一種海綿原細胞的分離純化方法

2023-09-20 07:21:40 1

專利名稱：一種海綿原細胞的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及海綿原細胞(幹細胞)的分離純化，具體地說是一種分離純化海綿原細胞的方法，提高了從混合海綿細胞中分離原細胞的純度和效率。
背景技術：
海綿組織中可分離提取出大量的結構新穎、活性極強的具有抗腫瘤、抗感染、抗HIV的活性物質，為獲得上述活性產物、以海綿細胞體外培養為基礎的海綿細胞工程研究也日漸引起關注，並成為解決海綿活性物質供給不足這一瓶頸問題的最有希望的途徑之一。海綿，多孔動物門，是一類低等海洋多細胞動物，靠過濾海水為食，有豐富的水溝系統，尤其是一些體態較小潮間帶海綿，例如繁茂膜海綿，這種特殊的多孔性結構導致在體外培養過程中無法進行定位取材，因此，在進行原代培養時，一般都是將海綿組織整體進行充分離散，分離出全部海綿細胞，直接培養或經初步分離後再培養。
海綿組織一般由原細胞(archaeocyte)、膠原細胞(collencyte，lophocyte，mucoid cell)、造骨細胞(sclerocyte)、扁平上皮細胞(pinacocyte)、領細胞(choanocyte)、肌細胞(myocyte)、孔細胞(porocyte)、灰細胞(gray cell，glycocyte)、小球細胞(spherulous cell)、泡細胞(cystencyte)、細菌性細胞(bacteriocyte)等多種細胞構成，其中原細胞是海綿組織中的多能幹細胞，具有較強的增殖能力，並且能夠分化成為膠原細胞、造骨細胞、上皮細胞、肌細胞、領細胞這些構成海綿體的主要細胞類型。
對於海綿細胞體外培養這一挑戰性的課題，體外培養對象，即細胞種類的選擇，對體外培養相關研究有重要影響，而某一類型海綿細胞培養的前提工作就是該類細胞的分離純化。但由於對海綿細胞膜表面抗原，尤其是細胞種類特異性膜蛋白的研究很少，加之不同海域、不同種屬海綿差異性較大，目前還沒有明確的海綿細胞分類的特異性標記物。因此，國內外的海綿細胞培養工作，大多利用混合海綿細胞培養，即使所使用的細胞分離方法也多為密度梯度離心方法，都未能對某類細胞進行高度富集。

發明內容
本發明的在於提供一種分離純化海綿的幹細胞——原細胞的方法。通過四步分離方法偶聯使用，實現了海綿中原細胞的有效分離和高度純化。
為了實現上述目的，本發明採用的技術方案為本發明根據各類海綿細胞的不同生物學特性，將差速離心、細胞特異性聚集、差速黏附和密度梯度離心四步分離方法偶聯使用，以較高的純度和效率分離純化出海綿原細胞；實現將海綿原細胞以較高的純度從由10多種細胞構成的混合海綿細胞中分離出來；可按如下步驟操作(1)海綿細胞離散-混合海綿細胞的製備取新鮮潔淨的健康海綿組織塊，切割成1-10mm3小塊，振蕩離散出海綿細胞，用200～500目篩網(如尼龍網、不鏽鋼、銅網)過濾，離心，留細胞沉澱(棄上清，)用含EDTA的CMFSW(無鈣鎂海水)重懸即為混合海綿細胞；具體為取新鮮或經水族槽暫養1-2周的健康海綿組織塊，用含200-800ug/ml慶大黴素的無鈣鎂海水洗滌(3-5次)，洗去除表面微生物及其他共生物後，剔除夾雜於組織塊中的藻類和泥沙等雜質；再將組織塊切割成1-3mm3小塊，4℃保存，浸泡於CMFSW中，洗滌3-5遍，每次2-3小時，振蕩30min離散出海綿細胞，重複兩次，過濾，離心，1000-3000rpm，10min；用含1-2mM EDTA的CMFSW重懸細胞沉澱即為混合海綿細胞；特點為混合海綿細胞的製備過程不使用EDTA，而用含抗生素的CMFSW多次洗滌海綿組織塊，使海綿組織呈「骨質疏鬆」樣，使海綿細胞易於離散，這樣不但可以最大限度地減少高濃度EDTA(10-20Mm)介導的化學離散過程對海綿細胞的化學性損傷，利於各類海綿細胞更好地保持其各自的細胞學特徵，還有利於清除海綿組織的水溝系及細胞間質中的微生物；製備得混合細胞後，為了防止海綿細胞聚集，使海綿細胞處於離散狀態，用含1-2mM EDTA的CMFSW製備細胞懸液，以方便下面的分離過程。
(2)差速離心將混合海綿細胞懸液進行低速離心，300～800rpm，10～30min，(差速離心條件通常為300～600rpm，10～20min)留取細胞沉澱，棄去上清；離心後所得細胞沉澱主要為原細胞、膠原細胞等大體積海綿細胞和部分小體積海綿細胞，上清主要是領細胞、上皮細胞、孔細胞、灰細胞等小體積海綿細胞；(3)差速聚集(選擇性聚集)將差速離心獲得的細胞接種於CMFSW中，利用原細胞較其他細胞具有更強的聚集能力，經過18～25℃下8-12小時的選擇性聚集，大多數原細胞及膠原細胞和部分上皮細胞先聚集成體積較大的不規則細胞聚集體，棄去體系中未參與聚集的小細胞及低活力的細胞；特點為海綿細胞在CMFSW中聚集，這種聚集沒有鈣、鎂離子的參與，是由聚集因子——聚集因子受體介導的細胞特異性聚集，而原細胞較其他種類海綿細胞具有更強的聚集能力，易於成團；大部分原細胞都參與形成細胞聚集體，但細胞聚集體中還參有膠原細胞、上皮細胞等貼壁型細胞，未參與聚集的游離細胞主要為小體積細胞和活力低下細胞。
(4)差速黏附將細胞聚集體於人工海水(ASW)中進行培養，細胞聚集體貼壁，海綿細胞聚集體貼壁鋪展達最大程度(即細胞達70-80％匯合)後，原細胞以聚集體或游離形式黏附在由貼壁的膠原細胞和上皮細胞構成的細胞基底層上，用CMFSW洗去ASW，利用原細胞和膠原細胞間黏附貼壁能力和方式的差異，鏡下觀測(鏡下控制EDTA的作用時間，保證原細胞解離，而膠原細胞層仍保持貼壁狀態，從而可以除去細胞聚集體中的膠原細胞和部分上皮細胞，一般作用時間為5-8min，由於膠原細胞在體積上與原細胞相差較小，且易與原細胞黏附聚集，所以此步驟是全部分離過程的限速步驟)應用含1～10mM(最好為2～5mM)EDTA的CMFSW先將原細胞離散下來，取出原細胞離散液，並震蕩進行充分離散；取樣計數其中的原細胞百分比並檢測PCNA陽性率，再取樣與BrdU共孵育考察BrdU陽性細胞百分比，其餘細胞用於下一步分離；(5)密度梯度離心利用原細胞與其他細胞在體積和密度上的差異，再應用密度梯度離心法，進一步將原細胞和殘存的膠原等細胞分離開，實現原細胞的最後純化，密度梯度液的配製採取Ficoll和泛影葡胺聯用，以降低Ficoll的粘度及其非特異性促細胞聚集作用，用2-5％的Ficoll(聚蔗糖)和20-40％泛影葡胺配製密度從1.01--1.10g/ml的梯度液(密度梯度液的密度分別為1.04，1.05，1.06，1.07，1.08，1.09，1.10g/ml)，並按照密度從高到低的順序先後鋪於試管中，將步驟(4)所得細胞懸液鋪於梯度液上，500-2000rpm，離心10～30min，(最好為500-1500rpm，5～15min，)將各層細胞用滴管逐層取出，鏡下觀察，收集原細胞，用CMFSW洗去密度梯度介質，共洗滌2～4次。
各個分類步驟所使用的CMFSW和ASW都加入一定量的抗生素(慶大黴素，400ug/ml)，而且全部分離過程進行了多次細胞洗滌，最大限度地減少了海綿組織本身固有的微生物，因此降低了海細胞體外培養過程中汙染的發生，至少延長了汙染發生的時間，為獲取更多的有效數據提供了更長的細胞體外操作時間。
本發明的優點如下1.分離效果好。本發明與常規利用密度梯度離心法富集海綿原細胞的不同之處在於，在進行密度梯度離心前，本發明通過採用差速離心、細胞特異性聚集、差速黏附法最大限度地純化了原細胞，減少了其他種類海綿細胞對密度梯度離心的幹擾，不但提高了分離所得原細胞的純度(原細胞純度大於90％)，還提高了原細胞的回收率(原細胞的回收率為50-60％)，而且分離後所得原細胞的活力在95％以上，實現了海綿原細胞的高效分離純化，有利於下一步深入研究海綿幹細胞生物學性質及其體外培養規律。
2.易於操作。本發明對於海綿幹細胞的分離純化，使用處理方法較為溫和，充分利用各類海綿細胞自身生物學特性的差異，最後獲得較高純度和活力的海綿幹細胞；該方法簡便、穩定、易於操作、適於實驗室常規使用，成本較低。還可以用於其他種類海綿細胞的分離純化。


圖1為差速離心前後海綿細胞構成及其BrdU和PCNA免疫組織化學染色光鏡照片；其中(A)混合海綿細胞(×400).(B)混合海綿細胞BrdU免疫組織化學染色(×400).(C)混合海綿細胞PCNA免疫組織化學染色(×400).(D)500rpm，15min離心後海綿細胞(×400).(E)500rpm，15min離心後海綿細胞經BrdU免疫組織化學染色(×400).(F)500rpm，15min離心後海綿細胞PCNA免疫組織化學染色(×400)；圖2為差速離心後，體積較大海綿細胞差速形成聚集體，並進行差速黏附貼壁的過程光鏡照片；比較了差速聚集後及差速黏附黏附後所得海綿細胞的構成及其BrdU和PCNA免疫組織化學染色情況；其中(A)30min快聚集細胞形成細胞團(×40).(B)培養2小時，細胞團開始貼壁，膠原細胞開始向外遷移(×40).(C)培養4小時，膠原細胞繼續遷移，細胞團開始鋪展(×40).(D)培養6小時，細胞團繼續鋪展，並通過膠原細胞開始匯合(×250).(E)培養8小時，細胞團間達到最大融合(×40).(F)原細胞從膠原細胞上解離下來，膠原細胞仍處於貼壁狀態(×400).(G)差速聚集的海綿細胞，混有部分膠原細胞和少量小細胞(×400).(H)差速聚集細胞的BrdU免疫組織化學染色(×400).(I)差速聚集細胞的PCNA免疫組織化學染色(×400).(J)差速黏附後，解離下來的細胞(×400).(J)差速黏附後，解離下來細胞的BrdU免疫組織化學染色(×400).(K)差速黏附後，解離下來海綿細胞的BrdU免疫組織化學染色(×400).(L)差速黏附後，解離下來海綿細胞的PCNA免疫組織化學染色(×400)；圖3為(A)使用Ficoll泛影葡胺配製的密度梯度層示意圖；(B)密度梯度離心後，海綿細胞在各個密度層的分布情況；圖4為密度梯度離心後分離所得原細胞，及其BrdU和PCNA免疫組織化學染色情況；其中(A)密度梯度離心後，C5層的原細胞(×400).(B)原細胞中BrdU陽性細胞(×400)(C)原細胞PCNA陽性細胞(×400)；圖5為混合海綿細胞經差速離心、差速聚集、差速黏附及密度梯度離心各個步驟所得海綿原細胞的百分比及其BrdU和PCNA百分比。其中MC混合細胞；DC差速離心；DA差速聚集；DAD差速黏附；DGC密度梯度離心；圖6為原細胞與BrdU孵育時間對原細胞攝取BrdU的影響。
具體實施例方式
中國黃勃海繁茂膜海綿原細胞的分離純化海綿細胞離散——混合海綿細胞的製備將2-3g新鮮採集或經水族槽暫養1-2周的健康繁茂膜海綿組織塊，用含慶大黴素(400ug/ml)的無鈣鎂海水(CMFSW)洗滌3遍，以除去表面微生物及其他共生物後，切成1-3mm3小塊，4℃保存，再用CMFSW洗滌3-5次，每次2-3小時，以160rpm的速度振蕩離散出海綿細胞，300目尼龍濾網過濾，離心1500rpm，10min，用含2mM EDTA的CMFSW將細胞重懸，獲得混合海綿細胞，用血細胞計數板計數混合細胞中原細胞的百分含量，留取樣品考察PCNA陽性率，再將部分樣品與BrdU共孵育，37℃，24小時，考察混合細胞中BrdU陽性細胞百分比，其餘細胞用於下一步分離。見圖1所示差速離心法——富集包括原細胞在內的大體積海綿細胞將上述利用1500rpm，10min離心製備的混合海綿細胞密度調整為2～5×107/ml，再以較小轉速離心，500rpm，15min，棄去上清液，保留細胞沉澱，計數其中原細胞百分比，留取部分細胞與BrdU共孵育24小時，37℃，考察BrdU陽性細胞百分比，其餘細胞用於下一步分離。見圖1所示差速聚集法——富離聚集能力強的海綿細胞(以膠原細胞和原細胞為主的混合體)將500rpm，15min離心後的細胞沉澱物，用CMFSW洗滌兩次以除去殘存的EDTA，調整細胞密度為5～10×107/ml，於100ml玻璃培養瓶中於CMFSW中培養，10ml/瓶，20℃，8小時，振蕩培養，20轉/min，使原細胞充分參與聚集，形成細胞聚集體，棄去未參與聚集的游離海綿細胞，留取部分細胞樣品計數細胞聚集體中的原細胞百分含量及PCNA和BrdU陽性率，其餘細胞用於下一步分離。見圖2所示差速黏附法初步分離原細胞——初步將膠原細胞和原細胞分離改用人工海水繼續培養細胞聚集體，8-10小時，使之貼壁，待聚集體中的膠原細胞和上皮細胞充分貼壁分布於細胞聚集體底部，並進行活躍遷移、鋪展達70-80％匯合時，停止培養，用CMFSW洗去ASW後，用含2mM EDTA的CMFSW將分布於細胞聚集體上層的原細胞離散下來，鏡下控制EDTA作用的時間，防止作用時間過長使過多的膠原細胞脫壁，18-22℃下，處理時間為5min。將離散下來的原細胞用含2mM EDTA的CMFSW充分離散，取樣計數其中的原細胞百分比並考察PCNA和BrdU陽性率，其餘細胞用於下一步分離。見圖2所示密度梯度離心純化原細胞——進一步將原細胞與混雜的膠原細胞分開將上一步驟所得離散細胞，調節密度為5～10×107/ml，備用。
用CMFSW將Ficoll粉末配製成3％Ficoll(ρ＝1.0276g/ml，16℃)，並將76％的泛影葡胺原液稀釋成為38％(ρ＝1.1486g/ml，16℃)，經過計算，配製密度為1.04，1.05，1.06，1.07，1.08，1.09，1.10g/ml的梯度液，用15ml試管時，每層梯度液為1ml，上樣量為1-2ml，總細胞數量為2-5×107；用50ml試管時，則每層梯度液為5-10ml，上樣量為3-5ml，總細胞數量為1-2×108，用水平離心機離心，1000rpm，20min。
待離心完畢，細胞分層後，用滴管將各層細胞取出，用CMFSW洗滌兩次，去除密度梯度介質，鏡下觀察各層細胞形態，原細胞分布於密度為1.07和1.08兩密度層之間，取樣計數原細胞百分比並考察PCNA和BrdU陽性率，部分細胞用於細胞培養觀察體外生長情況。見圖3、4所示海綿原細胞增殖活力的檢測方法(1)5-溴-2脫氧尿嘧啶(BrdU)標記及其免疫組織化學染色從上述各步驟所得海綿細胞中取樣，計數其中的原細胞含量及細胞密度，按照106個細胞對應加入0.5ml BrdU(1∶1000)進行孵育，37℃，24小時，考察各步驟所得海綿細胞的BrdU陽性率。
對於最後經密度梯度離心獲得的純度較高的海綿原細胞，用BrdU攝取法來考察分離純化各步驟所得細胞中處於DNA合成期細胞的百分含量，考察其與BrdU孵育時間為24，36，48，60小時的BrdU陽性率，以確定不同孵育時間對原細胞攝取BrdU的影響，發現隨著孵育時間的延長，原細胞攝取BrdU的效率也增加。
BrdU陽性率的檢測，按照Roche公司的BrdU標記和檢測試劑盒說明書進行。海綿細胞經BrdU孵育後，用CMFSW洗滌三次，於1000rpm，離心5min，去除殘餘BrdU。調整細胞濃度為5×107/ml，取10ul細胞懸液塗於APES處理過的玻璃片上，70％乙醇(pH 2)固定30min，用PBS緩衝液洗滌三次，加抗BrdU抗體於細胞塗片上，37℃溼盒，孵育1小時，洗滌三次，加鹼性磷酸酶標記羊抗鼠抗體，37℃溼盒，孵育1小時，洗滌三次，加新鮮配製的底物液(13ul NBT，10ul XP，3ml底物緩衝液，pH 9.6)，反應15min，PBS洗去底物液中止染色，梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封片。鏡檢，計數BrdU陽性細胞數。參見圖1、2、4所示方法(2)海綿細胞中增殖細胞核抗原(PNNA)的表達具體方法如下海綿細胞用CMFSW洗滌三次，調整細胞密度為5×107/ml，取10ul細胞懸液塗於APES處理過的玻璃片上，空氣乾燥後70％乙醇(pH2)固定30min，用PBS緩衝液洗滌三次，加抗PCNA抗體於細胞塗片上，37℃溼盒，孵育1小時，洗滌三次，加鹼性磷酸酶標記羊抗鼠抗體，37℃溼盒，孵育1小時，洗滌三次，加新鮮配製的底物液(13ul NBT，10ul XP，3ml底物緩衝液，pH 9.6)，反應15min，洗去底物液中止染色，梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封片。鏡檢，計數陽性細胞數。應用增殖細胞核抗原這一指標來考察海綿原細胞增殖能力，實驗數據表明，隨著分離過程的進行，所分離細胞中原細胞的比例逐漸增加，PCNA陽性細胞的比例也隨之增加，說明所分離的細胞具有較強的增殖能力，從而證明所分離的細胞是海綿原細胞。參見圖1、2、4所示。
權利要求
1.一種海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於可按如下步驟操作(1)混合海綿細胞的製備取新鮮潔淨的健康海綿組織塊，切割成1-10mm3小塊，振蕩離散出海綿細胞，用200～500目篩網過濾，離心，留細胞沉定用含EDTA的CMFSW重懸即為混合海綿細胞；(2)差速離心將混合海綿細胞懸液進行低速離心，300～800rpm，10～30min，留取細胞沉澱，棄去上清；(3)差速聚集將差速離心獲得的細胞接種於CMFSW中，使海綿細胞自由聚集形成細胞聚集體，棄去未參與聚集的游離細胞；(4)差速黏附將細胞聚集體於人工海水中進行培養，細胞聚集體貼壁，海綿細胞聚集體貼壁鋪展達最大程度後，用CMFSW洗去ASW，鏡下觀測應用含1～10mM EDTA的CMFSW先將原細胞離散下來，取出原細胞離散液，並震蕩進行充分離散；(5)密度梯度離心配製密度梯度液，用2-5％的Ficoll和20-40％泛影葡胺配製密度從1.01-1.10g/ml的梯度液，將步驟(4)所得細胞懸液鋪於梯度液上，於500-2000rpm，離心10～30min，將各層細胞用滴管逐層取出，鏡下觀察，收集原細胞。
2.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於所述步驟(1)過程中，取新鮮或經水族槽暫養1-2周的健康海綿組織塊，用含200-800ug/ml慶大黴素的無鈣鎂海水洗滌，剔除雜質；再將組織塊切割成1-3mm3小塊，浸泡於CMFSW中洗滌，振蕩離散出海綿細胞，過濾，離心，1000-3000rpm，10min；用含1-2mM EDTA的CMFSW製備細胞懸液。
3.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於步驟(2)中所使用的差速離心條件為300～600rpm，10～20min。
4.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於步驟(3)中海綿細胞在18～25℃下於CMFSW中培養8-12小時。
5.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於步驟(4)中用含2～5mMEDTA的CMFSW將原細胞解離下來。
6.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於步驟(5)中密度梯度液的密度分別為1.04，1.05，1.06，1.07，1.08，1.09，1.10g/ml；收集後的原細胞用CMFSW洗去密度梯度介質，500-1500rpm，5～15min，共洗滌2～4次。
7.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵在於考察海綿原細胞攝取BrdU效率與BrdU作用時間的關係，在具體實驗中，跟蹤各步驟分離效果時，所使用的BrdU的孵育條件為37℃，24小時。
8.按照權利要求1所述海綿原細胞的分離純化方法，其特徵還在於用抗增殖細胞核抗原抗體檢測海綿細胞中增殖細胞核抗原的表達。
全文摘要
本發明涉及一種海綿幹細胞——原細胞的分離純化方法，通過差速離心、細胞特異性聚集、差速黏附和密度梯度離心四種方法聯用，提高了海綿原細胞分離純化的純度和效率，為研究繁茂膜海綿幹細胞的生物學特性及體外培養規律提供了一種有效的原細胞製備方法。
文檔編號C12N5/07GK1814751SQ20051004585
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月5日 優先權日2005年2月5日
發明者張衛, 孫黎明, 虞星炬, 金美芳, 趙權宇 申請人:中國科學院大連化學物理研究所