在白喉桿菌中穩定複製的表達載體及含該載體的白喉桿菌的製作方法

2023-09-10 21:58:20

專利名稱：在白喉桿菌中穩定複製的表達載體及含該載體的白喉桿菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種疫苗生產菌株領域，具體涉及ー種在白喉桿菌中穩定複製的表達載體及攜帯該載體的白喉桿菌。
背景技術：
白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)是引起小兒白喉的病原菌，屬於棒狀桿菌屬(Corynebacterium),其生長周期短,繁埴速度快。白喉桿菌的致病物質主要是白喉毒素，白喉毒素以分泌型表達方式存在於胞質夕卜，且白喉桿菌其胞質外的分泌蛋白除白喉毒素外，其他雜蛋白含量極小，其對於白喉毒素的純化十分有利，因此白喉桿菌廣泛的應用於疫苗發酵生產中作為白喉毒素和白喉毒素突變體(CRM197)的生產工程菌株。而目前多採用的用於抗原發酵生產的表達體系有大腸桿菌，植物細胞等，其缺點 是雜蛋白含量較高，多為胞內或包涵體內表達，對於後期的純化工藝有很高的時間和人力，物力成本；而分泌型的表達系統的建立多需要引導肽的引入，但往往其要求與抗原蛋白融合表達，則需要在後期エ藝中對引導肽進行切除處理，増加了エ藝的複雜度和操作的難度。至今未有報導利用白喉桿菌攜帯可複製質粒用於抗原表達的研究和應用。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種在白喉桿菌中穩定複製的表達載體。本發明的第二個目的是提供一種攜帶在白喉桿菌中穩定複製的表達載體的白喉桿菌。本發明的第三個目的是提供一種重組CRM197蛋白的表達方法。本發明的技術方案概述如下一種在白喉桿菌中穩定複製的表達載體，所述載體包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列或具有與SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度為90%以上的DNA序列，能表達SEQ ID NO. 2所示導肽蛋白序列的DNA序列和SEQIDN0. 3所示的CRM197重組蛋白編碼基因的DNA序列。一種攜帶上述在白喉桿菌中穩定複製的表達載體的白喉桿菌。一種重組CRM197蛋白的表達方法，包括如下步驟a.將在白喉桿菌中穩定複製的表達載體通過結合轉移的方法導入宿主白喉桿菌中；b.篩選得到攜帯在白喉桿菌中穩定複製的表達載體的白喉桿菌；c.將步驟b獲得的白喉桿菌進行蛋白表達和分泌，得到重組CRM197蛋白；所述在白喉桿菌中穩定複製的表達載體包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列或具有與SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度為90%以上的DNA序列，能表達SEQ ID NO. 2所不導妝蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所不的CRM197
重組蛋白編碼基因的DNA序列。所述宿主白喉桿菌優選編號為ATCC39255的白喉桿菌，ATCC43145的白喉桿菌或CMCC38007白喉桿菌。本發明的優點是白喉桿菌攜帯的在白喉桿菌中穩定複製的表達載體，因其具有在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列，因而可以使得表達載體在白喉桿菌中穩定複製，同時表達載體上的能表達導妝蛋白序列的DNA序列可以使得表達的CRM197重組蛋白進行分泌表達並分泌到胞外，從而使得CRM197重組蛋白的表達量得到提高，使得表達的CRM197重組蛋白的純化工藝進ー步簡化，提高了蛋白得率，節約了生產時間和成本。


圖I為ー種在白喉桿菌中穩定複製的表達載體pCKM5. I酶切鑑定圖譜。圖2為攜帶pCKM5. I的白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)高效分泌表達蛋白 CRM197SDS-PAGE 圖譜。圖3為攜帶pCKM5. I的白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)發酵製備CRM197蛋白的 SDS-PAGE 圖譜。(I Al 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8 A8 9Marker)圖4為攜帶pCKM5. 2的白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)高效分泌表達蛋白CRM197SDS-PAGE 圖譜。圖5為攜帶pCKM5. 2的白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)發酵製備CRM197蛋白的 SDS-PAGE 圖譜。(I Al 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8Marker)
具體實施例方式下面實施例中的方法若無特殊說明均為常規方法。下面各實施例所涉及的白喉桿菌均為購買所得。白喉桿菌(CMCC38007，中國醫學細菌保藏管理中心，Pff8)下面結合具體實施例對本發明作進ー步的說明。實施例I在白喉桿菌中穩定複製的表達載體pCKM5. I的構建引物設計，PCR擴增目的抗原基因CRM197設計引物序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，以白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)基因組DNA為模板，PCR反應程序如下(I) 95°C，3分鐘；(2) 98°C，30秒，60°C，30秒，72°C，30秒，30循環；(3)72°C，2分鐘。反應結束後，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化。經純化回收的PCR產物通過T/A克隆連接於T載體pEASY-Tlsimple上，轉化大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆提取質粒，通過XhoI和SalI雙酶切將目的抗原基因CRM197切下插入到pCKM4. I (SEQ ID NO. 6)中的SalI位點上，得到重組質粒，轉化大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆並提取質粒，分別利用NheI，BglII和SalI進行酶切鑑定，其酶切鑑定圖譜如圖I所示，圖I中泳道I為Markerlk plus，泳道2為經NheI酶切的重組質粒的酶切片段，泳道3為BglII和SalI雙酶切的重組質粒酶切片段。對於酶切鑑定正確的重組質粒進行針對性測序，結果表明插入的目的抗原基因(CRM197重組蛋白編碼基因)的核苷酸序列(SEQ IDNO. 3)經分析與原序列(參考文獻1)99%吻合，其編碼的胺基酸序列100%吻合。將測序包含有SEQ ID NO. 3的重組質粒命名為pCKM5. I (SEQ ID NO. 7所示)(分別從6967-9646為SEQ ID NO. I、1666-1740 (反向編碼)為SEQ ID NO. 2的DNA編碼序列、5-2091 (反向編碼)SEQ ID NO. 3)。實施例2、pCKM5. I在白喉桿菌中表達CRM197將實施例I中獲得的表達質粒PCKM5. I電轉化至大腸桿菌s-17中，通過結合轉移轉化至白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)中，經篩選得到攜帯有穩定複製表達質粒pCKM5. I的白喉桿菌菌落，接種於IOOml白喉桿菌培養基(ATCC medium: 1417Low IronYCmedium)中(含有25ug/ml的卡那黴素)，37 °C，250rpm搖床上培養待測定0D_至15-18後，離心收集上清，在每IOOml離心上清中加入45g硫酸銨，4°C沉澱，離心收集沉澱，用30mlTris-HCL pH=8. 0水溶液重懸後進行SDS-PAGE電泳分析，並以無任何質粒的白喉桿菌菌體上清作為對照。如圖2所示，泳道I為protein marker I，泳道2，3為對照組野生型白喉桿菌分別在0. lg/L，lg/L游離鐵離子濃度下的分泌上清，泳道4，5為攜帶在白喉桿菌中穩定複製的表達載體PCKM5. I的白喉桿菌菌株分別在0. lg/L，lg/L游離鐵離子濃度下的分泌上清。經SDS-PAGE分析表明，CRM197重組蛋白的分子量與經胺基酸序列計算後的分子量相同，說明攜帯有重組表達質粒的白喉桿菌菌株可以高效分泌表達目的CRM197重組蛋白，可用於發酵生產和後續的疫苗製備エ藝。

實驗證明，將實施例I中獲得的表達質粒PCKM5. I電轉化至大腸桿菌s-17中，通過結合轉移分別轉化至ATCC43145白喉桿菌或CMCC38007白喉桿菌，也高效分泌表達出目的CRM197重組蛋白。實施例3、攜帶表達載體pCKM5. I的白喉桿菌進行CRM197的發酵製備和純化將實施例I中獲得的表達質粒PCKM5. I電轉化至大腸桿菌s-17中，通過結合轉移轉化至白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)中，經篩選得到攜帯有穩定複製表達質粒pCKM5. I的白喉桿菌菌落接種於200ml白喉桿菌培養基(ATCC medium: 1417Low Iron YCmedium)(含有25ug/ml的卡那黴素)中，37°C，250rpm搖床上培養待測定0D6(I(I=8. 0左右後，轉接於2L的發酵罐中，條件控制下發酵培養至0D_=15左右後，再次轉入50L發酵罐中，控制pH=7. 4，36°C條件下發酵至0D_=40-60左右後，停止培養收集菌液，經高速離心後，收集上清(2L和50L發酵罐中的發酵液均為白喉桿菌培養基)。將30L離心上清經過0. 22um無菌過濾後，通過30KD超濾濃縮至2L，取樣保留以備電泳檢測，記為Al。濃縮後使用IOL的IOmM PB緩衝液進行超濾,超濾至電導為9mS/cm,最終超濾後體積為2L，將超濾液過濾Q膜，取樣保留以備電泳檢測，記為A2。過濾液加入400g硫酸銨後攪拌均勻，IlOOOg離心保留上清，向上清中再繼續添加450g硫酸銨，攪拌均勻後IlOOOg離心棄上清獲得沉澱。加入I. 5L的IOmM PB緩衝液使沉澱復溶。復溶後溶液使用IOL的IOmM PB緩衝液進行超濾,超濾至電導為4mS/cm,取樣保留以備電泳檢測,記為A3。將超濾液通過0. 22um無菌過濾，取樣保留以備電泳檢測，記為A4。將過濾液過DEAE層析柱，先通過0. IM NaCl水溶液洗脫去掉雜質，再利用0. 5M NaCl水溶液洗脫得到目的蛋白CRM197，取樣保留以備電泳檢測，記為A5 ;將得到洗脫峰中的目的蛋白CRM197置換超濾至5%蔗糖水溶液中，取樣保留以備電泳檢測，記為A6;將超濾液通過0.22um過濾，取樣保留以備電泳檢測，記為A7;A7樣品稀釋10倍後樣品記為A8;將過濾液冰凍乾燥保存備用SDS-PAGE分析表明，經分離純化後的CRM197含量百分比達到90%以上(A1-A8樣品如圖3中的1_8)，同時蛋白含量測定分析後表明同等發酵和純化條件控制下，攜帯表達載體PCKM5. I的白喉桿菌發酵後經分離純化後CRM197相對於野生型白喉桿菌發酵後經分離純化的CRM197的蛋白產量120mg/L提高到179mg/L，提高了 49. 1%。實施例4、在白喉桿菌中穩定複製的表達載體pCKM5. 2的構建將質粒pCKM5. I (SEQ ID NO. 7)序列中包含的在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列(SEQ ID NO. I)和導肽的編碼核苷酸序列進行若干核苷酸突變，突變後的在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列與原序列具有90%以上的相似度，而突變後導肽的編碼核苷酸序列其翻譯的多肽序列不變，突變後的質粒序列為PCKM5. 2 (SEQ ID NO. 8)。實施例5、pCKM5. 2在白喉桿菌中表達CRM197將實施例4中獲得的表達質粒PCKM5. 2電轉化至大腸桿菌s_17中，通過結合轉移轉化至白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)中，經篩選得到攜帯有穩定複製表達質粒pCKM5. 2的白喉桿菌菌落，接種於IOOml白喉桿菌培養基(ATCC medium: 1417Low IronYCmedium)中(含有25ug/ml的卡那黴素)，37°C，250rpm搖床上培養待測定0D_至15-18後，離心收集上清，在每IOOml離心上清中加入45g硫酸銨，4°C沉澱，離心收集沉澱，用30ml Tris-HCL pH=8. 0水溶液重懸後進行SDS-PAGE電泳分析，並以無任何質粒的白喉桿菌菌體上清作為對照。電泳圖如圖4所示,泳道I為protein marker I,泳道2為對照組野生型白喉桿菌分別在lg/L游離鐵離子濃度下的分泌上清，泳道3為攜帶表達質粒pCKM5. 2的白喉桿菌菌株分別在lg/L游離鐵離子濃度下的分泌上清。經SDS-PAGE分析表明，CRM197重組蛋白的分子量與經胺基酸序列計算後的分子量相同，說明攜帯有重組表達質粒的白喉桿菌菌株可以高效分泌表達目的CRM197重組蛋白，可用於發酵生產和後續的疫苗製備エ藝。實驗證明，將實施例4中獲得的表達質粒PCKM5. 2電轉化至大腸桿菌s_17中，通過結合轉移轉化至至ATCC43145白喉桿菌或CMCC38007白喉桿菌，也高效分泌表達出目的CRM197重組蛋白。實施例6、攜帶表達載體pCKM5. 2的白喉桿菌進行CRM197的發酵製備和純化將實施例4中獲得的表達質粒PCKM5. 2電轉化至大腸桿菌s_17中，通過結合轉移轉化至白喉桿菌(ATCC39255的白喉桿菌)中，經篩選得到攜帯有穩定複製表達質粒pCKM5. 2 的白喉桿菌菌落接種於 200ml 培養基(ATCC medium: 1417Low Iron YC medium)(含有25ug/ml的卡那黴素)中，37°C 250rpm搖床上培養待測定0D_=8. 0左右後，轉接於2L的發酵罐中，條件控制下發酵培養至0D_=15左右後，再次轉入50L發酵罐中，控制pH=7. 4，36°C條件下發酵至0D_=40-60左右後，停止培養收集菌液，經高速離心後，收集上清2L和50L發酵罐中的發酵液均為白喉桿菌培養基)。將30L離心上清經過0. 22um無菌過濾後，通過30KD超濾濃縮至2L，取樣保留以備電泳檢測，記為Al。濃縮後使用IOL的IOmM PB緩衝液進行超濾,超濾至電導為9mS/cm,最終超濾後體積為2L，將超濾液過濾Q膜，取樣保留以備電泳檢測，記為A2。過濾液加入400g硫酸銨後攪拌均勻，IlOOOg離心保留上清，向上清中再繼續添加450g硫酸銨,攪拌均勻後IlOOOg離心棄上清獲得沉澱。加入I. 5L的IOmM PB緩衝液使沉澱復溶。復溶後溶液使用IOL的IOmMPB緩衝液進行超濾，超濾至電導小於4mS/cm，取樣保留以備電泳檢測，記為A3。將超濾液通過0. 22um無菌過濾，取樣保留以備電泳檢測，記為A4。將過濾液過DEAE層析柱，先通過0. IM NaCl溶液洗脫去掉雜質，再利用0. 5M NaCl溶液洗脫得到目的蛋白CRM197，取樣保留以備電泳檢測，記為A5 ;將得到洗脫峰中的目的蛋白置換超濾至5%蔗糖溶液中，取樣保留以備電泳檢測，記為A6 ;將超濾液通過0. 22um過濾，取樣保留以備電泳檢測，記為A7。將過濾液冰凍乾燥保存備用SDS-PAGE分析表明，經分離純化後的CRM197含量百分比達到90%以上(A1-A7樣品如圖5中的1-7)，同時蛋白含量測定分析後表明同等發酵和純化條件控制下，攜帯表達載體PCKM5. 2的白喉桿菌發酵後經分離純化後CRM197相對於野生型白喉桿菌發酵後經分離純化的CRM197的蛋白產量120mg/L提高到185mg/L，提高了54. 1%。參考文獻 I.The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtneriatoxin:CRM45and CRM197.Giannini G,Rappuoli R,Ratti G.Nucleic Acids Res.1984May25;12(10):4063-9。
權利要求
1.一種在白喉桿菌中穩定複製的表達載體，其特徵是所述載體包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列或具有與SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度為90%以上的DNA序列，能表達SEQ ID NO. 2所示導肽蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所不的CRM197重組蛋白編碼基因的DNA序列。
2.一種攜帶權利要求I在白喉桿菌中穩定複製的表達載體的白喉桿菌。
3.一種重組CRM197蛋白的表達方法，其特徵是包括如下步驟 a.將在白喉桿菌中穩定複製的表達載體通過結合轉移的方法導入宿主白喉桿菌中； b.篩選得到攜帶在白喉桿菌中穩定複製的表達載體的白喉桿菌； c.將步驟b獲得的白喉桿菌進行蛋白表達和分泌，得到重組CRM197蛋白；所述在白喉桿菌中穩定複製的表達載體包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列或具有與SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度為90%以上的DNA序列，能表達SEQ ID NO. 2所示導肽蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所示的CRM197重組蛋白編碼基因的DNA序列。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵是所述宿主白喉桿菌為編號為ATCC39255的白喉桿菌，ATCC 43145的白喉桿菌或CMCC 38007白喉桿菌或白喉桿菌CMCC 38007。
全文摘要
本發明公開了一種在白喉桿菌中穩定複製的表達載體及含該載體的白喉桿菌，所述載體包括在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列，能表達導肽蛋白序列的DNA序列和CRM197重組蛋白編碼基因的DNA序列。白喉桿菌攜帶的在白喉桿菌中穩定複製的表達載體，因其具有在白喉桿菌中穩定複製的複製起點DNA序列，因而可以使得表達載體在白喉桿菌中穩定複製，同時表達載體上的能表達導肽蛋白序列的DNA序列可以使得表達的CRM197重組蛋白進行分泌表達並分泌到胞外，從而使得CRM197重組蛋白的表達量得到提高，使得表達的CRM197重組蛋白的純化工藝進一步簡化，提高了蛋白得率，節約了生產時間和成本。
文檔編號C12N15/77GK102766647SQ20121025990
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者宇學鋒, 朱濤, 段磊, 毛慧華, 邱東旭, 邵忠琦 申請人:天津康希諾生物技術有限公司