增加商業化轉基因植物產生的dna構建體和方法

2023-09-19 13:11:30

專利名稱：增加商業化轉基因植物產生的dna構建體和方法
技術領域：
本發明涉及植物分子生物學和植物基因工程領域。採用植物基因工程方法創建新的DNA構建體，其包含異源遺傳元件，當它在轉基因植物中表達時提供了有用的表型。更具體地講，本發明包含DNA構建體和它的使用方法，從而讓更多從植物細胞培養物再生的轉基因植物能成功作為商業化植物的候選。
背景技術：
土壤桿菌(Agrobacterium)介導的植物細胞轉化方法涉及將植物細胞和組織暴露於含特定DNA質粒的土壤桿菌細胞懸浮液。具體構建這些DNA質粒以包含將在植物細胞中表達的轉基因(美國專利第5,034,322號)。最通常地，一個或多個轉基因為正向選擇標記基因，允許植物細胞在正向選擇化合物存在時生長，例如抗生素或除草劑。進一步操作這些細胞，再生為完整的能育植物。
通過土壤桿菌介導的轉化將轉基因導入植物的方法利用整合了轉基因遺傳元件的T-DNA(轉移DNA)，將那些遺傳元件轉移到植物的基因組中。將轉基因構建在DNA質粒載體中，並通常界定在土壤桿菌Ti質粒右邊緣DNA區域(RB)和左邊緣DNA區域(LB)之間。在土壤桿菌介導的轉化過程中，DNA質粒的左右邊緣區域被VirD2核酸內切酶切開，接著T-DNA區域插入到植物基因組中。T-DNA整合到植物基因組通常始於RB，並延伸到T-DNA的末端LB處。但是，有時候核酸內切酶不能同等切割兩端。當發生這種情況時，插入植物基因組的T-DNA常常含有部分或全部的質粒載體DNA。這種現象被稱為邊界通讀。通常優選的是只讓位於左緣和右緣區(T-DNA)之間的轉基因轉移到植物基因組當中而不攜帶任何相鄰的質粒載體DNA(載體骨架)。載體骨架DNA包含有各種質粒維持遺傳元件，例如複製起點、細菌選擇標記基因和其它由於規定不希望出現在商業化農作物產品中的DNA片斷。
大量的資源被用於篩查轉基因農作物的基因組中是否存在載體骨架DNA。方法如聚合酶鏈反應(PCR)和DNA印跡分析最常用於鑑定外源載體骨架DNA。這些方法耗時且大規模的篩查昂貴。載體骨架DNA可通過左邊界通讀整合，或者可不依賴T-DNA整合到植物基因組中(Kononov等，Plant J.11，945-957，1997)。被發現含有載體骨架DNA的轉基因植物不能商業化。從沒有商業潛力的植物細胞培養物再生轉基因植物浪費了大量努力。能大大降低載體骨架DNA在轉基因植物基因組中出現的DNA構建體和方法將是非常有用的。如果更少的轉基因植物不含載體骨架DNA，就可以生產更少。因此，只需要較少的實驗以確證是否含有骨架DNA。
Hanson等人(美國專利第6,521,458號)描述了在載體骨架中含有致死基因的DNA構建體，表達時殺死植物細胞。不過，控制在細菌和植物細胞中致死基因產物的表達是棘手的。致死基因的表達必須受各種遺傳元件控制，以防在細菌和非靶向植物細胞和組織中表達。在骨架中將非致死負性選擇標記基因用於植物細胞較使用致死基因是實質性的改善。非致死負性選擇標記基因可提供可視的方式以辨別正在表達非致死負性選擇標記基因產物的植物細胞和組織，植物細胞和植物的選擇更為可控，而且含有非致死負性選擇標記基因的植物細胞是可被救活的。為此目的所使用的基因可以是任何影響植物細胞分裂、莖幹伸長或是產生多效性莖幹或是葉片表型的基因。
可記分標記基因例如β-葡萄糖苷酶(GUS)(Kononov等，Plant J.11，945-957，1997)可提供檢測骨架DNA存在的方式，但是不能提供選出含有載體骨架DNA的細胞的方式，並且測定方法具有組織破壞性。條件致死的負性選擇標記基因也可用於骨架DNA中。其它條件致死基因產物的代表性實例包括將硫黃嘌呤轉變成毒性硫黃嘌呤單磷酸的大腸桿菌(E.coli)鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Besnard等，Mol.Cell.Biol.74139-4141，1987)；將磷酸化無活性化合物如絲裂黴素磷酸酯和阿黴素磷酸酯轉變成毒性去磷酸化化合物的鹼性磷酸酶；將5-氟胞嘧啶轉變成毒性化合物5-氟尿嘧啶的真菌(如尖鐮孢(Fusariumoxysporum))或細菌的胞嘧啶脫氨酶(codA)(Mullen，PNAS 8933，1992)；從對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲醯穀氨酸上切下穀氨酸，從而生成毒性苯甲酸氮芥的羧肽酶G2；將阿黴素和美法侖的苯氧基乙醯胺衍生物轉化成毒性化合物的青黴素-V醯胺酶(一般參見Vrudhula等，J.of Med.Chem.36(7)919-923，1993；Kern等，Canc.Immun.Immunother.31(4)202-206，1990)；以及膦酸單酯水解酶，pehA(美國專利第5,254,801號)。然而，為了生成對含有骨架DNA的細胞能產生致死效應的毒性產物，必須添加外源性底物。本發明不需要向培養基中添加額外的底物，也不需要用條件致死基因產物所需的底物外源處理植物培養細胞。
植物激素信號轉導基因和激素生物合成途徑基因可以作為植物轉化的選擇標記基因，並用於生產不含標記的轉基因植物的方法(美國專利第6,326,192號)。可是，如果此植物要進一步發展為所述的商業化植物，就必須除去這些基因。本文闡述的基因以及組合物在本發明中用作載體骨架DNA的非致死負性選擇標記基因。
代謝內源性植物細胞底物的基因產物可用作本發明的代謝幹擾基因。例如，sacB基因編碼蔗糖6-果糖基轉移酶，負責用蔗糖作底物合成中性多聚果糖(果聚糖)，經證實存在於多種細菌中例如芽孢桿菌(Bacillus spp.)、歐文氏菌(Erwinia spp.)等。旨在增加抗旱性或滲土強度(sink strength)而表達sacB基因的轉基因植物曾報導於菸草、馬鈴薯、甜菜、玉米和黑麥草(Ebskamp等，Bio/Technol.12，272-275，1994；van der Meer等，Plant Cell，6，561-570，1994；Caimi等，PlantPhysiol.110，355-363，1996；Rober等，Planta.199，528-536，1996；Ye等，Plant Cell Rep，20205-212，2001)。然而，當液泡靶向的受CaMV35S啟動子驅動的sacB基因重複轉化進入菸草和黑麥草的時候，只恢復了有發育障礙的植物(Ye等，2001)。在玉米中，表達sacB的玉米粒幹擾了顆粒充填並造成種子萎縮，其發芽率非常低(Caimi等，1996)。在馬鈴薯中，sacB基因在塊莖中的表達致使塊莖變小(Rober等，1996)。這些結果揭示，sacB的表達嚴重抑制了植物細胞和組織的發育。
其它編碼代謝幹擾酶的基因，例如編碼酵母轉化酶、酵母海藻糖-6-磷酸合酶的基因也可以以相同方式使用。據報導，在菸草和擬南芥(Arabidopsis)中表達酵母轉化酶(Suc2，Carlson等，Nucleic AcidsRes.11(6)，1943-1954，1983)嚴重抑制莖幹伸長和根發育(Sonnewald等，Plant J.195-106，1991)，而在菸草中組成型表達酵母海藻糖-6-磷酸合酶(TPS1，Bell等，Eur.J.Biochem.209(3)，951-959(1992))出現生長障礙和披針狀葉(Romero等，Planta 201293-297，1997)。代謝幹擾基因，例如編碼蔗糖6-果糖基轉移酶、轉化酶或海藻糖-6-磷酸合酶的多核苷酸作為非致死負性選擇標記轉基因用於本發明。
本發明將非致死負性選擇標記轉基因整合到DNA質粒的載體骨架DNA上，用於轉化植物細胞。設計轉基因以在含有DNA質粒載體骨架DNA的植物細胞中表達非致死基因產物。這些非致死負性選擇標記轉基因的產物涉及到植物激素生物合成途徑、植物激素底物的轉變、植物激素降解或者是代謝幹擾。利用這樣的DNA質粒來轉化植物細胞可以提高商業化植物的產量。
發明概述本發明包括包含了土壤桿菌Ti質粒第一邊緣區的DNA質粒，該邊緣區和至少一種轉基因相連接，轉基因可以是選擇性標記基因和其它農藝學目的基因，它們連接到土壤桿菌Ti質粒的第二邊緣區，再連接到載體骨架DNA，後者包含有非致死負性選擇標記基因。非致死負性選擇標記基因包括植物激素生物合成途徑基因或代謝幹擾基因。植物激素生物合成途徑基因的過度表達提供植物激素的表達增加，或者將植物激素底物轉化成無功能的激素類似物，或者將植物激素的底物導向另一種生物合成途徑。非致死負性選擇標記基因還可以包括減少內源性激素量的植物激素降解基因。非致死負性選擇標記轉基因還可以包括按反義方向排列的植物激素生物合成基因或其部分，通過轉錄後基因抑制減少內源性植物激素的量。非致死負性選擇標記基因還可以包括代謝幹擾基因，當它在植物細胞中過度表達時提供了異常表型。這種異常表型優選為生長減緩表型或者是莖幹或葉的畸型。
DNA質粒還包括植物表達盒，其包含在植物細胞中有功能的啟動子。這些植物表達盒提供了植物正向選擇標記基因、農藝學目的基因和非致死負性選擇標記基因。
非致死負性選擇標記基因包括在DNA質粒上的植物激素生物合成途徑基因，選自以下基因赤黴酸(GA)途徑基因、細胞分裂素途徑基因、植物生長素途徑基因、乙烯途徑基因和脫落酸途徑基因。
本發明的DNA質粒包含非致死負性選擇標記基因，該基因可以將GA途徑的底物轉化為無GA活性的化合物。例如，這類轉基因編碼的酶包括八氫番茄紅素合酶、GA20氧化酶或GA2β，3β-羥化酶。DNA質粒可以含有GA降解酶，如GA 2-氧化酶。
本發明的DNA質粒包含非致死負性選擇標記基因，該基因編碼細胞分裂素生物合成途徑中的酶，例如異戊烯基轉移酶(IPT)。
本發明的DNA質粒包含非致死負性選擇標記基因，該基因編碼植物生長素生物合成途徑中的酶，例如植物IAA合酶基因或土壤桿菌腫瘤基因iaaM、iaaH、rolABC或者其它從各種土壤桿菌種中分離的腫瘤或根毛基因。
本發明的DNA質粒包含非致死負性選擇標記基因，該基因編碼乙烯生物合成途徑中的酶。例如編碼ACC合酶的基因。DNA質粒也可以包含編碼乙烯降解酶的基因，例如ACC脫氨酶。本發明的DNA質粒也可以含有編碼乙烯受體的基因。本發明的DNA質粒也可以含有編碼植物激素信號蛋白的轉基因。
本發明的DNA質粒包含非致死負性選擇標記基因，該基因是代謝幹擾基因。例如，代謝幹擾基因包括但不限於編碼蔗糖6-果糖基轉移酶的sacB基因、編碼酵母轉化酶的Suc2基因或編碼酵母海藻糖-6-磷酸合酶的TPS1基因。代謝幹擾基因還包括構建為按轉錄後基因抑制機制發揮功能的基因。
將本發明DNA質粒轉化入土壤桿菌細胞中，用於轉移包含在質粒中的植物轉基因的方法。土壤桿菌細胞包含DNA質粒，其包含土壤桿菌Ti質粒第一邊緣區，連接到至少一種農藝學目的轉基因，再連接到土壤桿菌Ti質粒的第二邊緣區，再連接到非致死負性選擇標記基因，再連接到載體骨架DNA。
本發明提供了增強選擇商業化轉基因植物的方法，包括步驟a)使用在T-DNA中包含正向選擇標記基因且在質粒骨架中包含非致死負性選擇標記基因的DNA質粒轉化多個植物細胞；b)在正向選擇化合物上選擇所述的植物細胞；c)將所述選擇的植物細胞再生為完整的植物；其中該植物減少了質粒骨架DNA的出現，並且具有較低拷貝數的農藝學目的轉基因。通過此方生產的植物為本發明的一個方面。
附圖簡述


圖1.本發明DNA質粒圖解圖2.pMON80101的質粒圖譜圖3.pMON77406的質粒圖譜圖4.pLAGILBO1.0033的質粒圖譜圖5.pLAGILBO1.0037的質粒圖譜圖6.pMON69869的質粒圖譜圖7.pMON75157的質粒圖譜圖8.pMON75182的質粒圖譜圖9.pLAGILBO1.0035的質粒圖譜
圖10.pLAGILBO1.0038的質粒圖譜
圖11.pMON75183的質粒圖譜
圖12.pMON75181的質粒圖譜
圖13.pMON42066的質粒圖譜
圖14.非致死負性選擇標記基因對用pMON75181(crtB)和pMON75182(ipt)轉化的玉米植物的骨架頻率的效果
圖15.非致死負性選擇標記基因對用pMON75181(crtB)和pMON75182(ipt)轉化的玉米植物的插入拷貝數的效果
圖16.pMON73564的質粒圖譜
圖17.pMON73565的質粒圖譜
圖18.非致死負性選擇標記基因對用pMON73565(crtB+)轉化的玉米植物的骨架頻率的效果
圖19.非致死負性選擇標記基因對用pMON73565(crtB+)轉化的玉米植物的插入拷貝數的效果圖20.pMON67935的質粒圖譜圖21.pMON67936的質粒圖譜圖22.非致死負性選擇標記基因對用pMON67936(crtB+)轉化的玉米植物的骨架頻率的效果圖23.非致死負性選擇標記基因對用pMON67936(crtB+)轉化的玉米植物的插入拷貝數的效果圖24.pMON83912的質粒圖譜圖25.pMON83908的質粒圖譜圖26.pMON83907的質粒圖譜發明詳述本發明部分基於含有非致死負性選擇標記基因盒的DNA質粒，所述基因盒位於T-DNA外的質粒區域中，並與質粒維持DNA(載體骨架DNA)相連。當在轉基因植物細胞中表達時，非致死負性選擇標記基因含有的基因產物是非致死性的，但是幹擾了正常轉基因植物細胞再生為完整的轉基因，植物包括莖幹、葉和根。本發明提供了使用該DNA質粒來增強選擇商業用途植物細胞的方法。再生為完整的能育轉基因植物的植物細胞增強了商業可行性，部分因為不存在載體骨架DNA，部分因為在植物基因組中減少了T-DNA的拷貝數。
本發明的多核酸分子編碼非致死負性選擇標記基因產物的DNA分子，在本發明中鑑定為包含多核酸分子，當其在植物中表達時對植物細胞是非致死的，但是幹擾了植物細胞以正常速度再生為完整植物的能力，或與不含該多核酸分子的植物細胞或再生植物部分相比產生了異常表型。
本文使用的多核酸分子是指脫氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。DNA和RNA分子都是從核苷酸頭尾連接構建而來，其中每一個核苷酸含有一個磷酸基、一個糖部分、一個嘌呤或嘧啶鹼基。多核酸分子可以是單鏈或雙鏈的核苷酸聚合物，從5′端讀到3′端。多核酸也可以任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基，能夠允許被聚合酶正確連讀，並且不會改變該多核酸分子編碼的多肽的表達。
本發明的多核苷酸由核苷酸序列定義，本文使用的核苷酸序列是指線性排列的核苷酸形成多核酸分子的有義鏈和互補鏈的多核苷酸，無論是作為單鏈還是在雙鏈體中。本文使用的術語「編碼序列」和「結構多核苷酸分子」是指當置於合適的調節分子的控制之下時，通常通過mRNA，能翻譯成多肽的多核苷酸分子。編碼序列的邊界由5′-末端的翻譯起始密碼子和3′-末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限於染色體DNA、cDNA和重組多核苷酸分子。在本發明中所使用的編碼非致死負性選擇標記基因產物的多核苷酸的同系物、直向同源物(orthologs)或種內同源物(paralogs)，可以在DNA資料庫中得到鑑定，並從源生物中分離得到。或者，使用本領域技術人員已知的方法通過化學合成可以設計並創造出編碼非致死負性選擇標記基因產物的人工DNA分子。DNA引物和探針通常是合成的DNA分子。此外，使用本領域技術人員已知的方法合成DNA引物分子，使用DNA引物可以製造全長編碼序列或其片段。
本發明的多核酸分子可以和其它非天然的或「異源」序列以各種方式組合。「異源」序列是指任何未被發現天然地與提供本發明基因產物的核苷酸序列連接的序列，例如包括來源於相同植物的核苷酸序列非天然連接在一起的組合，或來源於不同物種的兩種序列的組合。本文使用的術語「有效連接」或「連接」，涉及調控和結構多核苷酸分子的物理和功能排列，這種排列導致有效連接的結構多核苷酸分子的調控表達。
DNA構建體或轉基因的表達是指從本發明多核苷酸分子或其翻譯物得來的有義RNA、反義RNA或蛋白的轉錄和穩定積聚。「有義」RNA是指包括mRNA的RNA轉錄物，因此能被細胞翻譯為多肽或蛋白。「反義RNA」是指與靶原始轉錄物或mRNA全部或部分互補的RNA轉錄物，當它在轉基因細胞中表達時幹擾了靶基因的表達(美國專利第5,107,065號)。反義RNA的互補性可以針對具體基因轉錄物的任何部分，例如在5′非編碼序列、3′非翻譯序列、內含子或編碼序列。「RNA轉錄物」是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄得到的產物。當RNA轉錄物與DNA序列的拷貝完全互補時，可以被認為是原始轉錄物或原始轉錄物轉錄後加工得來的RNA序列，被稱為成熟RNA。本發明的多核苷酸分子可包含與宿主靶多核苷酸互補的反義序列。本發明的多核苷酸分子也可能包含一個雙鏈RNA產物，當在宿主細胞中表達時提供了對靶宿主基因的轉錄後基因抑制。
在植物細胞中通過反向RNA調控基因表達的轉錄後基因抑制公開於美國專利5,107,065和美國專利5,759,829。在植物細胞中通過正向RNA調控基因表達的轉錄後基因抑制公開於美國專利5,283,184和美國專利5,231,020。在植物中由雙鏈RNA通過RNA幹擾(RNAi)抑制基因的轉錄後基因抑制公開於國際公開WO 99/53050，在分開的轉錄單位或單個轉錄單位中使用包含靶基因正向和反向元件的重組DNA構建體。也參見國際公開WO 99/49029、美國專利申請公開2003/0175965 A1(Lowe等)、美國專利申請10/465,800和美國專利6,506,559。另一個用於RNA幹擾基因抑制的DNA構建體包含以反向啟動子為邊界的單向基因元件，公開於美國專利申請公開2003/0061626 A1和美國專利6,326,193。也參見美國專利申請系列號10/393,347，公開了在轉基因植物中同時表達一個或多個重組基因而同時抑制一個或多個天然基因的構建體和方法。也參見美國專利6,448,473，公開了在植物中使用的多基因表達載體。所有上述的專利、申請和國際公開公開了在植物中用於轉錄後基因抑制的材料和方法，其通過引用結合到本文中。
在植物中轉錄後基因抑制的優選方法是使用穩定的(如具有末端髮夾結構)正向或反向轉錄RNA。影響轉錄後基因抑制的優選DNA構建體被轉錄為反向RNA片段，所述RNA片段與要抑制的靶基因具有同源性，其中反義RNA片段在3′端後連接有一段連續、互補的更短的正向RNA片段。在植物中自我穩定的反義RNA寡核苷酸的用途公開於國際公開94/01550。也參見國際公開98/05770，其中反義RNA被聚(CG)核苷酸的髮夾形成重複所穩定。也參見美國專利申請公開2002/00488l4 A1，其中有義或反義RNA被poly(T)-poly(A)尾所穩定。也參見美國專利申請公開2003/0018993 A1，其中有義或反義RNA被NOS基因後的反向重複序列所穩定。也參見美國專利申請公開2003/0036197 A1(Classman等)，其中與靶基因具有同源性的RNA被兩個互補RNA區域穩定。
本發明的植物細胞非致死負性選擇標記轉基因包含了編碼多肽和酶的多核苷酸，所述多肽和酶涉及植物激素。可以操縱植物激素，包括赤黴素、細胞分裂素、植物生長素、乙烯和脫落酸，用來影響植物細胞再生為完整的植物。
使用赤黴酸(GA)生物合成途徑底物但不會導致產生生物活性GA的酶，其過度表達用於在植物細胞中減少可用於GA生物合成的底物數量。在美國專利公開2002005309和WO0009722中闡述了GA途徑以及酶和底物的描述，包括GA 20-氧化酶(美國專利6,455,675)、GA2β，3β-羥化酶和八氫番茄紅素合酶。八氫番茄紅素合酶是與生產維生素A有關的酶(美國專利5,656,472、US20020051998、US20020092039、美國專利6,429,356，通過引用結合到本文中)。已經從細菌和植物來源中分離到編碼八氫番茄紅素合酶的DNA(美國專利5,429,939，通過引用結合到本文中)。草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)八氫番茄紅素合酶基因(crtB，美國專利6,429,356)對於生產類胡蘿蔔素色素和在本發明中減少植物細胞再生特別有用。Fray等(植物雜誌8693-701，1995)展示了在轉基因番茄中果實八氫番茄紅素合酶基因的組成型表達，通過使來源於赤黴素途徑的代謝產物改向，導致了植株矮小。在含有載體骨架DNA的植物中，本發明中所使用的八氫番茄紅素合酶可以將來源於赤黴酸生物合成途徑的底物焦磷酸 牛兒基 牛兒酯(GGPP)轉移到類胡蘿蔔素生物合成途徑。這個轉換結果導致可用於GA生產的底物數量減少。從植物細胞組織培養再生植物期間植物細胞中GA的減少延遲了莖幹形成。此外，因為類胡蘿蔔素色素的過量產生，培養基中植物愈傷組織是橙色的。本發明提供了在載體骨架中含有八氫番茄紅素合酶基因的DNA構建體，當在植物中過度表達時，降低了植物細胞再生為完整植物的速度，因此提供了相對不含有載體骨架的轉基因植物細胞的可選擇優勢。包括GGPP合酶的其它GA生物合成途徑酶(美國專利6,410,356)也可用於本發明。例如從菜豆、擬南芥、大豆、玉米和棉花(美國專利6,670,527和美國專利申請公開US20020053095，通過引用結合到本文中)中分離到的GA 2-氧化酶基因序列可以用來降低GA的水平，並在植物組織培養物中延遲莖幹伸長。通過降低生物活性的赤黴素的水平，實現GA 2-氧化酶基因產物的功能。2-氧化酶對生物活性的GA如GA1和GA4的羥基化作用使其失活，而生物合成前體如GA9和GA20的羥基化作用，對於GA生物合成酶而言產生了非優選的底物。2-氧化酶蛋白的過度表達因此能夠用來直接失活GA或通過影響底物水平間接下調內源性生物活性GA的水平，由此延遲了莖幹的再生。本發明提供了含有本文描述的GA相關酶的DNA構建體，其中植物表達盒含有編碼這些GA相關酶的多核酸，出現在載體骨架DNA上。
細胞分裂素生物合成途徑中轉基因酶的過度表達顯示出影響植物細胞和轉基因植物中的細胞分裂素水平。例如異戊烯基轉移酶(IPT)是用於細胞分裂素合成的酶，此基因(ipt)已從根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti質粒中分離到(Barry等，Proc.Natl.Acad.Sci.814776-4780，1984)。異戊烯基轉移酶使用5′-AMP和異戊烯二磷酸催化形成異戊烯基-腺苷-5′-單磷酸，為細胞分裂素生物合成的第一個中間體。IPT的過度表達使得在轉基因植物中細胞分裂素的水平提高(Medfor等，Plant Cell 1403-413，1989)。植物細胞中IPT的表達可以誘導從轉化的原生質體或葉片平板再生生理學異常的莖幹。這種表型可以作為標記使用(Ebinuma等，Proc.Natl.Acad.Sci.942117-2121，1997)。CKI1(cytokinin-independent 1，不依賴細胞分裂素-1)基因的表達提供了相似的表型(Kakimoto，Science 274982-985，1996)。已描述了增加的細胞分裂素水平用作植物轉化的選擇標記，例如IPT的可誘導控制(美國專利6,452,068和美國專利6,326,192，兩者通過引用結合到本文中)、ESR-2(美國專利6,441,276，通過引用結合到本文中)和ESR1-A(美國專利6,407,312，通過引用結合到本文中)的可誘導控制。在本發明中，細胞分裂素生物合成相關的蛋白優選為組成型表達。當這些基因在本發明DNA質粒構建體中作為載體骨架元件使用時，在含有載體骨架的單子葉植物細胞中誘導異常非胚胎產生的愈傷組織形成。本發明的DNA質粒尤其適用於單子葉植物細胞轉化，儘管很少產生含有骨架DNA的胚芽。當用來轉化雙子葉植物細胞時，含有嵌合體細胞分裂素生物合成基因的細胞產生異常芽，其不能產生豐富的根。此外，降解細胞分裂素的酶如細胞分裂素氧化酶(美國專利6,229,066，通過引用結合到本文中)，在本發明中可以用作含有載體骨架的植物細胞的非致死負性選擇標記轉基因。
植物生長素如吲哚-3-乙酸(IAA)影響植物細胞的生長和發育，尤其是與其它植物激素聯合使用時。細胞分裂素/植物生長素濃度比例的改變導致增強了植物的生長，優選發生在特定組織。例如，高細胞分裂素/植物生長素比例促進了莖的生長，相反低細胞分裂素/植物生長素比例促進了根的生長((Depicker等，(1983)Genetic Engineeringof Plants中，T.Kosunge，C.P.Meredith和A.Hollaender，eds.，PlenumPress，New York，154頁)。嘗試增加內源性IAA的合成，包括利用植物遺傳工程使其含有細菌IAA生物合成基因。這些基因包括土壤桿菌IAA生物合成途徑基因iaaM、iaaH、rolABC或其它從土壤桿菌種中分離到的具有提供植物生長素分子功能的根瘤或毛根基因。
通常而言，經由細菌酶表達高水平IAA的轉基因植物顯示出表型異常(Klee等，Genes Devel.186-96，1987；Schmulling等，EMBO J.72621-2629，1988)。這種轉基因植物展現出比正常植物更高的結合IAA和游離IAA水平，特別是當細菌iaaM(色氨酸單加氧酶)和/或iaaH(吲哚乙醯胺水解酶)基因與強效異源啟動子連接時(Sitbon，F.(1992)Transgenic Plants Overproducing IAA--A Model System To StudyRegulation of IAA Metabolism，Swedish University of Agricultural，Umea，Sweden)。玉米(Zea mays)中結合IAA的生物合成由UDP-葡萄糖吲哚-3-基乙醯基葡萄糖基轉移酶所催化(EC 2.4.1.121；也稱為IAA-葡萄糖合成酶，IAGlu合成酶，IAGlu轉移酶；美國專利第5,919,998號和第6,489,541號，通過引用結合到本文中)。此酶的過度表達導致在組織培養物中細胞的異常生長。本發明考慮了植物生長素生物合成基因在載體骨架中的用途，為含有DNA質粒載體骨架DNA的植物細胞提供了可鑑別的表型。
現已經確立了乙烯的生物合成，使用S-腺嘌呤甲硫氨酸(SAM)和1-氨基環丙烷-1-甲酸(ACC)作為中間體將甲硫氨酸轉化為乙烯。從SAM產生ACC由ACC合酶催化。ACC合酶在成熟時的果實和逆境植物(stressed plant)中產生，由高分歧基因家族編碼(美國專利第5,723,766號，通過引用結合到本文中)。ACC向乙烯的轉化是由乙烯形成酶(EFE)所催化(Spanu等，EMBO J 1991，10，2007)。例如，如美國專利第5,886,164號(通過引用結合到本文中)所描述，分離了1-氨基環丙烷-1-甲酸合酶(ACS)和乙烯形成酶(EFE)基因。將ACC轉化為乙烯的ACC氧化酶在大多數組織中都是組成型表達(Yang等，Ann.Rev.Plant Physiol.1984，35，155)，但在果實成熟期間被誘導(Gray等，Cell 199 372，427)，ACC氧化酶或其同系物的DNA和蛋白組合物是有用的，如美國專利第6,043,409號中公開的，其通過引用結合到本文中。本發明的DNA構建體考慮了載體骨架中植物表達盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細胞中提供乙烯生物合成酶的過度表達。ACC脫氨基酶通過將ACC轉化為α-丁酮酸和氨，代謝ACC(美國專利第5,702,933號，通過引用結合到本文中)。表達ACC脫氨基酶的轉化植物在它們的組織內降低了乙烯的水平。與不含有不敏感受體的植物相比，用乙烯不敏感受體ETR-1修飾的轉化植物具有乙烯敏感度減弱的特徵(美國專利第5,689,055號，通過引用結合到本文中)。本發明的DNA構建體考慮了載體骨架中植物表達盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細胞中提供了乙烯降解酶或乙烯不敏感受體蛋白的過度表達。
植物激素脫落酸(ABA)被認為在胚胎發生後期起作用，主要是在胚胎發生的成熟期抑制萌發(Abscisic AcidPhysiology andBiochemistry，W.J.Davies和H.G.Jones，eds.(OxfordBios ScientificPublishers Ltd.)，99-124頁，1991)。在擬南芥和玉米中鑑定了影響種子發育和ABA不敏感的突變。檢測到擬南芥ABA不敏感(abi3)突變和玉米胎萌(vp1)突變主要在胚胎發生後期(McCarty等，Plant Cell 1，523-532，1989，和Parcy等，Plant Cell 6，1567-1582，1994)。VP1基因和ABI3基因都被分離到，並且發現共享了保守區域(Giraudat，J.Current Opinion in Cell Biology 7232-238，1995，和McCarty，D.R.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Bio.4671-93，1995)。VP1基因顯示出具有轉錄激活因子的功能(McCarty等，Cell 66895-906，1991)。這就暗示ABI3具有相似的功能。美國專利第6,320,102號(通過引用結合到本文中)中描述了LEC1基因和相關的突變分子，即在胚胎發生後期導致與lec1或lec2相似缺陷的lec2、fus3-3和abi3-3。這些突變體對乾燥不耐受，有時在母體萌發，具有活化的莖幹頂端分生組織。Lec2和fus3-3突變體對ABA敏感，在它們的子葉上具有香毛簇(trichomes)，因此可以被歸類為多葉子葉型突變體。abi3-3突變體屬於不同類型的後期胚芽缺陷突變，對ABA不敏感，在子葉上不具有香毛簇。本發明的DNA構建體考慮載體骨架中植物表達盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細胞中提供了ABA相關蛋白的過度表達，從而提供了辨別組織培養植物細胞中是否具有載體骨架的方法。
擬南芥中的Bas1基因編碼了細胞色素P450(CYP 72B1)，在油菜素類固醇的信號轉導或合成中起作用。Bas1基因在植物中的過度表達，形成了墨綠色、矮小的表型，模擬了具有低水平植物激素-油菜素內酯的植物(美國專利公開US20020073446，通過引用結合到本文中)。此基因和其它相關的植物激素信號轉導基因的產物可以用於本發明以提供含有載體骨架DNA片段的植物異常表型，該DNA片段中包含這些基因作為非致死負性選擇標記轉基因。
代謝幹擾基因包括編碼蛋白的編碼序列，所述蛋白對內源性植物細胞底物具有催化活性，而對細胞是非致死性的。所述底物包括但不限於單糖、脂肪酸、胺基酸或核苷酸。因此，代謝幹擾基因編碼了例如生物合成途徑酶、從途徑中轉移底物的酶、降解或失活途徑底物的酶或影響途徑酶表達的基因產物，這些基因包括反義RNA分子或轉錄增強子和阻遏物。更具體而言，代謝幹擾蛋白的實例包括但不限於蔗糖6-果糖基轉移酶、轉化酶和海藻糖合酶。代謝幹擾基因的表達改變了植物細胞內底物的正常產生和分布。結果是減少了細胞的分裂、細胞的延伸或植物再生。代謝幹擾基因可以包括與內源植物細胞基因互補的反義序列或當在植物細胞中表達時減少植物細胞分裂、細胞延伸或植物再生的轉錄物。本發明的DNA構建體考慮載體骨架中植物表達盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細胞中提供了代謝幹擾酶或反義RNA的過度表達，所述幹擾酶或反義RNA的功能是作為代謝過程的阻遏分子。可以製備DNA構建體以提供反義RNA，當在植物細胞中表達時可以形成雙鏈RNA分子，並且此反義RNA提供了對宿主靶基因的轉錄後基因抑制。
基因通常是指涉及產生多肽的DNA片段。這種DNA片段包括獨立編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)以及編碼區域前面的(5＇非編碼DNA分子)和後面的(3′非編碼DNA分子)調控分子。「天然基因」是指在自然中發現的基因，本身就具有調控DNA序列。「嵌合基因」是指任何非天然的基因，包括在自然中未被發現在一起的異源調控和編碼序列。相應地，嵌合基因可以包含不同來源的調控序列和編碼序列，或同一來源但排列方式不同於在自然中所發現的調控序列和編碼序列。「轉基因」為通過轉化方法引入基因組從而產生轉基因生物的基因。轉基因也可以被構建為產生不編碼多肽的基因產物，例如反義RNA。
遺傳調控序列為基因的元件，當作為轉基因連接時包括位於結構多核苷酸序列上遊(5′非編碼序列)、當中或下遊(3′非編碼序列)的多核苷酸分子，影響關聯的結構多核苷酸序列的轉錄、RNA加工或穩定性或翻譯。調控序列可以包括啟動子、翻譯前導序列(如美國專利第5,659,122號)、內含子(如美國專利第5,424,412號)和多腺苷酸化識別序列。
在一個實施方案中，本發明的DNA構建體可含有啟動子，能夠引起本發明的轉基因產物的過度表達，其中「過度表達」是指表達通常不存在於宿主細胞中的產物，或者存在於所述宿主細胞中的產物表達水平比編碼所述多肽的內源性基因正常表達水平更高。能引起本發明轉基因產物過度表達的啟動子通常為本領域所已知，如病毒啟動子(P-CaMV35S，美國專利第5,352,605號；P-FMV35S，美國專利第5,378,619號和第5,018,100號)、各種植物來源的啟動子如植物肌動蛋白啟動子(P-Os.Actl，美國專利第5,641,876號和第6,429,357號)。這些啟動子是通常在大多數植物組織中表達的組成型啟動子的實例。其它的組成型啟動子為植物分子生物學領域所知，並且用於本發明。
可以修改本發明DNA構建體啟動子的表達水平或模式以增強它的表達。可以使用本領域技術人員已知的方法將增強元件(例如CaMV35S啟動子的子域，Benfey等，EMBO J.91677-1684，1990)插入到基因的5′序列。在一個實施方案中，可以加入增強元件用來產生啟動子，此啟動子包含了本發明基因天然啟動子的時間和空間表達方式，但具有更高水平的表達量。相似地，通過使用特異活化或抑制基因表達的元件(例如，花粉特異性元件，Eyal等，1995 Plant Cell 7373-384)修飾啟動子的5′區域，可以實現啟動子的組織特異性表達。術語「啟動子序列」或「啟動子」是指一個多核苷酸分子，當以順式與編碼多肽的結構多核苷酸序列相連時，以指導一種或多種編碼多肽的mRNA分子表達的方式發揮功能。這種啟動子區域典型地被發現於三核苷酸ATG上遊，位於多肽編碼區域起始位點。啟動子分子也可以包括DNA序列，從此序列開始轉錄轉移RNA(tRNA)或核糖體RNA(rRNA)序列。轉錄包括合成代表DNA雙鏈中一條鏈的RNA鏈。轉錄終止反應要求的DNA序列稱為3′轉錄終止區域。
優選所選擇的具體啟動子應該能夠引起足夠的表達，從而導致產生有效量的產物以引起所需的表型。除了已知的引起植物細胞中DNA轉錄的啟動子外，通過在植物cDNA庫中篩選能夠在靶組織中選擇性或優先表達的基因，然後確定啟動子區域，可以鑑定用於本發明的其它啟動子。在植物組織培養以將植物細胞再生為植物的過程期間，表達相連的非致死負性選擇標記基因產物的啟動子在本發明中尤其有用。
能夠在植物中用來表達轉基因的啟動子可以來源於編碼胚胎貯藏蛋白的基因，可以用於嵌合轉基因，所述編碼胚胎貯藏蛋白的基因包括來源於歐洲油菜(Brassica napus)的編碼2S貯藏蛋白的基因(Dasgupta等，Gene 133301-302，1993)；來源於擬南芥的2S種子貯藏蛋白基因家族；來源於歐洲油菜的編碼油質蛋白20kD(千道爾頓)的基因(GenBank M63985)；來源於大豆的編碼油質蛋白A(GenBankU09118)和油質蛋白B(GenBank U09119)的基因；來源於擬南芥的編碼油質蛋白的基因(GenBank Z17657)；來源於玉米的編碼油質蛋白18kD的基因(GenBank J05212，Lee，Plant Mol.Biol.261981-1987，1994)和來源於大豆的編碼低分子量富硫蛋白的基因(Choi等，Mol.Gen.Genet.246266-268，1995)。來源於玉米醇溶蛋白編碼基因的啟動子(包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和γ基因，Pedersen等，Cell 291015-1026，1982)可以用於嵌合轉基因。玉米醇溶蛋白是一類發現於玉米胚乳的貯藏蛋白。在種子組織中表達的啟動子本文中被稱為P-種子，除非另有定義。
公認的是，已經描述了另外的可利用啟動子，例如在美國專利第5,378,619號、第5,391,725號、第5,428,147號、第5,447,858號、第5,608,144號、第5,608,144號、第5,614,399號、第5,633,441號、第5,633,435號和第4,633,436號，所有這些專利整體結合到本文中。進一步公認的是，不能完全確定調節序列的確切邊界，並且不同長度的DNA片斷可以具有相同的啟動子活性。本領域的技術人員可以鑑定除本文所述之外的啟動子，所述啟動子在本發明中功能為提供植物細胞非致死負性選擇標記轉基因多核苷酸分子的表達。
翻譯前導序列為位於基因啟動子序列和編碼序列之間的DNA遺傳元件。翻譯前導序列在完全加工mRNA中存在於翻譯起始序列上遊。翻譯前導序列可以影響初級轉錄物加工為mRNA、mRNA的穩定性或翻譯效率。翻譯前導序列的實例包括玉米和牽牛花熱休克蛋白前導序列(美國專利第5,362,865號，通引用結合到本文中)、植物病毒外殼蛋白前導序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因前導序列和其它(Turner和Foster，molecular biotechnology 3225，1995)。
轉運多肽通常是指多肽分子，當與相關蛋白連接時，指導蛋白進入特定的組織、細胞、亞細胞部位或細胞器。實例包括但不限於葉綠體轉運肽、核導向信號和液泡信號。葉綠體轉運肽在本發明中尤其有用，用於指導八氫番茄紅素合酶表達到葉綠體。葉綠體轉運肽(CTP)被改造為與N端蛋白融合，定向入植物葉綠體。許多葉綠體定位蛋白都從核基因表達為前體，並通過葉綠體轉運肽(CTP)定向到葉綠體，並在輸入步驟期間除去葉綠體轉運肽。葉綠體蛋白的實例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS2，rubisco)的小亞基、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、集光複合體蛋白I和蛋白II以及硫氧還蛋白F。體內和體外試驗證明，通過使蛋白與CTP融合，也可以將非葉綠體蛋白定向到葉綠體，而且CTP序列足夠將蛋白定向到葉綠體。合適葉綠體轉運肽，例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPSCTP(Kle等，Mol.Gen.Genet.210437-442，1987)和碧冬茄(Petuniahybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836873-6877，1986)的摻入，顯示出在轉基因植物中將異源蛋白定向到葉綠體。通過加入CTP(WO 9714807，美國專利第6,429,356號，通過引用結合到本文中)，可以將轉基因植物中的八氫番茄紅素合酶的表達定向到葉綠體。本領域技術人員公認，假如需要，可以製造各種嵌合構建體，利用特殊CTP的功能將八氫番茄紅素合酶或其它非致死負性選擇標記基因產物輸入植物葉綠體。
3′非翻譯序列或3′終止區是指位於結構核苷酸序列下遊的DNA序列，包括編碼多腺苷酸化和其它影響轉錄、mRNA加工或基因表達的調控信號的序列。多腺苷酸化信號在植物中的功能為致使多聚腺苷酸添加到mRNA前體的3′末端。多聚腺苷酸化序列可以來源於天然基因、各種植物基因或T-DNA。多聚腺苷酸化序列的一個實例為胭脂氨酸合酶3′序列(nos 3′；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807，1983)。Ingelbrecht等例證了不同3′非翻譯序列的用途(PlantCell 1671-680，1989)。
本文所使用的重組DNA技術中的實驗室操作為本領域中熟知的和常用的操作。使用標準技術進行克隆、DNA和RNA分離、擴增和純化。包括DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切酶等的酶反應通常按照生產廠商的說明進行。這些技術和其它各種技術通常依據Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆一實驗室操作指南)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York(1989)進行，本文稱為Sambrook等。
植物重組DNA構建體和轉化植物本發明的分離多核酸分子可以具體用於創造轉基因農作物，其中過度表達了本發明的多肽。植物細胞中這些多肽的過度表達可以降低植物細胞再生為完整植物的速度，或產生不需要添加外源性底物即可容易通過眼睛辨別的表型。本發明的DNA質粒可被轉化入轉基因農作物植物細胞。
轉基因農作物植物含有外源多核苷酸分子，插入農作物植物細胞的基因組。農作物植物細胞，包括但不限於進一步組成以下部分的植物細胞懸浮培養物、胚芽、分生組織部位、愈傷組織、葉、根、枝、配子體、孢子體、胚珠、花粉和小孢子、種子和果實。「外源」是指來源於植物外的被引入到植物中的多核苷酸分子。外源性多核苷酸分子可以具有天然出現的或非天然出現的核苷酸序列。本領域的技術人員了解，外源性多核苷酸分子可以是來源於不同物種的異源分子，所述物種不同於待引入多核苷酸分子的植物，或者多核苷酸可以來源於與待引入多核苷酸分子的植物相同的植物物種。當外源性多核苷酸(轉基因)在轉基因植物中表達時，可提供農藝學重要的性狀。有農藝學意義(GOI)的轉基因為農作物提供了有益的農藝學性狀，例如包括但不限於包括以下的遺傳元件除草劑抗性(美國專利第5,633,435號；美國專利第5,463,175號)、增加產量(美國專利第5,716,837號)、害蟲防治(美國專利第6,063,597號；美國專利第6,063,756號；美國專利第6,093,695號；美國專利第5,942,664號；美國專利第6,110,464號)、真菌病抗性(美國專利第5,516,671號；美國專利第5,773,696號；美國專利第6,121,436號；美國專利第6,316,407號和美國專利第6,506,962號)、病毒抗性(美國專利第5,304,730號和美國專利第6,013,864號)、線蟲抗性(美國專利第6,228,992號)、細菌病抗性(美國專利第5,516,671號)、澱粉生產(美國專利第5,750,876號和美國專利第6,476,295號、修飾油脂生產(美國專利第6,444,876號)、高油產量(美國專利第5,608,149號和美國專利第6,476,295號)、修飾脂肪酸內含物(美國專利第6,537,750號)、高蛋白產量(美國專利第6,380,466號)、果實催熟(美國專利第5,512,466號)、增強的動物和人體營養(美國專利第5,985,605號和美國專利第6,171,640號)、生物多聚物(美國專利第5,958,745號和美國專利公開US20030028917)、環境應激抗性(美國專利第6,072,103號)、藥用肽(美國專利第6,080,560號)、改進的加工性狀(美國專利第6,476,295號)、改進的可消化性(美國專利第6,531,648號)、低棉子糖(美國專利第6,166,292號)、工業酶生產(美國專利第5,543,576號)、改進風味(美國專利第6,011,199號)、固氮作用(美國專利第5,229,114號)、雜種生產(美國專利第5,689,041號)和生物燃料生產(美國專利第5,998,700號)，以上列舉的專利中描述的遺傳元件和轉基因通過引用結合到本文中。
本發明也提供植物重組DNA構建體，用於生產轉基因農作物。可以使用本領域技術人員熟知的方法製備本發明的農作物重組DNA構建體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內遺傳重組。這類技術描述於Sambrook等(1989)。通過土壤桿菌介導的轉化或其它植物轉化領域中技術人員已知的方法，可以將通過上述方法創造的外源性多核苷酸分子轉入農作物植物細胞。
DNA構建體通常為雙Ti質粒邊緣DNA構建體，具有Ti質粒的右緣(RB或AGRtu.RB)和左緣(LB或AGRtu.LB)，Ti質粒從根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)分離到，包含T-DNA(轉化DNA)，該T-DNA與土壤桿菌細胞提供的轉移分子一起允許T-DNA整合到植物細胞的基因組。DNA構建體也含有載體骨架DNA片段，在細菌細胞中提供了複製功能和抗生素選擇性，例如大腸桿菌複製起始區如ori322，廣譜宿主性複製起始區如Ec.oriV或oriRi，和選擇標記的編碼區如編碼Tn7氨基糖苷腺苷轉移酶(aadA)(賦予大觀黴素或鏈黴素抗性)的Spec/Strp，或慶大黴素(Gm，Gent)選擇標記基因。對於植物轉化，宿主細菌菌株通常為根瘤土壤桿菌ABI、C58或LBA4404，不過其它植物轉化領域技術人員已知的菌株在本發明中也可發揮功能。本發明提供的DNA構建體在載體骨架內含有植物表達盒，當在植物細胞中表達是，產生了非致死產物，優選降低植物細胞再生為完整植物的效率，或產生具有異常表型的植物或植物部分。
本發明DNA構建體的T-DNA典型地包含一個或多個有農藝學意義的轉基因，以及賦予植物細胞選擇表型的正向選擇標記。此標記可以提供抗正向選擇化合物的抗性，例如抗生素抗性(如卡那黴素、G418、博來黴素、潮黴素等)或除草劑抗性(例如包括但不限於草甘磷、草銨磷、磺醯脲類、咪唑啉酮類、溴苯腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原氧化酶抑制劑和isoxasfiutole除草劑)。編碼有關除草劑耐受性蛋白的多核苷酸分子為本領域所已知，包括但不限於編碼以下酶的多核苷酸分子5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，描述於美國專利號第5,627,061號，第5,633,435號，第6,040,497號；Padgette等，Herbicide Resistant Crops，Lewis Publishers，53-85，1996；和Penaloza-Vazquez等，Plant Cell Reports 14482-487，1995)；草甘磷抗性的aroA(美國專利第5,094,945號)；耐受溴草腈的溴草腈腈水解酶(Bxn)(美國專利第4,810,648號)；八氫番茄紅素去飽和酶(crtI，Misawa等，(1993)Plant J.4833-840，和(1994)Plant J.6481-489)；耐受氟草敏的乙醯羥酸合酶(AHAS，aka ALS，Sathasiivan等，Nucl.Acids Res.182188-2193，1990)；耐受草銨磷和雙丙氨磷的bar基因(DeBlock等，EMBO J.62513-2519，1987)。
除了選擇標記，也可以希望使用報導基因。在一些情況中，報導基因可以單獨或與選擇標記一起使用。報導基因為典型地不存在於受體生物或組織中的基因，典型地編碼導致某些表型變化或酶特性的蛋白。Wising等，Ann.Rev.Genetics，22，421(1988)中提供了這種基因的實例，其通過引用結合到本文中。優選的報導基因包括大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、來源於大腸桿菌Tn9的氯黴素乙醯轉移酶基因、來源於生物發光水母維多利亞水母(Aequorea Victoria)的綠色螢光蛋白、來源於北美螢火蟲(Photinuspyralis)的螢光素酶基因。然後在將所述基因引入受體細胞後的合適時間，進行檢測報告基因表達的測定。優選這種測定需要使用編碼大腸桿菌uidA基因座β-葡萄糖苷酸酶的基因以鑑定轉化細胞，如Jefferson等(Biochem.Soc.Trans.15，17-19，1987)所描述，本文稱為GUS。
通過合適的土壤桿菌介導的植物轉化方法，可以將本發明的DNA構建體引入所需的植物宿主基因組。對於土壤桿菌介導的轉化，合適的植物轉化質粒構建體包括來源於根瘤土壤桿菌Ti質粒的構建體，和例如由Herrera-Estrella等，(Nature 303209，1983)；Bevan，(Nucleic Acids Res.128711-8721，1984)；Klee等，(Bio-Technology 3637-642，1985)所公開的構建體。通過根瘤土壤桿菌介導的轉化來轉化植物的方法包括Fraley等，(Bio/Technology 3629-635，1985)和Rogers等，(Methods Enzymol.153253-277，1987)。通過使用經過遺傳工程改造的屬於土壤桿菌屬的土壤細菌，可以完成根瘤土壤桿菌介導的轉化。某些土壤桿菌菌種介導稱為「T-DNA」的特殊DNA的轉移，其可以經過遺傳工程改造將任何需要的DNA片段攜帶入許多植物物種。構成T-DNA介導發病機理的主要事件是誘導致病基因和T-DNA的加工和轉移。這種過程為許多綜述的題目(Ream.Ann.Rev.Phytopathol.27583-618，1989；Howard and Citovsky，Bioassays，12103-108，1990；Kado，Crit.Rev.Plant Sci.101-32，1991；Winnans，Microbiol.Rev.5612-31，1992；Zambryski，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，43465-490，1992；Gelvin，In Transgenic Plants，S.D.Kung and R.Wu eds.，Academic Press，San Diego，49-87頁，1993；Binns和Howitz，In Bacterial Pathogenesis of Plants and Arimals(Dang，J.IL.，ed.).BerlinStringer Verlag，119-138頁，1994；Hooykaas和Beijersbergen，Ann.Rev.Pliytopathol.32157-179，1994；Lessl和Lanka，Cell 77321-324，1994；Zupan和Zambryski，Ann.Rev.Phytopathol.27，583-618，1995)。
植物細胞再生技術依賴於組織培養生長培養基中某些植物激素的操作，也典型地依賴於殺蟲劑和/或除草劑標記，這些標記與所需的核苷酸序列一起被引入。選擇具有合適方案的方法用於來源於以下的宿主豆科(Leguminoseae)(苜蓿、大豆、三葉草等)，傘形科(Umbelliferae)(胡蘿蔔、芹菜、歐洲防風)，十字花科(Cruciferae)(捲心菜、蘿蔔、canolal/油菜等)，葫蘆科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)，禾本科(Gramineae)(小麥、大麥、稻、玉米等)，茄科(Solanaceae)(馬鈴薯、菸草、番茄、胡椒)，各類花卉作物如向日葵，堅果樹如扁桃、腰果、核桃和美洲山核桃。例如參見Ammirato等，Handbook of PlantCell Culture-Crop Species；Macmillan Publ.Co.(1984)；Shimamoto等，Nature 338274-276(1989)；Fromm，UCLA Symposium on MolecularStrategies for Crop Improvement，April 16-22，1990；Keystone，CO(1990)；Vasil等，Bio/Technology 8429-434(1990)；Vasil等，Bio/Technology 10667-674(1992)；Hayashimoto，Plant Physiol.93857-863(1990)和Data等，Bio-technology 8736-740(1990)。這種再生技術通常描述於Klee等，Ann.Rev.Plant Phys.38467-486(1987)。在本發明實施過程中，通過將轉基因DNA構建體引入植物基因組轉化植物的方法和組合物可以包括任何熟知和已證明的方法。例如，在美國專利第5,824,877號、第5,591,616號和第6,384,301號中闡述了土壤桿菌介導的轉化，以上所有專利通過引用結合到本文中。
通過實施本發明可以製備的植物包括但不限于洋槐、苜蓿、蒔蘿(aneth)、蘋果、杏、朝鮮薊、芝麻菜(arugula)、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、黑莓、藍莓、花莖甘藍、抱子甘藍、捲心菜、芸苔、美國香瓜(cantaloupe)、胡蘿蔔、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、芫荽、柑桔、金錢橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、花旗松(Douglas fir)、茄子、菊苣、茅菜(escarole)、桉樹、茴香、無花果、森林樹、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜露(honey dew)、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭蔥(leeks)、檸檬、酸柚(lime)、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物(ornamental plant)、木瓜、歐芹(parsley)、豌豆、桃樹、花生、梨、胡椒、柿、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、西葫蘆、溫柏、輻射松木、苣萵(radicchio)、蘿蔔、懸鉤子、稻、黑麥、高梁、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、香楓(sweetgum)、橘子、茶、菸草、番茄、草皮(turf)、葡萄樹、西瓜、小麥、山藥和翠玉瓜(zucchini)。
提供下面的實施例以更好的說明本發明的實施，並且不應以任何方式解釋為限制本發明的範圍。本領域的技術人員應認識到，可對本文所述的方法和基因進行各種修飾、加入、置換、截短等，而不背離本發明的精神和範圍。
實施例實施例1DNA質粒本發明的DNA質粒為含有T-DNA片段和載體骨架片段的DNA構建體。T-DNA側面為土壤桿菌Ti質粒邊緣區[右緣(RB)和左緣(LB)區]，且含有正向選擇標記基因和有農藝學意義的基因(GOI)。載體骨架片段含有非致死負性選擇標記基因和質粒維持元件。作為對照用於比較目的的DNA質粒含有相同或相似T-DNA表達盒，但在載體骨架中不含有非致死負性選擇標記基因。
圖1中圖解了本發明質粒的基本設計。在此圖解中，RB和LB元件側面為T-DNA，這些邊緣元件可以用其它相似元件或有關DNA分子的片斷取代，這些片斷的功能是作為土壤桿菌致病基因所提供的核酸內切酶的酶切位點。這些選擇標記基因可以選自許多已知的提供植物抗正向選擇化合物的基因，正向選擇化合物例如抗生素如卡那黴素、潮黴素、慶大黴素，或除草劑如草甘磷、草銨磷、磺醯脲類、咪唑啉酮類、溴草腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原氧化酶抑制劑和isoxasflutole除草劑。可以選擇有農藝學意義的基因以提供任何數量的對植物有用的性狀。本發明在DNA構建體中提供了有農藝學意義的基因實例，包括但不限於除草劑耐受性基因、昆蟲抗性基因和增產基因。
尤其用於在單子葉植物細胞中表達的DNA構建體含有crtB DNA編碼序列，所述編碼序列具有相連的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶亞單位葉綠體轉運肽前導序列(SSU，TS-Ps.RbcS2，美國專利第6,429,356號的SEQ ID NO1，通過引用結合到本文中)，有效連接到強力組成型啟動子(P-CaMV.35Sen，美國專利第5,359,142號，具有重複增強子的CaMV 35S啟動子)、玉米Hsp70內含子(I-Zm.DnaK，美國專利第5,593,874號)和從根瘤土壤桿菌胭脂氨酸合酶基因(T-AGRtu.nos 3′)分離到的3′終止區，如pMON80101(圖2)中所圖解，此表達盒位於載體骨架DNA片段中。pMON80101中，T-DNA含有的植物表達盒既為選擇標記又為有農藝學意義的基因(草甘磷耐受性)。這種表達盒包含了來源於水稻actin1(P-Os.Actl，美國專利第5,641,876號)的啟動子、前導序列和內含子，與從擬南芥ShkF基因分離到的葉綠體轉運肽(CTP2)相連，再連接到來源於根瘤土壤桿菌的aroA-CP4編碼序列(美國專利第5,633,435號)，再連接到從根瘤土壤桿菌胭脂氨酸合酶基因分離到的3′終止區。
crtB編碼序列編碼了八氫番茄紅素合酶(本發明的SEQ ID NO1，或其它編碼八氫番茄紅素合酶的DNA分子如美國專利第6,429,356號的SEQ ID NO1)，含有此crtB編碼序列的DNA構建體被構建為尤其用於在雙子葉植物細胞中表達，在pMON77406中有圖解(圖3)。P-CaMV.35Sen啟動子為強效組成型啟動子，指導crtB基因產物在植物細胞中表達。這種構建體含有選擇標記基因(P-FMV35S/L-Ph-Hsp70/CTP2-aroA-CP4/T-RbcS2-E9)表達盒，提供了草甘磷抗性EPSPS酶(aroA-CP4)的強效組成型表達。P-FMV啟動子(美國專利第5,378,619號)、從碧冬茄(Petunta hybrida)Hsp70基因(美國專利第5,362,865號)分離到的翻譯前導序列、從擬南芥EPSPS分離到的葉綠體轉運肽(CTP2)與aroA-CP4草甘磷抗性EPSPS編碼序列有效連接，並與豌豆核酮糖二磷酸加氧酶-羧化酶小亞基3′終止區連接，也被稱為E9。此外，也可以在T-DNA內添加表達盒(有農藝學意義的轉基因)，以為含有T-DNA的轉基因植物提供增強的農藝學表型。
圖4中(pLAGILB01.0033)圖解的DNA構建體含有提高產量的轉基因(P-Seed/I-Zm.DnaK-Hsp70/Cglut.CordapA/T-AGlttu.Tr7)和草甘磷選擇標記基因。P-種子啟動子的功能是在種子組織中表達，其與玉米Hsp70內含子連接。CordapA基因(棒桿菌(Corynebacterium)dapA，Bonnassie等，Nucleic Acids Res.186421，1990)編碼了DHDPS酶，此酶對賴氨酸的抑制作用不敏感。轉錄終止區來源於根瘤土壤桿菌Tr7基因。crtB非致死負性選擇標記轉基因位於載體骨架DNA。
圖5中(pLAGILB01.0037)圖解的DNA構建體含有兩個昆蟲抗性轉基因，此轉基因的多核苷酸編碼Bt.EG11768蛋白(美國專利第6,242,241號)和Bt.cryIIAb蛋白(美國專利第6,489,542號)。crtB基因位於骨架DNA，由P-CaMV.35Sen啟動子驅動表達。
圖6中(pMON69869)圖解的DNA構建體含有用於表達選擇標記aroA:CP4的遺傳元件，此選擇標記提供了草甘磷抗性，並且在載體骨架DNA中含有非致死負性選擇標記轉基因和來源於根瘤土壤桿菌的編碼IPT酶多核苷酸(ipt或AGRtu.Ipt，SEQ ID NO2)。圖7中(pMON75157)圖解的DNA構建體顯示了含有另外的遺傳元件的質粒，所述遺傳元件用於表達AGRtu.ipt編碼序列。這種表達盒可以用在DNA質粒載體骨架中，用於土壤桿菌介導的植物細胞的轉化。
圖8中(pMON75182)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有可計分標記基因(GUS)和正向選擇標記基因(AGRtu.nptII的轉基因。在載體骨架DNA上含有AGRtu.ipt編碼序列。所述可計分標記基因可用有農藝學意義的轉基因(GOI)代替，以為農作物提供有價值的農藝學性狀。
圖9中(pLAGILB01.0035)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有提高產量轉基因(P-Seed/I-Zm.Dnak-Hsp70/Cglut.CordapA/T-AGRtu.Tr7)和草甘磷選擇標記轉基因的轉基因。在載體骨架DNA中含有ipt表達盒(P-CaW.35Sen/I-Zm.DNAK/ipt/T-AGRtu.nos3′)。
圖10中(pLAGILB01.0038)圖解的DNA構建物體含有2個昆蟲抗性轉基因，此轉基因的多核苷酸編碼了Bt.EG11768蛋白和Bt.cryIIAb蛋白。AGRtu.ipt基因位於骨架DNA，由P-CaMV.35Sen啟動子驅動表達。
圖11中(pMON75183)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有可計分標記基因(GUS)的轉基因和正向選擇標記基因(AGRtu.nptII)的轉基因。載體骨架DNA上含有codA編碼序列。codA提供了條件致死型選擇標記。在植物再生期間，將愈傷組織轉入含有5-氟胞嘧啶的培養基中，表達胞嘧啶脫氨酶的植物細胞將被殺死，只留下不含有載體骨架DNA的植物細胞。可計分標記基因可以用有農藝學意義的轉基因代替，以為農作物提供有價值的農藝學性狀。
圖12中(pMON75181)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有可計分標記基因(GUS)的轉基因和正向選擇標記基因(AGRtu.nptII)的轉基因。該T-DNA含有同pMON75183一樣的表達盒。crtB非致死負性選擇標記基因位於載體骨架DNA中。
圖13中(pMON42066)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有可計分標記基因(GUS)轉基因和正向選擇標記基因(AGRtu.nptII)的轉基因。該T-DNA中含有同pMON75183和pMON75181一樣的表達盒。在載體骨架DNA中沒有任何植物細胞非致死負性選擇標記(沒有基因)。
圖16中(pMON73564)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含啟動子和有關基因的表達盒。在載體骨架DNA中沒有任何植物細胞非致死負性選擇標記(沒有基因)。
圖17中(pMON73565)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含啟動子和有關基因的表達盒。crtB非致死負性選擇標記基因位於載體骨架DNA。
圖20中(pMON67935)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含啟動子和有關基因的表達盒。在載體骨架DNA中沒有任何植物細胞非致死負性選擇標記(沒有基因)。
圖21中(pMON67936)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含啟動子和有關基因的表達盒。crtB非致死負性選擇標記轉基因位於載體骨架DNA。
圖24中(pMON83912)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含GUS報導基因的表達盒。植物細胞表達盒位於載體骨架DNA，含有非致死負性選擇標記基因，該基因編碼多花菜豆(Phaseolus coccmeus)赤黴素2-氧化酶(SEQ ID NO3)。
圖25中(pMON83908)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含GUS報導基因的表達盒。植物細胞表達盒位於載體骨架DNA，含有非致死負性選擇標記基因(CKX1，SEQ ID NO4)，該基因編碼細胞分裂素氧化酶(SEQ ID NO3)。
圖25中(pMON83907)圖解的DNA構建體在T-DNA中含有正向選擇標記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉基因，並且含有包含GUS報導基因的表達盒。植物細胞表達盒位於載體骨架DNA，含有非致死負性選擇標記基因(sacB，SEQ ID NO5)，該基因編碼蔗糖6-果糖基轉移酶。
可以以類似如上所述的方式構建DNA構建體，使在載體骨架上包含其它代謝幹擾基因。這些幹擾基因的實例包括但不限於編碼酵母轉化酶(SEQ ID NO6)和編碼酵母海藻糖-6-磷酸合酶(SEQ IDNO7)的多核苷酸。
實施例2農作物轉化將本發明所描述的DNA構建體(如pMON42066、pMON75181、pMON75182和pMON75183)轉化入無害的土壤桿菌菌株中。例如通過三親交配法(Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sci.777347-7351，1980)，或通過電穿孔法，將DNA構建體轉入土壤桿菌。土壤桿菌的液體培養物從甘油保藏物或新鮮劃線平板開始，並在pH7.0、含有適當抗生素的LB液體培養中，26℃-28℃振蕩(大約150rpm)培養過夜至對數生長中期。將土壤桿菌細胞重懸浮於接種培養基，並調整OD660至約為1。
使用本領域已知的各種方法，通過土壤桿菌介導的轉化，進行玉米細胞的轉化和細胞再生為完整的能育植物。例如，使表面已滅菌的玉米種子發芽，並將幼苗切成碎片。將每一個具有傷口表面的苗碎片向下置於半固體愈傷組織誘導MSW57培養基，每個平皿中放置10-16個碎片，置於28℃光Percival培養箱中培養(16小時光周期)。2-4星期後，將有胚胎產生的愈傷組織轉入新鮮MSW57培養基中，28℃黑暗下培養2-3星期。
在培養皿(100mm×25mm)中選擇先前再次培養了6-8天的愈傷組織碎片。每一個平皿含有300-500個愈傷組織碎片。每1ml土壤桿菌懸浮液(該土壤桿菌含有本發明的DNA質粒)中加入1μl F-68(Pluronic F-68溶液10％ Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，然後將足夠的此懸浮液覆蓋所述組織。室溫下培養5-20分鐘。用頂端精密的移液管除去土壤桿菌懸浮液。傾倒愈傷組織碎片於培養皿，在培養皿底部有3片無菌濾紙(Whatman#1，直徑為8.5或9cm)，在頂部有2片濾紙。倒置幾次，對它們進行簡單印跡。將愈傷組織碎片(每60-100個)轉入無水或無培養基的培養皿中，此平皿帶有1片濾紙，用石蠟膜密封平皿。在黑暗中23℃培養平皿2-3天。
通過將2片氈(2cm×2cm平方)置於各個培養皿中，製備培養平板，每個培養平板中含有23-25ml MSW57/C500/P100(羧苄青黴素500mg/L，巴龍黴素100mg/L)培養基，培養基組成參見表1。將愈傷組織轉移入培養平板。在轉移的時候，將愈傷組織分成小碎片(2-3mm)，每個培養平板可以含有16-25個愈傷組織碎片。黑暗中27℃下培養平板大約2星期。去除選擇培養基，然後加入18-20ml新鮮培養基。黑暗中27℃下培養平板大約2星期。去除選擇培養基，用18-20ml MS/6BA/C250/P100培養基代替(將轉化的組織轉入含有25mg/L-1000mg/L 5-氟胞嘧啶的培養基中，所述組織用包含codA基因的DNA質粒轉化)。將平板移至光培養箱(16小時光周期，27℃)培養5-7天，然後將生長組織移至MSOD/C250/P100固體培養基。在此培養基中培養大約2星期。愈傷組織將再生為有根或無根的綠色莖幹。這些莖幹應當看起來健康，並且容易與一些小莖幹區別。將健康的莖幹轉入用3g/l Phytagar固化的MSOD/C250/P100培養基中。轉移時，除去附著在莖幹的根區域的愈傷組織。培養擴大莖幹和根，然後轉入土壤。
表1.培養基組成MSW57
通過植物轉化和組織培養領域已知的方法，可以轉化雙子葉植物細胞並再生為完整的植物。使用土壤桿菌介導的方法轉移本發明質粒的T-DNA為本領域所熟知。例如棉花(美國專利第5,004,863號；美國專利第5,159,135號；美國專利第5,518,908號，通過引用結合到本文中)、大豆(美國專利第5,569,834號；美國專利第5,416,011號，通過引用結合到本文中)。
上述轉化和再生方法提供了載體骨架DNA出現大大減少的植物。此外，該植物還具有插入T-DNA的拷貝數降低的優點。通過該方法生產的植物是本發明的一個方面。
實施例3骨架DNA和拷貝數的分子分析從用本發明DNA質粒轉化的並由植物細胞組織培養物再生的植物中分離組織樣品，從該組織樣品中抽提DNA。使用基於PCR的方法測定DNA，確定Ec.oriV DNA片斷是否存在，該Ec.oriV DNA片斷為載體骨架的指示。這種DNA靠近LB，其存在於從再生植物抽提的DNA中表明發生了超過了LB的載體序列轉移。可通過許多方法從植物組織中分離DNA，例如CTAB方法(Rogers等，Plant Mol.Biol.569-76，1985)或按照廠家說明書使用DEAeasyTM 96植物試劑盒(Cat.#69181，Qiagen Inc.，Valencia，CA)。Taqman(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)被描述為檢測和定量DNA序列存在的方法，按照廠家提供的說明書完全可以理解。表2中列舉的DNA引物分子用於所描述的方法中，以鑑定來源於植物提取物的Ec.oriVDNA。本領域技術人員可以改變條件和裝置而提供相同的結果。
使用以下質粒轉化玉米植物細胞對照DNA質粒(pMON42066)、在載體中具有條件致死基因的DNA質粒(pMON75183)、具有非致死選擇標記基因的DNA質粒(ipt，pMON75182)和具有非致死選擇標記基因的DNA質粒(crtB，pMON75181)，然後再生為完整的植物。分析完整植物是否存在Ec.oriV。
圖14顯示了此分析結果。35株使用對照質粒(沒有基因，pMON42066)轉化後再生的植物中，大約有一半為Ec.oriV DNA陽性，且77株用條件致死基因質粒(codA，pMON75183)轉化的植物中約35％為陽性。令人驚訝的是，非致死選擇標記基因，ipt和crtB，按預期減少了具有Ec.oriV DNA的轉基因植物的出現。83株用pMON75182轉化的植物中只有5％含有Ec.oriV DNA，61株用pMON75181轉化的植物中只有8％含有Ec.oriV DNA。
這些結果證明，通過減少載體骨架的出現，本發明DNA質粒帶來了實質性益處。用常規DNA質粒結構(pMON42066)轉化的植物中接近一半將被清除。使用本發明DNA質粒(pMON75182，pMON75181)轉化的植物中，被清除的少於10％。
表2Ec.OriV Endpoint Taqman測定-10uL反應
條件MJ引擎
另一個商業化轉基因植物的重要因素是低插入複雜性的出現。這通常指的是低拷貝數。假如插入的拷貝數太高，很難選擇子代並成功繁殖轉基因性狀。理想的是，只有單拷貝的轉基因能存在於轉基因植物中。若干分子生物學領域已知的方法可以檢測拷貝數。DNA印跡分析是最常用的方法。使用Taqmant技術的方法也可以精確且可靠的檢測插入轉基因植物的T-DNA的拷貝數。表3中列舉的方法和DNA引物分子表明怎樣測定植物是否存在nptII編碼序列。含有nptII選擇標記基因的表達盒存在於pMON42066、pMON75183和pMON75182中。通過Taqman方法對用這些DNA質粒轉化的植物進行拷貝數測定，結果顯示在
圖15中。骨架中沒有基因的質粒(pMON42066)顯示，所測定的34株植物的平均拷貝數約為2，只有47％為單拷貝。條件致死選擇標記(codA，pMON75183)質粒顯示，測定的50株植物的平均拷貝數約為2，只有36％的植物為單拷貝。非致死選擇標記基因(ipt，pMON75182)質粒顯示，測定的27株植物的平均拷貝數為1.2，令人驚訝的是，85％的轉基因植物為單拷貝。結果表明本發明質粒降低轉基因拷貝數的價值。
表3.NPTII Taqman測定ABI 7900(384孔板)
條件MJ引擎
例如，使用前述的方法將DNA構建體pMON73564和pMON73565轉化入玉米細胞。使用前述測定Ec.oriV DNA的條件測定所得的轉基因玉米植物是否存在骨架DNA。
圖18中顯示的結果表明，幾乎所有用pMON73565(crtB+，骨架中的非致死選擇標記基因)轉化後再生的植物(N＝104)都沒有Ec.oriV。用對照構建體pMON73564(crtB-，骨架中沒有標記基因)轉化的植物(N＝115)中40％在它們的基因組中含有Ec.oriV DNA。測定相同組的植物的拷貝數，結果顯示在
圖19中。這些結果表明，與用pMON73564構建體轉化的植物相比，實質上更多的用pMON73565(crtB+構建體)轉化的植物具有低拷貝數，且無骨架，該pMON73564在骨架中不含有非致死選擇標記基因。這些結果證明，DNA構建體中非致死選擇標記基因的應用提供了實質上更多具有商業品質的植物。
例如通過前述的轉化方法，使用DNA構建體pMON67935和pMON67936轉化玉米細胞，從中收集的數據為載體骨架中含有的非致死選擇標記基因的效用提供了另外的證據。使用前述檢測Ec.oriVDNA的條件測定所得的轉基因玉米植物是否存在骨架DNA。結果在圖22中顯示，表明用pMON67936(crtB+，在骨架中的非致死選擇標記基因)轉化後再生的植物(N＝54)中超過90％不含有Ec.oriV。用對照構建體pMON67935(crtB-，骨架中沒有標記基因)轉化的植物(N＝84)中約40％在它們的基因組中有Ec.oriV DNA。測定相同組的植物的拷貝數，結果在圖23中顯示。這些結果表明，與用pMON67935構建體轉化的植物相比，實質上更多的用pMON67936(crtB+構建體)轉化的植物具有低拷貝數，且無骨架，該pMON67935在骨架中不含有非致死選擇標記基因。這些結果證明，DNA構建體中非致死選擇標記基因的應用實質上提供了更多具有商業品質的植物。
已經闡明和描述了本發明的原則，對於本領域的技術人員顯而易見的是，可以在排列和細節上改變本發明而不背離這種原則。我們要求保護後附權利要求書的精神和範圍之內的所有修改。
本說明書中引用的所有出版物和出版的專利文件都通過引用結合到本文中，其程度等同於具體和單獨地指出各出版物和專利申請通過引用結合到本文中。
序列表110Gilbertson，Larry AKrieger，Elysia KYe.XudongZhang，Wanggen120增加商業化轉基因植物產生的DNA構建體和方法13038-21(52967)B15060/461,4591512003-04-09160162101211930212DNA213草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)4001atgagccaac cgccgctgct tgaccacgcc acgcagacca tggccaacgg ctcgaaaagt 60tttgccaccg ctgcgaagct gttcgacccg gccacccgcc gtagcgtgct gatgctctac 120acctggtgcc gccactgcga tgacgtcatt gacgaccaga cccacggctt cgccagcgag 180gccgcggcgg aggaggaggc cacccagcgc ctggcccggc tgcgcacgct gaccctggcg 240gcgtttgaag gggccgagat gcaggacccg gccttcgctg cctttcagga ggtggcgctg 300acccacggta ttacgccccg catggcgctc gatcacctcg acggctttgc gatggacgtg 360gctcagaccc gctatgtcac ctttgaggat acgctgcgct actgctatca cgtggcgggc 420
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212DNA213人工序列220
223DNA引物分子4008aacgcctgat tttacgcgag 20210921121212DNA213人工序列220
223DNA引物分子4009caataccgca gggcacttat c212101021118212DNA213人工序列220
223標記DNA引物分子40010cccacagatg atgtggac1821011
21116212DNA213人工序列220
223DNA引物分子40011gcctgccgca gaccaa 162101221122212DNA213人工序列220
223DNA引物分子40012caatgcagag ctcagcttca tc 222101321125212DNA213人工序列220
223標記DNA引物分子40013tccagtacgt gcagtccctc ctccc25
2101421119212DNA213人工序列220
223DNA引物分子40014cacgacgggc gttccttgc 192101521122212DNA213人工序列220
223DNA引物分子40015ggtggtcgaa tgggcaggta gc 222101621123212DNA213人工序列220
223標記DNA引物分子40016actgaagcgg gaagggactg gct 2權利要求
1.一種DNA質粒，所述質粒包含T-DNA，所述T-DNA包含土壤桿菌(Agrobacterium)Ti質粒第一邊界區，所述第一邊界區與至少一個轉基因相連，再與土壤桿菌Ti質粒第二邊界區相連，並且植物表達盒位於所述DNA質粒中T-DNA外，包含與載體骨架DNA相連的植物細胞非致死負性選擇標記基因。
2.權利要求1的DNA質粒，其中所述植物表達盒包含在植物細胞中發揮功能的啟動子，所述啟動子有效連接到植物細胞非致死負性選擇標記基因。
3.權利要求2的DNA質粒，其中所述啟動子為組成型啟動子。
4.權利要求2的DNA質粒，其中所述啟動子在植物再生期間在組織培養物中表達所述連接的非致死負性選擇標記基因產物。
5.權利要求1的DNA質粒，其中所述植物細胞非致死負性選擇標記基因包括植物激素生物合成途徑基因。
6.權利要求1的DNA質粒，其中所述植物細胞非致死負性選擇標記基因包括植物激素降解基因。
7.權利要求1的DNA質粒，其中所述植物細胞非致死負性選擇標記基因包括植物激素生物合成途徑底物轉移基因。
8.權利要求1的DNA質粒，其中所述植物細胞非致死負性選擇標記基因包括植物激素信號轉導基因。
9.權利要求1的DNA質粒，其中所述植物細胞非致死負性選擇標記基因包括代謝幹擾基因。
10.權利要求1的DNA質粒，其中所述轉基因為選自抗生素抗性和除草劑抗性的植物正向選擇標記基因。
11.權利要求1的DNA質粒，其中所述轉基因包括有農藝學意義的轉基因。
12.權利要求5的DNA質粒，其中所述植物激素生物合成途徑基因選自赤黴酸途徑基因、細胞分裂素途徑基因、植物生長素途徑基因、乙烯途徑基因和脫落酸途徑基因。
13.權利要求5的DNA質粒，其中所述植物激素生物合成途徑基因或其部分表達與內源植物細胞RNA互補的反義RNA，其中所述反義RNA被設計用於轉錄後基因抑制。
14.權利要求6的DNA質粒，其中所述植物激素降解基因選自赤黴酸降解基因、細胞分裂素降解基因、植物生長素降解基因、乙烯降解基因和脫落酸降解基因。
15.權利要求7的DNA質粒，其中所述植物激素生物合成途徑底物轉移基因選自赤黴酸途徑底物轉移基因、細胞分裂素途徑底物轉移基因、植物生長素途徑底物轉移基因、乙烯途徑底物轉移基因和脫落酸途徑底物轉移基團。
16.權利要求8的DNA質粒，其中所述植物激素信號轉導基因選自赤黴酸途徑信號轉導基因、細胞分裂素途徑信號轉導基因、植物生長素途徑信號轉導基因、乙烯途徑信號轉導基因和脫落酸途徑信號轉導基因。
17.權利要求9的DNA質粒，其中所述代謝幹擾基因編碼選自以下的酶生物合成途徑酶、從生物合成途徑中轉移底物的酶、降解或滅活生物合成途徑底物的酶。
18.權利要求17的DNA質粒，其中所述酶選自蔗糖6-果糖基轉移酶、轉化酶和海藻糖合酶。
19.權利要求9的DNA質粒，其中所述代謝幹擾基因表達與內源植物細胞RNA互補的反義RNA，其中所述反義RNA被設計用於轉錄後基因抑制。
20.一種增強選擇不含有載體骨架DNA的轉基因植物的方法，所述方法包括以下步驟a)用權利要求1的DNA質粒轉化多個植物細胞；b)在正向選擇化合物上選擇所述植物細胞；c)將所選植物細胞再生為植物。
21.一種通過權利要求20的方法產生的植物。
22.一種減少植物細胞中轉基因拷貝數的方法，所述方法包括以下步驟a)用權利要求1的DNA質粒轉化多個植物細胞；b)在正向選擇化合物上選擇所述轉化的植物細胞；c)將所選植物細胞再生為植物。
23.一種通過權利要求22的方法產生的轉基因植物。
全文摘要
本發明將非致死負性選擇標記基因整合到DNA質粒的載體骨架DNA中，用於轉化植物細胞。這些轉基因被設計為在含有DNA質粒載體骨架DNA的植物細胞中表達非致死基因產物。這些非致死負性選擇標記基因的基因產物涉及植物激素生物合成途徑、植物激素底物轉移、植物激素降解、植物激素信號轉導或代謝幹擾。用這些DNA質粒轉化植物細胞增加了商業化植物的產生。
文檔編號A01H5/00GK1809639SQ200480015511
公開日2006年7月26日 申請日期2004年4月9日 優先權日2003年4月9日
發明者L·吉爾伯特森, E·克裡格爾, W·張, X·葉 申請人:孟山都技術有限公司