包括表達植物分裂素氧化酶的修飾植物形態學、生物化學和生理學的方法

2023-09-09 20:27:25 6

專利名稱：包括表達植物分裂素氧化酶的修飾植物形態學、生物化學和生理學的方法
技術領域：
一般地，本發明涉及修飾諸如一個或多個發育過程和/或環境適應過程等植物形態學、生物化學和生理學性質或特性的方法，所述修飾包括但不限於根生長的起始、刺激或增加，和/或不定根形成，和/或側根形成，和/或根向地性，和/或枝條生長，和/或頂端優勢，和/或分支，和/或衰老時機安排，和/或開花時機安排，和/或花形成，和/或種子發育，和/或種子產量的修飾。也提供了增加種子大小和/或重量，增加胚大小和/或重量和增加子葉大小和/或重量的方法。該方法包括在植物中表達可操作地處於可調節啟動子序列，如細胞特異性啟動子、組織特異性啟動子或器官特異性啟動子序列控制下的細胞分裂素降解控制蛋白質，特別是細胞分裂素氧化酶。優選地，本發明修飾的特徵是細胞分裂素介導和/或植物生長素介導的特徵。本發明延及用於進行本發明方法的基因構建體和延及隨之產生的轉基因植物，與轉基因植物在其它方面等基因的對應植物比較，該轉基因植物具有改變的形態學和/或生物化學和/或生理學性質。
背景技術：
根是高等植物的重要器官。它們的主要功能是在土壤中固定植物和吸收水分和營養物(N-營養，礦物質等)。因此，特別是在營養物限制的情況下，根的生長對地上器官有直接或間接的影響。根也與次級植物產物，如防禦化合物和植物激素的產生有關。
根也是許多重要大宗作物中的貯藏器官。在歐洲，甜菜是最重要的產糖植物(2.6×108噸/年；佔世界產量的38％)。樹薯(木薯)、薯蕷、甘薯(batate)是重要的澱粉生產者(約1.5×108噸/年)。其澱粉含量可以高達馬鈴薯的兩倍。根也是許多蔬菜(例如，胡蘿蔔、小蘿蔔)，草本植物(姜、Kukuma)和藥用植物(例如，人參)中消耗的相關器官。此外，根中發現的次級植物產物對於化學和製藥工業具有經濟重要性。以薯蕷為例，其包含甾類激素合成的基本分子。另一個例子是紫草素，其通過髮根培養物中紫草(Lithospermum erythrorhizon)根產生。可利用紫草素的抗炎性、抗腫瘤和傷口癒合的性質。
而且，通過增加水分的可利用性和吸收，農作物植物改良的根生長也將增強與雜草植物的競爭性和改進在乾旱地區的生長。
改良的根生長也與生態學目的，如生物治療和土壤侵蝕的預防/阻止有關。
因為在大田中評估根體系結構性狀的困難，根體系結構是通過傳統育種大部分未探索的領域。因此，生物技術對這種性狀的改進可能有顯著的影響，因為生物技術不依賴於大田中的大規模篩選。相反，生物技術方法需要決定植物特定特徵的分子成分的基本理解。今天，該知識僅僅是部分的，因此，目前為止，生物技術不能實現在該領域的突破。
明確確定的根生長調節劑是植物生長素。給生長的植物施用吲哚-3-乙酸(IAA)刺激側根發育和側根伸長(Torrey，Am J Bot 37257-264，1950；Blakely等Bot Gaz 143341-352，1982；Muday和Haworth，PlantPhysiol Biochem 32193-203，1994)。暴露於一定範圍IAA的根引起了增加數量的側根(Kerk等，Plant Physiol，122925-932，2000)。而且，當對特定濃度外源植物生長素應答而產生了側根的根隨後暴露於更高濃度IAA時，在存在的側根間隔發現了許多額外的側根(Kerk等.，Plant Physiol，122925-932，2000)。相反地，在含有植物生長素轉運抑制劑，包括NPA的瓊脂上，根的生長減少了側根的數量。(Muday和Haworth，Plant Physiol Biochem 32193-203，1994)。
已經分離了含有增加的內源IAA水平的擬南芥(Arabidopsis)突變體(Boerjan等，Plant Cell 71405-141，1995；Celenza等，Gene Dev92131-2142，1995；King等，Plant Cell 72023-2037，1995；Lehman等，Cell 85183-194，1996)。現在已知它們是位於2號染色體上的單基因座的等位基因。這些突變的幼苗有額外的不定根和側根，這與上述外部植物生長素施用的作用一致。
植物生長素對不定根和側根形成的刺激作用表明轉基因植物中植物生長素的過量產生是增加根生長的有效策略。然而，也懷疑是否這將產生具有改良特徵的商品。除了植物生長素對不定根和側根形成的刺激作用外，植物生長素的過量產生引起了其它作用，如葉數的降低，異常的葉形態(狹窄、捲曲的葉片)，發育不全的花序、增加的頂端優勢，莖上不定根的形成，從農藝學角度講，這些作用的大多數都是不期望的(Klee等，Genes Devel 186-96，1987；Kares等，Plant Mol Biol 15225-236，1990)。因此，依賴於增加的植物生長素合成的方法的主要問題是限制問題，即，將植物生長素的作用限制於根。通過利用組織特異性的啟動子不可能克服限制的問題植物生長素在植物中轉運，因此它們的作用不限於合成位點。另一個問題是是否植物生長素將一直增加總的根生物量。對於瓊脂上生長的植物，注意到增加的濃度逐步刺激側根形成，但同時抑制這些根的過度生長(Kerk等，Plant Physiol，122925-932，2000)。
種子是高等植物的繁殖單位。植物種子含有發芽後確保胚營養的儲藏化合物。這些貯藏器官顯著地貢獻於人類營養和家畜飼養。種子包含三個主要部分，即胚、胚乳和種皮。儲藏化合物存貯在貯藏器官，該貯藏器官或者是胚乳(由雙受精產生，例如在所有穀類植物中)，所謂的外胚乳(來源於珠心組織)或子葉(例如，豆類品種)。貯藏化合物是脂類(含油種子油菜)、蛋白質(例如穀類植物的糊粉中)或碳水化合物(澱粉、寡糖如棉子糖)。
澱粉是穀類植物種子的貯藏化合物。最重要的物種是玉米(根據FAO1995，年產量是約570mio t)，水稻(540mio t p.a.)和小麥(530mio tp.a.)。蛋白質豐富的種子是不同種類的豆類(菜豆屬(Phaseolus spec.)，蠶豆(Vicia faba)，豇豆屬(Vigna spec.)；約20mio t p.a.)，豌豆(Pisum sativum；14mio t p.a.)和大豆(Glycine max；136mio t p.a.)。大豆種子也是脂類的重要來源。脂類豐富的種子也是不同芸苔屬(Brassica species)(約30mio t p.a.)、棉花、芝麻、亞麻、罌粟、蓖麻、向日葵、花生、椰子、油棕和一些其它較少經濟重要性植物的種子。
受精後，發育的種子變成了從植物源器官吸收營養化合物的吸收器官，並且利用它們在貯藏器官中產生儲藏化合物。對於許多不同農作物物種而言，期望種子大小和重量的增加。除了增加的澱粉、蛋白質和脂類儲藏和因此增加的攝取的營養外，種子大小和/或重量和子葉大小和/或重量的增加與發芽後快速生長(早期活力)和增加的脅迫耐受性相關。細胞分裂素是測定吸收強調的重要因子。通常的概念預測，細胞分裂素是吸收強度的正調節物。
許多報導把不同發育過程諸如根生長和分支、枝條中頂端優勢的控制、葉綠體發育和葉片衰老中的刺激或抑制功能歸因於細胞分裂素(MokM.C.(1994)在「細胞分裂素化學、活性和功能」，Mok，D.W.S.& Mok，M.C.編輯(CRC Boca Raton，F1)，155-166頁)。關於細胞分裂素生物學功能的結論主要來源於外源細胞分裂素施用或內源增加細胞分裂素水平的結果的研究(Klee，H.J.& Lanehon，M.B.(1995)在「植物激素生理學、生物化學和分子生物學」，Davies，P.J.編輯(Kluwer，Dordrdrocht，the Netherlands)，340-353頁，Smulling，T.，Rupp，H.M.Frank，M&Schafer，S.(1999)植物生長和發育調節的進展，Surnad，M.Pac P.&Beck，E.編輯(Peres，Prague)，85-96頁)。到現在為止，還不可能回答相反的問題如果降低內源細胞分裂素的濃度，植物生長和發育的結果是什麼？預期具有降低細胞分裂素含量的植物產生關於細胞分裂素限制因此可能進行調節的過程的更準確的信息。不同於其它植物激素諸如脫落酸、赤黴素和乙烯，還沒有分離出細胞分裂素生物合成突變體(Hooykens，P.J.J.，Hall，M.A.& Libbeuga，K.R.，編輯(1999)植物激素的生物化學和分子生物學(Elsevier，Amsterdam)。
分解代謝酶細胞分裂素氧化酶(CKX)在控制植物組織中細胞分裂素的水平中起主要作用。在大量高等植物和不同植物組織中已經發現了CKX活性。該酶是含有FAD的氧化還原酶，其催化具有不飽和類異戊二烯側鏈的細胞分裂素的降解。游離鹼基iP和Z，及它們各自的核糖核苷是優選的底物。iP分解代謝的反應產物是腺嘌呤和不飽和醛3-甲基-2-butonal(Armstrong，D.J.(1994)在「細胞分裂素化學，活性和功能」，Mok.D.W.S & Mok，M.C.編輯(CRC Boca Raton，FL)，139-154頁)。最近，已經分離了來源於玉米(Zea mays)的細胞分裂素氧化酶基因(Morris，R.O.，Bilyeu，K.D.，Laskey，J.G.& Cherich，N.N.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333，Houba-Heria，N.，Pethe，C.d』Alayer，J & Lelouc，M.(1999)Plant J.17615-626)。CKX基因表達的操作可以部分地克服細胞分裂素生物合成突變體的缺乏，並且可以用作研究高等植物整個生命周期期間iP和Z-型細胞分裂素相關性的有力工具。
通過內源細胞分裂素濃度的降低，本發明克服了與植物生長素作用的限制，根過度生長(outgrowth)的維持和增加的種子、胚和子葉大小和/或重量的提高有關的問題。
發明概述
本發明提供了植物細胞分裂素氧化酶蛋白質，編碼這種蛋白質的核酸序列，和載體，宿主細胞和包含該蛋白質、核酸序列和載體的轉基因植物細胞，植物和植物部分。例如，本發明涉及基因構建體，其包含編碼具有擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶活性的蛋白質的基因。可以在調節型啟動子控制下表達該基因。可以通過內源組織特異性或環境特異性因子調節該啟動子，或者，可替代地，可以通過特異性化學試劑的施用誘導該啟動子。
本發明也涉及通過在植物或植物部分中細胞分裂素氧化酶基因的表達或編碼降低活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸表達，修飾根系體系結構(root architecture)和生物量的方法。優選地，表達受對根或根的一些組織或細胞類型特異的啟動子控制。
此外，本發明涉及增加種子大小和/或重量，胚大小和/或重量，和子葉大小和/或重量的方法。該方法涉及在植物或植物部分中細胞分裂素氧化酶基因的表達或編碼降低活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸的表達。優選地，表達受優先引導在種子、胚或子葉中表達的啟動子控制。


圖1植物細胞分裂素氧化酶基因的圖示。
所示的是從玉米(ZmCKX1，記錄號AF044603，Biochem.Biophys.Res.Com.255328-333，1999)和擬南芥屬(Arabidopsis)(AtCKX1到AtCKX4)分離的不同細胞分裂素氧化酶基因的結構。用′E′命名外顯子，用陰影盒子表示。用白色盒子表示內含子。進一步標明了基因大小(在每個結構的上部，以kb表示)，基因的記錄號(在名稱下面)和表示0.5kb的大小棒。
圖2植物細胞分裂素氧化酶胺基酸序列的比對(alignment)
比對來源於玉米(ZmCKX1)和擬南芥(Arabidopsis)(AtCKX1到AtCKX4)的細胞分裂素氧化酶的胺基酸序列。通過黑色盒子標記相同的胺基酸殘基，用灰白盒子標記相似的胺基酸殘基。胺基酸相似性組(M，I，L，V)，(F，W，Y)，(G，A)，(S，T)，(R，K，H)，(E，D)，(N，Q)。
圖3表達AtCKX1的菸草和擬南芥植物的Northern印跡分析
(A)與野生型SNN菸草(泳道9)比較，組成地表達的菸草植物(泳道1-8)的Northern印跡分析，
(B)12小時誘導後葉片中四環素誘導的基因表達和組成型表達克隆的比較。泳道2-9，4個不同AtCKX1-W38TetR克隆(+，-，有或無四環素處理)的葉，泳道1，組成地表達35S::AtCKX1克隆，
(C)組成地表達AtCKX1基因的擬南芥(Arabidopsis)植物的Northern印跡分析。泳道2-4，與野生型擬南芥(Arabidopsis)植物(泳道1)比較，3個不同組成型表達35S::AtCKX1克隆。
圖4 35S::AtCKX1轉基因擬南芥(Arabidopsis)植物的生長特徵
(A)兩株野生型幼苗(左)與兩株35S::AtCKX1表達幼苗(右)比較。注意到轉基因幼苗中增加的不定根形成和增加的根分支。在發芽後14天照的該照片。植物以垂直位置體外生長在培養皿中的MS培養基上。
(B)除了根用甲苯胺藍染色外，與A類似。
(C)發芽後3周，具有35S::AtCKX1轉基因幼苗的培養皿俯視圖。
(D)液體培養中生長的35S::AtCKX1轉基因植物。在這些條件下，野生型幼苗的根生長不好(未顯示)。
(E)表達35S::AtCKX1基因的轉化體(T0)(右側的3株植物)，左側所示的是野生型植物。
(F)土壤中生長的T1植物的表型。野生型植物(左)與兩株35S::AtCKX1轉基因植物比較。
圖5過量表達AtCKX2的擬南芥(Arabidopsis)植物的表型表達35S::AtCKX2的擬南芥(Arabidopsis)植物的T1代(右側兩株植物)與野生型(左側植物)比較。
圖6表達AtCKX2的菸草和擬南芥(Arabidopsis)植物的Northern印跡分析
(A)與野生型SNN菸草(泳道8)比較，組成地表達的菸草植物(泳道1-7)的Northern印跡分析。
(B)組成地表達AtCKX2基因的擬南芥植物的Northern印跡分析。與野生型擬南芥(Arabidopsis)植物(泳道1)比較，泳道2-8，7個不同組成地表達35S::AtCKX2的克隆。
圖7表達AtCKX1和AtCKX2的菸草植物的枝條表型
(A)6周齡植物的俯視圖。
(B)開花期的菸草植物。
(C)莖伸長的動力學。箭頭標出了開花的開始。在箭頭上方標出了在此時期的植物年齡(發芽後天數)和葉片數。棒表示SD；n＝12。
(D)發芽後68天到100天之間形成的葉數(n＝12)和這些葉片的最終表面面積(100％野生型是3646±144cm2；n＝3)。
(E)葉片大小和衰老的比較。葉來自從上部開始第4，9，12，16和20個節點(從左到右)。
圖8表達AtCKX的轉基因菸草植物的根表型
(A)發芽後17天的幼苗。
(B)開花期土壤生長植物的根系統。
(C)發芽後10天，根長度、側根(LR)和不定根(AR)數。
(D)外源細胞分裂素對根生長抑制的劑量-應答曲線。棒表示±SD；n＝30。
圖9表達35S::AtCKX1的菸草植物中腋生枝分生組織的生長
圖10過量表達AtCKX1的菸草植物與野生型(WT)菸草比較的枝分生組織、葉和根分生組織的組織學
(A)通過營養枝頂端分生組織的縱向正中切面。P，葉原基。
(B)葉片的次級葉脈中的維管組織。X，木質部，PH，韌皮束。
(C)完全發育葉片的橫截面。
(D)葉片上表皮的掃描電子顯微術。
(E)用DAPI染色的根端。RM，根分生組織。
(F)發芽後10天，根分生組織的縱向正中切面。RC，根冠；PM，原分生組織。
(G)離頂端10mm的橫向根切面。E，表皮，C1-C4，皮層細胞層，X，木質部，PH，韌皮部。棒是100μm。
圖11表達AtCKX3和AtCKX4的菸草植物的Northern即跡分析
(A)組成地表達AtCKX3的菸草植物的Northern印跡分析。泳道名稱表示各個轉基因植物號，WT是野生型SNN菸草。上部印跡是用AtCKX3特異性探針探測的，下部印跡是用25S rRNA特異性探針探測的，並且作為RNA加樣的對照。
(B)組成地表達AtCKX4的菸草植物的Northern印跡分析。泳道名稱表示各個轉基因植物號，WT是野生型SNN菸草。上部印跡是用AtCKX4特異性探針探測的，下部印跡是用25S rRNA特異性探針探測的，並且作為RNA加樣的對照。
圖12 AtCKX2轉基因菸草植物和野生型植物的交互嫁接
(A)左側的兩株植物對照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右側的兩株植物嫁接在AtCKX2-38轉基因砧木上的WT接穗。
(B)左側對照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右側嫁接在WT砧木上的AtCKX2-38植物接穗。
(C)根面積的放大。左側對照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右側嫁接在AtCKX2-38轉基因砧木上的WT接穗。
(D)不定根的形成。左側對照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右側嫁接在AtCKX2-38轉基因砧木上的WT接穗。
圖13擬南芥(Arabidopsis)種子、胚和幼苗的表型
(A)AtCKX1轉基因系種子和野生型種子。棒條大小1mm。
(B)AtCKX1，AtCKX2，AtCKX3和AtCKX4轉基因系種子和野生型種子。棒條大小1mm。
(C)AtCKX1轉基因擬南芥(Arabidopsis)和野生型植物的成熟胚。棒條大小是200μm。成熟種子在20％ EtOH中吸收12小時，從種皮擠出胚，用水合氯醛清洗胚而獲得胚，並且用Nomarski光學器件照相。
(D)發芽後4天野生型和表達AtCKX1的擬南芥(Arabidopsis)幼苗。
(E)D的近距離照片。
圖14野生型和4個研究的AtCKX基因每一個基因的2個單獨克隆的種子重量。通過分析每個克隆的5個不同批次的200粒種子獲得平均重量。
發明詳述
為了繞過與增加植物生長素生物合成有關的上述問題，決定進行可替代的方法。我們推理，與增加的植物生長素水平比較，植物生長素生物拮抗劑的下調可能引起對根生長相似或者甚至更優越的作用。儘管激素作用和相互作用是極其複雜的，但是我們假定細胞分裂素可以起到對根生長而言的植物生長素拮抗劑的作用。植物組織培養的激素研究已經表明，植物生長素對細胞分裂素的比率比這些激素的每種激素的絕對水平對器官發生更重要，實際上，這表明了這些激素至少在一些生物過程中起拮抗劑的作用。而且，通過細胞分裂素的外源施用抑制側根形成。有趣地，根伸長也受細胞分裂素處理負影響，這表明細胞分裂素控制根分支和根過度生長。
綜合起來，目前的文獻數據表明增加的細胞分裂素水平負面地影響根生長，但是還不理解該過程的機理。植物中細胞分裂素合成位點是根尖和枝條幼年組織。細胞分裂素的內源濃度在nM範圍。然而，因為它們定量是困難的，所以需要提取相對大的組織量，並且不知道實際局部濃度。細胞分裂素的亞細胞區室化還不清楚。一般地認為游離鹼和核糖核苷定位在細胞質和核中，而葡糖苷定位在液泡中。也存在具有稍微不同化學結構的不同細胞分裂素。結果，不知道是否應該將外源細胞分裂素的作用歸因於總的細胞分裂素濃度的增加還是歸因於與植物帶有的細胞分裂素的其它形式(其在結構、細胞或亞細胞定位上不同)對受體、轉運蛋白、運載蛋白和修飾酶的競爭。
為了檢驗根中細胞分裂素水平實際上超過了根生長最佳水平的假設，從擬南芥(Arabidopsis thaliana)克隆編碼細胞分裂素氧化酶(其是細胞分裂素代謝酶)的新的基因(命名為AtCKX)，隨後在轉基因菸草和擬南芥(Arabidopsis)中，在強組成型啟動子控制下表達該基因。顯示AtCKX mRNA表達和增加的細胞分裂素氧化酶活性的轉化體也顯示了增加的根形成和生長。也觀察到對枝生長的負作用。後者與這些植物中細胞分裂素氧化酶基因的組成表達一致，說明了細胞分裂素氧化酶基因的限制表達對一般植物生長性質的重要性。通過利用細胞、組織或器官特異性啟動子可以獲得細胞分裂素氧化酶活性的限制，因為細胞分裂素降解是受限於表達CKX蛋白質的組織和細胞的過程，這與上述依賴於激素合成的方法形成了對比。
觀察到細胞分裂素氧化酶表達對枝條生長的負作用證明細胞分裂素氧化酶是促進生長的化學試劑設計或篩選的目的靶。這種化學試劑應該抑制細胞分裂素氧化酶活性，優選地，應該不轉運到根，並且應該快速在土壤中降解，這樣這些化學試劑的施用將不會抑制根生長。細胞分裂素也延遲了葉衰老，這意味著積極的作用將包括光合組織的生長和維持。此外，細胞分裂素延遲葉衰老、增加變綠(葉綠體含量)和減少枝條頂端優勢的觀察資料表明以抑制植物地上部分CKX活性為基礎的策略(如反義、核酶和共抑制技術)可能引起延遲的衰老、增加的葉片變綠和增加的分支。
類似地，觀察到細胞分裂素氧化酶表達對根生長的積極作用證明細胞分裂素氧化酶是除草劑設計或篩選的目的靶。這種除草劑應該抑制細胞分裂素氧化酶活性，優選地應該不轉運到枝條、並且在可以通過土壤施用到根的溶劑中應該是可溶及相對穩定的。
至今仍然不知道細胞分裂素氧化酶過量表達對植物發育和體系結構(architecture)的這些作用，因此不可能設想本發明和其實施方式。
觀察到的對枝條生長的不利作用證明細胞分裂素氧化酶的操作可以用於獲得矮化表型。例如，在商品農作物，如穀類植物和果樹中，矮化表型特別有用。
根據本發明，出人意料地發現過量表達細胞分裂素氧化酶基因的轉基因植物生長出了增加大小和/或重量的種子(包括胚)和子葉。因為曾經預期降低的細胞分裂素含量與降低的器官生長相關，所以這些結果是令人驚奇的。
本發明優選的實施方式涉及細胞分裂素氧化酶表達對植物生長和體系結構，特別是根生長和體系結構，種子大小和重量，胚大小和重量及子葉大小和重量的積極作用。擬南芥屬(Arabidopsis)中細胞分裂素氧化酶基因家族包含至少6個成員(參見下面的實施例)，並且本發明人已經表明用這些基因中的一些基因在轉基因植物中達到的作用存在量的差異。因為在許多綠色植物中(Hare和van Staden，Physiol Plant91128-136，1994；Jones和Schreiber，Plant Growth Reg 23123-134，1997)，和其它生物體中(Armstrong，在「細胞分裂素化學，活性和功能」，Mok and Mok編輯，CRC Press，pp139-154，1994)存在細胞分裂素氧化酶活性的證據，期望可以從其它生物體分離所述擬南芥(Arabidopsis)細胞分裂素氧化酶的功能性同系物。因此，在本發明中有作用的細胞分裂素的序列不需要與這裡所述的這些相同。本發明特別用於穀類農作物和一般而言單子葉農作物，並且例如，也可以利用來源於小麥或玉米的細胞分裂素氧化酶基因(Morris等，1999；Rinaldi andComandini，1999)。設想具有細胞分裂素活性或具有任何其它細胞分裂素代謝活性的其它基因(參見Za
ímalová等，植物激素的生物化學和分子生物學，Hooykaas，Hall和Libbenga(編輯)，ElsevierScience，141-160頁，1997)也可以用於本發明的目的。類似地，編碼將增加內源細胞分裂素代謝活性的蛋白質的基因也可以用於本發明的目的。原則上，通過幹擾在細胞分裂素下遊起作用的基因，如參與細胞分裂素信號轉導途徑的受體或蛋白質，也可以獲得類似的表型。
對於本發明的目的，應該理解術語「根生長」包括在單子葉植物和雙子葉植物中，在根不同發育階段，組成根系的不同部分的所有生長方面。應該理解，一個或多個根的部分包括初生根、側根、不定根等的增加的生長可以引起增加的根生長，所有這些都落入本發明範圍內。
對於本發明的目的，應該理解，種子重量或種子大小的增加可以包括胚、胚乳、糊粉和種皮之中一個或多個大小的增加。而且，胚大小和/或重量的增加可以包括與其有關的不同器官諸如子葉、下胚軸和根的增加。
根據第一實施方式，本發明涉及刺激根生長和/或增加側根和/或不定根形成和/或改變根向地性的方法，該方法包括植物細胞分裂素氧化酶的表達或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
在另一個實施方式中，本發明涉及通過增加植物中細胞分裂素氧化酶活性或水平或者通過降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達增加植物種子大小和/或重量的方法。優選地，增加的細胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達定位於種子包括種子的不同組織或細胞類型中。
在另一種實施方式中，本發明涉及通過增加植物中細胞分裂素氧化酶活性或水平或者通過降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達增加植物胚大小和/或重量的方法。優選地，在種子中定位增加的細胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。甚至更優選地，在胚中定位增加的細胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
在另一實施方式中，本發明涉及通過增加植物中細胞分裂素氧化酶活性或水平或者通過降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達增加植物子葉大小和/或重量的方法。優選地，在子葉中定位增加的細胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
在本發明上下文中，應該理解可以可交換地利用術語「表達」和/或「過量表達」，並且兩個術語都涉及植物細胞分裂素氧化酶或減低活性細胞分裂素水平的任何其它蛋白質在植物中「增加和/或異位的表達」。應該清楚，在此意指植物細胞分裂素氧化酶增加的表達及植物細胞分裂素或所述其它蛋白質的「從頭」表達。做為可替代方案，所述其它蛋白質增加植物細胞分裂素氧化酶的細胞分裂素代謝活性。
進一步，應該理解，在本發明上下文中，表述「側根和/或不定根」可以意指「側根和不定根」，但是也可以意指「側根或不定根」。增加可以存在於側根形成中或不定根形成中及在兩種類型非初生根形成中，但不是必需的。
此外，如這裡所用的「增加的種子大小和/或重量」可以意指增加的種子大小和重量，但也可以指增加的種子大小或重量。因此，增加可以存在於種子大小或種子重量或者兩者的增加中。類似的解釋應該應用於「增加的胚大小和/或重量」和「增加的子葉大小和/或重量」。
可以可交換地使用術語「植物」和「植物部分」與術語「多株植物」和「多個植物部分」。
根據進一步實施方式，本發明涉及刺激根生長和/或增加側根或不定根形成和/或改變根向地性和/或增加產量和/或增強早期活力(earlyvigor)和/或修飾根/冠比率和/或改進對倒伏的抗性和/或增加乾旱耐受性和/或促進外植體體外繁殖的方法，包括植物細胞分裂素氧化酶的表達或包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
根據優選的實施方式，本發明涉及通過細胞分裂素氧化酶，優選本發明細胞分裂素氧化酶或降低植物或植物部分，優選根中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的過量表達刺激引起根質量增加的根生長的方法。
由於生長促進序列的過量表達引起的較高的根生物量產生對產量有直接的作用和對由根細胞或轉基因根細胞或所述轉基因根細胞的細胞培養物產生的化合物產生有間接的作用。根培養物中產生的目的化合物的一個例子是紫草素，通過所述的方法可以有利地增加其產生。
根據更具體的實施方式，本發明涉及刺激根生長或增加側根和/或不定根形成或改變根向地性或增加種子大小和/或重量，或者增加胚大小和/或重量，或者增加子葉大小和/或重量的方法。該方法包括編碼植物細胞分裂素氧化酶的核酸的表達，所述核酸選自
(a)包含如任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34或其互補序列中給出的DNA序列的核酸，
(b)包含與任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34或其互補序列對應的RNA序列的核酸，
(c)與任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34或其互補序列特異性雜交的核酸，
(d)編碼包含如任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，32或35中給出的胺基酸序列的蛋白質的核酸或其互補序列，
(e)如(a)到(d)中任何一個所定義的核酸，其特徵在於所述核酸是DNA，基因組DNA，cDNA，合成DNA或其中用U置換T的RNA。
(f)作為遺傳密碼的結果，與如任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34中給出的核酸簡併的核酸或者與(a)到(e)任一個所定義的核酸簡併的核酸，
(g)由於生物體間密碼子使用的差異，與編碼如任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中給出的蛋白質的核酸不同的核酸或與如(a)到(e)任一個中所定義的核酸不同的核酸，
(h)由於等位基因間的差異，與編碼如SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中給出蛋白質的核酸或者如(a)到(e)中所定義的核酸不同的核酸，
(i)編碼如任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中給出的蛋白質的核酸，
(j)如(a)到(i)任一個中所定義的核酸的具有細胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，
(k)編碼植物細胞分裂素氧化酶的核酸，
或者包括優選在根中或種子(包含種子的部分如胚、胚乳、種皮或糊粉)中或子葉中表達編碼降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸。
在本發明中，已經分離了編碼新的擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶的核酸，本發明人第一次驚奇地證明了轉基因植物或植物部分中細胞分裂素氧化酶的表達引起上述根和種子相關特徵。為了實現根相關的特徵，應該在根中優選在根特異性啟動子控制下發生(一種或多種)細胞分裂素氧化酶的表達。為了實現種子(包括胚)相關的特徵，應該在種子中優選在種子特異性啟動子控制下發生(一種或多種)細胞分裂素氧化酶的表達。在序列SEQ ID NO36中提供了這種根特異性啟動子的一個例子。種子特異性啟動子的例子包括但不限於表4中列出的種子特異性啟動子。
為了實現子葉相關的特徵，應該在子葉中優選在在子葉中優先表達的啟動子控制下發生(一種或多種)細胞分裂素氧化酶的表達。
應該清楚，儘管在實施例部分通過幾個新的AtCKX基因和蛋白質支持本發明，但是本發明概念也涉及從其它植物中分離和在其它植物中表達的其它細胞分裂素氧化酶的用途，優選在所述其它植物根和/或種子和/或子葉中分離和表達其它細胞分裂素氧化酶，以獲得如實施例部分中所述的類似作用。
因此，本發明更一般地涉及編碼植物細胞分裂素氧化酶或編碼降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸用於刺激根生長或用於增加側根或不定根形成或用於改變根向地性的用途。本發明也涉及編碼植物細胞分裂素氧化酶或編碼降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸用於增加種子大小和/或重量，或用於增加胚大小和/或重量，或用於增加植物子葉大小和/或重量的用途。編碼上述細胞分裂素氧化酶的核酸及下文所定義的本發明新的核酸編碼所用的優選細胞分裂素。
本發明涉及編碼新的具有細胞分裂素氧化酶活性的植物蛋白質的分離的核酸，所述核酸選自
(a)包含如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34或其互補序列中給出的DNA序列的核酸，
(b)包含與任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34或其互補序列對應的RNA序列的核酸，
(c)與如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34或其互補序列中給出的核酸特異性雜交的核酸，
(d)編碼具有胺基酸序列的蛋白質的核酸，所述胺基酸序列包含如在SEQ ID NO32中給出的多肽，並且該胺基酸序列與SEQ ID NO4中給出的胺基酸序列至少70％相似，優選至少75％，80％或85％，更優選至少90％或95％，最優選至少99％相似，
(e)編碼具有胺基酸序列的蛋白質的核酸，該胺基酸序列與如在SEQ IDNO6中給出的胺基酸序列至少35％相似，優選37％，40％，45％，47％或50％相似，更優選55％，60％，65％，70％，75％或80％相似，最優選85％，90％或95％相似，
(f)編碼具有胺基酸序列的蛋白質的核酸，該胺基酸序列與如在SEQ IDNO10或35中給出的胺基酸序列至少35％相似，優選37％，40％，45％，47％或50％相似，更優選55％，60％，65％，70％，75％或80％相似，最優選85％，90％或95％相似，
(g)編碼包含如任一SEQ ID NOs4，6，10，32或35中給出的胺基酸序列的蛋白質的核酸，
(h)作為遺傳密碼結果，與任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，33或34中給出的核酸簡併的核酸或者與(a)到(g)任一個中所定義的核酸簡併的核酸，
(i)由於生物體間密碼子使用的差異，與編碼如任一SEQ ID NOs4，6，10或35中給出的蛋白質的核酸不同的核酸或與如在(a)到(g)任一個中所定義的核酸不同的核酸，
(j)由於等位基因間的差異而不同的編碼如在SEQ ID NOs4，6，10或35中給出的蛋白質的核酸，或如在(a)到(g)中所定義的核酸，
(k)編碼如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34中給出的核酸編碼的細胞分裂素氧化酶的免疫活性片段的核酸，或者如在(a)到(j)中任一個所定義的核酸的免疫活性片段，
(l)編碼如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34中給出的核酸編碼的細胞分裂素氧化酶功能性片段的核酸，或者如在(a)到(j)任一個中所定義的核酸的功能性片段，其中所述片段具有細胞分裂素生物學活性，和
(m)編碼如在SEQ ID NOs4，6，10或35中所定義蛋白質的核酸，
條件是所述核酸不是如下面任何一個Genbank記錄號所存放的核酸AC005917，AB024035和AC023754。
本發明也涉及本發明分離的核酸，該核酸是DNA，cDNA，基因組DNA或合成DNA，或用U置換T的RNA。
本發明也涉及至少15個核苷酸長度的核酸分子，該核酸分子特異地雜交或特異地擴增本發明的核酸。
不同的細胞分裂素形式可能在不同發育過程中起不同的作用。因此，CKX1，CKX2，CKX3和CKX4的不同作用可能與對不同細胞分裂素混合物的不同作用有關。例如CKX1和CKX3大多數促進根伸長和分支，而CKX2和CKX4主要刺激不定根形成。此外，CKX1和CKX3比CKX2和CKX4增加種子大小和重量的程度大。不被特定的作用方式所束縛，這種對於細胞分裂素混合物的差別的作用可能由底物特異性的一些差異或細胞分裂素氧化酶在細胞中差別區室化所引起(預測對於CKX1和CKX3是線粒體，而對於CKX2，CKX4，CKX5，和CKX6是細胞外)。
根據另一個實施方式，本發明也涉及包含本發明核酸的載體。在優選實施方式中，所述載體是表達載體，其中核酸可操作地與一個或多個控制序列連接，該控制序列使得所述序列能夠在原核生物和/或真核生物宿主細胞中表達。
應該理解，為了對於本發明細胞分裂素氧化酶基因在單子葉植物中表達，應當使用對應於cDNA序列的核酸序列以避免單子葉植物中內含子的錯誤剪接(mis-splicing)。優選的在單子葉植物中表達的cDNA序列有如在SEQ ID NOs25到30和34的任一個中表示的核酸序列。
本發明也涉及含有任何本發明核酸分子或載體的宿主細胞。所述宿主細胞選自細菌、昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
本發明另一個實施方式涉及本發明核酸可編碼的分離的多肽，或其同系物或衍生物，或其免疫活性或功能片段。本發明優選的多肽包含如在任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，32和35中表示的胺基酸序列，或其同系物或衍生物，或其免疫活性和/或功能性片段。在甚至更優選的實施方式中，本發明涉及具有如在任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中給出的胺基酸序列的多肽，或其同系物或衍生物，或其免疫活性和/或功能性片段。其優選的功能性片段是無它們信號肽的那些片段。
根據另一個實施方式，本發明涉及產生本發明多肽的方法，包括在允許多肽表達的條件下培養本發明宿主細胞，和從培養物回收產生的多肽。
本發明也涉及特異性識別本發明多肽或其特異性表位的抗體。
本發明進一步涉及轉基因植物、植物細胞或植物組織的生產方法，包括以可表達形式或本發明載體向所述植物、植物細胞或植物組織中引入本發明核酸分子。
本發明也涉及改變的植物、植物細胞或植物組織的生產方法，包括將本發明多肽直接引入所述植物的細胞、組織或器官。
根據另一個實施方式，本發明涉及實現本發明多肽表達的方法，包括向植物細胞基因組中穩定引入可操作連接一個或多個控制序列的本發明核酸分子或本發明載體。本發明進一步涉及上述的方法，進一步包括從所述植物細胞再生植物。
本發明也涉及包含本發明核酸序列的轉基因植物細胞，本發明核酸序列可操作地連接調節元件，該調節元件允許所述核酸在植物細胞中轉錄和/或表達；或者通過上述方法可獲得的轉基因植物細胞。
根據另一個優選實施方式，本發明涉及上述的轉基因植物細胞，其中本發明核酸穩定地整合進入所述植物細胞的基因組中。
本發明進一步涉及包含這裡所述植物細胞的轉基因植物或植物組織，也涉及所述轉基因植物的可收穫部分，可收穫部分優選選自種子、葉、果實、莖培養物、根、塊莖、根莖和鱗莖。本發明還涉及來自任何所述轉基因植物或植物部分的後代。
根據另一實施方式，本發明涉及刺激根生長的方法，包括本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
在本發明的另一方面，提供了增加種子大小和/或重量的方法。該方法包括增加植物中細胞分裂素氧化酶的水平或活性或者增加降低植物或植物部分，優選種子中活性細胞分裂素水平的蛋白質的水平或活性。
也可以增加種子不同部分(器官)諸如、例如胚、胚乳、種皮或糊粉的大小和/或重量。例如，根據本發明，提供了增加胚大小和/或重量的方法。該方法包括增加植物中細胞分裂素氧化酶的水平或活性或者增加降低植物或植物部分，優選胚中活性細胞分裂素水平的蛋白質的水平或活性。
本發明的另一方面，提供了增加子葉大小和/或重量的方法。該方法包括增加植物中細胞分裂素氧化酶的水平或活性或者增加降低植物或植物部分，優選子葉中活性細胞分裂素水平的蛋白質的水平或活性。
根據增加種子大小和/或重量的方法，導致幼苗生長速度的增加或早期活力的增加。也獲得了產量的增加。相似地，根據增加胚大小和/或重量，或子葉大小和/或重量的方法，導致幼苗生長速度的增加或早期活力的增加。在許多情況下，也獲得產量的增加。幼苗生長或早期活力的增加常常與增加的脅迫耐受性有關。例如，幼苗、包括發芽後幼苗根系的較快發育對於特別是在逆境條件如乾旱下的生存至關重要。
可以在本發明方法中利用編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的多肽的任何核苷酸序列。例如，這裡提供的編碼具有分裂素氧化酶活性的多肽的各種序列的任一序列都可以用在增加種子、胚、或子葉大小和/或重量的方法中。
優選地，產生表達如在SEQ ID NOs1，5，25，或27的任一中所述核酸或所述核酸的直向同源物(Ortholog)的轉基因植物。優選地，該直向同源物來源於轉基因植物的相關物種。甚至更優選地，直向同源物對轉基因植物物種是特定的(天然或內源的)。
如上所述，特異地或優先地控制表達的啟動子可以用在本發明方法中。因此，當期望種子大小或重量增加時，可以利用種子特異性啟動子。當期望胚大小或重量增加時，可以利用胚特異性啟動子。當期望子葉大小或重量增加時，優選控制在子葉中表達的啟動子。這種啟動子是公知的、廣泛可獲得的並且在例如這裡表4中列出了這種啟動子。
在另一實施方式中，本發明涉及增加種子大小或種子重量或兩者的方法，所述方法包括本發明核酸的表達或包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
在再另一實施方式中，本發明涉及增加胚大小或重量或兩者的方法，該方法包括本發明核酸的表達或包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
在再另一實施方式中，本發明涉及增加子葉大小的方法，該方法包括本發明核酸的表達或包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。所述細胞分裂素氧化酶基因或其部分，或者降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的定位表達引起子葉增加的生長。在有子葉做為貯藏器官的物種中，這種子葉的增加生長引起了增加的產量和/或幼苗增加的生長性能。進一步，在該方面，碳水化合物、脂類和蛋白質都貯藏在種子中，並且在發芽期間代謝以提供植物早期生長期間的能量和代謝物。種子大小常常與早期活力相關，因為更大的種子含有更多的碳水化合物、脂類和蛋白蛋，並因此賦予更快的生長。因此，本發明的方法引起了幼苗的快速生長。這種早期活力與增加的脅迫耐受性有關。例如，植物根系統的較快發育對特別是逆境條件(如乾旱)下的生存至關重要。早期的活力也與增加的產量和縮短的到開花的時間有關。
植物細胞或培養物是人工產生的生長在特定培養基中的植物細胞或植物組織的培養物，該培養基是液體或固體，其提供給這些植物細胞或組織生長和/或產生一些化合物必需的所有必需物質。例如，植物細胞和/或組織培養物可以用於植物快速繁殖和轉基因植物的產生。在所述培養基中，對於一些外植體或在一些條件下，根形成可能是困難的，在所述培養植物細胞或組織中細胞分裂素氧化酶的表達可以用於增加根形成。植物細胞和/或組織培養物也可以用於有價值化合物的工業生長。可能的生產化合物是藥物、農藥、色素、化妝品、香料、食品添加劑等。這種產品的一個例子是紫草素，其通過植物紫草(Lithospermumerythrorhizon)的根產生。植物組織培養的一個例子是髮根培養物，其是人工產生的髮根團。大量收集紫草(L.erythrorhizon)的根是困難的，並且通過製備髮根培養物，可以以比正常情況更高的速率工業化製備最終產物紫草素。如這裡所公開的，細胞分裂素氧化酶的表達增加了根生長和發育，因此可以有利地用在所述植物細胞和組織培養方法中。因此，根據本發明的另一個實施方式，提供了刺激根生長和發育的方法，該方法包括在轉基因植物細胞或包含所述轉基因植物細胞的組織培養物中編碼植物細胞分裂素氧化酶，優選本發明細胞分裂素氧化酶的核酸的表達。
本發明還涉及增加側根和不定根形成的方法，該方法包括本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
本發明也涉及改變根向地性的方法，該方法包括改變本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
本發明也涉及增加早期活力和/或改變根/冠比率和/或改進對倒伏抗性和/或增加乾旱耐受性和/或促進外植體體外繁殖的方法，該方法包括本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
本發明還涉及增加根大小或根分生組織大小的方法，該方法包括本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分，優選根中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
根據另一實施方式，本發明涉及增加枝條分生組織大小的方法，該方法包括(優選在枝條中)本發明核酸表達的下調。
根據另一個優選實施方式，本發明涉及延遲葉衰老的方法，該方法包括在葉中，優選在衰老葉中任何一種本發明細胞分裂素氧化酶表達的下調。本發明也涉及改變葉衰老的方法，該方法包括在衰老葉中細胞分裂素氧化酶之一的表達。
本發明也涉及增加葉厚度的方法，該方法包括本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分，優選葉中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
本發明也涉及減小導管大小的方法，包括本發明核酸的表達或者包括降低植物或植物部分，優選導管中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
本發明還涉及增加導管大小的方法，該方法包括在植物或植物部分中本發明核酸表達的下調。
根據另一實施方式，本發明涉及改進幼苗直立性(standability)的方法，該方法包括本發明核酸的表達或包括降低幼苗中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
而且，本發明涉及上述方法的任一種方法，所述方法引起了產量的增加。
本發明還涉及本發明方法的任何一種方法，其中在強組成型啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。關於本發明對植物根有作用的那些方面，如，例如刺激根生長，增加側根或不定根形成，或者改變根向地性的方法，優選地，優選於在根中優先表達的啟動子控制下發生主題核酸的表達。在表5中，包括了非窮盡地列出的根特異性啟動子。用在本發明方法中優選的啟動子是根clavata同系物啟動子，其有如在SEQ ID NO36中給出的序列。
關於本發明對植物種子有作用的那些方面，如，例如增加種子大小或重量，胚大小或重量的方法，或者對植物子葉有作用的那些方面，如，增加子葉大小和重量的方法，主題核酸在優先在種子中表達的啟動子控制下進行表達。種子特異性啟動子可以是在所有種子器官中表達的啟動子或者對一個或多個器官或組織如胚、胚乳或糊粉顯示優先表達的啟動子。這裡，在表4中闡述了這種啟動子的例子。
根據另一個實施方式，本發明涉及修飾細胞命運和/或修飾植物發育和/或修飾植物形態學和/或修飾植物生物化學和/或修飾植物生理學和/或修飾細胞周期前進速率(progression rate)的方法，該方法包括本發明核酸在植物特定細胞、組織或器官中表達的修飾。
本發明也涉及在植物中獲得增加的生長，和/或增加的產量和/或植物細胞、組織和/或器官改變的衰老和/或增加的植物側生器官形成頻率的方法，該方法包括本發明核酸的異位表達。
本發明也涉及促進和延長逆境生長條件和/或脅迫情況下細胞中細胞分裂活性的方法，該方法包括本發明核酸序列的異位表達。
根據另一實施方式，本發明涉及鑑定和獲得與本發明多肽相互作用的蛋白質的方法，該方法包括利用本發明多肽的篩選試驗。
在更優選的實施方式中，本發明涉及鑑定和獲得與本發明多肽相互作用的蛋白質的方法，該方法包括使用本發明多肽作為餌，cDNA文庫作為捕獲物的雙雜交篩選試驗。
本發明進一步涉及調節本發明多肽和通過上述方法可獲得的相互作用蛋白質伴侶之間相互作用的方法。
在進一步實施方式中，本發明涉及鑑定和獲得與本發明多肽相互作用的化合物的方法，該方法包括步驟
a)提供本發明多肽和通過上述方法可獲得的相互作用的蛋白質伴侶的雙雜交系統，
b)將所述化合物和a)中所定義的表達多肽形成的複合物相互作用，和
c)進行所述化合物與所述多肽或a)中所定義的表達多肽形成的複合物相互作用的(實時)測定。
本發明還涉及鑑定與本發明多肽特異結合的化合物或化合物混合物的方法，包括
(a)將本發明的多肽與所述化合物或化合混合物在適於允許複合物形成的條件下混合，和
(b)檢測複合物形成，其中複合物的存在鑑定了與所述多肽特異結合的化合物或混合物。
本發明也涉及上述方法，其中所述化合物或混合物抑制本發明所述多肽的活性，並且可以用於化學試劑的合理設計。
根據另一實施方式，本發明涉及通過上述方法鑑定的化合物或混合物作為植物生長調節劑或除草劑的用途。
本發明也涉及植物生長調節劑或除草劑組合物的生產方法，該方法包括上述化合物篩選方法步驟和以適合形式配製從所述步驟獲得的化合物用於在農業或植物細胞或組織細胞中應用。
本發明也涉及增加分支的方法，包括在植物或植物部分，優選莖或腋芽中本發明核酸的表達。
本發明也涉及改進倒伏抗性的方法，該方法包括在植物或植物部分，優選莖或腋芽中本發明核酸的表達。
本發明也涉及促進生長的化學試劑或除草劑的設計或篩選方法，該方法包括本發明核酸或本發明載體的應用。
根據另一個實施方式，本發明涉及本發明核酸分子，本發明載體或本發明多肽用於增加產量的用途。
本發明也涉及本發明核酸分子、本發明載體或本發明多肽用於刺激根生長的用途。
本發明也涉及本發明核酸分子、本發明載體或本發明多肽用於增加側根或不定根形成的用途。
本發明也涉及本發明核酸分子、本發明載體或本發明多肽用於改變根向地性的用途。
本發明也涉及本發明核酸分子、本發明載體或本發明多肽用於增加種子大小、種子重量、胚大小、胚重量、子葉大小和子葉重量的至少之一的用途。
本發明也涉及本發明核酸分子、本發明載體或本發明多肽用於增加早期活力和/或用於改變根/冠比率和/或提高對倒伏抗性和/或增加乾旱耐受性和/或促進外植體的體外繁殖的用途。
本發明也涉及本發明核酸分子、本發明載體或本發明多肽用於修飾植物發育和/或用於修飾植物形態學和/或用於修飾植物生物化學和/或用於修飾植物生理學的用途。
根據另一個實施方式，本發明涉及診斷組合物，其包含至少本發明核酸分子，本發明載體，本發明多肽或本發明抗體。
本發明另一實施方式涉及轉基因砧木在與接穗(scion)嫁接以產生具有改進農學或園藝學特徵的植物或樹的過程中的應用，由於細胞分裂素氧化酶的表達，所述砧木有增加的根生長和發育。接穗可以是轉基因或非轉基因的。該實施方式設想的特定特徵是由根系統賦予的那些特徵，並且包括在土壤中植物/樹改進的固著和/或改進的水分吸收，例如引起改進的乾旱耐受性，和/或改進的從土壤的營養吸收和/或遍布整個植物的有機物改進的轉運和/或增加的物質分泌到土壤中諸如，例如植物含鐵細胞，和/或改進的呼吸作用和/或改進的疾病抗性和/或增加的產量。利用轉化AtCKX的砧木嫁接的優點，除了它們增加的根系外，是嫁接植物上葉片延遲的衰老，如這裡所公開的(參見圖12A)。用於這個特定實施方式的優選植物或樹木包括在它們自己的根上生長不好的植物或樹木，並且嫁接在載培背景(Cultivated Settings)中，如有商業利益的品種葡萄樹、柑橘，杏樹、扁桃、李子樹、桃樹、蘋果樹、梨樹、櫻桃樹、胡桃樹、無花果樹、榛樹和枇杷樹。
如上文所述，植物生長素和細胞分裂素在一些生物過程中起拮抗劑作用。例如，細胞分裂素/生長素比率調節根和枝條的產生，高濃度的植物生長素引起有組織的根，而高濃度的細胞分裂素引起枝條產生。如本發明所公開的，菸草和擬南芥(Arabidopsis)中細胞分裂素氧化酶的表達引起了與增加的植物生長素作用一致的增加的根發育。植物生長素也參與果實的發育。用植物生長素處理雌性花部分在一些植物物種中引起了單性果實的發育。通過在雌性繁殖器官中增加植物生長素合成，已經在幾種園藝作物植物中經基因工程改造了單性果實發育(WO0105985)。
因此，根據另一個實施方式，本發明涉及誘導植物單性性狀的方法，所述方法包括下調一種或多種細胞分裂素氧化酶或降低植物或植物部分中優選雌性繁殖器官如胎座、胚珠和由此來源的組織中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。提供在胎座和胚珠中高度表達特異性的來源於金魚草(Antirrhinum majus)的DefH9啟動子區域或其同系物之一可以用於該目的。
本領域技術人員將意識到這裡所述的本發明除了這些具體描述的以外，可以進行其它變通和修改。應該理解，這裡所述的本發明包括所有這種變通和修改。本發明也包括該說明書中單個或集合性地提到或指明的所有這種步驟、特徵、組合物和化合物，及任一或更多所述步驟或特徵的任一和所有聯合。
本發明可以應用於任何植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或草料豆科植物，觀賞植物，糧食作物，樹木或灌木，其選自金合歡屬(Acacia spp.)、槭樹屬(Acer spp.)、獼猴桃屬(Actinidia spp.)、七葉樹屬(Aesculus spp.)、紐西蘭貝殼衫(Agathis australis)、合歡屬(Albizia amara)、Alsophila tricolor、須芒草屬(Andropogonspp.)、花生屬(Arachis spp.)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、多小葉紅蘇木(Baikiaea plurijuga)、樺木屬(Betulaspp.)、芸苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬(Calliandra spp)、大葉茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒屬(Capsicum spp.)、決明屬(Cassia spp.)、Centroemapubescens、木瓜屬(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、變異小冠花(Coronillia varia)、栒子屬serotina(Cotoneaster serotina)、山楂屬(Crataegus spp.)、甜瓜屬(Cucumis spp.)、柏木屬(Cupressusspp.)、Cyathea dealbata、榲桲(Cydonia oblonga)、日本柳衫(Cryptomeria japonica)、香茅屬(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata，榲桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(Davalliadivaricata)、山馬蝗屬(Desmodium spp.)、粗糙蚌殼蕨(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogon amplectens、黎豆屬(Dioclea spp)、鐮扁豆屬(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、龍爪稷(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐屬(Erythrina spp.)、桉樹屬(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬(Fagopyrum spp.)、費約果(Feijoasellowiana)、草莓屬(Fragaria spp.)、千斤拔屬(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、銀樺屬(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪屬(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrheniarufa、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigoincarnata、鳶尾屬(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脈根屬(Lotus spp.)、Macrotylomaaxillare、蘋果屬(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicagosativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、Nicotianum spp.、驢食豆屬(Onobrychis spp.)、Ornithopusspp.、稻屬(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄屬(Petunia spp.)、菜豆屬(Phaseolusspp.)、檳榔竹(Phoe nix canariensis)、Phormium cookianum、石楠屬(Photinia spp.)、白雲杉(Picea glauca)、松屬(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、紐西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、歐洲醋慄(Ribes grossularia)、茶藨子屬(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬(Rosa spp.)、懸鉤子屬(Rubusspp.)、柳屬(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬(Tadehagi spp.)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬(Trifolium spp.)、小麥屬(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsugaheterophylla)、越橘屬(Vaccinium spp.)、野豌豆屬(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗活森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、莧、朝鮮薊、蘆筍、嫩莖花椰芽、抱子甘藍、甘藍、芸苔、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍綠、亞麻、羽衣甘藍、扁豆、油籽油菜、黃秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西紅柿、南瓜和茶，等等，或上述具體列舉的任何植物的種子或任一個上述物種的組織、細胞或器官培養物。
在整個說明書中，除非上下文有另外的要求，文字「包含」、「包括」和「含有」將理解為意思是包括所述實體或步驟，或實體或步驟組，但不排除其它任何實體或步驟，或實體或步驟組。
如這裡所用，術語「來源於」應該理解為意指來源於特定物種的特定實體或實體組，但不必直接從該特定來源獲得。
這裡使用的術語「蛋白質」、「肽」或「寡肽」指任何長度的聚合形式的胺基酸。所述術語也包含已知胺基酸修飾諸如二硫鍵形式、半胱氨酸化、氧化、穀胱甘肽化、甲基化、乙醯化、法尼基化、生物素化、硬脂醯化、甲醯化、硫辛酸添加、磷酸化、硫酸化、遍在蛋白化、肉豆寇醯化、棕櫚醯化、牻牛兒基牻牛兒基化、環化(例如，焦穀氨酸形成)、氧化、脫醯胺、脫水、糖基化(例如，戊糖、己糖胺、N-乙醯己糖胺、脫氧己糖、己糖、唾液酸等)和醯化作用及非天然存在的胺基酸殘基，L-胺基酸殘基和D-胺基酸殘基。
本發明蛋白質的「同系物」是與和它們是同系物的所述蛋白質相比，包含胺基酸置換、缺失和/或添加，但不改變它的一種或多種功能特性，特別是不降低作為結果的活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶。例如，所述蛋白質的同系物將由所述蛋白質的生物活性胺基酸序列變異體組成。為了產生這種同系物，可以通過其它具有類似特性，例如疏水性、親水性、疏水力矩(hydrophobic moment)、抗原性、形成或破壞α-螺旋結構或β-片層結構的傾向特性等的胺基酸置換所述蛋白質中存在的胺基酸。胺基酸物理化學特性的概述在表1中給出。
本發明蛋白質的置換變異體是除去所述蛋白質胺基酸序列中至少一個殘基並在它的位置插入不同殘基的變異體。胺基酸置換通常是單個殘基，但是根據對該多肽的功能性限制因素，其可以是成簇的殘基；插入通常是約1-10胺基酸殘基，缺失的範圍將是約1-20殘基。優選地，胺基酸置換將包含保守性胺基酸置換，如上文所述胺基酸置換。
表1 天然存在的胺基酸的特性電荷特性/疏水性側鏈胺基酸非極性的疏水的脂肪族脂肪族，含S芳香族亞氨基ala，ile，leu，valmetphe，trppro極性不帶電荷脂肪族醯胺芳香族羥基巰基glyasn，glntyrser，thrcys帶正電荷鹼性arg，his，lys帶負電荷酸性asp，glu
本發明蛋白質插入的胺基酸序列變異體是在所述蛋白質預先確定的位點引入一個或多個胺基酸殘基的變異體。插入可以包含氨基末端和/或羧基末端融合及單或多個胺基酸的序列內插入。通常，胺基酸序列內的插入比氨基或羧基末端融合要少，約1到10個殘基。氨基-或羧基-末端融合蛋白質或肽的例子包含在雙雜交系統中所用的轉錄激活蛋白的結合域或激活域、噬菌體外被蛋白、(組氨酸)6-標記，谷光甘肽S-轉移酶、蛋白質A、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位(EETARFQPGYRS)、c-myc表位(EQKLISEEDL)、FLAG-表位(DYKDDDK)，lacZ，CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白質C表位(EDQVDPRLIDGK)和VSV表位(YTDIEMNRLGK)。
本發明蛋白質缺失變異體特徵在於從所述蛋白質胺基酸序列除去一個或多個胺基酸。
利用本領域公知的肽合成技術，如固相多肽合成等或者通過重組DNA操作可以容易地製備本發明蛋白質的胺基酸變異體。產生表現為置換、插入或缺失變異體的變異蛋白質的DNA序列操作是本領域公知的。例如，在具有已知序列的DNA中的預定位點進行置換突變的技術是本領域技術人員公知的，如通過M13誘變、T7-Gen體外誘變試劑盒(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導的定點誘變或其它定點誘變方法。
在本發明中，用本領域已知的電腦程式諸如DNAstar/MegAlign程序結合Clustal方法計算DNA序列和/或蛋白質之間的「同一性」和/或「相似性」百分數。
本發明蛋白質的「衍生物」是包含所述多肽至少約5個鄰接胺基酸殘基，但保留所述蛋白質生物活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶。與所述多肽天然存在形式的胺基酸序列比較，「衍生物」可以進一步包含另外天然存在、改變的糖基化、醯化或非天然存在的胺基酸殘基。作為可替代方案或此外，與所述多肽天然存在形式的胺基酸序列比較，衍生物可以包含一個或多個非胺基酸取代基，例如共價或非共價連接胺基酸序列的報導分子或其它配體，如，例如與之結合的報導分子有利於它的檢測。
「免疫活性」意指分子或其特定片段，如特定表位或半抗原被抗體識別，即結合。例如，利用Geysen等(1996)(Geysen，H.M.，Rodda，S.J.和Mason，T.J.(1986).模擬不連續抗原決定簇的肽的先驗描述，Mol.Immunol.23，709-715.)中所述的肽掃描技術可以確定特定表位。
術語「序列片段」或「序列部分」意指所提到的原始序列截短的序列。被截短的序列(核酸或蛋白質序列)長度可以廣泛變化；最小大小是足以提供給該序列至少與提到的原始序列相當的功能和/或活性的大小的序列(例如「功能性片段」)，而最大大小不是至關重要的。在一些應用中，最大大小常常不比提供原始序列期望活性和/或功能需要的大小顯著大。典型地，截短的胺基酸序列長度範圍將是約5到約60個胺基酸。更典型地，然而，該序列最大具有約50個胺基酸長度，優選，最大約60個胺基酸殘基的長度。通常，期望選擇至少約10，12或15個胺基酸，多到最大約20或25個胺基酸的序列。
功能性片段也可以包含含有對本發明蛋白質特異的表位的片段。優選的功能性片段有至少，例如5，10，25，100，150或200個胺基酸的長度。
因此，應該理解功能性片段也可以是免疫活性片段或不是。
在本發明上下文中具體包含上文所述細胞分裂素氧化酶的同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能性片段。考慮用在本發明中的特別優選的細胞分裂素氧化酶蛋白質的同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能性片段來源於植物，更具體來源於擬南芥(Arabidopsis thaliana)(At)CKX，或者具有在其中表達的能力。本發明清楚地考慮了AtCKX蛋白質的功能性同系物或衍生物和/或免疫活性片段的用途，並且在應用上，本發明不限於編碼所述AtCKX蛋白質之一的核苷酸序列的用途。
任何所述蛋白質、多肽、肽和其片段都可以在生物系統，例如細胞培養物中產生。作為可替代方案，例如通過固相多肽合成，可以化學製備任何所述蛋白質、多肽、肽和其片段。所述蛋白質或其片段可以是融合蛋白質的部分，在例如雙雜交測定法中就是這種情況，該雙雜交測定法能夠鑑定與本發明細胞分裂素氧化酶相互作用的蛋白質。
蛋白質或其片段還有，例如調節本發明細胞分裂素氧化酶和通過本發明方法獲得的相互作用蛋白質伴侶之間相互作用的用途。化學合成的肽，例如作為用於抗血清和/或抗體產生的抗原源特別有用。
「抗體」包含單克隆、多克隆、合成或重鏈camel抗體及如Fab、Fv或scFv片段等的抗體片段。可以通過在例如Liddle和Cryer(1991)中所述的技術製備單克隆抗體，其包含小鼠骨髓瘤細胞和來源於免疫動物的脾臟細胞的融合。而且，可以通過利用在例如Harlow和Lane(1988)中所述的方法獲得針對分子或其片段的抗體或其片段。在針對小肽，如本發明蛋白質的片段的抗體的情況下，在動物免疫前，所述肽通常與載體蛋白質偶聯。這種蛋白質載體包括匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白和破傷風毒素。載體蛋白質增強動物的免疫應答和提供T細胞受體結合位點的表位。術語「抗體」還包括其衍生物如標記的抗體。抗體標記包括鹼性磷酸酶、PKH2、PKH26、PKH67、螢光素(FITC)、Hoechst33258、R-藻紅蛋白(PE)、羅丹明(TRITC)、Quantum Red、Texas Red、Cy3、生物素、瓊脂糖、過氧化物酶和金球體。根據抗蛋白質抗體的分子生物學工具包括蛋白質凝膠印跡分析、允許基因鑑定的表達文庫篩選，蛋白質定量方法包括ELISA和RIA，蛋白質的免疫親和純化，蛋白質的免疫沉澱(參見，例如實施例6)和免疫定位。抗體，尤其是肽抗體的其它用途包括蛋白酶解加工研究(Loffler等，1994，Woulfe等，1994)，蛋白質活性位點的測定(Lerner 1982)，前體或翻譯後加工的研究(Baron和Baltimore 1982，Lerner等，1981，Semier等，1982)，涉及蛋白質-蛋白質相互作用的蛋白質結構域的鑑定(Murakami等，1992)和基因表達中外顯子使用的研究(Tamura等，1991)。
本發明中具體包括是特異識別上文所述細胞分裂素氧化酶或其同系物、衍生物或片段的抗體。優選地，所述細胞分裂素氧化酶是植物細胞分裂素氧化酶、更具體是擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶(AtCKX)之一。
術語「基因」、「多核苷酸」、「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「核酸分子」用在這裡指任何長度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或是脫氧核糖核苷酸或者兩者的聯合。所述的術語還包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。所述術語也包括已知的核苷酸修飾，如甲基化，環化和「帽結構」和用類似物如肌苷置換一個或多個天然存在的核苷酸。核苷酸的修飾包括添加吖啶、胺、生物素、cascade blue、膽固醇、Cy3、Cy5、Cy5.5Dabcyl、地高辛配基、二硝基苯酚基、Edans、6-FAM、螢光素、3′-甘油基、HEX、IRD-700、IRD-800、JOE、磷酸補骨脂素、羅丹明、ROX、巰基(SH)、間隔區、TAMRA、TET、AMCA-S、SE、BODIPY、Marina Blue、Pacific Blue、Oregon Green、Rhodamine Green、Rhodamine Red、Rhodol Green和Texas Red。多核苷酸骨架修飾包括甲基膦酸酯、2′-OMe-甲基膦酸酯RNA、硫代磷酸酯、RNA、2′-OMeRNA。鹼基修飾包括2-氨基-dA、2-氨基嘌呤、3′-(ddA)、3′dA(蛹蟲草菌素)、7-脫氮-dA、8-Br-dA、8-氧代-dA、N6-Me-dA、脫鹼基位點(dSpacer)、生物素dT、2′-OMe-5Me-C、2′-OMe-炔丙基-C、3′-(5-Me-dC)、3′-(ddC)、5-Br-dC、5-I-dC、5-Me-dC、5-F-dC、羧基-dT、可轉換的dA、可轉換的dC、可轉換的dG、可轉換的dT、可轉換的dU、7-脫氮-dG、8-Br-dG、8-氧代-dG、O6-Me-dG、S6-DNP-dG、4-甲基-吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe-肌苷、2′-dI、O6-苯基-dI、4-甲基-吲哚、2′-脫氧水粉草素、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、dP(嘌呤類似物)、dK(嘧啶類似物)、3-硝基吡咯、2-硫代-dT、4-硫代-dT、生物素-dT、羧基-dT、O4-Me-dT、O4-三唑dT、2′-OMe-炔丙基-U、5-Br-dU、2′-dU、5-F-dU、5-I-dU、O4-三唑dU。所述術語也包括肽核酸(PNAs)，一種DNA類似物，其中骨架是假肽，由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元而不是糖組成。PNAs模擬DNA的行為並且結合互補的核酸鏈。PNA的中性主鏈比正常鏈達到的結合和特異性產生了更強的結合和更大的特異性。此外，已經利用了PNA獨特的化學、物理和生物學特性以產生有力的生物分子工具，反義和反基因試劑，分子探針和生物傳感器。
有利地，本發明也提供了本發明核酸至少約15個鄰接核苷酸，優選15到50個核苷酸的核酸序列。有利地，這些序列可以用作特異雜交上述本發明序列的探針，或用作起始上述本發明序列特異擴增或複製的引物等等。可以根據本領域公知的技術，如通過重組或合成方法產生這種核酸序列。它們可以用在診斷試劑盒等中用於檢測本發明核酸的存在。一般地，這些試驗包括在雜交條件下，用樣品接觸探針，檢測探針和樣品中任何核酸之間任何雙螺旋或三螺旋形成的存在。
有利地，可以利用這種重組或合成方法，如，例如利用PCR克隆機理產生本發明核酸序列，所述PCR機理一般包括製備引物對，該引物對可以是期望克隆基因區域的約15到50個核苷酸，使引物與細胞mRNA，cDNA或基因組DNA接觸，在引起期望區域擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應，分離擴增的區域或片段，並回收擴增的DNA。一般地，這裡所述的這種技術是本領域公知的，如描述在Sambrook等(分子克隆實驗室指南，1989)。
「編碼序列」或「開放讀框」或「ORF」定義為當將其置於適合的控制序列或調節序列控制下時，即，當所述編碼序列或ORF以可表達形式存在時，可以轉錄為mRNA和/或翻譯為多肽的核苷酸序列。所述ORF編碼序列被5』翻譯起始密碼子和3』翻譯終止密碼子所限制。ORF或編碼序列可以包含，但不限於RNA、mRNA、cDNA，重組核苷酸序列，合成製備的核苷酸序列或基因組DNA。所述的ORF或編碼序列可以通過間插核酸序列間斷。
基本編碼相同蛋白質，但是從不同來源分離的基因和編碼序列可以由實質上相異的核酸序列組成。相互地，可以設計實質上相異的核苷酸序列以實現基本相同蛋白質的表達。這種核酸序列是，例如已經基因不同等位基因的存在，遺傳密碼簡併或密碼子使用差異的結果。因此，如表2所示，甲硫氨酸和色氨酸由單個密碼子編碼，而其它胺基酸如精氨酸、亮氨酸和絲氨酸可以分別由多達6種不同密碼子翻譯而成。在表3中示例了用於根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(細菌)，擬南芥(A.thaliana)，M.sativa(兩種雙子葉植物)和水稻(Oryza sativa)(單子葉植物)的優選密碼子使用的差異。為了摘錄一個例子，密碼子GGC(對於甘氨酸)是根瘤農桿菌(A.tumefaciens)中最常用的密碼子(36.2‰)，是水稻(O.sativa)中第二最常用的密碼子，但是其在擬南芥(A.thaliana)和M.sativa中使用的頻率低得多(分別為9‰和8.4‰)。編碼甘氨酸的4種可能密碼子中(參見表2)，所述GGC密碼子最優選在根瘤農桿菌(A.tumefaciens)和水稻(O.sativa)中使用。然而，在擬南芥(A.thaliana)中，這是GGA(和GGU)密碼子，而在M.sativa中，這是GGU(和GGA)密碼子。
可以通過間插序列間斷本發明DNA序列。「間插序列」意指任何核酸序列，其中斷包含所述本發明DNA序列的編碼序列或其中斷包含所述本發明DNA序列的DNA序列可表達形式。間插序列的去除恢復所述編碼序列或所述可表達形式。
間插序列的例子包括內含子和可移動的DNA序列，如轉座子。「可移動DNA序列」意指可以作為重組事件結果而移動的任何DNA序列。
表2 遺傳密碼的簡併胺基酸3字母密碼 一字母 密碼 可能的密碼子丙氨酸Ala A GCA GCC GCG GCU精氨酸Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU天冬醯胺Asn N AAC AAU天冬氨酸Asp D GAC GAU半胱氨酸Cys C UGC UGU穀氨酸Glu E GAA GAG穀氨醯胺Gln Q CAA CAG甘氨酸Gly G GGA GGC GGG GGU組氨酸His H CAC CAU異亮氨酸Ile I AUA AUC AUU亮氨酸Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU賴氨酸Lys K AAA AAG甲硫氨酸Met M AUG苯丙氨酸Phe F UUC UUU脯氨酸Pro P CCA CCC CCG CCU絲氨酸Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸Thr T ACA ACC ACG ACU色氨酸Trp W UGG酪氨酸Tyr Y UAC UAU纈氨酸Val V GUA GUC GUG GUU可能的″終止″密碼子UAAUAG UGA
表3 不同生物體中顯示的密碼子使用，
表示為每1000個密碼子的頻率(http//www.kazusa.or.jp/codon) 密碼子 根瘤農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) 擬南芥 (Arabidopsis thaliana) 紫花苜蓿 (Medicago sativa) 水稻 (Oryza sativa) UUU 13.9 22.5 24.1 11.3 UUC 24.3 20.7 16.9 26.3 UUA 3.5 12.9 10.4 4.7 UUG 13.2 21.0 22.4 11.8 UCU 7.0 24.6 19.8 10.1 UCC 14.8 10.8 7.7 16.9 UCA 7.4 17.8 17.2 9.7 UCG 18.2 8.9 3.2 10.8 UAU 12.3 15.2 16.6 9.2 UAC 10.3 13.7 14.0 20.6 UAA 0.9 0.9 1.2 0.9 UAG 0.6 0.5 0.8 0.8 UGU 3.0 10.8 10.6 5.0 UGC 7.4 7.2 5.8 14.3 UGA 1.8 1.0 0.8 1.3 UGG 12.2 12.7 10.0 12.8 CUU 19.1 24.3 28.3 14.6 CUC 25.7 15.9 12.0 28.0 CUA 5.2 10.0 8.8 5.7 CUG 31.6 9.9 8.5 22.1 CCU 7.7 18.3 23.2 11.8 CCC 10.6 5.3 5.3 12.5 CCA 8.9 16.1 22.6 12.2 CCG 20.7 8.3 3.6 16.7 CAU 10.6 14.0 14.6 9.2 CAC 9.1 8.7 9.1 14.6 CAA 11.2 19.7 23.2 11.9 CAG 24.9 15.2 12.3 24.6 CGU 12.2 8.9 10.1 6.8 CGC 25.5 3.7 4.2 15.9 CGA 8.2 6.2 4.2 4.2 CGG 13.2 4.8 1.8 9.7 AUU 15.4 22.0 29.4 13.8 AUC 36.9 18.5 14.7 25.5 AUA 6.2 12.9 11.7 7.2 AUG 24.7 24.5 21.7 24.4 ACU 6.4 17.8 20.8 10.3 ACC 20.9 10.3 11.7 18.6 ACA 9.1 15.9 18.9 10.0 ACG 18.8 7.6 2.8 10.8 AAU 13.5 22.7 25.0 12.9 AAC 18.7 20.9 18.7 25.1 AAA 13.6 31.0 32.2 12.0 AAG 24.4 32.6 35.1 39.4 AGU 5.7 14.0 12.6 7.3 AGC 15.8 11.1 8.8 16.9 AGA 5.3 18.7 13.6 7.7 AGG 6.5 10.9 11.7 14.9 GUU 16.6 27.3 34.7 15.0 GUC 29.3 12.7 9.9 22.8 GUA 6.1 10.1 10.0 5.7 GUG 19.7 17.5 16.5 25.0 GCU 17.4 28.0 34.6 19.8 GCC 35.8 10.3 11.4 33.2 GCA 19.5 17.6 25.9 15.6 GCG 31.7 8.8 3.4 25.3 GAU 25.8 36.8 40.0 21.5 GAC 28.0 17.3 15.5 31.6 GAA 29.9 34.4 35.9 17.1 GAG 26.3 32.2 27.4 41.1 GGU 16.5 22.2 28.7 16.3 GGC 36.2 9.0 8.4 34.7 GGA 12.5 23.9 27.3 15.0 GGG 11.3 10.2 7.4 16.6
「雜交」是基本同源互補的核苷酸序列相互退火的過程。雜交過程可以完全在溶液中發生，即，兩個互補核酸序列都在溶液中。根據這種過程的分子生物學工具包括PCR、扣除雜交和DNA序列測定。將互補核酸序列之一固定到基質如磁珠、Sepharose珠和任何其它樹脂上也可以發生雜交過程。根據這種過程的分子生物學工具包括poly(A+)mRNA的分離。互補核酸之一固定到固相支持體，如硝酸纖維素或尼龍膜，或者通過例如光刻法固定到例如矽質玻璃支持體也可以發生雜交過程(後者稱為核酸陣列或微陣列或稱為核酸晶片)。根據這種過程的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析，菌落雜交、噬菌斑雜交和微陣列雜交。為了允許雜交發生，通常熱或化學(例如，通過NaOH)變性核酸分子解鏈雙鏈成為兩個單鏈和/或從單鏈核酸除去髮夾或其它二極結構。雜交的嚴格性受條件，如溫度、鹽濃度和雜交緩衝液組成的影響。高嚴格性的雜交條件包括高溫和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和Na3-檸檬酸鹽)和/或雜交緩衝液中包含甲醯胺和/或雜交緩衝液中降低的化合物如SDS(去汙劑)濃度和/或從雜交緩衝液中排除化合物，如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇(促進分子聚集)。例如，在Sambrook等，(1989)中描述了常規的雜交條件，但是本領域技術人員將理解可以根據已知或期望同源性和/或核酸序列的長度設計大量不同的雜交條件。特別優選嚴格性足夠低的雜交條件分離與上文所述本發明DNA序列異源的核酸。引起上述異源性的因素包括上文所述等位性、遺傳密碼的簡併性和優選密碼子使用的差異。
術語「特異性雜交」或「特異雜交」指當序列存在於複雜混合物，例如總細胞DNA或RNA中時，分子與該特定核苷酸序列在中等到嚴格雜交條件下結合、形成雙螺旋或雜交。
在核酸雜交試驗如Southern和Northern雜交的上下文中「嚴格性雜交條件」和「嚴格性雜交衝洗條件」依賴於序列，並且它們在不同環境參數下不同。例如，較長序列在較高溫度特異性雜交。Tm是限定離子強度和pH下的溫度，在該溫度50％靶序列與完全匹配的探針雜交。典型地，特異性是雜交後衝洗的函數。這種衝洗的至關重要因素包括終衝洗溶液的離子強度和溫度。
一般地，在限定離子強度和pH情況下，選定嚴格性條件為比特定序列熱解鏈溫度(Tm)低約50℃。Tm是(限定離子強度和pH條件下)50％靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。Tm依賴於溶液條件和探針的鹼基組成，可以利用下面公式計算
Tm＝79.8℃+(18.5×Log[Na+])+(58.4℃×％[G+C])
-(820/雙螺旋中的#bp)-(0.5×％甲醯胺)
更優選的嚴格性條件是溫度在Tm以下20℃時，最優選的嚴格性條件是溫度在Tm以下10℃時。利用大量已知技術中任何一種技術，如，例如用含有蛋白質的溶液封閉膜、向雜交緩衝液添加異源RNA、DNA和SDS和用RNase處理也可以控制非特異性結合。
典型地，在嚴格性條件或該條件以下進行衝洗條件。一般地，上文闡述了核酸雜交測定或基因擴增檢測的適合的嚴格性條件。也可以選擇或多或少嚴格性條件。
為了限定嚴格性水平的目的，可以方便地參考參考文獻Sambrook，J.，E.F.Fritsch，等，1989「分子克隆實驗室指南，第二版，ColdSpring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，11.45。低嚴格性條件的例子是4-6X SSC/0.1-0.5％w/v SDS，在37℃-45℃，進行2-3小時。根據參與雜交的核酸來源和濃度，可以利用可替代的嚴格性條件，如中等嚴格性條件。中等嚴格性條件的例子包括1-4X SSC/0.25％w/v SDS，在≥45℃，進行2-3小時。高嚴格性條件的例子包括0.1-1XSSC/0.1％w/v SDS，在60℃，進行1-3小時。本領域技術人員知道雜交和衝洗期間可以改變的各種參數，並且這些參數或者維持或者改變嚴格性條件。例如，另一個嚴格性條件是在65℃，4X SSC雜交，接著在65℃，0.1X SSC中洗滌約1小時。做為可替代方案，示例的嚴格性雜交條件是在42℃，50％甲醯胺，4XSSC中。嚴格性條件的另一個例子包括在62℃，6X SSC，0.05X BLOTTO中雜交和在62℃，2X SSC，0.1％SDS中洗滌。
清楚地，本發明包括了以上定義的編碼細胞分裂素氧化酶、其同系物、衍生物或免疫活性和/或功能性片段的本發明DNA序列在任何雜交方法中的用途。而且，本發明也涉及與所述本發明DNA序列雜交的DNA序列。優選地，細胞分裂素氧化酶是植物細胞分裂素氧化酶，更具體是擬南芥(Arabidopsis thaliana)(At)CKX。
為了實現蛋白質在優選植物來源的細胞、組織或器官中的表達，或者通過例如微注射或轟擊方法可以將蛋白質直接引入所述細胞，或者作為可替代方案，可以以可表達形式將編碼所述蛋白質的分離的核酸分子引入所述細胞、組織或器官。
優選地，本發明DNA序列包含上文定義的編碼細胞分裂素氧化酶蛋白質或其同系物或衍生物或其免疫活性和/或功能性片段的編碼序列或開放讀框(ORF)。本發明優選的蛋白質包含所述細胞分裂素氧化酶的胺基酸序列。優選地，所述細胞分裂素氧化酶是植物細胞分裂素氧化酶，並且更具體地是擬南芥(Arabidopsis thaliara)(At)CKX。
「載體」或「載體序列」意指可以通過轉化引入生物體的DNA序列，並且可以在所述生物體中穩定維持它。在，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)，根瘤農桿菌(A.tumefaciens)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的培養物中載體維持是可能的。可以在細菌和/或病毒中維持和繁殖其它載體如噬菌粒和粘粒。一般地，載體序列包含一組限制酶識別的唯一位點，多個克隆位點(MCS)，其中可以插入一個或多個非載體序列。
「非載體序列」相應地意指在包含在載體內一個或多個MCS的位點整合的DNA序列。
「表達載體」形成載體的亞組，由於包含適合的調節或控制序列，其能夠產生插入的非載體序列的可表達形式，因此允許所述非載體序列編碼的蛋白質表達。表達載體是本領域已知的，其能使蛋白質在生物體，包括細菌(例如大腸桿菌(E.coli))、真菌(例如釀酒酵母(S.cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(S.pombe)，巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris))、昆蟲細胞(例如杆狀病毒表達載體)、動物細胞(例如，COS或CHO細胞)和植物細胞(例如，基於馬鈴薯病毒X的表達載體)中表達。
清楚地，本發明包含上文所述任何細胞分裂素氧化酶、其同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能性片段。優選地，所述細胞分裂素氧化酶是植物細胞分裂素氧化酶、更具體地是擬南芥(Arabidopsis thaliana)(At)CKX。
作為生物系統中表達載體介導的蛋白質產生的可替代方案，可以應用化學蛋白質合成。可以在液相中或固相中製備合成的肽。然而，固相肽合成(Merrifield 1963)是最常用的方法，包括順序添加胺基酸以產生線性肽鏈。固相肽合成包括3個步驟的循環(i)將成長中肽鏈的羧基末端胺基酸固定到固相支持體或樹脂；(ii)鏈組裝，該過程包括待添加到成長鏈的胺基酸的激活，偶聯和去保護；和(iii)切割，包括從樹脂移下完整的肽鏈和從胺基酸側鏈去除保護基團。固相肽合成的通常方法包括Fmoc/tBu(9-芴基甲氧羰基/叔丁基)和Boc(叔丁氧羰基)用作胺基酸氨基末端保護基。胺基酸側鏈保護基團包括甲基(Me)、甲醯(CHO)、乙基(Et)、乙醯基(Ac)、叔丁基(t-Bu)、茴香基、苄基(Bzl)、三氟乙醯基(Tfa)、N-羥基琥珀醯亞胺(ONSu，OSu)、苯甲醯基(Bz)、4-甲苄基(Meb)、硫代茴香基、硫代羥甲苯基、苄氧基甲基(Bom)、4-硝基苯基(ONp)、苄氧基羰基(Z)、2-硝基苯甲醯(NBz)、2-硝基苯基巰基(Nps)、4-甲苯磺醯(Tosyl，Tos)、五氟苯基(Pfp)、二苯甲基(Dpm)、2-氯苄氧基羰基(Cl-Z)、2，4，5-三氯苯基、2-溴苄氧基羰基(Br-Z)、三苯甲基(Trityl，Trt)和2，5，7，8-五甲基-色滿-6-碘醯(Pmc)。在鏈組裝期間，除去Fmoc或Boc，產生了激活的與成長鏈結合的胺基酸殘基氨基末端。例如，通過HBTU轉化為高度反應活性的酯激活正在產生的胺基酸羧基末端。利用目前技術(例如，PerSeptive Biosystems 9050合成儀，Applied BiosystemsModel 431A肽合成儀)，可以製備達到50個殘基的線性肽。可以得到許多指南以產生適於用在生物系統中的肽，包括(i)限制困難胺基酸如cys，met，trp(在肽合成期間容易氧化和/或降解)或arg的使用；(ii)最小化疏水性胺基酸(可以削弱肽的溶解性)；和(iii)避免氨基末端的穀氨酸(可以環化為焦穀氨酸)。
「可表達形式」意指分離的核酸分子是適於組成地，或通過細胞內或細胞外信號誘導後被轉錄為mRNA和/或被翻譯以產生蛋白質的形式，所述細胞內外信號如環境刺激或脅迫(促細胞分裂劑、缺氧、低氧、溫度、鹽、光、乾燥等)或者化學化合物如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)或如抗生素(四環素、氨苄青黴素、利福平、卡那黴素)、激素(例如赤黴素、植物生長素、細胞分裂素、糖皮質激素、油菜素類固醇、乙烯、脫落酸等)、激素類似物(吲哚乙酸(IAA)，2，4-D等)、金屬(鋅、銅、鐵等)或地塞米松，或其它。如本領域技術人員所將知道的，功能性蛋白質的表達也可能需要一種或多種翻譯後修飾，如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或者一種或多種蛋白質-蛋白質相互作用等等。所有這些過程包含在本發明術語「可表達形式」範圍內。
優選地，通過將編碼所述蛋白質的分離的核酸分子，如cDNA分子、基因組基因、合成的寡核苷酸分子、mRNA分子或開放讀框引入到所述細胞、組織或器官並在其中表達來實現優選植物來源的特定細胞、組織或器官中蛋白質的表達，其中放置所述核酸分子使其可操作地連接適合的調節或控制序列，包括啟動子，優選植物可表達的啟動子和終止子序列。
這裡提到的「啟動子」採用最廣的範圍，並且包含來源於經典真核生物基因組基因的轉錄調節序列，該轉錄調節序列包括精確轉錄起始所需的TATA盒子，有或無CCAAT盒子序列和應答發育和/或外部刺激，或以組織特異性方式改變基因表達的其它轉錄和調節元件(即，上遊激活序列，增強子和沉默子)。
術語「啟動子」也包含經典原核生物基因的轉錄調節序列，在這種情況下，其可以包含-35盒子序列和/或-10盒子轉錄調節序列。
術語「啟動子」也可以用於描述賦予、激活或增強細胞、組織或器官中核酸分子表達的合成或融合分子，或者衍生物。
啟動子可以含有一個或多個特定調節元件的額外拷貝以進一步增強與其可操作連接的核酸分子的表達，和/或改變空間表達和/或時間表達。可以鄰接異源啟動子序列放置這種調節元件以驅動核酸分子應答例如銅、糖皮質素、地塞米松、四環素、赤黴素、cAMP、脫落酸、植物生長素、創傷、乙烯、茉莉酮酸酯或水楊酸而表達，或者賦予核酸分子對特異性細胞、組織或器官，如分生組織、葉、根、胚、花、種子或果實的表達。
在本發明上下文中，優選地，啟動子是植物可表達的啟動子序列。本發明不排除在非植物細胞如細菌、酵母細胞和動物細胞中也起作用或僅在其中起作用的啟動子。「植物可表達的」意指啟動子序列，包括添加到它的或其中含有的任何調節元件，至少具有誘導、提供、激活或增強植物細胞、組織或器官，優選單子葉或雙子葉植物細胞、組織或器官中表達的能力。
這裡使用的術語「植物可操作的」和「植物中可操作的」，就啟動子序列而言，應理解為植物可表達的啟動子序列的等同物。
可調節的啟動子作為雙元病毒植物表達系統的部分也是本領域技術人員公知的(Yadav 1999-WO9922003；Yadav 2000-WO0017365)。
在本發明上下文中，「可調節的啟動子序列」是能夠可選地在特異性條件下賦予結構基因在植物特定細胞、組織或器官或者細胞、組織或器官組中表達，但是通常不賦予在所有條件下在整個植物中表達的啟動子。因此，可調節的啟動子序列可以是賦予在植物內特定位置中與之可操作地連接的基因表達的啟動子序列，或者做為可替代方案，在一組特定的條件下，例如通過化學化合物或其它誘發劑誘導表達後，賦予整個植物表達的啟動子序列。
優選地，用在本發明操作中的可調節的啟動子組成地或者誘導後賦予了植物內特定位置中的表達，但是不是任何條件下整個植物中的表達。包括在這種啟動子範圍內的是細胞特異性啟動子序列，組織特異性啟動子序列，器官特異性啟動子序列，細胞周期特異性基因啟動子序列，誘導型啟動子序列和組成型啟動子序列，例如通過轉座遺傳因子(Ac，Ds，Spm，En或其它轉座子)內所述組成型啟動子的整合，已經修飾了該組成型啟動子序列以賦予在任何時間，植物特定部分中的表達。
類似地，術語「組織特異性」應該理解為意指儘管表達不必僅在所述組織或組織類型中，但是表達主要是在優選植物來源的特定的組織或組織類型中。
類似地，術語「器官特異性」應該理解為意指儘管表達不必僅在所述器官中，但是表達主要是在優選植物來源的特定的器官中。
類似地，術語「細胞周期特異性」應該理解為意指儘管表達不必要僅在細胞周期細胞中，優選植物來源的周期細胞中，但是其主要是細胞周期性的，並在一或多個，不必要是連續的細胞周期時期中存在。
本領域技術人員將知道「誘導型啟動子」是應答發育、化學、環境或物理刺激其轉錄活性被增加或誘導的啟動子。類似地，本領域技術人員也將理解「組成型啟動子」是在生物體生長和發育的大多數階段，但不必是所有階段期間，在生物體，優選植物的大多數部分，但不必是所有部分中有轉錄活性的啟動子。
不用過度試驗，本領域技術人員從公眾可得到或容易得到的來源，將能夠容易地選定用於調節細胞分裂素氧化酶蛋白質適當表達的適合啟動子序列。
放置核酸分子受啟動子序列調節控制或者與啟動子序列可操作地連接意指定位所述的核酸分子，使其表述受啟動子序列控制。啟動子常常、但不是必需定位在其調節的核酸分子上遊，或在5』-末端，並且在轉錄起始位點2kb內。在異源啟動子/結構基因組合的構建中，一般地優選在距基因轉錄起始位點的如下距離處定位啟動子，該距離大約與啟動子和其在天然背景中控制的基因(即，啟動子來源的基因)的距離相同。如本領域所公知，可以容納該距離的一些變化，而啟動子功能沒有遺失。類似地，調節序列元件相對於置於其控制之下的異源基因的優選位置受其天然背景(即，其來源的基因)中該元件位置限定。而且，如本領域所知，該距離也可以出現一些變化。
適於用在本發明基因構建體中啟動子的例子包括表4中列出的啟動子和其它啟動子。提供表4中列出的啟動子僅僅為了舉例說明的目的，本發明不受這裡提供的列表限制。本領域技術人員將容易地提供用於進行本發明的其它啟動子。
在組成型啟動子或誘導整個植物中表達的啟動子情況下，優選通過核苷酸添加來修飾這種序列，所說核苷酸序列來源於表4中所列的一種或多種組織特異性啟動子，或者做為可替代方案，所述核苷酸序列來源於上述一種或多種組織特異性誘導型啟動子，以賦予其組織特異性。如前所述(Ellis等，1987)，例如，可以通過玉米Adh1啟動子序列的添加修飾CaMV 35S啟動子，以賦予其厭氧調節的根特異性表達。另一個例子描述了通過將CaMV35S啟動子與玉米富甘氨酸蛋白質GRP3基因的元件融合，賦予了根特異性或根高豐富度基因表達(Feix和Wulff 2000-WO0015662)。本領域技術人員通過常規試驗可以獲得這種修飾。
術語「終止子」(teminator)指在轉錄單元末端的DNA序列，其發出轉錄終止的信號。終止子是包含聚腺苷酸化信號的3』-非翻譯DNA序列，該聚腺苷酸化信號有利於向初級轉錄物3』-末端添加聚腺苷酸序列。已知並且在文獻中描述了在來源於病毒、酵母、黴菌、細菌、昆蟲、鳥類、哺乳動物和植物的細胞中有活性的終止子。可以從細菌、真菌、病毒、動物和/或植物分離它們。
表4.示例的用在本發明實施中的植物可表達啟動子I細胞特異性、組織特異性和器官特異性啟動子基因來源表達模式參考文獻α-澱粉酶(Amy32b)糊粉Lanahan，M.B.，等.，Plant Cell 4203-211，1992；Skriver，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887266-7270，1991組織蛋白酶(-樣基因糊粉Cejudo，F.J.，等.Plant Molecular Biology20849-856，1992.毛根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)rolB形成層Nilsson等，Physiol.Plant.100456-462，1997AtPRP4花http//salus.medium.edu/mmg/tierney/html查耳酮合酶(chsA)花Van der Meer，等，Plant Mol.Biol.15，95-109，1990.LAT52花葯Twell等，Mol.Gen Genet.217240-245(1989)apetala-3花幾丁質酶果實(漿果、葡萄等)Thomas等.CSIRO Plant Industry，Urrbrae，South Australia，Australia；http//winetitles.com.au/gwrdc/csh95-1.htmlrbcs-3A綠色組織(例如葉)Lam，E.等，The Plant Cell 2857-866，1990.；Tucker等，Plant Physiol.1131303-1308，1992.葉片特異性基因葉Baszczynski，等，Nucl.Acid Res.164732，1988.AtPRP4葉http//salus.medium.edu/mmg/tierney/html小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子葉Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 2685-93稻的aldP基因啟動子葉Kagaya等，1995，Molecular and GeneralGenetics 248668-674稻或番茄的rbcs啟動子葉Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102991-1000松屬cab-6葉Yamamoto等，Plant Cell Physiol.35773-778，1994.核酮糖二磷酸羧化/加氧酶啟動子葉cab(葉綠素a/b結合蛋白質葉SAM22衰老的葉Crowell，等，Plant Mol.Biol.18459-466，1992.Ltp基因(脂質轉移基因)Fleming，等，Plant J.2，855-862.日本根瘤菌(R.japonicum)nif基因根瘤美國專利號4,803,165日本慢生根瘤菌(B.japonicum)nifH基因根瘤美國專利號5,008,194GmENOD40根瘤Yang，等，The Plant J.3573-585.PEP羧化酶(PEPC)根瘤Pathirana，等，Plant Mol.Biol.20437-450，1992.豆血紅蛋白(Lb)根瘤Gordon，等，J.Exp.Bot.441453-1465，1993.Tungro bacilliform病毒基因韌皮部Bhattacharyya-Pakrasi，等，The Plant J.471-79，1992.花粉特異性基因花粉；小孢子Albani，等，Plant Mol.Biol.15605，1990；Albani，et al.，Plant Mol.Biol.16501，1991)Zm13花粉Guerrero等，Mol.Gen.Genet.224161-168(1993)apg基因小孢子Twell等，Sex.Plant Reprod.6217-224(1993)玉米花粉特異性基因花粉Hamilton等，Plant Mol.Biol.18211-218，1992.向日葵花粉表達的基因花粉Baltz，等，The Plant J.2713-721，1992.甘藍型油菜(B.napus)花粉特異性基因花粉；花葯；絨氈層Arnoldo等，J.Cell.Biochem.，Abstract No.Y101，204，1992.根可表達的基因根Tingey，等，EMBO J.61，1987.菸草植物生長素誘導型基因根尖Van der Zaal，等，Plant Mol.Biol.16，983，1991.β-微管蛋白根Oppenheimer，等，Gene 6387，1988.菸草根特異性基因根Conkling，等，Plant Physiol.931203，1990.甘藍型油菜(B.napus)G1-3b基因根美國專利號5,401,836SbPRP1根Suzuki等，Plant Mol.Biol.21109-119，1993.AtPRP1；AtPRP3根；根毛http//salus.medium.edu/mmg/tierney/htmlRD2基因根皮層http//www2.cnau.edu/ncsu/researchTobRB7基因根維管結構http//www2.cnsu.edu/ncsu/researchAtPRP4葉片；花；側根原基http//salus.medium.edu/mmg/tierney/html種子特異性基因種子Simon，等，Plant Mol.Biol.5191，1985；Scofield，等，J.Biol.Chem.26212202，1987.；Baszczynski，等，Plant Mol.Biol.14633，1990.巴西堅果白蛋白種子Pearson，等，Plant Mol.Biol.18235-245，1992.豆球蛋白種子Ellis，等，Plant Mol.Biol.10203-214，1988.谷蛋白(水稻)種子Takaiwa，等，Mol.Gen.Genet.20815-22，1986；Takaiwa，et al.，FEBS Letts.22143-47，1987.玉米醇溶蛋白種子Matzke等，Plant Mol Biol，14(3)323-321990NapA種子Stalberg，等，Planta 199515-519，1996.小麥LMW和HMW麥谷蛋白-1胚乳Mol Gen Genet 21681-90，1989；NAR17461-2，1989小麥tSPA種子Albani等，Plant Cell，9171-184，1997小麥α，β，γ-麥醇溶蛋白胚乳EMBO 31409-15，1984大麥Itr1啟動子胚乳大麥B1，C，D，大麥醇溶蛋白胚乳Theor Appl Gen 981253-62，1999；Plant J4343-55，1993；Mol Gen Genet 250750-60，1996大麥DOF胚乳Mena等，The Plant Journal，116(1)53-62，1998blz2胚乳EP99106056.7合成的啟動子胚乳Vicente-Carbajosa等，Plant J.13629-640，1998.水稻醇溶谷蛋白NRP33胚乳Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998水稻α-球蛋白Glb-1胚乳Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998水稻OSH1胚Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938117-8122，1996水稻α-球蛋白REB/OHP-1胚乳Nakase等，Plant Mol.Biol.33513-522，1997水稻ADP-葡萄糖PP胚乳Trans Res 6157-68，1997玉米ESR基因家族胚乳Plant J 12235-46，1997高梁γ-高梁醇溶蛋白胚乳PMB 321029-35，1996KNOX胚Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39257-71，1999水稻油質蛋白胚和糊粉Wu等，J.Biochem.，123386，1998向日葵油質蛋白種子(胚和乾燥種子)Cummins，等，Plant Mol.Biol.19873-876，1992LEAFY枝條分生組織Weigel等，Cell 69843-859，1992.擬南芥(Arabidopsisthaliana)knat1枝條分生組織記錄號AJ131822蘋果(Malusdomestica)kn1枝條分生組織記錄號Z71981CLAVATA1枝條分生組織記錄號AF049870柱頭特異性基因柱頭Nasrallah，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855551，1988；Trick，等，Plant Mol.Biol.15203，1990.類型I patatin基因塊莖Liu等，Plant Mol.Biol.153386-395，1991.PCNA水稻分生組織Kosugi等，Nucleic Acids Research191571-1576，1991；Kosugi S.和Ohashi Y，Plant Cell 91607-1619，1997.豌豆TubA1微管蛋白分裂細胞Stotz和Long，Plant Mol.Biol.41，601-614.1999擬南芥(Arabidopsis)cdc2a周期性細胞Chung和Parish，FEBS Lett，3；362(2)215-9，1995擬南芥(Arabidopsis)Rop1A花葯；成熟花粉+花粉管Li等，1998 Plant Physiol 118，407-417.擬南芥(Arabidopsis)AtDMC1減數分裂相關Klimyuk和Jones 1997 Plant J.11，1-14.豌豆PS-IAA4/5和PS-IAA6植物生長素誘導的Wong等，1996 Plant J.9，587-599.豌豆法尼基轉移酶分生組織；生長組織附近的韌皮部；光-和-糖抑制的Zhou等，1997 Plant J.12，921-930菸草(N.sylvestris)細胞周期蛋白B1；1分裂細胞/分生組織Trehin等，1997 Plant Mol.Biol.35，667-672.有絲分裂細胞周期蛋白CYS(A-型)和CYM(B-型)分裂細胞/分生組織Ito等，1997 Plant J.11，983-992擬南芥(Arabidopsis)cyc1At(＝cyc B1；1)和cyc3aAt(A-型)分裂細胞/分生組織Shaul，等，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93，4868-4872.擬南芥(Arabidopsis)tef1啟動子盒子分裂細胞/分生組織Regad等，1995 Mol.Gen.Genet.248，703-711.長春花(Catharanthusroseus)cyc07分裂細胞/分生組織Ito等，1994 Plant Mol.Biol.24，863-878. II示例的組成型啟動子基因來源表達模式參考文獻肌動蛋白組成型McElroy等，Plant Cell，2163-171，1990CAMV 35S組成型Odell等，Nature，313810-812，1985CaMV 19S組成型Nilsson等，Physiol.Plant.100456-462，1997GOS2組成型de Pater等，Plant J.2837-844，1992泛素組成型Christensen等，Plant Mol.Biol.18675-689，1992水稻親環蛋白組成型Buchholz等，Plant Mol Biol.25837-843，1994玉米組蛋白H3組成型Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231276-285，1992紫花苜蓿組蛋白H3組成型Wu等，Nucleic Acids Res.173057-3063，1989；Wu等，Plant Mol.Biol.11641-649，1988肌動蛋白2組成型An等，Plant J.10(1)；107-121，1996III示例的脅迫誘導型啟動子名稱脅迫參考文獻P5CS(δ(1)-吡咯啉-5-羧酸合酶)鹽、水Zhang等，Plant Science.12981-89，1997cor15a寒冷Hajela等，Plant Physiol.931246-1252，1990cor15b寒冷Wlihelm等，Plant Mol Biol.231073-1077，1993cor15a(-305到+78nt)寒冷、乾旱Baker等，Plant Mol Biol.24701-713，1994rd29鹽、乾旱、寒冷Kasuga等，Nature Biotechnology18287-291，1999熱激蛋白質，包括含有熱激元件(HSE)的人工啟動子熱Barros等，Plant Mol Biol 19665-75，1992.Marrs等，DevGenet.1427-41，1993.Schoffl等，Mol Gen Gent，217246-53，1989.smHSP(小熱激蛋白質)熱Waters等，J Experimental Botany47325-338，1996wcs120寒冷Ouellet等，FEBS Lett. 423324-328，1998ci7寒冷Kirch等，Plant Mol Biol 33897-909，1997Adh寒冷、乾旱、低氧Dolferus等，Plant Physiol 1051075-87，1994pwsi18水、鹽和乾旱Joshee等，Plant Cell Physiol 3964-72，1998ci21A寒冷Schneider等，Plant Physiol 113335-45，1997Trg-31寒冷Chaudhary等，Plant Mol Biol 301247-57，1996滲透蛋白滲透的Raghothama等，Plant Mol Biol 231117-28，1993Rab17滲透的，ABAVilardell等，Plant Mol Biol 17985-93，1991LapA創傷，環境的WO99/03977 University ofCalifornia/INRAIV示例的病原體誘導型啟動子名稱病原體參考文獻RB7根癌線蟲(Meloidogynespp.)US5760386-North Carolina StateUniversity；Opperman等，(1994)Science 263221-23.PR-1，2，3，4，5，8，11真菌、病毒、細菌Ward等，(1991)Plant Cell 31085-1094；Reiss等，1996；Lebel等，(1998)，Plant J，16(2)223-33；Melchers等，(1994)，Plant J，5(4)469-80；Lawton等，(1992)，Plant Mol Biol，19(5)735-43.HMG2線蟲WO9503690-Virginia TechIntellectual Properties Inc.Abi3Cyst線蟲(Heterodera spp.)未公開ARM1線蟲Barthels等，(1997)The PlantCell 9，2119-2134.WO 98/31822植物遺傳系統Att0728線蟲Barthels等，(1997)The PlantCell 9，2119-2134.PCT/EP98/07761Att1712線蟲Barthels等，(1997)The PlantCell 9，2119-2134.PCT/EP98/07761Gst1不同類型的病原體Strittmatter等，(1996)Mol.Plant-Microbe Interact.9，68-73.LEMMI線蟲WO 92/21757植物遺傳系統CLE雙粒病毒組PCT/EP99/03445-CINESTAVPDF1.2真菌，包括芸苔鏈格孢(Alternariabrassicicola)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)Manners等，(1998)，Plant MolBiol，38(6)1071-80.Thi2.1真菌Fusariumoxysporum f sp.MatthiolaeVignutelli等，(1998)PlantJ；14(3)285-95DB#226線蟲Bird和Wilson(1994)，植物-微生物相互作用分子生物學，7，419-42WO 95.322888DB#280線蟲Bird和Wilson(1994)，植物-微生物相互作用分子生物學，7，419-42WO 95.322888Cat2線蟲Niebel等，(1995)植物-微生物相互作用分子生物學，1995May-Jun；8(3)371-8Tub線蟲Aristizabal等，(1996)，植物-微生物相互作用分子生物學第8次國際會議，Knoxville US B-29SHSP線蟲Fenoll等，(1997)在植物-線蟲相互作用的細胞和分子方面.Kluwer Academic，C.Fenoll，F.M.W.Grundler和S.A.Ohl(編輯)，Tsw12線蟲Fenoll等，(1997)在植物-線蟲相互作用的細胞和分子方面.Kluwer Academic，C.Fenoll，F.M.W.Grundler和S.A.Ohl(編輯)Hs1(pro1)線蟲WO 98/122335-JungNsLTP病毒、真菌、細菌Molina & Garc ia-Olmedo(1993)FEBS Lett，316(2)119-22RIP病毒、真菌Tumer等，(1997)Proc Natl AcadSci USA，94(8)3866-71
特別適於用在本發明基因構建體中的終止子例子包括根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂鹼合酶(NOS)基因終止子，根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)章魚鹼合酶(OCS)基因終止子序列，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S基因終止子序列，水稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子序列(t3′Bt2)，玉米(Zea mays)玉米醇溶蛋白基因終止子序列，rbcs-1A基因終止子和rbcs-3A基因終止子序列，和其它終止子序列。
本發明優選的啟動子序列包括根特異性啟動子和種子特異性啟動子，例如，但不限於表5，表4中所列出的啟動子和如實施例中概述的啟動子。
表5.用在本發明實施中的示例的根特異性啟動子 名稱來源參考文獻 SbPRP1大豆Suzuki等，Plant Mol Biol，21109-119，1993 TobRB7 636bp片段菸草Yamamoto等，Plant Cell 3371-382，1991 GGPS3擬南芥(Arabidopsis)Okada等，Plant Physiol 1221045-1056，2000 prxEa 580bp片段擬南芥(Arabidopsis)Wanapu和Shinmyo，Ann N Y AcadSci 782107-114，1996 Ids2啟動子大麥Okumura等，Plant Mol Biol 25705-719，1994 AtPRP3擬南芥(Arabidopsis)Fowler等，Plant Physiol 1211081-1092，1999
本領域技術人員將知道可以用於進行本發明的其它啟動子序列和終止子序列。不需要任何過多的試驗，可以容易地利用這些序列。
在本發明上下文中，基因或蛋白質的「異位表達」或「異位過量表達」指所述基因或蛋白質在天然條件下正常不出現的表達模式和/或表達水平，更具體地是指增加的表達和/或增加的表達水平。可以用許多方法包括將編碼所述蛋白質的編碼序列與分離的同源或異源啟動子可操作地連接以產生嵌合基因和/或可操作地連接所述編碼序列和其自身分離的啟動子(即，天然地驅動所述蛋白質的表達的未分離的啟動子)以產生重組基因重複或基因倍增作用來獲得異位表達。「異位共表達」指兩個或多個基因或蛋白質的異位表達或異位過量表達。
優選地，本發明中所用啟動子序列可操作地連接上文所述編碼細胞分裂素氧化酶蛋白質或其同系物，衍生物或免疫活性和/或功能性片段的編碼序列或開放讀框(ORF)。
這裡所用的「表達的下調」指降低基因表達的水平和/或活性基因產物的水平和/或基因產物活性的水平。如Angell和Baulcombe(1998-WO9836083)，Lowe等，(1989-WO9853083)，Lederer等，(1999-WO9915682)或者Wang等(1999-WO9953050)所述，通過，例如以相對於啟動子序列的有義方向(如果引起共抑制)或者反義方向添加編碼序列或其部分，和通過，例如插入誘變(例如T-DNA插入或轉座子插入)或通過基因沉默策略可以完成表達的降低。目的在於沉默基因表達的基因構建體可以有以相對於啟動子序列有義和/或反義方向包含的所述基因的核苷酸序列(或其一個或多個部分)。另一個下調基因表達的方法包括核酶的應用。
可以通過將細胞、組織、器官或生物體施用或暴露於所述基因產物、其同系物、衍生物和/或免疫活性片段可以實現調節，包括降低，活性基因產物或基因產物活性的水平。免疫調節是具有下調活性基因產物和/或基因產物活性水平能力的另一種技術的例子，包括施用或暴露所述基因產物的抗體於其中要調節所述基因產物的水平和/或基因產物活性的細胞、組織、器官或生物體，或在這種細胞、組織、器官或生物體中表達所述基因產物的抗體。這種抗體包括「植物抗體(plantibodies)」，單鏈抗體、IgG抗體和重鏈camel抗體及其片段。
還可以通過將細胞、組織、器官或生物體施用或暴露於所述基因產物或其活性的拮抗劑(agonist)實現調節，包括降低，活性基因產物或基因產物活性的水平。這種拮抗劑包括上文所述本發明鑑定的蛋白質(包括例如，激酶和蛋白酶)和化學化合物。
在本發明上下文中設想了早先定義的細胞分裂素氧化酶基因表達的下調。優選地，所述細胞分裂素氧化酶是植物細胞分裂素氧化酶，更具體是AtCKX。本發明還包括細胞分裂素氧化酶蛋白質或細胞分裂素氧化酶活性水平的下調，在此，上文已經定義了所述細胞分裂素氧化酶蛋白質。優選地，所述細胞分裂素氧化酶蛋白質是植物細胞分裂素氧化酶蛋白質，更具體是AtCKX。
「修飾細胞命運和/或植物發育和/或植物形態學和/或生物化學和/或生理學」意指通過進行這裡所述本發明的一個或多個步驟改變植物的一個或多個發育和/或形態學和/或生物化學和/或生理學特徵。
「細胞命運」指植物發育期間或為此的細胞過程，特別是細胞周期期間或者作為細胞周期過程的結果產生的特定細胞的細胞類型或細胞特徵。
這裡使用的「植物發育」或術語「植物發育特徵」應該理解為意指參與決定植物細胞發育命運，特別是祖細胞將發育成的特定組織或器官類型的植物的任何細胞過程。參與植物發育的細胞過程是本領域技術人員公知的。這種過程包括，例如形態發生、光形態發生、莖幹發育、根發育、營養發育、繁殖發育、莖延長、開花和參與決定細胞命運的調節機理，特別是參與細胞周期的過程或調節過程。
當這裡使用「植物形態學」或術語「植物形態學特徵」時，本領域技術人員將理解為意指植物的外觀，包括任何一種或多種結構特徵或其結構特徵的聯合。這種結構特徵包括植物任何細胞、組織或器官或者細胞、組織、器官組，包括根、莖、葉、枝條、葉柄、毛狀體、花、花瓣、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮、糊粉、纖維、果實、形成層、木材、心材、薄壁組織、通氣組織、篩分子、韌皮部或維管組織等的形狀大小、數量、位置、顏色、組織結構、排列和模式化。
當這裡使用「植物生物化學」或術語「植物生物化學特徵」或類似術語時，本領域技術人員將理解為意指植物的代謝和催化過程，包括初級和次級代謝和其產物，包括植物產生的任何小分子、大分子或化學化合物，如，但不限於澱粉、糖、蛋白質、肽、酶、激素、生長因子、核酸分子、纖維素、半纖維素、愈傷葡聚糖、凝集素、纖維、色素如花青苷、維生素、礦物質、微量營養物或者大量營養物。
這裡使用的「植物生理學」或術語「植物生理學特徵」或類似術語將理解為意指植物功能性過程，包括發育過程如生長、擴展和分化，有性發育、有性繁殖、結籽、種子發育、籽粒灌漿、無性繁殖、細胞分裂、休眠、發芽、光適應、光合作用、葉片擴展、纖維產生、次級生長或木材產生等等；植物對外加因子如金屬、化學試劑、激素、生長因子、環境和環境脅迫因子(例如，缺氧，低氧、高溫、低溫、乾燥、光、晝長、水淹、鹽、重金屬等)的應答，包括植物對所述外加因子的適應性應答。
將重組DNA引入植物組織或細胞的方法包括，但不限於利用CaCl2和其變化形式的轉化，特別是Hanahan(1983)所述的方法，直接DNA攝取進入原始質體(Krens等，1982；Paszkowski等，1984)，PEG-介導的原生質體攝取(Armstrong等，1990)，微粒轟擊，電穿孔(Fromm等，1985)，DNA的微注射(Crossway等，1986)，組織外植體或細胞的微粒轟擊(Christou等，1988；Sanford，1988)，基本如An等，(1985)，Dodds等，(1985)，Herrera-Estrella等，(1983a，1983b，1985)所述的用核酸的組織真空滲入，或在植物的情況下，從農桿菌屬(Agrobacterium)到植物組織的T-DNA介導的轉化。單子葉植物轉化的方法是本領域已知的，包括農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化(Cheng等，1997-WO9748814；Hansen 1998-WO9854961；Hiei等，1994-WO9400977；Hiei等，1998-WO9817813；Rikiishi等，1999-WO9904618；Saito等，1995-WO9506722)，微射彈轟擊(Adams等，1999-US5969213；Bowen等，1998-US5736369；Chang等，1994-WO9413822；Lundquist等，1999-US5874265/US5990390；Vasil和Vasil，1995-US5405765.Walker等，1999-US5955362)，DNA攝取(Eyal等，1993-WO9318168)，農桿菌屬(Agrobacterium)細胞的微注射(von Holt，1994-DE4309203)和超聲處理(Finer等，1997-US5693512)。
對於細胞的微粒轟擊，將微粒推進細胞以產生轉化的細胞。任何適合的彈道細胞轉化方法學和儀器都可以用於進行本發明。Stomp等，(美國專利號5,122,466)和Sanford和Wolf(美國專利號4,945,050)公開了示例性的儀器和方法。當使用彈道轉化方法時，基因構建體可以摻入在待轉化的細胞中具有複製能力的質粒。適於用在這種系統中的微粒的例子包括1到5μm金球體。可以通過任何適合的技術，如通過沉澱在微粒上沉積DNA構建體。
根據本領域公知的方法，可以從轉化或轉染細胞再生整個植物。可以用本發明基因構建體轉化具有無論通過器官發生還是胚發生隨後無性繁殖能力的植物組織，由此再生整個植物。選定的特定組織將根據轉化的特定物種可得到的和最適的無性繁殖系統而變化，示例的組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、存在的分生組織(例如，頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。
這裡所用術語「器官發生」意指芽和根從分生組織中心順序發育的過程。
這裡所用術語「胚發生」意指芽和根無論從體細胞還是配子，以協同方式(不是順序地)一起發育的過程。
優選地，通過本領域知道的方法，如微射彈轟擊、顯微注射、農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化(包括in planta轉化)，原生質體融合或電穿孔、其它方法，根據用基因序列轉染或轉化或引入蛋白質的本發明方法產生植物。最優選地，通過農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化產生所述的植物。
植物、酵母、黴菌或絲狀真菌的農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化或農桿菌彈擊法轉化(agrolistic transformation)是以將轉化載體序列稱為T-DNA的部分轉移到核並且在所述真核生物基因組中整合所述T-DNA為基礎。
「農桿菌屬(Agrobacterium)」意指農桿菌科(Agrobacteriaceae)的成員，更優選地農桿菌屬(Agrobacterium)和根瘤桿菌屬(Rhizobacterium)，最優選根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。
「T-DNA」或「轉移DNA」意指以T-DNA邊界為側翼的轉化載體部分，在農桿菌屬(Agrobacterium)vir基因激活後，在T-DNA邊界被切割，並且作為單鏈DNA轉移到真核生物細胞的核中。
當這裡用「T-DNA邊界」，「T-DNA邊界區域」或「邊界區域」意指或者右T-DNA邊界(RB)或者左T-DNA邊界(LB)。這種邊界包含核心序列，核心序列側翼是作為邊界側翼T-DNA一部分的邊界內部區域和/或作為邊界側翼載體骨架一部分的邊界外部區域。在章魚鹼型載體的情況下，核心序列含有22bp，在胭脂鹼型載體的情況下核心序列含有25bp。右邊界區域和左邊界區域的核心序列形成不完全重複。邊界核心序列對於農桿菌屬切口複合物的識別和加工必不可少，所述複合物至少包含VirD1和VirD2。T-DNA側翼的核心序列足以促進所述T-DNA的轉移。然而，利用攜帶有僅以所述核心序列為側翼的所述T-DNA的轉化載體，轉化效率低。已知邊界內和外部區域調節T-DNA轉移的效率(Wang等，1987)。已經表徵了一個增強T-DNA轉移的元件，其位於右邊界外部區域，並且稱為overdrive(Peralta等，986，van Haaren等1987)。
「T-DNA轉化載體」或「T-DNA載體」意指包含以右和左T-DNA邊界為側翼的T-DNA序列的任何載體，並且用於任何真核細胞的轉化，該右和左T-DNA邊界至少分別由右和左邊界核心序列組成。
「T-DNA載體骨架序列」或「T-DNA載體骨架序列」意指含T-DNA載體位於T-DNA邊界外，更具體地，位於邊界核心不完整重複切口位點外的所有DNA。
本發明包括優化的T-DNA載體，使得真核生物細胞基因組中載體骨架整合最少或沒有。「優化的T-DNA載體」意指設計的T-DNA載體或者降低或者消除了載體骨架序列向真核生物細胞基因組的轉移。這種T-DNA載體對本領域技術人員是已知的，並且包括Hanson等，(1999)和Stuiver等，(1999-WO9901563)所述的T-DNA載體。
本發明清楚地考慮了在農桿菌彈擊法轉化所用的任何T-DNA載體，包含雙元轉化載體、超雙元轉化載體，共整合轉化載體、Ri-來源的轉化載體中及帶有T-DNA的載體中包含上文所述編碼細胞分裂素氧化酶，其同系物、衍生物或免疫活性和/或功能性片段的DNA序列。優選地，所述細胞分裂素氧化酶是植物細胞分裂素氧化酶，更具體地是擬南芥(At)CKX。
「雙元轉化載體」意指T-DNA轉化載體，其包含
(a)T-DNA區域，其包含至少一個目的基因和/或至少一個在待轉化真核生物細胞中有活性的選擇標記；和
(b)載體骨架區域，其至少包含在大腸桿菌(E.coli)和農桿菌屬(Agrobacterium)中有活性的複製起點和用於在大腸桿菌(E.coli)和農桿菌屬(Agrobacterium)中選擇的標記。
雙元轉化載體的T-DNA邊界可以來源於章魚鹼型或胭脂鹼型Ti質粒或者來源於這兩個Ti質粒。雙元載體的T-DNA僅聯合輔助質粒被轉移到真核生物細胞。
「輔助質粒」意指在農桿菌屬(Agrobacterium)中穩定維持的質粒，並且至少帶有一套使T-DNA能夠轉移必需的vir基因。所述一套vir基因可以來源於章魚鹼型或胭脂鹼型Ti質粒或者來源於這兩個Ti質粒。
「超雙元轉化載體」意指雙元轉化載體，它在載體骨架區域還帶有
超級毒性根瘤農桿菌(A.tumefaciens)株系A281(EP0604662，EP0687730)的Ti質粒pTiBo542的vir區域。超雙元轉化載體與輔助質粒聯合使用。
「共整合轉化載體」意指T-DNA載體，它至少包含
(a)T-DNA區域，其包含至少一個目的基因和/或至少一個在植物中有活性的選擇標記；和
(b)載體骨架區域，其至少包含在大腸桿菌(E.coli)和農桿菌屬(Agrobacterium)中有活性的複製起點和用於在大腸桿菌(E.coli)和農桿菌屬(Agrobacterium)中選擇的標記，和一套使T-DNA轉移必需的vir基因。
所述T-DNA載體的T-DNA邊界和所述一套vir基因可以來源於章魚鹼型或胭脂鹼型Ti質粒或者來源於這兩個Ti質粒。
「Ri-來源的轉化載體」意指雙元轉化載體，其中T-DNA邊界來源於Ti質粒，所述雙元轉化載體與帶有必需的一套vir基因的「輔助」Ri-質粒聯合使用。
如這裡所用的術語「選擇標記基因」或「選擇標記」或「用於選擇的標記」包括賦予細胞表型的任何基因，其中，其表達有利於用本發明基因構建體或其衍生物轉染或轉化的細胞的鑑定和/或篩選。這裡考慮的適合的選擇標記基因包括氨苄青黴素抗性(Ampr)，四環黴素抗性基因(Tcr)，細菌卡那黴素抗性基因(Kanr)，膦絲菌素抗性基因，新黴素磷酸轉移酶基因(nptII)，潮黴素抗性基因，β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因，綠色螢光蛋白(gfp)基因(Haseloff等，1997)和螢光素酶基因和其它選擇標記基因。
「農桿菌彈擊法(agrolistics)」，「農桿菌彈擊轉化」或「農桿菌彈擊轉移」這裡意指聯合農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化和生物彈擊(biolistic)DNA遞送的特徵的轉化方法。正因為如此，含有T-DNA的靶質粒與能夠在植物中產生VirD1和VirD2，有或無VirE2的DNA/RNA共遞送(Hansen和Chilton 1996；Hansen等，1997；Hansen和Chilton1997-WO9712046)。
「外源DNA」意指通過重組技術在宿主細胞基因組中引入的任何DNA序列。所述外源DNA包括例如T-DNA序列或其部分，如包含可表達形式的選擇標記的T-DNA序列。而且，外源DNA包含上文所述的間插DNA序列。
「重組事件」意指位點特異性重組事件或由於轉座子「跳躍」引起的重組事件。
「重組酶」意指位點特異性重組酶或轉座酶。
「重組位點」意指位點特異性重組位點或轉座子邊界序列。
「位點特異性重組事件」意指由一般由3個元件一對DNA序列(位點特異性重組序列或位點)和特異性酶(位點特異性重組酶)組成的系統催化的事件。位點特異性重組酶根據位點特異性重組序列的方向，僅催化兩個位點特異性重組序列間的重組反應。在位點特異性重組酶存在的情況下，當位點特異性重組序列以相互相反方向定向(即，反向重複)時，間插在兩個位點特異性重組位點之間的序列將倒置。如果位點特異性序列以相互相同的方向定向(即，同向重複)，那麼一旦與位點特異性重組酶相互作用，任何間插序列將缺失。因此，如果位點特異性重組序列做為同向重複在整合進入真核生物基因組中的外源DNA兩個末端存在，那麼所述序列的這種整合隨後可以被位點特異性重組序列與相應的位點特異性重組酶的相互作用所逆轉。
可以利用大量不同的位點特異性重組酶系統，包括但不限於噬菌體P1的Cre/lox系統，酵母的FLP/FRT系統，噬菌體Mu的Gin重組酶，大腸桿菌(E.coli)的Pin重組酶，志賀氏菌屬(Shigella)的PinB，PinD和PinF，和pSR1質粒的R/RS系統。重組酶通常都是整合酶、解離酶或翻轉酶(flippases)。而且，雙特異性重組酶可以與對應雙特異性重組酶的兩個不同位點特異性重組位點的同向重複或不同向重複(indirectrepeats)聯合使用(WO99/25840)。兩個優選的位點特異性重組酶系統是噬菌體P1 Cre/lox和酵母FLP/FRT系統。在這些系統中，重組酶(Cre或FLP)與其各自位點特異性重組序列(分別是lox或FRT)相互作用以倒置或切除間插序列。這兩個系統的每個系統的位點特異性重組序列都相對短(對於lox是34bp，對於FRT是47bp)。在植物如菸草(Dale等，1990)和擬南芥(Arabidopsis)(Osborne等，1995)中已經高效率地使用了這些系統的一些系統。位點特異性重組系統在植物分子生物學，包括控制同源重組(例如，US5527695)、靶向插入、基因堆積等方法(WO99/25821)和複合T-DNA整合模式的解離或選擇標記的切除(WO99/23202)方法中有許多應用。
儘管位點特異性重組序列必須與待切除或待倒置的DNA的末端連接，但是編碼位點特異性重組酶的基因可以定位在其它地方。例如，重組酶基因可以已經存在真核生物DNA中或者可以由後來引入的DNA片段提供，該DNA片段可以通過交換或通過異體授粉或直接引入細胞中。做為可替代方案，例如，可以通過顯微注射或粒子轟擊將基本純化的重組酶蛋白質直接引入真核細胞。典型地，位點特異性重組酶編碼區將可操作地連接調節序列，該調節序列能夠使位點特異性重組酶在真核生物細胞中表達。
「轉座子跳躍引起的重組事件」或「轉座酶介導的重組」意指被由3個元件一對DNA序列(轉座子邊界序列)和特異性酶(轉座酶)組成的系統催化的重組事件。轉座酶僅催化做為反向重複排列的兩個轉座子邊界序列之間的重組反應。
可以利用大量不同的轉座子/轉座酶系統，包括但不限於Ds/Ac系統、Spm系統和Mu系統。這些系統來源於玉米，但是已經表明至少Ds/Ac和Spm系統在其它植物中也起作用用(Fedoroff等，1993，Schlappi等，1993，Van Sluys等，1987)。優選的是Ds-和Spm-型轉座子，描述其分別有11bp和13bp的邊界序列。
儘管轉座子邊界序列必需與待切除的DNA的末端連接，但是編碼轉座酶的基因可以位於其它地方。例如，重組酶基因可以已經存在真核生物DNA中或者可以由後來引入的DNA片段提供，該DNA片段可以通過交換或通過異體授粉或直接引入細胞中。作為可替代方案，例如，可以通過顯微注射或粒子轟擊將基本純化的轉座酶蛋白質直接引入細胞。
作為本發明的一部分，轉座子邊界序列包含在外源DNA序列中，這樣它們位於所述DNA序列的外側，並且將所述DNA轉化進入轉座子樣實體，該轉座子樣實體可以通過轉座酶作用移動。
因為轉座子常常在宿主基因組的另一個位點重新整合，其中轉座酶允許起作用的宿主的子代的分離對於分離含有，例如僅僅轉座子足跡的轉化宿主和仍然含有外源DNA的轉化宿主可能是必要的。
在實施本發明時，優選地，如，例如通過細胞中重組酶蛋白質的表達，該蛋白質接觸遺傳因子的整合位點，並促進其中重組事件，在原始整合位點完整地切除遺傳因子或者可替代地留下「足跡」，通常約20個核苷酸長或更長，來誘導遺傳因子運動。可以通過標準核酸雜交和/或擴增技術以檢測可動遺傳因子或包含其的基因構建體的存在鑑定根據本發明方法產生的這些宿主和宿主部分。做為可替代方案，在可動遺傳因子已經切除的轉化的宿主細胞、組織和宿主的情況下，可以用這種技術檢測切除事件後留下的宿主基因組中足跡。如這裡所用術語「足跡」應該理解為指這裡所述可動遺傳因子或含該因子的基因構建體的任何衍生物，通過先前所述基因構建體轉化的細胞基因組中可動遺傳因子的切除、缺失或其它去除可以產生它。通常地，足跡包含至少用於促進切除的轉座子或重組位點的單拷貝。然而，足跡可以包含來源於基因構建體的其它序列，例如，如果使用，來源於左邊界序列、右邊界序列、複製起點、重組酶編碼序列或轉座酶編碼序列的核苷酸序列，或其它載體來源的核苷酸序列。因此，根據所用基因構建體重組基因座或轉座子的核苷酸序列，如，例如與lox位點或frt位點對應或互補的核苷酸序列，可鑑定足跡。
術語「細胞周期」意指與細胞生長和分裂有關，特別是與DNA複製和有絲分裂的調節有關的周期性生物化學和結構事件。細胞周期包括稱為G0，間隔期1(G1)，DNA合成(S)，間隔期2(G2)和有絲分裂(M)的階段。正常地，這4個階段順序出現，然而，細胞周期也包括修飾的周期，其中缺少一個或多個階段，產生了修飾的細胞周期如，核內有絲分裂、acytokinesis、多倍性、多線性和核內再複製。
術語「細胞周期進程」指經過不同細胞周期階段的過程。因此，術語「細胞周期進程速率」指穿過所述細胞周期階段的速度或完成所述細胞周期階段需要的時間跨度。
術語「雙雜交測定法」意指以以下觀察為基礎的測定法，即，許多真核生物轉錄因子包含當物理分離(即，共價鍵的破壞)時不能實現靶基因表達的兩個結構域，DNA結合結構域(DB)和激活結構域(AD)。能夠與融合到DB的所述蛋白質的一種蛋白質和融合到AD的所述蛋白質的另一個蛋白質物理相互作用的兩種蛋白質將重新結合轉錄因子的DB和AD結構域，引起靶基因表達。通常，酵母雙雜交測定法中的靶基因是報導基因，如β-半乳糖苷酶基因。因此，可以通過測定報導基因產物的活性定量酵母雙雜交測定中蛋白質伴侶間的相互作用(Bartel和Fields1997)。做為替代方案，可以利用包括例如，編碼嵌合綠色螢光蛋白的報導基因的哺乳動物雙雜交系統(Shioda等，2000)。
而且，利用適合的電腦程式可以進行本發明蛋白質結構基序的摺疊模擬和計算機再設計(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675-679)。蛋白質摺疊的計算機模擬可以用於詳細肽和蛋白質模型的構象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特別地，通過計算機輔助檢索互補肽序列，適合的程序可以用於細胞分裂素氧化酶、它的配體或其它相互作用蛋白質的相互作用位點的鑑定(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。而且，在背景技術中，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用於蛋白質和肽設計的適合的計算機系統。從上述計算機分析獲得的結果可以用於例如本發明蛋白質或其片段的肽模擬物的製備。這種蛋白質天然胺基酸序列的假肽類似物可以非常有效地模擬親本蛋白質(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，本發明蛋白質或其片段中容易得到的非手性Ω-胺基酸殘基的摻入引起了脂肪族鏈聚亞甲基單元對氨基鍵的置換，因此提供了構建肽模擬物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。在背景技術中描述了其它系統中的小肽激素的超活性肽模擬類似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通過連續胺烷基化合成肽模擬物組合文庫，和檢測由此得到化合物，例如它們的結合，激酶抑制和/或免疫特性鑑定本發明蛋白質適合的肽模擬物。在背景技術，例如在Ostresh，Methods inEnzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模擬物組合文庫產生的方法和用途。
而且，本發明蛋白質的三維和/或晶體結構可以用於本發明蛋白質生物活性肽模擬物抑制劑的設計(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
本發明方法中將獲得或鑑定的化合物可以是能結合本發明任何核酸、肽或蛋白質的化合物。將鑑定的其它目的化合物是調節基因或本發明蛋白質表達的化合物，這樣通過所述化合物的作用增加或降低所述基因或蛋白質的表達。做為替代方案，該化合物可以通過增加或降低任何本發明蛋白質的活性發揮它的作用。在此，優選的蛋白質是新的細胞分裂素氧化酶。
例如在樣品，例如來源於植物、動物或微生物的細胞提取物中可以包含所述一種化合物或所述多種化合物。而且，所述化合物可以是本領域已知的，但是迄今為止不知道其具有抑制或激活細胞分裂素氧化酶相互作用蛋白質的能力。反應混合物可以是無細胞提取物或可以包含細胞或組織培養物。用於本發明方法的適合設備是本領域技術人員已知的，並且，一般地，在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第3版(1994)，特別是17章中進行了描述。多種化合物可以，例如添加到反應混合物、細胞培養基中或者注射進入細胞中。
如果在本發明方法中鑑定了含有化合物或多種化合物的樣品，那麼可以從鑑定含有能起拮抗劑(agonist)作用的化合物的原始樣品分離化合物，或者如果，例如原始樣品由多種不同化合物組成，人們可以進一步細分原始樣品，以降低每個樣品的不同物質的數量，並且利用原始樣品的細分部分重複該方法。根據樣品的複雜性，可以進行上述步驟幾次，優選地，直到根據本發明方法鑑定的樣品僅僅含有有限數量或僅僅含有一種物質為止。優選地，所述樣品含有具有類似化學和/或物理特性的物質，最優選所述物質相同。優選地，根據上述方法鑑定的化合物或其衍生物被進一步製成適於植物育種或植物細胞或組織培養物中施用的形式。
術語「早期活力」指植物在早期發育期間快速生長的能力，涉及發芽後，發育良好的根系和發育良好的光合器官的成功建成。
術語「倒伏抗性」或「直立能力(standability)」指植物固定其自身到土壤的能力。對於直立或半直立生長習性的植物，該術語也指在逆境(環境)條件下維持直立位置的能力。該性狀涉及根系大小、深度和形態學。
這裡所用術語「嫁接」指兩個不同植物部分連接在一起，這樣它們結合在一起，並且汁液可以流動，由此形成了可以生長和發育的單個新植物。因此，嫁接包含兩個部分(i)下部是這裡提到的砧木(rootstock)，基本上由根系和部分莖組成，和(ii)上部即接穗或嫁接枝條，其產生了植物地上部分。
如這裡所用，tblastn指比對工具，其是BLAST(基本局部比對搜索工具)家族程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的一部分。BLAST目的是鑑定最佳局部對比的區域，即兩個核酸或蛋白質序列的一些部分比對以檢測僅共有分離的相似性區域的序列間的關係(Altschul等，1990)。在本發明中，利用BLAST 2.0程序包的tblastn，針對在所有讀框中動態翻譯的核苷酸序列資料庫，比較玉米細胞分裂素氧化酶蛋白質序列(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)).
給出下面實施例用於舉例說明本發明而非限制。這裡，如同詳盡闡述一樣，併入包含在該申請中所有文獻為參考文獻。
實施例
實施例1 本發明序列的簡要說明SEQ ID NO 說明1 AtCKX1基因組的2 AtCKX1蛋白質3 AtCKX2基因組的4 AtCKX2蛋白質5 AtCKX3基因組的6 AtCKX3蛋白質7 AtCKX4基因組的8 AtCKX4蛋白質9 AtCKX5基因組的(短的形式)10 AtCKX5蛋白質(短的形式)11 AtCKX6基因組的12 AtCKX6蛋白質13 5』引物AtCKX114 3』引物AtCKX1 15 5』引物AtCKX2 16 3』引物AtCKX2 17 5』引物AtCKX3 18 3』引物AtCKX3 19 5』引物AtCKX4 20 3』引物AtCKX4 21 5』引物AtCKX5 22 3』引物AtCKX5 23 5』引物AtCKX6 24 3』引物AtCKX6 25 AtCKX1 cDNA 26 AtCKX2 cDNA 27 AtCKX3 cDNA 28 AtCKX4 cDNA 29 AtCKX5 cDNA(短的形式) 30 AtCKX6 cDNA 31 AtCKX2 cDNA片段 32 AtCKX2肽片段 33 AtCKX5基因組的(長的形式) 34 AtCKX5 cDNA(長的形式) 35 AtCKX5蛋白質(長的形式) 36 根clavata同系物啟動子
實施例2.擬南芥(Arabidopsis thaliana)的候選細胞分裂素氧化酶編碼基因的鑑定
鑑定與玉米細胞分裂素氧化酶基因(Morris等，Biochem BiophysRes Comm 255328-333，1999；Houda-Herin等.Plant J 17615-626；WO99/06571)具有序列相似性的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的6種不同基因。利用tblastn程序，通過用玉米蛋白質序列篩選公共基因組資料庫核苷酸序列的6個讀框翻譯物，發現這些基因。將這序列命名為擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣基因或AtCKX。將它們隨意地編號為AtCKX1到AtCKX6。下面的列表概述了這些基因的信息。標示了預測的ORF邊界和蛋白質序列，以近似說明擬南芥(Arabidopsi)和玉米細胞分裂素氧化酶之間，以及不同擬南芥(Arabidopsi)細胞分裂素氧化酶之間的蛋白質序列差異。不應該將所示ORF邊界和蛋白質序列當做這些AtCKX基因作用方式的結論性證據。利用了DNAstar的程序MegAlign進行DNA和蛋白質序列比較。這個程序利用Clustal方法進行比對。對於蛋白質和cDNA序列的多序列比對，空位罰值(gap penalty)和空位長度罰值(gap length penalty)設為每次10。對於蛋白質的成對序列比對，參數如下Ktuple為1；空位罰值3；視窗5；diagonals saved為5。對於cDNA的成對序列比對，參數如下Ktuple為2；空位罰值5；視窗4；diagonals saved為4。蛋白質比對的相似性組是(M，I，L，V)，(F，W，Y)，(G，A)，(S，T)，(R，K，H)，(E，D)，(N，Q)。在擬南芥(Arabidopsis)cDNA和蛋白質序列之間標出的值代表用所有組合發現的最低和最高值。
A.基因名稱AtCKX1(擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣蛋白質1 SEQ ID NO1)
資料庫中的位置(記錄號，bac上位置)AC002510，擬南芥(Arabidopsisthaliana)染色體II，完整序列255的225部分。序列來源於克隆T32G6。資料庫中預測的ORF
15517..16183，16415..16542，16631..16891，16995..17257，17344..17752
AtCKX1 cDNA序列列為SEQ ID NO25。
預測的蛋白質序列SEQ ID NO2
同源性
與玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
31.5％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與玉米(Z.mays)蛋白質的％相似性
32.2％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(範圍)
38.2％(AtCKX2)54.1％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)蛋白質的％相似性(範圍)
37.1％(AtCKX2)58.1％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
B.基因名稱AtCKX2(擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣蛋白質2，SEQ ID NO3)
資料庫中的位置(記錄號，bac上位置)AC005917，擬南芥(Arabidopsisthaliana)染色體II，完整序列255的133部分。序列來源於克隆F27F23，F3P11。
資料庫中預測的ORF
互補序列，40721..41012，41054..41364，41513..41770，42535..42662，43153..43711
注意利用基因預測程序NetPlantGene(http//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)，本發明人鑑定的cDNA序列不同於資料庫中注釋的cDNA序列。根據新的cDNA序列，修正了資料庫中預測的ORF
互補序列，40721..41012，41095..41364，41513..41770，42535..42662，43153..43711
該cDNA編碼的蛋白質序列列為SEQ ID NO4。用一步RT-PCR試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)，通過RT-PCR從AtCKX2轉基因植物組織的總RNA克隆AtCKX2T的cDNA，並且利用ABI PRISM Big Dye終止子循環測序反應試劑盒(Perkin Elmer Applied Biosystems Division)測序。證實了本發明人鑑定和預測的cDNA序列是正確的。此新的AtCKX2 cDNA列出為SEQ ID NO26。對應於AtCKX2 cDNA核苷酸1171到1254的84-bp片段列出為SEQ ID NO31。該84-bp cDNA序列的對應的肽序列列出為SEQ ID NO32。
同源性
與玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
38.4％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與玉米(Z.mays)蛋白質的％相似性
37.5％(Dnastar/MegALIgn Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(範圍)
34.9％(AtCKX6)64.5％(AtCKX4)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)蛋白質的％相似性(範圍)
36.5％(AtCKX6)66.1％(AtCKX4)(Dnastar/MegAlignClustal方法)
C.基因名稱AtCKX3(擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣蛋白質3，SEQ ID NO5)
資料庫中的位置(記錄號，bac上位置)AB024035，擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組DNA，染色體5，P1克隆MHM17，完整序列。
資料庫中沒有ORF預測。
利用幾個基因預測程序，包括GRAIL(ftp//arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail)，Genscan(http//CCR-081.mit.edu/GENSCAN html)和NetPlantGene(http//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)，本發明人鑑定了該基因
互補序列，29415..29718，29813..30081，30183..30443，30529..30656，32107..32716
本發明人鑑定的新AtCKX3 cDNA序列列出為SEQ ID NO27。基於自己ORF預測，預測的蛋白質序列SEQ ID NO6。
同源性
與玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
38.7％(Dnastar/MegAlign Clustal方法)
與玉米(Z.mays)蛋白質的％相似性
39.2％(Dnastar/MegAlign Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(範圍)
38.8％(AtCKX6)51.0％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlignClustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)蛋白質的％相似性(範圍)
39.9％(AtCKX6)46.7％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlignClustal方法)
D.基因名稱AtCKX4(擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣蛋白質4，SEQ ID NO7)
資料庫中的位置(記錄號，bac上位置)
1)AL079344，擬南芥(Arabidopsis thaliana)DNA染色體4，BAC克隆T16L4(ESSA工程)
2)AL161575，擬南芥(Arabidopsis thaliana)DNA染色體4，毗連序列群片段號71。
資料庫中預測的ORF
1)76187..76814，77189..77316，77823..78080，78318..78586，78677..78968
2)101002..101629，102004..102131，102638..102895，103133..103401，103492..103783
AtCKX4 cDNA序列列出為SEQ ID NO28。
預測的蛋白質序列SEQ ID NO8
同源性
與玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
41.0％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與玉米(Z.mays)蛋白質的％相似性
41.0％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(範圍)
35.2％(AtCKX6)64.5％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)蛋白質的％相似性(範圍)
35.1％(AtCKX6)66.1％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
E.基因名稱AtCKX5(擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣蛋白質5，SEQ ID NO9)
資料庫中的位置(記錄號，bac上位置)AC023754，F1B16，完整序列，染色體1
資料庫中沒有ORF預測
利用幾種基因預測程序，包括GRAIL(ftp//arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail)，Genscan(http//CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html)和NetPlantGene(http//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)，本發明人鑑定了該基因。
43756..44347，44435..44562，44700..44966，45493..45755，46200..46560
本發明人鑑定和預測的新AtCKX5 cDNA序列列出為SEQ ID NO29。該cDNA預測的蛋白質序列列出為SEQ ID NO10。在基因組序列更上遊9個核苷酸處，存在第二個可能的ATG起始密碼子。不清楚這2個起始密碼子中哪個密碼子編碼蛋白質第一個胺基酸。因此，在本發明中，也將在該上遊起始密碼子起始的第二個可能AtCKX5 cDNA列出為SEQ ID NO34。相應基因組序列列出為SEQ ID NO33，編碼的蛋白質列出為SEQ IDNO35。
同源性
與玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
39.1％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與玉米(Z.mays)蛋白質的％相似性
36.6％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(範圍)
40.1％(AtCKX2)44.0％(AtCKX3)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)蛋白質的％相似性(範圍)
41.6％(AtCKX4)46.4％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
F.基因名稱AtCKX6(擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞分裂素氧化酶樣蛋白質6，SEQ ID NO11)
資料庫中的位置(記錄號，bac上位置)AL163818，擬南芥(Arabidopsisthaliana)DNA染色體3，P1克隆MAA21(ESSA工程)。
資料庫中預測的ORF
46630..47215，47343..47470，47591..47806，47899..48161，48244..48565
AtCKX6 cDNA序列列出為SEQ ID NO30。
預測的蛋白質序列SEQ ID NO12
同源性
與玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
37.3％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與玉米(Z.mays)蛋白質的％相似性
36.1％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(範圍)
34.9％(AtCKX2)54.1％(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
與其它擬南芥(Arabidopsis)蛋白質的％相似性(範圍)
35.1％(AtCKX4)58.1％(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
在資料庫中基因AtCKX3和AtCKX5沒有注釋為推定的細胞分裂素氧化酶，並且沒有給出這些基因的ORFs。而且，預測的AtCKX2的ORF(和由此的蛋白質結構)不同於我們自己的預測，並且通過測序AtCKX2 cDNA證實了我們的預測。
圖1中示出了擬南芥(Arabidopsis)AtCKX基因1到4和玉米CKX基因的基因結構比較。
擬南芥(Arabidopsis)AtCKX基因編碼的預測的蛋白質顯示了與玉米蛋白質32％到41％之間的相似性，而它們相互之間顯示了35％到66％之間的序列相似性。因為該降低的序列保守性，事先不清楚是否擬南芥(Arabidopsis)AtCKX基因編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的蛋白質。在圖2中示出了擬南芥(Arabidopsis)AtCKX預測的蛋白質1到4和玉米CKX基因的比對。
實施例3.過量表達AtCKX1的轉基因植物顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性和改變的植物形態學
1.克隆方法的說明
利用下面引物從擬南芥(Arabidopsis thaliana)，登錄名ColumbiaPCR擴增AtCKX1基因(用於克隆的非同源序列為小寫字母)，
5』引物的序列cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG(SEQ ID NO13)
3』引物的序列gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT(SEQ ID NO14)
在pUC19的SalI位點插入通過這些引物擴增的2235-bp PCR片段。測序該插入，並且證實PCR擴增產物不含有任何突變。在雙元載體pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)修飾的CaMV 35S啟動子(帶有3個四環素操縱基因序列)下遊SalI位點中亞克隆該載體的SalI/SalI片段。通過農桿菌介導的轉化，利用標準的轉化方法，將由此得到的構建體引入菸草和擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.轉基因株系的分子分析
鑑定了以高水平合成AtCKX1轉錄物的幾個轉基因株系(圖3)。表達AtCKX1轉錄物的轉基因株系也顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性，其中如所述(Motyka等，1996)，通過基於[2-3H]iP到腺嘌呤轉化的細胞分裂素氧化酶活性的標準測定法測定所述活性。在表6中示例了2株菸草和2株擬南芥(Arabidopsis)株系。該結果證明AtCKX1基因編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的蛋白質。
表6.在AtCKX1轉基因植物組織中細胞分裂素氧化酶活性葉片試樣植物物種 植物株系 細胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白質.h)擬南芥(Arabidopsis) Col-0野生型 0.009 CKX1-11 0.024 CKX1-22 0.026 CKX1-22 0.027菸草 SNN野生型 0.004 CKX1-SNN-8 0.016 CKX1-SNN-28 0.021
3.轉基因株系的表型描述
3.1在菸草中
該植物具有降低頂端優勢(圖7A，B和C)和增加的根生長(圖8)的矮化表型。
表型的5種分類
1)強的2個克隆
2)中等的3個克隆
3)弱的4個克隆
4)具有大花序的高大植物(如同WT(野生型))-5個克隆
5)與WT相似，9個克隆
高度(參見圖7B和C)
-WT100-150cm之間
-弱的約75cm
-中等的約40-45cm(主莖約25cm，但是過分生長側枝)
-強的約10cm
轉基因植物AtCKX1-48和AtCKX1-50顯示了強的表型。下面是與WT植物比較的莖伸長測定值株系野生型AtCKX1-48AtCKX1-50發芽後的天數高度(cm)高度(cm)高度(cm)479.5±0.51.3±0.31.2±0.25822.4±2.32.2±0.32.3±0.36835.3±2.63.1±0.52.6±0.5100113.3±9.87.1±0.84.8±0.9117138.6±8.18.7±0.76.6±0.9131139.0±9.39.3±0.78.6±1.0152136.6±10.410.9±1.110.0±1.016511.8±1.911.4±1.418116.5±1.714.9±1.219819.5±1.518.1±1.3
實驗植物在溫室土壤中生長。從每個株系至少10株植物收集數據。
葉(參見圖7D和E)
AtCKX1轉基因表達子的葉形狀是披針形(較長而窄)成熟葉片的寬長比率從野生型植物的1∶2下降到AtCKX1轉基因植物中的1∶3(圖7E)。與野生型比較，葉數量和葉表面積減少了(參見圖7D)。也注意到葉片衰老進程的顯著差異。在WT菸草中，在最基部葉中開始葉衰老，並且引起葉片色素的均勻減少(圖7E)。相反，強表達AtCKX1的植物衰老葉片沿著葉脈保持綠色，在脈間區域中變黃，表明改變的葉片衰老。老葉片的質地是更剛性。
根
通過形成密集的更多根(強的)(圖8A)的能力和通過形成沿著莖的氣生根，體外生長的高度表達所述基因的植物容易和WT相區分。
如圖8C中示例的AtCKX1-50過量表達的幼苗，初生根更長，側和不定根的數量更多(也參見實施例9)
外源細胞分裂素對根生長抑制的劑量-應答曲線表明轉基因幼苗的根比WT根更具有細胞分裂素抗性(圖8D)。AtCKX1轉基因植物對iPR抗性不如AtCKX2轉基因植物對iPR的抗性顯著，這與後者iP型細胞分裂素較小的改變一致(參見表10)。
儘管地上植物部分生長高度地減少，但是觀察到了生長在土壤中成熟植物根生物量的大量增加(參見圖8B生長在土壤中4到5個月的植物)。
節間距
·中等表型與WT植物中花序下第5和第9節間距長度分別是5cm和2cm比較，花序下第5節間距約是2.5cm長，第9節間距約是0.5cm長。
·強的表型植物AtCKX1-50，在萌芽後131天測定的從底部起第20節間距長度是1.3±0.4mm，而相比之下WT是39.2±3.8mm。
頂端優勢和分支
形成了更多側枝，表明與WT比較，營養生長期間頂端優勢減少(參見圖9)。側枝生長超過主莖，對於中等AtCKX1表達子，達到40-45cm高度。甚至出現次生枝。然而，芽沒有從頂端優勢完全釋放，即，側枝條不真正繼續發育。減少的頂端優勢可能是由於較小枝條頂端分生組織的植物生長素產生減少引起的(參見實施例10)。
繁殖發育
AtCKX1轉基因植物中開花的開始被建遲，花數和每個蒴果(capsule)的種子產量降低。轉基因植物中花的大小沒有改變，並且單個種子重量與野生型植物種子的重量相當。下面概述了兩個代表性AtCKX1轉基因植物的數據
A.開花的開始株系野生型AtCKX1-48AtCKX1-50開花時間(DAG)106.2±3.3193.3±4.3191.8±3.8
實驗每個株系至少10株植物收集數據。第一朵花的充分伸展定義為開花的開始。DAG＝發芽後的天數
B.每株植物的種子蒴果數株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50蒴果數83.33±5.13 2.00±1.00 2.60±1.67
實驗至少從5個不同植物測定種子蒴果數。注意這些植物生長在冬季的溫室條件下。這不利地影響形成的花數，特別是轉基因克隆中形成的花數。然而，它們形成減少數量的花的基本概念是正確的。n.d.，沒有測定。
C.種子產量/蒴果(mg)株系野生型AtCKX1-48 AtCKX1-50種子/蒴果(mg)87.41±28.7523.83±13.36 61.8±40.66
實驗測定至少12個種子蒴果的種子產量。種子蒴果大小是變化很大的，因此標準差較大。n.d.，沒有測定。
D.100粒種子的重量(mg)株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50種子重量(mg)9.73±0.44 10.70±1.60 9.54±0.94
實驗種子生物量測定為至少5個不同種子蒴果的100粒種子重量。n.d.，沒有測定。
3.2在擬南芥(Arabidopsis)中
-發芽開始與WT相同
-總的根系擴大，側根和不定根數增加(參見圖4A到D)。
-地上器官生長減弱，導致了矮化的表型(參見圖4E和F)，葉生物量降低。葉片和花形成延遲。
-與WT相比生命周期變長，與WT比較，種子產量降低。
下面形態測定數據舉例說明了這些表型
根發育
A.根系的總長株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15長度(mm)32.576.568.4
B.初生根長度株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15長度(mm)32.3±3.852.3±4.839.9±4.2
C.側根(LR)長度株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15長度(mm)0.2±0.415.6±11.010.4±7.6
D.不定根長度株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15長度(mm)0.03±0.188.6±8.519.1±11.0
E.側根(LR)數量株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15LR數量0.3±0.510.4±5.42.6±1.1
F.不定根(AR)數量株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15AR數量0.03±0.181.6±1.12.6±1.1
實驗對在體外MS培養基上發芽後8天的植物上進行測定。對每個株系至少17株植物進行評分。
枝條發育
A.葉面積株系野生型AtCKX1-11-7T3純合植物AtCKX1-11-12T3純合植物AtCKX1-15-1T3純合植物葉面積(cm2)21.16±1.732.28±0.582.62±0.281.66±0.22
實驗測定發芽後30天後形成的主蓮座葉片的葉面積。對每個克隆分析3株植物。
繁殖發育
開花的開始株系野生型AtCKX1-11T3雜合植物AtCKX2-2T2雜合植物AtCKX2-5T2雜合植物開花時間(DAG)43.6±5.869.7±9.451.2±4.145.1±6.9
實驗植物在溫室條件下生長。對每個克隆分析了至少13株植物。
DAG＝發芽後的天數。
結論AtCKX1轉基因擬南芥(Arabidopsis)植物的分析基本上證實了從菸草獲得的結果，並且顯示了降低細胞分裂素含量的結果的一般特性。總根系擴大(在AtCKX1轉基因植物中總根長增加約110-140％)，枝條發育更慢(延遲了開花)，並且葉生物量降低。轉基因植物中種子的產量也降低。
實施例4.過量表達AtCKX2的轉基因植物顯示了細胞分裂素氧化酶活性增加和植物形態學上的改變
1.克隆方法的說明
利用下面的引物從擬南芥(Arabidopsis thaliana)，登錄名Columbia PCR擴增AtCKX2基因(用於克隆的非同源序列為小寫字母)
5』引物的序列gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC(SEQ ID NO15)
3』引物的序列gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC(SEQ ID NO16)。
在pUC19的KpnI位點中插入由這些引物擴增的3104-bp PCR片段。測序該插入以檢查通過PCR方法沒有引入不同於公開的序列的差異。在雙元載體pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)中修飾的CaMV 35S啟動子(帶有3個四環素操縱基因序列)下遊的KpnI位點亞克隆該載體的KpnI/KpnI片段。利用標準轉化方法，通過農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化，將由此得到的構建體引入菸草和擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.轉基因株系的分子分析
鑑定了高水平合成AtCKX2轉錄物的幾個轉基因株系(圖6)。表達AtCKX2轉錄物的轉基因株系也顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性。在表7中示例了2株菸草和3株擬南芥(Arabidopsis)株系。該結果證明AtCKX2基因編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的蛋白質。
表7.AtCKX2轉基因植物組織中細胞分裂素氧化酶活性樣品植物物種和組織 植物株系 細胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白質.h)擬南芥(Arabidopsis)愈傷組織 Col-0野生型 0.037 CKX2-15 0.351 CKX2-17 0.380 CKX2-55 0.265菸草葉 SNN野生型 0.009 CKX2-SNN-18 0.091 CKX2-SNN-19 0.091
3.轉基因株系的表型描述
3.1在菸草中(參見圖7到10)
3類表型
1)強的15個克隆(與AtCKX1的中等表型相似)
2)弱的6個克隆
3)其它與WT植物相似，7個克隆
地上植物部分
除了一些一般性微小的定量差異，即在AtCKX1轉基因植物中比AtCKX2轉基因植物中矮化特徵更嚴重外，關於植物高度、節間距、分支、葉形成和黃化的觀察結果與AtCKX1轉基因植物相似(在圖7A和B中比較AtCKX1植物和AtCKX2植物)。下面示例了具有強表型克隆AtCKX2-38和AtCKX2-40的莖伸長和節間距測量值。
莖伸長株系野生型AtCKX2-38AtCKX2-40發芽後天數高度(cm)高度(cm)高度(cm)479.5±0.52.4±0.12.6±0.25822.4±2.35.5±0.75.3±0.56835.3±2.67.1±0.87.0±0.7100113.3±9.815.5±2.520.3±6.4117138.6±8.119.8±3.829.5±6.0131139.0±9.326.5±7.033.4±5.8152136.6±10.433.7±6.333.9±6.416536.2±4.3
實驗植物生長在溫室的土壤中。從至少每個株系的10株植物收集數據。
節間距株系野生型AtCKX2-38節間距(mm)39.2±3.87.2±1.6
實驗發芽後131天測定從下部起的第20節間距的長度。
根
通過形成密集的更多根(強的)的能力和通過形成沿著莖的氣生根，體外生長的高度表達所述基因的植物容易和WT相區分。
如圖8C中所示例的AtCKX2-38過量表達的幼苗，初生根更長，側根和不定根的數量更多(也參見實施例9)。
外源細胞分裂素對根生長抑制劑的量-應答曲線表明轉基因幼苗的根比WT根更具有細胞分裂素抗性(圖8D)。AtCKX1-28轉基因植物對iPR的抗性不如AtCKX2-38對iPR的抗性顯著，這與後者中iP型細胞分裂素較小改變一致(參見表10)。
與WT比較，從生長在土壤中的植物觀察到，AtCKX2轉基因植物T0株系根生物量鮮重和乾重增加，如下表所示株系野生型AtCKX2(T0)鮮重(g)45.2±15.477.1±21.3乾重(g)6.3±1.98.6±2.2
試驗在土壤中生長6株WT植物和6株35S::AtCKX2克隆的獨立T0株系。開花後，用水衝洗根系，儘可能地除去土壤，稱量其鮮重和乾重。與WT比較，也觀察到水培法中生長的AtCKX2轉基因植物F1子代的根生物量鮮重和乾重的增加，如下表中所示
株系野生型AtCKX2-38AtCKX2-40根鮮重(g)19.76±6.7933.38±7.7650.04±15.59根乾重(g)2.36±0.432.61±0.393.52±1.06枝條鮮重(g)159.8±44.5333.66±2.6748.84±11.83根冠鮮重比8.24±0.631.04±0.181.08±0.51
實驗發芽後60天，將土壤生長的植物轉移到水培系統(Hoagland溶液)，並且生長另外60天。水培溶液連續通氣，每隔3天用新鮮溶液置換。
總之，水培溶液中生長的轉基因植物比野生型植物多形成約65-150％的根生物量(鮮重)。乾重增加10-50％。這種差異部分可能是由於轉基因植物較大的細胞體積引起的。這減少了形成大部分乾物質材料的細胞壁的相對比例。枝條生物量減少到野生枝條的20％-70％。鮮重的差異引起了根冠比的改變，其在野生型中約是8，而在轉基因克隆中約是1。
結論
儘管地上植物部分生長減少，但是觀察到與WT對照比較，生長在不同條件下的AtCKX2轉基因幼苗和成熟植物的根生長和生物量的增加。觀察到不同轉基因植物之間的量差異觀察到最強表達克隆的根生物量增加更大。
繁殖發育
AtCKX2轉基因植物中開花的開始延遲，花數和每個蒴果的種子產量降低。這些結果與在AtCKX1轉基因植物中觀察到的結果非常相似，但是在AtCKX2轉基因植物中它們較不顯著，如下表中所示。轉基因植物中花的大小沒有改變。每個種子的重量可與野生型植物種子的重量相比。
A.開花的開始
株系野生型AtCKX1-48AtCKX1-50AtCKX2-38AtCKX2-40開花時間(DAG)106.2±3.3193.3±4.3191.8±3.8140.6±6.5121.9±9.8
實驗每個株系收集至少10株植物的數據。定義第一朵花的充分伸展為開花的開始。DAG＝發芽後的天數
B.每株植物的種子蒴果數株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50AtCKX2-38 AtCKX2-40蒴果數83.33±5.13 2.00±1.00 2.60±1.674.30±2.58 n.d.
實驗測定至少5株不同植物的種子蒴果數。注意這些植物生長在冬季溫室條件下。這不利地影響了形成的花數，特別是轉基因克隆中形成的花數。然而，它們形成減少數量的花的基本基本概念是正確的。n.d.，沒有測定。
C.種子產量/蒴果(mg)株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40種子/蒴果(mg)87.41±28.75 23.83±13.36 61.8±40.66 46.98±29.30 n.d.
實驗測定至少12個種子蒴果的種子產量。種子蒴果大小是非常可變的，因此標準偏差大。
D.100粒種子的重量(mg)株系野生型AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40種子重量(mg)9.73±0.4410.70±1.60 9.54±0.94 10.16±0.47 n.d.
實驗測定種子生物量為至少5個不同種子蒴果的100粒種子的重量。n.d.，沒有測定。
3.2在擬南芥(Arabidopsis)中
獲得了AtCKX2轉基因植物的下面形態測量數據
根發育
A.根系總長株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5長度(mm)32.550.648.5
B.初生根長度株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5長度(mm)32.3±3.830.7±4.831.6±6.8
C.側根長度株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5長度(mm)0.2±0.45.5±9.01.9±2.5
D.不定根長度株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5長度(mm)0.03±0.1814.4±10.214.9±9.1
E.側根(LR)數株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5LR數0.3±0.52.9±2.31.9±1.0
F.不定根(AR)數株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5AR數0.03±0.181.8±0.91.8±1.0
實驗對體外MS培養基上發芽後8天的植物進行測定。每個株系評分至少17株植物。
枝條發育
葉面積株系野生型AtCKX2-2T2雜合植物AtCKX2-5T2雜合植物AtCKX2-9T2雜合植物葉面積(cm2)21.16±1.738.20±2.358.22±0.557.72±0.85
實驗測定發芽後30天後形成的主蓮座葉片的葉面積。每個克隆分析了3株植物。
繁殖發育
開花的開始株系野生型AtCKX1-11T3雜合植物AtCKX2-2T2雜合植物AtCKX2-5T2雜合植物開花時間(DAG)43.6±5.869.7±9.451.2±4.145.1±6.9
實驗植物在溫室條件下生長。每個克隆分析了至少13株植物。DAG＝發芽後的天數。
結論擬南芥(Arabidopsis)AtCKX2轉基因植物有與AtCKX1轉基因植物相似的降低的葉片生物量和矮化的表型(比較圖5和圖4F)。在AtCKX2轉基因擬南芥(Arabidopsis)中也擴大了總根系。在AtCKX2轉基因植物中總根長增加了約50％。AtCKX1轉基因植物有更長的初生根，更多的側根和形成更多的不定根。AtCKX2轉基因植物缺乏初生根生長的增加，但是比WT形成了更多的側根(side roots)和側根(lateral roots)。
總結
觀察到的AtCKX2轉基因植物表型與AtCKX1轉基因植物非常相似但是不同，接著其與菸草轉基因植物獲得的結果非常相似但不相同。這證實了在這兩個植物物種中細胞分裂素含量減少的結果的一般特性，因此，在其它植物物種中也可以預期相似的表型。菸草和擬南芥(Arabidopsis)之間的主要不同是在AtCKX2過量表達的植物中缺乏初生根生長的增加。
實施例5.過量表達AtCKX3的轉基因植物顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性和改變的植物形態學
1.克隆方法的說明
利用下面引物從擬南芥(Arabidopsis thaliana)，登錄名ColumbiaPCR擴增AtCKX3基因(用於克隆的非同源序列為小寫字母)，
5』引物的序列gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA(SEQ IDNO17)
3』引物的序列gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA(SEQ ID NO18)在pBluescript的KpnI位點中插入該由PCR擴增產生的3397-bp PCR片段。測序該插入物以證實PCR產物與所述基因比較沒有序列改變。在雙元載體pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)中修飾的CaMV 35S啟動子(帶有3個四環素操縱基因序列)下遊的KpnI位點亞克隆該載體的KpnI/KpnI片段。利用標準轉化方法，通過農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化，將由此得到的構建體引入菸草和擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.轉基因株系的分子分析
鑑定了高水平合成AtCKX3轉錄物的幾株轉基因菸草株系(圖11A)。表達AtCKX3轉錄物的轉基因菸草株系也顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性。在表8中示例了3株植物。這證明AtCKX3基因編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的蛋白質。
表8.AtCKX4轉基因植物組織中細胞分裂素氧化酶活性樣品植物物種和組織 植物株系 細胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白質.小時)菸草葉 SNN野生型 0.011 CKX3-SNN-3 0.049 CKX3-SNN-6 0.053 CKX3-SNN-21 0.05
3.植物表型分析
菸草和擬南芥(Arabidopsis)中AtCKX3基因過量表達產生的表型基本與表達AtCKX1和AtCKX2的植物表型相似，即，增加的生根和矮化。然而，菸草中AtCKX3基因的過量表達引起了比AtCKX2更強的表型。在這個意義上，AtCKX3過量表達與AtCKX1過量表達更相似。
實施例6.過量表達AtCKX4的轉基因植物顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性和改變的植物形態學
1.克隆方法的說明
利用下面引物從擬南芥(Arabidopsis thaliana)，登錄名ColumbiaPCR擴增AtCKX4基因(用於克隆的非同源序列為小寫字母)，
5』引物的序列gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTTTG(SEQ ID NO19)
3』引物的序列gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA(SEQ ID NO20)
在pBluescript的KpnI位點中插入該PCR擴增產生的2890-bp PCR片段。測序該插入物以證實PCR產物與該基因比較沒有序列改變。在雙元載體pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)中修飾的CaMV 35S啟動子(帶有3個四環素操縱基因序列)下遊的KpnI位點亞克隆該載體的KpnI/KpnI片段。利用標準轉化方法，通過農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化，將由此得到的構建體引入菸草和擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.轉基因株系的分子分析
鑑定了高水平合成AtCK4轉錄物的幾株轉基因菸草株系(圖11B)。表達AtCKX4轉錄物的轉基因株系也顯示了增加的細胞分裂素氧化酶活性。在表9中示例了3株擬南芥(Arabidopsis)和3株菸草株系。該結果證明AtCKX4基因編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的蛋白質。
表9.AtCKX4轉基因植物組織中細胞分裂素氧化酶活性樣品植物物種和組織 植物株系 細胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白質.h)擬南芥(Arabidopsis)愈傷組織 Col-0野生型 0.037 CKX4-37 0.244 CKX4-40 0.258 CKX4-41 0.320菸草葉 SNN野生型 0.011 CKX4-SNN-3 0.089 CKX4-SNN-18 0.085 CKX4-SNN-27 0.096
總的來說，數據表明用iP做為底物，4種細胞分裂素氧化酶的表觀Km值範圍是0.2到9.5μM，其進一步證明由AtCKX1到4編碼的蛋白質確實是如這裡所公開的細胞分裂素氧化酶。
3.植物表型分析
AtCKX4基因在菸草和擬南芥(Arabidopsis)中過量表達產生的表型基本上與表達AtCKX1和AtCKX2的植物的表型相似，即，增加的生根、減少的頂端優勢、矮化和菸草老葉中脈間區域的黃化。在菸草中的另一個表型是披針形葉(改變的長和寬比率)。
過量表達AtCKX的菸草植物的一般觀察結果
總的來說，表型分析證明AtCKX基因過量表達引起了菸草植物枝條和根系劇烈的發育改變，包括增加的根系發育和地上植物部分的矮化。如本文所公開的，也觀察到其它的結果如改變的葉衰老，莖上不定根的形成等。不同基因的改變非常相似，但是不同。在菸草中，AtCKX1和AtCKX3過量表達植物相似，就象AtCKX2和AtCKX4類似一樣。一般地，這前兩者，特別是在枝條中，顯示了性狀的更高表達。因此，為了獲得本發明實施方式中所述表型，特定細胞分裂素氧化酶基因可能是優選的。
實施例7.AtCKX5基因的克隆
利用下面引物，從登錄名Columbia的擬南芥(Arabidopsisthaliana)PCR擴增AtCKX5基因(用於克隆的非同源序列為小寫字母)
5』引物的序列ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC(SEQ ID NO21)
3』引物的序列ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTGTCCTGT(SEQ ID NO22)
5』引物序列包含AtCKX5蛋白質兩個可能的起始密碼子，最可能的
5』起始密碼子以下劃線表示，第二ATG密碼子以斜體表示。
該PCR擴增產生的2843-bp PCR片段做為平端產物插入pCR-BluntII-TOPO克隆載體(Invitrogen)中。
實施例8.AtCKX6基因的克隆
利用下面引物，從登錄名Columbia的擬南芥(Arabidopsisthaliana)PCR擴增AtCKX6基因(用於克隆的非同源序列為小寫字母)
5』引物的序列gctctagaTCAGGGAAAAGAACCATGCTTATAG(SEQ ID NO23)
3』引物的序列gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG(SEQ ID NO24)
該PCR擴增產生的1949-bp PCR片段做為平端產物插入pCR-BluntII-TOPO克隆載體(Invitrogen)中。
實施例9.菸草幼苗的生長測定證明了AtCKX轉基因植物的早期活力
在體外，在MS培養基上播種過量表達AtCKX1-50和AtCKX2-38的轉基因植物和WT菸草的種子，冷處理後放到培養室4天，6天後發芽。發芽後10天對幼苗生長進行觀察(也參見圖8C)，概述如下。每個克隆評分至少20個個體。在2個其它試驗中已經獲得了相似的數據。
A.根系的總長株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38長度(mm)61.1122.0106.5
B.初生根長度株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38長度(mm)32.3±2.650.8±4.552.4±4.8
C.側根長度株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38長度(mm)9.8±5.518.0±8.113.0±6.0
D.不定根長度株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38長度(mm)19.0±5.053.0±12.042.0±9.8
E.側根(LR)數株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38LR數1.9±0.96.5±2.25.6±2.0
F.不定根(AR)數株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38AR數2.2±0.63.5±0.93.6±1.3
AtCKX1和AtCKX2植物，普遍的觀察結果
發芽後10天，過量表達AtCKX1和AtCKX2的菸草植物幼苗比未轉化的對照植物多60％的不定根和多3倍的側根。初生根長度增加約70％。這和更多和更長的側根和次生根一起引起了總根長70％-100％的增加。這些結果表明細胞分裂素氧化酶的過量表達增加了主根和不定根的生長和發育，引起了早期活力。
實施例10.過量表達AtCKX1的菸草植物中改變的植物形態學的組織學分析
不同組織的顯微分析表明細胞數量和細胞形成速率的明顯變化反映了AtCKX轉基因植物中的形態學變化(參見圖10)。儘管AtCKX1轉基因植物枝條頂端分生組織(SAM)比野生型中的枝條頂端分生組織(SAM)小，並且較少數細胞佔據側生器官形成的中央區域和周圍區域之間的空間，但是細胞具有相同的大小(圖10A)。做為減少的細胞分裂素含量結果的減少的細胞數和SAM大小表明細胞分裂素在SAM增殖控制中有作用。在分化模式中沒有顯著的變化出現，表明SAM中分化區域的空間組織很大程度上獨立於細胞數和局部細胞分裂素濃度。細胞分裂素過量表達植物中葉的總組織模式沒有改變。然而，韌皮部和木質部的大小顯著地減小(圖10B)。相反，葉片薄壁組織和表皮細胞的平均細胞大小增加4到5倍(圖10C，D)。AtCKX1轉基因植物新的細胞以野生型葉3-4％速率形成，並且估計最終的葉細胞數是野生型的5-6％。這表明葉片中維持細胞分裂周期絕對需要細胞分裂素。花器官細胞大小或細胞形狀都沒有改變，並且野生型和AtCKX轉基因植物中每個蒴果的種子產量相似。AtCKX1轉基因植物根分生組織的細胞群擴大約4倍，並且在中和側柱(columnella)中的細胞數增加(圖10E，F)。由於所有類型根細胞直徑的增加，最終的根直徑增加了60％。除了常常在轉基因的根中注意到皮層細胞第四層外，根徑向模式在野生型和轉基因植物中相同(圖10G)。增加的細胞數和輕微降低的細胞長度表明根生長的增加是由於增加的進入細胞周期的細胞數，而不是增加的細胞生長引起的。在降低的細胞分裂素含量存在的情況下，根分生組織細胞離開分生組織並且開始伸長之前，它們必需進行額外的有絲分裂循環。因此從分生組織中退出被對細胞分裂素敏感的機理調節。明顯地，細胞分裂素在根分生組織中有負的調節作用，並且野生型細胞分裂素濃度抑制最大根系的發育。因此，通過過量表達細胞分裂素氧化酶降低活性細胞分裂素的水平刺激根發育，與WT植物比較，其引起了具有更多側根和不定根以及根大小上的增加。
實施例11.過量表達AtCKX1和AtCKX2的菸草植物具有降低的細胞分裂素含量
在檢測的16種不同細胞分裂素代謝物中，最大的變化出現在AtCKX2過量表達子的iP型細胞分裂素中(表10)iP型細胞分裂素含量總的降低在表達AtCKX2的植物中比AtCKX1轉基因植物中更顯著。AtCKX1轉基因植物在枝條中顯示了較強的表型。不知道哪種細胞分裂素代謝物與分析的不同性狀有關。可能不同細胞分裂素形式在各種發育過程中起不同的作用。注意到Z型細胞分裂素的改變較小，其可能是由於底物不同的可接近性或蛋白質的較低底物特異性引起的。各個轉基因克隆中iP和Z代謝物的總含量是野生型的31％和63％之間。轉基因植物中細胞分裂素O-葡糖苷的儲藏庫也降低了(表10)。轉基因幼苗中N-葡糖苷和DHZ-型細胞分裂素的濃度非常低，並且沒有改變或者僅僅微量地改變(未示出數據)。
表10.AtCKX轉基因植物中細胞分裂素含量。如Faiss等，1997所述進行細胞分裂素提取、免疫純化、HPLC分離和通過ELISA定量。分析每個克隆約100株2周齡幼苗的3個單獨混合樣品(2.5g/樣品)。濃度是pmol x g鮮重-1。縮寫iP，N6-(Δ2異戊烯基)腺嘌呤；iPR，N6-(Δ2異戊烯基)腺嘌呤核苷；iPRP，N6-(Δ2異戊烯基)腺嘌呤核苷5』-單磷酸；Z，反式-玉米素(ZR，玉米素核苷；ZRP，玉米素核苷5』-單磷酸；ZOG，玉米素O-葡糖苷；ZROG，玉米素核苷O-葡糖苷。
株系 WT AtCKX1-2 AtCKX1-28AtCKX2-38 AtCKX2-40
細胞分裂素
濃度 濃度 WT的％濃度 WT的％ 濃度 WT的％濃度 WT的％
代謝物
iP5.90±1.804.76±0.82814.94±2.62841.82±0.44312.85±0.6248
IPR 2.36±0.741.53±0.14650.75±0.27320.55±0.39230.89±0.0738
IPRP 3.32±0.730.87±0.26261.12±0.13340.80±0.48241.68±0.4551
Z 0.24±0.060.17±0.02710.22±0.03920.21±0.06880.22±0.0292
ZR0.60±0.130.32±0.12530.34±0.03570.34±0.15570.32±0.0553
ZRP 0.39±0.170.42±0.11107 0.28±0.15720.06±0.01150.17±0.0644
ZOG 0.46±0.200.32±0.09700.26±0.13570.20±0.07430.12±0.0226
ZROG 0.48±0.170.30±0.06630.47±0.02980.23±0.05480.30±0.1363
總計 13.75 8.69 638.38 614.21 316.55 48
實施例12.嫁接試驗表明由於AtCKX過量表達引起的矮化和增加的根發育局限於轉基因組織
為了研究細胞分裂素氧化酶過量表達的哪些表型效應局限於表達組織，即，是細胞或器官自主性狀，進行嫁接試驗。在AtCKX2轉基因菸草和WT菸草之間進行交互嫁接。用在該試驗中的轉基因植物是AtCKX2-38，其顯示了以根生長的增加和地上植物部分發育的減少為特徵的強的表型。如實施例3到6所述，這是由菸草和擬南芥(arabidopsis)中細胞分裂素氧化酶過量表達引起的兩種重要的表型。
當嫁接時，植物約15cm高，嫁接接合部約是土壤以上10cm。圖12表示嫁接後15周的植物。主要的結果是(i)嫁接在轉基因砧木上的WT接穗的地上表型與WT對照嫁接(＝WT砧木上WT接穗)相似。重要地，這表明AtCKX2轉基因在砧木中的過量表達不誘導植物非轉基因的地上部分的矮化(參見圖12A)。轉基因砧木根生長的改善被維持，表明AtCKX轉基因植物根生長的改善是自主的，不依賴於AtCKX轉基因枝條(圖12C)。有趣地，嫁接在轉基因砧木上的WT接穗看上去更健康，並且發育得更好。值得注意地，這些植物中基葉的衰老延遲(參見圖12A)；(ii)嫁接在WT砧木上的轉基因接穗看上去與其來源的轉基因植物的地上部分相似，即，枝條的矮化表型也是自主的，並且不依賴於改善的根生長(參見圖12B)。
除了上述嫁接在轉基因砧木上WT枝條的更好外觀外，注意到了WT枝條基部上不定根的形成(圖12D，右側植物)。不定根形成也在AtCKX轉基因植物的莖上出現，但沒有在WT對照嫁接植物莖上出現(圖12D，左側植物)，因此看起來是非自主性狀。
概括地，本發明公開了過量表達AtCKX的菸草中根形成的增加和枝條矮化是自主的性狀，並且可以由嫁接方法分離開。令人驚訝的是，AtCKX轉基因砧木上WT接穗的嫁接產生了生長更有活力的植物和葉衰老的延遲。
作為嫁接的可替代方案，可以利用組織特異性啟動子以解離細胞分裂素過量表達的自主表型效應。因此，本發明公開了組織特異性方式的細胞分裂素氧化酶過量表達可以用於改變植物如枝條或根系的形態學。
實施例13.轉基因植物中根特異性啟動子控制下AtCKX基因的表達引起了增加的根產生
在擬南芥(Arabidopsis)根clavata同系物啟動子(SEQ ID NO36)控制下克隆AtCKX基因(參見實施例4)，所述啟動子是驅動根特異性表達的啟動子。其它根特異性啟動子也可以用於本發明目的。參見表5示例的根特異性啟動子。
在根中特異地表達AtCKX基因的轉基因植物顯示了增加的根產量，沒有不利地影響植物地上部分的生長和發育。觀察到了對葉衰老和地上植物部分生長的積極作用。
實施例14轉基因植物中衰老誘導型啟動子控制下的AtCKX基因抑制導致了延遲的葉片衰老和增加的種子產量
在衰老誘導型啟動子控制下克隆來源於AtCKX基因，並設計為抑制內源細胞分裂素氧化酶基因表達的嵌合基因構建體。例如，可以利用來源於衰老相關基因(SAG)的啟動子，如SAG12啟動子(Quirino等，2000)。特異性在衰老葉中抑制內源細胞分裂素氧化酶基因的轉基因植物顯示了延遲的葉衰老和更高的種子產量，沒有不利地影響植物的形態學及生長和發育。
實施例15.雌性繁殖器官中AtCKX基因的過量表達引起了單性果實發育
在賦予雌性繁殖器官過量表達的啟動子控制下，克隆AtCKX基因的開放讀框，所述啟動子如，例如是來源於的金魚草(Antirrhinum majus)的DefH9啟動子或其同系物之一，其在胎座和胚珠中有高度表達特異性。這些組織中具有增加的細胞分裂素氧化酶活性的轉基因植物顯示了單性果實發育
實施例16.AtCKX基因過量表達引起了種子和子葉大小的增加
在35s啟動子控制下過量表達細胞分裂素氧化酶(AtCKX)基因的轉基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)植物如上文所述。轉基因植物，特別是那些表達AtCKX1和AtCKX3基因的轉基因植物，發育成大小增加的種子，該大小增加幾乎完全是由增大的胚引起的。在圖13A到13E中示出了種子，胚和早期胚後期表型的細節。表11示出了野生型和4個研究的AtCKX基因的每個基因的2個獨立克隆的種子重量。通過分析每個克隆5個不同批次的200粒種子獲得平均重量。定量評估表明AtCKX1和AtCKX3表達克隆的種子重量比野生型高約1.8-2.3倍。AtCKX2和AtCKX4表達株系種子重量的增加範圍是10-25％(表11和圖14)。
由於曾預期減少的細胞分裂素含量將與減小的器官生長有關，因此種子、胚和子葉大小和重量的增加是意外的。種子、胚和子葉大小增加的一個可能原因是細胞分裂素在這些貯藏器官中以前未知的負調節功能。至今，僅知道根的細胞分裂素在器官生長控制中的負調節功能(Werner等，2001)。因此，我們提出在細胞分裂素負調節其生長的組織中，細胞分裂素氧化酶基因的定位表達引起該組織增加的生長。例如，在子葉發育期間CKX基因的定位表達可能引起子葉生長的增加，並且在子葉作為貯藏器官的物種中，引起增加的產量和幼苗增加的生長性能。在AtCKX1和AtCKX3表達子中種子總數減少。然而，以前還沒有擬南芥(Arabidopsis)中減少的種子數與大小增加有關的報導。
實施例17
用帶有CaMV 35S啟動子控制下的AtCKX1基因或AtCKX2基因的載體Bin-Hyg-TX轉化菸草(Nicotiana tabacum L.cv.Samsun NN)葉外植體。進一步栽培來源於這些轉化植物的幾個株系，並分析它們的種子大小(表12)。
具有轉基因CKX1和CKX2的菸草都顯示了作為種子大小參數的種子面積的增加。
表11 WTCKX1-11-7CKX1-15-1 CKX2-2-4CKX2-9-3CKX3-9-4CKX3-12-13CKX4-37-2CKX4-41-7種子重量 0.0158± 0.00090.0372±0.00150.0352±0.0023 0.0201± 0.00170.0180±0.00010.0340±0.00270.0280±0.00270.0185±0.00040.0179±0.0007WT的％ 100235.5222.6 126.7113.7215.0176.7116.8112.7
表12 菸草植物 描述 轉基因平均種子面積2 T1 38無合子 (nullizygote)03 T1 38無合子0.2794 T1 38無合子0.2975 WT0.2486 WT0.2437 WT0.2648 WT0.2771 T1 38轉基因的CKX20.3539 T1 38轉基因的CKX20.28110 T1 38轉基因的CKX20.29311 T1 38轉基因的CKX20.32912 T1 38轉基因的CKX20.28213 T1 8轉基因的CKX10.27814 T1 8轉基因的CKX10.31515 T1 8轉基因的CKX10.32216 T1 8轉基因的CKX10.312
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序列表
CROP005PCT2.ST25.txt
Werner，Tomas
Schmulling，Thomas
修飾植物形態學、生物化學和生理學的方法
CROP-005-PCT2
US 10/014,101
2001-10-12
36
PatentIn version 3.1
1
2236
DNA
擬南芥(Arabidopsis thaliana)
1
atgggattga cctcatcctt acggttccat agacaaaaca acaagacttt cctcggaatc 60
ttcatgatct tagttctaag ctgtatacca ggtagaacca atctttgttc caatcattct 120
gttagtaccc caaaagaatt accttcttca aatccttcag atattcgttc ctcattagtt 180
tcactagatt tggagggtta tataagcttc gacgatgtcc acaatgtggc caaggacttt 240
ggcaacagat accagttacc acctttggca attctacatc caaggtcagt ttttgatatt 300
tcatcgatga tgaagcatat agtacatctg ggctccacct caaatcttac agtagcagct 360
agaggccatg gtcactcgct tcaaggacaa gctctagctc atcaaggtgt tgtcatcaaa 420
atggagtcac ttcgaagtcc tgatatcagg atttataagg ggaagcaacc atatgttgat 480
gtctcaggtg gtgaaatatg gataaacatt ctacgcgaga ctctaaaata cggtctttca 540
ccaaagtcct ggacagacta ccttcatttg accgttggag gtacactatc taatgctgga 600
atcagcggtc aagcattcaa gcatggaccc caaatcaaca acgtctacca gctagagatt 660
gttacaggta tttcattcat gctttatctc tgcggtagtc tcaaaaaaat atgcacctgt 720
aaagaatatc catctcttca tgagcaaaaa cactgacgac tttaaataat ttttgactat 780
aaaacaagag tgcataggca caaatgtgaa atatgcaaca cacaattgta acttgcacca 840
agaaaaaagt tataaaaaca aacaactgat aagcaatata tttccaatat ttaatcaggg 900
aaaggagaag tcgtaacctg ttctgagaag cggaattctg aacttttctt cagtgttctt 960
ggcgggcttg gacagtttgg cataatcacc cgggcacgga tctctcttga accagcaccg1020
catatggtaa agttctatct tgaacaaagt tcaaacaata tacgctatga ttctaagaac1080
cactttcctg acacagtcaa ataactttta ataggttaaa tggatcaggg tactctactc1140
tgacttttct gcattttcaa gggaccaaga atatctgatt tcgaaggaga aaacttttga1200
ttacgttgaa ggatttgtga taatcaatag aacagacctt ctcaataatt ggcgatcgtc1260
CROP005PCT2.ST25.txt
attcagtccc aacgattcca cacaggcaag cagattcaag tcagatggga aaactcttta1320
ttgcctagaa gtggtcaaat atttcaaccc agaagaagct agctctatgg atcaggtaag1380
atgtgaaagc aatatataac tagacttagt ttccacagag agctccaaat caaccgttgg1440
ctactagcct actaacataa tgaatggttg ccgtgcagga aactggcaag ttactttcag1500
agttaaatta tattccatcc actttgtttt catctgaagt gccatatatc gagtttctgg1560
atcgcgtgca tatcgcagag agaaaactaa gagcaaaggg tttatgggag gttccacatc1620
cctggctgaa tctcctgatt cctaagagca gcatatacca atttgctaca gaagttttca1680
acaacattct cacaagcaac aacaacggtc ctatccttat ttatccagtc aatcaatcca1740
agtaagtgag caaaatgcca aaagcaaatg cgtccagtga ttctgaaaca taaattacta1800
accatatcca acattttgtg gtttcaggtg gaagaaacat acatctttga taactccaaa1860
tgaagatata ttctatctcg tagcctttct cccctctgca gtgccaaatt cctcagggaa1920
aaacgatcta gagtaccttt tgaaacaaaa ccaaagagtt atgaacttct gcgcagcagc1980
aaacctcaac gtgaagcagt atttgcccca ttatgaaact caaaaagagt ggaaatcaca2040
ctttggcaaa agatgggaaa catttgcaca gaggaaacaa gcctacgacc ctctagcgat2100
tctagcacct ggccaaagaa tattccaaaa gacaacagga aaattatctc ccatccaact2160
cgcaaagtca aaggcaacag gaagtcctca aaggtaccat tacgcatcaa tactgccgaa2220
acctagaact gtataa2236
2
575
PRT
擬南芥
2
Met Gly Leu Thr Ser Ser Leu Arg Phe His Arg Gln Asn Asn Lys Thr
1 5 10 15
Phe Leu Gly Ile Phe Met Ile Leu Val Leu Ser Cys Ile Pro Gly Arg
20 25 30
Thr Asn Leu Cys Ser Asn His Ser Val Ser Thr Pro Lys Glu Leu Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Pro Ser Asp Ile Arg Ser Ser Lau Val Ser Leu Asp Leu
50 55 60
Glu Gly Tyr Ile Ser Phe Asp Asp Val His Asn Val Ala Lys Asp Phe
65 70 75 80
CROP005PCT2.ST25.txt
Gly Asn Arg Tyr Gln Leu Pro Pro Leu Ala Ile Leu His Pro Arg Ser
85 90 95
Val Phe Asp Ile Ser Ser Met Met Lys His Ile Val His Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Asn Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Leu Gln
115 120 125
Gly Gln Ala Leu Ala His Gln Gly Val Val Ile Lys Met Glu Ser Leu
130 135 140
Arg Ser Pro Asp Ile Arg Ile Tyr Lys Gly Lys Gln Pro Tyr Val Asp
145 150 155 160
Val Ser Gly Gly Glu Ile Trp Ile Asn Ile Leu Arg Glu Thr Leu Lys
165 170 175
Tyr Gly Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val
180 185 190
Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Lys His
195 200 205
Gly Pro Gln Ile Asn Asn Val Tyr Gln Leu Glu Ile Val Thr Gly Lys
210 215 220
Gly Glu Val Val Thr Cys Ser Glu Lys Arg Asn Ser Glu Leu Phe Phe
225 230 235 240
Ser Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg
245 250 255
Ile Ser Leu Glu Pro Ala Pro His Met Val Lys Trp Ile Arg Val Leu
260 265 270
Tyr Ser Asp Phe Ser Ala Phe Ser Arg Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser
275 280 285
Lys Glu Lys Thr Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Ile Asn Arg
290 295 300
Thr Asp Leu Leu Asn Asn Trp Arg Ser Ser Phe Ser Pro Asn Asp Ser
305 310 315 320
Thr Gln Ala Ser Arg Phe Lys Ser Asp Gly Lys Thr Leu Tyr Cys Leu
325 330 335
CROP005PCT2.ST25.txt
Glu Val Val Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Glu Ala Ser Ser Met Asp Gln
340 345 350
Glu Thr Gly Lys Leu Leu Ser Glu Leu Asn Tyr Ile Pro Ser Thr Leu
355 360 365
Phe Ser Ser Glu Val Pro Tyr Ile Glu Phe Leu Asp Arg Val His Ile
370 375 380
Ala Glu Arg Lys Leu Arg Ala Lys Gly Leu Trp Glu Val Pro His Pro
385 390 395 400
Trp Leu Asn Leu Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ile Tyr Gln Phe Ala Thr
405 410 415
Glu Val Phe Asn Asn Ile Leu Thr Ser Asn Asn Asn Gly Pro Ile Leu
420 425 430
Ile Tyr Pro Val Asn Gln Ser Lys Trp Lys Lys His Thr Ser Leu Ile
435 440 445
Thr Pro Asn Glu Asp Ile Phe Tyr Leu Val Ala Phe Leu Pro Ser Ala
450 455 460
Val Pro Asn Ser Ser Gly Lys Asn Asp Leu Glu Tyr Leu Leu Lys Gln
465 470 475 480
Asn Gln Arg Val Met Asn Phe Cys Ala Ala Ala Asn Leu Asn Val Lys
485 490 495
Gln Tyr Leu Pro His Tyr Glu Thr Gln Lys Glu Trp Lys Ser His Phe
500 505 510
Gly Lys Arg Trp Glu Thr Phe Ala Gln Arg Lys Gln Ala Tyr Asp Pro
515 520 525
Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly Gln Arg Ile Phe Gln Lys Thr Thr Gly
530 535 540
Lys Leu Ser Pro Ile Gln Leu Ala Lys Ser Lys Ala Thr Gly Ser Pro
545 550 555 560
Gln Arg Tyr His Tyr Ala Ser Ile Leu Pro Lys Pro Arg Thr Val
565 570 575
3
2991
CROP005PCT2.ST25.txt
DNA
擬南芥
3
atggctaatc ttcgtttaat gatcacttta atcacggttt taatgatcac caaatcatca 60
aacggtatta aaattgattt acctaaatcc cttaacctca ccctctctac cgatccttcc 120
atcatctccg cagcctctca tgacttcgga aacataacca ccgtgacccc cggcggcgta 180
atctgcccct cctccaccgc tgatatctct cgtctcctcc aatacgccgc aaacggaaaa 240
agtacattcc aagtagcggc tcgtggccaa ggccactcct taaacggcca agcctcggtc 300
tccggcggag taatcgtcaa catgacgtgt atcactgacg tggtggtttc aaaagacaag 360
aagtacgctg acgtggcggc cgggacgtta tgggtggatg tgcttaagaa gacggcggag 420
aaaggggtgt cgccggtttc ttggacggat tatttgcata taaccgtcgg aggaacgttg 480
tcgaatggtg gaattggtgg tcaagtgttt cgaaacggtc ctcttgttag taacgtcctt 540
gaattggacg ttattactgg tacgcatctt ctaaactttg atgtacatac aacaacaaaa 600
actgtttttg ttttatagta tttttcattt tttgtaccat aggttttatg ttttatagtt 660
gtgctaaact tcttgcacca cacgtaagtc ttcgaaacac aaaatgcgta acgcatctat 720
atgttttttg tacatattga atgttgttca tgagaaataa agtaattaca tatacacaca 780
tttattgtcg tacatatata aataattaaa gacaaatttt cacaattggt agcgtgttaa 840
tttgggattt ttgtaatgta catgcatgac gcatgcatat ggagcttttc ggttttctta 900
gatttgtgta gtatttcaaa tatatcattt attttctttc gaataaagag gtggtatatt 960
tttaaaatag caacatttca gaatttttct ttgaatttac actttttaaa ttgttattgt1020
taatatggat tttgaataaa taatttcagg gaaaggtgaa atgttgacat gctcgcgaca1080
gctaaaccca gaattgttct atggagtgtt aggaggtttg ggtcaatttg gaattataac1140
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aaataaaata taacctaacg gaaataatta ttttactaat cggataatgt ctgattaaaa1380
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actcaaatat actccaaagt ttagaatata gtcttctgac taattagaat cttacaaccg1740
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CROP005PCT2.ST25.txt
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4
501
PRT
擬南芥
4
Met Ala Asn Leu Arg Leu Met Ile Thr Leu Ile Thr Val Leu Met Ile
1 5 10 15
Thr Lys Ser Ser Asn Gly Ile Lys Ile Asp Leu Pro Lys Ser Leu Asn
20 25 30
Leu Thr Leu Ser Thr Asp Pro Ser Ile Ile Ser Ala Ala Ser His Asp
35 40 45
Phe Gly Asn Ile Thr Thr Val Thr Pro Gly Gly Val Ile Cys Pro Ser
50 55 60
CROP005PCT2.ST25.txt
Ser Thr Ala Asp Ile Ser Arg Leu Leu Gln Tyr Ala Ala Asn Gly Lys
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gln Val Ala Ala Arg Gly Gln Gly His Ser Leu Asn Gly
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100 105 110
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115 120 125
Thr Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Ala Glu Lys Gly Val Ser
130 135 140
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Ile Thr Val Gly Gly Thr Leu
145 150 155160
Ser Asn Gly Gly Ile Gly Gly Gln Val Phe Arg Asn Gly Pro Leu Val
165 170 175
Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Met Leu
180 185 190
Thr Cys Ser Arg Gln Leu Asn Pro Glu Leu Phe Tyr Gly Val Leu Gly
195 200 205
Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Val Leu Asp
210 215 220
His Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Phe Arg Met Leu Tyr Ser Asp Phe
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Thr Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Met Ala Asn Asp
245 250 255
Ile Gly Val Asp Tyr Leu Glu Gly Gln Ile Phe Leu Ser Asn Gly Val
260 265 270
Val Asp Thr Ser Phe Phe Pro Pro Ser Asp Gln Ser Lys Val Ala Asp
275 280 285
Leu Val Lys Gln His Gly Ile Ile Tyr Val Leu Glu Val Ala Lys Tyr
290 295 300
Tyr Asp Asp Pro Asn Leu Pro Ile Ile Ser Lys Val Ile Asp Thr Leu
CROP005PCT2.ST25.txt
305 310 315 320
Thr Lys Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Gly Phe Ile Ser Met His Asp Val
325 330 335
Ala Tyr Phe Asp Phe Leu Asn Arg Val His Val Glu Glu Asn Lys Leu
340 345 350
Arg Ser Leu Gly Leu Trp Glu Leu Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Tyr
355 360 365
Val Pro Lys Ser Arg Ile Leu Asp Phe His Asn Gly Val Val Lys Asp
370 375 380
Ile Leu Leu Lys Gln Lys Ser Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Tyr Pro
385 390 395 400
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405 410 415
Ile Asp Glu Asp Val Ile Tyr Ile Ile Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr
420 425 430
Pro Lys Asp Leu Pro Glu Val Glu Ser Val Asn Glu Lys Ile Ile Arg
435 440 445
Phe Cys Lys Asp Ser Gly Ile Lys Ile Lys Gln Tyr Leu Met His Tyr
450 455 460
Thr Ser Lys Glu Asp Trp Ile Glu His Phe Gly Ser Lys Trp Asp Asp
465 470 475 480
Phe Ser Lys Arg Lys Asp Leu Phe Asp Pro Lys Lys Leu Leu Ser Pro
485 490 495
Gly Gln Asp Ile Phe
500
5
3302
DNA
擬南芥
5
atggcgagtt ataatcttcg ttcacaagtt cgtcttatag caataacaat agtaatcatc 60
attactctct caactccgat cacaaccaac acatcaccac aaccatggaa tatcctttca 120
cacaacgaat tcgccggaaa actcacctcc tcctcctcct ccgtcgaatc agccgccaca 180
CROP005PCT2.ST25.txt
gatttcggcc acgtcaccaa aatcttccct tccgccgtct taatcccttc ctccgttgaa 240
gacatcacag atctcataaa actctctttt gactctcaac tgtcttttcc tttagccgct 300
cgtggtcacg gacacagcca ccgtggccaa gcctcggcta aagacggagt tgtggtcaac 360
atgcggtcca tggtaaaccg ggatcgaggt atcaaggtgt ctaggacctg tttatatgtt 420
gacgtggacg ctgcgtggct atggattgag gtgttgaata aaactttgga gttagggtta 480
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ggaattagtg gacaaacgtt tcggtacggt ccacagatca ctaatgttct agagatggat 600
gttattactg gtacgtacca cgatcttttt cacacagaga ttaaaaaaaa cagtaatagt 660
gattttaact tcgtacgttt ctgatagaca acaaagaact tcgtacgttt ttcgaagttt 720
tttcgtcttt ttcattttag atctgcgcgg ccatttttgg ttatgctatt gtttgtttgt 780
attgtttgtc tctgtttatt tatttctcga acttgttgat agcttttctt cttttcacac 840
atcaatctaa tcaccttttt tggtcttaag attagaaaga agatacggac taggtaaaaa 900
taggtggttg taaacgtaga cgcattaaaa aaatattggt ttttttattt tttgataagc 960
aaaattggtg gttggtctaa gattataaac ttgatattaa tgcaaaggtc gatctagcaa1020
tagaagatta atcaatattc ttggtgtttt aacaacagat tatttcatca ttaaaatcgt1080
gaaacaaaga aattttggta gtatacatta cgtgtagttt tgttagttta ttaaaaaaaa1140
tagtatatag ttttgttaaa acgcgattta tttagtaaca cattagtata ttacacgttt1200
aaccaactaa actttttttt ttgaataatt atgttctata tttcttactc aaattatgca1260
aatttcgtgg attcgaagtc aaatttctgc gaaatttaca tggtcatata ttataaaact1320
gttcatataa cccggtgaac aaacagacaa ttaagggttt gaatggttac ggcggttggg1380
gcggacacaa ccgtcaatag atcagaccgt tttttattta ccattcatca attatattcc1440
gcagtggttt ggggtaaaaa aaatagaaga aaaccgcagc ggaccaattc cataccgttt1500
ttacatacaa ataaacatgg tgcgcaacgg tttattgtcc gcctcaaaaa tgaaatggac1560
taaaccgcag ataaattaga ccgctttgtc cgctgcctcc attcatagac taaaaaaaaa1620
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CROP005PCT2.ST25.txt
ggatcttttc ttcgcggtgt taggaggttt gggtcaattc ggcattataa caagagccag2160
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ag 3302
6
523
PRT
擬南芥
6
Met Ala Ser Tyr Asn Leu Arg Ser Gln Val Arg Leu Ile Ala Ile Thr
1 5 10 15
Ile Val Ile Ile Ile Thr Leu Ser Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr Ser
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Pro Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser His Asn Glu Phe Ala Gly Lys Leu
35 40 45
CROP005PCT2.ST25.txt
Thr Ser Ser Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly His
50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala Ser
100 105 110
Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg Asp
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Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Cys Leu Tyr Val Asp Val Asp Ala
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro Gln
180 185 190
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195 200 205
Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Phe Ala Val Leu
210 215 220
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu
225 230 235 240
Glu Val Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Ile Asp
245 250 255
Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Val Ile Ser Lys Thr Asp
260 265 270
Gly Val Asp Phe Leu Glu Gly Ser Ile Met Val Asp His Gly Pro Pro
275 280 285
Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile
290 295 300
CROP005PCT2.ST25.txt
Ala Ser Met Val Lys Arg His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Val
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405 410 415
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Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Gly
435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
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Gly Gln Asn Ile Phe Gln Lys Ile Asn Ser Ser
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7
2782
DNA
擬南芥
7
CROP005PCT2.ST25.txt
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8
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PRT
擬南芥
8
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Ile Ser Leu Thr Pro Thr Leu Ile Lys Ser Asp Glu Gly Ile Asp Val
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Ile Ser Ala Ala Ser His Asp Phe Gly Asn Ile Thr Asp Glu Asn Pro
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65 70 75 80
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Ala Ser Thr Phe Lys Val Ala Ala Arg Gly Gln Gly His Ser Leu Arg
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Ala Val Asp Arg Gly Val Ser Pro Val Thr Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr
165 170 175
Leu Ser Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Gly Gly Gln Thr
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Phe Met Phe Val Gln Asp Val Pro Tyr Phe Asp Phe Leu Asn Arg Val
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DNA
擬南芥
9
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10
536
PRT
擬南芥
10
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ile Cys Lys Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Leu Asn Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly
20 25 30
Ala Ile Asp Val Asp Gly His Phe Thr Val His Pro Ser Asp Leu Ala
35 40 45
Ser Val Ser Ser Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu
50 55 60
Ala Val Leu His Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Val Arg
65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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Val Leu Lys Lys Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile
165 170 175
Ser Gly Gln Ala Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu
180 185 190
Leu Asp Val Val Thr Gly Lys Gly Glu Val Met Arg Cys Ser Glu Glu
195 200 205
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210 215 220
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CROP005PCT2.ST25.txt
Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met Asn Lys Asp
405 410 415
Lys Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu Glu Val Phe
420 425 430
Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Thr Asp Gly Glu Glu Thr
435 440 445
Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile Leu Glu Phe
450 455 460
Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro His His Ala
465 470 475 480
Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Phe Gly Asp Lys Trp Asp Arg Phe
485 490 495
Arg Ser Leu Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu Ala Thr Gly
500 505 510
Gln Arg Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ser Leu Phe Pro Pro Ser Ser
515 520 525
Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Trp
530 535
11
1936
DNA
擬南芥
11
atgcttatag taagaagttt caccatcttg cttctcagct gcatagcctt taagttggct 60
tgctgcttct ctagcagcat ttcttctttg aaggcgcttc ccctagtagg ccatttggag 120
tttgaacatg tccatcacgc ctccaaagat tttggaaatc gataccagtt gatccctttg 180
gcggtcttac atcccaaatc ggtaagcgac atcgcctcaa cgatacgaca catctggatg 240
atgggcactc attcacagct tacagtggca gcgagaggtc gtggacattc actccaaggc 300
caagctcaaa caagacatgg aattgttata cacatggaat cactccatcc ccagaagctg 360
caggtctaca gtgtggattc ccctgctcca tatgttgatg tgtctggtgg tgagctgtgg 420
ataaacattt tgcatgagac cctcaagtac gggcttgcac caaaatcatg gacggattac 480
ctgcatttaa ctgtaggtgg tactctgtcc aatgctggaa taagcggcca ggcattccga 540
catggaccac agatcagcaa tgttcatcaa ctggagattg tcacaggtta gttcagagtt 600
CROP005PCT2.ST25.txt
gcagtattcg tgttttgaaa gcatagactc tatatggttg gtgactatta acaacatgaa 660
gagattcccg agaatagcta cccactaatg tcatgcctat ttattgactg caggaaaagg 720
cgagatccta aactgtacaa agaggcagaa cagcgactta tttaatggtg ttcttggtgg 780
tttaggtcag tttggcatca taacgcgggc aagaatagca ttggaaccag caccaaccat 840
ggtaaacaat aaataaataa aaaacttaaa aactgaacac gcgtgtgtcc tcctaactct 900
gtataatgga caggtaaaat ggataagagt gttatacctg gattttgcag cttttgccaa 960
ggaccaagag caactaatat ctgcccaggg ccacaaattc gattacatag aagggtttgt1020
gataataaac aggacaggcc tcctgaacag ctggaggttg tctttcaccg cagaagagcc1080
tttagaagca agccaattca agtttgatgg aaggactctg tattgtctgg agctagccaa1140
gtatttgaag caagataaca aagacgtaat caaccaggtg agaaaacaga gtagaagcaa1200
tcggtagaat cttctttggt agatgacatt cattggaact gaaaatatat atatatttgt1260
ccaatccagg aagtgaaaga aacattatca gagctaagct acgtgacgtc gacactgttt1320
acaacggagg tagcatatga agcattcttg gacagggtac atgtgtctga ggtaaaactc1380
cgatcgaaag ggcagtggga ggtgccacat ccatggctga acctcctggt accaagaagc1440
aaaatcaatg aatttgcaag aggtgtattt ggaaacatac taacggatac aagcaacggc1500
ccagtcatcg tctacccagt gaacaaatca aagtaagaaa gaaagaaaga aagagctagt1560
catgattttg tttcttttca cttgttgaca aaacaaaagc atgttggtga gcaggtggga1620
caatcaaaca tcagcagtaa caccggagga agaggtattc tacctggtgg cgatcctaac1680
atcggcatct ccagggtcgg caggaaagga tggagtagaa gagatcttga ggcggaacag1740
aagaatactg gaattcagtg aagaagcagg gatagggttg aagcagtatc tgccacatta1800
cacgacaaga gaagagtgga gatcccattt cggggacaag tggggagaat ttgtgaggag1860
gaaatccaga tatgatccat tggcaattct tgcgcctggc caccgaattt ttcaaaaggc1920
agtctcatac tcatga1936
12
504
PRT
擬南芥
12
Met Leu Ile Val Arg Ser Phe Thr Ile Leu Leu Leu Ser Cys Ile Ala
1 5 10 15
Phe Lys Leu Ala Cys Cys Phe Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala
20 25 30
Leu Pro Leu Val Gly His Leu Glu Phe Glu His Val His His Ala Ser
CROP005PCT2.ST25.txt
35 40 45
Lys Asp Phe Gly Asn Arg Tyr Gln Leu Ile Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Lys Ser Val Ser Asp Ile Ala Ser Thr Ile Arg His Ile Trp Met
65 70 75 80
Met Gly Thr His Ser Gln Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly Arg Gly His
85 90 95
Ser Leu Gln Gly Gln Ala Gln Thr Arg His Gly Ile Val Ile His Met
100 105 110
Glu Ser Leu His Pro Gln Lys Leu Gln Val Tyr Ser Val Asp Ser Pro
115 120 125
Ala Pro Tyr Val Asp Val Ser Gly Gly Glu Leu Trp Ile Asn Ile Leu
130 135 140
His Glu Thr Leu Lys Tyr Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Leu His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly
165 170 175
Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val His Gln Leu Glu
180 185 190
Ile Val Thr Gly Lys Gly Glu Ile Leu Asn Cys Thr Lys Arg Gln Asn
195 200 205
Ser Asp Leu Phe Asn Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile
210 215 220
Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ala Leu Glu Pro Ala Pro Thr Met Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gln Leu Ile Ser Ala Gln Gly His Lys Phe Asp Tyr Ile Glu Gly
245 250 255
Phe Val Ile Ile Asn Arg Thr Gly Leu Leu Asn Ser Trp Arg Leu Ser
260 265 270
Phe Thr Ala Glu Glu Pro Leu Glu Ala Ser Gln Phe Lys Phe Asp Gly
275 280 285
CROP005PCT2.ST25.txt
Arg Thr Leu Tyr Cys Leu Glu Leu Ala Lys Tyr Leu Lys Gln Asp Asn
290 295 300
Lys Asp Val Ile Asn Gln Glu Val Lys Glu Thr Leu Ser Glu Leu Ser
305 310 315 320
Tyr Val Thr Ser Thr Leu Phe Thr Thr Glu Val Ala Tyr Glu Ala Phe
325 330 335
Leu Asp Arg Val His Val Ser Glu Val Lys Leu Arg Ser Lys Gly Gln
340 345 350
Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Leu Val Pro Arg Ser Lys
355 360 365
Ile Asn Glu Phe Ala Arg Gly Val Phe Gly Asn Ile Leu Thr Asp Thr
370 375 380
Ser Asn Gly Pro Val Ile Val Tyr Pro Val Asn Lys Ser Lys Trp Asp
385 390 395 400
Asn Gln Thr Ser Ala Val Thr Pro Glu Glu Glu Val Phe Tyr Leu Val
405 410 415
Ala Ile Leu Thr Ser Ala Ser Pro Gly Ser Ala Gly Lys Asp Gly Val
420 425 430
Glu Glu Ile Leu Arg Arg Asn Arg Arg Ile Leu Glu Phe Ser Glu Glu
435 440 445
Ala Gly Ile Gly Leu Lys Gln Tyr Leu Pro His Tyr Thr Thr Arg Glu
450 455 460
Glu Trp Arg Ser His Phe Gly Asp Lys Trp Gly Glu Phe Val Arg Arg
465 470 475 480
Lys Ser Arg Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly His Arg Ile
485 490 495
Phe Gln Lys Ala Val Ser Tyr Ser
500
13
31
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
CROP005PCT2.ST25.txt
13
cggtcgacat gggattgacc tcatccttac g31
14
35
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
14
gcgtcgactt atacagttct aggtttcggc agtat 35
15
33
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
15
gcggtaccag agagagaaac ataaacaaat ggc 33
16
31
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
16
gcggtaccca attttacttc caccaaaatg c 31
17
34
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
17
gcggtacctt cattgataag aatcaagcta ttca 34
18
31
DNA
人工序列
CROP005PCT2.ST25.txt

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
18
gcggtaccca aagtggtgag aacgactaac a 31
19
28
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
19
gcggtacccc cattaaccta cccgtttg 28
20
32
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
20
gcggtaccag acgatgaacg tacttgtctg ta32
21
28
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
21
ggggtacctt gatgaatcgt gaaatgac 28
22
31
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
22
ggggtaccct ttcctcttgg ttttgtcctg t 31
23
32
DNA
CROP005PCT2.ST25.txt
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
23
gctctagatc aggaaaagaa ccatgcttat ag32
24
32
DNA
人工序列

人工序列的說明寡核苷酸引物或探針
24
gctctagatc atgagtatga gactgccttt tg 32
25
1728
DNA
擬南芥
25
atgggattga cctcatcctt acggttccat agacaaaaca acaagacttt cctcggaatc 60
ttcatgatct tagttctaag ctgtatacca ggtagaacca atctttgttc caatcattct 120
gttagtaccc caaaagaatt accttcttca aatccttcag atattcgttc ctcattagtt 180
tcactagatt tggagggtta tataagcttc gacgatgtcc acaatgtggc caaggacttt 240
ggcaacagat accagttacc acctttggca attctacatc caaggtcagt ttttgatatt 300
tcatcgatga tgaagcatat agtacatctg ggctccacct caaatcttac agtagcagct 360
agaggccatg gtcactcgct tcaaggacaa gctctagctc atcaaggtgt tgtcatcaaa 420
atggagtcac ttcgaagtcc tgatatcagg atttataagg ggaagcaacc atatgttgat 480
gtctcaggtg gtgaaatatg gataaacatt ctacgcgaga ctctaaaata cggtctttca 540
ccaaagtcct ggacagacta ccttcatttg accgttggag gtacactatc taatgctgga 600
atcagcggtc aagcattcaa gcatggaccc caaatcaaca acgtctacca gctagagatt 660
gttacaggga aaggagaagt cgtaacctgt tctgagaagc ggaattctga acttttcttc 720
agtgttcttg gcgggcttgg acagtttggc ataatcaccc gggcacggat ctctcttgaa 780
ccagcaccgc atatggttaa atggatcagg gtactctact ctgacttttc tgcattttca 840
agggaccaag aatatctgat ttcgaaggag aaaacttttg attacgttga aggatttgtg 900
ataatcaata gaacagacct tctcaataat tggcgatcgt cattcagtcc caacgattcc 960
acacaggcaa gcagattcaa gtcagatggg aaaactcttt attgcctaga agtggtcaaa1020
CROP005PCT2.ST25.txt
tatttcaacc cagaagaagc tagctctatg gatcaggaaa ctggcaagtt actttcagag1080
ttaaattata ttccatccac tttgttttca tctgaagtgc catatatcga gtttctggat1140
cgcgtgcata tcgcagagag aaaactaaga gcaaagggtt tatgggaggt tccacatccc1200
tggctgaatc tcctgattcc taagagcagc atataccaat ttgctacaga agttttcaac1260
aacattctca caagcaacaa caacggtcct atccttattt atccagtcaa tcaatccaag1320
tggaagaaac atacatcttt gataactcca aatgaagata tattctatct cgtagccttt1380
ctcccctctg cagtgccaaa ttcctcaggg aaaaacgatc tagagtacct tttgaaacaa1440
aaccaaagag ttatgaactt ctgcgcagca gcaaacctca acgtgaagca gtatttgccc1500
cattatgaaa ctcaaaaaga gtggaaatca cactttggca aaagatggga aacatttgca1560
cagaggaaac aagcctacga ccctctagcg attctagcac ctggccaaag aatattccaa1620
aagacaacag gaaaattatc tcccatccaa ctcgcaaagt caaaggcaac aggaagtcct1680
caaaggtacc attacgcatc aatactgccg aaacctagaa ctgtataa 1728
26
1506
DNA
擬南芥
26
atggctaatc ttcgtttaat gatcacttta atcacggttt taatgatcac caaatcatca 60
aacggtatta aaattgattt acctaaatcc cttaacctca ccctctctac cgatccttcc 120
atcatctccg cagcctctca tgacttcgga aacataacca ccgtgacccc cggcggcgta 180
atctgcccct cctccaccgc tgatatctct cgtctcctcc aatacgccgc aaacggaaaa 240
agtacattcc aagtagcggc tcgtggccaa ggccactcct taaacggcca agcctcggtc 300
tccggcggag taatcgtcaa catgacgtgt atcactgacg tggtggtttc aaaagacaag 360
aagtacgctg acgtggcggc cgggacgtta tgggtggatg tgcttaagaa gacggcggag 420
aaaggggtgt cgccggtttc ttggacggat tatttgcata taaccgtcgg aggaacgttg 480
tcgaatggtg gaattggtgg tcaagtgttt cgaaacggtc ctcttgttag taacgtcctt 540
gaattggacg ttattactgg gaaaggtgaa atgttgacat gctcgcgaca gctaaaccca 600
gaattgttct atggagtgtt aggaggtttg ggtcaatttg gaattataac gagagccaga 660
attgttttgg accatgcacc taaacgggcc aaatggtttc ggatgctcta cagtgatttc 720
acaactttta caaaggacca agaacgtttg atatcaatgg caaacgatat tggagtcgac 780
tatttagaag gtcaaatatt tctatcaaac ggtgtcgttg acacctcttt tttcccacct 840
tcagatcaat ctaaagtcgc tgatctagtc aagcaacacg gtatcatcta tgttcttgaa 900
gtagccaagt attatgatga tcccaatctc cccatcatca gcaaggttat tgacacatta 960
CROP005PCT2.ST25.txt
acgaaaacat taagttactt gcccgggttc atatcaatgc acgacgtggc ctacttcgat1020
ttcttgaacc gtgtacatgt cgaagaaaat aaactcagat ctttgggatt atgggaactt1080
cctcatcctt ggcttaacct ctacgttcct aaatctcgga ttctcgattt tcataacggt1140
gttgtcaaag acattcttct taagcaaaaa tcagcttcgg gactcgctct tctctatcca1200
acaaaccgga ataaatggga caatcgtatg tcggcgatga taccagagat cgatgaagat1260
gttatatata ttatcggact actacaatcc gctaccccaa aggatcttcc agaagtggag1320
agcgttaacg agaagataat taggttttgc aaggattcag gtattaagat taagcaatat1380
ctaatgcatt atactagtaa agaagattgg attgagcatt ttggatcaaa atgggatgat1440
ttttcgaaga ggaaagatct atttgatccc aagaaactgt tatctccagg gcaagacatc1500
ttttga 1506
27
1572
DNA
擬南芥
27
atggcgagtt ataatcttcg ttcacaagtt cgtcttatag caataacaat agtaatcatc 60
attactctct caactccgat cacaaccaac acatcaccac aaccatggaa tatcctttca 120
cacaacgaat tcgccggaaa actcacctcc tcctcctcct ccgtcgaatc agccgccaca 180
gatttcggcc acgtcaccaa aatcttccct tccgccgtct taatcccttc ctccgttgaa 240
gacatcacag atctcataaa actctctttt gactctcaac tgtcttttcc tttagccgct 300
cgtggtcacg gacacagcca ccgtggccaa gcctcggcta aagacggagt tgtggtcaac 360
atgcggtcca tggtaaaccg ggatcgaggt atcaaggtgt ctaggacctg tttatatgtt 420
gacgtggacg ctgcgtggct atggattgag gtgttgaata aaactttgga gttagggtta 480
acgccggttt cttggacgga ttatttgtat ttaacagtcg gtgggacgtt atcaaacggc 540
ggaattagtg gacaaacgtt tcggtacggt ccacagatca ctaatgttct agagatggat 600
gttattactg gaaaaggaga gattgcaact tgttccaagg acatgaactc ggatcttttc 660
ttcgcggtgt taggaggttt gggtcaattc ggcattataa caagagccag aattaaactt 720
gaagtagctc cgaaaagggc caagtggtta aggtttctat acatagattt ctccgaattc 780
acaagagatc aagaacgagt gatatcgaaa acggacggtg tagatttctt agaaggttcc 840
attatggtgg accatggccc accggataac tggagatcca cgtattatcc accgtccgat 900
cacttgagga tcgcctcaat ggtcaaacga catcgtgtca tctactgcct tgaagtcgtc 960
aagtattacg acgaaacttc tcaatacaca gtcaacgagg aaatggagga gttaagcgat1020
agtttaaacc atgtaagagg gtttatgtac gagaaagatg tgacgtatat ggatttccta1080
CROP005PCT2.ST25.txt
aaccgagttc gaaccggaga gctaaacctg aaatccaaag gccaatggga tgttccacat1140
ccatggctta atctcttcgt accaaaaact caaatctcca aatttgatga tggtgttttt1200
aagggtatta tcctaagaaa taacatcact agcggtcctg ttcttgttta tcctatgaat1260
cgcaacaagt ggaatgatcg gatgtctgcc gctatacccg aggaagatgt attttatgcg1320
gtagggtttt taagatccgc gggttttgac aattgggagg cttttgatca agaaaacatg1380
gaaatactga agttttgtga ggatgctaat atgggggtta tacaatatct tccttatcat1440
tcatcacaag aaggatgggt tagacatttt ggtccgaggt ggaatatttt cgtagagaga1500
aaatataaat atgatcccaa aatgatatta tcaccgggac aaaatatatt tcaaaaaata1560
aactcgagtt ag1572
28
1575
DNA
擬南芥
28
atgactaata ctctctgttt aagcctcatc accctaataa cgctttttat aagtttaacc 60
ccaaccttaa tcaaatcaga tgagggcatt gatgttttct tacccatatc actcaacctt 120
acggtcctaa ccgatccctt ctccatctct gccgcttctc acgacttcgg taacataacc 180
gacgaaaatc ccggcgccgt cctctgccct tcctccacca cggaggtggc tcgtctcctc 240
cgtttcgcta acggaggatt ctcttacaat aaaggctcaa ccagccccgc gtctactttc 300
aaagtggctg ctcgaggcca aggccactcc ctccgtggcc aagcctctgc acccggaggt 360
gtcgtcgtga acatgacgtg tctcgccatg gcggctaaac cagcggcggt tgttatctcg 420
gcagacggga cttacgctga cgtggctgcc gggacgatgt gggtggatgt tctgaaggcg 480
gcggtggata gaggcgtctc gccggttaca tggacggatt atttgtatct cagcgtcggc 540
gggacgttgt cgaacgctgg aatcggtggt cagacgttta gacacggccc tcagattagt 600
aacgttcatg agcttgacgt tattaccgga aaaggtgaaa tgatgacttg ctctccaaag 660
ttaaaccctg aattgttcta tggagtttta ggaggtttgg gtcaattcgg tattataacg 720
agggccagga ttgcgttgga tcatgcaccc acaagggtga aatggtctcg catactctac 780
agtgacttct cggcttttaa aagagaccaa gagcgtttaa tatcaatgac caatgatctc 840
ggagttgact ttttggaagg tcaacttatg atgtcaaatg gcttcgtaga cacctctttc 900
ttcccactct ccgatcaaac aagagtcgca tctcttgtga atgaccaccg gatcatctat 960
gttctcgaag tagccaagta ttatgacaga accacccttc ccattattga ccaggtgatt1020
gacacgttaa gtagaactct aggtttcgct ccagggttta tgttcgtaca agatgttccg1080
tatttcgatt tcttgaaccg tgtccgaaac gaagaagata aactcagatc tttaggacta1140
CROP005PCT2.ST25.txt
tgggaagttc ctcatccatg gcttaacatc tttgtcccgg ggtctcgaat ccaagatttt1200
catgatggtg ttattaatgg ccttcttcta aaccaaacct caacttctgg tgttactctc1260
ttctatccca caaaccgaaa caaatggaac aaccgcatgt caacgatgac accggacgaa1320
gatgtttttt atgtgatcgg attactgcaa tcagctggtg gatctcaaaa ttggcaagaa1380
cttgaaaatc tcaacgacaa ggttattcag ttttgtgaaa actcgggaat taagattaag1440
gaatatttga tgcactatac aagaaaagaa gattgggtta aacattttgg accaaaatgg1500
gatgattttt taagaaagaa aattatgttt gatcccaaaa gactattgtc tccaggacaa1560
gacatattta attaa 1575
29
1611
DNA
擬南芥
29
atgacgtcaa gctttcttct cctgacgttc gccatatgta aactgatcat agccgtgggt 60
ctaaacgtgg gccccagtga gctcctccgc atcggagcca tagatgtcga cggccacttc 120
accgtccacc cttccgactt agcctccgtc tcctcagact tcggtatgct gaagtcacct 180
gaagagccat tggccgtgct tcatccatca tcggccgaag acgtggcacg actcgtcaga 240
acagcttacg gttcagccac ggcgtttccg gtctcagccc gaggccacgg ccattccata 300
aacggacaag ccgcggcggg gaggaacggt gtggtggttg aaatgaacca cggcgtaacc 360
gggacgccca agccactcgt ccgaccggat gaaatgtatg tggatgtatg gggtggagag 420
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gaggtgatga gatgctcaga agaagagaac acaaggctat tccatggagt tcttggtgga 660
ttaggtcaat ttgggatcat cactcgagca cgaatctctc tcgaaccagc tccccaaagg 720
gtgagatgga tacgggtatt gtattcgagc ttcaaagtgt ttacggagga ccaagagtac 780
ttaatctcaa tgcatggtca attaaagttt gattacgtgg aaggttttgt gattgtggac 840
gaaggactcg tcaacaattg gagatcttct ttcttctctc cacgtaaccc cgtcaagatc 900
tcctctgtta gttccaacgg ctctgttttg tattgccttg agatcaccaa gaactaccac 960
gactccgact ccgaaatcgt tgatcaggaa gttgagattc tgatgaagaa attgaatttc1020
ataccgacat cggtctttac aacggattta caatatgtgg actttctcga ccgggtacac1080
aaggccgaat tgaagctccg gtccaagaat ttatgggagg ttccacaccc atggctcaac1140
ctcttcgtgc caaaatcaag aatctctgac ttcgataaag gcgttttcaa gggcattttg1200
CROP005PCT2.ST25.txt
ggaaataaaa caagtggccc tattcttatc taccccatga acaaagacaa atgggacgag1260
aggagctcag ccgtgacgcc ggatgaggaa gttttctatc tggtggctct attgagatca1320
gctttaacgg acggtgaaga gacacagaag ctagagtatc tgaaagatca gaaccgtcgg1380
atcttggagt tctgtgaaca agccaagatc aatgtgaagc agtatcttcc tcaccacgca1440
acacaggaag agtgggtggc tcattttggg gacaagtggg atcggttcag aagcttaaag1500
gctgagtttg atccgcgaca catactcgct actggtcaga gaatctttca aaacccatct1560
ttgtctttgt ttcctccgtc gtcgtcttct tcgtcagcgg cttcatggtg a 1611
30
1515
DNA
擬南芥
30
atgcttatag taagaagttt caccatcttg cttctcagct gcatagcctt taagttggct 60
tgctgcttct ctagcagcat ttcttctttg aaggcgcttc ccctagtagg ccatttggag 120
tttgaacatg tccatcacgc ctccaaagat tttggaaatc gataccagtt gatccctttg 180
gcggtcttac atcccaaatc ggtaagcgac atcgcctcaa cgatacgaca catctggatg 240
atgggcactc attcacagct tacagtggca gcgagaggtc gtggacattc actccaaggc 300
caagctcaaa caagacatgg aattgttata cacatggaat cactccatcc ccagaagctg 360
caggtctaca gtgtggattc ccctgctcca tatgttgatg tgtctggtgg tgagctgtgg 420
ataaacattt tgcatgagac cctcaagtac gggcttgcac caaaatcatg gacggattac 480
ctgcatttaa ctgtaggtgg tactctgtcc aatgctggaa taagcggcca ggcattccga 540
catggaccac agatcagcaa tgttcatcaa ctggagattg tcacaggaaa aggcgagatc 600
ctaaactgta caaagaggca gaacagcgac ttatttaatg gtgttcttgg tggtttaggt 660
cagtttggca tcataacgcg ggcaagaata gcattggaac cagcaccaac catggaccaa 720
gagcaactaa tatctgccca gggccacaaa ttcgattaca tagaagggtt tgtgataata 780
aacaggacag gcctcctgaa cagctggagg ttgtctttca ccgcagaaga gcctttagaa 840
gcaagccaat tcaagtttga tggaaggact ctgtattgtc tggagctagc caagtatttg 900
aagcaagata acaaagacgt aatcaaccag gaagtgaaag aaacattatc agagctaagc 960
tacgtgacgt cgacactgtt tacaacggag gtagcatatg aagcattctt ggacagggta1020
catgtgtctg aggtaaaact ccgatcgaaa gggcagtggg aggtgccaca tccatggctg1080
aacctcctgg taccaagaag caaaatcaat gaatttgcaa gaggtgtatt tggaaacata1140
ctaacggata caagcaacgg cccagtcatc gtctacccag tgaacaaatc aaagtgggac1200
aatcaaacat cagcagtaac accggaggaa gaggtattct acctggtggc gatcctaaca1260
CROP005PCT2.ST25.txt
tcggcatctc cagggtcggc aggaaaggat ggagtagaag agatcttgag gcggaacaga1320
agaatactgg aattcagtga agaagcaggg atagggttga agcagtatct gccacattac1380
acgacaagag aagagtggag atcccatttc ggggacaagt ggggagaatt tgtgaggagg1440
aaatccagat atgatccatt ggcaattctt gcgcctggcc accgaatttt tcaaaaggca1500
gtctcatact catga 1515
31
84
DNA
擬南芥
31
tcagcttcgg gactcgctct tctctatcca acaaaccgga ataaatggga caatcgtatg 60
tcggcgatga taccagagat cgat 84
32
28
PRT
擬南芥
32
Ser Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Tyr Pro Thr Asn Arg Asn Lys Trp
1 5 10 15
Asp Asn Arg Met Ser Ala Met Ile Pro Glu Ile Asp
20 25
33
2814
DNA
擬南芥
33
atgaatcgta tgacgtcaag ctttcttctc ctgacgttcg ccatatgtaa actgatcata 60
gccgtgggtc taaacgtggg ccccagtgag ctcctccgca tcggagccat agatgtcgac 120
ggccacttca ccgtccaccc ttccgactta gcctccgtct cctcagactt cggtatgctg 180
aagtcacctg aagagccatt ggccgtgctt catccatcat cggccgaaga cgtggcacga 240
ctcgtcagaa cagcttacgg ttcagccacg gcgtttccgg tctcagcccg aggccacggc 300
cattccataa acggacaagc cgcggcgggg aggaacggtg tggtggttga aatgaaccac 360
ggcgtaaccg ggacgcccaa gccactcgtc cgaccggatg aaatgtatgt ggatgtatgg 420
ggtggagagt tatgggtcga tgtgttgaag aaaacgttgg agcatggctt agcaccaaaa 480
tcatggacgg attacttgta tctaaccgtt ggaggtacac tctccaatgc aggaatcagt 540
ggtcaagctt ttcaccatgg tcctcaaatt agtaacgtcc ttgagctcga cgttgtaact 600
CROP005PCT2.ST25.txt
ggttagtatt aaaacattca agttcatata ttttaaatgc ttttgtctga agttttacta 660
ataacaagaa attgatacca aaaagtaggg aaaggagagg tgatgagatg ctcagaagaa 720
gagaacacaa ggctattcca tggagttctt ggtggattag gtcaatttgg gatcatcact 780
cgagcacgaa tctctctcga accagctccc caaagggtaa tattttttta atgactagct 840
atcaaaaatc cctggcgggt ccatacgttg taatcttttt agtttttact gttgatggta 900
ttttttatat attttggata ataaaaccct aaaatggtat attgtgatga caggtgagat 960
ggatacgggt attgtattcg agcttcaaag tgtttacgga ggaccaagag tacttaatct1020
caatgcatgg tcaattaaag tttgattacg tggaaggttt tgtgattgtg gacgaaggac1080
tcgtcaacaa ttggagatct tctttcttct ctccacgtaa ccccgtcaag atctcctctg1140
ttagttccaa cggctctgtt ttgtattgcc ttgagatcac caagaactac cacgactccg1200
actccgaaat cgttgatcag gtcactttca ttattcactt agaaaaaagc gatattttca1260
ttttttatat tgatgaatat ctggaaggat ttaacgctat gcgactattg ggaaatcatt1320
atgaaaaaat atttagttta tatgattgaa agtggtctcc atagtatttt tgttgtgtcg1380
actttattat aacttaaatt tggaagagga catgaagaag aagccagaga ggatctacag1440
agatctagct tttccacctg aacttaataa tgcacattta tataattatt tttcttcttc1500
taaagtttag tttatcacta gcgaattaat catggttact aattaagtag tggacagggt1560
catggaccac tcactcacca aataatgatt cctctttact cttaagttta attttaataa1620
aaccaactct actggaatct taacttatcc ttggttttgg taggctttta tagcaacacg1680
gtttttttaa ttttcctatt ccagattttg tatattaaat gtcgattttt tttctttttg1740
tttcaggaag ttgagattct gatgaagaaa ttgaatttca taccgacatc ggtctttaca1800
acggatttac aatatgtgga ctttctcgac cgggtacaca aggccgaatt gaagctccgg1860
tccaagaatt tatgggaggt tccacaccca tggctcaacc tcttcgtgcc aaaatcaaga1920
atctctgact tcgataaagg cgttttcaag ggcattttgg gaaataaaac aagtggccct1980
attcttatct accccatgaa caaagacaag taagtcttga cattaccatt gattactact2040
tctaaatttc ttctctagaa aaaagaataa aacgagtttt gcattgcatg catgcaaagt2100
tacacttgtg gggattaatt agtggtccaa gaaaaaaagt ttgtcaaaat tgaaaaaaac2160
tagacacgtg gtacatggga ttgtccgaaa aacgttgtcc acatgtgcat cgaaccagct2220
aagattgaca acaacacttc gtcggctcgt atttctcttt ttgttttgtg accaaatccg2280
atggtccaga ttgggtttat ttgtttttaa gttcctagaa ctcatggtgg gtgggtccca2340
atcagattct cctagaccaa accgatctca acgaaccctc cgcacatcat tgattattac2400
attaatatag atattgtcgt tgctgacgtg tcgtaatttg atgttattgt cagatgggac2460
gagaggagct cagccgtgac gccggatgag gaagttttct atctggtggc tctattgaga2520
CROP005PCT2.ST25.txt
tcagctttaa cggacggtga agagacacag aagctagagt atctgaaaga tcagaaccgt2580
cggatcttgg agttctgtga acaagccaag atcaatgtga agcagtatct tcctcaccac2640
gcaacacagg aagagtgggt ggctcatttt ggggacaagt gggatcggtt cagaagctta2700
aaggctgagt ttgatccgcg acacatactc gctactggtc agagaatctt tcaaaaccca2760
tctttgtctt tgtttcctcc gtcgtcgtct tcttcgtcag cggcttcatg gtga 2814
34
1620
DNA
擬南芥
34
atgaatcgta tgacgtcaag ctttcttctc ctgacgttcg ccatatgtaa actgatcata 60
gccgtgggtc taaacgtggg ccccagtgag ctcctccgca tcggagccat agatgtcgac 120
ggccacttca ccgtccaccc ttccgactta gcctccgtct cctcagactt cggtatgctg 180
aagtcacctg aagagccatt ggccgtgctt catccatcat cggccgaaga cgtggcacga 240
ctcgtcagaa cagcttacgg ttcagccacg gcgtttccgg tctcagcccg aggccacggc 300
cattccataa acggacaagc cgcggcgggg aggaacggtg tggtggttga aatgaaccac 360
ggcgtaaccg ggacgcccaa gccactcgtc cgaccggatg aaatgtatgt ggatgtatgg 420
ggtggagagt tatgggtcga tgtgttgaag aaaacgttgg agcatggctt agcaccaaaa 480
tcatggacgg attacttgta tctaaccgtt ggaggtacac tctccaatgc aggaatcagt 540
ggtcaagctt ttcaccatgg tcctcaaatt agtaacgtcc ttgagctcga cgttgtaact 600
gggaaaggag aggtgatgag atgctcagaa gaagagaaca caaggctatt ccatggagtt 660
cttggtggat taggtcaatt tgggatcatc actcgagcac gaatctctct cgaaccagct 720
ccccaaaggg tgagatggat acgggtattg tattcgagct tcaaagtgtt tacggaggac 780
caagagtact taatctcaat gcatggtcaa ttaaagtttg attacgtgga aggttttgtg 840
attgtggacg aaggactcgt caacaattgg agatcttctt tcttctctcc acgtaacccc 900
gtcaagatct cctctgttag ttccaacggc tctgttttgt attgccttga gatcaccaag 960
aactaccacg actccgactc cgaaatcgtt gatcaggaag ttgagattct gatgaagaaa1020
ttgaatttca taccgacatc ggtctttaca acggatttac aatatgtgga ctttctcgac1080
cgggtacaca aggccgaatt gaagctccgg tccaagaatt tatgggaggt tccacaccca1140
tggctcaacc tcttcgtgcc aaaatcaaga atctctgact tcgataaagg cgttttcaag1200
ggcattttgg gaaataaaac aagtggccct attcttatct accccatgaa caaagacaaa1260
tgggacgaga ggagctcagc cgtgacgccg gatgaggaag ttttctatct ggtggctcta1320
ttgagatcag ctttaacgga cggtgaagag acacagaagc tagagtatct gaaagatcag1380
CROP005PCT2.ST25.txt
aaccgtcgga tcttggagtt ctgtgaacaa gccaagatca atgtgaagca gtatcttcct1440
caccacgcaa cacaggaaga gtgggtggct cattttgggg acaagtggga tcggttcaga1500
agcttaaagg ctgagtttga tccgcgacac atactcgcta ctggtcagag aatctttcaa1560
aacccatctt tgtctttgtt tcctccgtcg tcgtcttctt cgtcagcggc ttcatggtga1620
35
539
PRT
擬南芥
35
Met Asn Arg Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ile Cys
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ile Ala Val Gly Leu Asn Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu
20 25 30
Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val Asp Gly His Phe Thr Val His Pro Ser
35 40 45
Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu
50 55 60
Glu Pro Leu Ala Val Leu His Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg
65 70 75 80
Leu Val Arg Thr Ala Tyr Gly Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala
85 90 95
Arg Gly His Gly His Ser Ile Asn Gly Gln Ala Ala Ala Gly Arg Asn
100 105 110
Gly Val Val Val Glu Met Asn His Gly Val Thr Gly Thr Pro Lys Pro
115 120 125
Leu Val Arg Pro Asp Glu Met Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu
130 135 140
Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn
165 170 175
Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn
180 185 190
CROP005PCT2.ST25.txt
Val Leu Glu Leu Asp Val Val Thr Gly Lys Gly Glu Val Met Arg Cys
195 200 205
Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly Leu
210 215 220
Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Gln Arg Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Lys Val
245 250 255
Phe Thr Glu Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly Gln Leu Lys
260 265 270
Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn
275 280 285
Asn Trp Arg Ser Ser Phe Phe Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile Ser
290 295 300
Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr His Asp Ser Asp Ser Glu Ile Val Asp Gln Glu Val Glu Ile
325 330 335
Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp
340 345 350
Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys
355 360 365
Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu
370 375 380
Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys
385 390 395 400
Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met
405 410 415
Asn Lys Asp Lys Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu
420 425 430
Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Thr Asp Gly
CROP005PCT2.ST25.txt
435 440 445
Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile
450 455460
Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro
465 470 475 480
His His Ala Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Phe Gly Asp Lys Trp
485 490 495
Asp Arg Phe Arg Ser Leu Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu
500 505 510
Ala Thr Gly Gln Arg Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ser Leu Phe Pro
515 520 525
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Trp
530 535
36
842
DNA
擬南芥
36
aagcttaaat gacaatttag taccttgggt tggtcatgat ttagagcgga acaaatatac 60
catacatcaa acgaggatat acagagaaaa ttcatggaag tatggaattt agaggacaat 120
ttctcttctg ggctacaacg gaccggccca ttcgctcatt tacccagagg tatcgagttt 180
gtggactttt gatgccgcta gagactattg gcatcggatt gaaaaaaatg tttacttcgt 240
tgttaacaat tttctgaatg caatattttc cttgtcatga atatttaaac ttgttattac 300
tttcttttag cttaggtgtg gacaattatg gagtttactt caaacgagga agaatcttaa 360
acgctcggtt caggtctcga aaacaaacca actcacaatc ctgacttaat tgaggaaaac 420
aatgcaaaac cacatgcatg cttccatatt tctatcataa tcttataaga aaaaacacta 480
ctaagtgaaa tgattctgta tatatataac caatgccttt tgttttgtga tattttatgt 540
atatataact attgactttt gtcatctatg gatagtgtct cgggctcttg gcaaacatat 600
ttcaaagaaa agttaatgac tgtaattaat taatctgaag ctagaaacag aaccccgagg 660
taaaagaaaa agacagagca catgaagttt agtactttta tatatttaat atatcattct 720
ttcttattgc ttatctctaa agcaaaaact tccctaaacc ctaagccaaa ggactcagat 780
cgatgcagaa ccaagaaggc ttgttttgga tttgagagcc aaatgcaaag aaaaaaactc 840
tt84權利要求
1、一種刺激根生長或增加側根或不定根形成或改變根向地性的方法，該方法包括增加植物或植物部分中植物細胞分裂素氧化酶或其它蛋白質的水平，所述其它蛋白質降低植物或植物部分中活性細胞分裂素的水平。
2、一種刺激根生長或增加側根或不定根形成或改變根向地性的方法，該方法包括表達編碼植物細胞分裂素氧化酶的核酸，所述核酸選自
(a)包含SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一個或其互補序列中給出的DNA序列的核酸，
(b)包含與SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一個或其互補序列對應的RNA序列的核酸，
(c)與SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一個或其互補序列特異性雜交的核酸，
(d)編碼包含SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，32或35任一個中給出的胺基酸序列的蛋白質的核酸或其互補序列，
(e)如(a)到(d)中任何一個所定義的核酸，其特徵在於所述核酸是DNA，基因組DNA，cDNA，合成DNA或其中用U置換T的RNA。
(f)由於遺傳密碼的原因，與SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一個中給出的核酸簡併或者與(a)到(e)任一個所定義的核酸簡併的核酸，
(g)由於生物間密碼子使用的差異，與編碼SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35任一個中給出的蛋白質的核酸不同或與如(a)到(e)任一個中所定義的核酸不同的核酸，
(h)由於等位基因間的差異，與編碼如SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中給出蛋白質的核酸或者如(a)到(e)中所定義的核酸不同的核酸，
(i)編碼SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35任一個中給出的蛋白質的核酸，
(j)在(a)到(i)任一個中所定義的核酸具有細胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，以及
(k)編碼植物細胞分裂素氧化酶的核酸，
或者包括表達，優選在根中表達，如下核酸，所述核酸編碼降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的蛋白質。
3、編碼具有細胞分裂素氧化酶活性的植物蛋白質的分離的核酸，所述核酸選自
(a)包含SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一個或其互補序列中給出的DNA序列的核酸，
(b)包含與SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一個或其互補序列對應的RNA序列的核酸，
(c)與SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一個或其互補序列中給出的核酸特異性雜交的核酸，
(d)編碼具有如下胺基酸序列的蛋白質的核酸，所述胺基酸序列包含在SEQ ID NO32中給出的多肽，並且該胺基酸序列與SEQ ID NO4中給出的胺基酸序列至少70％相似，
(e)編碼具有如下胺基酸序列的蛋白質的核酸，該胺基酸序列與在SEQ ID NO6中給出的胺基酸序列至少47％相似，
(f)編碼具有如下胺基酸序列的蛋白質的核酸，該胺基酸序列與在SEQ ID NO10或35中給出的胺基酸序列至少47％相似，
(g)編碼包含SEQ ID NOs4，6，10，32或35任一個中給出的胺基酸序列的蛋白質的核酸，
(h)由於遺傳密碼的原因，與SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，33或34任一個中給出的核酸簡併的或者與(a)到(g)任一個中所定義核酸簡併的核酸，
(i)由於生物間密碼子使用的差異，與編碼SEQ ID NOs4，6，10或35任一個中給出的蛋白質的核酸不同或與在(a)到(g)任一個中所定義核酸不同的核酸，
(j)由於等位基因間的差異，與編碼在SEQ ID NOs4，6，10或35中給出的蛋白質的核酸，或在(a)到(g)中所定義的核酸不同的核酸，
(k)核酸，其編碼SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一個中給出的核酸編碼的細胞分裂素氧化酶的免疫活性片段，或者在(a)到(j)任一個中所定義的核酸的免疫活性片段，
(l)核酸，其編碼SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一個中給出的核酸編碼的細胞分裂素氧化酶的功能性片段，或者如在(a)到(j)任一個中所定義的核酸的功能性片段，其中所述片段具有細胞分裂素生物學活性，和
(m)編碼在SEQ ID NOs4，6，10或35中所定義蛋白質的核酸，條件是所述核酸不是如下面任何一個Genbank記錄號所存放的核酸AC005917，AB024035和AC023754。
4、如權利要求3所述分離的核酸，其是DNA、cDNA、基因組DNA或合成DNA、或其中用U置換T的RNA。
5、與權利要求3或4所述核酸特異性雜交的至少15個核苷酸長的核酸分子。
6、特異性擴增權利要求3或4所述核酸的至少15個核苷酸長的核酸分子。
7、包含權利要求3或4所述核酸的載體。
8、如權利要求7所述的載體，其是表達載體，其中核酸可操作地連接一個或多個使得所述核酸在原核生物宿主細胞中表達的控制序列。
9、如權利要求7所述的載體，其是表達載體，其中核酸可操作地連接一個或多個使得所述核酸在真核生物宿主細胞中表達的控制序列。
10、包含權利要求3或4所述核酸的宿主細胞。
11、包含權利要求7所述載體的宿主細胞。
12、包含權利要求8所述載體的宿主細胞。
13、包含權利要求9所述載體的宿主細胞。
14、如權利要求10所述的宿主細胞，其中宿主細胞是細菌、昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
15、如權利要求11所述的宿主細胞，其中宿主細胞是細菌、昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
16、如權利要求12所述的宿主細胞，其中宿主細胞是細菌細胞。
17、如權利要求13所述的宿主細胞，其中宿主細胞是昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
18、權利要求3或4所述核酸編碼的分離的多肽，或其同系物或衍生物，或其免疫活性或功能性片段。
19、如權利要求18所述的多肽，包含SEQ ID NOs4，6，10或35任一個中所述胺基酸序列，或其同系物或衍生物，或其免疫活性或功能性片段。
20、一種產生具有細胞分裂素氧化酶活性的多肽的方法，該方法包括在使得該多肽表達的條件下培養權利要求11所述的宿主細胞，和從培養物回收產生的多肽。
21、一種產生具有細胞分裂素氧化酶活性的多肽的方法，該方法包括在使得該多肽表達的條件下培養權利要求12所述的宿主細胞，和從培養物回收產生的多肽。
22、一種產生具有細胞分裂素氧化酶活性的多肽的方法，該方法包括在使得該多肽表達的條件下培養權利要求13所述的宿主細胞，和從培養物回收產生的多肽。
23、特異性識別權利要求18所述多肽或其特定表位的抗體。
24、特異性識別權利要求19所述多肽或其特定表位的抗體。
25、產生轉基因植物、植物細胞或植物組織的方法，包括以可表達形式或載體在其中引入權利要求3或4所述核酸。
26、產生改變的植物、植物細胞或植物組織的方法，包括將權利要求18所述多肽直接引入所述植物的細胞、組織或器官中。
27、產生改變的植物、植物細胞或植物組織的方法，包括將權利要求19所述多肽直接引入所述植物的細胞、組織或器官中。
28、實現權利要求18所述多肽表達的方法，包括向植物細胞基因組中穩定引入編碼所述多肽的核酸或包含編碼所述多肽的核酸的載體，其中所述核酸可操作地與一個或多個控制序列連接。
29、實現權利要求19所述多肽表達的方法，包括向植物細胞基因組中穩定引入編碼所述多肽的核酸或包含編碼所述多肽的核酸的載體，其中所述核酸可操作地與一個或多個控制序列連接。
30、如權利要求25所述的方法，還包括從所述植物細胞再生植物。
31、如權利要求28所述的方法，還包括從所述植物細胞再生植物。
32、如權利要求29所述的方法，還包括從所述植物細胞再生植物。
33、包含權利要求3或4所述核酸的轉基因植物細胞，所述核酸可操作地與使得所述核酸在植物細胞或轉基因植物細胞中轉錄和/或表達的調節元件連接。
34、如權利要求33所述的轉基因植物細胞，其中所述核酸穩定地整合進入所述植物細胞基因組中。
35、包含權利要求33所述植物細胞的轉基因植物、植物部分或植物組織。
36、包含權利要求34所述植物細胞的轉基因植物、植物部分或植物組織。
37、權利要求35所述植物的可收穫部分。
38、權利要求36所述植物的可收穫部分。
39、權利要求37所述植物的可收穫部分，其選自種子、葉、果實、莖培養物、根莖、根、塊莖和鱗莖。
40、權利要求38所述植物的可收穫部分，其選自種子、葉、果實、莖培養物、根莖、根、塊莖和鱗莖。
41、來源於權利要求35所述植物或植物部分的後代。
42、來源於權利要求36所述植物或植物部分的後代。
43、一種刺激根生長的方法，包括權利要求3或4所述核酸的表達，或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
44、一種增加側根或不定根形成的方法，包括權利要求3或4所述核酸的表達，或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
45、一種改變根向地性的方法，包括改變權利要求3或4所述核酸的表達，或者包括降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。
46、如權利要求43所述方法，其中所述方法引起產量的增加。
47、如權利要求44所述方法，其中所述方法引起產量的增加。
48、如權利要求45所述方法，其中所述方法引起產量的增加。
49、如權利要求43所述的方法，其中在強組成型啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。
50、如權利要求44所述的方法，其中在強組成型啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。
51、如權利要求45所述的方法，其中在強組成型啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。
52、如權利要求43所述的方法，其中在優先在根中表達的啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。
53、如權利要求44所述的方法，其中在優先在根中表達的啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。
54、如權利要求45所述的方法，其中在優先在根中表達的啟動子控制下發生所述核酸的所述表達。
55、鑑定和獲得與權利要求18所述多肽相互作用的蛋白質的方法，包括利用權利要求18所述多肽的篩選測定法。
56、鑑定和獲得與權利要求19所述多肽相互作用的蛋白質的方法，包括利用權利要求19所述多肽的篩選測定法。
57、如權利要求55所述的方法，包括雙雜交篩選測定法，其中利用權利要求18所述多肽做為餌，cDNA文庫做為捕獲物。
58、如權利要求56所述的方法，包括雙雜交篩選測定法，其中利用權利要求19所述多肽做為餌，cDNA文庫做為捕獲物。
59、一種調節權利要求18所述多肽和通過篩選測定法可獲得的相互作用的蛋白質伴侶之間相互作用的方法，其中利用所述多肽。
60、一種調節權利要求19所述多肽和通過篩選測定法可獲得的相互作用的蛋白質伴侶之間相互作用的方法，其中利用所述多肽。
61、一種鑑定和獲得與權利要求18所述多肽相互作用的化合物的方法，包括步驟
(a)提供雙雜交系統，其中表達權利要求18所述多肽和通過權利要求55所述方法可獲得的相互作用的蛋白質伴侶，
(b)將所述化合物和a)中所定義的表達多肽形成的複合物相互作用，
(c)進行所述化合物與所述多肽或a)中所定義的表達多肽形成的複合物相互作用的測定。
62、一種鑑定和獲得與權利要求19所述多肽相互作用的化合物的方法，包括步驟
(a)提供雙雜交系統，其中表達權利要求19所述多肽和通過權利要求56所述方法可獲得的相互作用的蛋白質伴侶，
(b)將所述化合物和a)中所定義的表達多肽形成的複合物相互作用，
(c)進行所述化合物與所述多肽或a)中所定義的表達多肽形成的複合物相互作用的測定。
63、一種鑑定與權利要求18所述多肽特異性結合的化合物或化合物混合物的方法，包括
(a)在適於允許複合物形成的條件下，將所述化合物或化合物混合物和權利要求18所述多肽合併，和
(b)檢測複合物形成，其中複合物存在鑑定了特異性結合所述多肽的化合物或混合物。
64、一種鑑定與權利要求19所述多肽特異性結合的化合物或化合物混合物的方法，包括
(a)在適於允許複合物形成的條件下，將所述化合物或化合物混合物和權利要求19所述多肽合併，和
(b)檢測複合物形成，其中複合物存在鑑定了特異性結合所述多肽的化合物或混合物。
65.如權利要求61所述的方法，其中所述化合物抑制所述多肽的活性，並且可以用於化學試劑的合理設計。
66.如權利要求62所述的方法，其中所述化合物抑制所述多肽的活性，並且可以用於化學試劑的合理設計。
67.如權利要求63所述的方法，其中所述化合物或化合物混合物抑制所述多肽的活性，並且可以用於化學試劑的合理設計。
68.如權利要求64所述的方法，其中所述化合物或化合物混合物抑制所述多肽的活性，並且可以用於化學試劑的合理設計。
69.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求55所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
70.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求56所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
71.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求57所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
72.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求58所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
73.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求59所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
74.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求60所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
75.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求61所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
76.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求62所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
77.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求63所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
78.一種產生植物生長調節劑或除草劑組合物的方法，包括權利要求64所述方法的步驟和以適於應用在農業或植物細胞或組織培養中的形式配製從所述步驟獲得的化合物。
79.包含權利要求3或4所述核酸分子的診斷組合物。
80.包含權利要求7所述載體的診斷組合物。
81.包含權利要求8所述載體的診斷組合物。
82.包含權利要求18所述多肽的診斷組合物。
83.包含權利要求19所述多肽的診斷組合物。
84.包含權利要求23所述抗體的診斷組合物。
85.包含權利要求24所述抗體的診斷組合物。
86.一種增加根分生組織大小的方法，包括表達權利要求3或4所述核酸或者權利要求2中定義的核酸，或者包括表達編碼降低植物或植物部分，優選根中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸。
87.一種增加根大小的方法，包括表達權利要求3或4所述核酸或者權利要求2中定義的核酸，或者包括表達編碼降低植物或植物部分，優選根中活性細胞分裂素水平的蛋白質的另一種核酸。
88.一種增加枝條分生組織大小的方法，包括優選在枝條中下調權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達。
89.一種延遲葉衰老的方法，包括優選在開始衰老的葉中下調權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達。
90.一種改變葉衰老的方法，包括在開始衰老的葉中表達權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸。
91.一種增加葉厚度的方法，包括表達權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸，或者包括表達編碼降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸。
92.一種減小導管大小的方法，包括表達權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸，或者包括表達編碼降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸。
93.一種增加導管大小的方法，包括在植物或植物部分中下調權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達。
94.一種誘導單性結實的方法，包括權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達，或者包括編碼降低植物或植物部分中，優選胎座、胚珠和由它們衍生的組織中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸的表達。
95.一種改進幼苗直立性的方法，包括權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達，或者包括編碼降低幼苗中，優選幼苗根中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸的表達。
96.一種增加分枝的方法，包括在植物或植物部分中表達權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸。
97.一種改進倒伏抗性的方法，包括在植物或植物部分中，優選莖或腋芽中權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達。
98.包含過量表達植物細胞分裂素氧化酶的轉基因砧木的轉基因植物。
99.權利要求98所述轉基因植物，還包含接穗。
100.權利要求98或99所述植物的可收穫部分。
101.刺激根生長和發育的方法，包括在轉基因植物細胞或組織培養物中編碼植物細胞分裂素氧化酶的核酸的表達。
102.如權利要求61所述的方法，其中所述核酸是權利要求3所述的或權利要求2中定義的核酸中的至少一個。
103.一種增加種子大小或重量的方法，包括增加植物中細胞分裂素氧化酶的水平或活性，或者增加降低植物或植物部分，優選種子中活性細胞分裂素水平的蛋白質的水平或活性。
104.一種增加胚大小或重量的方法，包括增加植物中細胞分裂素氧化酶的水平或活性，或者增加降低植物或植物部分，優選胚中活性細胞分裂素水平的蛋白質的水平或活性。
105.一種增加子葉大小的方法，包括增加植物中細胞分裂素氧化酶的水平或活性，或者增加降低植物或植物部分，優選子葉中活性細胞分裂素水平的蛋白質的水平或活性。
106.一種增加種子大小或重量的方法，包括權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達，或者包括編碼降低植物或植物部分，優選種子中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸的表達。
107.一種增加胚大小或重量的方法，包括權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達，或者包括編碼降低植物或植物部分，優選胚中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸的表達。
108.一種增加子葉大小的方法，包括權利要求3或4所述核酸，或權利要求2中定義的核酸的表達，或者包括編碼降低植物或植物部分，優選子葉中活性細胞分裂素水平的蛋白質的核酸的表達。
109.如權利要求106所述的方法，其中核酸受啟動子控制，該啟動子控制優先在種子中表達。
110.如權利要求107所述的方法，其中核酸受啟動子控制，該啟動子控制優先在胚中表達。
111.如權利要求108所述的方法，其中核酸受啟動子控制，該啟動子控制優先在子葉中表達。
112.如權利要求109所述的方法，其中啟動子還對胚乳或糊粉是特異的。
113.如權利要求106所述的方法，其中所述方法引起產量的增加。
114.如權利要求106所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生長的增加或早期活力的增加。
115.如權利要求107所述的方法，其中所述方法引起產量的增加。
116.如權利要求107所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生長的增加或早期活力的增加。
117.如權利要求108所述的方法，其中所述方法引起產量的增加。
118.如權利要求108所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生長的增加或早期活力的增加。
119.如權利要求114所述的方法，其中幼苗生長或早期活力的增加與增加的脅迫耐受性有關。
120.如權利要求116所述的方法，其中幼苗生長或早期活力的增加與增加的脅迫耐受性有關。
121.如權利要求118所述的方法，其中幼苗生長或早期活力的增加與增加的脅迫耐受性有關。
122.一種增加植物中種子大小或重量的方法，該方法包括SEQ IDNOs1，5，25，或27任一個所示核酸或所述核酸的直向同源物的表達，其中所述直向同源物對該植物物種是特異的。
123.一種增加植物中胚大小或重量的方法，該方法包括SEQ ID NOs1，5，25，或27任一個所示核酸或所述核酸的直向同源物的表達，其中所述直向同源物對該植物物種是特異的。
124.一種增加植物中子葉大小的方法，該方法包括SEQ ID NOs1，5，25，或27任一個所示核酸或所述核酸的直向同源物的表達，其中所述直向同源物對該植物物種是特異的。
125.如權利要求122所述的方法，其中核酸受啟動子控制，該啟動子控制優先在種子中表達。
126.如權利要求123所述的方法，其中核酸受啟動子控制，該啟動子控制優先在胚中表達。
127.如權利要求124所述的方法，其中核酸受啟動子控制，該啟動子控制優先在子葉中表達。
128.如權利要求125所述的方法，其中啟動子還對胚乳或糊粉是特異的。
129.如權利要求122所述的方法，其中所述方法引起產量的增加。
130.如權利要求122所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生長的增加或早期活力的增加。
131.如權利要求123所述的方法，其中所述方法引起產量的增加。
132.如權利要求123所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生長的增加或早期活力的增加。
133.如權利要求124所述的方法，其中所述方法引起產量的增加。
134.如權利要求124所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生長的增加或早期活力的增加。
135.如權利要求130所述的方法，其中幼苗生長或早期活力的增加與增加的脅迫耐受性有關。
136.如權利要求132所述的方法，其中幼苗生長或早期活力的增加與增加的脅迫耐受性有關。
137.如權利要求134所述的方法，其中幼苗生長或早期活力的增加與增加的脅迫耐受性有關。
全文摘要
本發明涉及刺激根生長和/或增加側根和/或不定根形成和/或改變根向地性的方法，該方法包括在植物或植物部分中植物細胞分裂素氧化酶的表達。本發明也提供了增加種子大小和/或重量，胚大小和/或重量，子葉大小和/或重量的方法。該方法包括植物細胞分裂素氧化酶的表達或降低植物或植物部分中活性細胞分裂素水平的另一種蛋白質的表達。本發明也涉及新的植物細胞分裂素氧化酶蛋白質，編碼細胞分裂素氧化酶蛋白質的核酸序列及包含所述序列的載體，宿主細胞、轉基因細胞和植物。本發明也涉及所述序列用於改進根相關特性，包括增加產量和/或增強早期活力和/或修飾根冠比和/或改進倒伏抗性和/或增加乾旱耐受性和/或促進外植體體外繁殖和/或修飾細胞命運和/或植物發育和/或植物形態學和/或植物生物化學和/或植物生理學的用途。本發明也涉及所述序列在上述方法中的用途。本發明也涉及鑑定和獲得與細胞分裂素氧化酶蛋白質相互作用的蛋白質和化合物的方法。本發明還涉及所述化合物做為植物生長調節劑或除草劑的用途。
文檔編號G01N33/50GK1650016SQ0282669
公開日2005年8月3日 申請日期2002年12月10日 優先權日2001年12月10日
發明者託馬斯·施穆林, 託馬斯·維爾納 申請人:託馬斯·施穆林, 託馬斯·維爾納