使用非均相催化劑的點擊化學的製作方法

2023-08-09 15:21:41 2

專利名稱：使用非均相催化劑的點擊化學的製作方法
使用非均相催化劑的點擊化學本發明涉及用於通過點擊反應(Click reaction)使用非均相催化劑系統偶聯分子的新的方法和試劑。此外，本發明涉及用於進行點擊反應的新的裝置。
背景技術：
在2001/2002年Sharpless和Meldal的小組獨立地定義了「點擊化學」的概念和將轉化認為是點擊反應的標準[2]和[3]。自此，銅催化的由疊氮化物與炔類得到1，2， 3-三唑類(1，3-偶記Huisgen環加成[1])的反應就被成了應用最廣泛的點擊反應。由於其條件溫和且效率高，該反應在生物學和材料科學中得到了非常廣泛的應用，諸如目的為 DNA標記方面的應用[16]。當應用於生物分子標記時該方法的限制之一涉及Cu(I)作為點擊反應催化劑的應用。Cu-離子對細菌和哺乳動物細胞是有毒的，因而限制該反用於活體系統內部。此外， 對於DNA和RNA，由於Cu-離子催化磷酸二酯水解，因此不恰當的操作催化劑能引起寡核苷酸類的降解[17、18]。這些問題的解決方法已經有報導，包括原位Cu(I)生成和/或使用 Cu (I)-穩定配體。後者受限於底物和實驗條件，其耐受點擊反應所用的用以溶解有機配體 (通常為叔胺)的有機溶劑的存在。加入甚至是小量的有機溶劑後分子諸如蛋白質或長DNA 鏈最終沉澱或形成不溶解的附聚物，因而對點擊反應的產出有負面影響。在任何情況中，游離Cu(I)離子在環境條件下存在時間有限，其被氧化為點擊反應-無活性的Cu(II)。所以，為點擊反應新鮮製備的Cu(I)配體混合物的操作需要小心和迅速。因此該方法只能用在勞動密集型的手工作業中，但不能用在自動化過程中。依據最新的綜述[4]，在硫酸銅(II)(約1 % )和抗壞血酸鈉(約10% )存在下點擊反應足以在含水介質(例如&0/tBu0H)中原位生成催化活性的Cu(I)，且通常是優選的。作為選擇的條件，諸如原位氧化Cu(O)或直接引入Cu(I)鹽(通常為CuI或CuBr)也被已使用[5]。當兩個反應配偶體均已在固相條件下各自被偶聯時(例如在聚苯乙烯上) [3、6]，鮮見由非均相銅(I)源介導的點擊化學的實例。有一個報導依賴於通過基於聚苯乙烯的苄型胺螯合於可能不穩定的銅[7a]。其中只研究了無阻礙的、低分子量的和非鹼性含氮的實例，而沒有定量的從固體載體損失銅的數據。基於未被負載的銅簇的混懸液的其它的研究也受到了限制[7b]。Lipshutz等人最近描述了炭載銅(Cu-C)作為用於該新領域的簡單、價廉且尤其是廣泛和高效的非均相催化劑的優點[19]。據報導，在水中使用超聲波浴將Cu(II)源、例如Cu (NO3)2)浸透活性木炭(Aldrich, 100目，$53. 90/千克)[8]，將水蒸餾，並乾燥後，可得到納米粒-尺寸的Cu(I)-C[9]。該Cu(I)由Cu(II)產生，不是在原位還原反應中產生，而是經由炭介導的還原反應產生，這使得這樣產生的Cu(I)源的預組裝和存儲時間延長。由於CuO和Cu2O兩者均被提出過作為在炭基質內的物質[10]，所以Cu(I)的出現表明可能不需要還原劑。實際上，該作者已經證實在室溫在10mOl% Cu-C存在下一旦將苄基疊氮與苯乙炔(1 1)在二巧悉烷中混合，環加成10小時內完成。過濾和溶劑蒸發後區域專一性地且近乎定量地得到純的三唑[19]。此外，Lipshutz等人證實在溶液中沒有游離Cu(I),確證了該點擊反應事件的非均相性質。
總之，Lipshutz等人報導了可以通過包埋在活性炭細孔中的銅納米粒非均相催化有機疊氮化物與末端炔類之間的高效的點擊化學[9]。此外，該作者還展示反應能用化學計量的K3N加速或通過簡單地增加該反應的溫度而加速。在微波輻照下，能在150°C形成三唑類。環加成能在純有機介質中、含水溶劑混合液中或在純水中進行。通常與銅鹽的選擇有關的溶解度問題、銅汙染和產率不高可完全避免。不需要已知可加速點擊反應的外部配體。該催化劑似乎不受暴露於空氣而影響，表明其保存期限長。其對一個或兩個配偶體中的空間位阻耐受良好，且產物分離顯著容易，如Lipshutz等人[19]所證明。在[20]和[21]中還公開了 Cu/C催化劑在游離形式的有機分子的點擊反應中的應用。然而這些文獻中沒有一篇描述了其中點擊配偶體之一被固定於固體載體上的點擊反應。在[16]、[22]、[23]和[24]中公開了涉及生物分子的應用的點擊反應。這些反應在可溶解性催化劑的存在的進行。本發明描述了非均相催化劑的應用，特別是用於標記諸如DNA的生物分子的 Cu(I)-C-催化劑的應用，以及許多可行的基於本發明的易用的裝置或方法，其中幾種在本申請中作為概念驗證和實施例顯示。發明概述本發明涉及在非均相催化劑存在下、優選在水相中對生物分子進行的點擊反應， 例如用於標記生物分子諸如核酸的點擊反應。本發明為新的和易用的生物分子-標記程序以及易於操作的和/或自動化生物分子-標記方案開闢了道路。該點擊反應在下文為1，3-偶極基團、特別是疊氮化物與不飽和的基團、特別是炔烴之間的通過非均相催化劑例如非均相銅(I)或其它的金屬催化劑所催化的反應。優選地，該點擊反應包括得到5-元雜環基團諸如1，2，3_三唑基團的(3+2)1,3-偶極環加成反應。本發明的第一個方面涉及將第一個分子與第二個分子通過點擊反應偶聯的方法， 其中第一個分子包含第一個點擊官能團，其為點擊-反應性的不飽和基團，且第二個分子包含第二個互補的點擊官能團，其為能與第一個點擊官能團進行點擊反應的點擊-反應性的1，3-偶極基團，所述方法包括在非均相催化劑存在下將第一個和第二個分子在其中第一個和第二個分子之間發生點擊反應的條件下接觸，其中第一個和第二個分子之一為生物分子。本發明的另一個方面涉及將第一個分子與第二個分子通過點擊反應偶聯的方法， 其中第一個分子包含第一個點擊官能團，其為點擊-反應性的不飽和基團，且第二個分子包含第二個互補的點擊官能團，其為能與第一個點擊官能團進行點擊反應的點擊-反應性的1，3-偶極基團，所述方法包括在非均相催化劑存在下將第一個和第二個分子在其中第一個和第二個分子之間發生點擊反應的條件下接觸，其中第一個和第二個分子之一被固定於固體載體，例如被固定於非均相催化劑和/或被固定於另外的固體載體物質，例如色譜填料。在該實施方案中，點擊反應可被視為「在固體載體上點擊」。本發明的另一個方面涉及具有至少一個反應室的裝置，其中所述反應室包含用於進行點擊反應的非均相催化劑並任選地包含另外的固體載體物質，其中點擊反應的配偶體可被固定於所述非均相催化劑和/或被固定於所述另外的固體載體物質，特別是用於上文所述的方法。本發明的另一個方面涉及具有至少一個反應室的裝置，其包含用於點擊反應的非均相催化劑並任選地包含被固定於前述非均相催化劑上的用於點擊反應的配偶體之一、優選包含點擊-反應性的1，3偶極基團的配偶體。本發明的另一個方面涉及用於點擊反應的試劑盒，其包含具有至少一個反應室的裝置，其中所述反應室包含用於進行點擊反應的非均相催化劑並任選地包含另外的固體載體物質，其中點擊反應的配偶體可被固定於所述非均相催化劑和/或被固定於所述另外的固體載體物質，且包含第一個和第二個分子，其中第一個分子包含第一個點擊官能團，其為點擊-反應性的不飽和基團，且第二個分子包含第二個互補的點擊官能團，其為點擊-反應性的1，3_偶極基團。本發明的另一個方面涉及以上方法和用於製備標記的生物分子的試劑的應用。這些標記的生物分子可用於檢測被分析物，例如樣品中的核酸，特別涉及通過點擊反應標記的化合物的應用，其與待檢測的被分析物形成結合產物。該方面的實施方案涉及用於檢測樣品中的被分析物的方法，其包括以下步驟(i)提供具有至少一個反應室的裝置，其中所述反應室包含用於進行點擊反應的非均相催化劑並任選地包含另外的固體載體物質，其中點擊反應的配偶體可被固定於所述非均相催化劑和/或被固定於所述另外的固體載體物質。(ii)在所述反應室中、在非均相催化劑存在下，將作為第一個點擊配偶體的第一個分子與作為第二個點擊配偶體的第二個分子在其中第一個和第二個分子之間發生點擊反應的條件下接觸，其中第二個分子優選包含報導基團或報導前體基團，(iii)如需要，則將報導前體基團轉化為報導基團，(iv)將第一個分子和第二個分子的偶聯產物與樣品在允許檢測被分析物的條件下接觸，和(ν)定性地和/或定量地檢測被分析物，優選通過所述報導基團進行。優選地，被分析物檢測包括自動化操作。更優選所述點擊反應和被分析物檢測在單一的一體化裝置內進行。本發明可高度靈敏地檢測被分析物並設計與合成通過適於生命科學研究、分子診斷、藥物和納米技術應用的非均相催化的點擊反應而連接的新的軛合物。優選的應用包括但不限於遺傳變異性的檢測，例如單核苷酸多態性(SNP)、殺蟲劑或藥物抵抗、耐受或不耐性、基因分型，例如有機體物種或株系的檢測；基因修飾的有機體或株系的檢測，或者病原體或有害生物的檢測；和疾病的診斷，例如遺傳性疾病、變應性疾病、自身免疫疾病或感染性疾病。進一步優選的應用是檢測樣品中的核酸用於品牌保護，其中使用產品特異性信息對產品諸如農業產品、食品或有價值的商品和/或這些產品的包裝進行編碼，所述產品特異性信息例如但不限於生產地點、生產日期、經銷商等，且其中所述信息使用如上文所述的方法進行檢測。優選實施方案詳述本發明提供了方法和試劑，由此可用報導基團通過點擊反應對被分析物進行易用的和特定的標記。此外，本發明提供了方法和試劑，由此通過單個或多個點擊反應從兩個或多個配偶體形成特定的軛合物。所述點擊反應在非均相催化劑存在下在第一個分子和第二個分子之間進行。這些分子之一是包含不飽和的點擊-反應性的基團、優選炔基的點擊配偶體，其能與點擊-反應性的1，3-偶極基團、優選疊氮基團通過點擊反應進行反應。另一個分子為互補的點擊配偶體，其包含點擊-反應性的1，3_偶極基團、優選疊氮基團。在優選的實施方案中，點擊反應配偶體之一或者在多個點擊反應的情況下超過一個配偶體可例如通過共價或非共價負載和/或吸附方式被固定於非均相催化劑和/或另外的固體載體物質，從而得到易用的試劑盒。此外，所述試劑盒在洗滌步驟之後可重複使用。點擊-反應性的不飽和基團的優選的實例為親偶極物質(dipolarophiles)，諸如烯烴和炔烴和具有相關雜原子官能團的分子(諸如羰基類和腈類)。點擊-反應性的不飽和基團的尤其優選的實例為炔類。點擊-反應性的1，3-偶極基團的優選的實例為包含一個或多個雜原子的化合物， 其能被描述為具有至少一個表示帶電荷偶極的中介結構。優選為直鏈的1，3_偶極基團，例如炔丙基-丙二烯基-型偶極諸如腈氧化物R^^N4「喊--』 R-C^j-Qr疊氮化物R-N=N^i--—— R-N.-N=NI重氮烷β—Ηδ二Ν+ΞΝΙ-- R-C=N=N^點擊配偶體包含可與互補的點擊配偶體進行環加成反應的官能團，在所述環加成反應中在點擊官能團和反應配偶體之間的形成環連接、例如雜環連接。所述點擊反應的尤其優選的實例是疊氮化物和炔基之間的(3+ 環加成，該反應導致形成1，2，3-三唑環。因而，偶聯產物可通過包含疊氮化物的配偶體和包含炔基的配偶體進行點擊反應而生成。該點擊反應的尤其優選的實施方案包括銅催化的(3+2)環加成反應，例如疊氮化物和炔基之間的反應。作為疊氮化物/炔烴環加成反應的結果的1，2，3-三唑類的不可逆的形成是正交的(orthogonal)，所需的化學基團小(摻入而對生物分子的環境破壞最小)
且具有選擇性，原因是自然界中沒有疊氮化物和炔類。
R1
—一一 cu(i) ^
'N
R2
「點擊」其中R1和&為第一個和第二個分子。本發明的方法包括在非均相催化劑存在下的點擊反應。所述非均相催化劑優選為非均相Cu-催化劑，更優選為非均相Cu(I)-催化劑。然而，應當注意的是可使用其它的非均相金屬催化劑諸如&、W、Fe、Ru、Co、I h、Ir、Ni、Pd、Pt、Ag、Au、Zn、Cd、Hg和對點擊反應連接的催化有直接或間接作用的其它的金屬離子。在優選的實施方案中，所述非均相催化劑為金屬-C-催化劑，即包含基於碳的載體的催化劑，諸如其中摻入金屬離子、例如Cu(I)-離子的炭。在尤其優選的實施方案中，所述非均相催化劑為Cu (I) -C-催化劑，例如Cu (I)-炭催化劑，其可如[19]中所述而製備。
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適合的Cu(I)-炭催化劑的及其製備的簡圖描述如圖Ia中所示。將木炭裝載 Cu(II)源，Cu(II)源被炭還原並摻入其中，由此得到穩定的Cu(I)源。在第一個和第二個分子之間的點擊反應的優選的實施方案，即在非均相催化劑存在下DNA-炔烴和疊氮化物之間的反應如圖Ib中所示。非均相催化劑可以是微粒催化劑，例如由IOnm至1000 μ m大小的粒子構成的非均相催化劑，優選10 μ m至200 μ m或IOnm至IOOOnm的粒子。或者，催化劑還可以是多孔的非微粒催化劑，例如其中包埋催化活性粒子的固體基質。此外，該反應可在以下條件下進行其中該反應配偶體之一被固定於固體載體物質，所述固體載體物質能與點擊反應的試劑和/或產物(核酸或其它的點擊配偶體)發生物理的相互作用。所述固體載體物質優選為例如能固定點擊反應的配偶體的微粒或非微粒固體物質的固體載體物質。在一個實施方案中，所述固體載體物質可以是非均相催化劑，例如Cu(I)-C-催化劑，其上可吸附例如點擊-官能團化報導分子，例如螢光或非螢光染料或生物素。在另一個實施方案中，所述固體載體物質為不同於非均相催化劑的物質，例如固定有生物分子、諸如核酸、核酸類似物、蛋白質或肽的色譜填料。在這些實施方案中，點擊反應能在以下條件下進行其中第一個和/或第二個反應配偶體被固定於固體載體，且另一個配偶體為在溶液中的游離態。適合的色譜填料的實例為離子交換材料、親水材料或疏水材料。在一個優選的實施方案中，親水材料、例如矽膠能與非均相催化劑、例如Cu(I)/C組合使用。在另一個優選的實施方案中，疏水材料、例如二氧化矽C18或C4或離子交換樹脂能與非均相催化劑、例如 Cu(I)/C組合使用。在另一個優選的實施方案中，所述固體載體物質可以是用於生物分子、 例如核酸、核酸類似物、蛋白質或肽類的固相合成的樹脂。令人驚訝發現非均相催化劑系統可有效地催化固定的反應配偶體(例如共價的或非共價固定的反應配偶體)和在溶液中游離的反應配偶體之間的點擊反應。所述策略可同時完成點擊反應以及產物從雜質和/或最終出現在試劑溶液中的鹽中的純化和/或分
1 O在本發明一個優選的實施方案中，點擊反應在包含至少一個反應室的裝置中進行，例如移液器吸頭、旋轉柱(spin column)、生物晶片上或微量滴定板中的反應室等。所述反應室包含非均相催化劑並任選地包含上文所述的用於固定反應配偶體的另外的固體載體物質。所述催化劑和載體物質可處於單一反應室中，例如作為粒子的物理混合物或作為非均相固體基質或在該反應室中的分隔的各隔室中。各點擊反應配偶體可同時或依次放入反應室。如果反應室包含固體載體，優選在發生固定化的條件下首先放入待固定於反應室的反應配偶體。在該實施方案中，固定的反應配偶體優選為生物分子、例如核酸或肽或多肽。然後，可在其中固定的和游離的點擊配偶體可完成點擊反應的條件下將游離的點擊配偶體、例如點擊-官能團化報導分子放入反應室。在另一個優選的實施方案中，固體載體物質(即所述催化劑和/或任選另外的載體物質)可被反應配偶體之一預浸透，並以乾燥形式提供。然後可在固定的和游離的點擊-配偶體之間發生點擊反應的條件下將包含另一個反應配偶體的液體介質通過所述固體載體物質。
非均相催化劑和另外的載體物質各自的量可在很大程度不同。例如，催化劑和另外的載體物質比率可由1 1000至1000 1(以重量計)。在點擊反應完成後，優選將偶聯產物從固體載體物質洗脫，例如通過改變溫度和/或介質組分(例如通過改變鹽和/或有機溶劑的量等)。依據本發明所述點擊反應優選在含水介質中進行，即在包含至少60% (ν/ν)、優選至少75% (ν/ν)、甚至更優選至少90% (ν/ν)和甚至更優選至少95% (ν/ν), 98% (ν/ν) 或99% (ν/ν)水的液體介質中進行。最優選含水介質中沒有有機溶劑。除水之外，如需要時，所述液體介質還可包含適合的緩衝物質或其它的輔助劑。或者，該反應可在有機或含水 /有機液體介質中使用與相應的非均相催化劑相容的有機溶劑進行。依據本發明，我們發現非均相催化的點擊反應可在環境溫度可有效進行。一般情況下，反應溫度可以為約4至約80°C或更高的溫度，尤其為約10至約40°C。最優選地，所述反應在約15至約25°C的溫度進行。此外，我們發現本發明的非均相催化的點擊反應進行得相當快，從而為生物分子的標記提供方便的和簡單的方案。例如，反應時間可為約1分鐘至約10分鐘或更長時間， 尤其是約2分鐘至約5分鐘。在特定的情況中，可能需要較長的反應時間，特別是10分鐘至4小時或10分鐘至8小時。非均相催化的點擊反應能通過與非均相催化劑和/或與底物相互作用的胺類或其它的分子的存在而加速。在一個優選的實施方案中，將高至10% (ν/ν)、更優選高至 (ν/ν)和最優選地高至0.1% (ν/ν)的胺加入所述催化劑/試劑混合物。所述胺可以是伯胺、仲胺或叔胺，其可以具有芳族的、雜芳族的、脂肪族的、脂環族的、不飽和的或完全飽和的骨架。優選地，所述胺為叔胺諸如三乙胺。此外，非均相催化的點擊反應能通過不同來源的能量加速，諸如微波或紅外輻照。此外，我們發現所述反應可以在非常小的體積中進行，例如以存在於微量滴定孔中、移液器吸頭或旋轉柱中的反應體積中進行。例如，所述反應可在具有可從約0. 1至約 1000 μ 1或更大、優選約0. 1 μ 1至約100 μ 1、且更優選約0. 1 μ 1至約10 μ 1的體積的反應室中進行。在尤其優選的實施方案中，所述反應在移液器吸頭中進行，例如在其中提供了預定量的非均相催化劑的移液器吸頭中進行。在另一個優選的實施方案中，所述反應可在已經在其中摻入了預定量的非均相催化劑的旋轉柱中進行。在不同的優選的實施方案中，所述反應能在注射器內操作，所述注射器裝有多至IOml (用於大規模的點擊反應)或1至5ml 或優選0. 1至Iml的確定量的非均相催化劑。在本發明的一個實施方案中，第一個和/或第二個分子選自(1)天然和人工胺基酸及它們的低聚物和聚合物，諸如肽類、輪烷、糖肽類、蛋白質、酶類、抗體類等，(2)核酸和核酸類似物，諸如DNA、RNA、LNA、PNA、MeO-RNA、硫代磷酸酯核酸等，(3)脂質，諸如脂肪酸類及它們的衍生物，例如脂肪酸酯，磷脂類，鞘脂類和包含諸如脂質體、膠束、細胞膜結構的脂質等，(4)聚合物和生物聚合物或它們的單體、凝膠類和膜類，(5)病毒類、維生素類、激素類、神經遞質諸如多巴胺、腎上腺素、5-羥色胺等，(6)糖類諸如單糖類、寡糖類和多糖類，
(7)高分子類諸如有機和無機粒子、玻璃表面(glass surface)、矽材料、二氧化矽珠、磁性小珠、金屬納米粒、金屬絡合物、金屬茂合物、樹狀高分子、糖樹狀分子 (glycodendrimer)、納米管、富勒烯、量子點。所述分子已經被用於點擊反應，然而，不是與非均相催化劑組合使用。在「用於生物技術和材料科學的點擊化學(Click Chemisty for Biotechnology and Materials kience)」(作者Joerg Laham，Wiley 2009) 一書中可以找到多方面的概述，其內容被引入本文作為參考。在優選的實施方案中，第一個和第二個分子之一是生物分子，例如選自核苷類、核苷酸類、胺基酸、肽類、糖類和脂質的分子，其包括天然生成的和人工修飾的核苷酸類或核酸類。更優選地，所述生物分子選自核酸類、其包括修飾的核酸類。所述生物分子可以游離分子或以固定形式出現，例如如上文所述地共價或非共價地結合於固體載體物質。第一個和第二個分子中的另一個可以是⑴報導分子，(ii)親和性分子，(iii)固相，(iv)生物分子，例如蛋白質或脂質，(ν)接頭分子或間隔分子，其可包含脂肪族或脂環族基團、芳族或雜芳族基團、烯基、炔基和/或聚合物基團、例如聚乙二醇基團，(vi)藥用的化合物或基團、光敏的基團，和/或氧化還原活性的基團，和/或識別部位。報導分子可以是能通過已知的分析方法檢測的任何分子。優選的報導分子是染料，即通過光學方法可檢測的分子。所述染料可以是螢光、發光的或另外的光學可測的染料。所述親和性分子可以是能與互補的親和性配偶體特異性地形成非共價的親合勢鍵的任何分子，所述互補的親和性配偶體諸如生物素或生物素類似物，其可與鏈黴抗生物素或抗生物素蛋白形成親合勢鍵，或半抗原，其可與抗體形成親合勢鍵。所述固相可以是任何在分析方法中適用的固相，例如晶片(chip)的表面、微孔等或微粒。第二個點擊配偶體還可以是任何天然產生的或具有確定或不確定分布的合成的聚合物，例如聚乙二醇，或藥物或那些分子的組合。在尤其優選的實施方案中，第一個分子(為生物分子)與至少一個第二個分子 (為報導分子或親和性分子或者用於與報導分子或親和性分子偶聯的反應性化合物)反應。第一個分子優選包含至少一個炔基且各第二個分子優選包含疊氮基。在非均相催化劑存在下在含水介質中通過點擊反應標記生物分子有巨大優勢。這些優勢可被總為以下幾項1.非均相催化劑在環境條件下穩定，且不引起生物分子的破壞，例如在核酸中的鏈斷裂。因此，所述金屬催化劑能預先製備並長期存儲。對於點擊反應而言，這代表這一個非常重要的改善，尤其對與生物分子進行的點擊反應而言如此。2.所述反應可在沒有非水溶性金屬配體、例如Cu(I)-配體的情況下進行。3.所述反應能在含水介質中，即在沒有有機溶劑諸如DMSO和/或叔丁醇的情況下進行。這些有機溶劑對較長的核酸分子即超過30個核苷酸類的DNA鏈不是最佳的。此外，這些分子與多肽類不相容或與使用HPLC對反應混合物進行後處理不相容。4.通過使用非均相催化劑能大幅度減少包括準備、進行反應以及後處理在內的反應時間。5.所述非均相催化的點擊反應能用在自動化操作中，例如用於自動化標記操作諸如用在DNA-自動合成儀上，這擴展了點擊化學的工業應用。6.炭一般用於脫色並純化反應混合物。因而，使用非均相基於碳的催化劑、例如Cu⑴/C催化劑的另一個優勢是一個步驟的反應-純化。使用Cu (I)/C與例如保有核酸分子(例如點擊反應期間或結束後的寡核苷酸)的C18材料的混合物或基質可增加這一優勢的效果，這樣做使得可以洗掉樣品的鹽類和其它的雜質並可以濃縮樣品。然後可在適合的洗脫劑、例如1 1或8 2或不同組成的乙腈/水存在下，實現產物例如核酸軛合物的最終洗脫。7.所述反應可在固定有第一個或第二個反應配偶體的固體載體物質存在下進行。 這使得所需反應產物可有效純化和/或分離。典型的現有技術的點擊反應方案(圖2)和本發明的有創造性的點擊反應方案 (圖3)的對比表明了以上優勢。在另一個優選的實施方案中，反應配偶體之一(例如點擊-反應性的螢光或非螢光染料或生物分子諸如DNA)能預先直接吸附於固體載體，所述固體載體可以是非均相催化劑(例如Cu-C)和/或另外的固體載體物質。由此提供了易用的試劑盒，例如用於生物分子-標記的試劑盒，其包含(a)非均相催化劑並任選地包含另外的固體載體物質，和(b) 點擊反應的配偶體之一，優選標記物，其可非共價地被固定於所述催化劑和/或另外的固體載體物質。這極大方便了生物分子的標記方案，例如寡核苷酸類或蛋白質，其將實際動手的工作簡化為簡單地將待標記的所述生物分子分配到包含預吸附的固相(例如Cu-C-螢光素，以獲得螢光-標記的-生物分子；Cu-C-生物素；Cu-C-Alexa550，Cu-C-Eterneon等)的反應室中。所述易用的試劑盒也適於自動化操作。在尤其優選的實施方案中，包含點擊-反應性的不飽和基團的第一個分子為如上文所述的生物分子。該生物分子優選包含多個可以相同或不同的點擊-反應性的不飽和基團。第二個分子優選為如上文所述報導分子，例如螢光或非螢光染料。在另一個作為選擇的尤其優選的實施方案中，包含點擊-反應性的1，3_偶極基團的第二個分子為如上文所述的生物分子。該生物分子可包含單個點擊-反應性的1，3_偶極基團。優選地，該生物分子包含多個可以相同或不同的點擊-反應性的1，3_偶極基團。 第二個分子優選是如上文所述的報導分子，例如螢光或非螢光染料。本發明的另一個尤其優選的實施方案包括在非均相催化劑存在下在水或含水緩衝液中進行的例如炔烴-修飾的核酸、諸如DNA與疊氮化物-修飾的報導基團、例如螢光或非螢光染料的反應，或者疊氮化物-修飾的核酸、諸如DNA與炔烴-修飾的報導基團、例如螢光或非螢光染料的反應。在所述反應的終點，產物可從原料(如果仍在該溶液中的話) 中純化，例如通過尺寸排阻從原料中分離最終產物，和/或例如通過過濾從非均相催化劑中分離。所述產物在含水溶液中獲得，可以在反應後照原樣被分析或者使用。從樣品中過濾Cu/C的步驟能在從反應混合物(例如染料、核苷、小分子等)中分離其它的組分的步驟之前、期間和/或之後進行。適合的過濾/純化系統的實例是用於純化超過IOObp的DNA片段的矽膠膜(例如Jena Bioscience)、用於除去未摻入的核苷酸類的離心過濾機單元(例如來自Jena Bioscience)、QIAquick PCR純化試劑盒(來自 QIAGEN)，Microcon 離心過濾機裝置(來自 Millipore)，Amicon Ultra-0. 5 和 Ultra-15離心過濾機裝置(來自Millipore)，Ultrafree _MC和-CL離心過濾機裝置(來自Millipore)，孔徑0. 2禾Π 0. 45 μ m的Acrodisc 丨3匪和25匪注射器式過濾器(來自 PALL Science)，帶有醋酸纖維素或尼龍膜的Gestoi^Spill-X 離心管過濾器(例如膜孔徑為 0. 22 0. 45 μ m), Vectaspin Micro, Anopore ( ^ g Whatman )，Nanosep MF ^ 置，Sample Reservoir過濾器，例如13mm注射器式濾器，0. 2 μ m，用於樣品製備和小體積化學過濾的PTFE、尼龍或聚丙烯膜(來自VWRhEconoSpin All-in-1微型旋轉柱和適合的接收管，Filterplate 96-孔，lml,GF/FF,GF/N和GF/B過濾器，RC/5，IO-Ultrafi 1 tration-微孔板，5 和 IOkD, 96-孔，RC/30 和 IOOUltrafiltration-微孔板，30 和 IOOkD, 96-孔，和 AcroPrep 96 和 384Multi~ffell Filter Plates(來自 PALL)。本發明還包括被分析物的檢測。所述檢測可以是定性測定，例如被分析物、例如待分析樣品中特定的核酸序列存在或不存在的檢測。然而，本發明還能定量檢測待檢測樣品中的被分析物、例如核酸序列。定性和/或定量檢測可包括依據本領域已知的方法檢測報
道基團。待檢測的被分析物優選選自在生物學或環境樣品中的被分析物諸如生物分子、藥物或有毒化合物。生物分子的實例包括核酸、肽類、多肽類、糖類、脂質、留體類等。例如，所述被分析物可選自核酸和核苷_、核苷酸-或核酸-結合的分子，例如核苷_、核苷酸-或核酸-結合的蛋白質。更優選地，所述被分析物是核酸，例如能依據已知的技術、特別是雜交技術檢測的任何類型的核酸。例如，核酸被分析物可選自DNA，例如雙鏈或單鏈DNA、RNA 或DNA-RNA雜交物。核酸被分析物的特別的實例是基因組DNA、mRNA或源自其的產物，例如 cDNA。本發明的方法能進行依據適於檢測被測物、特別是樣品中的核酸被分析物的任何已知的測試模式進行。例如，所述方法可涉及被固定於固體表面上的被分析物的檢測，所述固體表面諸如膜，例如在免疫印跡、DNA印跡或RNA印跡中，晶片，晶片(array)或微粒諸如小珠。此外，所述檢測能在凝膠中進行，例如在凝膠、例如瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中的樣品電泳分離之後進行，通過色譜方法和/或通過質譜方法進行。所述方法可包括測定單個被分析物或並行檢測多個被分析物，例如在晶片或微陣列模式中。所述樣品可以是可包含待檢測被分析物的任何樣品。例如，所述樣品可以是生物學樣品，諸如農業樣品，例如包含植物材料的樣品和/或與植物生長、植物材料存儲或加工的位置相關的物質。另一方面，所述樣品還可以是臨床的樣品，諸如組織樣品或體液樣品、 諸如血液、血清、血漿等，特別是人類來源的。樣品的進一步的類型包括但不限於環境樣品、 土壤樣品、食品樣品、法醫樣品或來自為品牌保護而檢測的有價值的商品的樣品。由於其高靈敏度，本發明的方法適於直接檢測被分析物而不用放大。例如，可通過 DNA印跡法和本發明方法聯合進行生物學樣品中的被分析物例如基因的檢測。然而，應當注意本發明的方法也允許核酸的檢測與放大步驟組合，所述放大步驟可依據已知的方案進行，諸如PCR或其改進方法、諸如不對稱PCR、實時PCR、逆轉錄PCR等或其它的放大方案諸
12如 LCR。在本發明的一個優選的實施方案中，進行被分析物的序列特異性檢測，其中例如將樣品中具有特異性序列的核酸與其它的核酸序列相區別，或者將樣品中能結合特異性核酸序列多肽與其它的多肽類區別。所述序列特異性檢測優選包括序列特異性雜交反應，通過所述反應待檢測的核酸序列與帶有標記基團或標記前體基團的化合物結合。然而，應當注意本發明還可以非序列特異性地檢測核酸，例如檢測樣品中存在的任何核酸。為鑑定待檢測的被分析物，可將所述樣品在其中與被分析物、例如核酸形成結合產物的條件下與檢測試劑接觸，所述檢測試劑為點擊配偶體，即如上文所述的第一個或第二個分子。在該實施方案中，點擊反應可在被分析物存在下進行，即在所形成的結合產物上進行。在一個不同的實施方案中，通過點擊反應第一個和第二個分子進行反應，得到標記的檢測試劑，接著將其與待檢測的被分析物接觸。點擊反應和被分析物可通過自動化操作進行、優選在單一的整體設備中進行。第一個分子可包含單個點擊官能團或多個官能團。例如，分子可偶聯於包含多個、 例如2、3、4、5、6、7、8或更多個如上文所示的點擊官能團的樹枝狀基團。樹枝狀基團可通過已知的技術合成。第一個分子上的點擊官能團可是相同的或不同的，例如未保護的炔基與一種或若干種類型的受保護的炔基的組合，如在W02008/052775中所述，其內容被引入本文作為參考。在第一個分子包含未保護的和受保護的點擊官能團的情況下，可與若干種類型的不同的第二個分子發生連續的反應。所述點擊官能團連接於能與被分析物形成結合產物的分子。所述分子可以是核苷類或核苷酸類化合物，例如核苷或核苷類似物或核苷酸或核苷酸類似物或低聚物或聚合物，例如核酸或核酸類似物。核苷類或核苷酸類化合物是能例如通過化學或酶法被引入核酸或核酸類似物的核苷或核苷類似物或核苷酸或核苷酸類似物。得到的核酸或核酸類似物應當能形成結合產物，例如核酸與被分析物的雜交物。優選地，所述化合物包含鹼性部分， 例如核苷鹼基或能與核苷鹼基形成鹼基對的另外的雜環鹼性部分，以及骨架部分，在核苷或核苷酸中例如包含糖基並任選地包含磷酸基或在核苷或核苷酸類似物中包含不同的骨架部分。優選的官能團化核苷類化合物的實例，其中核苷鹼基是7-dN-G、C、7-dN_A或Τ。優選地，所述點擊官能團連接於鹼性部分，例如連接於核苷鹼基。然而，所述點擊官能團還可連接於骨架部分，例如糖基、磷酸基，或者在核苷或核苷酸類似物的情況中，連接於修飾的糖基、修飾的磷酸基或肽骨架部分等。優選地，所述官能團以共價方式經直接的鍵或間隔分子連接於所述化合物。如果連接經間隔分子實現，所述間隔分子可包含脂肪族基團或脂環族基團、芳族或雜芳族基團、烯基和/或炔基和/或聚乙烯基團。在官能團化的核苷、核苷酸和核酸中，點擊基團優選連接於核苷鹼基，其選自天然產生的和非天然產生的嘌呤和嘧啶鹼基。優選地，所述核苷鹼基選自胞苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤(7-deazaadenine)、7_脫氮鳥嘌呤(7_deazaguanine)、 肌苷和黃嘌呤。官能團優選連接於嘧啶核苷鹼基的5或6位、更優選連接於嘧啶核苷鹼基的5位，或者連接於嘌呤核苷鹼基的7或8位、更優選連接於嘌呤核苷鹼基的7位，特別是如果需要酶法進入核酸時如此。
點擊官能團、即不飽和基團和1，3-偶極基團分別以共價方式連接於第一個或第二個分子。一個或這兩個基團均可經由接頭基團連接於各自的分子。優選地，至少所述1， 3-偶極基團經由接頭基團連接於其分子。含接頭基團的基團可通過直連鍵或通過具有長度多至20個原子的鏈的接頭基團連接於其分子。所述接頭基團可具有1-20個或更多個原子的長度，且是柔性的，例如基於亞烷基的接頭基團，任選地包含諸如0、S和/或N的雜原子，或者是至少部分剛性的，例如包含至少一個剛性基團的接頭基團，所述剛性基團選自烯基、炔基、環狀基團、特別是芳族或雜芳族基團，還有脂環族基團及它們的組合第一個或第二個分子和/或它們的偶聯產物可以是能夠與待檢測的被分析物形成結合產物。例如，第一個或第二個分子可以是包括修飾的核苷酸或核酸的核苷酸或核酸。依據本發明術語「核苷酸」尤其涉及核糖核苷酸類，2'-脫氧核糖核苷酸類或2'、3'-雙脫氧核糖核苷酸類。核苷酸類似物可選自糖-或骨架修飾的核苷酸類，特別是能以酶法引入核酸的核苷酸類似物。在優選的糖-修飾的核苷酸中，核糖的2' -OH或H-基團被選自 0R、R、滷素3!1、51 、冊2、冊1 、殿2或CN的基團所代替，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基且滷素是F、Cl、Br或I。核糖自身可以被其它的碳環或雜環5-或6-元基團諸如環戊烷或環己烯基團所代替。在優選的骨架修飾的核苷酸中，磷酸(三)酯基團可被修飾的基團例如硫代磷酸酯基團或H-膦酸酯基團所代替。進一步優選的核苷酸類似物包括用於合成核酸類似物的結構單元諸如嗎啉代核酸、肽核酸、鎖核酸或硫代磷酸酯。點擊-或官能團化核酸可以是寡核苷酸類，例如具有多至30個核苷酸(或核苷酸類似物)結構單元的長度的核酸，或具有多於30個核苷酸(或核苷酸類似物)結構單元的長度的聚核苷酸類。優選地，所述核酸和核酸類似物能特異性地與被分析物結合，例如在試驗條件下能與核酸被分析物雜交。最小的長度優選為12個且更優選為14個核苷酸(或核苷酸類似物)結構單元。官能團化核酸或核酸類似物結構單元可通過用於化學合成的標準技術和/或酶法引入核酸，如W02006/117161中所述其內容被引入本文作為參考。本發明的方法提供了多個檢測被分析物的實施方案。用於檢測核酸的方法在例如W02006/117161中描述，其內容被引入本文作為參考。在另一個實施方案，可採用本發明的方法對活細胞(例如包括哺乳動物或人細胞的真核細胞，或原核細胞)進行體內標記。所述方法在例如W02007/50811和WO 2007/120192中描述，其內容被引入本文作為參考。在該實施方案中，所述反應可在適於接收和/或維持活細胞的反應室中進行。用於檢測其它的被分析物、諸如多肽類、碳水化合物或脂質、藥物或有毒物質的方法可依據基本已知的方法進行，然而，其涉及包含聚乙二醇點擊官能團、例如聚乙二醇-疊氮基團的試劑的應用，或者涉及該試劑與互補的點擊配偶體的偶聯產物的應用，如上文詳述。例如，本發明的檢測方法可通過任何已知的檢測方案進行，例如涉及固體載體的應用。例如，可提供能與待檢測的被分析物結合、例如雜交的固體載體(例如晶片或晶片或微粒材料諸如小珠)，捕獲試劑結合於所述載體。固相結合的被分析物的檢測可通過以下方法進行使用固相結合被分析物，隨後對該結合了的試劑進行檢測。該方法特別適於農業和臨床領域的診斷應用，例如用於檢測被分析物，例如來自植物(例如基因修飾的物質)的 DNA和/或mRNA，來自病原體或植物有害生物等的DNA。報導分子中標記基團的檢測可依據已知的方法進行。例如，通過光學方法和/或電方法可定性和/或定量測定金屬沉積。螢光標記基團可通過已知的螢光測定方法定性和 /或定量地測定，例如經適合的光源諸如雷射激發並檢測發出的螢光。在優選的實施方案中，本發明的方法和試劑盒用於農業應用。例如，本發明適於檢測來自植物、植物病原體或植物有害生物諸如病毒、細菌、真菌或昆蟲的核酸。此外，本發明適於檢測遺傳變異性，例如植物、植物各部分、植物病原體或植物有害生物(諸如昆蟲)中的 SNP。進一步的應用是檢測或監測有機體或有機體群體中除草劑、殺真菌劑或殺蟲劑的抵抗、耐受或不耐性，例如其在真菌、昆蟲或植物中的抵抗、耐受或不耐性。本發明還適於快速基因分型，例如適於快速檢測和/或區分真菌、昆蟲或植物的物種或株系。此外，可能用於檢測和/或區分基因修飾的有機體或株系，例如真菌、昆蟲或植物的有機體或株系。此外，本發明適於的醫藥、診斷和法醫應用，例如在人醫學或獸醫學中的應用，例如用於檢測來自病原體的核酸，例如人的病原體或牲畜類或寵物動物的病原體的核酸。進一步優選的應用包括遺傳變異性的檢測、例如人的SNP的檢測，或者藥物的抵抗、耐受或不耐性或者變應性的檢測。此外，本發明適於基因分型、特別是人的基因分型以確定與素因或紊亂、變態反應和不耐性的風險增加相關的突變。本發明還可用於檢測基因修飾有機體或株系、細菌或病毒的有機體或株系以及基因修飾的牲畜等。本發明特別適於快速疾病的診斷，例如遺傳疾病、變應性疾病、自身免疫疾病或感染性疾病。此外，本發明適於檢測基因的功能和/或表達，例如用於研究目的。另一個實施方案是用於品牌保護的方法的應用，例如用於檢測在產品中編碼的特定的信息，所述產品諸如有價值的商品如植物保護產品、藥物、化妝品和精細化學品(例如維生素和胺基酸)和飲料產品、燃料產品(例如汽油和柴油)、消費類電子產品，以上均能被標記。此外，能標記這些產品或其它的產品的包裝。所述信息通過核酸或核酸類似物編碼， 所述核酸或核酸類似物已被摻入產品和/或產品的包裝。所述信息可涉及製造商的確定、 生產地點、生產日期和/或經銷商。通過本發明能對產品特定數據進行快速檢測。樣品可由產品的等分試樣製備，然後將其與一個或若干能檢測樣品中核酸-編碼的信息存在的序列特異性的官能團化雜交探針接觸。本發明還適合營養物領域。例如，在飼料領域，動物營養物、例如玉米中補充有較大數量的防腐劑諸如丙酸。通過應用本發明的方法，能減少防腐劑的添加。此外，使用本發明方法進行基因組分析可以預測個體利用特定營養物的能力(營養基因組學)。另一個優選的實施方案涉及實驗胚胎學領域。該實施方案特別涉及DNA的分析， 例如關於胞嘧啶鹼基甲基化的基因組DNA。在該實施方案中，所述DNA可用胞嘧啶-特異性試劑處理，例如胼和/或羥胺。通過所述處理，會發生胞嘧啶或甲基胞嘧啶殘基的選擇反應。例如，使用羥胺處理導致胞嘧啶殘基的選擇性修飾。優選地，加入亞化學計量量的所述試劑以獲得部分修飾，例如胞嘧啶基團的部分修飾。然後例如使用至少一個如上文所示的修飾的核酸結構單元、例如dU和/或dC鹼基通過引物延伸反應分析處理過的DNA。優選使用點擊修飾的鹼基、例如炔烴-修飾的鹼基。所述引物延伸反應得到來自該反應在修飾的dC或5-甲基-dC鹼基中斷的特徵性測序梯。涉及非均相催化的點擊反應的本發明的方法和試劑可應用於若干特定的實施方案中。一個實施方案包括生物分子的直接標記，所述生物分子例如在合成器上的寡核苷酸類或肽類、例如用於自動化合成生物分子(例如DNA/RNA)的寡核苷酸-合成器。在該實施方案中，當生物分子、例如寡核苷酸或肽以共價方式結合於固相時，可進行所述點擊反應或點擊反應的至少一個步驟。任選地，在將生物分子從載體物質裂解下後，可與不同的點擊配偶體進行進一步的點擊反應。其它的實施方案包括在體外和/或體內標記細胞內和細胞外的基因。另一個實施方案包括在核酸擴增模式中標記分子，例如在PCR-模式中進行。 此外，還可使用非均相催化劑標記固體表面。其它的優選的實施方案包括在裝置(例如， 移液器吸頭或旋轉柱)中標記生物分子，所述裝置部分或完全填充有非均相催化劑，且任選地部分或完全填充如上文所述的固體載體物質，包括微流系統(micro-flow system)和 HPLC-樣應用。附圖描述

圖1是(a)Cu⑴炭催化劑的簡圖描述及其製備和(b)在非均相催化劑存在下第一個和第二個點擊官能團化分子之間的反應的簡圖描述。圖2是用於DNA-標記的現有技術點擊反應方案的簡圖描述。圖3是使用Cu/C催化劑系統的用於核酸標記的本發明有創造性的點擊反應方案的簡圖描述。圖4是涉及包含非均相催化劑系統的移液器吸頭的應用的點擊反應的簡圖描述。圖5顯示適合用於本發明的旋轉柱的典型的實例。圖6是在旋轉柱中進行的點擊反應的簡圖描述。圖7是與固定的生物分子諸如DNA進行的點擊反應的簡圖描述。圖8是於固定的報導分子諸如標記物-疊氮化物分子進行的點擊反應的簡圖描述。圖9是使用非均相Cu(I)-C-催化劑和移液器吸頭(「點擊吸頭」(Click Tip))或旋轉柱(「點擊旋柱」(Click Spin))的用於DNA標記的點擊反應方案的優選的實施方案。實施例1 「點擊吸頭」(ClickTip)「點擊吸頭」是一種具有大致定量體積(例如，0.2-0. 6μ L或更高)的非均相催化劑(諸如Cu(I))床的移液器吸頭(例如，10 μ L，100 μ L或1000 μ L)，催化劑被固體多孔載體負載，例如負載在炭上，優選固定於其末端以避免死體積，任選地存在色譜填料諸如矽膠和/或C18和/或C4和/或離子交換樹脂和/或任何其它的能保持一種或多種點擊反應組分的材料。催化或促進點擊反應或另外的共價鍵形成的其它的非均相物質能用於類似的裝置中。在催化劑上或在色譜填料上可提供以吸附形式的點擊反應配偶體之一，例如用於生物分子的標記物。「點擊吸頭」移液器吸頭簡單且易用。可將其置於適合的抽吸器上，例如單-或多-通道移液器，標準的22-號平端HPLC針，或相容的自動化液體處理/樣品製備站。對處理樣品而言，可將點擊-反應性的分子、例如DNA-炔烴和標記物-疊氮化物吸出並分送而通過載體一次或若干次。點擊反應在該過程期間在移液器吸頭本身發生(圖4)。最終將新形成的點擊產品、例如DNA/標記物軛合物釋放，並最後用新鮮的介質(即水)洗滌
1ClickTip。對需要更小反應體積(例如，< IyL)的應用而言，製備包含更小體積載體(例如，0.2yL)的微珠模式。大的反應裝備是可能的，其使用較大的吸頭(例如，IOOyL或 IOOOyL)進行。在另一個優選的實施方案中，將非均相催化劑與色譜填料、例如C18或C4 或離子交換樹脂直接組合以提供一個步驟的反應/純化的試驗。實施例2 「點擊旋柱」(ClickSpin)「點擊旋柱」是用於進行點擊反應和之後的分離/純化的易用的、微量離心機相容的柱。它們由兩個分離的部分組成柱和管(圖5)。用於點擊反應的非均相催化劑、例如Cu(I)/炭催化劑可加入柱中，並被固定於其中的玻璃料上，例如用於體積排阻或微粒過濾或離子交換。所述點擊反應發生在填充了的柱上，例如通過標準的振蕩法(使用例如恆溫混勻儀(Thermomixer))進行，或直接在離心步驟期間進行(對於進行迅速的反應)。分離/純化步驟通過離心完成固體載體(例如催化劑)被保留在柱中(在過濾器上或在體積排阻材料上)，且產物、例如DNA/染料軛合物被洗脫至管中。當使用體積排阻載體時，分離步驟可以包括從最終未反應的底物純化產物的步驟(圖6)。在另一個優選的實施方案中，將非均相催化劑與色譜填料、例如C18或C4 或離子交換樹脂直接組合以提供一個步驟的反應/純化的試驗。實施例3 與固相固定分子進行的點擊化學在本發明的另一個實施方案中，點擊配偶體之一可被固定於非均相催化劑和/或另外的固體載體物質、例如實施例1和2中所述的色譜填料上。在圖7中描述了一個實施方案，其中將催化劑與固體載體組合，例如DNA固定的於色譜填料，例如疏水的C18或C4樹脂或離子交換樹脂。非均相催化劑(例如Cu(I)炭)和色譜填料(例如C18)的組合使點擊反應能在固體載體上發生。該實施方案在圖8中以簡圖描述。在另一個實施方案中，在將催化劑負載至適合的筒、例如上文所述的「點擊吸頭」 或「點擊旋柱」筒中之前，將反應配偶體之一、例如疊氮官能團化的報導分子(RN3)固定於非均相催化劑(例如C/Cu)。為該目的，可將在適合的溶劑中的適合量的官能團化反應配偶體與催化劑接觸，且溶劑可被蒸發。由此得到的預浸透的筒準備好與生物分子、例如炔烴-官能團化生物分子諸如DNA進行反應。例如，報導分子可以選自螢光染料諸如FAM、Cy3、Atto, Eterneon等，選自其它的標記基團、諸如生物素。所述非均相催化劑可與另外的固體載體物質、例如色譜填料、諸如上文所述的C18組合。實施例4 用於使用非均相催化劑系統的標記DNA的點擊反應方案將包含炔基的分子(例如DNA)與疊氮化物-修飾的報導基團(例如染料)混合， 並與非均相催化劑、例如在適合的裝置、例如實施例1和2中所述的「點擊吸頭」或「點擊旋柱」中的Cu(I)-C催化劑接觸。該準備步驟的時間多至1分鐘。在所述裝置中的點擊反應優選歷時2-5分鐘，然而也可考慮更長的反應時間。最後，例如通過可歷時1分鐘的過濾可對反應產物進行後處理。該方案的簡圖描述如圖9中所示。實施例5 在非均相催化劑的存在下的點擊反應
5. lCu/C催化劑的製備將Darco KB活性炭(15. Og, 100目，25%的吐0含量)加入包含攪拌棒的300_mL圓底燒瓶中。將 Cu(NO3)2 3H20(Acros Organics, 3. 334g, 13. 80mmol)在去離子的 H2O(IOOmL) 中的溶液加入活性炭中，並加入另外的去離子的H20(125mL)以從燒瓶壁洗下。用氬氣清潔燒瓶，並劇烈攪拌30分鐘。然後，在正性的氬氣流下將燒瓶浸入超聲波浴中達1小時，之後將其與氬氣淨化的蒸餾裝置連接，並置於預加熱至175-180°C的帶有攪拌片的沙浴中。待蒸餾完成，燒瓶溫度開始升高，並保持在210°C之下再經過15分鐘。待冷卻至室溫加入甲苯 (75mL)以從燒瓶壁洗下。將燒瓶再次置於熱的沙浴中，直至甲苯/H2O共沸物已蒸餾。一旦蒸餾完成，再次重複共沸蒸餾。冷卻至室溫後，在氬氣下用甲苯OX50mL)將黑色的固體洗滌至預乾燥的150-mL粗製燒結式漏鬥(在真空下)。在真空下將燒結式漏鬥上下顛倒5小時直至Cu/C由玻璃料落至收集燒瓶中。然後將收集燒瓶在110-115°C的沙浴在在真空下加熱18小時以再次乾燥催化劑。將預浸透的炭(約13克)轉移並儲存在琥珀色瓶中。催化劑的ICP-EAS分析表明負載1. Olmmol Cu/g催化劑或6. 4wt. % Cu。由此製備的Cu/C催化劑具有約12個月的有限的儲藏期限，如果在惰性氣氛下密封存儲儲藏期限>18個月。在乙二醇(EG)中的Cu/C的製備將120mg Cu/C加入500 μ 1 EG中。將該混合物渦旋並離心。在聚乙二醇(PEG)中的Cu/C的製備將120mg Cu/C加入500 μ 1 PEG中。將該混合物渦旋並離心。5. 2寡核苷酸的製備依據標準方法製備包含Z = CSdC(X)基團的寡核苷酸，其中X在下文進一步定義。寡核苷酸l:22_mer5 『 -CGCGTATCGCTATCGCTATGGZ-3 『(序列號1)寡核苷酸 2:5_mer5' -ZCTAG-3『(序列號2)寡核苷酸3:33-mer5 『 -ZAAAT [C] [T] AGAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAG-磷酸-3 『(序列號3)[C]和[T]表示修飾的(LNA)核苷酸類5. 3回收率和轉化率的定義在本文中認為「回收率」是沉澱步驟後得到的寡核苷酸(nmol)的百分比。在本文中認為「轉化率」是在反應中形成的產物的MALDI百分比。5. 4用於MALDI測定的樣品製備反應後，將樣品脫鹽，並將0. 4 μ 1各樣品與0. 4 μ 1 HPA_C基質(羥基-吡啶甲酸 +15冠-5) —起點到MALDI靶標上。使用移液器吸頭ZipTipcl8 (Millipore)通過用水和乙腈洗滌，或使用MFTM-膜濾器0. 025 μ m VSffP (Millipore)將樣品脫鹽。5. 5使用Cu/C催化劑合成5nt寡核苷酸-PEG軛合物寡核苷酸2與PEG-8_N3的反應將1 μ 1 PEG-N3 禾口 Cu/C 加入 100 μ 1 寡核苷酸 2 (1. 6nmol/ μ 1_ > 160nmol 總)中，並放入恆溫混勻儀中達2小時(900rpi，25°C)。然後將樣品用ΙΟΟμΙ水稀釋，並經由 Acrodisc 13mm注射器式濾器過濾。將過濾器用另外的100 μ 1水洗滌，將該溶液未經處理地用於HPLC和MALDI分析。將產物經RP-HPLC再次純化。濃度是使用微量核酸蛋白分析儀(nanophotometer)得到的。結果93. 8%回收率序列3，-GATCU-X(PEG) 8NH2量*:27nmol ;MW. :2005 (1567+438)。*該量由在沈此！!!測定的30 μ L溶液的濃度計算，且其涉及溶液中的寡核苷酸濃度 (參見5. 3)。其中U-X 是
權利要求
1.將第一個分子與第二個分子通過點擊反應偶聯的方法，其中第一個分子與第二個分子通過點擊反應偶聯，其中第一個分子包含第一個點擊官能團，其為點擊-反應性的不飽和基團，且第二個分子包含第二個互補的點擊官能團，其為能與第一個點擊官能團進行點擊反應的點擊-反應性的1，3-偶極基團，所述方法包括在非均相催化劑存在下將第一個和第二個分子在其中第一個和第二個分子之間發生點擊反應的條件下接觸，其中第一個和第二個分子之一被固定於固體載體。
2.權利要求1的方法，其中第一個和第二個分子之一是生物分子。
3.權利要求1或2的方法，其中第一個和第二個分子之一被固定於非均相催化劑和/ 或另外的固體載體物質。
4.權利要求3的方法，其中提供了乾燥的預浸透有第一個和第二個分子之一固體載體，將其與包含另一個分子的液體介質接觸。
5.權利要求1-4中任意一項的方法，其中第一個分子是選自以下的生物分子核苷、核苷酸、核酸、胺基酸、肽、糖和脂質、特別選自核酸。
6.權利要求1-5中任意一項的方法，其中第二個分子是(i)報導分子、特別是染料，( )親和性分子，(iii)固相，(iv)生物分子，例如蛋白質或脂質，(ν)接頭分子或間隔分子，其可包含脂肪族或脂環族基團、芳族或雜芳族基團、烯基、炔基和/或聚合物基團、例如聚乙二醇基團，(vi)藥用的化合物或基團、光敏的基團，和/或氧化還原活性的基團，和/或識別部位。
7.權利要求1-6中任意一項的方法，其中所述點擊-官能不飽和基團是炔基，且其中點擊-官能1，3-偶極基團是疊氮基。
8.權利要求1-7中任意一項的方法，所述非均相催化劑是非均相Cu催化劑、特別是 Cu-C催化劑。
9.權利要求1-8中任意一項的方法，其中所述點擊反應在增加點擊反應速度的能與非均相催化劑相互作用的分子的存在下進行，特別是在胺存在下進行，優選胺的量高至10% (ν/ν)、最優選高至(ν/ν)且甚至最優選高至0. 1% (ν/ν)，其中所述胺優選是伯胺、仲胺或叔胺，其可以具有芳族的、雜芳族的、脂肪族的、脂環族的、不飽和的或完全飽和的骨架， 且其中所述胺更優選為三乙胺。
10.權利要求1-9中任意一項的方法，其中⑴反應溫度為約4至約80°C，特別是約10 至約40°C和/或(ii)反應時間為約1分鐘至約8小時，例如約1分鐘至約10分鐘、特別是約2分鐘至約5分鐘，或約10分鐘至8小時，和/或其中反應體積為約0. 1至約1000 μ 1 或更大。
11.權利要求1-10中任意一項的方法，其中所述反應在移液器吸頭、旋轉柱或注射器中進行。
12.權利要求1-11中任意一項的方法，其進一步包括分離/純化步驟。
13.具有至少一個反應室的裝置，其包含用於進行點擊反應的非均相催化劑並任選地包含另外的固體載體物質，其中點擊反應的配偶體可被固定於所述非均相催化劑和/或被固定於所述另外的固體載體物質，所述裝置特別是用於權利要求1-12中任意一項的方法， 其中所述裝置優選為移液器吸頭或旋轉柱。
14.具有至少一個反應室的裝置，其包含用於點擊反應的非均相催化劑和被固定於前述非均相催化劑上的用於點擊反應的配偶體之一、優選包含點擊-反應性的1，3偶極基團的配偶體。
15.用於點擊反應的試劑盒，其包含權利要求13或14的裝置和第一個和第二個分子， 其中第一個分子包含第一個點擊官能團，其為點擊-反應性的不飽和基團，且第二個分子包含第二個互補的點擊官能團，其為能與第一個點擊官能團進行點擊反應的點擊-反應性的1，3-偶極基團。
16.用於檢測樣品中的被分析物的方法，其包括以下步驟(i)提供具有至少一個反應室的裝置，其中所述反應室包含用於進行點擊反應的非均相催化劑並任選地包含另外的固體載體物質，其中點擊反應的配偶體可被固定於所述非均相催化劑和/或被固定於所述另外的固體載體物質；( )在所述反應室中、在非均相催化劑存在下，將作為第一個點擊配偶體的第一個分子與作為第二個點擊配偶體的第二個分子在其中第一個和第二個分子之間發生點擊反應的條件下接觸，其中第二個分子優選包含報導基團或報導前體基團，(iii)如需要，則將報導前體基團轉化為報導基團，(iv)在一體化裝置內將第一個分子和第二個分子的偶聯產物與樣品在允許檢測被分析物的條件下接觸，和(ν)定性地和/或定量地檢測被分析物，優選通過所述報導基團進行。
全文摘要
本發明涉及用於通過點擊反應使用非均相催化劑系統偶聯分子的新的方法和試劑。此外，本發明涉及用於進行點擊反應的新的裝置。
文檔編號G01N33/50GK102387858SQ201080015635
公開日2012年3月21日 申請日期2010年4月8日 優先權日2009年4月9日
發明者A·馬內託, P·M·E·格拉姆利克, S·瓦恩克 申請人:巴斯克立克公司