高解析度分析核酸以檢測序列變異的系統和方法
2023-09-19 18:08:05 3
高解析度分析核酸以檢測序列變異的系統和方法
【專利摘要】本發明提供了用於檢驗生物樣品中具有藥物抗性和/或藥物敏感性表型的微生物的方法，其中該方法能夠檢測與已知和/或未知突變相關的抗性和敏感性表型。在一些方面，提供了用於檢測藥物抗性結核分枝桿菌（MTb）包括多藥物抗性MTb的方法，其中藥物抗性與一種或多種新型突變相關。還提供了與這樣的方法相關的系統、試劑盒和組合物。
【專利說明】高解析度分析核酸以檢測序列變異的系統和方法
[0001]本申請是2008年3月28日提交的題為「高解析度分析核酸以檢測序列變異的系統和方法」的國家申請號為200880018252.X(PCT / US2008 / 058786)的發明專利申請的
分案申請。
[0002]相關申請的交叉引用
[0003]本申請按照35U.S.C.§ 119(e)要求申請日為2007年3月28日的美國臨時申請60 / 908,604的優先權，其以參考方式全文納入本文。
【技術領域】
[0004]本發明大體上涉及用於製備和分析生物樣品的系統和方法，以檢測與目的表型相關的核酸序列變異。在某些實施方式中，提供了用於擴增來自生物樣品的微生物的核酸以及檢測與藥物抗性和/或敏感性相關的序列變異的方法和系統。
【背景技術】
[0005]在科學史上很少有像控制病原微生物所取得的進展這樣對人類生活產生如此巨大的影響。直至19世紀末期和20世紀初期Pasteur和Koch的工作才確立微生物作為傳染性疾病的誘因並提供了引起理論預防的策略和控制策略。磺胺類藥劑是最初被發現抑制微生物感染的一組化合物，雖然對其作用機理知之甚少，但是該發現刺激了大規模尋找更有效的抗生素化合物。1940年Florey和Chain分離出不純的但是高活性的青黴素製備物，後來青黴素的成 功轉移科學努力朝向抗生素的探索，這引起約3000種被命名的抗生素的發現。但是，雖然發現新化合物迅速發展，但是只有50種指定的抗生素滿足臨床用途，甚至更少的被普遍用於治療微生物疾病。
[0006]抗生素對於抵抗微生物感染的最初有效性已經被對各種抗生素呈抗性的微生物菌株的出現所抵銷。由於微生物的加速進化適應性、臨床上抗生素的加速濫用和病人缺少完成所開劑量方案的服從，所以抗生素抗性被證明是難以克服的。抗性問題使得很多本來能治癒的疾病例如淋病和傷寒症變得難以治療。此外，微生物對萬古黴素(一種最後的廣泛有效的抗生素)的抗性在醫院正變得越來越多的普遍。
[0007]一直在開發新的抗生素化合物以阻擋傳染性微生物，對抗生素抗性的機理的理解被證明在開發過程中是有價值的。基因組學的進展使研究人員可以鑑定易於發生抑制或修飾的生化途徑，並理論設計靶向這樣的途徑的藥物。很多藥物通過與微生物蛋白結合併改變其結構和/或功能而顯示出治療性效應。在這樣的情況下，微生物可以以感染藥物結合或活性的方式而對靶蛋白進行物理修飾從而發展免疫力。例如，在幾種微生物中對抗生素紅黴素的抗性來源於50S核糖體亞基的變異，該變異引起核糖體與紅黴素親和力的降低。由於蛋白的結構/功能是由其初級序列決定的，而初級序列又是由編碼蛋白的核酸的序列決定的，所以與藥物抗性表型相關的核酸序列變異對於藥物抗性的診斷指示劑是有用的。
[0008]雖然已經建立了鑑定微生物中核酸序列變異的方法，但是現有的方法受到需要預先知道用作診斷指示劑的特定突變或其它變異的要求的限制。結果，已知的篩選程序經常忽視那些與藥物抗性或者其它目的特性相關的新發生的和/或未鑑別的序列變異。
[0009]因此，本領域需要快速的、承擔得起的和可靠的既檢測已知的又檢測未知的核酸序列變異的方法，所述核酸變異具有診斷應用，包括與眾多生物例如酵母、病毒、真菌、細菌、寄生蟲甚至人類中的藥物敏感性和/或藥物抗性模式相關的突變。
【發明內容】
[0010]在一些方面，提供了用於確定微生物對藥物的反應性的方法，該方法包括，從病人獲得生物樣品，樣品包含感染性微生物；擴增微生物的一個或多個DNA片段，所述一個或多個片段包括與微生物對目的藥物的反應性相關的至少一個多態性；檢驗一個或多個擴增的DNA片段相對於參考序列的序列變異，其中所述一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵微生物對藥物的反應性。
[0011]在一些優選的實施方式中，使用高解析度熔解曲線分析來檢驗擴增的DNA的序列變異。在各種實施方式中，熔解曲線分析包括:在存在DNA結合螢光染料時(該染料在存在雙鏈DNA(dsDNA)時相對於存在單鏈DNA(ssDNA)時發射出實質上不同水平的螢光)，將互補的參考序列例如野生型序列和擴增的DNA(靶DNA) —起孵育。在一些優選的實施方式中，DNA結合染料是dsDNA特異性染料，例如SYBR Green I或SYBR Green II，熔解曲線分析包括:隨著以恆定速率緩慢加熱檢驗溶液，監測螢光水平作為時間的函數。有利地，本文所提供方法的熔解曲線分析能夠精確地檢測靶DNA序列和參考序列之間的單一鹼基對錯配，和/或兩個、三個、四個、五個或更多個鹼基的錯配。
[0012]在一些實施方式中，本文所提供方法的熔解曲線分析中所用的參考序列包括與藥物反應性例如藥物抗性或藥物敏感性相關的至少一個多態性，並且該分析檢測DNA片段中的一個或更多個另外的多態性，包括與藥物反應性相關的多態性。
[0013]在一些實施方式中，提供了用於確定病人是否能夠以藥物治療的方法，該方法包括:從病人獲得生物樣品，所述樣品包含結核分支桿菌(Myobacterium tuberculosis)(MTb) ID NO:142-204的MTb DNA的一個或多個片段，所述一個或多個片段各包括與MTb對抗生素藥物敏感性相關的至少一個多態性；檢驗一個或多個擴增的DNA片段相對於SEQ ID NO =142-204中的對應序列的序列變異，其中所述一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對所述抗生素藥物的敏感性。在一些實施方式中，兩個或更多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對抗生素藥物的敏感性。
[0014]在一些實施方式中，使用SEQ ID NO:11-36的對應引物通過PCT來擴增SEQ IDNO=142-204 的 MTb DNA。
[0015]在各種實施方式中，擴增的MTb DNA包含SEQ ID NO:142-145中的一個或多個，一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對利福平的敏感性；擴增的MTb DNA包含SEQID NO =146-151中的一個或多個，一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對吡嗪醯胺的敏感性；擴增的MTbDNA包含SEQ ID NO =152-154中的一個或多個，一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對鏈黴素的敏感性；擴增的MTb DNA包含SEQ ID NO =155-176中的一個或多個，一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對異煙肼的敏感性；擴增的MTb DNA包含SEQ ID NO: 177-198中的一個或多個，一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對乙胺丁醇的敏感性；擴增的MTb DNA包含SEQ ID NO:199-203中的一個或多個，一個或多個擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對捲曲黴素和紫黴素中的一種或對二者的敏感性；和/或擴增的MTb DNA包含SEQ ID NO:204 ;擴增的DNA片段中的變異指徵MTb對西沙星(oxif1xacin)、莫西沙星(moxifloxican)、加替沙星(gatifloxican)、西他沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星和司帕沙星中的一個或多個的敏感性。
[0016]在另外的方面，提供了用於確定病人是否能夠以藥物治療的試劑盒，該試劑盒包括SEQ ID NO:1-136中至少一對引物；與SEQ ID NO: 137-204中的擴增子互補的至少一個核苷酸探針；和使用所述至少一對引物擴增來自結核分支桿菌(MTb)感染的病人的生物樣品中的DNA的操作指示，和使用所述至少一個核苷酸探針使用高解析度熔解曲線分析來檢測擴增的DNA中的序列變異的操作指示。
[0017]附圖簡述
[0018]圖1:設計重疊引物退火溫度和模板變性溫度的代表圖示。
[0019]圖2:通過實時PCR獲得的常規擴增產物的圖示。
[0020]圖3:顯示用與圖2所用相同的模板進行的高溫PCR擴增。
[0021 ] 圖4:顯示 以相同的模板材料使用不同的起始材料濃度的HTPCR擴增。
[0022]圖5:A-水中和MycoBuffer中結核分支桿菌的CFP32基因的HTPCR產物的比較。B-水中和MycoBuffer中結核分支桿菌的IS6110基因區域的HTPCR產物的比較。C-水中和MycoBuffer中結核分支桿菌的btMTb基因區域的HTPCR產物的比較。D-水中和MycoBuffer中結核分支桿菌的IS6110轉座酶靶基因區域的HTPCR產物的比較。E-水中和MycoBuffer中結核分支桿菌的BTTb基因區域的HTPCR產物的比較。
[0023]圖6:來自利福平抗性篩選的擴增產物的圖示代表。A-同質雙鏈和異質雙鏈擴增產物。B-同質和異質雙鏈產物的熔解曲線。C-B中熔解曲線間的差異圖。
[0024]圖7:曲線分析和對照及敏感樣品的不同曲線的圖示代表。
[0025]圖8:顯示不同核酸的不同螢光曲線的圖示代表。
[0026]圖9:對照、抗性和敏感性樣品間不同曲線分析的圖示代表。
[0027]圖1OA:來自結核分支桿菌的利福平敏感性和抗性樣品的不同曲線分析。B:來自結核分支桿菌的鏈黴素敏感性和抗性樣品的不同曲線分析。
[0028]圖11:來自釀酒酵母(S.cerevisiae)的特比萘芬抗性樣品的不同曲線分析。
[0029]圖12:來自人的紫杉烷(Taxane)敏感和抗性樣品的不同曲線分析。
[0030]圖13:來自瘧疾感染的氯喹抗性樣品的不同曲線分析。
[0031]圖14:來自HIV的齊多夫定敏感和抗性樣品的不同曲線分析。
[0032]圖15:來自金黃色葡萄球菌(S.aureus)的萬古黴素敏感和抗性樣品的不同曲線分析。
[0033]圖16:通過動態波動擴增模擬(dynamic flux amplification simulation)擴增的結核分支桿菌DNA產物的瓊脂糖凝膠分析。
[0034]圖17:通過動態波動擴增方法擴增的鼠傷寒沙門氏菌(S.tymphimurium)DNA擴增產物的實時分析。
[0035]本發明說明性方面的詳細描述
[0036]本文提供了可靠的、低成本的方法，其用於檢測與在治療疾病、疾患或病狀中具有診斷應用的一種或多種表型特徵相關的核酸序列變異。在其它方面，本文描述的方法可用於檢測與微生物對一種或多種藥物的反應性相關的核酸序列變異。本文還提供了與本方法相關的組合物、系統和試劑盒。雖然對於各種方法本文描述了本發明的一些方面和優點，但是技術人員將認識到這樣的方面和優點也適用於相關的組合物、系統和試劑盒等。
[0037]術語「微生物」在本文中是指細菌、真菌、原生動物、寄生蟲和/或病毒。在各種優選的實施方式中，微生物是細菌病原體。在一些優選的實施方式中，微生物是結核分支桿菌。但是，雖然對於結核分支桿菌本文描述了本發明的一些方面和優點，但是技術人員將認識到這樣的方面和優點也適用於其它的微生物，並適用於眾多疾病和病狀。本文提供的診斷方法中可用的微生物的非限制性的例子總結於表1，其中還提供了與這些微生物的藥物反應性相關的可變序列元件。
[0038]本文所稱「個體」可以是任何能夠作為微生物宿主的生物，包括但不限於實驗動物(例如小鼠、大鼠、兔子等)和人。在各種優選的實施方式中，個體為患有傳染性疾病的病人。在一些優選的實施方式中，病人患有結核病。
[0039]本文所述「生物樣品」可包括從個體中取得的任何生物材料，包括但不限於吐出物(例如痰液(sputum))、血液、血細胞(例如淋巴細胞)、組織、活組織檢查、培養的細胞、胸膜、腹膜或腦脊髓液、汗液、糞便和尿液。在一些實施方式中，來自個體的生物樣品在按照本文提供的方法檢驗前進行處理，例如培養感染性微生物和/或擴增其遺傳材料。
[0040]本文所用的術語「藥物」可以指任何化合物、藥劑、處理形式或其組合。在一些實施方式中，藥物是抗生素化合物。
[0041]本文所用的術語「靶核酸」是指源自感染性微生物的核酸，以與來自個體的核酸和/或與待處理疾病、疾患或病狀無關的外源核酸區別。在一些實施方式中，靶核酸是按照本文所述方法檢驗的微生物的核酸。
[0042]本文所用的術語「參考核酸」是指對應於靶核酸(例如代表基因組DNA的相同部分)的核酸，其與靶核酸的不同之處在於一個或多個序列變異。例如，在一些方面，參考核酸具有野生型微生物(例如，相對於感興趣藥物的反應性來說)的序列。在其它方面，參考核酸具有野生型人類細胞的序列，例如疾病細胞包括人類癌細胞。
[0043] 本文所用的與核酸相關的術語「序列變異」是指核酸相對於對應核酸的序列(例如代表相同基因或基因組DNA的其它部分的序列)來說序列中的差別。在一些優選的實施方式中，根據本文提供的各種方法檢測的序列變異為「單核苷酸多態性」(「SNP」)，其產生於革巴核酸和參考核酸之間的單一核苷酸相同性的變異。在其它實施方式中，根據本文提供的各種方法檢測的序列變異為「多核苷酸多態性」(「MNP」)。在一些實施方式中，參考核酸對應於非藥物抗性表型，根據本文提供的方法通過鑑定來自微生物感染個體的生物樣品或疾病細胞例如藥物抗性癌細胞的靶核酸和參考核酸之間的序列變異來檢測藥物抗性表型。
[0044]本文所用的術語「反應性」和「藥物反應性」是指微生物或疾病細胞例如癌細胞的與藥物治療效果相關的抗性、敏感性、易感性、耐受性和/或其它表型特徵，包括非反應性。藥物反應性可根據藥物對目標微生物或疾病細胞例如癌細胞的效應(例如細菌死亡率或細胞死亡率)直接測定，和/或可根據藥物對由微生物引起的傳染性疾病的一個或多個方面的效應(例如，預防、改善、緩和和/或消除疾病或疾病的一個或多個症狀)而間接測定。在一些優選的方面，本文提供的系統和方法用於檢測對一種或多種藥物的抗性，其中抗性是指可遺傳的(遺傳性)抗性。[0045]術語「可變序列元件」是指核酸(例如DNA或RNA)區域，其包含一串毗連的核苷酸-例如2、3、5、10、15、25、50、75、100或更多個連續鹼基-其包含至少一個已知與目的表型特徵相關的序列變異，所述表型特徵例如抗性、敏感性和/或藥物反應性的其它方面。不被特定理論所限制，相信與藥物反應性例如藥物抗性和/或敏感性相關的序列變異可能發生於對決定反應表型起重要作用的核酸區域中，從而包含變異(和周圍核苷酸)的可變序列元件實質上更可能包含另外的、未經鑑定的、與反應性(例如抗性或敏感性)表型相關的變異。例如，與藥物抗性相關的序列變異經常發生於編碼相應蛋白位點的核酸區域，所述蛋白對藥物反應性在結構和/或功能上是決定性的，例如藥物結合位點。包括已知的變異(和周圍核苷酸)的可變序列元件將可能編碼蛋白的結構和/或功能相關部分(例如，袋、摺疊或其它包含藥物結合位點的結構)，可變序列元件中的其它的未鑑定的變異將可能與已知變異一樣與相同的表型相關。
[0046]因此本文提供了用於檢驗與已知和/或未知序列變異相關的藥物反應性表型的方法。有利地，這樣的方法能夠檢測藥物反應性而不需預先知道特定的核酸序列變異，這允許迅速鑑定與藥物抗性、藥物敏感性和/或其它藥物反應性表型相關的新的遺傳突變。因此，本文提供的方法可比現有的基於已鑑定的突變的方法達到更高的敏感性和具有更多的診斷應用。
[0047]因此，本文提供的可變序列元件包括一個或多個已知與藥物抗性表型相關的序列變異，按照本文描述檢驗這樣的可變序列元件允許檢測由於已知變異和/或另外的未鑑定的變異而引起的藥物抗性表型。優選地，本文提供的可變序列元件的大小為允許高度敏感性並且假陽性低(例如，其大小足夠編碼被已知變異改變的蛋白部分和結構和/或功能上相關的區域而不包括蛋白的顯著不相關部分)。在一些實施方式中，檢測本文提供的可變序列元件內的序列變異是藥物抗性的指徵，其假陽性比率為約小於25%，小於約20%，小於約15%，或更優選為小於約10%、5%或1%。
[0048]在各個方面，提供了診斷方法，該方法通過測定微生物對藥物的反應性而確定被微生物感染的個體是否能夠用該藥物治療。在一些方面，通過從個體獲得生物樣品並檢驗該樣品中與藥物反應性相關的可變序列元件內的一個或多個序列變異而測定反應性。在一些優選方面，可變序列元件與對藥物的敏感性相關。
[0049]在一些優選方面，提供了檢測個體是否被藥物抗性Tb感染的方法，其中該方法包括從個體中獲得生物樣品並檢驗樣品中靶DNA可變序列元件內一個或多個核酸序列變異，所述可變序列元件選自表1中所示的可變序列元件。在一些優選的實施方式中，方法還包括使用表3中所示的引物擴增靶可變序列元件。
[0050]在一些優選方面，本文提供的方法包括製備生物樣品以有利於檢測和/或分析靶核酸的步驟。在一些方面，提供了製備生物樣品以進行高解析度序列分析的系統和方法。在一些優選的實施方式中，處理 生物樣品以通過聚合酶鏈反應(PCR)或本領域已知的其它方法擴增靶DNA可變序列元件。
[0051]PCR擴增通常包括起始變性、退火、聚合和最後的延伸的步驟。PCR擴增通常是在反應室中進行，其中提供了必需的PCR反應物，包括含有靶DNA的生物樣品，DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)、核苷三磷酸、與靶DNA雜交並位於擴增的DNA產物(「擴增子」)兩翼的第一和第二引物(包含引物對)。PCR儀器通常包括使擴增循環的每個步驟所需要的反應室溫度循環的裝置，所述溫度包括，例如雙鏈DNA 「熔解」產生單鏈DNA ;引物與單鏈DNA模板退火；和擴增的DNA通過聚合酶延伸。
[0052]用於擴增特定靶DNA序列的精確條件可根據一些因素而變化，這在技術人員的知識範圍內。在一些實施方式中，變性在約90-95°C進行約10-30秒，退火在約45-65°C進行約10-30秒；延伸在約70-75°C進行約10-90秒；最終的延伸在72°C進行約5分鐘。在一些實施方式中，反應混合物包含基因組DNA、MgCl2和其它生理鹽(例如MnCl2)、PCR緩衝液、0.1-1.0 mM dNTP、0.04-1.5μΜ的每個引物、和0.5-5.0單位的熱穩定性聚合酶(例如Taq聚合酶)。
[0053]本領域已知的其它擴增方法可也使用，包括例如，自主維持序列擴增(3SR);鏈替代擴增(SDA)支鏈」 DNA擴增(Chiron Corp.);連接酶鏈反應(LCR) ;QB複製酶擴增(QBR);連接激活轉錄(LAT);基於核酸序列的擴增(NASBA);修復鏈反應(RCR);和循環探針反應(CPR)(參見例如 The Genesis Report, DX ；Vol.3(4), pp.2-7 (1994 年 2 月)中的綜述)。
[0054]在一些方面，提供了新型引物用於擴增靶核酸以用於按照本文所提供方法的分析。例如，在各種實施方式中，表2中所示的引物可用於擴增表3中所示的相應的擴增子，其可用於本文描述的各種方法中以用於檢測指徵藥物抗性的序列變異。
[0055]在一些方面，使用熔解曲線分析(MCA)根據本文提供的方法檢測靶核酸內的序列變異。在各種實施方式中，MCA包括:在染料存在時緩慢加熱DNA片段，所述染料允許測定雙鏈DNA(dsDNA)和單鏈DNA(ssDNA)的相對量作為時間和溫度的函數，如在Morrison和Stols, Biochemistry, 32:3095-3104(1993)中所描述。合適的染料包括但不限於dsDNA-特異性染料，如溴乙唳、SYBR Green I 和 SYBR Green II (Molecular Probes,Eugene, Oreg.)、Eva Green (GENTAUR EUROPE)和ssDNA-特異性染料。在一些優選實施方式中，染料為螢光染料如 SYBR Green I,SYBR Green II,Eva Green,LC Green I 和 LC Green Plus。在各種實施方式中，染料可以是飽和或不飽和的。
[0056]在各個方面，在本文提供的方法中用於檢測序列變異的MCA包括:在螢光DNA結合染料存在時將含有靶核酸的樣品和核苷酸探針一起孵育，並監測雜交程度(由螢光水平指示)作為時間和溫度的函數。例如，在一些實施方式中，表3的可變序列元件在生物樣品中被擴增，在dsDNA結合染料存在時將擴增的樣品和與表3中所示的野生型序列互補的核苷酸探針一起孵育。然後以恆定的速率緩慢加熱樣品(例如每分鐘約0.05至10.(TC )同時測定相對於時間的螢光水平。在各種優選實施方式中，進行平行的對照MCA，其中靶DNA為已知具有表3中所示的野生型序列。在最初的低溫度時靶DNA與互補的核苷酸探針雜交形成dsDNA，而當溫度升高時，dsDNA變性，將dsDNA轉化為ssDNA。dsDNA轉化為ssDNA伴隨著螢光的變化，這是所用的特定染料的特性。有利地，可通過分析相對於對照樣品來說螢光隨時間的變化而檢測生物樣品中的序列變異。
[0057]在各種優選實施方式中，在本文提供的方法中使用的MCA允許「高解析度」檢測靶序列內的序列變異，其作為螢光數據的一個或多個方面的變化而被檢測。在一些優選的實施方式中，根據本文提供的方法的高解析度MCA可分辨樣品-探針和對照-探針dsDNA種類之間單個鹼基和/或2、3、4、5或更多鹼基的差別。
[0058]在一些方面，可使用以下方程將螢光數據作為時間的函數繪圖，以確定最大螢光、最小螢光、最小螢光的時間和擴增產物的已知濃度的二級速率常數:
【權利要求】
1.一種擴增方法，該方法包括: 獲得包含一個或多個DNA片段的樣品； 從一個或多個DNA片段確定靶核酸序列； 以使寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍最小化的方式用與變性曲線(TD)或靶核酸序列重疊的退火曲線(TA)確定一對寡核苷酸引物；和 採用一對寡核苷酸引物擴增靶核酸序列，並使溫度在等於或大於寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍內循環。
2.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍不大於2.5°C。
3.權利要求1的方法，其中所述窄溫度範圍為75°C到90°C之間。
4.權利要求1的方法，其中所述窄溫度範圍為82°C到89°C之間。
5.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物中的至少一個的熔解溫度與靶核酸序列的熔解溫度相同。
6.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物中的至少一個的熔解溫度在靶核酸序列的熔解溫度的2.5°C內。
7.權利要求1的方法，其中所述擴增包括在窄溫度範圍內寡核苷酸引物的退火和變性至靶核酸序列。
8.權利要求7的方法，其中所述寡核苷酸引物的退火和變性至靶核酸序列發生在動態波動中。
9.權利要求1的方法，其中擴增產生靶核酸序列的特定產物。
10.權利要求1的方法，其中，與寬溫度範圍內的擴增相比，擴增減少非特異性擴增產物的形成。
11.權利要求1的方法，其中所述擴增的靶核酸序列通過比色檢測讀出器檢測。
12.權利要求11的方法，其中所述讀出器是陽性或陰性信號。
13.權利要求1的方法，還包括通過從DNA結合的螢光染料發射的螢光檢測所述擴增的靶核酸序列。
14.權利要求1的方法，還包括通過高解析度熔解曲線分析檢驗所述擴增的靶核酸序列相對於參考序列的序列變異。
15.權利要求14的方法，其中所述熔解曲線分析檢測所述擴增的靶核酸序列和參考序列之間的一個或多個鹼基配對。
16.權利要求1的方法，其中一個或多個擴增的DNA片段來自感染性微生物，且其中所述靶核酸序列包括與微生物對藥物的反應性相關的至少一個多態性。
17.權利要求16的方法,還包括確定參考序列,所述參考序列包括與對藥物的反應性相關的至少一個多態性。
18.權利要求16的方法，其中所述至少一個多態性與對藥物的敏感性相關。
19.權利要求17的方法，其中所述參考序列的至少一個多態性指示對藥物的敏感性。
20.權利要求16的方法，其中所述至少一個多態性與對藥物的抗性相關。
21.權利要求17的方法，其中所述參考序列的至少一個多態性指示對藥物的抗性。
22.權利要求1的方法，其中所述靶核酸序列包括至少一個多態性。
23.權利要求22的方法，還包括檢測所述擴增的靶核酸序列相對於參考序列的序列變巳升。
24.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍不大於5°C。
25.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍不大於10°c。
26.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍不大於15°C。
27.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的熔解溫度和靶核酸序列的熔解溫度之間的溫度範圍不大於20°C。
28.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的至少一個的熔解溫度在靶核酸序列的熔解溫度的5°C內。
29.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的至少一個的熔解溫度在靶核酸序列的熔解溫度的10°C內。
30.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物的至少一個的熔解溫度在靶核酸序列的熔解溫度的15°C內。
31.一種擴增DNA的方法，該方法包括: 獲得包含一個或多個DNA片段的樣品； 在一個或多個DNA片段內確定目的序列； 確定一對引物，所述引物的熔解溫度(Tm)與靶核酸序列的熔解溫度(Tm)有窄範圍的不同；和 採用所述確定的引物對擴增目的序列。
32.權利要求1的方法，其中所述引物的熔解溫度(Tm)在目的序列的熔解溫度(Tm)的2.5。。內。
33.權利要求1的方法，其中所述引物的熔解溫度(Tm)在目的序列的熔解溫度(Tm)的5。。內。
34.權利要求1的方法，其中所述引物的熔解溫度(Tm)在目的序列的熔解溫度(Tm)的10°C 內。
35.權利要求1的方法，其中所述引物的熔解溫度(Tm)在目的序列的熔解溫度(Tm)的15°C 內。
36.權利要求1的方法，其中所述引物的熔解溫度(Tm)和目的序列的熔解溫度(Tm)均在75。。到90°C之間。
37.權利要求1的方法，其中所述引物的熔解溫度(Tm)和目的序列的熔解溫度(Tm)均在82°C至Ij 89°C之間。
38.權利要求1的方法，還包括檢測所述擴增的DNA片段相對於參考序列的序列變異的步驟。
39.權利要求1的方法，還包括計算靶核酸序列的理論熔解溫度(Tm)。
40.權利要求1的方法，還包括調節pH以提高在其它核酸中選擇擴增所述靶核酸的特異性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952470SQ201410066674
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2008年3月28日 優先權日:2007年3月28日
【發明者】B.E.凱普林 申請人:信號診斷公司