多潛能細胞的處理的製作方法

2023-09-11 21:18:10

本申請為分案申請，原申請的申請日為2009年4月22日，申請號為200980124647.2(pct/us2009/041356)，發明名稱為「多潛能細胞的處理」。本發明涉及處理多潛能細胞的方法，其中通過用gsk-3b酶活性抑制劑處理多潛能細胞，該多潛能細胞可在培養物中有效擴增和分化。
背景技術：
：由於i型糖尿病細胞替代療法的進步和可移植胰島的不足，人們已重點關注於開發適於移植的胰島素生成細胞或β細胞來源。一種方法是從多潛能細胞(例如胚胎幹細胞)產生功能性β細胞。在脊椎動物的胚胎發育中，多能幹細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內胚層)的一組細胞。諸如例如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內胚層，經由中間階段發育而來。該過程中的中間階段是形成定形內胚層。定形內胚層細胞可表達多種標誌物，例如hnf-3β、gata-4、mixl1、cxcr4和sox-17。定形內胚層分化成胰腺內胚層導致形成胰腺。胰腺內胚層細胞可表達胰-十二指腸同源盒基因pdx-1。在不存在pdx-1時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽後不再發育。因此，pdx-1的表達標誌著胰腺器官形成中的關鍵步驟。除了其他細胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內分泌組織。外分泌和內分泌組織來自胰腺內胚層的分化。產生足夠量的細胞物質用於移植需要可在培養物中有效擴增並有效分化成所關注的組織(例如功能性β細胞)的細胞物質來源。當前培養胚胎幹細胞的方法很複雜，它們需要使用外源因子或化學成分確定的培養基，以便細胞在不喪失其多潛能性的情況下分化。此外，胚胎幹細胞的分化通常導致細胞在培養物中擴增減少。例如，cheon等人(bioreproddoi：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公開了一種無飼養細胞的無血清培養系統，其中胚胎幹細胞維持在補充有能引發胚胎幹細胞自我更新的不同生長因子的未經調理的血清替代(sr)培養基中。又如，us20050233446公開了一種用於培養幹細胞，包括未分化的靈長類原始幹細胞的限定培養基。在溶液中，此培養基較於在培養的幹細胞基本上是等滲的。在給定的培養物中，特定的培養基包含基礎培養基和各為一定量的bfgf、胰島素和抗壞血酸，所述bfgf、胰島素和抗壞血酸為支持胚性幹細胞進行基本上非分化性生長所必需。又如，wo2005086845公開了維持未分化幹細胞的方法，所述方法包括使幹細胞暴露於量足以將細胞維持在未分化狀態的轉化生長因子-β(tgfβ)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(fgf)蛋白家族的成員或煙醯胺(nic)，維持足夠的時間以實現所需的結果。已知糖原合成酶激酶-3(gsk-3)的抑制劑可促進成體幹細胞的增殖和擴增。例如，tateishi等人(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications(2007)352：635)顯示，抑制gsk-3可增強從新生兒或成人心臟回收並具有間質特徵的人心臟幹細胞(hcsc)的生長和存活。例如，rulifson等人(pnas144，6247-6252，(2007))聲稱「wnt信號傳導可刺激胰島β細胞增殖」。又如，wo2007016485報導，添加gsk-3抑制劑至非胚胎幹細胞(包括專能(multipotent)成體祖細胞)可導致在擴增期間維持多潛能表型，並導致更強的分化響應。又如，us2006030042利用通過添加wnt或gsk-3的小分子抑制劑來抑制gsk-3的方法，來在不使用飼養細胞層的情況下維持胚胎幹細胞。又如，wo2006026473報導添加gsk-3b抑制劑，通過轉錄激活c-myc和穩定c-myc蛋白來使多潛能細胞保持穩定。又如，wo2006100490報導使用含有gsk-3抑制劑和gp130激動劑的幹細胞培養基來維持多能幹細胞(包括小鼠或人胚胎幹細胞)的自我更新群體。又如，sato等人(naturemedicine(2004)10：55-63)表明，用特異性藥理性化合物抑制gsk-3可維持胚胎幹細胞的未分化表型以及維持多潛能狀態特異性轉錄因子例如oct-3/4、rex-1和nanog的表達。又如，maurer等人(journalofproteomeresearch(2007)6：1198-1208)表明，用gsk-3抑制劑處理成體神經元幹細胞可顯示出神經元分化的增強，特別是通過促進β-連環蛋白靶基因的轉錄和使凋亡降低。又如，gregory等人(annalsofthenewyorkacademyofsciences(2005)1049：97-106)報導，gsk-3b的抑制劑可增強體外成骨作用。又如，feng等人(biochemicalandbiophysicalresearchcommuncations(2004)324：1333-1339)表明，胚胎幹細胞向造血分化與wnt/β-連環蛋白途徑的下調相關，其中wnt是gsk3的天然抑制劑。因此，仍然非常需要開發用於處理多能幹細胞而使得多能幹細胞可被擴增以滿足當前臨床需要，同時保持分化為胰腺內分泌細胞、胰腺激素表達細胞或胰腺激素分泌細胞的潛能的方法。技術實現要素：本發明提供了通過用gsk-3b酶活性抑制劑處理多潛能細胞而使多潛能細胞擴增和分化的方法。在一個實施例中，本發明提供了使多潛能細胞擴增和分化的方法，該方法包括如下步驟：a.培養多潛能細胞，以及b.用gsk-3b酶活性抑制劑處理所述多潛能細胞。在一個實施例中，所述多潛能細胞分化成可表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。多潛能細胞可以是人胚胎幹細胞，或者它們可以是根據60/913475中公開的方法衍生自人胚胎幹細胞的表達多潛能標誌物的細胞。在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑是式(i)化合物：在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑是式(ii)化合物：在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑是式(iii)化合物：附圖說明圖1示出了一系列濃度的化合物jnj17189731對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖2示出了一系列濃度的化合物jnj17163796對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖3示出了一系列濃度的化合物jnj17223375對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖4示出了一系列濃度的化合物jnj18157698對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖5示出了一系列濃度的化合物jnj26158015對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖6示出了一系列濃度的化合物jnj26483197對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖7示出了一系列濃度的化合物jnj26483249對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖8示出了一系列濃度的化合物jnj10220067對細胞數目的作用(分圖a)和對sox-17表達的作用(分圖b)，其中細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，sox-17表達通過免疫螢光染色的強度確定。結果用incellanalyzer1000(gehealthcare)從人胚胎幹細胞系h1的細胞(白色柱條)或從人胚胎幹細胞系h9的細胞(黑色柱條)獲得。圖9示出了在用所示化合物根據實例8中所述的方法處理過的細胞上，cxcr4在細胞表面上的表達，該表達通過免疫螢光染色和流式細胞檢測分析測定。圖10示出了在用所示化合物根據實例8中所述的方法處理過的細胞上，cxcr4(分圖a)、hnf-3β(分圖b)和sox-17(分圖c)的表達，該表達通過實時pcr測定。圖11示出了一系列濃度的所示化合物對細胞數目的作用(分圖a)和對pdx-1表達的作用(分圖b)，其中使用incellanalyzer1000(gehealthcare)，細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，pdx-1表達通過免疫螢光染色的強度確定。細胞根據實例9中所述的方法進行處理。圖12示出了一系列濃度的所示化合物對pdx-1表達(白色柱條)和hnf-6表達(黑色柱條)的作用，所述pdx-1表達通過實時pcr測定。細胞根據實例9中所述的方法進行處理。圖13示出了一系列濃度的所示化合物對細胞數目的作用(分圖a)和對胰島素表達的作用(分圖b)，其中使用incellahalyzer1000(gehealthcare)，細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，pdx-1表達通過免疫螢光染色的強度確定。細胞根據實例10中所述的方法進行處理。圖14示出了一系列濃度的所示化合物對pdx-1表達(白色柱條)和胰島素表達(黑色柱條)的作用，所述表達通過實時pcr測定。細胞根據實例10中所述的方法進行處理。圖15示出了一系列濃度的所示化合物對細胞數目的作用(分圖a)和對胰島素表達的作用(分圖b)，其中使用incellanalyzer1000(gehealthcare)，細胞數目通過所觀察到的細胞核的數目確定，pdx-1表達通過免疫螢光染色的強度確定。細胞根據實例11中所述的方法進行處理。具體實施方式將本發明的具體實施方式部分分成以下幾個分部分，來描述或舉例說明本發明的某些特徵、實施例或應用，這是為了使公開內容清楚起見，並非限制本發明。定義幹細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和末端分化細胞。幹細胞的特徵還在於：其具有在體外由多種胚層(內胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細胞譜系的功能細胞的能力、移植後產生多種胚層的組織的能力以及注射入胚泡後基本上有助於大部分(如果不是所有的話)組織形成的能力。根據它們的發育潛能將幹細胞分為：(1)全能幹細胞，意指能夠產生所有胚胎或胚外細胞類型；(2)多能幹細胞，意指能夠產生所有胚胎細胞類型；(3)專能幹細胞，意指能夠產生一亞群的細胞譜系，但這些細胞都位於特定的組織、器官或生理系統內(例如，造血幹細胞(hsc)能夠產生包括hsc(自我更新)、血細胞限制性寡能祖細胞和為血液正常組分的所有細胞類型和成分(如血小板)的子代；(4)寡能幹細胞，意指能夠產生比專能幹細胞更為有限的一亞群細胞譜系；以及(5)單能幹細胞，意指能夠產生單種細胞譜系(如精原幹細胞)。分化是未特化的(「未定向的」)或特化不足的細胞獲得特化細胞(如神經細胞或肌肉細胞)的特徵的過程。分化的細胞或誘導分化的細胞是已經在細胞譜系中佔據更特化的(「定向的」)位置的細胞。術語「定向的」當應用到分化的過程時，指在分化途徑中已經進行到這麼一種程度的細胞：在正常環境下，它會繼續分化成特定的細胞類型或細胞類型子集，且在正常環境下不能分化成另一細胞類型或回復到分化程度較低的細胞類型。去分化指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)程度較低的地位的過程。如本文所用，「細胞的譜系」限定細胞的遺傳關係，即它來自哪些細胞和它能產生什麼細胞。細胞譜系將細胞定位於發育和分化的遺傳計劃內。譜系特異性標記物是指與所關注譜系的細胞表型特異性相關並能夠用於評價非定向細胞向所關注譜系的分化的特徵。「β-細胞譜系」是指具有轉錄因子pdx-1和下列轉錄因子中的至少一種的陽性基因表達的細胞：ngn-3、nkx2.2、nkx6.1、neurod、isl-1、hnf-3β、mafa、pax4和pax6。表達β細胞譜系特徵性標誌物的細胞包括β細胞。如本文所用，「表達定形內胚層譜系特徵性標記物的細胞」是指可表達下列標記物中的至少一種的細胞：sox-17、gata-4、hnf-3β、gsc、cer1、nodal、fgf8、brachyury、mix樣同源盒蛋白、fgf4cd48、脫中胚蛋白(eomes)、dkk4、fgf17、gata-6、cxcr4、c-kit、cd99或otx2。表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內胚層細胞和定形內胚層細胞。如本文所用，「表達胰腺內胚層譜系特徵性標記物的細胞」是指表達下列標記物中的至少一種的細胞：pdx-1、hnf-1β、ptf-1α、hnf-6或hb9。表達胰腺內胚層譜系特徵性標記物的細胞包括胰腺內胚層細胞。如本文所用，「表達胰腺內分泌譜系特徵性標記物的細胞」是指表達下列標記物中的至少一種的細胞：ngn-3、neurod、islet-1、pdx-1、nkx6.1、pax-4或ptf-1α。表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞包括胰腺內分泌細胞、胰激素表達細胞、胰激素分泌細胞和β-細胞譜系的細胞。如本文所用，「定形內胚層」指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產生的細胞的特性並形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內胚層細胞表達下列標記物：hnf-3β、gata-4、sox-17、cerberus、otx2、goosecoid、c-kit、cd99和mixl1。如本文所用，「胚外內胚層」是指表達下列標記物中的至少一種的細胞群：sox-7、afp和sparc。如本文所用，「標記物」是指在所關注細胞內差異表達的核酸或多肽分子。在這個情形中，差異表達意思是陽性標誌物的水平增加，而陰性標誌物的水平降低。與其他細胞相比，所關注細胞中的核酸或多肽標記物的可檢測水平足夠高或足夠低，使得可以使用本領域已知的多種方法識別所關注細胞，並將所關注細胞與其他細胞區相區分。如本文所用，「中內胚層細胞」是指表達下列標記物中的至少一種的細胞：cd48、脫中胚蛋白(eomes)、sox-17、dkk4、hnf-3β、gsc、fgf17、gata-6。如本文所用，「胰腺內分泌細胞」或「表達胰激素的細胞」是指能夠表達下列激素中的至少一種的細胞：胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，「分泌胰激素的細胞」是指能夠分泌下列激素中的至少一種的細胞：胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，「原條前體細胞」是指表達下列標記物中的至少一種的細胞：nodal或fgf8。如本文所用，「原條細胞」是指表達下列標記物中的至少一種的細胞：brachyury、mix樣同源盒蛋白或fgf4。在一個實施例中，本發明提供了使多潛能細胞擴增和分化的方法，該方法包括用gsk-3b酶活性抑制劑處理多潛能細胞。在一個實施例中，本發明提供了使多潛能細胞擴增和分化的方法，該方法包括如下步驟：c.培養多潛能細胞，以及d.用gsk-3b酶活性抑制劑處理所述多潛能細胞。在一個實施例中，所述多潛能細胞分化成可表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。定形內胚層譜系特徵性標誌物選自sox17、gata4、hnf-3β、gsc、cer1、nodal、fgf8、brachyury、mix樣同源盒蛋白、fgf4cd48、脫中胚蛋白(eomes)、dkk4、fgf17、gata6、cxcr4、c-kit、cd99和otx2。本發明中還考慮的是衍生自多潛能細胞的表達至少一種定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。在本發明的一個方面，表達定形內胚層譜系特徵性標記物的細胞為原條前體細胞。在一個替代方面，表達定形內胚層譜系特徵性標記物的細胞為中內胚層細胞。在一個替代方面，表達定形內胚層譜系特徵性標記物的細胞為定形內胚層細胞。可將多潛能細胞用gsk-3b酶活性抑制劑處理約1至約72小時。作為另一種選擇，可將多潛能細胞用gsk-3b酶活性抑制劑處理約12至約48小時。作為另一種選擇，可將多潛能細胞用gsk-3b酶活性抑制劑處理約48小時。在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑以約100nm至約100μm的濃度使用。或者，gsk-3b酶活性抑制劑以約1μm至約10μm的濃度使用。或者，gsk-3b酶活性抑制劑以約10μm的濃度使用。適用於本發明方法的化合物在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑是式(i)化合物以及其可藥用鹽：其中：r1是苯基、取代的苯基(其中所述苯基取代基選自c1-5烷基、滷素、硝基、三氟甲基和腈)或嘧啶基；r2是苯基、取代的苯基(其中所述苯基取代基選自c1-5烷基、滷素、硝基、三氟甲基和腈)或嘧啶基(其任選被c1-4烷基取代)，並且r1和r2中的至少一者是嘧啶基；r3是氫、2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基甲基、c1-5烷氧羰基、芳氧羰基、芳基c1-5烷氧羰基、芳基c1-5烷基、取代的芳基c1-5烷基(其中一個或多個芳基取代基獨立地選自c1-5烷基、c1-5烷氧基、滷素、氨基、c1-5烷基氨基和二c1-5烷基氨基)、鄰苯二甲醯亞胺基c1-5烷基、氨基c1-5烷基、二氨基c1-5烷基、琥珀醯亞胺基c1-5烷基、c1-5烷基羰基、芳基羰基、c1-5烷基羰基c1-5烷基和芳氧羰基c1-5烷基；r4是-(a)-(ch2)q-x；a是乙烯撐基、亞乙炔基或r5選自氫、c1-5烷基、苯基和苯基c1-5烷基；q為0-9；x選自氫、羥基、乙烯基、取代的乙烯基(其中一個或多個乙烯基取代基各自選自氟、溴、氯化和碘)、乙炔基、取代的乙炔基(其中乙炔基取代基選自氟、溴、氯和碘)、c1-5烷基、取代的c1-5烷基(其中一個或多個烷基取代基各自選自c1-5烷氧基、三滷代烷基、鄰苯二甲醯亞胺基和氨基)、c3-7環烷基、c1-5烷氧基、取代的c1-5烷氧基(其中烷基取代基選自鄰苯二甲醯亞胺基和氨基)、鄰苯二甲醯亞胺基氧基、苯氧基、取代的苯氧基(其中一個或多個苯基取代基各自選自c1-5烷基、滷素和c1-5烷氧基)、苯基、取代的苯基(其中一個或多個苯基取代基各自選自c1-5烷基、滷素和c1-5烷氧基)、芳基c1-5烷基、取代的芳基c1-5烷基(其中一個或多個芳基取代基各自選自c1-5烷基、滷素和c1-5烷氧基)、芳氧基c1-5烷基氨基、c1-5烷基氨基、二c1-5烷基氨基、腈、肟、苄氧基亞胺基、c1-5烷氧基亞胺基、鄰苯二甲醯亞胺基、琥珀醯亞胺基、c1-5烷基羰氧基、苯基羰氧基、取代的苯基羰氧基(其中一個或多個苯基取代基各自選自c1-5烷基、滷素和c1-5烷氧基)、苯基c1-5烷基羰氧基(其中一個或多個苯基取代基各自選自c1-5烷基、滷素和c1-5烷氧基)、氨基羰氧基、c1-5烷基氨基羰氧基、二c1-5烷基氨基羰氧基、c1-5烷氧羰氧基、取代的c1-5烷氧羰氧基(其中一個或多個烷基取代基各自選自甲基、乙基、異丙基和己基)、苯氧基羰氧基、取代的苯氧基羰氧基(其中一個或多個苯基取代基各自選自c1-5烷基、c1-5烷氧基和滷素)、c1-5烷硫基、取代的c1-5烷硫基(其中烷基取代基選自羥基和鄰苯二甲醯亞胺基)、c1-5烷基磺醯基、苯基磺醯基、取代的苯基磺醯基(其中一個或多個苯基取代基各自選自溴、氟、氯、c1-5烷氧基和三氟甲基)；前提條件是，如果a是q為0且x是h，則r3可以不是2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基甲基。本發明的例子包括其中r1為取代的苯基且r2為嘧啶-3-基的式(i)化合物。本發明的例子包括其中r1為4-氟代苯基的式(i)化合物。本發明的例子包括其中r3為氫、芳基c1-5烷基或取代的芳基c1-5烷基的式(i)化合物。本發明的例子包括其中r3為氫或苯基c1-5烷基的式(i)化合物。本發明的例子包括其中a為亞乙炔基且q為0-5的式(i)化合物。本發明的例子包括其中x是琥珀醯亞胺基、羥基、甲基、苯基、c1-5烷基磺醯基、c3-6環烷基、c1-5烷基羰氧基、c1-5烷氧基、苯基羰氧基、c1-5烷基氨基、二c1-5烷基氨基或腈的式(i)化合物。共同轉讓的美國專利號6,214,830中公開了式(i)化合物，將該專利的全部公開內容以引用的方式併入本文。本發明的例子包括其中化合物選自如下化合物的式(i)化合物：本發明的例子包括其中化合物為下式表示的化合物5的式(i)化合物：在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑是式(ii)化合物以及其可藥用鹽：其中：r選自ra、-c1-8烷基-ra、-c2-8烯基-ra、-c2-8炔基-ra和氰基；ra選自環烷基、雜環基、芳基和雜芳基；r1選自氫、-c1-8烷基-r5、-c2-8烯基-r5、-c2-8炔基-r5、-c(o)-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-o-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-c(o)-nh(c1-8烷基-r9)、-c(o)-nh(芳基-r8)、-c(o)-n(c1-8烷基-r9)2、-so2-(c1-8)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-環烷基-r6、-雜環基-r6、-芳基-r6和-雜芳基-r6；其中雜環基和雜芳基通過雜環基或雜芳基環碳原子與1號位上的氮雜吲哚氮原子連接；r5是1至2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-o-(c1-8)烷基、-o-(c1-8)烷基-oh、-o-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基、-o-(c1-8)烷基-nh2、-o-(c1-8)烷基-nh(c1-8烷基)、-o-(c1-8)烷基-n(c1-8烷基)2、-o-(c1-8)烷基-s-(c1-8)烷基、-o-(c1-8)烷基-so2-(c1-8)烷基、-o-(c1-8)烷基-so2-nh2、-o-(c1-8)烷基-so2-nh(c1-8烷基)、-o-(c1-8)烷基-so2-n(c1-8烷基)2、-o-c(o)h、-o-c(o)-(c1-8)烷基、-o-c(o)-nh2、-o-c(o)-nh(c1-8烷基)、-o-c(o)-n(c1-8烷基)2、-o-(c1-8)烷基-c(o)h、-o-(c1-8)烷基-c(o)-(c1-8)烷基、-o-(c1-8)烷基-co2h、-o-(c1-8)烷基-c(o)-o-(c1-8)烷基、-o-(c1-8)烷基-c(o)-nh2、-o-(c1-8)烷基-c(o)-nh(c1-8烷基)、-o-(c1-8)烷基-c(o)-n(c1-8烷基)2、-c(o)h、-c(o)-(c1-8)烷基、-co2h、-c(o)-o-(c1-8)烷基、-c(o)-nh2、-c(nh)-nh2、-c(o)-nh(c1-8烷基)、-c(o)-n(c1-8烷基)2、-sh、-s-(c1-8)烷基、-s-(c1-8)烷基-s-(c1-8)烷基、-s-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基、-s-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基-oh、-s-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基-nh2、-s-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基-nh(c1-8烷基)、-s-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基-n(c1-8烷基)2、-s-(c1-8)烷基-nh(c1-8烷基)、-so2-(c1-8)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-8烷基)、-so2-n(c1-8烷基)2、-n-r7、氰基、(滷素)1-3、羥基、硝基、氧代基、-環烷基-r6、-雜環基-r6、-芳基-r6和-雜芳基-r6；r6是1至4個獨立地選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基：氫、-c1-8烷基、-c2-8烯基、-c2-8炔基、-c(o)h、-c(o)-(c1-8)烷基、-co2h、-c(o)-o-(c1-8)烷基、-c(o)-nh2、-c(nh)-nh2、-c(o)-nh(c1-8烷基)、-c(o)-n(c1-8)烷基)2、-so2-(c1-8)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-8烷基)、-so2-n(c1-8烷基)2、-(c1-8)烷基-n-r7、-(c1-8)烷基-(滷素)1-3、-(c1-8)烷基-oh、-芳基-r8、-(c1-8)烷基-芳基-r8和-(c1-8)烷基-雜芳基-r8；前提條件是，當r6與碳原子連接時，r6進一步選自-c1-8烷氧基、-(c1-8)烷氧基-(滷素)1-3、-sh、-s-(c1-8)烷基、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、氧代基和-雜芳基-r8；r7是2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-c1-8烷基、-c2-8烯基、-c2-8炔基、-(c1-8)烷基-oh、-(c1-8)烷基-o-(c1-8)烷基、-(c1-8)烷基-nh2、-(c1-8)烷基-nh(c1-8烷基)、-(c1-8)烷基-n(c1-8烷基)2、-(c1-8)烷基-s-(c1-8)烷基、-c(o)h、-c(o)-(c1-8)烷基、-c(o)-o-(c1-8)烷基、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-8烷基)、-c(o)-n(c1-8烷基)2、-so2-(c1-8)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-8烷基)、-so2-n(c1-8烷基)2、-c(n)-nh2、-環烷基-r8、-(c1-8)烷基-雜環基-r8、-芳基-r8、-(c1-8)烷基-芳基-r8和-(c1-8)烷基-雜芳基-r8；r8是1至4個獨立地選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基：氫、-c1-8烷基、-(c1-8)烷基-(滷素)1-3和-(c1-8)烷基-oh；前提條件是，當r8與碳原子連接時，r8進一步選自-c1-8烷氧基、-nh2、-nh(c1-8烷基)、-n(c1-8烷基)2、氰基、滷素、-(c1-8)烷氧基-(滷素)1-3、羥基和硝基；r9是1至2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-c1-8烷氧基、-nh2、-nh(c1-8烷基)、-n(c1-8烷基)2、氰基、(滷素)1-3、羥基和硝基；r2是1個選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基：氫、-c1-8烷基-r5、-c2-8烯基-r5、-c2-8炔基-r5、-c(o)h、-c(o)-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-8烷基-r9)、-c(o)-n(c1-8烷基-r9)2、-c(o)-nh(芳基-r8)、-c(o)-環烷基-r8、-c(o)-雜環基-r8、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-雜芳基-r8、-co2h、-c(o)-o-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-so2-(c1-8)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-環烷基-r6、-芳基-r6和-(c1-8)烷基-n-r7；前提條件是，當r2與碳原子連接時，r2進一步選自-c1-8烷氧基-r5、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、氧代基、-雜環基-r6和-雜芳基-r6；r3是1至3個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基：氫、-c1-8烷基-r10、-c2-8烯基-r10、-c2-8炔基-r10、-c1-8烷氧基-r10、-c(o)h、-c(o)-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-8烷基-r9)、-c(o)-n(c1-8烷基-r9)2、-c(o)-環烷基-r8、-c(o)-雜環基-r8、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-雜芳基-r8、-c(nh)-nh2、-co2h、-c(o)-o-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-so2-(c1-8)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、-環烷基-r8、-雜環基-r8、-芳基-r8和-雜芳基-r8；r4是1至4個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基：氫、-c1-8烷基-r10、-c2-8烯基-r10、-c2-8炔基-r10、-c1-8烷氧基-r10、-c(o)h、-c(o)-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-8烷基-r9)、-c(o)-n(c1-8烷基-r9)2、-c(o)-環烷基-r8、-c(o)-雜環基-r8、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-雜芳基-r8、-c(nh)-nh2、-co2h、-c(o)-o-(c1-8)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-sh、-s-(c1-8)烷基-r10、-so2-(c1-8)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-so2-nh2、-so2-nh(c1-8烷基-r9)、-so2-n(c1-8烷基-r9)2、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、-環烷基-r8、-雜環基-r8、-芳基-r8和-雜芳基-r8；r10是1至2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-nh2、-nh(c1-8烷基)、-n(c1-8烷基)2、氰基、(滷素)1-3、羥基、硝基和氧代基；並且，y和z獨立地選自o、s、(h、oh)和(h、h)；前提條件是，y和z其中一者是o而另一者選自o、s、(h、oh)和(h、h)。本發明的實施例包括其中r選自ra、-c1-4烷基-ra、-c2-4烯基-ra、-c2-4炔基-ra和氰基的式(ii)化合物。本發明的實施例包括其中ra選自雜環基、芳基和雜芳基的式(ii)化合物。在一個實施例中，ra選自二氫-吡喃基、苯基、萘基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、氮雜吲哚基、吲唑基、苯並呋喃基、苯並噻吩基、二苯並呋喃基和二苯並噻吩基。本發明的實施例包括其中r1選自如下基團的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基-r5、-c2-4烯基-r5、-c2-4炔基-r5、-c(o)-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-o-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-c(o)-nh(c1-4烷基-r9)、-c(o)-nh(芳基-r8)、-c(o)-n(c1-4烷基-r9)2、-so2-(c1-4)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-環烷基-r6、-雜環基-r6、-芳基-r6和-雜芳基-r6；其中雜環基和雜芳基通過雜環基或雜芳基環碳原子與1號位上的氮雜吲哚氮原子連接。在一個實施例中，r1選自氫、-c1-4烷基-r5、-芳基-r6和-雜芳基-r6；其中雜芳基通過雜芳基環碳原子與1號位上的氮雜吲哚氮原子連接。在一個實施例中，r1選自氫、-c1-4烷基-r5和-萘基-r6。本發明的實施例包括其中r5是1至2個獨立地選自如下基團的取代基的式(ii)化合物：氫、-o-(c1-4)烷基、-o-(c1-4)烷基-oh、-o-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基、-o-(c1-4)烷基-nh2、-o-(c1-4)烷基-nh(c1-4烷基)、-o-(c1-4)烷基-n(c1-4烷基)2、-o-(c1-4)烷基-s-(c1-4)烷基、-o-(c1-4)烷基-so2-(c1-4)烷基、-o-(c1-4)烷基-so2-nh2、-o-(c1-4)烷基-so2-nh(c1-4烷基)、-o-(c1-4)烷基-so2-n(c1-4烷基)2、-o-c(o)h、-o-c(o)-(c1-4)烷基、-o-c(o)-nh2、-o-c(o)-nh(c1-4烷基)、-o-c(o)-n(c1-4烷基)2、-o-(c1-4)烷基-c(o)h、-o-(c1-4)烷基-c(o)-(c1-4)烷基、-o-(c1-4)烷基-co2h、-o-(c1-4)烷基-c(o)-o-(c1-4)烷基、-o-(c1-4)烷基-c(o)-nh2、-o-(c1-4)烷基-c(o)-nh(c1-4烷基)、-o-(c1-4)烷基-c(o)-n(c1-4烷基)2、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基、-co2h、-c(o)-o-(c1-4)烷基、-c(o)-nh2、-c(nh)-nh2、-c(o)-nh(c1-4烷基)、-c(o)-n(c1-4烷基)2、-sh、-s-(c1-4)烷基、-s-(c1-4)烷基-s-(c1-4)烷基、-s-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基、-s-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基-oh、-s-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基-nh2、-s-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基-nh(c1-4烷基)、-s-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基-n(c1-4烷基)2、-s-(c1-4)烷基-nh(c1-4烷基)、-so2-(c1-4)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-4烷基)、-so2-n(c1-4烷基)2、-n-r7、氰基、(滷素)1-3、羥基、硝基、氧代基、-環烷基-r6、-雜環基-r6、-芳基-r6和-雜芳基-r6。在一個實施例中，r5是1至2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-o-(c1-4)烷基、-n-r7、羥基和-雜芳基-r6。在一個實施例中，r5是1至2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-o-(c1-4)烷基、-n-r7、羥基、-咪唑基-r6、-三唑基-r6和-四唑基-r6。本發明的實施例包括其中r6是1至4個獨立地選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基、-c2-4烯基、-c2-4炔基、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基、-co2h、-c(o)-o-(c1-4)烷基、-c(o)-nh2、-c(nh)-nh2、-c(o)-nh(c1-4烷基)、-c(o)-n(c1-4)烷基)2、-so2-(c1-4)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-4烷基)、-so2-n(c1-4烷基)2、-(c1-4)烷基-n-r7、-(c1-4)烷基-(滷素)1-3、-(c1-4)烷基-oh、-芳基-r8、-(c1-4)烷基-芳基-r8和-(c1-4)烷基-雜芳基-r8；前提條件是，當r6與碳原子連接時，r6進一步選自-c1-4烷氧基、-(c1-4)烷氧基-(滷素)1-3、-sh、-s-(c1-4)烷基、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、氧代基和-雜芳基-r8。在一個實施例中，r6是氫。本發明的實施例包括其中r7是2個獨立地選自如下基團的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基、-c2-4烯基、-c2-4炔基、-(c1-4)烷基-oh、-(c1-4)烷基-o-(c1-4)烷基、-(c1-4)烷基-nh2、-(c1-4)烷基-nh(c1-4烷基)、-(c1-4)烷基-n(c1-4烷基)2、-(c1-4)烷基-s-(c1-4)烷基、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基、-c(o)-o-(c1-4)烷基、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-4烷基)、-c(o)-n(c1-4烷基)2、-so2-(c1-4)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-4烷基)、-so2-n(c1-4烷基)2、-c(n)-nh2、-環烷基-r8、-(c1-4)烷基-雜環基-r8、-芳基-r8、-(c1-4)烷基-芳基-r8和-(c1-4)烷基-雜芳基-r8。在一個實施例中，r7是2個獨立地選自如下基團的取代基：氫、-c1-4烷基、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基、-c(o)-o-(c1-4)烷基、-so2-nh2、-so2-nh(c1-4烷基)和-so2-n(c1-4烷基)2。本發明的實施例包括其中r8是1至4個獨立地選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基、-(c1-4)烷基-(滷素)1-3和-(c1-4)烷基-oh；前提條件是，當r8與碳原子連接時，r8進一步選自-c1-4烷氧基、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、氰基、滷素、-(c1-4)烷氧基-(滷素)1-3、羥基和硝基。在一個實施例中，r8是氫。本發明的實施例包括其中r9是1至2個獨立地選自如下基團的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷氧基、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、氰基、(滷素)1-3、羥基和硝基。在一個實施例中，r9是氫。本發明的實施例包括其中r2是1個選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基-r5、-c2-4烯基-r5、-c2-4炔基-r5、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-4烷基-r9)、-c(o)-n(c1-4烷基-r9)2、-c(o)-nh(芳基-r8)、-c(o)-環烷基-r8、-c(o)-雜環基-r8、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-雜芳基-r8、-co2h、-c(o)-o-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-so2-(c1-4)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-環烷基-r6、-芳基-r6和-(c1-4)烷基-n-r7；前提條件是，當r2與碳原子連接時，r2進一步選自-c1-4烷氧基-r5、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、氧代基、-雜環基-r6和-雜芳基-r6。在一個實施例中，r2是1個選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基：氫、-c1-4烷基-r5、-c2-4烯基-r5、-c2-4炔基-r5、-co2h、-c(o)-o-(c1-4)烷基-r9、-環烷基-r6、-芳基-r6和-(c1-4)烷基-n-r7；前提條件是，當r2與氮原子連接時，不形成季銨鹽；並且，前提條件是，當r2與碳原子連接時，r2進一步選自選自-c1-4烷氧基-r5、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、氧代基、-雜環基-r6和-雜芳基-r6。在一個實施例中，r2是1個選自如下基團的與碳或氮原子連接的取代基：氫、-c1-4烷基-r5和-芳基-r6；前提條件是，當r2與氮原子連接時，不形成季銨鹽；並且，前提條件是，當r2與碳原子連接時，r2進一步選自-n-r7、滷素、羥基和-雜芳基-r6。本發明的實施例包括其中r3是1至3個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基-r10、-c2-4烯基-r10、-c2-4炔基-r10、-c1-4烷氧基-r10、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-4烷基-r9)、-c(o)-n(c1-4烷基-r9)2、-c(o)-環烷基-r8、-c(o)-雜環基-r8、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-雜芳基-r8、-c(nh)-nh2、-co2h、-c(o)-o-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-so2-(c1-8)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-n-r7、-(c1-4)烷基-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、-環烷基-r8、-雜環基-r8、-芳基-r8和-雜芳基-r8。在一個實施例中，r3是1個選自如下基團的與碳原子連接的基團：氫、-c1-4烷基-r10、-c2-4烯基-r10、-c2-4炔基-r10、-c1-4烷氧基-r10、-c(o)h、-co2h、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、氰基、滷素、羥基和硝基。在一個實施例中，r3是1個選自如下基團的與碳原子連接的取代基：氫、-c1-4烷基-r10、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、滷素和羥基。本發明的實施例包括其中r4是1至4個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基的式(ii)化合物：氫、-c1-4烷基-r10、-c2-4烯基-r10、-c2-4炔基-r10、-c1-4烷氧基-r10、-c(o)h、-c(o)-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-nh2、-c(o)-nh(c1-4烷基-r9)、-c(o)-n(c1-4烷基-r9)2、-c(o)-環烷基-r8、-c(o)-雜環基-r8、-c(o)-芳基-r8、-c(o)-雜芳基-r8、-c(nh)-nh2、-co2h、-c(o)-o-(c1-4)烷基-r9、-c(o)-o-芳基-r8、-sh、-s-(c1-4)烷基-r10、-so2-(c1-4)烷基-r9、-so2-芳基-r8、-so2-nh2、-so2-nh(c1-4烷基-r9)、-so2-n(c1-4烷基-r9)2、-n-r7、氰基、滷素、羥基、硝基、-環烷基-r8、-雜環基-r8、-芳基-r8和-雜芳基-r8。在一個實施例中，r4是1至4個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基：氫、-c1-4烷基-r10、-c2-4烯基-r10、-c2-4炔基-r10、-c1-4烷氧基-r10、-c(o)h、-co2h、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、氰基、滷素、羥基、硝基、-環烷基、-雜環基、-芳基和-雜芳基。在一個實施例中，r4是1至4個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基：氫、c1-4烷基-r10、c1-4烷氧基-r10、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、滷素和羥基。在一個實施例中，r4是1至4個獨立地選自如下基團的與碳原子連接的取代基：氫、c1-4烷基-r10、c1-4烷氧基-r10、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、氯、氟和羥基。本發明的實施例包括其中r10是1至2個獨立地選自如下基團的取代基的式(ii)化合物：氫、-nh2、-nh(c1-4烷基)、-n(c1-4烷基)2、氰基、(滷素)1-3、羥基、硝基和氧代基。在一個實施例中，r10是1至2個獨立地選自氫和(滷素)1-3的取代基。在一個實施例中，r10是1至2個獨立地選自氫和(氟)3的取代基。本發明的實施例包括其中y和z獨立地選自o、s、(h、oh)和(h、h)的式(ii)化合物；前提條件是，y和z其中一者是o而另一者選自o、s、(h、oh)和(h、h)。在一個實施例中，y和z獨立地選自o和(h、h)；前提條件是，y和z其中一者是o而另一者選自o和(h、h)。在一個實施例中，y和z獨立地選自o。共同轉讓的美國專利號7,125,878中公開了式(ii)化合物，將該專利的全部公開內容以引用的方式併入本文。本發明的例子包括其中化合物選自如下化合物的式(ii)化合物：本發明的例子包括其中化合物選自如下化合物的式(ii)化合物：在一個實施例中，gsk-3b酶活性抑制劑是式(iii)化合物以及其可藥用鹽：其中a和e獨立地選自氫取代的碳原子和氮原子；其中獨立地選自1h-吲哚、1h-吡咯並[2，3-b]吡啶、1h-吡唑並[3，4-b]吡啶和1h-吲唑；z選自o；或者，z選自二氫，其中每個氫原子通過單鍵連接；r4和r5獨立地選自任選被氧代基取代的c1-8烷基、c2-8烯基和c2-8炔基；r2選自-c1-8烷基-、-c2-8烯基-、-c2-8炔基-、-o-(c1-8)烷基-o-、-o-(c2-8)烯基-o-、-o-(c2-8)炔基-o-、-c(o)-(c1-8)烷基-c(o)-(其中上述烷基、烯基和炔基連接基團中任一者是直鏈碳鏈，任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、-c(o)o-(c1-8)烷基、-c1-8烷基-c(o)o-(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基、羥基(c1-8)烷基和氧代基；並且，其中上述烷基、烯基和炔基連接基團中任一者任選被一個或兩個獨立地選自如下基團的取代基取代：雜環基、芳基、雜芳基、雜環基(c1-8)烷基、芳基(c1-8)烷基、雜芳基(c1-8)烷基、螺環烷基和螺雜環基(其中上述環烷基、雜環基、芳基和雜芳基取代基中任一者任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基；並且，其中上述雜環基取代基中任一者任選被如下取代基取代：氧代基))、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基(其中環烷基、雜環基、芳基和雜芳基任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基；並且，其中雜環基任選被氧代基取代)、-(o-(ch2)1-6)0-5-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-o-、-(o-(ch2)1-6)0-5-nr6-、-o-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-nr6-、-(o-(ch2)1-6)0-5-s-、-o-(ch2)1-6-s-(ch2)1-6-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-s-、-nr6-、-nr6-nr7-、-nr6-(ch2)1-6-nr7-、-nr6-(ch2)1-6-nr7-(ch2)1-6-nr8-、-nr6-c(o)-、-c(o)-nr6-、-c(o)-(ch2)0-6-nr6-(ch2)0-6-c(o)-、-nr6-(ch2)0-6-c(o)-(ch2)1-6-c(o)-(ch2)0-6-nr7-、-nr6-c(o)-nr7-、-nr6-c(nr7)-nr8-、-o-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-s-、-s-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-o-、-s-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-s-、-nr6-(ch2)1-6-s-(ch2)1-6-nr7-和-so2-(其中r6、r7和r8獨立地選自氫、c1-8烷基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基(c1-8)烷基、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、羥基(c1-8)烷基、雜環基(c1-8)烷基、芳基(c1-8)烷基和雜芳基(c1-8)烷基(其中上述雜環基、芳基和雜芳基取代基任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基任選被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基；並且，其中雜環基任選被氧代基取代))；前提條件是，如果a和e選自氫取代的碳原子，則r2選自-c2-8炔基-、-o-(c1-8)烷基-o-、-o-(c2-8)烯基-o-、-o-(c2-8)炔基-o-、-c(o)-(c1-8)烷基-c(o)-(其中上述烷基、烯基和炔基連接基中任一者是直鏈碳鏈，任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、-c(o)o-(c1-8)烷基、-c1-8烷基-c(o)o-(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基、羥基(c1-8)烷基和氧代基；並且，其中上述烷基、烯基和炔基連接基團中任一者任選被一個或兩個獨立地選自如下基團的取代基取代：雜環基、芳基、雜芳基、雜環基(c1-8)烷基、芳基(c1-8)烷基、雜芳基(c1-8)烷基、螺環烷基和螺雜環基(其中上述環烷基、雜環基、芳基和雜芳基取代基中任一者任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基；並且，其中上述雜環基取代基中任一者任選被如下取代基取代：氧代基))、環烷基(其中環烷基任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基)、-(o-(ch2)1-6)1-5-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-o-、-(o-(ch2)1-6)1-5-nr6-、-o-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-nr6-、-(o-(ch2)1-6)0-5-s-、-o-(ch2)1-6-s-(ch2)1-6-o-、-o-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-s-、-nr6-nr7-、-nr6-(ch2)1-6-nr7-、-nr6-(ch2)1-6-nr7-(ch2)1-6-nr8-、-nr9-c(o)-、-c(o)-nr9-、-c(o)-(ch2)0-6-nr6-(ch2)0-6-c(o)-、-nr6-(ch2)0-6-c(o)-(ch2)1-6-c(o)-(ch2)0-6-nr7-、-nr6-c(o)-nr7-、-nr6-c(nr7)-nr8-、-o-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-s-、-s-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-o-、-s-(ch2)1-6-nr6-(ch2)1-6-s-和-nr6-(ch2)1-6-s-(ch2)1-6-nr7-(其中r6、r7和r8獨立地選自氫、c1-8烷基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基(c1-8)烷基、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、羥基(c1-8)烷基、雜環基(c1-8)烷基、芳基(c1-8)烷基和雜芳基(c1-8)烷基(其中上述雜環基、芳基和雜芳基取代基任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基；並且，其中雜環基任選被氧代基取代)；並且，其中r9選自c1-8烷基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基(c1-8)烷基、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、羥基(c1-8)烷基、雜環基(c1-8)烷基、芳基(c1-8)烷基和雜芳基(c1-8)烷基(其中上述雜環基、芳基和雜芳基取代基任選被1至4個獨立地選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、c1-8烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基；並且，其中雜環基任選被氧代基取代))；並且，r1和r3獨立地選自氫、c1-8烷基、c2-8烯基、c2-8炔基(其中烷基、烯基和炔基任選被選自如下基團的取代基取代：c1-8烷氧基、烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、(滷素)1-3、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基、羥基(c1-8)烷基和氧代基)、c1-8烷氧基、c1-8烷氧羰基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、c1-8烷硫基、芳基、雜芳基(其中芳基和雜芳基任選被選自如下基團的取代基取代：c1-8烷基、c1-8烷氧基、烷氧基(c1-8)烷基、羧基、羧基(c1-8)烷基、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氨基(c1-8)烷基(其中氨基被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、滷素、(滷素)1-3(c1-8)烷基、(滷素)1-3(c1-8)烷氧基、羥基和羥基(c1-8)烷基)、氨基(被獨立地選自氫和c1-4烷基的取代基取代)、氰基、滷素、羥基和硝基。在一個實施例中，式(iii)化合物是選自如下的化合物以及其可藥用鹽：其中所有其他變量是如此前所定義的。在一個實施例中，式(iii)化合物是選自如下的化合物以及其可藥用鹽：其中所有其他變量是如此前所定義的。共同轉讓的美國專利號6,828,327中公開了式(iii)化合物，將該專利的全部公開內容以引用的方式併入本文。本發明的一個例子包括其中化合物選自如下的式(iii)化合物：本發明的一個例子包括其中化合物選自如下的式(iii)化合物：本發明的另一個例子包括選自如下的化合物：本發明的另一個例子包括選自如下的化合物：適於根據本發明方法的處理的細胞適用本發明的多潛能細胞表達至少一種選自如下的多潛能標誌物：abcg2、cripto、foxd3、連接蛋白43、連接蛋白45、oct4、sox-2、nanog、htert、utf-1、zfp42、ssea-3、ssea-4、tra1-60和tra1-81。在一個實施例中，多潛能細胞是胚胎幹細胞。在一個替代實施例中，多潛能細胞是衍生自胚胎幹細胞的表達多潛能標誌物的細胞。在一個實施例中，胚胎幹細胞是人胚胎幹細胞。人胚胎幹細胞的分離、擴增和培養人胚胎幹細胞的表徵：人胚胎幹細胞可表達階段特異性胚胎抗原(ssea)3和4以及可用稱為tra-1-60和tra-1-81的抗體(thomson等人，science282：1145，1998)檢測的標誌物中的一種或多種。人胚胎幹細胞體外分化導致喪失ssea-4、tra-1-60和tra-1-81的表達(如果存在的話)，並增加ssea-1的表達。未分化的人胚胎幹細胞通常具有鹼性磷酸酶活性，該酶可通過用4％多聚甲醛固定細胞，然後用vectorred作為底物顯影來檢測，如生產商(vectorlaboratories，burlingamecalif)所描述的。未分化的多能幹細胞通常還表達oct-4和tert，這可由rt-pcr檢測。增殖的人胚胎幹細胞的另一期望表型是有潛能分化成所有三個胚層：內胚層、中胚層和外胚層組織的細胞。可以例如通過如下方式來確定幹細胞的多潛能性：將細胞注射入scid小鼠，用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然後對其進行組織學檢驗，找出來自三個胚層的細胞類型的證據。作為另外一種選擇，可以通過產生胚狀體並評估胚狀體中三個胚層相關的標記物的存在來確定多能性。可以使用標準g帶顯帶技術並與相應靈長類物種的已公開的核型進行比較來分析增殖的人胚胎幹細胞系的核型。希望獲得具有「正常核型」(其意指細胞是整倍體的)的細胞，其中所有人染色體都存在並且無明顯的改變。人胚胎幹細胞的來源：可以使用的多人胚胎幹細胞的類型包括衍生自妊娠後形成的組織的已建立的人胚胎細胞系，這些組織包括在妊娠期任何時間(通常但不是必須在妊娠前大約10-12周)採集的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織。非限制性的例子是已確立的人胚胎幹細胞系或人胚胎生殖細胞系，例如人胚胎幹細胞系h1、h7和h9(wicell)。還可設想的是，在此類細胞的初始建立或穩定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細胞將是直接取自源組織的原代多潛能細胞。另外合適的是取自已在不存在飼養細胞的情況下培養的多能幹細胞群體的細胞。同樣合適的是突變型人胚胎幹細胞系，例如bg01v(bresagen，athens，ga)。在一個實施例中，人胚胎幹細胞是如thomson等人(美國專利no.5,843,780；science282：1145，1998；curr.top.dev.biol.38：133ff.，1998；proc.natl.acad.sci.u.s.a.92：7844，1995)所描述製備。人胚胎幹細胞的培養：在一個實施例中，將人胚胎幹細胞在基本上不含飼養細胞、但仍支持人胚胎幹細胞增殖而不進行大量分化的培養系統中培養。使用通過此前培養另一細胞類型而調理過的培養基來支持人胚胎幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學成分確定的培養基來支持人胚胎幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。在一個替代實施例中，將人胚胎幹細胞最初在飼養細胞層上培養，該飼養細胞可以多種方式支持人胚胎幹細胞。然後將人胚胎轉移至基本上無飼養細胞、但仍支持人胚胎幹細胞增殖而不進行大量分化的培養系統中培養。適用於本發明的調理培養基的例子在us20020072117、us6642048、wo2005014799和xu等人(stemcells22：972-980，2004)中有所公開。適用於本發明的化學成分確定的培養基的例子可在us20070010011找到。合適的培養基可以由下列組分製成，例如為：達爾伯克氏改良伊格爾培養基(dmem)，gibco#11965-092；knockout達爾伯克氏改良伊格爾培養基(kodmem)，gibco#10829-018；ham′sf12/50％dmem基礎培養基；200mm的l-穀氨醯胺，gibco#15039-027；非必需胺基酸溶液，gibco11140-050；β-巰基乙醇，sigma#m7522；人重組鹼性成纖維細胞生長因子(bfgf)，gibco#13256-029。在一個實施例中，將人胚胎幹細胞接種在合適的培養基質上，該培養基質在根據本發明方法處理前進行了處理。在一個實施例中，處理物是細胞外基質組分，例如衍生自基底膜或可形成粘附分子受體-配體配偶體的部分的那些。在一個實施例中，合適的培養基質是(bectondickenson)。是來自於engelbreth-holm-swarm腫瘤細胞的可溶性製劑，其在室溫下會發生膠化從而形成重構基底膜。其他的細胞外基質組分和組分混合物適合作為替代物。這可以包括層粘連蛋白、纖粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙醯肝素等等，它們可以單獨使用或多種組合使用。可在存在促進細胞存活、增殖和保持理想特性的培養基的情況下，以合適的分布將多能幹細胞接種於所述基質上。所有這些特性可得益於對接種分布的認真考慮並可容易地由本領域技術人員確定。衍生自人胚胎幹細胞的表達多潛能標誌物的細胞的分離、擴增和培養在一個實施例中，可表達多潛能標誌物的細胞通過包括如下步驟的方法而衍生自人胚胎幹細胞：a.培養人胚胎幹細胞，b.使所述人胚胎幹細胞分化成表達定形內胚層細胞特徵性標誌物的細胞，以及c.移出細胞，隨後將它們在低氧條件下在組織培養基質上培養，在培養細胞之前該組織培養基質沒有用蛋白質或細胞外基質進行預處理。在一個實施例中，可表達多潛能標誌物的細胞通過包括如下步驟的方法而衍生自人胚胎幹細胞：a.培養人胚胎幹細胞，並且b.移出細胞，隨後將它們在低氧條件下在組織培養基質上培養，該組織培養基質沒有用蛋白質或細胞外基質進行預處理。細胞在低氧條件下在未用蛋白質或細胞外基質預處理過的組織培養基質上的培養在一個實施例中，將細胞在低氧條件下，在未用細胞外基質塗覆的組織培養基質上培養約1至約20天。在一個替代實施例中，將細胞在低氧條件下，在未用細胞外基質塗覆的組織培養基質上培養約5至約20天。在一個替代實施例中，將細胞在低氧條件下，在未用細胞外基質塗覆的組織培養基質上培養約15天。在一個實施例中，低氧條件是約1％的o2至約20％的o2。在一個替代實施例中，低氧條件是約2％的o2至約10％的o2。在一個替代實施例中，低氧條件是約3％的o2。可將細胞在低氧條件下，在未用蛋白質或細胞外基質預處理過的組織培養基質上在含有血清、激活素a和wnt配體的培養基中培養。作為另一種選擇，該培養基還可含有igf-1。該培養基可具有在約2％至約5％的範圍內的血清濃度。在一個替代實施例中，血清濃度可以為約2％。激活素可以約1pg/ml至約100μg/ml的濃度使用。在一個替代實施例中，該濃度可以為約1pg/ml至約1μg/ml。在一個替代實施例中，該濃度可以為約1pg/ml至約100ng/ml。在一個替代實施例中，該濃度可以為約50ng/ml至約100ng/ml。在一個替代實施例中，該濃度可以為約100ng/ml。wnt配體可選自wnt-1、wnt-3a、wnt-5a和wnt-7a。在一個實施例中，wnt配體是wnt-1。在一個替代實施例中，wnt配體是wnt-3a。wnt配體可以約1ng/ml至約1000ng/ml的濃度使用。在一個替代實施例中，wnt配體可以約10ng/ml至約100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，wnt配體的濃度是約20ng/ml。igf-1可以約1ng/ml至約100ng/ml的濃度使用。在一個替代實施例中，igf-1可以約10ng/ml至約100ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，igf-1的濃度是約50ng/ml。通過本發明方法衍生的表達多潛能標誌物的細胞能夠在未用蛋白質或細胞外基質預處理過的組織培養基質上，在低氧條件下在培養物中擴增。通過本發明方法衍生的表達多潛能標誌物的細胞可表達至少一種選自如下的多潛能標誌物：abcg2、cripto、foxd3、連接蛋白43、連接蛋白45、oct4、sox-2、nanog、htert、utf-1、zfp42、ssea-3、ssea-4、tra1-60和tra1-81。表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的進一步分化可以通過本領域的任何方法，使表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據d』amour等人，naturebiotechnology24，1392-1401(2006)中公開的方法，使表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，還通過下述方法，使表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞：用成纖維細胞生長因子和kaad-環巴胺處理表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，然後移除含有成纖維細胞生長因子和kaad-環巴胺的培養基，隨後將細胞在含有視黃酸、成纖維細胞生長因子和kaad-環巴胺的培養基中進行培養。該方法的一個例子在d』amour等人，naturebiotechnology，24：1392-1401，(2006)有所公開。胰腺內胚層譜特徵性標誌物選自pdx1、hnf-1β，ptf1a、hnf-6、hb9和prox1。適用於本發明的是表達至少一種胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰腺內胚層譜系特徵性標記物的細胞為胰腺內胚層細胞。表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的進一步分化可以通過本領域的任何方法，將表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據d』amour等人，naturebiotechnology24，1392-1401(2006)中公開的方法，使表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。胰腺內分泌譜系特徵性標記物選自ngn-3、神經源性分化蛋白(neurod)、islet-1、pdx-1、nkx6.1、pax-4以及ptf-1α。在一個實施例中，胰腺內分泌細胞能夠表達至少一種以下激素：胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用於本發明的細胞為表達至少一種胰腺內分泌譜系特徵性標記物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰腺內分泌譜系特徵性標記物的細胞為胰腺內分泌細胞。胰腺內分泌細胞可以是胰激素表達細胞。或者，胰腺內分泌細胞可以是胰激素分泌細胞。在本發明的一個方面，胰腺內分泌細胞是表達β細胞譜系特徵性標誌物的細胞。表達β細胞譜系特徵性標記物的細胞可表達pdx1以及至少一種以下轉錄因子：ngn-3、nkx2.2、nkx6.1、neurod、isl-1、hnf-3β、mafa、pax4和pax6。在本發明的一個方面，表達β細胞譜系特徵性標誌物的細胞是β細胞。表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的檢測表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的形成可以通過在特定方案前後檢測標誌物的存在情況來確定。多能幹細胞通常不表達這類標誌物。因而，當細胞開始表達它們時即檢測到多潛能細胞的分化。可通過將處理過的細胞群體暴露於可特異性識別由表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞表達的蛋白質標誌物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用於評估蛋白質標誌物和核酸標誌物在培養的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些方法包括定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)、rna印記、原位雜交(參見例如，currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人(編輯)，2001增刊))以及免疫測定法(例如切片材料的免疫組織化學分析)、蛋白質印記以及針對完整細胞中可觸及的標誌物的流式細胞分析(facs)(參見例如，harlow和lane，usingantibodies：alaboratorymanual，newyork：coldspringharborlaboratorypress(1998))。可用於檢測某些蛋白質標誌物的抗體的例子在表ia中列出。應該指出的是，針對表ia所列抗體識別的相同標誌物的替代抗體是可獲得的，或可容易開發還可以採用這種替代抗體來評價根據本發明的分離細胞中標誌物的表達。例如，多能幹細胞的特徵是本領域技術人員所熟知的，並且多能幹細胞的其他特徵不斷地被鑑別。多能幹細胞標誌物包括(例如)如下標誌物中的一者或多者的表達：abcg2、cripto、foxd3、連接蛋白43、連接蛋白45、oct4、sox2、nanog、htert、utf-1、zfp42、ssea-3、ssea-4、tra1-60、tra1-81。在用本發明方法處理多能幹細胞後，可通過將處理過的細胞群體暴露於特異性識別由表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞表達的蛋白質標誌物(例如cxcr4)來進行純化。表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的檢測胰腺內胚層譜系特徵性標誌物是本領域技術人員所熟知的，並且其他胰腺內胚層譜系特徵性標誌物不斷被鑑別。這些標誌物可用於確定根據本發明處理過的細胞是否已分化而獲得胰腺內胚層譜系特徵性特性。胰腺內胚層譜系的特異性標誌物包括一種或多種轉錄因子，例如hlxb9、ptf-1a、pdx-1、hnf-6、hnf-1β的表達。可通過將處理過的細胞群體暴露於可特異性識別由表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞表達的蛋白質標誌物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用於評估蛋白質標誌物和核酸標誌物在培養的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些方法包括定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)、rna印記、原位雜交(參見例如，currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人(編輯)，2001增刊))以及免疫測定法(例如切片材料的免疫組織化學分析)、蛋白質印記以及針對完整細胞中可觸及的標誌物的流式細胞分析(facs)(參見例如，harlow和lane，usingantibodies：alaboratorymanual，newyork：coldspringharborlaboratorypress(1998))。可用於檢測某些蛋白質標誌物的抗體的例子在表ia中列出。應該指出的是，針對表ia所列抗體識別的相同標誌物的替代抗體是可獲得的，或可容易開發還可以採用這種替代抗體來評價根據本發明的分離細胞中標誌物的表達。表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞的檢測胰腺內分泌譜系特徵性標誌物是本領域技術人員所熟知的，並且其他胰腺內分泌譜系特徵性標誌物不斷被鑑別。這些標誌物可用於確定根據本發明處理過的細胞是否已分化而獲得胰腺內分泌譜系特徵性特性。胰腺內分泌譜系的特異性標誌物包括一種或多種轉錄因子，例如ngn-3、neurod、islet-1的表達。β細胞譜系特徵性標誌物是本領域技術人員熟知的，並且其他的β細胞譜系特徵性標誌物有待繼續辨別。這些標誌物可用於確定根據本發明處理過的細胞是否已分化而獲得β細胞譜系特徵性特性。β細胞譜系特異性特徵包括一種或多種轉錄因子例如pdx1(胰十二指腸同源盒基因-1)、nkx2.2、nkx6.1、isl1、pax6、pax4、neurod、hnf1b、hnf-6、hnf-3β和mafa等的表達。這些轉錄因子在內分泌細胞鑑別領域中已得到公認。參見例如edlund(naturereviewsgenetics3：524-632(2002))。可通過將處理過的細胞群體暴露於可特異性識別由表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞表達的蛋白質標誌物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。或者，可以通過將處理過的細胞群暴露於特別地識別以下蛋白質標誌物的試劑(例如抗體)來測定分化效率，該標誌物由表達β細胞譜系特徵性標誌物的細胞表達。用於評估蛋白質標誌物和核酸標誌物在培養的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些方法包括定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)、rna印記、原位雜交(參見例如，currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人(編輯)，2001增刊))以及免疫測定法(例如切片材料的免疫組織化學分析)、蛋白質印記以及針對完整細胞中可觸及的標誌物的流式細胞分析(facs)(參見例如，harlow和lane，usingantibodies：alaboratorymanual，newyork：coldspringharborlaboratorypress(1998))。可用於檢測某些蛋白質標誌物的抗體的例子在表ia中列出。應該指出的是，針對表ia所列抗體識別的相同標誌物的替代抗體是可獲得的，或可容易開發還可以採用這種替代抗體來評價根據本發明的分離細胞中標誌物的表達。本發明通過(但不限於)以下實例進一步說明。實例1人胚胎幹細胞培養物幹細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和末端分化細胞。幹細胞的特徵還在於：其具有在體外由多種胚層(內胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細胞譜系的功能細胞的能力以及移植後產生多種胚層的組織的能力和注射入胚泡後相當有助於大部分(如果不是所有的話)組織形成的能力。從wicellresearchinstitute，inc.，(madison，wi)獲得人胚胎幹細胞系h1、h7和h9，並根據該來源公司提供的說明進行培養。簡而言之，在es細胞培養基中，在小鼠胚胎成纖維細胞(mef)飼養層上培養細胞，所述培養基由補充有20％的knockout血清替代品、100nm的mem非必需胺基酸、0.5mm的β-巰基乙醇、2mm的l-穀氨醯胺和4ng/ml人鹼性成纖維細胞生長因子(bfgf)(全部得自invitrogen/gibco)的dmem/f12(invitrogen/gibco)組成。衍生自e13至13.5小鼠胚胎的mef細胞從charlesriver購得。將mef細胞在補充有10％fbs(hyclone)、2mm穀氨醯胺和100mmmem非必需胺基酸的dmem培養基中擴增。用10μg/ml絲裂黴素c(sigma(st.louis，mo))處理亞匯合態mef細胞培養物3小時，以阻止細胞分裂，然後用胰蛋白酶處理並以2×104/cm2的密度接種在用0.1％牛明膠塗布的培養皿上。將傳代兩次至四次的mef細胞用作飼養層。將鋪在mef細胞飼養層上的人胚胎幹細胞在增溼的組織培養箱中於37℃在含5％的co2的大氣中培養。當匯合時(接種後大約5-7天)，用1mg/mliv型膠原酶(invitrogen/gibco)處理人胚胎幹細胞5-10分鐘，然後用5ml吸管輕輕刮落。將細胞以900rpm離心5分鐘，然後將沉澱物以細胞在新鮮培養基中為1∶3至1∶4的比率重新懸浮，並再次接種。同時，將h1、h7和h9人胚胎幹細胞也接種於包被有低生長因子matrigeltm(bdbiosciences)的1∶30稀釋物的板上並在補充有8ng/ml的bfgfmef調理培養基中培養。將在matrigeltm上培養的細胞用膠原酶iv(invitrogen/gibco)、分散酶(bdbiosciences)或liberase酶(source)進行常規的傳代。將該人胚胎幹細胞培養中的一些在低氧條件(大約3％的o2)下孵育。實例2衍生自人胚胎幹細胞的可表達多潛能標誌物的細胞的衍生和培養將來自人胚胎幹細胞系h1和h9多個傳代(第30-54代)的細胞在低氧條件(大約3％的o2)下培養至少三代。根據實例1將細胞在補充有8ng/mlbfgf的mef-cm中培養並接種於包被有matrigel的板上。然後用補充有0.5％fbs、20ng/mlwnt-3a(目錄號1324-wn-002，r&dsystems，mn)和100ng/ml激活素-a(r&dsystems，mn)的dmem/f12培養基處理細胞兩天，然後用補充有2％fbs和100ng/ml激活素-a(aa)的dmem/f12培養基另外處理3至4天。該方案導致定形內胚層標誌物顯著上調。然後將細胞用trypletmexpress溶液(invitrogen，ca)處理5分鐘。將脫離的細胞再懸浮於dmem-f12+2％fbs培養基中，離心回收，並用血球計進行計數。將脫離的細胞以1000-10,000個細胞/cm2接種組織培養聚苯乙烯(tcps)處理過的培養瓶上並在標準組織培養箱中，於37℃在低氧條件(大約3％的o2)下在dmem-f12+2％fbs+100ng/ml激活素-a+20ng/mlwnt-3a中培養。該tcps培養瓶未用matrigel或其他細胞外基質蛋白包被。每日更換培養基。在某些培養物中，該培養基還補充有10-50ng/ml的igf-i(胰島素生長因子-i，購自r&dsystems，mn)或1xits(胰島素、轉鐵蛋白和硒，購自invitrogen，ca)。在某些培養條件下，基礎培養基(dm-f12+2％fbs)還補充有0.1mm的巰基乙醇(invitrogen，ca)和非必需胺基酸(1x，neaa，購自invitrogen，ca)。在培養5至15天後，明顯的細胞集落呈現出被大量擴大的細胞圍繞，這些擴大的細胞看起來處於衰老狀態。在大約50至60％匯合時，通過在室溫下暴露於trypletmexpress溶液5分鐘來使培養物傳代。將脫離的細胞再懸浮於dmem-f12+2％fbs培養基中，離心回收，在組織培養聚苯乙烯(tcps)處理過的培養瓶上以10,000個細胞/cm2接種於dmem-f12+2％fbs+100ng/ml激活素-a+20ng/mlwnt-3a+/-50ng/ml的igf-i中。該培養基將另外稱為「生長培養基」。實例3從人胚胎幹細胞的單細胞懸浮液衍生可表達多潛能標誌物的細胞將來自人胚胎幹細胞系h1第33代和h9第45代的細胞在低氧條件(大約3％的o2)下培養至少三代。根據實例1將細胞在補充有8ng/mlbfgf的mef-cm中培養並接種於包被有matrigel的板上。在大約60％匯合時，使培養物暴露於trypletmexpress溶液(invitrogen，ca)5分鐘。將脫離的細胞再懸浮於dmem-f12+2％fbs培養基中，離心回收，並用血球計進行計數。將脫離的細胞以1000至10,000個細胞/cm2接種於組織培養聚苯乙烯(tcps)處理過的培養瓶上並在標準組織培養箱中，於37℃在低氧條件(大約3％的o2)下在dm-f12+2％fbs+100ng/ml激活素-a+20ng/mlwnt-3a+50ng/ml的igf-i+0.1mm巰基乙醇(invitrogen，ca)和非必需胺基酸(1x，neaa，購自invitrogen，ca)中培養。該tcps培養瓶未用matrigel或其他細胞外基質蛋白包被。每日更換培養基。將第一代細胞稱為p1。實例4可用於衍生自人胚胎幹細胞的可表達多潛能標誌物的細胞的擴增的多種生長培養基已經在如下培養基組合物中成功培養衍生自人胚胎幹細胞的可表達多潛能標誌物的細胞至少2-30代：1.dm-f12+2％fbs+100ng/mlaa+20ng/mlwnt-3a2.dm-f12+2％fbs+100ng/mlaa+20ng/mlwnt-3a+50ng/mligf-i3.dm-f12+2％fbs+100ng/mlaa+20ng/mlwnt-3a+10ng/mligf-i4.dm-f12+2％fbs+50ng/mlaa+20ng/mlwnt-3a+50ng/mligf-i5.dm-f12+2％fbs+50ng/mlaa+10ng/mlwnt-3a+50ng/mligf-i6.dm-f12+2％fbs+50ng/mlaa+20ng/mlwnt-3a+10ng/mligf-i7.dm-f12+2％fbs+100ng/mlaa+10ng/mlwnt-3a+10ng/mligf-i8.hescgro確定培養基(chemicon，ca)上面列出的培養基的基礎組分可用類似的培養基例如rpmi、dmem、crml、knockouttmdmem和f12替代。實例4gsk-3β酶活性抑制劑對可表達多潛能標誌物的細胞的活力的作用可表達多潛能標誌物的細胞的衍生和維持按已在實例2中描述的進行。使細胞在補充有2％fcs(invitrogen)、100ng/ml激活素a、20ng/mlwnt-3a和50ng/mligf(r&dbiosystems)的dmem：f12中生長。將細胞以10,000個細胞/cm2的密度接種於falcon聚苯乙烯培養瓶上並在37℃、5％co2、低氧條件下以單層培養物培養。在達到60-70％匯合後，通過用pbs洗滌該單層並用tryple(invitrogen)孵育3-5分鐘使細胞脫離以及單個細胞散開而進行傳代。用來自專有小分子庫的測試化合物進行篩選，選擇它們抑制gsk-3b酶活性的能力。使來自該庫的化合物以96孔板的形式作為50mmhepes、30％dmso中的1mm母液供使用。對於測定法，將表達多潛能標誌物的細胞洗滌、計數並在底部透明、孔黑色的96孔板(costar)中以每孔20,000個細胞的接種密度接種於標準的培養基中。該接種密度此前確定可在過夜培養物中產生最佳的單層形成。第二天，移除培養基，用pbs衝洗細胞單層三次，將測試化合物以80μl等分試樣加至孔中，每份等分試樣被稀釋進測定培養基中至最終測試濃度為10μm。在測定的2天，從每孔移除培養基並用新鮮的稀釋進測定培養基中的測試化合物等分試樣替換。培養的第1和第2天的測定培養基由補充有0.5％fcs和100ng/ml激活素a的dmem：f12組成。在培養的第3和第4天，將培養基從每個孔移除並用補充有2％fcs和100ng/ml激活素a(無測試化合物)的dmem：f12替換。在測定的第4天，將15μl的mts(promega)加至每個孔，將板在37℃下孵育1.5至4小時，然後在spectramax(moleculardevices)儀器上於490nm處讀取光密度。對每個重複組(duplicateset)，計算由平均值、標準偏差和變異係數組成的統計學度量。對每個試驗孔，計算相對於陽性對照(在培養的第1和第2天用激活素a和wnt3a處理的孔)的毒性。表ii是所有篩選結果的彙編。表達多潛能標誌物的細胞在本測定法中最初作為匯合單層接種；因此，這些結果代表這四天培養期的毒性度量。結果以對照的活力百分數表示，證明了在所使用的10μm篩選濃度下一些化合物具有不同程度的毒性。在此基於細胞的測定法中更大比例的化合物具有極少的毒性或者沒有可測量的毒性。將一小批選定的化合物在窄的劑量滴定範圍內重複進行試驗，這同樣是使用表達多潛能標誌物的細胞按上述類似測定法進行。表iii是這些結果的匯總，顯示了一系列毒性和非毒性化合物的可變劑量滴定效應。實例5用高內涵篩選測定法測定的gsk-3β酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞的分化和增殖的作用人胚胎幹細胞(h9系)的維持按實例1中所述進行。將細胞集落維持在未分化、多潛能狀態，平均每四天傳代一次。傳代是這樣進行：使細胞培養物在37℃下暴露於膠原酶溶液(1mg/ml；sigma-aldrich)10至30分鐘，然後用移液管頭小心刮擦以回收細胞簇。讓細胞簇借重力沉澱下來，然後進行洗滌以除去殘餘的膠原酶。將細胞簇以1∶3的比例分傳以進行常規維持培養，或以1∶1比例分傳以立即進行測試。將所用的人胚胎幹細胞系以小於50代的傳代數目進行維持，並例行評估核型表型是否正常和支原體汙染是否存在。將本測定中所用的細胞簇均勻重懸於正常培養基中，並以100μl/孔的體積接種到matrigel包被的96孔packardviewplates(perkinelmer)上。補充有8ng/mlbfgf的mef調理培養基用於初始接種和回收。日常飼養是通過從每個孔抽吸掉廢培養基並用等體積的新鮮培養基替換來進行。在整個測試期間，將板在加溼箱中維持在37℃、5％co2下。用來自專有小分子庫的測試化合物進行篩選，選擇它們抑制gsk-3b酶活性的能力。使來自該庫的化合物以96孔板的形式作為50mmhepes、30％dmso中的1mm母液供使用。將篩選化合物以三次重複組或兩次重複組進行測試。如下開始初級篩選測定法：從每個孔抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清。回加80至100μl/孔的測試體積，其含有補充有0.5％fcs(hyclone)和100ng/ml激活素a(r&dbiosystems)及10μm測試化合物的dmem：f12基礎培養基(invitrogen)。陽性對照孔含有相同的基礎培養基，但用10-20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)替代測試化合物。陰性對照孔含有基礎培養基，同時含0.5％fcs和僅激活素a(僅aa)，或者含0.5％fcs但不含激活素a或wnt3a(無處理)。在測定的第2天，抽吸各孔並再供應相同的溶液。在第3和第4天，抽吸所有的測定孔並轉換成補充有2％fcs和100ng/ml激活素a(無測試化合物或wnt3a)的dmem：f12；平行的陰性對照孔孔則維持在dmem：f12基礎培養基加上2％fcs和激活素a(僅僅aa)或者2％fcs但不加激活素a(無處理)。在培養結束時，將96孔板中的細胞用4％多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，用pbs洗滌三次，然後用0.5％tritonx-100在室溫下透化處理20分鐘。或者，將細胞用冰冷的70％乙醇在-20℃下固定過夜，用pbs洗滌三次，然後用tritonx-100在4℃下透化處理5分鐘。在固定和透化處理後，將細胞再用pbs洗滌三次，然後用pbs中的4％雞血清(invitrogen)在室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人sox17和山羊抗人hnf-3β；r&dsystems)在4％雞血清中1∶100稀釋，在室溫下加至細胞中保持一小時。將alexafluor488綴合的二抗(雞抗山羊igg；molecularprobes)在pbs中1∶200稀釋，並在用pbs洗滌細胞三次後加入。為對細胞核進行復染，在室溫下加入5mmdraq5(alexisbiochemicals)保持五分鐘。將細胞用pbs洗滌一次，並保留在100ml/孔pbs中以用於成像。用incellanalyzer1000細胞分析儀(gehealthcare)對細胞進行成像，對於用draq5和alexafluor488染色的細胞採用51008bs二向分色鏡。用陽性對照孔和只用二抗染色作為無處理陰性對照的孔來優化曝光時間。每孔獲取12個視野，以補償處理和染色程序中的任何細胞損失。用incelldevelopertoolbox1.6(gehealthcare)軟體測量sox-17和hnf-3β的總細胞數目和總細胞密度。基於灰階水平(基線範圍100-300)和核大小確定細胞核的分裂情況。計算三次重複測試的平均值和標準偏差。總蛋白質表達以總強度或積分強度報告，該強度定義為細胞總螢光乘以細胞面積。基於灰階範圍在300至3000之間且形狀係數大於或等於0.4的接受標準來去除背景。通過將每個孔的總強度除以wnt3a/激活素a陽性對照的平均總強度，將總強度數據進行歸一化。對於每個重複組，對歸一化的數據計算平均值和標準偏差。表iv是所有篩選結果的代表性匯總。表v得自該篩選的命中化合物的列表。強命中化合物定義為大於或等於對照值的120％；中等命中化合物定義為落入對照值的60-120％的範圍內。大量的化合物在本測定中能引起增殖響應。同時，大量的化合物在本測定中能引起分化，這由sox17和hnf-3b轉錄因子的蛋白質表達測量。實例6用讀板儀測定法測定的gsk-3β酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞的增殖的作用人胚胎幹細胞(h9或h1系)的維持按實例1中所述進行。將細胞集落維持在未分化、多潛能狀態，平均每四天傳代一次。傳代是這樣進行的：使細胞培養物在37℃下暴露於膠原酶溶液(1mg/ml；sigma-aldrich)10至30分鐘，然後用移液管頭小心刮擦以回收細胞簇。讓細胞簇沉澱下來，洗滌以除去殘餘的膠原酶。將細胞簇以1∶3單層面積的比例分傳以進行常規培養，或者以1∶1比例分傳以立即進行測試。將用於這些實例的人胚胎幹細胞系以小於50的傳代數目進行維持，並例行評估核型表型是否正常和支原體汙染是否存在。將測試中所用的細胞簇均勻重懸於正常培養基中，並以100μl/孔的體積接種到matrigel包被的96孔packardviewplates(perkinelmer)上。補充有8ng/mlbfgf的mef調理培養基用於初始接種和回收。日常飼養是通過從每個孔抽吸掉廢培養基並用等體積的新鮮培養基替換來進行。在整個測試期間，將板在加溼箱中維持在37℃、5％co2下。如下開始初級篩選測定法：從每個孔抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清。回加80-100μl/孔的測試體積，其含有補充有0.5％fcs(hyclone)和100ng/ml激活素a(r&dbiosystems)及10μm測試化合物的dmem：f12基礎培養基(invitrogen)。陽性對照孔含有相同的培養基，但用10-20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)替代測試化合物。陰性對照孔含有基礎培養基加上0.5％fcs，但無激活素a或wnt3a。將篩選化合物重複測試三次。在測定的第2天，抽吸各孔並再供應相同的溶液。在第3和第4天，抽吸所有的測定孔並轉成補充有2％fcs和100ng/ml激活素a的dmem：f12，但陰性對照孔例外，其維持在含2％fcs的dmem：f12基礎培養基中。在測定的第4天，將15-20μl的mts(promega)加至每個孔，將板在37℃下孵育1.5至4小時。用moleculardevices公司的分光光度讀板儀於od490處測定密度讀數。計算各重複組的平均讀數以及標準偏差和變異係數。將實驗孔與激活素a/wnt3a陽性對照進行比較以計算對照值百分數，作為增殖的度量。表vi是所有篩選結果的代表性匯總。表vii是得自該篩選的命中化合物的列表。強命中化合物定義為大於或等於對照值的120％；中等命中化合物定義為落入對照值的60-120％的範圍內。大量的化合物在本測定中能引起增殖響應。實例7gsk-3β酶抑制劑對人胚胎幹細胞的分化和增殖的作用：先導化合物的劑量滴定確認從初級篩選鑑定到的命中化合物的活性並通過劑量滴定進一步分析活性範圍，這是重要的。獲得選擇的初級篩選命中化合物亞組的新樣品乾粉，將其增溶以製備新鮮儲備試劑，並稀釋到二級確認測定中以評估對人胚胎幹細胞的作用。兩種人胚胎幹細胞(h1和h9)按實例1中所述進行。將細菌集落在matrigeltm(invitrogen)包被的聚苯乙烯塑料(用matrigeltm於dmem：f12中的1∶30稀釋液包被表面)上維持在未分化、多潛能狀態。細胞平均每四天通過酶促傳代進行分傳。傳代是這樣進行的：使細胞單層在37℃下暴露於膠原酶溶液(1mg/ml；sigma-aldrich)10至60分鐘，然後用移液管頭小心刮擦以回收細胞簇。讓細胞簇借重力沉澱下來，然後進行洗滌以除去殘餘的膠原酶。將細胞簇以1∶3比例分傳以進行維持培養，或者以1∶1比例分傳以隨後進行測試。將人胚胎幹細胞系以小於50代進行維持，並例行評估核型表型是否正常和支原體汙染是否存在。測定用細胞的製備：將用於本測試的h1或h9人胚胎幹細胞系的細胞簇均勻重懸於培養基中，並以100μl/孔的體積接種到matrigeltm包被的96孔packardviewplates(perkinelmer)上。補充有8ng/mlbfgf的mef調理培養基用於初始接種和增殖。日常飼養是通過從每個孔抽吸掉廢培養基並用等體積的新鮮培養基替換來進行。在接種後讓培養物增殖一至三天，然後再開始測試。在整個測試期間，將板在加溼箱中維持在37℃、5％co2下。化合物和測定培養基的製備：將從初級篩選得到的命中化合物亞組用於後續研究和隨後的二級測定法。將二十個作為乾粉可利用的化合物在dmso中增溶成10mm原液，並在-20℃下乾燥保藏備用。在臨測定前，將化合物原液在補充有0.5％fcs(hyclone)和100ng/ml激活素a(r&dbiosystems)的dmem：f12基礎培養基(invitrogen)中進行1∶1000稀釋以製備10μm測試化合物。將此稀釋液同樣在補充有0.5％fcs(hyclone)和100ng/ml激活素a的dmem：f12基礎培養基中進一步進行系列兩倍稀釋，以給每種化合物製作七點稀釋曲線。二級篩選測定法：如下開始測試：從每個孔中的細胞單層抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清。回加100μl/孔的測試體積，其含有培養基加上0.5％fcs和不同濃度的抑制劑化合物加上100ng/ml激活素a，無wnt3a。陽性對照孔含有相同的基礎培養基加上0.5％fcs和加上20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)，無測試化合物。陰性對照孔含有相同的基礎培養基加上0.5％fcs，無激活素a、wnt3a或測試化合物。在測定的第2天，將測定孔抽吸，並再次供應相同濃度的測試化合物或對照溶液。在第3和第4天，將所有的測定孔抽吸並供應補充有2％fcs和100ng/ml激活素a但無測試化合物或wnt3a的dmem：f12。在第3和第4天，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs的dmem：f12基礎培養基中。測定評估：在培養結束時，將96孔板中的細胞用pbs洗滌兩次，然後用4％多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，用pbs再洗滌三次，然後用0.5％tritonx-100在室溫下透化處理20分鐘。在固定和透化處理後，將細胞再用pbs洗滌三次，然後用pbs中的4％雞血清(invitrogen)在室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人sox17；r&dsystems)在4％雞血清中1∶100稀釋，在室溫下加至細胞中保持一小時。將alexafluor488綴合的二抗(雞抗山羊igg；molecularprobes)在pbs中1∶200稀釋，並在用pbs洗滌細胞三次後加至每個孔。為對細胞核進行復染，在室溫下加入2μg/mlhoechst33342(invitrogen)保持十分鐘。將細胞用pbs洗滌一次，並保留在100μl/孔pbs中以進行成像。用incellanalyzer1000細胞分析儀(gehealthcare)對細胞進行成像，對於用hoechst33342和alexafluor488染色的細胞採用51008bs二向分色鏡。用陽性對照孔和只用二抗染色作為無處理陰性對照的孔來優化曝光時間。每孔獲取15個視野的圖像，以補償處理和染色程序中的任何細胞損失。用incelldevelopertoolbox1.7(gehealthcare)軟體獲得每個孔的總細胞數目和總sox-17密度的測量值。基於灰階水平(基線範圍100-300)和核大小確定細胞核的分裂情況。計算每個重複數據集的平均值和標準偏差。總sox17蛋白質表達以總強度或積分強度報告，該強度定義為細胞總螢光乘以細胞面積。基於灰階範圍在300至3000之間且形狀係數大於或等於0.4的接受標準來去除背景。通過將每個孔的總強度除以wnt3a/激活素a陽性對照的平均總強度，將總強度數據進行歸一化。對於每個重複組，對歸一化的數據計算平均值和標準偏差。結果顯示了八種gsk-3b酶抑制劑的結果，其中活性得到確認，效價通過本二級測定法中的滴定來確定。所給出的數據顯示了化合物對細胞數目和sox17強度的作用，其中各個數據點是從重複組取平均值，並據以挖掘來自相同視野和孔的每個參數。在本實例中，sox17表達指示定形內胚層分化。用h1人胚胎幹細胞系取得的細胞數目和sox17強度的結果分別在表viii和表ix中顯示。h9人胚胎幹細胞系的結果在表x和表xi中顯示。將細胞數目和sox17強度的陽性對照值歸一化為1.000。兩種細胞系的細胞數目陰性對照值均小於0.388，sox17強度陰性對照值均小於0.065。在圖1至8中提供了這些數據的圖示，比較了兩種人胚胎幹細胞系，並包括每種化合物的劑量滴定。細胞數目在分圖a中顯示；sox17強度在分圖b中顯示。這些數據確認每種化合物都能促進hes細胞增殖和定形內胚層分化，並確定出最佳活性範圍。實例8gsk-3β酶抑制劑對與定形內胚層相關的另外標誌物的表達的作用證明除了轉錄因子sox17之外先導化合物還能誘導其他指示定形內胚層分化的標誌物，這是重要的。對選定的命中化合物亞組測試它們促進cxcr4(一種表面受體蛋白)和hnf-3β(一種同樣與定形內胚層分化相關的轉錄因子)的表達的能力。測定用細胞的製備：將用於本測定的h1人胚胎幹細胞系的細胞簇均勻重懸於培養基中，並以2ml/孔的體積接種到matrigeltm包被(1∶30稀釋)的6孔板(coming)上。補充有8ng/mlbfgf的mef調理培養基用於初始接種和增殖。日常飼養是通過從每個孔抽吸掉廢培養基並用等體積的新鮮培養基替換來進行。在接種後讓培養物增殖一至三天，然後再開始測試。在測試期間，將板維持在37℃、5％co2下。化合物和測定培養基的製備：將從初級篩選得到的七個命中化合物亞組用於後續研究和隨後的二級測定法。將純化合物在dmso中增溶成10mm原液，並在-20℃下乾燥保藏備用。在臨測試前，將化合物原液在補充有0.5％fcs(hyclone)和100ng/ml激活素a(r&dbiosystems)的dmem：f12基礎培養基(invitrogen)中稀釋至在1μm至5μm之間的終濃度。測試：如下開始測試：從每個孔中的細胞單層抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清。回加2ml/孔的測試體積，其含有培養基加上0.5％fcs和不同濃度的抑制劑化合物加上100ng/ml激活素a，無wnt3a。陽性對照孔含有相同的基礎培養基和0.5％fcs加上100ng/ml激活素a和20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)，無測試化合物。陰性對照孔含有基礎培養基加上0.5％fcs，無激活素a、wnt3a或測試化合物。在測定的第2天，將測定孔抽吸，並再次供應相同濃度的測試化合物或對照溶液。在第3和第4天，將所有的測定孔抽吸並供應補充有2％fcs和100ng/ml激活素a但無測試化合物或wnt3a的dmem：f12。在第3和第4天，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs的dmem：f12基礎培養基中。測定評估：在培養結束時，將細胞單層用pbs洗滌，並通過與trypletmexpress溶液(invitrogen，ca)一起孵育5分鐘從培養板收穫。將細胞重懸於mef調理培養基中，分成兩等份樣品。一組樣品進一步用各種螢光標記抗體染色，並進行流式細胞術(facs)分析。另一平行組樣品進行定量pcr。將用於facs分析的細胞洗滌到pbs中，在稀釋於pbs和bdfacs染色緩衝液中的0.125％人γ-球蛋白(sigma目錄號為g-4386)中於4℃封閉15分鐘。用直接綴合到螢光標記且對cd9pe(bd#555372)、cd99pe(caltag#mhcd9904)或cxcr-4apc(r&dsystems目錄號為fab173a)有特異性的抗體，將細胞的等分試樣(各自大約為105個細胞)在4℃下染色30分鐘。在bdfacs染色緩衝液中進行一系列洗滌後，將細胞用7-aad(bd#559925)染色以評估活力，並在bdfacsarray儀器(bdbiosciences)上進行分析，收集至少10,000個事件。用針對pe和apc兩者的小鼠igg1k同種型對照抗體來測量(gate)陽性細胞百分數。將用於定量pcr的細胞進行處理，以供rna提取、純化和cdna合成。rna樣品通過在含乙醇的高鹽緩衝液存在下結合到矽膠膜(rneasyminikit，qiagen，ca)然後洗滌除去汙染物來進行純化。用turbo無dna試劑盒(ambion，inc.)進一步純化rna，將高質量的rna在水中洗脫。通過在分光光度計上讀取a260和a280讀數來評估產率和純度。用appliedbiosystems，inc.(abi，ca)大容量cdna庫試劑盒，從純化的rna製備cdna拷貝。除非另有規定，否則實時pcr擴增和定量用的所有試劑均購自abi。實時pcr反應用abiprism7900序列檢測系統進行。將taqman通用pcr主混合物(abi，ca)與20ng的反轉錄rna一起用於20μl的總反應體積中。每種cdna樣品重複運行兩次以校正吸量誤差。引物和fam標記的taqman探針以200nm的濃度使用。用abi之前開發的人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)內源對照品，將每種靶標基因的表達水平進行歸一化。引物和探針組列出如下：cxcr4(hs00237052)、gapdh(4310884e)、hnf3b(hs00232764)、sox17(探針部分#450025，正向和反向部分#4304971)。在50℃下初始孵育2分鐘然後95℃下孵育10分鐘後，將樣品進行40次的兩階段循環：變性步驟，95℃15秒，隨後的退火/延伸步驟，60℃1分鐘。數據分析用geneamp7000序列檢測系統的軟體進行。對於每個引物/探針組，ct值確定為螢光強度達到擴增指數區中部中的特定值時的循環數。用比較性ct方法來計算相對基因表達水平。簡而言之，對於每個cdna樣品，從所關注基因ct減去內源對照ct值，以得到δct值(δct)。假定擴增效率為100％，將靶標的歸一化含量計算為2-δct。最終的數據是相對於校準樣品表示的。結果圖9顯示了在用各種gsk3抑制劑處理後，表達cxcr4表面受體的陽性細胞百分數的facs分析。相對於無處理的細胞群體(陰性對照)或用激活素a和wnt3處理的細胞(陽性對照)，顯示了每個化合物的在1μm和5μm之間的兩個濃度。圖10的分圖a、b和c顯示了cxcr4、sox17和hnf3β(它們也被認為是定形內胚層的標誌物)的實時pcr數據。acs和實時pcr分析都證明，相對於無處理的對照細胞，在分化的細胞中觀察到這些標誌物的每一種都顯著增加。這些定形內胚層標誌物的表達水平在一些情況中與陽性對照相當，這表明gsk3抑制劑在這個分化階段可代替wnt3a。實例9gsk-3β酶抑制劑對胰腺內胚層的形成的作用證明在定形內胚層誘導過程中用gsk3β抑制劑處理不會妨礙其他細胞類型(例如胰腺內胚層)隨後的分化，這是重要的。對選擇的命中化合物亞組測試它們促進pdx1和hnf6(與胰腺內胚層相關的關鍵轉錄因子)的表達的能力。人胚胎幹細胞(h1和h9系)的維持按實例1中所述進行。將細胞集落維持在未分化、多潛能狀態，平均每四天傳代一次。傳代是這樣進行的：使細胞培養物在37℃下暴露於膠原酶溶液(1mg/ml；sigma-aldrich)10至30分鐘，然後用移液管頭小心刮擦以回收細胞簇。讓細胞簇借重力沉澱下來，然後進行洗滌以除去殘餘的膠原酶。將細胞簇以1∶3比例分傳以進行例行維持培養，或者以1∶1比例分傳以隨後進行測試。將所用的人胚胎幹細胞系以小於50代進行維持，並例行評估核型表型是否正常和支原體汙染是否存在。測定用細胞的製備：將本測試中所用的h1人胚胎幹細胞系的細胞簇均勻重懸於培養基中，並以1ml/孔的體積接種到matrigeltm包被(1∶30稀釋)的24孔板(黑孔；arcticwhite公司)上。補充有8ng/mlbfgf的mef調理培養基用於初始接種和增殖。在第二個實驗，將來自h9系的hes細胞簇接種在96孔板中小鼠胚胎飼養(mef)層上，所述層之前通過用絲裂黴素c(sigmachemicalco)處理使其失活。mef單層上hes細胞的培養基組成為：dmem：f12，含20％knockout血清替代品(invitrogen)，補充有極限必需胺基酸(invitrogen)、l-穀氨醯胺和2-巰基乙醇。日常飼養是通過從每個孔抽吸掉廢培養基並用等體積的新鮮培養基替換來進行。在接種後讓培養物增殖一至三天，然後再開始測試。在測試期間，將板維持在37℃、5％co2下。化合物和測定培養基的製備：將從初級篩選得到的八種命中化合物亞組用於後續研究和隨後的二級測定法。將純化合物在dmso中增溶成10mm原液，並在-20℃下乾燥保藏備用。在臨測試前，將化合物原液在含添加物的基礎培養基中稀釋至在1μm至5μm之間的最終濃度。測定法：在本測定法中，僅在定形內胚層分化步驟的第1和第2天包括gsk3抑制劑，取代wnt3a。如以上實例7和實例8中所述，通過從每個孔中的細胞單層抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清，來開始matrigeltm上的胚胎幹細胞培養。為分化成定形內胚層，加入測試體積(對於24孔板為0.5ml/孔，對於96孔板為100μl/孔)，其含有dmem：f12培養基加上0.5％fcs和不同濃度的抑制劑化合物加上100ng/ml激活素a，無wnt3a。陽性對照孔含有相同的基礎培養基加上0.5％fcs和加上100ng/ml激活素a和20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)，無測試化合物。陰性對照孔含有相同的基礎培養基加上0.5％fcs，無激活素a、wnt3a或測試化合物。在測定的第2天，將測定孔抽吸，並再次供應相同濃度的測試化合物或對照溶液。在第3和第4天，將所有的測定孔抽吸並供應補充有2％fcs和100ng/ml激活素a但無測試化合物或wnt3a的dmem：f12。在第3和第4天，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs的dmem：f12基礎培養基中。為分化成胰腺內胚層，將細胞處理三天，每日供應含有2％fcs加上0.25μmkaad環巴胺(emdbiosciences)和20ng/mlfgf7(r&dbiosystems)的dmem：f12基礎培養基。然後將細胞再處理四天，每日供應含有1％b27(invitrogen)、0.25μmkaad環巴胺、2μm視黃酸(ra；sigma-aldrich)和20ng/mlfgf7的dmem：f12。平行的陰性對照孔自始至終維持在補充有2％fcs(階段2)或1％b27(階段3)但無任何其他添加物的dmem：f12基礎培養基中。使h9人胚胎細胞的平行培養物在mef飼養層上生長並分化成胰腺內胚層。將細胞在如下培養基中進行培養來實現定形內胚層分化，所述培養基的組成為：rpmi-1640(invitrogen)，在第1天不含血清，在第2和第3天含0.2％fcs，加上不同濃度的抑制劑化合物和100ng/ml激活素a。陽性對照孔含有相同的基礎培養基(加入或不加入血清)加上100ng/ml激活素a和20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)，無測試化合物。陰性對照孔含有相同的基礎培養基(加入或不加入血清)，無激活素a、wnt3a或測試化合物。在測定的第2天，將測定孔抽吸，並再次供應相同濃度的測試化合物或對照溶液。在第3天，將所有的測定孔抽吸並供應補充有2％fcs和100ng/ml激活素a但無測試化合物和wnt3a的rpmi-1640。在第3天，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs的rpmi-1640基礎培養基中。通過將細胞處理四天，每日供應含有2％fcs加上0.25mmkaad環巴胺(emdbiosciences)和50ng/mlfgf10(r&dbiosystems)的rpmi-1640基礎培養基，使細胞分化成胰腺內胚層。隨後，將細胞處理三天時間，每日供應含有1％b27(invitrogen)、0.25mmkaad環巴胺、2mm視黃酸(ra；sigma-aldrich)和50ng/mlfgf10的rpmi-1640。平行的陰性對照孔自始至終維持在補充有2％fcs(階段2)或1％b27(階段3)但無任何其他添加物的rpmi-1640基礎培養基中。測定評估：在分化結束時，如實例8中所述通過實時pcr檢查細胞的基因表達。對於高含量螢光染色，將96孔板中的細胞用pbs洗滌兩次，然後用4％多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，再用pbs洗滌三次，然後用0.5％tritonx-100在室溫下透化處理20分鐘。在固定和透化處理後，將細胞再用pbs洗滌三次，然後用pbs中的4％雞血清(invitrogen)在室溫下封閉30分鐘。將一抗(山羊抗人pdx1；santacruz)在4％雞血清中1∶100稀釋，在室溫下加到細胞中保持兩小時。將alexafluor488綴合的二抗(雞抗山羊igg；molecularprobes)在pbs中1∶200稀釋，並在用pbs洗滌細胞三次後加至每個孔。為對細胞核進行復染，在室溫下加入2μg/mlhoechst33342(invitrogen)保持十分鐘。將細胞用pbs洗滌一次，並保留在100μl/孔pbs中以進行成像。用incellanalyzer1000細胞分析儀(gehealthcare)對細胞進行成像，對於用hoechst33342和alexafluor488染色的細胞採用51008bs二向分色鏡。用陽性對照孔和只用二抗染色的孔來優化曝光時間。每孔獲取15個視野的圖像，以補償處理和染色程序中的任何細胞損失。用incelldevelopertoolbox1.7(gehealthcare)軟體獲得每個孔的總細胞數目和總pdx1強度的測量值。基於灰階水平(基線範圍100-300)和核大小確定細胞核的分裂情況。計算每個重複數據集的平均值和標準偏差。總pdx1蛋白質表達以總強度或積分強度報告，該強度定義為細胞總螢光乘以細胞面積。基於灰階範圍在300至3000之間的接受標準來去除背景。通過將每個孔的總強度除以wnt3a/激活素a陽性對照的平均總強度，將總強度數據進行歸一化。對於每個重複組，對歸一化的數據計算平均值和標準偏差。將用於定量pcr的細胞在rlt緩衝液(qiagen)中裂解，然後進行處理以供rna提取、純化和cdna合成。rna樣品通過在含乙醇的高鹽緩衝液存在下結合到矽膠膜(rneasyminikit，qiagen，ca)然後洗滌除去汙染物來進行純化。用turbo無dna試劑盒(ambion，inc.)進一步純化rna，將高質量的rna在水中洗脫。通過在分光光度計上讀取a260和a280讀數來評估產率和純度。用appliedbiosystems，inc.(abi，ca)大容量cdna庫試劑盒，從純化的rna製備cdna拷貝。除非另有規定，否則實時pcr擴增和定量用的所有試劑均購自abi。實時pcr反應用abiprism7900序列檢測系統進行。將taqman通用pcr主混合物與20ng的反轉錄rna一起用於20μl的總反應體積中。每種cdna樣品重複運行兩次以校正吸量誤差。引物和fam標記的taqman探針以200nm的濃度使用。用abi之前開發的人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)內源對照品，將每種靶標基因的表達水平進行歸一化。引物和探針組列出如下：pdx1(hs00236830_m1)、gapdh(4310884e)和hnf6(hs00413554_m1)。在50℃下初始孵育2分鐘然後95℃下孵育10分鐘後，將樣品進行40次的兩階段循環：變性步驟，95℃15秒，隨後的退火/延伸步驟，60℃1分鐘。數據分析用7000序列檢測系統的軟體進行。對於每個引物/探針組，ct值確定為螢光強度達到擴增指數區中部中的特定值時的循環數。用比較性ct方法來計算相對基因表達水平。簡而言之，對於每個cdna樣品，從所關注基因ct減去內源對照ct值，以得到δct值(δct)。假定擴增效率為100％，將靶標的歸一化含量計算為2-δct。最終的數據是相對於校準樣品表示的。結果顯示了八種gsk-3β酶抑制劑的結果。圖11中給出的來自高內涵分析的數據顯示了對h1hes細胞系的細胞數目(分圖a)和pdx1強度(分圖b)的作用，其中各個數據點是從重複樣品組取平均值，並據以挖掘來自相同視野和孔的每個參數。圖12給出的來自實時pcr的數據顯示了這些小分子抑制劑對兩種轉錄因子pdx1和hnf6的誘導表達的作用。在這些實例中，pdx1和hnf6表達指示胰腺內胚層分化。gsk3β抑制劑化合物在這些測試中在細胞譜系定向的早期階段中可替代wnt3a；所得的細胞保持了在分化的隨後各相續階段中形成胰腺內胚層的能力。實例10gsk-3β酶抑制劑對胰腺內分泌細胞的形成的作用證明在定形內胚層誘導過程中用gsk3抑制劑處理不會妨礙其他細胞類型(例如胰腺內分泌細胞或產胰島素細胞)隨後的分化，這是重要的。對選定的命中化合物亞組測試了它們促進胰激素的表達的能力。測定用細胞的製備：使按照實例9中所述的方法獲得的胰腺內胚層細胞(在96孔板和24孔板上培養)隨後暴露於會造成這些細胞分化成表達胰激素的細胞的物質。如以上實例7-9中所述，通過從每個孔中的細胞單層抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清，來開始matrigeltm上的h1人胚胎幹細胞系培養物的測定。為分化成定形內胚層，加入測試體積(對於24孔板為0.5ml/孔，對於96孔板為100μl/孔)，其含有培養基加上0.5％fcs和不同濃度的抑制劑化合物加上100ng/ml激活素a，無wnt3a。陽性對照孔含有相同的基礎培養基和0.5％fcs加上100ng/ml激活素a和20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)，無測試化合物。陰性對照孔含有相同的基礎培養基加上0.5％fcs，無激活素a、wnt3a或測試化合物。在測定的第2天，將測定孔抽吸，並再次供應相同濃度的測試化合物或對照溶液。在第3、第4和第5天，將所有的測定孔抽吸並供應補充有2％fcs和100ng/ml激活素a但無測試化合物或wnt3a的dmem：f12。在第3、第4和第5天，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs的dmem：f12基礎培養基中。為分化成胰腺內胚層，將細胞處理三天，每日供應含有2％fcs加上0.25μmkaad環巴胺(emdbiosciences)和20ng/mlfgf7(r&dbiosystems)的dmem：f12基礎培養基。隨後將細胞處理四天，每日供應含有1％b27(invitrogen)、0.25μmkaad環巴胺、2μm視黃酸(ra；sigma-aldrich)和20ng/mlfgf7的dmem：f12。在階段2和階段3期間，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs或1％b27但無任何其他添加物的dmem：f12基礎培養基中。在胰腺內胚層形成後，再將細胞處理六天時間，每日供應含有1％b27加上1μmdapt(γ分泌酶抑制劑：emdbiosciences)和50ng/ml毒蜥外泌肽4(sigma-aldrich)的dmem：f12基礎培養基。然後將細胞再處理三天時間，每日供應含有1％b27、50ng/ml毒蜥外泌肽4、50ng/mligf(r&dbiosystems)和50ng/mlhgf(r&dbiosystems)的dmem：f12基礎培養基。平行的陰性對照孔自始至終維持在補充有1％b27但無任何其他添加物的dmem：f12基礎培養基中。測定評估：在培養結束時，如以上實例7和實例8中對細胞進行處理，以通過高內涵分析或實時pcr進行評估。對於高含量螢光染色，將96孔板中的細胞用pbs洗滌兩次，然後用4％多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，再用pbs洗滌三次，然後用0.5％tritonx-100在室溫下透化處理20分鐘。在固定和透化處理後，將細胞再用pbs洗滌三次，然後用pbs中的4％雞血清(invitrogen)在室溫下封閉30分鐘。將一抗(豚鼠抗豬胰島素，可與人胰島素交叉反應；dakocytomation)在4％山羊血清中1∶500稀釋，然後在室溫下加到細胞中保持一小時。將細胞用pbs洗滌三次，然後用在4％山羊血清中1∶100稀釋的alexafluor488綴合的二抗(山羊抗豚鼠igg；molecularprobes)染色。為對細胞核進行復染，在室溫下加入2μg/mlhoechst33342(invitrogen)保持十分鐘。將細胞用pbs洗滌一次，並保留在100μl/孔pbs中以進行成像。用incellanalyzer1000細胞分析儀(gehealthcare)對細胞進行成像，對於用hoechst33342和alexafluor488染色的細胞採用51008bs二向分色鏡。用陽性對照孔和只用二抗染色的孔來優化曝光時間。每孔獲取15個視野的圖像，以補償處理和染色程序中的任何細胞損失。用incelldevelopertoolbox1.7(gehealthcare)軟體獲得每個孔的總細胞數目和總胰島素強度的測量值。基於灰階水平(基線範圍100-300)和核大小確定細胞核的分裂情況。計算每個重複數據集的平均值和標準偏差。總胰島素蛋白質表達以總強度或積分強度報告，該強度定義為細胞總螢光乘以細胞面積。基於灰階範圍在300至3000之間的接受標準來去除背景。通過將每個孔的總強度除以wnt3a/激活素a陽性對照的平均總強度，將總強度數據進行歸一化。對於每個三次重複組，對歸一化的數據計算平均值和標準偏差。將用於定量pcr的細胞在rlt緩衝液(qiagen)中裂解，然後進行處理以供rna提取、純化和cdna合成。rna樣品通過在含乙醇的高鹽緩衝液存在下結合到矽膠膜(rneasyminikit，qiagen，ca)然後洗滌除去汙染物來進行純化。用turbo無dna試劑盒(ambion，inc.)進一步純化rna，將高質量的rna在水中洗脫。通過在分光光度計上讀取a260和a280讀數來評估產率和純度。用appliedbiosystems，inc.(abi，ca)大容量cdna庫試劑盒，從純化的rna製備cdna拷貝。除非另有規定，否則實時pcr擴增和定量用的所有試劑均購自abi。實時pcr反應用abi7900序列檢測系統進行。將通用(abi，ca)與20ng的反轉錄rna一起用於20μl的總反應體積中。每種cdna樣品重複運行兩次以校正吸量誤差。引物和fam標記的探針以200nm的濃度使用。用abi之前開發的人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)內源對照品，將每種靶標基因的表達水平進行歸一化。引物和探針組列出如下：pdx1(hs00236830_m1)、胰島素(hs00355773)和gapdh(4310884e)。在50℃下初始孵育2分鐘然後95℃下孵育10分鐘後，將樣品進行40次的兩階段循環：變性步驟，95℃15秒，隨後的退火/延伸步驟，60℃1分鐘。數據分析用7000序列檢測系統的軟體進行。對於每個引物/探針組，ct值確定為螢光強度達到擴增指數區中部中的特定值時的循環數。使用比較性ct法計算相對基因表達水平。簡而言之，對於每個cdna樣品，從目的基因的ct值減去內源對照的ct值，以得到δct值(δct)。假定擴增效率為100％，將靶標的歸一化含量計算為2-δct。最終的數據是相對於校準樣品表示的。結果顯示了八種gsk-3b酶抑制劑的結果。圖13中給出的來自高內涵分析的數據顯示了化合物對h1hes細胞系的細胞數目(分圖a)和胰島素強度(分圖b)的作用，其中各個數據點是從三次重複組取平均值，並據以挖掘來自相同視野和孔的每個參數。圖14中給出的來自實時pcr的數據顯示了化合物對pdx1的胰島素的作用。在這些實例中，pdx1和胰島素表達指示胰腺內胚層的分化和激素陽性細胞的產生。選擇性gsk3β抑制劑化合物在這些測試中在細胞譜系定向的早期階段中能代替wnt3a，且在分化的隨後各相續階段中能誘導和維持胰島β細胞形成，這由胰島素免疫染色和實時pcr兩者明顯看出。實例11gsk-3β酶抑制劑對胰腺內分泌細胞的形成的累加效果證明gsk3β抑制劑如果在細胞命運定向的多個時期中加入的話，抑制劑所進行的處理能改進胰島β細胞分化，這是重要的。將選定的命中化合物亞組通過相續定時加入以提高與胰腺激素陽性細胞相關的胰島素表達來進行測試。測定用細胞的製備：用於測定法的細胞製備物：使按照實例9和實例10中所述的方法獲得的胰腺內胚層細胞(在96孔板上培養)隨後暴露於會造成這些細胞分化成表達胰激素的細胞的物質。如以上實例7-9中所述，通過從每個孔中的細胞單層抽吸掉培養基，然後在pbs中洗滌三次以除去殘餘的生長因子和血清，來開始matrigeltm上的h1人胚胎幹細胞系培養物的測定。為分化成定形內胚層，加入測試體積(對於96孔板為100μl/孔)，其含有培養基加上0.5％fcs和不同濃度的抑制劑化合物加上100ng/ml激活素a，無wnt3a。陽性對照孔含有相同的基礎培養基和0.5％fcs加上100ng/ml激活素a和20ng/mlwnt3a(r&dbiosystems)，無測試化合物。陰性對照孔含有相同的基礎培養基加上0.5％fcs，無激活素a、wnt3a或測試化合物。在測定的第2天，將測定孔抽吸，並再次供應相同濃度的測試化合物或對照溶液。在第3、第4和第5天，將所有的測定孔抽吸並供應補充有2％fcs和100ng/ml激活素a但無測試化合物或wnt3a的dmem：f12。在第3、第4和第5天，將平行的陰性對照孔維持在補充有2％fcs的dmem：f12基礎培養基中。為分化成胰腺內胚層，將細胞處理三天，每日供應含有2％fcs加上0.25μmkaad環巴胺(emdbiosciences)和20ng/mlfgf7(r&dbiosystems)的dmem：f12基礎培養基。隨後將細胞處理四天，每日供應含有1％b27(invitrogen)、0.25μmkaad環巴胺、2μm視黃酸(ra；sigma-aldrich)和20ng/mlfgf7的dmem：f12。平行的陰性對照孔自始至終維持在補充有2％fcs或1％b27但無任何其他添加物的dmem：f12基礎培養基中。在胰腺內胚層形成後，再將細胞處理六天時間，隔日供應含有1％b27加上1μmdapt(γ分泌酶抑制劑：emdbiosciences)和50ng/ml毒蜥外泌肽4(sigma-aldrich)及1μmtgfβr1抑制劑ii(alk5抑制劑；emdbiosciences)的dmem：f12基礎培養基。在這六天時間中，將gsk3β抑制劑回加到各個孔，在分化開始時使用與之前的處理相同的濃度。然後再將細胞處理三天時間，隔日供應含有1％b27、50ng/ml毒蜥外泌肽4、50ng/mligf(r&dbiosystems)和50ng/mlhgf(r&dbiosystems)及1μmtgfβr1抑制劑ii(alk5抑制劑；emdbiosciences)的dmem：f12基礎培養基。在這三天時間中，將gsk3β抑制劑回加到各個孔，在分化開始時使用與之前的處理相同的濃度。平行組的陽性對照孔在20ng/mlwnt3a存在或不存在下進行處理。平行的陰性對照孔自始至終維持在補充有1％b27但無任何其他添加物的dmem：f12基礎培養基中。測定評估：在培養結束時，如以上實例10中對細胞進行處理，以通過高內涵分析進行評估。對於高含量螢光染色，將96孔板中的細胞用pbs洗滌兩次，然後用4％多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，再用pbs洗滌三次，然後用0.5％tritonx-100在室溫下透化處理20分鐘。在固定和透化處理後，將細胞再用pbs洗滌三次，然後用pbs中的4％雞血清(invitrogen)在室溫下封閉30分鐘。將一抗(豚鼠抗豬胰島素，可與人胰島素交叉反應；dakocytomation)在4％山羊血清中1∶500稀釋，然後在室溫下加到細胞中保持一小時。將細胞用pbs洗滌三次，然後用在4％山羊血清中1∶100稀釋的alexafluor488綴合二抗(山羊抗豚鼠igg；molecularprobes)染色。為對細胞核進行復染，在室溫下加入2μg/mlhoechst33342(invitrogen)保持十分鐘。將細胞用pbs洗滌一次，並保留在100μl/孔pbs中以進行成像。用incellanalyzer1000細胞分析儀(gehealthcare)對細胞進行成像，對於用hoechst33342和alexafluor488染色的細胞採用51008bs二向分色鏡。用陽性對照孔和只用二抗染色的孔來優化曝光時間。每孔獲取15個視野的圖像，以補償處理和染色程序中的任何細胞損失。用incelldevelopertoolbox1.7(gehealthcare)軟體獲得每個孔的總細胞數目和總胰島素強度的測量值。基於灰階水平(基線範圍100-300)和核大小確定細胞核的分裂情況。計算每個重複數據集的平均值和標準偏差。總胰島素蛋白質表達以總強度或積分強度報告，該強度定義為細胞總螢光乘以細胞面積。基於灰階範圍在300至3000之間的接受標準來去除背景。通過將每個孔的總強度除以wnt3a/激活素a陽性對照的平均總強度，將總強度數據進行歸一化。對於每個三次重複組，對歸一化的數據計算平均值和標準偏差。結果顯示了八種gsk-3b酶抑制劑的結果。圖15中給出的來自高內涵分析的數據顯示了化合物對h1hes細胞系的細胞數目(分圖a)和胰島素強度(分圖b)的作用，其中各個數據點是從三次重複組取平均值，並據以挖掘來自相同視野和孔的每個參數。在這些實例中，胰島素表達指示向激素陽性胰腺細胞的分化。在這些測定法中選擇的gsk3β抑制劑化合物在細胞譜系定向的早期階段中能代替wnt3a，且當在分化的隨後各階段加入時似乎能促進胰島素表達相對於陽性對照樣品而言得到提高。藉此將整篇文檔中引用的出版物全文以引用方式併入。儘管已通過參考實例和優選的實施例對本發明的多個方面進行了闡述，但應當理解，本發明的範圍不由前面的描述限定，而是由專利法的原理正確解釋的權利要求書所限定。表ia：用於facs和免疫染色分析的一抗列表表ib：用於facs和免疫染色分析的綴合的二抗列表綴合的二抗供應商稀釋度apc綴合的山羊抗小鼠iggjacksonimmunoresearch(pa)1∶200pe綴合的山羊抗小鼠iggjacksonimmunoresearch(pa)1∶200pe或apc綴合的驢抗兔抗體jacksonimmunoresearch(pa)1∶200pe或apc綴合的驢抗山羊抗體jacksonimmunoresearch(pa)1∶200pe綴合的山羊抗小鼠igmsouthernbiotech(al)1∶200pe綴合的山羊抗大鼠igmsouthernbiotech(al)1∶200pe綴合的山羊抗小鼠igg3southernbiotech(al)1∶200表ii：gsk-3b酶活性抑制劑對可表達多潛能標誌物的細胞的活力的作用表iii：gsk-3b酶活性抑制劑對可表達多潛能標誌物的細胞的活力的作用表vi：gsk-3b酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞增殖的作用表vii：gsk-3b酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞增殖的作用表viii：gsk-3b酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞系h1的細胞增殖的劑量依賴性效果。表ix：gsk-3b酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞系h1的細胞分化的劑量依賴性效果。表x：gsk-3b酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞系h9的細胞增殖的劑量依賴性效果。表xi：gsk-3b酶活性抑制劑對人胚胎幹細胞系h9的細胞分化的劑量依賴性效果。當前第1頁12