發明提供了用於上市的抗癌和抗感染性疾病組合物的製備過程。在某些實施方式中，組合物包含一種或多種非致病性病毒。在某些實施方式中，非致病性病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。在某些實施方式中，非致病性病毒包括滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。在某些實施方式中，製備過程包括進行組合物的釋放試驗以確保組合物的安全性、毒性和有效性符合處方的指導原則。
製備抗癌和抗感染性疾病組合物的過程包括使組合物與第一滅活劑接觸以有效地滅活有活性的病毒，使組合物與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合，通過體外試驗確定滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分是無活性的。在某些實施方式中，每個滅活步驟後都要檢測所述病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分被滅活的情況。
在某些實施方式中，製備過程還包括對組合物隨機取樣以分析安全性、有效性或毒性中的一種或多種。在某些實施方式中，隨機取得的樣品的安全性和/或有效性和/或有效性與第二種抗癌或抗感染性疾病化合物的安全性和/或有效性和/或有效性比較。比較所得到的數據用於上市前藥品評價。
在某些實施方式中，通過噬菌斑形成試驗來確定病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分是否已被滅活。在某些實施方式中，噬菌斑形成試驗用的是Sf細胞。在某些實施方式中，製備過程還包括對滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分進行計數。計數可用本領域技術人員所熟知的任何方法進行。在某些實施方式中，計數用EM進行。
下面的實施例用於說明本發明，並不以任何方式構成對本發明的限定。本領域的技術人員應該清楚在本發明的精神和範圍內可以對本發明作出修改。
實施例實施例1.重組杆狀病毒的製備將編碼人CCL21的全長序列(GenBank登錄號No.NM 002989)克隆到杆狀病毒運送載體pVL1392(Pharmingen of San Diego，California)內，按照廠商推薦的方法與BACULOGOLDWT基因組DNA(Pharmingen of San Diego，California)共轉染。利用這種方法獲得的重組杆狀病毒在Sf9細胞內通過噬菌斑純化進行亞克隆以製備幾株表達人CCL21的分離株。挑選出一個克隆，因為這個克隆與其親本病毒相比具有異常的表達特徵。這個杆狀病毒分離株的擴增以較低的感染複數(MOI)進行以製備出高滴度低傳代的病毒種用於蛋白的製備。表達CCL21的杆狀病毒被命名為BV422。其他重組杆狀病毒用同樣的方法製備。例如，製備出表達胞內Raf蛋白的杆狀病毒，命名為BV762。
用感染複數(MOI)為2-10的杆狀病毒感染無蛋白培養基內的粉紋夜蛾(Tn5)細胞48小時以製備蛋白質和出芽的杆狀病毒。含有重組CCL21的BV422培養上清通過離心收穫，過濾澄清後通過色譜柱進行純化。
實施例2.肺癌動物模型內的腫瘤生長抑制9-11周齡的C57BL/6小鼠在接種腫瘤細胞前最少要適應環境7天。在小鼠右腹部皮下接種2×105處於傳代早期(＜10代)的3LL-HM腫瘤細胞。每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤生長到50-100mm3(一般在接種後7天可以達到這個體積)，將小鼠隨機分組。給荷瘤小鼠的腫瘤內注射杆狀病毒表達的CCL21。調整給藥劑量和給藥方案以達到最大的腫瘤抑制效應。一旦有任何一組的腫瘤體積達到3000mm3(對照組小鼠一般在接種後33-35天可達到這個體積)就將小鼠處死。
如圖1所示，瘤內注射杆狀病毒表達的CCL21可導致3LL腫瘤生長的延遲。優化CCL21的劑量以達到完全抑制腫瘤生長的效果。以相對高的劑量注射2次或3次的給藥方案與以相對低的劑量注射6次的給藥方案所達到的效果一致。單次注射也可以觀察到某種程度的腫瘤抑制。
實施例3.乳腺癌模型內的腫瘤生長抑制
9-11周齡的Balb/c小鼠在接種腫瘤細胞前最少要適應環境7天。在小鼠右腹部皮下接種2×105處於傳代早期(＜10代)的4T1細胞。每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤生長到50-100mm3(一般在接種後7天可以達到這個體積)，將小鼠隨機分組。給荷瘤小鼠的腫瘤內注射杆狀病毒。調整給藥劑量以確定最佳有效劑量。一旦有任何一組的腫瘤體積達到3000mm3(對照組小鼠一般在接種後33-35天可達到這個體積)就將小鼠處死。如圖2所示，瘤內注射CCL21可導致4T1腫瘤生長的延遲。
實施例4.黑色素瘤模型內的腫瘤生長抑制鼠黑色素瘤細胞系B16-BL6用於在6-8周齡的粉紅色雌性BDF-1小鼠(CharlesRiver Laboratories of Boston，Massachusetts)皮下建立腫瘤模型。為了建立皮膚腫瘤，在第0天將0.2ml含106B16-BL6細胞的培養基注射到6-8周齡的雌性BDF-1小鼠背部。在細胞注射之前及之後利用臺盼藍排出試驗分析細胞的存活能力。注射之前的死細胞數一般不超過細胞總數的10％。6天之後腫瘤的直徑一般可達到5-10mm。
杆狀病毒表達的CCL21按照實施例1描述的方法製備。在第3天和第4天，於離每個腫瘤約3mm的部位皮下注射杆狀病毒。每日測量腫瘤的體積，連續測量3周。當腫瘤體積達到4000mm3處死小鼠。
實施例5.對再接種腫瘤的抵抗力按照上述方法製備和用杆狀病毒處理荷瘤小鼠。給那些腫瘤完全被抑制的小鼠或在最後一次注射杆狀病毒後2天將未完全抑制的腫瘤手術切除的小鼠再次接種腫瘤。腹腔注射200μl氯胺酮/賽拉嗪混合物(4∶1的氯胺酮/賽拉嗪，用磷酸鹽緩衝液稀釋10倍)以麻醉小鼠，切除腫瘤後用釘書釘封閉傷口。切除腫瘤後1到4天在原腫瘤部位以外的其他部位皮下注射2×1054T1細胞以再次接種腫瘤。每周測量2次再次接種的腫瘤體積。將腫瘤生長被完全抑制的小鼠平均分成兩組。一組在原腫瘤的對側腹部皮下注射1×105細胞再次接種同種腫瘤，另一組在小鼠的左腹部皮下接種1×105不同種的腫瘤細胞(B16F10)。監測再接種部位腫瘤的生長狀況。用杆狀病毒處理小鼠可誘導小鼠對再次接種的3LL-HM腫瘤細胞產生抵抗力，但是卻不能誘導小鼠對不同種的腫瘤細胞產生抵抗力。
實施例6.抑制腫瘤的轉移
按照實施例3所描述的方法製備荷瘤小鼠並用杆狀病毒處理。當對照組的小鼠由於肺轉移而出現病危信號時處死小鼠。常規的觀察指標包括呼吸困難、毛髮油膩及體重下降。取小鼠的肺並保存在Buoin溶液中。觀察是否發生了肺轉移。圖3顯示杆狀病毒表達的CCL21可顯著抑制腫瘤的轉移。
實施例7.杆狀病毒的抗腫瘤活性如實施例2-3和5-6所描述，杆狀病毒表達的hCCL21的抗腫瘤活性主要是由於杆狀病毒而不是CCL21。如圖6所示，經過濾的杆狀病毒表達的CCL21製備物不足以影響3LL腫瘤模型的緩解。經過過濾以後所有樣品中CCL21的濃度沒有發生變化。有些但不是所有杆狀病毒表達的CCL21製備物同樣是無效的。
與體內試驗所觀察到的療效出現變化相反，所有的CCL21製備物在體外都可以有效誘導淋巴細胞的趨化作用。見表1和圖7。這些結果說明杆狀病毒表達的CCL21內的高分子雜蛋白對於達到較高的抗腫瘤活性是必需的，但不是CCL21在體外誘導趨化作用所必需的。
表1.重組CCL21製備物的活性
1可從PreproTech EC Ltd.of Rocky Hill，New Jersey購買如實施例1所描述，杆狀病毒是杆狀病毒表達的CCL21製備物中的汙染物。以能特異性識別杆狀病毒gp4蛋白的抗體為探針利用蛋白印跡分析杆狀病毒表達的CCL21。如圖8所示，可以在杆狀病毒表達的CCL21製備物中檢測到gp64。另外，具有抗腫瘤活性的杆狀病毒表達的CCL21批次含有的活病毒滴度相對較高，而無活性的批次含有的活病毒滴度相對較低(表2)。
表2.病毒滴度與杆狀病毒表達的CCL21製備物的抗腫瘤活性相關
1小組分；2大組分；3bv，杆狀病毒圖9顯示在不存在CCL21的情況下，將與CCL21製備物中汙染的病毒滴度相同的純化活杆狀病毒注射到腫瘤內所達到的腫瘤抑制效果與汙染杆狀病毒的CCL21一樣。
實施例8.杆狀病毒誘導的體外細胞毒活性按照實施例1所描述的方法製備杆狀病毒。以未感染的Sf9細胞作為對照。離心以後收集上清和細胞團。樣品用培養基按1∶11稀釋到初始病毒滴度5×106PFU/ml，分析其細胞毒活性。
人肺上皮細胞A549接種到96孔組織培養板中，設3復孔，與系列稀釋的杆狀病毒感染的或未感染的Sf9細胞及其上清共孵育。24小時去掉培養基，細胞用新鮮培養基洗滌。24到48小時後通過結晶紫染色分析細胞的存活能力，用分光鏡定量。
如圖10A所示，細胞團所誘導的細胞毒反應比上清更強。未感染細胞的上清沒有細胞毒活性。圖10B顯示杆狀病毒表達上清用0.2μm的濾膜過濾後(去掉內含的杆狀病毒)其細胞毒活性顯著降低，與體內活性的喪失相似。本文所描述的體外細胞毒試驗可用於預測體內抗癌活性。參見圖13。
實施例9.杆狀病毒活化樹突細胞的成熟樹突細胞(DC)培養物內添加野生型的杆狀病毒可誘導DC細胞的成熟，其表現是活化標記分子在細胞表面表達水平的升高。如圖11A和11B所示，杆狀病毒可活化鼠骨髓衍生的DC和人單核細胞來源的DC。
按照標準的方法製備骨髓衍生的鼠DC。簡言之，從6-8周齡的雌性Balb/c或C57BI/6(Charles River Laboratories of Holster，Califomia)小鼠體內分離其骨髓，用添加10％細胞培養級二甲亞碸(DMSO)的熱滅活胎牛血清冷凍(-80℃)保存，細胞密度為2×107細胞/ml。細胞凍存管快速解凍後洗滌去除DMSO。將細胞接種到150mm懸浮培養皿中，培養基用20ml添加200U/ml鼠GM-CSF(PreproTech of Rocky Hill，New Jersey)的補充RPMI培養基(Sigma-ALDRICH of St.Louis，Missouri)。在培養的第3天，再次添加鼠GM-CSF，在第5天，離心去掉一半培養基，用含GM-CSF的新鮮培養基替換。用移液管小心吸取收穫BMDC。
在第6天時加入杆狀病毒和其他對照試劑。細胞繼續孵育18小時，然後分析細胞和上清液。通過FACS分析BMDC表面的分子標記，通過測定第6天加入刺激因子前標記未成熟DC的標記物來確定其成熟情況，其中包括CD11c、CD11b、H-2Kd、I-Ad(表達低)、CD80(表達低)和CD86(表達低)。細胞與各種刺激因子共孵育過夜後洗滌細胞，用抗CD11c抗體和抗CD86抗體或抗I-A抗體雙染，然後用流式細胞儀分析。採用門技術圈出CD11c陽性的活細胞群。刺激表達為平均螢光強度(MFI)除以只用GM-CSF處理的染色細胞的MFI。圖11A顯示用杆狀病毒刺激後DC活化標記分子CD86和MHC II的表達顯著升高(用抗I-A抗體檢測)。經杆狀病毒刺激後CD80和CD40的表達同樣升高。
人源DC來源於外周血單核細胞，是用抗CD-14抗體包被的磁珠(Miltenyi Biotecof Auburn，California)從健康志願者外周血棕黃層中純化出來的。用含白細胞介素4和GM-CSF(1000U/ml，購自PreproTech of Rocky Hill，New Jersey)的培養基培養3-4天後收穫未成熟的DC。通過FACS(Pharmingen of San Diego，California)分析發現，培養物中超過90％的細胞都是CD1a陽性的。用門技術(gating)圈出CD11a陽性的活細胞通過FACS分析DC表面的活化標記分子。圖11B顯示杆狀病毒可誘導CD86和HLA-DR++表達水平升高。
實施例10.杆狀病毒在體內活化CTL用杆狀病毒和可溶性蛋白抗原(HIV p24)免疫小鼠可誘導出很強的抗原特異性CTL反應。第三次免疫後2周取免疫小鼠的脾。將所取的脾混合，這樣每個樣品中有5個脾。免疫小鼠的脾細胞在24孔板中培養，每孔5×106個細胞。將這些細胞中的1×106細胞用下列物質致敏(1)合成的p7g肽，這是一種H-2Kd限制性CTL表位，相當於HIV-1SF2p24gag的199-208位胺基酸；以及(2)pGagb肽，這是一種H-2Db限制性CTL表位，相當於HIV-1SF2p55gag的390-398位胺基酸。肽的濃度為10μM，37℃處理1小時。然後洗滌脾細胞，與剩餘的4×106未處理的細胞共培養。脾細胞用2ml脾細胞培養基培養，培養基中含有添加100mM L-穀氨醯胺(Gibco ofGrand Island，New York)的RPMI 1640(Sigma-Aldrich of St.Louis，Missouri)和α-Mem(最低要求標準培養基α，添加L-穀氨醯胺、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)(1∶1)、10％熱滅活胎牛血清(Hyclone of Logan，Utah)(在56℃水浴中孵育30分鐘滅活)、100U/ml青黴素、10μg/ml鏈黴素、10ml/L 100mM丙酮酸鈉和50μM 2-巰基乙醇。另外，在細胞開始培養前以5％大鼠T-Stim IL2(大鼠T-StimCollaborative BiomedicalProducts of Bedford，Massachusetts)作為IL2源添加到培養基中。
經過6-7天的刺激，收集脾細胞作為效應細胞進行鉻釋放試驗。約1×106SV/Balb或MC57靶細胞用200μl含50μCi51Cr的培養基培養，加入1μM校正肽p7g孵育60分鐘後洗滌，以細胞-靶位不配對的肽作為陰性對照。效應細胞以不同的效應細胞靶細胞比例與5×103靶細胞在200μl培養基中共培養4小時，培養板用的是96孔圓底或V形底組織培養板。兩個復孔的每分鐘計數平均值用於計算特異性釋放百分率。圖12顯示杆狀病毒可誘導細胞毒T細胞反應。
實施例11.光化學方法滅活杆狀病毒2升粉紋夜蛾(Tn)細胞懸浮培養物感染杆狀病毒。在28℃孵育3天後收穫被感染的細胞，800×g離心10分鐘使上清液澄清。收穫的培養基中的杆狀病毒滴度用草地夜蛾(Tn)細胞通過噬菌斑形成試驗來確定，如King Possee(1992)，杆狀病毒表達系統實驗室手冊(The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Manual)，Chapman Hall，London所描述。
用二甲亞碸(DMSO)製備0.2mg/ml的trioxalen儲存液。感染細胞懸液中加入約5-10μg/ml的trioxalen，溫和震蕩使其分散到細胞懸液內。然後將細胞懸液倒入一個無縫的不鏽鋼託盤(如約1cm深)內，將託盤置於旋轉平臺上。將一個長波紫外燈(365nm，6W)直接放到託盤上空，離液面1cm。紫外照射進行約15分鐘或足以滅活病毒的時間。
為了評價病毒滅活情況，用昆蟲細胞測定trioxalen/UV滅活樣品的滴度。例如，從細胞懸液中取樣，系列稀釋後感染Sf9細胞。接種後約16小時換液以使DMSO誘導的細胞毒性降到最低。接種後7天在顯微鏡下觀察細胞以評價細胞的病理狀況，如果是陰性的，將細胞再傳代2次以進一步確定病毒的滅活情況。還可以檢測培養物以評價細胞的細胞毒性。
實施例12.預測體內抗腫瘤效應的體外試驗用細胞毒性試驗和體內鼠腫瘤模型分析各批次的CCL21，下文描述了兩種試驗的方法。細胞毒活性係數在下文也有描述。通過測定體內試驗結束時的腫瘤大小來確定哪個批次是有活性的，哪個批次是無活性的。
誘導PBMC細胞毒活性的試驗
誘導PBMC細胞毒活性的試驗分析的是某種活化物質所誘導的細胞毒(或細胞抑制)反應，如細胞因子(IL-2或β-IFN)或抗粘附靶細胞系(A549或MG-63細胞)的杆狀病毒(BV)，所用的是效應細胞(PBMC)和靶細胞的共培養技術。孵育以後，通過Alamar blue染色定量檢測靶細胞的存活能力。試驗用的材料包括生長培養基(GM)(含Earle鹽的Eagle′s MEM，2.2g/L碳酸氫鈉，胎牛血清(FBS)，L-穀氨醯胺，青黴素和鏈黴素)MEM............................................................................500mlFBS.............................................................................50mlL-穀氨醯胺(200mM)............................................................... 5ml青黴素(10,000U/ml)/鏈黴素(10,000μg/ml)/mix....................................... 5ml生長/分析培養基(GAM)(RPMI 1640w/o pH指示劑，胎牛血清(FBS)，L-穀氨醯胺)RPMI 1640.......................................................................500mlFBS............................................................................. 50ml
L-穀氨醯胺(200mM)..................................................... 5mlPBMC製備培養基(RPMI 1640w/o pH指示劑，0.5％BSA成分V)RPMI 1640........................................................... 500mlBSA(7.5％BSA溶液).................................................... 37mlSTV溶液(鹽水A，胰蛋白，依地酸(Na4EDTA))NaCl................................................................ 8.00gKCl................................................................. 0.40gD-葡萄糖1.00gNaHCO3.............................................................. 0.58g胰蛋白1250........................................................ 0.50gNa4EDTA............................................................ 0.20g0.5％酚紅........................................................... 0.9ml玻璃蒸餾水............................................. 添加到總體積為1.0L磷酸緩衝鹽水(PBS，無鈣無鎂)KCl.................................................................. 0.2gNaCIl................................................................ 8.0gKH2PO4...............................................................0.2gNa2HPO4.............................................................1.14g玻璃蒸餾水............................................. 添加到總體積為1.0LAlamar Blue染色培養基添加Alamar blue(Biosource International)的RPMI 1640。
A549細胞A549人肺癌細胞得自美國典型培養物收集中心，處於第76代(ATCC CCL 185)。擴增細胞，然後將低傳代的細胞冷凍保存。A549細胞的主種子用液氮冷凍保存。
A549工作培養物A549細胞以粘連單層生長，傳代時必須用胰酶消化。倒掉T-175培養瓶中的培養基，細胞單層用10-15ml PBS洗滌兩次，然後每瓶中加入3-5ml STV，孵育3-4分鐘直到細胞開始脫離，溫和吹打脫離的細胞。每瓶中加入5ml生長培養基，用移液管輕輕吹打細胞製備單細胞懸液，然後將細胞轉移到含新鮮生長培養基的50ml離心管內輕輕混合。將不同比例的細胞混合物(1∶5、1∶10或1∶20的分別培養2、3和4天的細胞)加入到含40±5ml、37℃預熱的新鮮生長培養基的T175培養瓶內。
MG-63細胞人骨肉瘤細胞系MG-63得自美國典型培養物收集中心(ATCC CRL 1427)。MG-63細胞的主種子用液氮冷凍保存。
MG-63工作培養物工作培養物每3天或4天分裂一次。細胞生長到融合的單細胞層後每3天按1∶6的比例傳代或者每4天按1∶8的比例傳代。
傳代過程MG-63以粘連單層生長，傳代時必須用胰酶消化。吸去T-175培養瓶中的培養基，細胞單層用10-15ml PBS洗滌兩次，每瓶中加入4±0.1ml STV，然後在37℃±2℃、5±1％CO2中孵育3-5分鐘直到細胞開始脫離，溫和吹打使細胞脫離培養瓶壁。
用移液管上下吹打STV內的細胞製備均勻的細胞懸液，然後將細胞轉移到含新鮮生長培養基的50ml離心管內輕輕混合。將不同比例的細胞混合物(1∶6或1∶8)加入到含40±5ml、37℃預熱的新鮮生長培養基的培養瓶內。
PBMC細胞PBMC採自志願者。
製備A549或MG-63細胞用於PBMC誘導的細胞毒試驗去掉T-175培養瓶內A549或MG-63工作培養物的培養基。細胞單層用10-15mlPBS洗滌兩次，然後每瓶中加入3-5ml STV，孵育5分鐘或者直到細胞開始脫離，溫和吹打使細胞脫離培養瓶壁。每瓶中加入5ml生長培養基，用移液管輕輕吹打細胞製備單細胞懸液，然後將細胞轉移到50ml圓錐形試管內，再加入25ml生長培養基，反轉試管以混合細胞，得到細胞濃縮物。測定細胞濃縮物中細胞的密度。簡言之，將細胞懸液按1∶3稀釋，然後用Z1型Coulter計數儀計數。計數A549細胞時把計數儀的閾值設定為8微米，計數MG-63細胞時計數儀的閾值也設定為8微米。
用生長分析培養基將A549細胞濃縮到50,000細胞/ml，將MG-63細胞濃縮到65,000細胞/ml。所需要的總細胞數等於所需要的培養基總體積乘以接種密度。所需要的細胞濃縮物的體積(C)等於所需要的細胞總數除以濃縮物的密度。所需要添加的生長/分析培養基的體積(GAM)等於所需要的培養基的體積減去細胞濃縮物的體積。用於PBMC誘導的細胞毒試驗的靶細胞接種密度由(C)和(GAM)決定。
在一次性Erlenmeyer培養瓶或組織培養玻璃器皿中製備細胞懸液。在15分鐘內將細胞加到分析板中。每孔內加入100μl細胞懸液(每孔5000個A549細胞或者6500個MG-63細胞)。分析板加蓋後在溼潤的37℃±2℃、5±0.5％CO2孵育箱中孵育18到24小時。
在轉移板內進行初始樣品製備和系列稀釋初篩試驗為了提高檢測到PBMC細胞毒活性誘導因子的機率，先製備相對較高濃度的樣品。在隨後的試驗中根據樣品的活性逐漸降低樣品的濃度。
低濃度的CCL21樣品用PBS(無鈣無鎂)將低蛋白濃度的CCL21樣品(3000μg/ml以下)稀釋到400到600μg/ml之間。加入FBS和L-穀氨醯胺使樣品中FBS的濃度達到10％，L-穀氨醯胺的濃度達到1％。將240μl的樣品加到96孔板的第一孔中。用含10％FBS和1％L-穀氨醯胺的PBS在96孔轉移板內倍比稀釋樣品。
準備使用高濃度進行試驗的樣品(蛋白、活性、細胞或病毒)按照低濃度蛋白樣品的試驗方法進行製備，或者直接加入生長/分析培養基進行製備。將240μl的樣品加到96孔板的第一孔中。用生長分析培養基在96孔轉移板內倍比稀釋樣品。
杆狀病毒樣品BV樣品用生長/分析培養基(GAM)稀釋到1∶2到1∶10，按照上述方法用GAM進行系列稀釋。
β-IFN或IL-2小玻璃瓶內的β-IFN或IL-2樣品用適當的稀釋劑(注射用鹽水或注射用水)從新配製。0.25mg/ml從新配製的β-IFN等於13.9μM，1.1mg/ml從新配製的IL-2等於64.7μM。用生長分析培養基(GAM)進一步稀釋200,000IU/ml的細胞因子製備成工作液。批號為IFN-01-001的β-IFN按1∶35.75的比例用GAM稀釋，批號為MLAPM006的IL-2按1∶91.75的比例用GAM稀釋。然後用GAM稀釋到試驗所需的濃度。IL-2的試驗濃度為2000IU/ml，β-IFN的試驗濃度為2000IU/ml。
高濃度的CCL21樣品上述3mg/ml的CCL21樣品用GAM稀釋到200到600μg/ml的試驗濃度。
將稀釋的樣品轉移到靶細胞(分析)板上將稀釋板內的樣品轉移到分析(細胞)板內。樣品的最終濃度為原稀釋板濃度的1/2。用具有板到板轉移程序的移液器進行樣品的轉移。在製備PBMC的同時孵育分析板。
用於測定試驗樣品對靶細胞的直接細胞毒性的毒性對照板取兩個一樣的轉移板(稀釋板)，將培養基加到2個細胞板內。第一個板內加入50μl PBMC製備物用於誘導的細胞毒性試驗，第二個板內加入50μl PBMC製備培養基用於測定被測樣品的直接細胞毒活性。
從人外周血中分離外周血單核細胞(PBMC)製備1∶10稀釋的漂白溶液(3升)。所有接觸血的試管和移液管都要漂白過夜。將燒杯乾燥並將所有物品棄於收集生物危害品的容器。在處理血液前將50ml試管的蓋子去掉(防止血液汙染蓋子)。將血液加入到250ml可降解的聚合羧酸鹽培養瓶內，用等量的HBSS稀釋。在加入血液前30分鐘將約17ml ficoll-plaque溶液加到50ml聚苯乙烯試管內。血液會在ficoll-plaque溶液之上分層，並且不會破壞ficoll層。每3ml ficoll-plaque加入4ml血液/HBSS(即每個50ml試管內加入17ml ficoll和23ml血液/HBSS)。
在室溫下1800rpm(400×g)離心試管30分鐘(Sorval GLC-2B離心機)。用25ml的血清學移液管儘可能多地吸取頂層的液體，留約5ml的體積在第二層頂部。用5ml血清學移液管去掉第一層的剩餘部分。然後用5ml的無菌血清學移液管收集含B淋巴細胞和T淋巴細胞的第二層，轉移到另一個50ml試管內。收集物用3倍體積的不含添加物的RPMI稀釋，所得到的溶液900rpm(100×g)離心15-20分鐘(第一次洗滌)。用血清學移液管將上清去掉，細胞用40ml RPMI重懸，900rpm重複離心一次(第二次洗滌)。用血清學移液管將上清去掉，細胞用40ml PBMC製備培養基(含0.5％BSA的RPMI)重懸。準確記錄重懸細胞的總體積。用Coulter計數器對細胞進行計數以確定細胞的濃度--用PBMC製備培養基按1∶5的比例稀釋濃縮的細胞用於計數)。
確定達到合適細胞濃度所需要的重懸體積。細胞毒性試驗所需要的細胞濃度為2×106細胞/ml，冷凍PBMC理想的細胞密度為10×106細胞/ml。最終的重懸體積等於細胞濃度乘以總體積再除以最終所需的細胞濃度(2或10×106細胞/ml)。
剩餘的重懸細胞900rpm再次離心(第三次洗滌)。去掉上清液，將細胞重新懸浮到終體積。用Coulter計數器確定細胞的濃度(用PBMC製備培養基按1∶10的比例稀釋濃縮的細胞用於計數)。
試驗用的PBMC製備物細胞重懸到PBMC製備培養基內直接用於分析試驗。將細胞用PBMC製備培養基按1∶2的比例稀釋使細胞終濃度達到1×106細胞/ml。將細胞加到分析板中與50μl/孔的靶細胞混合(50000PBMC/孔)。用多道移液器添加PBMC。分析板置於37℃、5％CO2中孵育3到4天。
用於凍存的PBMC製備物將細胞重懸到含10％DMSO的FBS(熱滅活的)中，以10×106細胞/ml的濃度凍存。細胞分裝到2ml的無菌凍存管中，加入異丙醇後冷凍到-70℃冰箱的凍存盒內。用Coulter計數器確定最終的細胞濃度。
解凍凍存的PBMC用於試驗在37℃水浴中快速融化PBMC凍存管。細胞用13ml RPMI 1640重懸，裝入圓錐形離心管後900rpm(100×g)離心15-20分鐘。用血清學移液管去掉上清，細胞重懸到13ml PBMC製備培養基中(含0.5％BSA的RPMI)。用Coulter計數器計數以確定細胞的濃度(用PBMC製備培養基按1∶5的比例稀釋濃縮的細胞用於計數)。
確定達到合適細胞濃度所需要的重懸體積。細胞毒性試驗所需要的細胞濃度為2×106細胞/ml，冷凍PBMC理想的細胞密度為10×106細胞/ml。最終的重懸體積等於細胞濃度乘以總體積再除以最終所需的細胞濃度(2或10×106細胞/ml)。剩餘的重懸細胞900rpm再次離心。去掉上清液，將細胞重新懸浮到終體積。
用Coulter計數器確定細胞的濃度(用PBMC製備培養基按1∶10的比例稀釋濃縮的細胞用於計數)。將細胞用生長分析培養基按1∶2的比例進一步稀釋使細胞終濃度達到1×106細胞/ml。將細胞加到分析板中與50μl/孔的靶細胞混合(50000 PBMC/孔)。用多道移液器添加PBMC。分析板置於37℃、5％CO2中孵育3到4天。
用Alamar Blue染色分析板孵育3到4天後，從分析板上吸去培養基。每孔加入100μl Alamar Blue染色液(含10％Alamar Blue、0.5％BSA的RPMI)，分析板再孵育2到3小時。用分光光度計(測定570nm-630nm處的吸光度)或螢光光度計(測定530nm處的激發光和590nm處的發射光)。
檢測活性檢測活性定義為參照孔的反應除以PBMC樣品孔的反應。在大多數情況下，參照孔是無PBMC的樣品對照孔，其中所含的樣品濃度與PBMC樣品孔一樣，通常用最大的樣品濃度(系列稀釋中的第一孔)。在某些情況下，如果樣品量不足以設無PBMC的對照板，則參照孔用含或不含PBMC的PBS/生長培養基。
如果有足夠量的樣品來設置無PBMC的對照板，則活性設定為直接的細胞毒反應/誘導的細胞毒反應。如圖14所示，體外的試驗結果與體內的試驗結果一致。
實施例13.抗-gp64單克隆抗體阻斷杆狀病毒的腫瘤細胞殺傷效應杆狀病毒起始材料(CΔ3)用抗-gp64抗體處理。簡言之，1-500μg純化的抗-gp64鼠單克隆抗體(克隆1.3A，由Dr.DONALD Jarvis，U.of WY提供)或Ig對照抗體與不同感染複數的重組杆狀病毒在一定的體積內混合。在室溫下於暗處使抗體與病毒結合約15小時，在進行噬菌斑形成試驗或細胞毒試驗前將樣品冷藏1-2天。按照上面所描述的方法用細胞毒試驗檢測樣品。見圖15。
實施例14.滅活杆狀病毒在體外誘導PBMC介導的腫瘤細胞殺傷作用杆狀病毒起始材料(CΔ3)通過trioxalen和紫外線處理加以滅活。杆狀病毒通過補骨脂素和紫外線照射進行光滅活(Weightman，S.A.和Banks，M.J.Virol.Met.81179-182(1999))。將含杆狀病毒的昆蟲細胞培養培養基(3ml，約6E7 pfu)轉移到6孔培養板(Costar)內。用二甲亞碸(DMSO)製備2mg/ml的4，5』，8-三甲基補骨脂素(trioxalen)儲存液，然後加到每個孔內，終濃度達到100μg/ml。然後在培養板上1.5cm處放置一個手提燈(Model UVL-56，UVP，Upland，CA)用紫外線(365nm)照射培養板15分鐘。對照樣品包括不含補骨脂素的DMSO和含補骨脂素但未進行紫外線照射的DMSO。照射以後將培養基轉移到10 MWCO透析筒(Slidalyzer，Pierce)內，用磷酸緩衝鹽透析。所有樣品都用Sf9細胞進行噬菌斑形成試驗。按照上面所描述的方法檢測樣品的細胞毒活性，結果見圖16。
實施例15.腫瘤細胞是杆狀病毒的主要靶細胞完整的A549靶細胞單層培養物經杆狀病毒處理3小時後用生長分析培養基洗滌3次。同時，效應細胞(PBMC)也用杆狀病毒處理3小時後用生長分析培養基洗滌3次。按照如下組合將杆狀病毒處理的和未處理的靶細胞與效應細胞混合1)單獨的未處理靶細胞；2)未處理靶細胞和效應細胞；3)杆狀病毒處理的靶細胞和未處理的PBMC；以及4)未處理的靶細胞與杆狀病毒處理的PBMC。
孵育4天後按照SOP中所描述的方法測定靶細胞的存活能力。利用Alamar Blue螢光確定的細胞存活能力，取每組中16個孔平均值(試驗在96孔板內進行)。結果見圖17。
實施例16.利用杆狀病毒抑制肺癌動物模型內腫瘤的生長8-10周齡的C57BL/6小鼠在接種腫瘤細胞前最少要適應環境7天。在小鼠右腹部皮下接種2×105處於傳代早期(＜10代)的3LL-HM腫瘤細胞。每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤生長到50-100mm3(一般在接種後7天可以達到這個體積)時，將小鼠隨機分組，同一天給小鼠的腫瘤內注射第一次杆狀病毒。給藥方案為每日一次，連續6天。小鼠分為如下4組1)白蛋白陰性對照，單次劑量為25μg(0.5mg/ml)；2)活病毒陽性對照(滴度約為1×107/ml)；3)活病毒陰性對照(滴度約為800/ml)；以及4)滅活病毒(滴度約為800/ml)。每周測量兩次腫瘤的大小，連續測定4周。當腫瘤體積達到2500mm3或小鼠出現下列任何一種症狀時處死小鼠體重下降超過20％；腫瘤潰瘍面積超過腫瘤表面積的30％或者雖然低於30％但是腫瘤出現破潰、出血或流膿；嚴重的呼吸困難或處於垂死狀態。
如圖18所示，瘤內注射杆狀病毒可導致3LL腫瘤生長的延遲。
實施例17.利用杆狀病毒在體外和體內產生抗感染性因子的保護作用。
活杆狀病毒已經表明可誘導鼠細胞系和人細胞系分泌幹擾素(IFN)，並且可在鼠體內誘導抗腦心肌炎病毒感染的保護作用。但是用紫外線將杆狀病毒滅活後其感染性和IFN誘導活性喪失(Gronowski等，J Virology，Dec.1999，p.9944-9951卷73，No.12)。
為了研究杆狀病毒對感染因子的影響，用水泡性口炎病毒(VSV)在體內和體外感染細胞。如圖19所示，用Sf9和杆狀病毒或Sf9和杆狀病毒培養上清處理的細胞或培養基可在體外產生最大的抗VSV保護效應。如圖19所示，滅活的杆狀病毒在體內和體外都可以產生抗致病性病毒感染的保護效應。
實施例18旁觀者效應為了確定腫瘤細胞的抑制是否是直接的作用(即每個細胞必須被非致病性病毒感染)，將感染的腫瘤細胞與未感染的腫瘤細胞按不同比例混合。
A549或MG-63細胞系或PBMC與活化劑量的杆狀病毒接觸3到5小時，然後將剩餘的或未結合的病毒從應答細胞內洗去。經洗滌的BV處理細胞與未處理的應答細胞按不同比例混合。BV處理的和未處理的PBMC混合物加到未處理的A549或MG-63靶細胞內，另外，BV處理的A549或MG-63細胞混合物加到未處理的PBMC內。BV未處理的細胞和BV處理的細胞按照一樣的方法處理。
PBMC在CO2培養箱內不斷振搖使之處於懸浮狀態才能被BV感染。細胞經離心、倒掉上清、再懸浮(3次)洗滌後與未處理的PBMC混合。BV處理A549和MG-63靶細胞的方式有兩種，一種是完整單層細胞用BV處理，再用新鮮的生長培養基溫和洗滌，然後將未處理的靶細胞加到分析板內；另一種方式是如上面所描述的PBMC那樣在懸浮狀態下處理。
如果將杆狀病毒從A549和MG-63靶細胞中洗掉後很久再加入PBMC，則細胞毒試驗中所檢測到的細胞毒反應快速消失。對於A549細胞來說，去掉杆狀病毒後20小時細胞毒反應完全消失，對於MG-63細胞來說，細胞毒反應基本消失(數據未列出)。
原位洗滌杆狀病毒處理的靶細胞單層，然後與未處理的細胞混合，立即加入PBMC可對A549和MG-63細胞產生旁觀者效應。
在懸浮狀態下用BV處理PBMC或A549細胞再經過離心洗滌(3個循環的離心、去上清、再懸浮)可有效地消除細胞毒反應。
BV處理MG-63細胞並離心洗滌對MG-63靶細胞的細胞毒反應影響較小。
在振搖使之處於懸浮狀態下用BV處理PBMC再經過離心洗滌好像可以非特異性地刺激抗MG-63靶細胞的細胞毒反應(在含0％BV處理細胞的孔內)，但是對A549細胞沒有這種作用。
如圖20所示，當總細胞體積是20％的感染細胞和80％的非感染細胞時，可以觀察到最大反應。因此，未感染的細胞可被大家所熟知的旁觀者效應殺傷(即靠近靶細胞可促進非靶細胞(未感染細胞)的死亡)。
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應當理解的是本發明的各種詳細描述在不脫離本發明的範圍的情況下可以做出修改。而且，上述的說明書只是為了說明的目的，並不意味著對權利要求所定義的本發明的限制。
權利要求
1.一種在動物體內誘導免疫應答的方法，所述方法包括給予所述動物一定量的包含非致病性滅活病毒的組合物以有效地誘導所述動物體內的免疫應答。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內注射、瘤旁註射、病變部位內注射、病變部位旁註射或者上述方式的組合給藥。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述非致病性滅活病毒包括病毒顆粒或病毒成分。
6.如權利要求5所述的方法，其中，所述病毒成分是gp64。
7.如權利要求1所述的方法，其中，所述免疫應答可產生抗感染性疾病的保護作用。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述免疫應答可產生抗癌的保護作用。
9.如權利要求1所述的方法，其中，所述免疫應答是T細胞記憶反應。
10.如權利要求1所述的方法，其中，所述免疫應答可促進樹突細胞成熟。
11.如權利要求7所述的方法，其中，所述感染性疾病是病毒、真菌或細菌。
12.一種在細胞內導致細胞死亡的方法，所述方法包括將含有一定量的非致病性病毒的組合物給予所述細胞以有效地導致所述細胞死亡。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
14.如權利要求12所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低於約500,000PFU或500,000PFU等價濃度時就可導致體外試驗中約50％以上的與其接觸的細胞死亡。
15.如權利要求13所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述杆狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
17.如權利要求16所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
18.如權利要求12所述的方法，其中，所述細胞是癌細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其中，所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、腎癌或皮膚癌。
20.如權利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
21.如權利要求20所述的方法，其中，所述病毒成分是至少兩種病毒成分，其中所述病毒成分選自肽、蛋白質、核酸、脂質或糖。
22.如權利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒包括非致病性病毒的膜蛋白。
23.如權利要求22所述的方法，其中，所述膜蛋白是gp64。
24.如權利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒。
25.如權利要求24所述的方法，其中，所述滅活是化學滅活、紫外線滅活、輻射滅活或基因滅活。
26.如權利要求24所述的方法，其中，所述滅活是補骨脂素滅活、紫外線滅活或者二者的結合。
27.如權利要求12所述的方法，其中包含非致病性病毒的組合物主要由杆狀病毒家族的病毒組成。
28.如權利要求12所述的方法，其中，所述組合物與其他藥劑一同給藥，其中，所述藥劑是化療藥、抗癌藥、疫苗或其混合物。
29.如權利要求12所述的方法，其中，所述組合物與第二組合物一同給藥，所述第二組合物包含抗原和佐劑。
30.如權利要求28或29所述的方法，其中，所述組合物和藥劑或所述組合物和第二組合物同時使用。
31.一種激發動物體內CTL反應的方法，所述方法包括將包含一定量的非致病性病毒的組合物給予動物以有效地激發動物體內的CTL反應，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
32.如權利要求31所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低於約500,000PFU或500,000PFU等價濃度時就可以有效地激發體外試驗中約50％以上與其接觸的細胞產生CTL反應。
33.如權利要求31所述的方法，其中，所述動物是人。
34.如權利要求31所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
35.一種抑制動物體內腫瘤生長的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性的昆蟲特異性病毒的組合物以有效地抑制所述動物體內腫瘤的生長。
36.如權利要求35所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低於約500,000PFU或500,000PFU等價濃度時就可以有效地抑制體外試驗中約50％以上與其接觸的細胞的生長。
37.如權利要求36所述的方法，其中，所述體外試驗是軟瓊脂上的細胞生長試驗。
38.如權利要求35所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內注射和/或瘤旁註射給藥。
39.如權利要求35所述的方法，其中，所述動物是哺乳動物。
40.如權利要求39所述的方法，其中，所述哺乳動物是人或小鼠。
41.如權利要求39所述的方法，其中，所述組合物是多次給藥。
42.如權利要求35所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
43.如權利要求42所述的方法，其中，所述病毒成分包含至少兩種病毒蛋白。
44.如權利要求42所述的方法，其中，所述至少兩種病毒蛋白包括gp64。
45.如權利要求42所述的方法，其中，所述病毒成分是gp64。
46.如權利要求42所述的方法，其中，所述病毒成分包含核酸、脂質或糖中的一種或多種。
47.如權利要求35所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒。
48.如權利要求47所述的方法，其中，所述滅活是熱滅活、化學滅活或紫外線滅活。
49.如權利要求47所述的方法，其中，所述滅活是補骨脂素滅活、紫外線滅活或者二者的結合。
50.一種治療動物體內腫瘤的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地緩解所述動物體內的腫瘤症狀。
51.如權利要求50所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低於約500,000PFU或500,000PFU等價濃度時就可以有效地抑制體外試驗中約50％以上與其接觸的細胞的生長。
52.如權利要求50所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
53.如權利要求52所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
54.一種抑制動物體內癌轉移的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動物體內的癌轉移。
55.如權利要求54所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低於約500,000PFU或500,000PFU等價濃度時就可以有效地抑制體外試驗中約50％以上與其接觸的細胞的生長。
56.如權利要求54所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
57.如權利要求56所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
58.一種使動物對再次接種的腫瘤產生抵抗力的方法，所述方法包括給予所述的動物包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制再次接種的腫瘤在動物體內生長。
59.如權利要求58所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
60.如權利要求59所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
61.如權利要求58所述的方法，其中，所述動物是人或小鼠。
62.一種抑制動物體內非腫瘤性增生性疾病的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制動物體內的非腫瘤性增生性疾病。
63.如權利要求62所述的方法，其中，所述組合物通過病變部位內注射、病變部位旁註射給藥或者兩種方式結合給藥。
64.如權利要求62所述的方法，其中，所述動物是哺乳動物。
65.如權利要求64所述的方法，其中，所述動物是人。
66.一種抑制動物體內增生的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動物體內的增生。
67.如權利要求66所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
68.如權利要求66所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
69.如權利要求66所述的方法，其中，所述動物是人或小鼠。
70.如權利要求66所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內注射、瘤旁註射、病變部位內注射、病變部位旁註射給藥或者上述方式結合給藥。
71.一種抑制動物體內化生的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動物體內的化生。
72.如權利要求71所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
73.如權利要求72所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
74.如權利要求71所述的方法，其中，所述動物是人或小鼠。
75.如權利要求71所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內注射、瘤旁註射、病變部位內注射、病變部位旁註射給藥或者上述方式結合給藥。
76.一種抑制癌症患者的一種或多種症狀的方法，所述方法包括給予所述的患者一定量的包含一定量非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述患者的一種或多種癌症症狀。
77.如權利要求76所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
78.如權利要求76所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
79.如權利要求76所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內注射、瘤旁註射、病變部位內注射、病變部位旁註射給藥或者上述方式結合給藥。
80.如權利要求76所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒或病毒成分。
81.如權利要求80所述的方法，其中，所述病毒成分是gp64。
82.如權利要求76所述的方法，其中，所述一種或多種癌症症狀是腫瘤生長、異常細胞增生、癌轉移、血管生成、細胞死亡或細胞侵潤。
83.如權利要求76所述的方法，其中，所述一種或多種癌症症狀是體重下降、出血、呼吸困難、骨折、免疫耐受或疲乏。
84.一種保護動物免受感染性疾病影響的方法，所述方法包括給予所述的患者一定量的包含非致病性滅活病毒的組合物以有效地保護所述的動物不受感染性疾病的影響。
85.如權利要求84所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
86.如權利要求85所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
87.如權利要求86所述的方法，其中，所述杆狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
88.如權利要求87所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
89.如權利要求84所述的方法，其中，所述滅活是基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活，或者上述幾種滅活方式的組合。
90.如權利要求89所述的方法，其中，所述基因滅活是溫度敏感型突變。
91.一種導致一群細胞中的細胞死亡的方法，所述方法包括使所述細胞群的一部分細胞與含一定量非致病性病毒的組合物接觸從而有效地導致所述細胞群中的細胞死亡。
92.如權利要求91所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
93.如權利要求91所述的方法，其中，所述細胞群中的所述部分細胞不超過所述細胞群的約30％。
94.如權利要求91所述的方法，其中，所述細胞群中的所述部分細胞不超過所述細胞群的約20％。
95.如權利要求92所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
96.如權利要求95所述的方法，其中，所述杆狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
97.如權利要求96所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
98.如權利要求91所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
99.如權利要求91所述的方法，其中，所述細胞群包含外周血細胞、腫瘤細胞、NK細胞或巨噬細胞。
100.一種治療患者的疾病的方法，所述方法包括(a)滅活非致病性病毒，其中，所述非致病性病毒通過加入濃度約為5-10μg/ml的trioxalen並在約365nm和6W的紫外線下照射約15分鐘加以滅活；(b)將所述的滅活的非致病性病毒製備成藥物組合物；以及(c)將所述的藥物組合物給予患者。
101.如權利要求100所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
102.如權利要求100所述的方法，其中，所述疾病是癌或感染性疾病。
103.一種預測化合物的體內抗腫瘤活性的方法，所述方法包括a)使化合物與腫瘤細胞和外周血單核細胞接觸接觸；以及b)測定所述腫瘤細胞的死亡率；其中能引起被接觸腫瘤細胞死亡的化合物被認為是具有體內活性的化合物。
104.如權利要求103所述的方法，其中，所述化合物是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
105.如權利要求103所述的方法，其中，所述化合物來源於杆狀病毒家族。
106.如權利要求103所述的方法，其中，所述化合物是昆蟲特異性病毒。
107.如權利要求103所述的方法，其中，所述腫瘤細胞是A549細胞、3LL-HM細胞、4T1細胞、MT901細胞、MAT BIII細胞、B16黑色素瘤細胞或MG-63細胞。
108.一種抑制動物體內的感染性疾病的方法，所述方法包括給予所述的動物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動物體內的感染性疾病。
109.如權利要求108所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
110.如權利要求109所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
111.如權利要求110所述的方法，其中，所述杆狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
112.如權利要求111所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
113.如權利要求91所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
114.一種含有非致病性病毒和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
115.如權利要求114所述的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒是滅活的病毒。
116.如權利要求114所述的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
117.如權利要求116所述的藥物組合物，其中，所述昆蟲特異性病毒是杆狀病毒家族的病毒。
118.如權利要求117所述的藥物組合物，其中，所述杆狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
119.如權利要求118所述的藥物組合物，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
120.如權利要求114所述的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒是無活性的病毒。
121.如權利要求120所述的藥物組合物，其中，所述滅活是基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活，或者上述幾種滅活方式的組合。
122.如權利要求121所述的藥物組合物，其中，所述滅活至少通過下列方法中的兩種方法滅活基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
123.如權利要求121所述的藥物組合物，其中，所述基因滅活是溫度敏感型的突變。
124.一種藥物組合物，所述組合物中所包含的非致病性病毒至少用兩種不同的方法滅活。
125.如權利要求124所述的藥物組合物，其中，所述病毒至少用三種不同的方法滅活。
126.一種含有非致病性病毒和載體的藥物組合物，其中，所述載體是脂質體、病毒樣顆粒、病毒體或蛋白運送載體。
127.如權利要求126所述的藥物組合物，其中，所述病毒是無活性的。
128.如權利要求124所述的藥物組合物，其中，所述滅活至少通過選自如下一組的兩種方法滅活基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
129.如權利要求125所述的藥物組合物，其中，所述滅活至少通過選自如下一組的三種方法滅活基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
130.一種含有非致病性病毒和至少一種PBMC的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒至少通過選自如下一組的兩種方法滅活基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
131.如權利要求130所述的藥物組合物，所述組合物還含有至少一種癌細胞。
132.一種製備包含非致病性病毒的抗癌或抗感染性疾病組合物的方法，所述方法包括(a)使病毒與第一滅活劑接觸以有效地滅活有活性的病毒；(b)使所述病毒與第二滅活劑接觸以有效地滅活有活性的病毒；(c)使所述病毒與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合；以及(d)利用體外試驗確定所述病毒已被滅活。
133.如權利要求132所述的方法，所述方法還包括隨機採集所述抗癌組合物的部分樣品用於分析該組合物的安全性、有效性或毒性中的一種或多種。
134.如權利要求133所述的方法，其中，所述第一滅活劑是基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
135.如權利要求133所述的方法，其中，所述第二滅活劑是基因滅活、化學滅活、光化學滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活，但是第一滅活劑與第二滅活劑是不同的。
136.如權利要求133所述的方法，所述方法還包括將所述抗癌或抗感染性疾病組合物的所述隨機樣品的安全性、有效性或毒性數據中的一種或多種與第二抗癌組合物已有的安全性、有效性或毒性數據進行比較。
137.如權利要求132所述的方法，其中，所述病毒是否有活性是通過噬菌斑形成試驗確定的。
138.如權利要求137所述的方法，其中，所述噬菌斑形成試驗用的是Sf9細胞。
139.如權利要求132所述的方法，所述方法還包括通過EM計數非致病性病毒。
140.如權利要求132所述的方法，其中，在步驟(a)和步驟(b)後都驗證所述的病毒是否有活性。
141.如權利要求136所述的方法，其中，所述比較的結果在所述抗癌或抗感染性疾病組合物上市前需要彙編。
142.如權利要求1、12、31、35、50、54、58、62、66、71、76、84、91或108之一所述的方法，其中，所述非致病性病毒製備成藥物組合物。
143.一種包含非致病性的滅活病毒和至少一種抗原以及至少一種佐劑的藥物組合物，其中，所述抗原與非致病性的滅活病毒不同。
144.一種包含佐劑組合物的免疫刺激組合物，所述佐劑組合物包含非致病性的滅活病毒、至少一種抗原，其中，所述抗原與佐劑組合物不同，另外，其中所述免疫刺激組合物能刺激針對抗原的免疫應答。
145.如權利要求144所述的免疫刺激組合物，其中，所述非致病性的滅活病毒包括滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
146.如權利要求18所述的方法，其中，所述癌細胞是上皮癌細胞。
147.一種包含非致病性病毒和外周血單核細胞(PBMC)的藥物組合物。
148.一種治療癌的方法，所述方法包括給予需要治療的患者以權利要求147所述的藥物組合物。
全文摘要
本發明提供了通過給予受試者非致病性病毒來治療和/或預防腫瘤的方法和組合物。本發明還提供了通過給予受試者非致病性病毒來治療和/或預防感染性疾病的方法和組合物。
文檔編號A61K31/00GK1717250SQ200380104308
公開日2006年1月4日 申請日期2003年10月1日 優先權日2002年10月7日
發明者W·M·卡瓦諾, D·L·斯隆, M·L·麥克佔 申請人:希龍公司