博德特氏菌檢測測定的製作方法

2024-01-25 21:48:15

專利名稱：博德特氏菌檢測測定的製作方法
技術領域：
本發明涉及病原體檢測領域。
背景技術：
下面關於本發明背景技術的討論僅僅是為了幫助讀者理解本發明而提供，並且沒 有承認描述或構成了本發明的現有技術。百日咳是高傳染性呼吸系統疾病。百日咳的症狀包括幾段猛烈的咳嗽後接著吸氣 喘息聲並且有時嘔吐。在極端情況下，這些症狀導致缺氧、永久性腦損傷甚或死亡。大多 數情況(80-98% )是由小的革蘭氏陰性細菌百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis) 引起的，然而少數情況(2-20% )是由副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis) 引起的(Mattoo等人，Clin. Microbiol. Rev.，18 :326_382，2005)。由副百日咳博德特氏菌 (B. parapertussis)引起的百日咳的症狀一般地比由百日咳博德特氏菌(B. pertussis)引 起的要溫和，然而，僅僅基於臨床症侯學差別診斷是困難的。極少的是類似百日咳的症狀， 其由支氣管敗血性博德特氏菌(B. hronchiseptica)或霍氏博德特氏菌(B. holmesii)感染 所引起的。診斷早期百日咳可能是困難的，因為病徵和症狀類似於其它常見呼吸疾病，諸如 傷風、感冒或支氣管炎。傳統上，細菌培養物已用於確診百日咳。粘液獲自患者的鼻和/或 喉並被送到醫學實驗室進行培養。儘管陽性結果被認為是決定性的，但是博德特氏菌培養 物一般需要5至7天才獲得診斷。博德特氏菌屬某一種的細菌培養物由於細菌難以培養的 特性也易於產生錯誤的陰性結果。包括ELISA在內的抗體測定通過檢測典型細菌抗原也被用於診斷博德特氏菌屬 (Bordetella sp.)。最常見地，百日咳毒素蛋白的檢測被用作博德特氏菌感染的表示。盡 管這些基於抗體的測定具有良好的靈敏性和特異性，但是它們一般需要患者血液樣品而不 是非侵入性獲得的粘液樣品，並且還需要感染處於早期和/或漸愈階段。如果患者樣品不 是在疾病過程的合適時間獲得的，這些測定因此易於產生假陰性結果。檢測博德特氏菌感染的其它方法包括直接螢光抗體(DFA)測試和各種基於PCR的 方法。DFA測試具有能用非侵入性獲得的粘液樣品檢測博德特氏菌的優點但缺乏靈敏性。 基於PCR的方法正變得被廣泛應用。

發明內容
本發明提供測定生物學樣品中百日咳博德特氏菌和/或副百日咳博德特氏菌存 在或不存在的組合物和方法。本發明也可單獨地或者與臨床症狀或其它指示物組合用於診 斷患有百日咳的個體。具體地，本發明能夠通過檢測樣品中細菌核酸的存在來檢測已知引 起百日咳的病原菌(博德特氏菌屬的某種)。檢測方法基於在細菌基因組內發現特定的靶 序列——其是有用的細菌感染指示物。因此，一方面，本發明通過檢測下列的存在或不存在來測定生物學樣品中百日咳博德特氏菌和/或副百日咳博德特氏菌存在或不存在的方法(a) IS481靶核酸，其具有至少14個與SEQ ID NO 2至少95%相同的連續核苷酸 或其互補序列，和(b)IS1001靶核酸，其具有至少14個與SEQ ID NO :8至少95%相同的連續核苷酸 或其互補序列，其中所述IS481靶核酸的存在鑑定百日咳博德特氏菌的存在，並且IS1001靶核酸 的存在鑑定副百日咳博德特氏菌的存在。在一些實施方式中，IS481靶核酸和IS1001靶核酸之一或兩者被擴增(例如通過 PCR)。在另一實施方式中，所述方法包括下列步驟(a)提供適於擴增IS481靶核酸或其片段的第一引物對，和提供適於擴增IS1001 靶核酸或其片段的第二引物對，(b)在適於當IS481靶核酸存在於樣品時產生第一反應產物和當IS1001靶核酸 存在於樣品時產生第二反應產物的條件下，進行包括步驟(a)的引物對的多重引物延伸反 應；禾口(c)通過檢測具有至少14個與SEQ ID NO 2核苷酸序列至少95%相同的連續核 苷酸或其互補序列的第一反應產物的存在或不存在，測定百日咳博德特氏菌的存在或不存 在；和/或通過檢測具有至少14個與SEQ ID NO 8核苷酸序列至少95%相同的連續核苷 酸或其互補序列的第二反應產物的存在或不存在，測定副百日咳博德特氏菌的存在或不存 在。在另一方面，本發明還提供通過檢測具有至少14個與SEQ ID NO :2至少95%相 同的連續核苷酸或其互補序列的IS481靶核酸的存在或不存在，測定生物學樣品中百日咳 博德特氏菌的存在或不存在的方法。在一實施方式中，測定百日咳博德特氏菌的方法包括下列步驟(a)提供適於擴增IS481靶核酸或其片段的引物對；(b)在適於當IS481靶核酸存在於所述樣品時產生反應產物的條件下，進行包括 步驟(a)的引物對的引物延伸反應；和(c)通過檢測具有至少14個與SEQ ID NO 2的核苷酸序列至少95%相同的連續核 苷酸或其互補序列的反應產物的存在或不存在，測定百日咳博德特氏菌的存在或不存在。在另一方面，本發明還提供通過檢測具有至少14個與SEQ ID NO :8至少95%相 同的連續核苷酸或其互補序列的IS1001靶核酸的存在或不存在，測定生物學樣品中副百 日咳博德特氏菌的存在或不存在的方法。在一實施方式中，檢測副百日咳博德特氏菌的方法包括下列步驟(a)提供適於擴增IS1001靶核酸或其片段的引物對；(b)在適於當IS1001靶核酸存在於所述樣品時產生反應產物的條件下，進行包括 步驟(a)的引物對的引物延伸反應；和(c)通過檢測具有至少14個與SEQ ID NO :8核苷酸序列至少95%相同的連續核苷 酸或其互補序列的反應產物的存在或不存在，測定副百日咳博德特氏菌的存在或不存在。在本發明所有方面的優選實施方式，IS481反應產物包含至少20、25、30、35、40、45、50、75、100、125或140個與SEQ ID NO :2 至少 95% (例如至少 99%或 100% )相同的 連續核酸或其互補序列。在其它優選的實施方式，IS481反應產物與SEQ ID NO :3的至少 15、20、25、30、35、40、45、50、75或85個連續核酸或其互補序列至少95% (例如至少99% 或100%)相同。在其它優選的實施方式中，IS481反應產物長度上小於大約175、150、125、 100或75個核酸。在其它優選的實施方式，至少一個IS481引物(即適於擴增IS481或其片段的引 物)包括具有SEQ ID NO :4或5的序列或其互補序列的核酸。在一實施方式中，採用寡核 苷酸探針檢測IS481靶核酸。寡核苷酸探針優選地具有SEQ ID NO :6或27的序列或其互 補序列並且被可檢測性地標記。在其它優選的實施方式中，可檢測標記是螢光標記。在本發明所有方面的優選實施方式中，IS1001反應產物包含至少20、25、30、35、 40、45、50、75、100、125、140、160 或 180 個與 SEQ ID NO :8 至少 95 % (例如至少 99 % 或 100%)相同的連續核酸或其互補序列。在其它優選的實施方式中，IS1001反應產物與SEQ ID NO :9的至少15、20、25、30、35、40、45、50或70個連續核酸或其互補序列至少95% (例如 至少99%或100%)相同。在其它優選的實施方式中，IS1001靶核酸長度上小於大約175、 150、125、100 或 75 個核酸。在其它優選的實施方式中，至少一個IS 1001引物(即適於擴增IS1001或其片段 的引物)包括具有SEQ ID NO :10或11的序列或其互補序列的核酸。在一實施方式中，採 用寡核苷酸探針檢測IS1001反應產物。寡核苷酸探針優選地具有SEQ ID NO 12的序列或 其互補序列並且被可檢測性地標記。在其它優選的實施方式，可檢測標記是螢光標記。
在任何前述方法的其它優選實施方式中，所述方法進一步包括實時PCR。在其它實 施方式中，至少一個引物是蠍子引物(Scorpionprimers)。合適的IS481蠍子引物包括例如 具有SEQ ID NO 13或28的序列或其互補序列的核酸引物。合適的IS1001蠍子引物包括 例如具有SEQ ID NO 14的序列或其互補序列的核酸引物。在另一方面，本發明提供編碼IS481靶核酸的分離的核酸。IS481靶核酸與至少 20(例如至少25、30、35、40、45、50、75、100、125或140)個 SEQ ID NO :2 的連續核苷酸或其 互補序列基本相同，並且長度上小於1000個核苷酸(例如小於750、500、250、200、175、150、 125、100或75個核苷酸)。在一實施方式中，IS481靶核酸包含與至少20個SEQ ID NO 3 的連續核苷酸基本相同的核苷酸序列。在另一方面，提供編碼IS1001靶核酸的分離的核酸。IS1001靶核酸與至少20 (例 如至少25、30、35、40、45、50、75、100、125、150或175)個 SEQ ID NO 8 的連續核苷酸或其互 補序列基本相同，並且長度上小於1000個核苷酸(例如小於750、500、250、200、175、150、 125、100或75個核苷酸)。在一實施方式中，IS1001靶核酸包含與至少20個SEQ ID NO: 9的連續核苷酸基本相同的核苷酸序列。在另一方面，本發明提供適於擴增和/或檢測IS481靶核酸或IS1001靶核酸的寡 核苷酸引物和探針。本發明的IS481引物和探針長度上為10-50 (例如12、14、16、18、20、 22、25、30、35、40或45)個核苷酸，並且與SEQ ID NO :2的相應核苷酸序列基本相同，優選地 100%相同。本發明的IS 1001引物和探針長度上為10-50(例如12、14、16、18、20、22、25、 30、35、40或45)個核苷酸，並且與SEQ ID NO :8的相應核苷酸序列基本相同，優選地100% 相同。在優選的實施方式中，IS481引物和探針具有SEQ ID NOs :4_6或27的核苷酸序列。在其它優選的實施方式，IS1001引物和探針具有SEQ ID NOs :10_12的核苷酸序列。在另一方面，本發明提供用於擴增和檢測IS481靶核酸和IS1001靶核酸的蠍子引 物，其中所述蠍子引物包括寡核苷酸探針序列和寡核苷酸引物序列，其每個都分別單獨地 符合寡核苷酸引物和探針的要求。在優選的實施方式中，IS481蠍子引物具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列。在其它優選的實施方式中，IS1001蠍子引物具有SEQ ID N0:14核苷酸 序列。在另一方面，本發明提供試劑盒，其包含(a)第一引物對，其與具有SEQ ID NO :2的序列或其互補序列的核酸特異性地雜 交；以及第一探針，其能與具有SEQ ID NO :2的序列或其互補序列的核酸特異性地雜交，和(b)第二引物對，其與具有SEQ ID NO :8的序列或其互補序列的核酸特異性地雜 交；以及第二探針，其能與具有SEQ ID NO :8的序列或其互補序列的核酸特異性地雜交。在優選的實施方式中，第一引物對和/或第一探針能與具有SEQ IDNO :3的序列或 其互補序列的核酸特異性地雜交。第一引物對的優選成員具有SEQ ID N0s:4-5的序列或 其互補序列，並且優選的第一探針具有SEQ ID NO :6或27的序列或其互補序列。在其它優選的實施方式中，第二引物對和/或第二探針能與具有SEQ ID NO 9的 序列或其互補序列的核酸特異性地雜交。第二引物對的優選成員具有SEQ ID NOs=IO-Il 的序列或其互補序列，並且優選的第二探針具有SEQ ID N0:12的序列。 優選地，探針還包括可檢測標記(例如螢光標記)。


圖1是以GenBank登錄號M28220提供的百日咳博德特氏菌IS481插入序列的核 苷酸序列(SEQ ID NO :1)。圖2是以GenBank登錄號X66858提供的副百日咳博德特氏菌IS1001插入序列的 核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。
具體實施例方式本發明提供適於鑑定百日咳博德特氏菌和/或副百日咳博德特氏菌——與百日咳 相關的最常見的病原體——的方法、組合物和試劑盒。本發明基於獲自個體的生物學樣品 中百日咳博德特氏菌的插入序列IS481和/或副百日咳博德特氏菌的插入序列IS1001的 實時PCR檢測。這些插入序列有利地被用於基於PCR的診斷測定，因為它們具有相對高的 基因組拷貝數。百日咳博德特氏菌基因組一般包含大約100-200個拷貝的IS481序列。而 副百日咳博德特氏菌基因組一般包含大約20個拷貝的IS1001序列。如本文所用，除非另外指明，單數形式的「一 / 一個(a)」、「一 / 一個(an)」和「該 /所述(the)」包括複數指代物。因此，舉例來說，對「一個寡核苷酸」的指代包括多個寡核 苷酸分子，以及對「一個核酸」的指代包括一個或更多個核酸。如本文所用，「大約」含義是指加上或減去10%。如本文所用，術語「擴增(amplification) 」或「擴增(amplify) 」包括拷貝靶核酸 的方法，由此增加所選核酸序列的拷貝數。擴增可以是指數型或線性的。靶核酸可以是DNA 或RNA。以這種方式擴增的序列形成「擴增子」或「擴增產物」。儘管下文描述的示例性方法涉及採用聚合酶鏈式反應(PCR)的擴增，但是許多其它用於擴增核酸的方法在本領域中 是已知的(例如等溫法、滾環方法等)。本領域普通技術人員應理解這些其它方法可以代替 PCR 方法或與之一起使用。參見例如 Saiki，「 Amplification of Genomic DNA「 in PCR Protocols, Innis 等人，Eds, Academic Press, San Diego, CA 1990, pp 13-20 ；Wharam 等 入，Nucleic Acids Res 2001 Jun 1 ；29 (11)E54-E54 ；Hafner ^A, Biotechniques 2001 Apr, 30 (4) 852-6，858，860 ；Zhong 等人，Biotechniques2001 Apr, 30 (4) 852-6，858，860。如本文所用，與多核苷酸(即，核苷酸的序列，諸如寡核苷酸或靶核酸)有關的術 語「互補序列」、「互補的」或「互補性」所根據的是標準的Watson/Crick配對規則。使一個序 列的5'端與另一個序列的3'端配對的核酸序列的互補序列是呈「反向平行關係」。例如， 序列「5' -A-G-T-3' 」與序列「3' -T-C-A-5' 」互補。在自然界的核酸中不常見的某些 鹼基可以包括在本文描述的核酸中，這些包括例如肌苷、7-脫氮鳥嘌呤、鎖定核酸(Locked Nucleic Acids, LNA)和肽核酸(Peptide NucleicAcids，PNA)。互補性不需要完美互補；穩 定的雙鏈體可以包含錯配的鹼基對、簡併的或不匹配的鹼基。核酸技術領域的普通技術人 員可以通過考慮許多變量，其包括例如寡核苷酸的長度、寡核苷酸的鹼基組成和序列、錯配 鹼基對的離子強度和發生率，經驗性地確定雙鏈體的穩定性。互補序列還可以是與DNA序 列或其互補序列互補的RNA的序列，以及還可以是cDNA。如本文所用，術語「基本互補」指 兩個序列特異性地雜交(如下定義)。本領域普通技術人員應理解基本互補的序列不需要 沿著它們的整個長度雜交。如本文所用，在檢測來自檢測標記的信號以指示樣品中靶核酸的存在的上下文中 使用的術語「檢測」不要求該方法提供100%靈敏性和/或100%特異性。眾所周知，「靈敏 性」是假設某人具有靶核酸序列，測試為陽性的概率，而「特異性」是假設某人不具有靶核 酸序列，測試為陰性的概率。至少50%的靈敏性是優選的，儘管至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%和至少99%的靈敏性明顯地是更優選的。至少50%的特異性是優選的，盡 管至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的特異性明顯地是更優選的。檢 測還包括假陽性和假陰性的測定。假陰性的比率可以為1%、5%、10%、15%、20%或更高。 假陽性的比率可為1%、5%、10%、15%、20%或更高。在基因片段的上下文中的「片段」是指核苷酸殘基的序列，其為至少大約20個核 苷酸、至少大約25個核苷酸、至少大約30個核苷酸、至少大約40個核苷酸、至少大約50個 核苷酸或至少大約100個核苷酸。片段一般小於大約400核苷酸、小於大約300核苷酸、小 於大約250核苷酸、小於大約200核苷酸或小於150核苷酸。在某些實施方式中，所述片段 可被用於各種雜交過程或微陣列過程以鑑定特定的病原體。當提及核酸(例如寡核苷酸)時，「分離的」是指這樣的核酸，其與該核酸自然出現 的基因組的基本部分分開。例如，經合成(例如通過連續鹼基縮合)產生的任何核酸被認 為是分離的。同樣，重組表達的、通過引物延伸反應(例如PCR)產生或者另外地從基因組 中切離的核酸也被認為是分離的。如本文所用，術語「多重引物延伸反應」是指這樣的引物延伸反應，其能在相同的 反應容器內同時產生兩個或多個靶核酸的互補拷貝。各個反應產物使用不同的引物對啟動 的。多重反應可進一步包括各個產物的特異性探針，其被可檢測地標記有不同的可檢測部 分。在優選的實施方式，多重引物延伸反應是多重PCR，其中相同反應容器內的兩個或多個產物被擴增。如本文所用，術語「寡核苷酸」是指短的聚合物，其由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸 或其任意組合組成的。寡核苷酸長度一般在大約10、11、12、13、14或15個至大約150個核 苷酸(nt)之間，更優選地在大約10、11、12、13、14或15個至大約70個nt之間，並且最優 選地長度在大約18個至大約26個nt之間。核苷酸的單字母代碼被描述在《美國專利局專 利審查程序指南》(U S Patent Office Manual ofPatentExamining Procedure)第 2422 節表1中。對此，核苷酸名稱「R」是指嘌呤諸如鳥嘌呤或腺嘌呤。「Y」是指嘧啶諸如胞嘧啶 或胸腺嘧啶(如果是RNA，指尿嘧啶)，以及「M」是指腺嘌呤或胞嘧啶。寡核苷酸可被用作 引物或探針。用作特異性地擴增(即擴增特定靶核酸序列)或特異性地檢測(即檢測特定靶核 酸序列)靶核酸的引物或探針的寡核苷酸一般能特異性地與靶核酸雜交。「病原體」是指能在哺乳動物(例如人)中引起百日咳或相關疾病的任何微生物有 機體。特定的病原體包括例如百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌。如本文所用，用於擴增的「引物」是這樣的寡核苷酸，其與靶核苷酸序列互補並且 在DNA或RNA聚合酶的存在下使核苷酸添加到引物的3'端。對於最佳表達和擴增來說， 引物的3'核苷酸應當一般與相應核苷酸位置處的靶序列相同。如本文所用，術語「引物」 包括可以被合成的所有形式的引物，其包括肽核酸引物、鎖定核酸引物、硫代磷酸修飾的引 物、標記的引物等。如本文所用，「正向引物」是與dsDNA的反義鏈互補的引物。「反向引物」 是與dsDNA的正義鏈互補的引物。「引物對」是指正向引物和反向引物的組合，每一個對於 相同的靶核酸具有特異性。引物長度一般在大約10個與大約100個核苷酸之間，優選地在大約10個與大約 60個核苷酸之間，並且最優選地在大約13個與大約25個核苷酸之間(例如13、15、17、19、 21或23個核苷酸)。對於最優的雜交或聚合酶鏈式反應擴增來說沒有標準的長度。對於具 體引物應用的最佳長度可以 H. Erhch, PCR Technology, Principles and Applicationfor DNA Amplification, (1989)中描述的方式容易地測定。對靶核酸特異性的寡核苷酸(例如探針或引物)將在合適的條件下「雜交」到靶 核酸。如本文所用，「雜交(hybridization) 」或「雜交(hybridizing) 」是指這樣的方法，通 過該方法在確定的條件下通過鹼基配對，寡核苷酸單鏈與互補鏈退火。「引物延伸反應」是指合成反應，其中寡核苷酸引物雜交到靶核酸並且靶核酸的互 補拷貝通過單個互補核苷酸依賴聚合酶的3'-添加而產生。在優選的實施方式中，引物延 伸反應是PCR。如本文所用，術語「樣品」或「生物學樣品」是指獲自患者(例如人患者)的臨床 樣品。在優選的實施方式中，樣品獲自從對象收集的組織、體液或微生物。樣品來源包括但 不限於粘液、唾液(處理的或未處理的)、支氣管肺泡灌洗物(BAL)、支氣管衝洗物(BW)、血 液(例如全血、血漿和血清)、體液、腦脊髓液(CSF)、尿、血漿、血清或組織(例如活組織檢 查材料)。優選的樣品來源包括鼻咽拭子和/或咽喉拭子(swabs)。如本文所用，「蠍子引物」是指這樣的寡核苷酸，其包括具有5'延伸的探針尾的 3'引物，其包括具有螢光團/猝滅劑對的髮夾式結構。任選地，蠍子引物進一步包括擴增 阻斷物(例如己二醇(「HEG」)，其將探針部分與引物部分分開。如本文更詳細地描述，Scorpion 引物是蠍子引物的實例。如本文所用，術語「Scorpion 檢測系統」是指實時PCR的方法。該方法利用雙功 能分子(本文中被稱為「Scorpion 」)，其包含通過聚合物阻斷基團共價連接到探針元件的 PCR引物元件。此外，各個Scorpion 分子包含螢光團，其與猝滅劑相互作用以降低背景螢光。「特異性雜交」是兩個核酸序列具有高度互補性的指示。特異性雜交複合物在許可 退火條件下形成並且在任何隨後的洗滌步驟後保持雜交。核酸序列退火的許可條件可由本 領域普通技術人員常規測定並且可例如在大約6XSSC的存在下在65°C發生。雜交的嚴格 性可部分參考進行洗滌步驟的溫度得以表現。這樣的溫度一般被選定為低於特定序列在限 定離子強度和PH下的熱解鏈點(Tm)大約5°C至20°C。Tm是50%靶序列與完全匹配的探 針雜交時的溫度(在確定的離子強度和PH下)。計算Tm的公式和核酸雜交的條件在本領 域中是已知的。如本文所用，當將寡核苷酸和核酸進行比對時，如果寡核苷酸與核酸的一部分具 有至少50%序列同一性，那麼寡核苷酸對核酸是「特異性的」。對核酸特異性的寡核苷酸是 這樣的在合適的雜交或洗滌條件下，其能與感興趣的靶序列雜交並且基本上不會與不感 興趣的核酸雜交。較高水平的序列同一性是優選的，並且包括至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%並且更優選地至少98%序列同一性。序列同一性可利用默認設 置的商業可利用的電腦程式測定的，其採用本領域眾所熟知的運算法則。如本文所用，具 有「高序列同一性」的序列至少在大約50%比對的核苷酸位置上，優選地至少在大約60% 比對的核苷酸位置上，並且更優選地至少在大約75%比對的核苷酸位置上具有相同的核苷 酸。如本文所用，當提及核酸時，術語「基本上相同的」是這樣的核酸，其與參考核酸序 列具有至少80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的序列同一性。比較長度優選地為全長的核酸， 但一般為至少20個核苷酸、30個核苷酸、40個核苷酸、50個核苷酸、75個核苷酸、100個核 苷酸、125個核苷酸或更多個核苷酸。當提及寡核苷酸引物或引物對時，「適於擴增」是指這樣的引物，其特異性地雜交 到靶核酸並且能提供引物延伸反應的起始位點，其中靶核酸的互補拷貝被合成。如本文所用，術語「靶核酸」或「靶序列」是指這樣的序列，其包括要擴增和檢測 的感興趣的核苷酸片段。在擴增反應期間產生的靶序列的拷貝被稱為擴增產物、擴增引物 (amplimers)或擴增子。靶核酸可由染色體的片段、帶有或不帶有基因間序列的完整基因、 帶有或不帶有基因間序列的基因的片段或部分、或設計探針或引物的核酸的序列組成。靶 核酸可包括野生型序列(或多個)、突變、缺失或複製、串聯重複區域、感興趣基因、感興趣 基因的區域或其上遊或下遊區域。靶核酸可表示具體基因的可選序列或等位基因。靶核酸 可源自基因組DNA、cDNA或RNA。如本文所用，靶核酸可以是提取自細胞的DNA或RNA或從 其中拷貝或擴增的核酸，或可包括利用亞硫酸氫鹽反應進一步轉化的提取的核酸。如本文所用，「TaqMan PCR檢測系統」涉及實時PCR的方法。在該方法中，與擴 增的核酸片段雜交的TaqMan 探針包括在PCR反應混合物中。TaqMan⑧探針包括在探針 任一端並且相互足夠接近的供體和猝滅劑螢光團，從而供體的螢光被猝滅劑吸收。然而，當 探針雜交到擴增的片段時，Taq聚合酶的5'-外切核酸酶活性切割探針，由此使供體螢光發射可被檢測的螢光。生物學樣品收集和製備本發明的方法和組合物可被用於通過檢測獲自個體的生物學樣品中的核酸來檢 測引起百日咳的病原體。用於病原體檢測的樣品還可包括在合適培養基上生長以形成菌落 的分離的細菌培養物，其中培養物從獲自個體的生物學樣品中製備。核酸(DNA或RNA)可按照本領域普通技術人員熟知的任何方法從樣品中分離。如 有必要，樣品可通過離心等進行收集或濃縮。樣品的細胞可進行裂解，例如通過用酶、加熱、 表面活性劑、超聲破碎或其組合處理。進行裂解處理是為了獲得足夠量的源自病原體的 DNA——如果樣品中存在的話——以利用聚合酶鏈式反應檢測。各種DNA提取方法適於分離DNA。合適的方法包括苯酚和氯仿萃取。參見Maniatis 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, page 16.54(1989)。許多商業試劑盒也產生合適的DNA，其包括但不限於QIAamp 微型血液試劑盒、Agencourt Genf ind 、Roche Cobas Roche MagNA Pure 或利用 Eppendorf Phase Lock Gels 的苯酚氯仿萃取。靶核酸和引物在本發明的各種實施方式中，寡核苷酸引物和探針在本文所述的方法中被用於擴 增和檢測病原體的靶序列。在某些實施方式中，靶核酸可包括來自百日咳博德特氏菌的 IS481插入序列(及其片段)以及來自副百日咳博德特氏菌的ISlOOl插入序列(及其片 段)。此外，引物也可被用於擴增一個或多個對照核酸序列。本文描述的靶核酸可利用各個 靶序列的單個標記單獨地或以多重形式檢測。本領域普通技術人員鑑於本公開內容能夠設計和製備適於擴增靶序列的引物。用 於本發明中的擴增引物的長度取決於幾個因素，其包括核苷酸序列同一性以及這些核酸在 體外核酸擴增過程中被雜交或使用的溫度。確定對於具體序列同一性的擴增引物的優選長 度所必需的考慮事項對本領域普通技術人員是熟知的。擴增核酸分子的引物可以採用電腦程式諸如0LIG0 (MolecularBiology Insights, Inc, Cascade, CO)進行設計。設計要被用作擴增引物的寡核苷酸時的重要特徵 包括但不限於利於檢測(例如通過電泳或實時PCR)的合適大小的擴增產物、對於一對引物 的成員的相似解鏈溫度以及各個引物的長度(即，引物需要足夠長以具有序列特異性的退 火併且起始合成，但不能長至在寡核苷酸合成過程中降低保真性)。一般地，寡核苷酸引物 長度為15至35個核苷酸。可以類似於引物設計的方式進行設計要被用作雜交探針的寡核苷酸。像寡核苷酸 引物一樣，寡核苷酸探針通常具有類似的解鏈溫度，並且各個探針的長度必須足以發生序 列特異性雜交但不能長至在合成過程中降低保真性。寡核苷酸探針長度一般為15至60個 核苷酸。在一些實施方式中，提供在一個或多個核苷酸位置具有簡併性的弓I物混合物。簡 並引物被用於PCR中，其中變異性存在於靶序列中，即序列信息是不明確的。一般地，簡併 引物應在至多大約4個、至多大約3個、優選地至多大約2個以及最優選地至多大約1個核 苷酸位置呈現變異性。在合適的實施方式中，PCR採用雙功能引物/探針組合(例如Scorpion 引物)進行。如本發明所用，蠍子引物包括具有5'延伸的探針尾的3'引物，其包括具有螢光團/ 猝滅劑對的髮夾式結構。在PCR過程中，通過包含己二醇(HEG)，聚合酶被阻止延伸到探針 尾。在擴增的第一輪，3'靶向特異性引物退火到靶序列並且被延伸以致於Scorpion 現在 被併入到新合成的鏈，其具有新合成的5'探針靶向區域。在變性和退火的下一輪，蠍子引 物髮夾環的探針區域將與靶序列雜交，因此分開螢光團和猝滅劑並且產生可測量信號。這 樣的探針被描述在 Whitcombe 等人，Nature Biotech 17 804-807 (1999)。核酸的擴增核酸樣品或分離的核酸可通過本領域普通技術人員已知的各種方法進行擴增。優 選地，PCR被用於擴增感興趣的核酸。簡而言之，在PCR中，製備兩個引物序列，其與標記序 列相對的互補鏈上的區域互補。向反應混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸與DNA聚合 酶，例如Taq聚合酶。當模板被序列修飾時，如上所述，擴增混合物優選地不包含UNG核酸酶。如果樣品中存在靶序列，引物將結合到該序列並且聚合酶將通過添加核苷酸使得 引物沿著靶序列延伸。通過升高和降低反應混合物的溫度，延伸的引物將與標記解離以形 成反應產物，過量的引物將結合到標記和反應反物並且重複該過程，由此產生擴增產物。根 據要延伸的擴增產物的長度，可以改變循環參數。內部陽性擴增對照物(IPC)可利用核苷 酸引物和/或探針被包括在樣品中。IPC可被用於監測轉化過程以及任何隨後的擴增。在合適的實施方式中，實時PCR採用能檢測PCR擴增產物累積的任何合適的儀器 進行。最常見地，儀器能檢測來自一個或多個螢光標記的螢光。例如，在儀器(例如ABI Real-Time PCR System 7500 序列檢測器)上的實時檢測監測螢光並計算在各個PCR循 環中指示器信號量度或Rn值。閾值循環或Ct值是螢光與閾值交叉的循環。閾值由序列檢 測系統軟體或手動檢測。擴增的靶核酸的檢測核酸的擴增可通過本領域中許多熟知的方法中任何一個諸如凝膠電泳、柱層析、 與探針雜交、測序、解鏈曲線分析或「實時」檢測進行檢測。在優選的方法中，來自兩個或多個感興趣片段的序列在相同的反應容器(即「多 重PCR」)中進行擴增。可以通過測量反應的終點或者在「實時」中進行檢測。對於實時檢 測，引物和/或探針可例如當引物被結合或當探針被雜交時被可檢測地標記以允許螢光差 別，並且在反應期間在能檢測螢光變化的儀器中被擴增。核酸擴增的實時檢測方法是熟知 的並且包括例如TaqMan 系統、Scorpion 引物系統以及對於雙鏈核酸使用嵌入染料。在終點檢測中，擴增子(或多個)可通過首先按大小分離擴增子然後檢測按大小 分離的擴增子來進行檢測。不同大小擴增子的分離可通過例如凝膠電泳、柱層析或毛細管 電泳來完成。這些和其它方法在本領域中是熟知的。在一實例中，大約10個至大約150個 鹼基對的擴增子——其大小可存在10個或更多個的鹼基對不同——可例如在4%至5%瓊 脂糖凝膠(對於大約150個至大約300個鹼基對的擴增子使用2%至3%瓊脂糖凝膠)或 6%至10%聚丙烯醯胺凝膠上進行分離。分離的核酸然後可用染料諸如溴化乙啶進行染色， 並且所產生的染色條帶或多個條帶的大小可與標準DNA梯進行比較。在一些實施方式中，擴增的核酸通過與特定的探針雜交進行檢測。探針寡核苷 酸——與擴增的靶序列的一部分互補——可被用於檢測擴增的片段。雜交可實時或非實時地進行檢測。對於每個靶序列來說，擴增的核酸可同時(即在相同的反應容器中)或單獨 地(即在分離的反應容器中)進行檢測。在優選的實施方式，擴增的DNA利用兩個或多個 可區別標記的基因特異性寡核苷酸探針同時檢測，其中一個與第一靶序列雜交，並且其中 一個與第二靶序列雜交。對於序列修飾的核酸，靶序列可獨立地選自頂鏈(top strand)或 底鏈(bottom strand)。因此，所有要檢測的靶序列可包括頂鏈靶序列、底鏈靶序列或者頂 鏈和底鏈靶序列的組合。探針可通過本領域已知的方法可檢測地標記。有用的標記包括例如螢光染料(例 如 Cy5 、Cy3 、FITC、羅丹明、鑭磷(Ianthamidephosphors)、Texas red、FAM、JOE、Cal Fluor Red 610 、Quasar 670 )、放射性同位素(例如 32P、35S、3H、14C、125I、131I)、高電子密 度試劑(例如金)、酶(例如辣根過氧化物酶、β 「半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、比 色標記(例如膠體金)、磁性標記(例如Dynabeads )、生物素、地高辛(dioxigenin)或半 抗原以及抗血清或單克隆抗體可利用的蛋白。其它標記包括能分別與相應的受體或寡核苷 酸互補序列形成複合物的配體或寡核苷酸。標記可被直接結合到要檢測的核酸中，或者它 可被連接到探針(例如寡核苷酸)或者與要檢測的核酸雜交或結合的抗體。實時PCR的一種一般方法使用螢光探針諸如TaqMan 探針、分子信標(molecular beacons)和Scorpions。相比其它形式的定量PCR——其檢測最終擴增的產物的量，實時 PCR更特異性地、靈敏性和再現性地量化模板的初始量。實時PCR沒有檢測擴增子的大小。 在Scorpion 和TaqMan 技術中使用的探針基於螢光猝滅原理以及涉及供體螢光團和猝 滅部分。 在優選的實施方式中，可檢測標記是螢光團。如本文所用，術語「螢光團」是指在 特定波長(激發頻率)吸收光並且隨後發射更長波長(發射頻率)的光的分子。如本文所 用，術語「供體螢光團」是指這樣的螢光團，其當與猝滅劑部分非常靠近時將發射能量供給 或轉移至猝滅劑。由於向猝滅劑供給能量，供體螢光團本身將在特定發射頻率發射比不存 在靠近定位的猝滅劑部分時它所具有的更少的光。如本文所用，術語「猝滅劑部分」是指這樣的分子，其在與供體螢光團非常接近時 吸收供體所產生的發射能量並且以熱散發能量或者發射比供體吸收波長長的波長光。在後 面的情況中，猝滅劑被認為是受體螢光團。猝滅部分可經由鄰近(即碰撞)猝滅或者通過 F5ister或螢光共振能量轉移(「FRET」)發揮作用。通過FRET的猝滅一般被用在TaqMan 探針中而鄰近猝滅被用在分子標誌和Scorpion 型探針中。合適的螢光部分包括本領域中已知的下列螢光團4_乙醯胺基-4'-異硫氰酸 芪_2，2' 二磺酸、吖啶和衍生物(吖啶、吖啶硫氰酸酯)AlexaFluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluoi 568、Alexa Fluor 594、Alexa 卩111(^ 647(分子探針)、5-(2'-氨乙基)胺基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙 烯基磺醯基)苯基]萘醯亞胺_3，5 二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)、N-(4_苯胺基萘 基)馬來醯亞胺、2-氨基苯甲醯胺、BODIPY R-6G、BOPIPY 530/550、BODIPY FL、 Brilliant Yellow、香豆素和衍生物(香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_ 氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumarin 151))、Cy2 、Cy3 、Cy3. 5 、Cy5 > Cy5. 5 、cyanosine、4'，6_ 二脒基 _2_ 苯基吲哚(DAPI)、5『，5〃 - 二溴聯苯三酚-碸酞 (Bromopyrogallol Red)、7-二乙氨基-3-(4『-異硫氰酸苯基)_4_甲基香豆素、二乙撐三胺五醋酸酯、4，4' -二異硫氰酸二氫-芪_2，2' -二磺酸、4，4' 一二異硫氰酸根合芪_2， 2' -二磺酸、5-[二甲氨基]萘-1-磺醯氯(DNS，丹醯氯)、4-(4' -二甲氨基苯偶氮基)安 息香酸(DABCYL)、4_二甲氨基苯偶氮基苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC) ,EclipseTM(Epoch Biosciences Inc)、曙紅和衍生物(曙紅、曙紅異硫氰酸酯)、赤蘚紅和衍生物(赤蘚紅B、赤 蘚紅異硫氰酸酯)、溴乙啶(ethidium)、螢光素和衍生物(5-羧基螢光素(FAM)、5-(4，6-二 氯三嗪-2-基)氨基螢光素(DTAF)、2'，7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基螢光素 (JOE)、螢光素、螢光素異硫氰酸酯(FITC)、六氯-6-羧基螢光素(HEX)、QFITC (XRlTC)、四氯 螢光素(ΤΕΤ))、螢光胺、IR144、IR1446、孔雀石綠異硫氰酸酯、4-甲基傘形酮、鄰甲酚、硝基 酪氨酸、鹼性副品紅、苯酚紅、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、鄰苯二醛、OregonGreen 、碘化丙 啶、芘和衍生物(芘、芘丁酸酯、琥珀醯亞胺基1-芘丁酸酯)、QSY 7、QSY 9、QSY 21、 QSY 35 (Molecular Probes) > Reactive Red 4(Cibacron Brilliant Red 3B-A) 明和衍生物(6-羧基-X-羅丹明(R0X)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B磺醯氯、羅丹 明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明綠、羅丹明X異硫氰酸酯、硫代羅丹明B、硫代羅丹 明101、硫代羅丹明101的磺醯氯衍生物(Texas Red)), N, N, N' ,N'-四甲基-6-羧基羅 丹明(TAMRA)、四甲基羅丹明、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)、核黃素、玫紅酸、鋱鰲合 物衍生物。可以使用其它螢光核苷酸類似物，參見例如Jameson，278Meth. Enzymol. 363-390(1997)，Zhu，22 Nucl. Acids Res. 3418-3422(1994)。美國專利號 5，652，099和6，268，132還描述了核苷類似物，用於經由酶或化學合成結合到核酸例如DNA 和/或RNA或寡核苷酸以產生螢光寡核苷酸。美國專利號5，135，717描述了用作螢光標記 的酞菁和四苯三氮雜卟啉(tetrabenztriazaporphyrin)試劑。合適的猝滅劑基於特定螢光團的螢光光譜進行選擇。有用的猝滅劑包括例如 Black Hole 猝滅劑 BHQ-I、BHQ_2 和 BHQ-3 (BiosearchTechnologies, Inc)以及 ATTO 系列 猝滅劑(ΑΤΤ0 540Q、ATT0 580Q 禾口 ATTO 612Q ；Atto-Tec GmbH)。可檢測標記可參入至核酸、與核酸連接或偶聯。標記可通過各種長度的間隔臂 連接以減少潛在的位阻或影響其它有用或期望特性。參見例如Mansfield，9Mol. Cell. Probes 145-156(1995)。可檢測標記可通過共價或非共價方式，例如通過轉錄，諸如通過利 用Klenow聚合酶的隨機引物標記，或切口平移，或擴增或本領域已知的等效方式參入到核 酸。例如，核苷酸鹼基被偶聯到可檢測部分諸如螢光染料，然後在核酸合成或擴增期間被參 入到核酸。對於蠍子引物，序列特異性引發和PCR產物檢測利用單個分子實現。蠍子引物維 持未雜交狀態的莖環構型。螢光團被連接到5'末端並且通過連接到3'末端的部分猝滅， 儘管在合適的實施方式中這種排列可進行轉換。莖和/或環的3'部分還包含與引物延伸 產物互補的序列。該序列經由非擴增單體連接到特異性引物的5'末端。引物部分延伸後， 特異性探針序列能結合到延伸的擴增子內的其互補序列上，因此打開發夾環。這防止螢光 被猝滅並且觀察到信號。特異性靶序列通過反向引物和蠍子引物的引物部分進行擴增，導 致延伸產物。由於蠍子引物的探針元件結合到延伸產物所引起的螢光團與猝滅劑的分離， 產生了螢光信號。TaciMan 探針(Heid 等人，Genome Res 6 :986_994，1996)利用 Taq 聚合酶的螢光5'外切核酸酶活性測量cDNA樣品中靶序列的量。TaqMan 探針是這樣的寡核苷酸，其包 含通常在5'鹼基處或附近的供體螢光團以及通常在3'鹼基處或附近的猝滅部分。猝滅 部分可以是染料諸如TAMRA或者可以是非螢光分子諸如4-(4- 二甲氨基苯偶氮基)安息香 酸(DABCYL)。參見 Tyagi 等人，16 Nature Biotechnology 49-53(1998)。當被照射時，被 激發的螢光供體通過FRET而不是發射螢光將能量轉移給附近的猝滅部分。因此，供體和猝 滅劑的非常接近可防止供體發射螢光而探針保持完整。TaqMan 探針被設計成退火到PCR產物的內部區域。當聚合酶(例如反轉錄酶) 複製TaqMan 探針所結合的模板時，其5'外切核酸酶活性切割探針。這結束了猝滅劑的 活性(沒有FRET)並且供體螢光團開始發射螢光，其在每個循環中與探針分裂的速度成比 例地增加。PCR產物的累積通過檢測報告染料螢光的增加進行檢測(注意，引物沒有被標 記)。如果猝滅劑是受體螢光團，那麼PCR產物的累積可通過檢測受體螢光團螢光的減少進 行檢測。百日咳博德特氏菌的檢測患者中百日咳博德特氏菌的存在可通過檢測生物學樣品中編碼IS481插入序列 或其診斷片段的核酸的存在進行測定。百日咳博德特氏菌IS481的核苷酸序列被提供為 Genbank登錄號M28220並且顯示在圖1中(SEQ ID NO :1)。在優選的實施方式，靶核酸與IS481的核苷酸553-693或其片段對應，並且在下面 作為SEQ ID NO :2提供。1 gcgccctggc caccgggtca cgggcaaccg acgcgatacc RttRaRRRRR ccggctggga61 cttcgtcttc gtggccatcg atgaccacgc ccgcgtggcc ttcaccgaca tcccccccga121 cgagcgcttc cccagcgccg tSEQ ID NO 2全靶核酸序列或其任何部分可採用任何合適的引物和探針進行擴增和檢測。一個 特別有用的靶核酸序列包含IS481的核苷酸580-665 (SEQ ID NO :3)，其與SEQ ID NO :2的 核苷酸28-113對應。有用的引物包括例如涉及IS481的核苷酸580-597 (SEQ ID NO 4)和 648-665 (SRQ ID NO 5)或其互補序列(上述提供的靶核酸下劃線部分)的那些。有用的 探針涉及擴增的IS481序列任何有用的區域，其包括例如IS481的核苷酸623-642 (SEQ ID NO 6)和核苷酸604-628 (SEQ ID NO 27)或其互補序列(分別地，SEQ ID NO :2的核苷酸 71-90 和 52-76)。用SEQ ID NO 6的探針進行的BLAST搜索揭示與百日咳博德特氏菌和霍氏博德特 氏菌的IS481靶核酸序列完全匹配。另外，在螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) 基因組內有18/20核苷酸匹配，並且在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和水稻黃單胞菌 (Xanthomonasoryzae)基因組內有17/20核苷酸匹配。如下所示，螢光假單胞菌、稻瘟病菌 和水稻黃單胞菌與SEQ ID NOs :4-5的引物沒有顯著的序列同一性。因此，當使用SEQ ID NOs 4-5的擴增引物時，這些物種不應當是假陽性的重要來源。SEQ ID NO 6的探針的交叉 反應性可通過採用足以抑制這種非同源性水平雜交的高嚴緊性雜交條件來降低或消除。用SEQ ID NOs :4_5的引物序列進行的BLAST搜索顯示與百日咳博德特氏菌 和霍氏博德特氏菌的IS481靶核酸序列完全同源性。霍氏博德特氏菌引起的人類感染 非常少，但可採用本文所述的引物和探針進行檢測。還發現15-17個核苷酸與鳥博德特氏菌(Bordetella avium)、鞭毛甲基桿菌(Methylobacillus flagellalus)、紅球菌屬 (Rhodococcus)和喜木聚糖紅色桿菌(Rubrobacter xylanophilus)基因組的序列匹配。然 而，這些細菌和真菌已知不會感染人，所以應當不是假陽性診斷結果的顯著原因。副百日咳博德特氏菌的檢測患者中副百日咳博德特氏菌的存在可通過檢測生物學樣品中編碼ISlOOl插入序 列或其診斷片段的核酸的存在進行測定。副百日咳博德特氏菌IS 1001的核苷酸序列被提 供在Genbank登錄號X66858並且顯示在圖2中(SEQ ID NO :7)。在優選的實施方式，靶核酸與ISlOOl的核苷酸680-859或其片段對應，並且作為 SEQ ID NO 8被提供在下面。1 caattgccgc ctggggccgc ccaacgcatc aaggccgttg ccatcgacat gaccaccgcc61 tacgagttGG AGATCCAGGC ccacagccca CaRRCRRaRa tcRtctataRa cttRttccat121 gtcgtggcca agtatggacg agaggtcatt gatcgggtgc gcgtggatca ggccaatcaaSEQ ID NO 8全靶核酸序列或其任何部分可採用任何合適的引物和探針進行擴增和檢測。一個 特別有用的靶核酸序列包含IS481的核苷酸730-802 (SEQ ID NO :9)，其與SEQ ID NO :8的 核苷酸51-123對應。有用的引物包括例如涉及IS481的核苷酸730-747 (SEQ ID NO=IO) 和777-802(SEQ ID NO=Il)或其互補序列(上述提供的靶核酸下劃線部分)的那些。一個 有用的探針涉及ISlOOl的核苷酸748-761 (SEQ ID NO 12)或其互補序列(上述提供的靶 核酸中大寫字母部分)。用SEQ ID NOs :10_11的引物進行的BLAST搜索揭示與副百日咳博德特氏菌 的ISlOOl靶核酸序列完全匹配。另外，SEQ ID NO :10的引物顯示在Acanthostigma perpusillum、類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)、臼本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和Salinibacter ruber的基因組內有16和17個核苷酸匹配。SEQ ID NO 11 的引物僅僅顯示與任何相關物種短且可忽略的匹配。實施例實施例1 樣品收集和DNA提取為了測定確認目的，製備並測試了總計306個鼻咽拭子樣品。在306個樣品中，290 個是從患者中得到的實際臨床樣品。其餘16個樣品是「人工」(即陽性對照)副百日咳博 德特氏菌樣品。人工樣品通過將病原體陰性鼻咽拭子基質與培養的副百日咳博德特氏菌生 物混合而製備。鼻咽拭子從患者中收集並且被立刻放在含有木炭的Aimes培養基或液體病毒輸 送培養基中(Micro Test M4 media ；Remel, Inc.)中，在_20°C冷凍用於輸送，並且儲存 在-20°C直至測試。對於下述博德特氏菌屬某些種的測試，從鼻咽拭子樣品中提取DNA。簡而言之，樣 品進行解凍並且將200 μ 1每個樣品等分至1. 5mlEppendorf管中。含有200 μ 1稀釋劑具 有陽性參照(參見下面)或沒有DNA(陰性參照)的另外的管被製備並且與患者樣品同時 處理。然後向每個樣品中加入5 μ 1內部對照DNA (參見下面)。QIAamp 微型血液試劑盒 (Qiagen)按照廠商的說明被用於提取DNA。內部對照(internal control, IC)DNA由任何測試生物中不存在的隨機序列的DNA片段組成。帶有5'磷酸鹽的兩個寡核苷酸(pIC F 5' P和pIC R 5' ρ)被退火，並 且產物被克隆到PUC19的EcoRI位點。(pIC F5 『 P) 5 『磷酸鹽-aaTTCGCCCT TTGTTTCGAC CTAGCTTGCCAGTTCGCAGAA TTTGTTGCTC GTCAGTCGTC GGCGGTTTTA agggcg(SEQ ID NO 15)(pIC R5 『 P) 5 『磷酸鹽-aattcgccct TAAAACCGCC GACGACTGACGAGCAACAAA TTCTGCGAAC TGGCAAGCTA GGTCGAAACA AAGGGCG(SEQ ID NO 16)IC擴增子由下列與pUC19序列退火的引物產生。正向引物(PUC-For)5' GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTA(SEQ ID NO 17)反向引物(PUC-Rev)5' CACTTTATGC TTCCGGCTCG TA(SEQ ID N0:18)IC 擴增子 的序列1 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCgccctta aaaccgccga61 CRactRacRa Rcaacaaatt CtRCRaaCtR RcaaRctaRR tcRaaacaaa gggcRRattc121 GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGGCGTAATC181 ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG241 AGCCGGAAGC ATAAAGTG(SEQ ID NO 19)畫下劃線的序列是pUC19的多克隆位點部分(MCS)。小寫的序列通過退火兩個互 補的寡核苷酸而產生。IC擴增子通過下列與PUC19序列退火的引物而產生。對於所有測定，陽性和陰性對照被製備並且與患者樣品一起同時運行。陽性對照 DNA由625bp DNA片段組成，其在單個分子中分別包含百日咳博德特氏菌和副百日咳博德 特氏菌的IS481和ISlOOl目標區域。陰性對照測定不包含DNA。為了構建陽性對照模板，引物被設計得以擴增IS481和IS1001的靶區域，並且將 它們串聯地克隆到PUC19質粒。IS481正向引物被設計為添加EcoRI限制位點(IS481 EcoRI F)，而IS481反向引物被設計為添加BamHI限制位點(IS481BamHI R)。然後，這些引物被用 於從百日咳博德特氏菌的IS481產生237bp擴增子。IS481 EcoRI F 5' agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca(SEQ ID NO 20)IS481 BamHI R 5' atatgcggat ccgccactgc gtccttgagga(SEQ ID NO 21)ISlOOl正向引物被設計為添加BamHI限制位點(IS1001 BamHI F)並且ISlOOl反 向引物被設計為添加Pstl限制位點(IS1001 Pstl R)。ISlOOl BamHI F 5' atatgcggat ccataccgtc aagacgctgg aca(SEQ ID NO 22)IS1001 PstI R 5' tagcaactgc agcgatcaat gacctctcgt ccata(SEQ ID NO 23)這些引物被用於從副百日咳博德特氏菌的IS1001產生358bp擴增子。然後，擴增子被純化並且利用T4DNA連接酶同時連接到先前用EcoRI和Pstl消化 的PUC19質粒中。連接的質粒被轉化到大腸桿菌(E.coli)中，接著在包含氨苄青黴素的 LB瓊脂上選擇性生長。選擇單個菌落並且製備DNA。該DNA在通過利用IS481正向引物和 IS1001反向引物的SYBR綠色實時PCR(SYBR green real-time PCR)進行的篩選中被用作 模板DNA。然後，產生陽性SYBR綠色PCR結果的質粒被測序以確定包含串聯排列的IS481 和IS1001靶序列(595bp)以及BAMHI限制位點(6bp)的601bp插入序列的存在。陽性對照擴增子通過利用包含串聯601bp IS481/IS1001插入序列的質粒作為模 板與IS481 EcoRIF和IS1001 Pstl R引物一起擴增產生。包含所添加的限制位點，陽性對照擴增子的總大小是具有下列核苷酸序列的625bp 1agcagtgaattcggtggtgcgctacgagcatcaggcccccggcgatctgctgcacatcga
61catcaagaagctgggacgtatccagcgccctggccaccgggtcacgggcaaccgacgcga
121taccgttgagggggccggctgggacttcgtcttcgtggccatcgatgaccacgcccgcgt
181ggccttcaccgacatcccccccgacgagcgcttccccagcgccgtccagttcctcaagga
241cgcagtggcggatccataccgtcaagacgctggacaaggctcggctgcgtgcgtcggtgc
301gcgaaccggattggtccaagatcgagtatttggcgatggacgagtttgccctgcacaaag
361ggcatcgctacgcgacagtggtggtcgatccgatcggcaggcaggtgctgtggattggcc
421caggacgctcacgcgagacggcccgggcgttcttcgaacaattgccgcctggggccgccc
481aacgcatcaaggccgttgccatcgacatgaccaccgcctacgagttggagatccaggccc
541acagcccacaggcggagatcgtctatgacttgttccatgtcgtggccaagtatggacgag
601aggtcattgatcgctgcagttgcta(SEQ ID NO 24)
實施例2 博德特氏菌屬某些種的多重PCR檢測
最終的PCR試劑i容液包含下歹LI Tris-HCKpH 90) ^MgCL」KC1、EDTA、DTT、吐溫 20、
(NH4)2S04、甘油、dNTPs (dT、dA、dG 和 dC)和 FastStart DNA Polymerase 。製備10XPCR引物溶液，其包含百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和內部 對照的蠍子引物和反向引物。在10XPCR引物溶液中，百日咳博德特氏菌蠍子引物和反向 引物最終濃度為2 μ M，副百日咳博德特氏菌蠍子引物和反向引物最終濃度為1.5μΜ，並且 IC蠍子引物和反向引物最終濃度為1 μ Μ。兩種不同的百日咳博德特氏菌蠍子引物被單獨 測試。引物對如下百日咳博德特氏菌(IS481) [Q]-GCGTGGTCATCGATGGCCACcacgct-[F]-tttttt-heg-ccgacgcgataccgttga(SEQ ID NO 13)和[Q]-agcGGCCACGAAGACGAAGTCCCAGCCGct-[F]-heg-ccgacgcgataccgttga(SEQ ID NO 28)；和反向引物ggatgtcggtgaaggcca(SEQID NO:25).副百日咳博德特氏菌(ISlOOl)[Q]-accGGGCCTGGATCTCCcggt-[F]-heg-gaccaccgcctacgagtt(SEQ ID NO 14)，和反向弓丨物柳0已1區區88088區1^18區80區81(；1:燭9 ID NO:26).內部對照[Q]-TGCGAACTGGCAAGCT-[F]-heg -attcgccctttgtttcgaccta(SEQ ID NO 15)，和反向引物CCGACGACTGACGAGCAA(SEQID NO 16).對於上面所列的各個蠍子引物，Q =猝滅劑，F =螢光團，以及「heg」 =己二醇。探 針序列通過大寫字母進行鑑定。
對於每個要進行的樣品測定，PCR反應溶液通過將12. 5 μ 1 PCR試劑溶液、2. 5 μ 1 10XPCR引物溶液和5 μ 1無核酸酶的水混合而產生。在96孔板中進行多重PCR檢測測定。每個測定包含20 μ 1 PCR反應溶液和5 μ 1 提取的核酸(即患者樣品、陽性對照或陰性對照)。將板密封，在2000 X g下離心2分鐘，並 且在 Applied Biosystems (ABI) 7500Real-Time PCR Detection System 中運行。PCR 反應 如下進行第1階段(一個循環)95°C 10分鐘第2階段(45個循環)步驟1 :95°C 15秒步驟2 :60°C 35秒(在步驟2期間數據收集)。收集數據並且分析患者樣品一個或多個病原種類的存在。對任何一個或多個病原 種類具有陽性結果的患者樣品被記分為對於那些種類陽性。對所有病原種類具有陰性結果 的患者樣品僅被記為陰性，條件是內部對照靶核酸被檢測到並且陽性對照樣品測定對於百 日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌靶核酸來說是陽性的。實施例3 多重PCR測定結果的證實上述多重測定的結果與其它檢測測定進行比較。等分的所有樣品在第二測定中運 行以證實多重測定結果。百日咳博德特氏菌在ProPertussis分析(Prodesse，Inc)中進行 評測，其檢測IS481插入序列內的不同靶核酸以及分離的內部對照。副百日咳博德特氏菌 利用與上述蠍子引物和反向引物的引物和探針區域相同的引物和探針採用Taqman 型分 析評測IS1001插入序列。在多重測定中對306個樣品中每一個同時測試百日咳博德特氏菌和副百日咳博 德特氏菌。此外，306個樣品採用ProPertussis分析測試一次，並且採用副百日咳博德特氏 菌Taqman⑧分析測試一次。對於百日咳博德特氏菌測定(多重和ProPertussis)，彡37. 0 的Ct值被記為陽性。對於副百日咳博德特氏菌測定(多重和Taqman )，彡36. 5的Ct值 被記為陽性。三個樣品的多重測定在第一次重複中失敗並且兩個樣品的多重測定在重複測 試中失敗，很可能原因在於臨床樣品中的抑制物質引起內部對照失敗。這使下面所示的重 復#1和#2之間的總數從303增至304。此外，百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的 兩個測試之間存在分歧的所有樣品用多重測試和比較器進行重複。來自重複#2的結果包 括樣品結果及任何重複測試。各個測定的結果如下。百日咳博德特氏菌 靈敏性=95.9% ；特異性=96. 5% ；一致性=96. 4%多重測定的百日咳博德特氏菌成分與ProPertussis測定具有95. 9%陽性一致以 及96. 4%陰性一致。 靈敏性=96.2% ；特異性=99. 6% ；一致性=98. 7%多重測定的百日咳博德特氏菌成分與ProPertussis測定具有96. 2%陽性一致以 及99. 6%陰性一致。副百日咳博德特氏菌 靈敏性=91.3% ；特異性=99. 2% ；一致性=98. 0% 靈敏性=97.8% ；特異性=100% ；一致性=99. 7%多重測定的副百日咳博德特氏菌成分與Taqman⑧測定具有97. 8%陽性一致以及100%陰性一致。實施例4 博德特氏菌多重測定的交叉反應性對於交叉反應性測定，對照鼻拭子樣品與測試生物之一(對於每種生物η = 5)混 合併且根據上述方法進行提取DNA。唯一的例外是金黃色葡萄球菌(S. aureus)，其用於已 知為金黃色葡萄球菌陽性的臨床鼻樣品(即金黃色葡萄球菌樣品是真實的，不是人工的)。 對各個樣品進行博德特氏菌多重測定。在各個情況中，< 37. 0的Ct值被認為是百日咳博 德特氏菌交叉反應性的陽性結果，並且< 36. 5的Ct值被認為是副百日咳博德特氏菌交叉 反應性的陽性結果。對下列種類沒有測量出交叉反應性蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)月市炎衣原體(Chlamydophila pneumoniae)胃HfIfiI胃(Haemophilus influenzae)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)月市炎枝原體(Mycoplasma pneumoniae)月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)黏膜炎莫拉氏菌屬(Muraxellacatarrhal is)甲型、流感病毒(Influenza A)乙型流感病毒(Influenza B)B型呼吸道合胞病毒(RSV B)人隨機對照 DNA (Human random control DNA)還利用五個單獨的人工鼻拭子樣品測試副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)的交叉反應性。五個樣品中每一個都運行兩次。在這兩次重複中樣品 兩次測得對百日咳博德特氏菌略微陽性(Ct值分別為36. 65和36. 46)。每個陽性樣品 在ProPertussis分析中也測得對百日咳博德特氏菌陽性。對於所列的包括副流感嗜血菌 (H. parainfluenzae)在內的任何生物，觀測到與副百日咳博德特氏菌都沒有交叉反應性。 儘管出現混合的陽性結果，但是BLAST搜索揭示在百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏 菌以及副流感嗜血菌的多重PCR引物之間沒有同源性。除非另外指明，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域普通 技術人員所通常理解的相同的含義。本文例證性描述的本發明可在本文沒有具體公開的任何元素或多個元素、限制或 多個限制不存在的情況下合適地進行實施。因此，例如，術語「包括(comprising)」、「包括 (including) 」、「包含(containing) 」等應當作廣義且無限制性的理解。此外，本文所用的 術語和表達已經被用作說明性術語不是限制性術語，而且沒有意圖使用排除所示和描述的 特徵或其部分的任何等價形式的這樣的術語和表達，但是應當認識到在所請求保護的發明 範圍內各種改變是可能的。
因此，應當理解，儘管本發明已經通過優選實施方式和任選特徵具體地公開，但是 本領域普通技術人員可以採取在本文所公開的、在其中具體化的本發明的改變、改進和變 化，並且這樣的改變、改進和變化被認為在本發明的範圍內。這裡提供的物質、方法和實例 代表了優選實施方式，是示範性的，並且沒有意欲限制本發明的範圍。本發明在本文中已經做了廣泛且一般性描述。落在一般公開內容內的每一較窄種 類和下位分類也形成了本發明的部分。這包括從種類中去除任何主題的假定或否定性限制 的本發明一般性描述，無論所分離的物質是否在本文中具體描述。此外，在本發明的特徵或方面按照馬庫什(Markush)組來描述的情況下，本技術 領域的普通技術人員應認識到，本發明從而也根據Markush組的任意單一成員或成員的亞 組來描述。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻明確地以其全部內容 通過引用併入至如同每一篇通過引用單獨併入的程度。在衝突的情況下，以包括定義在內 的本說明書為主。
2權利要求
鑑定生物學樣品中百日咳博德特氏菌和/或副百日咳博德特氏菌存在或不存在的方法，其包括檢測下列的存在或不存在(a)IS481靶核酸，其包括至少14個與SEQ ID NO2至少95％相同的連續核苷酸或其互補序列，和(b)IS1001靶核酸，其包括至少14個與SEQ ID NO8至少95％相同的連續核苷酸或其互補序列，其中所述IS481靶核酸的存在鑑定百日咳博德特氏菌的存在，以及所述IS1001靶核酸的存在鑑定副百日咳博德特氏菌的存在。
2.權利要求1的方法，其中所述方法包括擴增所述IS481靶核酸或所述IS1001靶核酸 中至少一個。
3.權利要求1-2中任一項的方法，其中所述IS481靶核酸包括至少20個與SEQID NO 2至少95%相同的連續核苷酸。
4.權利要求1-2中任一項的方法，其中所述IS1001靶核酸包括至少20個與SEQID NO 8至少95%相同的連續核苷酸。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述方法包括(a)提供適於擴增IS481靶核酸或其片段的第一引物對，和提供適於擴增IS1001靶核 酸或其片段的第二引物對，(b)在適於當IS481靶核酸存在於所述樣品時產生第一反應產物和當IS1001靶核酸存 在於所述樣品時產生第二反應產物的條件下，進行包括步驟(a)所述引物對的多重引物延 伸反應；和(c)通過檢測具有至少14個與SEQID NO 2的核苷酸序列至少95%相同的核苷酸的 第一反應產物的存在或不存在，測定百日咳博德特氏菌的存在或不存在，和/或通過檢測 具有至少14個與SEQ ID NO 8的核苷酸序列至少95%相同的核苷酸的第二反應產物的存 在或不存在，測定副百日咳博德特氏菌的存在或不存在。
6.權利要求5的方法，其中所述第一反應產物包括至少14個來自SEQID NO 3的序 列的連續核苷酸或其互補序列。
7.權利要求6的方法，其中所述第一引物對的至少一個成員包括SEQID NOs :4或5的 序列或其互補序列。
8.權利要求6的方法，其中所述第一引物對的至少一個引物包括SEQID N0s:13或28 的序列或其互補序列。
9.權利要求6的方法，其中所述第一反應產物採用包括SEQIDNOs :6或27的序列或 其互補序列的探針進行檢測。
10.權利要求9的方法，其中所述探針進一步包括螢光標記。
11.權利要求5的方法，其中所述第二反應產物包括至少14個來自SEQID NO 9的序 列的連續核苷酸或其互補序列。
12.權利要求11的方法，其中所述第二引物對的至少一個引物包括SEQID N0s:10或 11的序列或其互補序列。
13.權利要求11的方法，其中所述第二引物對的至少一個引物包括SEQID NO 14的 序列或其互補序列。
14.權利要求11的方法，其中所述第二反應產物採用包括SEQIDNO :12的序列或其互 補序列的探針進行檢測。
15.權利要求14的方法，其中所述探針進一步包括螢光標記。
16.檢測生物學樣品中百日咳博德特氏菌存在或不存在的方法，其包括檢測包括至少 14個SEQ ID NO 2的連續核苷酸的IS481靶核酸存在或不存在。
17.權利要求16的方法，其中所述IS481靶核酸包括至少20個SEQID NO :2的連續 核苷酸。
18.權利要求16-17中任一項的方法，其中所述方法包括(a)提供適合擴增IS481靶核酸或其片段的引物對；(b)在適於當IS481靶核酸存在於所述樣品時產生反應產物的條件下，進行包括步驟 (a)的所述引物對的引物延伸反應；和(c)通過檢測具有至少14個與SEQID NO 2的核苷酸序列至少95%相同的核苷酸的 反應產物的存在或不存在，測定百日咳博德特氏菌的存在或不存在。
19.權利要求18的方法，其中所述反應產物包括至少14個來自SEQID NO 3的序列 的連續核苷酸或其互補序列。
20.權利要求19的方法，其中所述引物對的至少一個引物包括SEQID NOs :4或5的 序列或其互補序列。
21.權利要求19的方法，其中所述引物對的至少一個引物包括SEQID N0s:13或28的 序列或其互補序列。
22.權利要求18-21中任一項的方法，其中所述反應產物採用包括SEQID NOs :6或27 的序列或其互補序列的探針進行檢測。
23.權利要求22的方法，其中所述探針進一步包括螢光標記。
24.權利要求16-23中任一項的方法，其中所述方法包括實時PCR。
25.檢測生物學樣品中副百日咳博德特氏菌的存在或不存在的方法，其包括檢測具有 至少14個SEQ ID NO 8的連續核苷酸的IS1001靶核酸的存在或不存在。
26.權利要求25的方法，其中所述IS1001靶核酸包括至少20個SEQID NO 8的連續 核苷酸。
27.權利要求25-26中任一項的方法，其中所述方法包括(a)提供適合擴增IS1001靶核酸或其片段的引物對；(b)在適於當IS1001靶核酸存在於所述樣品時產生反應產物的條件下，進行包括步驟 (a)的所述引物對的引物延伸反應；和(c)通過檢測具有至少14個與SEQID NO 8的核苷酸序列至少95%相同的核苷酸的 反應產物的存在或不存在，測定副百日咳博德特氏菌的存在或不存在。
28.權利要求27的方法，其中所述反應產物包括至少14個來自SEQID NO 9的序列 的連續核苷酸或其互補序列。
29.權利要求27的方法，其中所述引物對的至少一個引物包括SEQID N0s:10或11的 序列或其互補序列。
30.權利要求27的方法，其中所述引物對的至少一個引物包括SEQID N0:14的序列 或其互補序列。
31.權利要求27-30中任一項的方法，其中所述反應產物採用包括SEQID N0:12的序 列或其互補序列的探針進行鑑定。
32.權利要求31的方法，其中所述探針進一步包括螢光標記。
33.權利要求25-32中任一項的方法，其中所述方法包括實時PCR。
34.分離的核酸，其包括與至少20個SEQID NO :2的連續核苷酸至少95%相同的核苷 酸序列或其互補序列，並且其中所述核酸長度上小於200個核苷酸。
35.權利要求34的核酸，其中所述核酸包括與至少20個SEQIDNO 2的連續核苷酸相 同的核苷酸序列或其互補序列。
36.權利要求34-35中任一項的核酸，其中所述核酸包括與至少40個SEQID NO 2的 連續核苷酸相同的核苷酸序列或其互補序列。
37.權利要求34-36中任一項的核酸，其中所述核酸包括與SEQIDNO 3相同的核苷酸 序列。
38.權利要求37的核酸，其中所述核酸由與SEQID NO :3相同的核苷酸序列組成。
39.分離的核酸，其包括與至少20個SEQID NO :8的連續核苷酸至少95%相同的核苷 酸序列或其互補序列，並且其中所述核酸長度上小於200個核苷酸。
40.權利要求39的核酸，其中所述核酸包括與至少20個SEQIDNO 8的連續核苷酸相 同的核苷酸序列或其互補序列。
41.權利要求38-40中任一項的核酸，其中所述核酸包括與至少40個SEQID NO :8的 連續核苷酸相同的核苷酸序列或其互補序列。
42.權利要求39-41中任一項的核酸，其中所述核酸包括與SEQIDNO :9相同的核苷酸 序列。
43.權利要求42的核酸，其中所述核酸由與SEQID NO :9相同的核苷酸序列組成。
44.試劑盒，其包括(a)第一引物對，其與具有SEQID NO :2的序列或其互補序列的核酸特異性地雜交，以 及第一探針，其能與具有SEQ ID NO :2的序列或其互補序列的核酸特異性地雜交，和(b)第二引物對，其與具有SEQID NO :8的序列或其互補序列的核酸特異性地雜交，以 及第二探針，其能與具有SEQ ID NO :8的序列或其互補序列的核酸特異性地雜交。
45.權利要求44的試劑盒，其中所述第一引物對能與具有SEQIDNO :3的序列或其互 補序列的核酸特異性地雜交。
46.權利要求44-45中任一項的試劑盒，其中所述第一探針能與具有SEQID NO :3的 序列或其互補序列的核酸特異性地雜交。
47.權利要求44-46中任一項的試劑盒，其中所述第一引物對的至少一個成員包括SEQ ID NO :4或5的序列或其互補序列。
48.權利要求44-47中任一項的試劑盒，其中所述第一探針包括SEQID NO 6或27的 序列或其互補序列。
49.權利要求44-48中任一項的試劑盒，其中所述第二引物對能與具有SEQID NO :9的 序列或其互補序列的核酸特異性地雜交。
50.權利要求44-49中任一項的試劑盒，其中所述第二探針能與具有SEQID NO :9的 序列或其互補序列的核酸特異性地雜交。
51.權利要求44-46和48-50中任一項的試劑盒，其中所述第二引物對的至少一個成員 包括SEQ ID NO :10或11的序列或其互補序列。
52.權利要求44-48和50中任一項的試劑盒，其中所述第二探針包括SEQID N0:12的 序列或其互補序列。
53.權利要求44-52中任一項的試劑盒，其中所述第一引物對的至少一個成員是蠍子 引物。
54.權利要求53的試劑盒，其中所述蠍子引物具有SEQID NO 13或28的序列或其互 補序列。
55.權利要求44-54中任一項的試劑盒，其中所述第二引物對的至少一個成員是蠍子 引物。
56.權利要求55的試劑盒，其中所述蠍子引物具有SEQID NO 14的序列或其互補序列。
57.權利要求44-56中任一項的試劑盒，其中所述第一探針和所述第二探針進一步包 括可檢測標記。全文摘要
本文公開了通過分別檢測IS481和IS1001基因組插入序列的存在，檢測百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK101903537SQ200880121984
公開日2010年12月1日 申請日期2008年10月7日 優先權日2007年10月26日
發明者F·陳, J·陳, L·I·孔, M·M·塔布, M·埃, M·李, N·盧 申請人:奎斯特診斷投資公司