結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體c3相互作用及其用途的製作方法
2023-08-13 15:38:01 2
專利名稱：結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體c3相互作用及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及以結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用為基礎的藥物篩選模型及其用途，尤其是在結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用調控分子篩選方面的用途。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是人類重要的致病菌。據世界衛生組織估計，每年有兩百萬人死於結核病；每三個人中就有一個人被感染；從2000年到2020年間，將會有近十億人新感染結核病(http://www.theglobalfund.org/en/about/tuberculosis/default.asp)。特別是近年來，隨著多重耐藥菌株的出現及增多和愛滋病的流行，結核病的發病率也呈急劇上升趨勢。結核分枝桿菌作為一種病原菌，成功之處主要在於能在寄主體內進入休眠狀態，並保持持久的活性。當寄主的免疫系統因為某些原因(如衰老，感染HIV)免疫力下降時，這些休眠期的病原菌將會被重新激活並引發明顯的臨床症狀。
人體的補體系統由許多蛋白組成。正常狀態下，補體系統的這些成分處於一種代謝平衡的狀態。一定的條件下補體被激活，合成增強。補體成分經3條途徑活化，而3條不同的途徑均經C3成分進入溶膜途徑。C3主要在人體肝臟中合成。C3結合分子在如Legionellapneumophila，Trypanosoma cruzi和Leishmania mexicana等幾種胞內致病菌的表面都被鑑定，Stacey L.Mueller-Ortiz等的研究顯示結核菌的細胞膜表面的heparin-bindinghemagglutinin(HbhA)與人的C3結合，且推測在M.tuberculosis和M.avium的表面不止有一個分子能和C3結合介導細菌吸附到單核細胞，而HbhA屬於該分子之一。同時J.Scott Ferguson等的研究顯示在人的血清中，C3通過起始經典途徑或替代途徑結合MTB。Geir Hetland認為MTB並不被補體裂解，而是使用補體系統作為一種進入宿主白細胞的方式。一旦進入胞內的吞噬體，結核菌就有可能逃離免疫系統的檢測而存在許多年。
結核分枝桿菌在營養缺乏時進入休眠狀態，在一定的條件下復甦進入感染狀態。乙醛酸循環是細菌和真菌利用二碳化合物的重要途徑，也是結核菌得以持續的關鍵之一。異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是乙醛酸循環中的關鍵酶，研究該酶有助於開發新型藥物的。部分胞內致病菌的表面蛋白能夠與補體成分3(complement component 3，C3)相互作用。C3作為補體系統3條途徑的交匯點，是進入溶膜途徑的必經之路。研究結核菌的ICL和人補體系統C3的相互作用對了解其致病機理和開發新的藥物提供了新途徑。
蛋白質間的相互作用的特異性適合於藥物篩選。例如均質二聚體(SH2)磷酸酪氨酸蛋白，分子大小與五聚物相同的肽即可解離兩個亞基的作用。這樣小的分子完全可以進行有機設計。蛋白與蛋白之間的親和力高，解離速度也快，正好可以進行競爭性結合。通過體內實驗、細胞分析、對化合物有選擇性生長優勢的細胞分析，如以酵母細胞生長依賴性為檢測手段的藥物篩選；以化合物對蛋白質相互作用的解離為選擇性優勢的反向雙雜交系統。
例如對於不能合成嘧啶的營養缺陷型酵母突變體，可根據它對脲基琥珀酸的抗性將其從野生菌中挑選出來。反向篩選已經用於與蛋白相互作用無關的藥物篩選。例如利用內源性G蛋白(Ste18p)對野生型酵母菌的毒性作用篩選，抑制小G蛋白如Ras法尼基化的化合物，根據對酵母菌的挽救作用，鑑定出手黴素(m anum ycin)是法尼基化的強抑制劑，它抑制K12Ras轉化的纖維肉瘤的生長，也說明它有可能成為抗腫瘤藥物。又如流感A病毒M2蛋白可改變H+2A TP酶建立的電化學梯度，抑制野生型酵母細胞的生長，利用此特性篩選出了抗病毒藥物B I1743。
酵母雙雜交系統是可用於分析大量的蛋白質間的相互作用的最有效的遺傳學方法。經過雙雜交系統鑑定的蛋白質相互作用還要經過生物系統測試。傳統的方法包括內源性蛋白的免疫共沉澱、免疫定位、分級沉澱和一些生理技術。最直接的是解離此作用對生理作用的影響。如果一個新檢測的蛋白之間的相互作用對於生物功能是重要的，解離這一關係則必然導致功能性損害。理論上講，蛋白質相互作用可通過一配偶體的順式突變(相當於等位基因缺陷)或由類似解離肽的小分子的作用而抑制。由於鑑定相互作用缺陷等位基因或其專一性解離分子的技術困難，至今這一遺傳策略還未能廣泛應用於蛋白質間相互作用的確定。相互作用缺陷的等位基因可發生難以預料的突變，使在沒有明顯影響蛋白質的情況下，使蛋白的相互作用瓦解。
確定蛋白質之間相互作用後，還要進一步研究其結構和功能的關係，確定蛋白質間作用的關鍵位點或起決定作用的個別胺基酸，特定結構尤為重要。反向酵母雙雜交系統是鑑定阻斷蛋白間相互作用的技術，其關鍵是報導基因的表達產物對細胞生長有抑制作用。這樣當DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用時，表達出有毒性的報導蛋白，細胞不能生長。Uidal等建立的酵母細胞株中，其URA 3的表達由含CAL 4結合位點的啟動子嚴密控制，此細胞株在缺乏尿嘧啶的培養基中需GSL 4的DNA結合結構域和轉錄激活結構域的融合蛋白相互作用，使URA表達，其產物為合成尿嘧啶所必需，因此細胞能夠存活。但此產物同時能催化5-氟乳清酸轉化為5-氟尿嘧啶，所以在含5-氟乳清酸的完全培養基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。根據這一原理，可以篩選出阻斷蛋白質相互作用的突變體。反向酵母雙雜交系統還可作為研究體內功能的遺傳學方法。臨床上可以篩選阻斷蛋白質相互作用的小肽類藥物，這也是當前及今後研究的熱點之一。
反向酵母雙雜交分析不需要價格昂貴的高度純化的靶分子，對許多蛋白質可以在相對短的時間內進行分析。此外，使用的分析環境接近於生理條件，細胞的生存和死亡可以作為篩選的參數，不需要進行體外的初篩。更重要的是此分析是完全標準化的，還可以分析只有特殊情況下才可能出現的蛋白之間的相互作用。DB2X:AD2Y相互作用可以產生細胞毒性，在培養基中的具有解離蛋白的相互作用的非毒性的化合物進入細胞，使細胞得以生存。還可以用PCR的方法分析特定的作用。這一分析可與現代的高通量篩選相匹配設計，可以通過計算機和自動化工具進行樣品採集。在合成的化合物庫和天然產物庫中篩選分析出活性分子，篩選出的化合物本身的毒性一般較弱，因為生長優勢是活性測定的基礎。酵母系統的不足在於藥物的滲透問題。然而，經特殊的基因修飾，使酵母對很多化合物有較好的滲透性，包括親水性化合物甚至帶電離子。如廣泛應用的erg6突變，它影響麥角甾醇的合成和膜功能，增加細胞對一些化合物的敏感性，如環己醯亞胺、布雷菲爾德菌素A、萘啶酮酸、氨茴黴素和放線菌素及N aL i。然而，一些erg6突變體結構複雜，有多效表型，導致低的質粒轉化效率、色氨酸低速轉運等，因此也提供了選擇空間。如編碼藥物排出泵基因PDR5缺失的菌落是多藥敏感性表型，FK 506拯救DB 2R IC:AD2FKBP12表達細胞可因為pdr5Δ背景而增加。其他的突變體如snq2和yo rL也增加了細胞對藥物的敏感性。以細胞為基礎的分析要求化合物有比較高的濃度，將細胞限制在很小的納米粒脂囊內，可能積累較高的化合物濃度，用於反向雙雜交篩選。篩選大的文庫、等位基因或分子可應用抑制蛋白的相互作用所提供的遺傳選擇性，如反向雙雜交系統。將雙雜交系統反過來，以毒性標誌(如U RA 3)為報告基因(反向篩選)，DB2X和AD2Y的相互作用使毒性標誌基因表達，對野生型酵母菌產生毒性或致死性作用。在此情況下，解離DB2X:AD2Y作用有助於酵母菌的生長，可用於鑑定相互作用缺陷的等位基因和解離肽或小分子。U RA 3的表達產物為酵母細胞合成尿嘧啶所必需，同時可催化5-氟2乳清酸(5-FOA)轉化為一毒性產物，因而在含有5-FOA的介質中DB2X:AD2Y表達的酵母菌不能生長，發生了蛋白質相互作用解離的菌株才可以因為表現出抗性而生存。使用反向雙雜交系統除可用於選擇相互作用缺陷型的等位基因，還可以用於鑑定抑制蛋白質相互作用的小分子。
發明內容
本發明的目的在於提供，1.一種以結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用為基礎的藥物篩選模型；2.基於結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的關鍵功能域的藥物篩選模型。
本發明的技術方案如下採用本領域技術人員熟知的技術，從結核菌基因組擴增異檸檬酸裂合酶基因，擴增人補體C3基因，分別構建酵母等雙雜交所需載體，在酵母等適宜的宿主表達，建立雙雜交模型。以構建的模型，篩選調控雙雜交信號的分子。由於酵母菌的可多變性，有可能建立一系列的功能分析用於反向篩選。如只要報告基因的啟動子存在C3的結合位點，C3的功能可在酵母細胞中再建，應用一毒性標識，就可能設計出對C3特異的反向篩選系統。
實現上述目的的基本技術路線為總體技術方案是克隆包括提取結核菌基因組，利用合適的載體和限制性內切酶片段，構建轉化載體，將基因組DNA克隆到合適的大腸桿菌宿主細胞。確定異檸檬酸裂合酶與補體C3之間存在相互作用。建立基於異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的反向雙雜交模型。應用該模型篩選抑制異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的分子。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養基或YE培養基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養基中，培養到合適的菌體濃度，按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌包括反向雙雜交工程菌的構建按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當的載體，轉化適當的宿主菌，通過一定的選擇標記，收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業途徑獲得的載體、限制性內切酶和方法，將目標基因克隆到載體，轉化宿主細胞，篩選轉化子。分別根據已知的結核菌入侵人體和動物模型可能遭遇的不利環境，進行人工模擬，從基因組表達文庫篩選相應的轉化子，並進一步驗證。
4.利用含有功能相互作用的反向雙雜交重組菌，進行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
5.反向雙雜交主要採用文獻Gray PN，Busser KJ，Chappell TG.A novel approach forgenerating full-length，high coverage allele libraries for the analysis of protein interactions Mol CellProteomics，2006採用的方法。
發明效果利用本技術方案涉及的方法，得到了確定異檸檬酸裂合酶與補體C3之間存在相互作用。建立基於異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的反向雙雜交模型。應用該模型篩選抑制異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的分子。
具體實施例方式
1材料與方法1.1重組質粒的構建及其鑑定從重慶市肺科醫院購買的H37Rv中克隆ICL。以克隆的ICL為模板，PCR產物純化，將其與改造後加SfiI酶切位點的質粒pDBLeu(從invitrogen公司購買)連接，構建重組質粒icl-pDBLeu作為BD載體。轉化Top10，PCR和酶切鑑定後測序鑑定。
1.2正常人肝cDNA文庫篩選1.2.1icl轉化酵母細胞及自激活檢測在YEPD培養基中過夜培養酵母菌Mav203，轉接種子液使其OD600達到0.1，30℃，250rpm搖床培養5-6hr，至OD600＝0.4。5000rpm離心5min收菌，分別用無菌水和LiAc/TE/H2O(1∶1∶8)各洗滌1次後，將酵母細胞懸浮於適量的LiAc/TE中，再加入200ug的icl-pDBLeu和適量的LiAc/TE/PEG3350(1∶1∶8)混勻；30℃水浴30min；42℃熱激15min；再次30℃水浴20min後收集菌體，懸浮於適量的無菌水中後塗布於SC(synthetic complete)-Leu平板，30℃培養3天後，挑取轉化子做lacZ檢測。同樣的操作將icl-pDBLeu和pPC86即AD空載(加SfiI酶切位點改造)共同轉化Mav203，並做lacZ檢測。
1.2.2人肝cDNA文庫的篩選及其轉化效率的檢測從invitrogen購買的人肝cDNA文庫用於篩選與icl相互作用的蛋白。篩庫的方法如1.2.1，挑取Mav203-icl-pDBLeu的菌落接種於SC-Leu中，過夜培養後轉接至YEPD中，5-6hr後當其OD600達到0.4時收菌。無菌水和LiAc/TE分別洗滌後，將細胞懸浮於2.75ml的LiAc/TE中，加入250μl ssDNA(5mg/ml)和12.5μg cDNA文庫質粒及15ml的PEG3350/LiAc/TE，混勻；30℃水浴30min，42℃熱激15min，30℃水浴20min，收菌並懸浮於4ml的無菌水中，塗布於SD-Trp-Leu-His+25mM 3AT平板，30℃培養3天後影印清除，4天後挑取陽性克隆到25mM 3AT。另取40μl菌液倍比稀釋1∶10，1∶100，1∶1000，各取100μl塗布於SD-Leu-Trp平板，30℃培養3天後，對轉化子進行記數，計算轉化效率。
1.3假陽性克隆的鑑定及排除將在25mM 3AT上培養2-3天後的陽性克隆進行lacZ檢測，排除假陽性。將顯色的陽性克隆接種到選擇性培養基中30℃，250rpm培養過夜，收集菌體抽提酵母質粒。菌體用100μlSTET懸浮，加入0.2g玻璃株，渦旋震蕩5min；再加入50μl STET，100℃水浴5min，冰浴2min，5000rpm，離心10min；取100μl上清，加入50μl 7.5M NH4Ac，-20℃1-2hr；12000rpm離心10min；取100μl上清加入2倍體積無水乙醇，-20℃放置1-2hr；12000rpm，離心10min，棄上清；75％乙醇500μl洗滌；12000rpm，離心1min，棄上清；殘留乙醇揮發，加20μl水溶解，-20℃儲存。
將抽提的酵母質粒轉化Top10，提取的質粒分別和BD空載及icl-pDBLeu共轉Mav203，3天後挑取轉化子進行lacZ檢測。
1.4基因序列的測定和分析將共轉驗證的陽性克隆以改造後的AD為引物進行序列測定。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov對所得基因序列進行同源性比較。
1.5反向雙雜交體體系的構建酵母菌株和分子操作，C3::URA3報告基因的構建；C3::URA3報告基因的整合；質粒構建等採用文獻Gray PN，Busser KJ，Chappell TG.A novel approach for generating full-length，highcoverage allele libraries for the analysis of protein interactions Mol Cell Proteomics，2006採用的方法。
2結果2.1 ICL重組質粒的構建重組質粒icl-pDBLeu經PCR、酶切和測序鑑定。結果表明icl基因引入酶切位點和插入方向完全正確。
2.2人肝cDNA文庫篩選2.2.1icl轉化酵母細胞及自激活檢測將icl-pDBLeu轉化酵母細胞的轉化子進行lacZ檢測，Mav203-icl-pDBLeu及其重組質粒和AD共轉的轉化子經lacZ檢測均不變藍。說明不存在自激活效應，從invitrogen公司的購買的該酵母雙雜交系統可以用於篩選與icl基因相互作用的蛋白。
2.2.2人肝cDNA文庫的篩選及其轉化效率的檢測2次篩庫的轉化效率分別為8×10-5和4×10-5。
2.假陽性克隆的鑑定及排除在25mM 3AT平板上生長的陽性克隆經lacZ檢測通過的共有154個克隆。將這154個陽性克隆抽提酵母質粒，共轉驗證後有4個陽性克隆通過。對其序列比較分析，結果顯示為補體系統C3的片斷。
權利要求
1.基於結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的藥物篩選模型，其特徵是以結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用為靶標，篩選調控該相互作用的分子。
2.權利要求1所述的結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的藥物篩選模型，其特徵是兩個全長基因參與的相互作用。
3.權利要求1所述的結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用的藥物篩選模型，其特徵是兩個基因的部分參與的相互作用，尤其是補體C3的備解素功能域參與的相互作用。
全文摘要
本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及以結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用為基礎的藥物篩選模型及其用途，尤其是在結核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶與補體C3相互作用調控分子篩選方面的用途。
文檔編號C12Q1/68GK1995379SQ20061009534
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優先權日2006年12月25日
發明者謝建平, 申嚴傑, 霍克克, 王洪海 申請人:西南大學