用於基因轉移的病毒包膜載體的製作方法

2024-01-21 16:24:15

專利名稱：用於基因轉移的病毒包膜載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於體外和體內基因轉移的安全、高效載體。具體地，本發明涉及通過使用病毒或滅活的病毒，尤其滅活的HVJ(仙臺病毒)所製備的基因轉移載體。而且，本發明所述基因轉移載體還可用於基因治療和大規模(high throughput)篩查。
背景技術：
現已開發了多種旨在用於基因治療的病毒性和非病毒性(合成的)基因轉移方法(Mulligan，科學，260，926-932(1993)和Ledley，人類基因治療，第6卷，1129-1144(1995))。一般而言，病毒方法比非病毒方法能更有效地將基因轉移至細胞中。但病毒載體由於同時引入了親代病毒的基本基因元件，以及病毒基因的滲漏表達，免疫原性，和對宿主基因組結構的修飾，使得它存在安全性方面的考慮。非病毒載體一般具有較少的細胞毒活性和較小的免疫原性。但大多數非病毒方法的基因轉移效率(尤其在體內)低於某些病毒載體。
因此，病毒載體和非病毒載體都既有限制又有優點。因此必須開發體內應用的高效、低毒性基因轉移載體，以便彌補其中一類載體系統的限制又具有另一類系統的優點。
另一方面，HVJ具有較高免疫原性，且已知可誘導CTL，特別是當產生大量NP蛋白時(Cole，G.A.等，免疫學雜誌158，4301-4309(1997))。也有人擔心宿主的蛋白質合成可能被抑制。
HVJ還有一個問題，當使病毒融合蛋白經離心或柱操作而純化以便在脂質膜上重建時，所產生的顆粒可能由於重建而失去病毒的其它蛋白(主要是M蛋白)，從而使要求融合活性的F1與HN蛋白間的比率不能維持在與野生型病毒相同的水平，導致較低融合活性。此外，由於融合蛋白在重建時插入脂質膜的方向不必與在野生型中一樣，故可提呈某些未知抗原。
另有人報導了一種通過添加新的分子而實施重建的方法(Uchida，T.等，細胞生物學雜誌80，10-20，1979)。但該方法存在失去原有病毒功能的高度危險，因為合成顆粒的膜組分本質上不同於天然病毒顆粒的膜組分。
涉及將基因或蛋白包入脂質體並將其與滅活的HVJ融合而產生融合顆粒(如在傳統HVJ-脂質體中一樣)的方法已能將非侵襲性或非毒性基因轉移至培養的細胞或體內組織中。該項技術在世界各地頻繁用於動物試驗中(Dzau，V.J.等，美國國家科學院學報，93，11421-11425(1996)和Kaneda，Y.等，今日分子醫學，5，298-303(1999))。但已有人發現該項技術的缺陷例如，由於須製備兩種不同載體，即病毒和脂質體，該方法可能比較複雜；由於與脂質體融合而致使平均直徑比病毒顆粒大1.3倍的那些顆粒，它們的融合活性為病毒的10％或更低。
此外，就某些組織而言，基於傳統HVJ的載體可能不能獲得任何基因轉移，或如果可以，效率也極低。這表明，根據傳統方法可用於基因治療的組織很有限。
有需要開發一種用於人類基因治療的病毒性載體，其可安全、高效、並簡單地製備，還能將基因轉移至廣泛多種體內組織中。
因此，本發明的一個目標是開發一種安全、高效、且簡單的基於病毒的基因轉移載體，其可應用於廣泛多種培養細胞或體內組織，它克服了傳統重建型HVJ載體方法或HVJ-脂質體方法的缺點。
發明公開在本發明的一個方面中，提供一種安全、高效的利用滅活病毒的基因轉移載體。滅活病毒(其中病毒的基因組已被滅活)不能複製病毒蛋白，因此比較安全並具有低細胞毒性和低抗原性。通過將基因包入病毒包膜載體這種利用滅活病毒的基因轉移載體，可製備一種安全、高效、且簡單的用於培養細胞或體內組織的基因轉移載體。
在本發明另一方面中，提供一種能將基因轉移至很多種體內組織中的病毒包膜載體。在一個實施方案中，所用病毒是HVJ。可利用本發明之病毒包膜載體獲得體內基因轉移的組織的實例有，但不限於肝臟、骨胳肌、子宮、腦、眼、頸動脈、皮膚、血管、肺、心臟、腎臟、脾臟、癌組織、神經、B淋巴細胞、以及呼吸道組織。
在本發明另一方面中，提供簡單實現(realizing)向懸浮細胞的基因轉移的方法。利用本發明病毒包膜載體向懸浮細胞實施基因轉移的優選方法實例包括，在有硫酸魚精蛋白的條件下使懸浮細胞與病毒包膜載體混合，並使混合物離心的基因轉移方法。
在本發明另一方面中，通過利用本發明的能在短時間內包容大量基因的基因轉移載體實現向培養細胞和體內組織中高效且快速的基因轉移。因此，在本發明另一方面中，利用本發明基因轉移載體建立對基因組的高流通量、快速質量分析系統。
在本發明另一方面中，基因轉移載體可長期以冷凍狀態貯存於-20℃。例如，可將該基因轉移載體以冷凍狀態密封、貯存、並運輸。
本發明另一方面提供一種基因轉移載體，其對優選70％或更多的細胞，更優選80％或更多的細胞，還更優選對90％或更多的細胞，最優選對95％或更多的細胞具有體外基因轉移活性。
本發明一個特定方面提供一種基因轉移載體，當滅活病毒製備成功的2個月後，產生病毒包膜載體作為基因轉移載體時，可維持基因轉移活性的60％或更多，優選70％或更多，更優選80％或更多，最優選90％或更多。
本發明另一方面提供一種基因轉移載體，當體內局部給與時，其對優選30％或更多的組織中細胞，更優選40％或更多的組織中細胞，還更優選50％或更多的組織中細胞，最優選60％或更多的組織中細胞具有基因轉移活性。
本發明的一方面提供一種含有滅活病毒的包膜的基因轉移載體。
本發明的一方面中，用於製備基因轉移載體的病毒可以是野生型病毒或重組型病毒。
本發明又一方面中，所用病毒屬於逆轉錄病毒科(Retroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、黃病毒科(Flaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、杆狀病毒科(Baculoviridae)、以及嗜肝DNA病毒科(Hepdnaviridae)。本發明一個具體方面中，所用病毒為HVJ。在本發明另一方面中，用Hasan，M.K.等(普通病毒學雜誌，78，2813-2820(1997))或Yonemitsu，Y.等(自然生物技術學(Nature Biotechnology)18，970-973(2000))所述重組仙臺病毒製備基因轉移載體。
本發明另一方面提供能向動物體內組織實施基因轉移的基因轉移載體。
在製備本發明基因轉移載體的方法中，不必滅活病毒。因此，本發明一個方面中，可在不進行滅活病毒的步驟的前提下，利用含以下步驟的方法製備基因轉移載體1)使病毒與外源基因混合，和2)凍融該混合物，或進一步使該混合物與一種表面活性劑混合。
本發明另一方面提供用於基因轉移的滅活型病毒包膜載體的製備方法，該方法包括以下步驟滅活病毒，使該滅活的病毒與外源基因混合，和凍融該混合物。
本發明又一方面提供用於基因轉移的滅活型病毒包膜載體的製備方法，該方法包括以下步驟滅活病毒，和使該滅活的病毒與外源基因在有表面活性劑存在的情況下混合。
在本發明另一方面中，所用表面活性劑選自辛基葡糖苷、Triton-X100、CHAPS和NP-40。
本發明一個具體方面提供製備滅活型病毒包膜載體的方法，該方法還包括在外源基因與滅活病毒的包膜混合之前，向外源基因中添加硫酸魚精蛋白的步驟。
本發明另一方面提供將基因導入分離的動物組織中的方法，該方法包括以下步驟製備含所需基因的基因轉移載體，和通過基因轉移載體將基因導入動物組織。
本發明另一方面提供將外源基因導入懸浮細胞的方法，該方法包括以下步驟使懸浮細胞與基因轉移載體在有硫酸魚精蛋白存在的情況下混合，和離心該混合物。
本發明還有一方面提供含本發明基因轉移載體的用於基因治療的藥用組合物。


圖1顯示，多次凍融HVJ包膜載體並轉染培養的細胞後，外源基因(螢光素酶基因)表達水平(螢光素酶活性)的測量結果。
圖2顯示，當培養的細胞被轉染後，螢光素酶活性的測量結果，確保使用相同數量的病毒來製備添加至培養的細胞中的HVJ包膜載體。
圖3顯示，當HVJ包膜載體中使用各種量的外源基因(螢光素酶表達載體)時，螢光素酶活性的測量結果。
圖4顯示，當使用各類緩衝液製備HVJ包膜載體時，螢光素酶活性的測量結果。
圖5顯示用傳統基因轉移載體、滅活型HVJ-脂質體以及本發明的方法進行基因轉移的結果比較。
圖6圖示利用表面活性劑的情況下，製備滅活的HVJ包膜載體的方法。
圖7示用表面活性劑製備的HVJ包膜載體中所含蛋白的SDS-PAGE模式。
圖8是HVJ包膜載體的顯微電鏡負染圖，其顯示(1)未處理的HVJ；(2)不含DNA但接受了辛基葡糖苷處理的HVJ；和(3)含DNA並接受了辛基葡糖苷處理的HVJ。
圖9A-9C顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自辛基葡糖苷的不同濃度；辛基葡糖苷對HVJ的不同處理時間；是否進行超聲(聲)處理；以及所用載體的不同大小，如圖所示。
圖10A和10B顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自硫酸魚精蛋白(PS)的如圖所示不同濃度和不同轉染時間。
圖11A和11B顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自圖示的不同DNA量(實驗中所用量)，以及不同貯存溫度。
圖12顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自用各種HAU滴度的HVJ製備HVJ包膜載體並將其用於基因轉移的情況，如圖所示。
圖13A顯示如圖所示的不同UV輻射量下，以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力。
圖13B顯示以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自圖中所示的不同β-丙醇酸內酯(BPL)濃度。
圖14顯示對人的舌上扁平上皮癌(SAS)的以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自圖中硫酸魚精蛋白的不同濃度和轉染保溫的不同時間。
圖15顯示對人的主動脈內皮細胞(HAEC)的以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性取自圖中硫酸魚精蛋白的不同濃度和轉染保溫的不同時間。
圖16A顯示對小鼠肝臟的以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性通過利用本發明的HVJ包膜載體或HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂質體獲得。
圖16B顯示對小鼠子宮的以螢光素酶活性水平表示的基因轉移效力，所述酶活性通過利用本發明的HVJ包膜載體或HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂質體獲得。
圖16C顯示用本發明的HVJ包膜載體向小鼠子宮實施pEB-CMV-LacZ基因轉移後，對子宮組織的LacZ染色結果。通過LacZ染色可見，LacZ基因的表達主要在子宮內膜的腺上皮中。
圖16D顯示，將含有pEGFP-1(10,000 HAU)的HVJ包膜載體經小腦延髓池或經頸動脈給藥至SD大鼠(雄性，體重300-400g)的結果。給藥的3-4天後，處死大鼠，製備活組織切片(live section)，在螢光顯微鏡下進行觀察。
①經小腦延髓池給藥經證實基因已導入腦表面。另一方面又證實沒有向腦的深部進行基因轉移。還證實，沒有向脈絡叢中進行基因轉移。
②，③經頸動脈給藥在左側(即給藥處)證實有顯著高表達。在腦內表面部分、基底核部、以及另一腦的腦表面均證實有表達。在另一腦的腦表面的表達被認為已通過側流(collateral)傳(flow)向另一側。
圖16E顯示pCMV-NK4對VEGF-誘導型血管生成的劑量依賴性抑制作用，所述載體能表達一種HGF突變體，該突變體可抑制HGF的功能。
圖16F顯示通過向氣管注射HVJ包膜載體而實施的基因轉移的結果。
圖17A和17B顯示將寡核苷酸導入細胞後，第二天在螢光顯微鏡下觀察到的細胞螢光結果。保溫10分鐘後獲得約10％的寡核苷酸導入效力(圖17B)，而保溫60分鐘後寡核苷酸已導入80％或更多的細胞中(圖17A)。
圖18顯示在人的白血病細胞系CCRF-CEM，NALM-6，和K-562中的導入實驗的結果。
當使用脂質體或存在脂質體試劑(Gibco BRL的Lipofectamine、lipofectin等)時，這些細胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)顯示極低的導入效力。
加入600-1,000μg/ml硫酸魚精蛋白，於20℃以10,000rpm或15,000rpm離心10分鐘，即可獲得高螢光素酶活性。未觀察到與HVJ包膜載體相關的顯著細胞毒活性。硫酸魚精蛋白的離心和添加是基因轉移所必需的。
圖19顯示癌組織的基因轉移結果。在癌組織的腫瘤實體中觀察到基因表達。尤其，用500μg/ml硫酸魚精蛋白獲得了較高的基因轉移活性。另一方面，在較低硫酸魚精蛋白濃度下未檢測到基因表達。
圖20顯示用皰疹病毒包膜載體將基因轉移至細胞的結果。儘管總螢光素酶活性低，但已確定，用Triton-X10處理5分鐘可獲得具有最高導入效力的載體。一種未利用硫酸魚精蛋白的製備方法具有高導入效力。所有樣品經形態學觀察均未見任何細胞毒性。
圖21顯示用貯存於-80℃的皰疹病毒包膜載體將基因轉移至細胞的結果。用添加了10％血清的培養基所獲導入效力高於用無血清培養基所獲。用200μl載體溶液(估計量2.8×107病毒顆粒/孔)所獲基因轉移活性高於用100μl載體溶液(估計量1.4×107病毒顆粒/孔)所獲。
實施本發明的最佳模式(定義)本文中「基因轉移」指將天然、合成、或重組的所需基因或基因片段(體外或體內)導入靶細胞，其導入方式可使所導入的基因維持其功能。本發明將被導入的基因或基因片段包括DNA、RNA、或任何核酸(DNA或RNA的具有特定序列的合成類似物)。本說明書中，術語「基因轉移」、和「轉染」可互換使用。
本文中「基因轉移載體」、「基因載體」或「病毒包膜載體」指通過在病毒包膜中包含外源基因而獲得的載體。用於製備基因轉移載體的病毒可以是野生型病毒或重組型病毒。
本發明的一個方面中，所用病毒屬於逆轉錄病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、彈狀病毒科、痘病毒科、皰疹病毒科、杆狀病毒科、以及嗜肝DNA病毒科。本發明一個具體方面中，所用病毒為HVJ。
本文中「基因轉移活性」指載體的「基因轉移」活性，其可利用所導入的基因的功能(如果是表達載體，則是所編碼蛋白的表達和/或該蛋白的活性等)作為指標來檢測。
本文中「滅活的」用於指基因組已被滅活的病毒。滅活病毒具有複製缺陷。優選，滅活可通過UV處理或用烷基化試劑處理來獲得。
本文中「外源基因」指包含在基因轉移載體中的任何核酸序列，但該核酸序列並非病毒來源。本發明的一個方面中，將外源基因可操作連接至使被基因轉移載體導入的基因能表達的適當調節序列(如轉錄所必需的啟動子、增強子、終止子、poly A加尾信號，以及翻譯所必需的核糖體結合位點、起始密碼子、終止信號等)。本發明另一方面中，外源基因不包括用於該外源基因表達的任何調節序列。本發明還一方面中，外源基因為寡核苷酸或誘騙(decoy)核酸。
包含在基因轉移載體中的外源基因主要是DNA或RNA核酸分子，但所導入的核酸分子可包括核酸類似物分子。基因轉移載體中所含分子種類可以是一種，也可以是多種不同基因分子。
本文中「基因文庫」指含有自然界分離的或人工合成的核酸序列的核酸文庫。核酸序列的自然來源包括真核生物、原核生物、或病毒的基因組序列或cDNA序列，但不限於此。通過向自然界分離的序列中加入任意序列(如信號或標記)而獲得的文庫也包括在本發明的基因文庫中。在一個實施方案中，基因文庫包含諸如導致其中所含核酸序列轉錄和/或翻譯的啟動子等序列。
本文中，「HVJ」和「仙臺病毒」可互換使用。
本文中，「HAU」指可凝集雞紅細胞的0.5％的病毒活性水平。一個HAU相當於約24,000,000個病毒顆粒(Okada，Y.等，Biken Journal 4，209-213，1961)。
(基因治療)治療性核酸構建物可利用本發明的基因轉移載體而局部或全身性給藥。當這類核酸構建物包括蛋白的編碼序列時，該蛋白的表達可利用內源性哺乳動物啟動子或外源啟動子誘導。編碼序列的表達可以是組成型的或可以調節。
當本發明的基因轉移載體被作為基因治療的組合物使用時，本發明載體的給與，可通過將載體的PBS(磷酸鹽緩衝液)、鹽水等懸浮液直接注射至局部位點(如癌組織內部、肝內、肌肉內和腦內)，或經由其脈管(如動脈內、靜脈內或門靜脈內)給與。
在一個實施方案中，基因轉移載體通常是將單位注射劑型(溶液、懸浮液、或乳液)的基因轉移載體與可藥用載體(即在所用劑量和濃度下對受體無毒性且能與製劑中其它成分相容的物質)混合而配製成。例如，製劑優選不包括氧化劑以及已知對基因轉移載體有害的其它化合物。
可藥用載體最好包含少量添加劑如增強滲透性和化學穩定性的物質。這些物質在所用劑量和濃度下對受體無毒性，且包括緩衝液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸、及其它有機酸或它們的鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；小分子多肽(約不到10個殘基)，如多聚精氨酸或三肽；蛋白質(如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白)；親水性聚合物(如聚乙烯吡硌烷酮)；胺基酸(如甘氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、或精氨酸)；單糖、二糖、及其它碳水化合物(包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精)；螯合劑(如EDTA)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；反離子(如鈉)；和/或非離子表面活性劑(如聚山梨酯(polysorbate)或聚羥亞烴(polyxamer))，或PEG。
含基因轉移載體的藥用組合物通常以水溶液形式保存在單劑型或多劑型的容器，如密封的安瓿瓶或小瓶中。
本發明還提供一種藥劑包裝或試劑盒，其包括一或多個容器，其中裝載本發明藥用組合物的一或多種成分。此外，本發明的多肽可與其它治療性化合物一起使用。
含有本發明基因轉移載體的藥用組合物可根據醫療實踐進行配製和用量，應考慮患者個人的臨床狀況(如需預防或治療的狀況)、含基因轉移載體的組合物的運送位點、靶組織、給藥方法、給藥時間表、以及本領域技術人員已知的其它因素。因此，本說明書中描述的基因轉移載體的「有效量」或適當劑量可根據上述考慮而定。
例如，將本發明的基因轉移載體給藥至小鼠時，每隻小鼠可給與相當於20-20,000 HAU、優選60-60,000 HAU、更優選200-2,000 HAU的基因載體。所給與的基因載體中外源基因的含量為0.1-100μg，優選0.3-30μg，更優選1-10μg/小鼠。
如果將本發明的基因載體給藥至人，每人可給與相當於400-400,000HAU、優選1,200-120,000 HAU、更優選4,000-40,000 HAU的基因載體。所給與的基因載體中外源基因的含量為2-2,000μg，優選6-600μg，更優選20-200μg/人。
以下實施例旨在舉例說明本發明，並非限制。
實施例1.基因轉移載體的利用凍融法的製備，以及其應用(實施例1利用凍融法製備HVJ包膜載體)用螢光素酶基因作為外源基因。將重組HVJ病毒凍融多次後，將該基因導入培養的細胞中。
將500μl TE、750μg螢光素酶表達載體pcOriPLuc(Saeki和Kaneda等，人類基因治療，11，471-479(2000))與各種濃度的HVJ病毒混合。將HVJ病毒的濃度調整至10、25、50、或100 HAU/μl。將該溶液分為12等份，每份均保存在4℃，用乾冰冷凍然後解凍；如此重複最多達30次。將已凍融了指定次數的溶液加入BHK-21細胞中(24孔板，4×104細胞/板，0.5mlDMEM，10％FCS)。使細胞與5％CO2在37℃反應20分鐘後，細胞用PBS洗滌，然後再加入0.5ml培養液，培養24小時。
除去培養基。向細胞中加入500μl 1×細胞培養物裂解試劑(Promega)以裂解細胞，將該溶液置於微量離心管中，離心。用Promega螢光素酶分析系統和Lumat LB9501發光儀(Luminophotometer)測定20μl所得上清的螢光素酶活性。每種溶液測三次，取平均值。
結果見圖1。螢光素酶活性隨著重組HVJ病毒凍融次數的增加而增加。凍融20次時的螢光素酶表達10倍或更多倍於凍融三次的觀察結果。這些結果證實，在本實施例所用條件下，重組HVJ病毒的凍融次數優選為5次以上，更優選約15-約20次。
(實施例2經凍融製備的HVJ包膜載體的基因轉移效力)將類似於實施例1所用的重組HVJ病毒凍融30次後，在確保將相同量病毒加入到宿主細胞的前提下，檢查向細胞內轉移基因的效力。
結果見圖2。圖2中，在X軸的500 HAU處，具有10 HAU/μl病毒濃度的溶液的加入量為50μl，而100 HAU/μl溶液的加入量為5μl。如圖2所示，具有100 HAU/μl病毒濃度的溶液的基因表達效力與具有10-50HAU/μl病毒濃度的溶液相比減少約50％。該結果表明，在本實施例的條件下，重組病毒的濃度優選為10-50 HAU/μl。
此外，將重組HVJ病毒凍融29次後，第30次實施冷凍，然後將該HVJ病毒溶液以此冷凍狀態保存一周，然後凍融，加至細胞中。結果，在冷凍狀態下保存了一周的重組HVJ病毒也顯示與經受了連續30次凍融的病毒相同的螢光素酶基因表達水平。
(實施例3測定用螢光素酶表達基因進行的基因轉移效力)利用不同量的螢光素酶表達載體製備HVJ包膜載體，檢查向宿主細胞的基因轉移效力。
HVJ病毒的量為50 HAU/μl TE。螢光素酶表達載體pcOriPLus的量為0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，或5.5μg/μl TE。凍融20次，將所述溶液的終體積調整至100μl，然後用如實施例1所述相同的方法測定螢光素酶活性。
結果見圖3。以表達載體pcOriPLuc(約9.5kb)為外源基因，隨著它的添加，其表達量以劑量依賴的方式增加，直至添加量達1.5μg；隨後，表達量幾乎不再有變化。該結果證實，在本實施例的條件下，優選用1.5μg/μl或更多的外源基因DNA進行基因轉移。
(實施例4緩衝液類型對基因轉移效力的影響)用不同類型的緩衝液製備HVJ包膜載體，檢查向宿主細胞實施基因轉移的效力。
HVJ病毒的量為50 HAU/μl緩衝液。螢光素酶表達載體pcOriPLuc的量為15μg/μl。所用緩衝液為TE、PBS、或BSS(137mM NaCl，5.4mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)、或向這些緩衝液中添加蔗糖至終濃度為0mM，20mM，40mM，或60mM。凍融20次，將所述溶液的終體積調整至100μl，然後用如實施例1所述相同的方法測定螢光素酶活性。
結果見圖4，其證實，在本實施例的條件下，優選只使用TE作為製備重組HVJ病毒的緩衝液。
(實施例5AVE(人工病毒包膜)型載體和本發明之HVJ包膜載體的比較)利用滅活的HVJ脂質體(具有最佳基因轉移效力的AVE型(Saeki，Y.等，人類基因治療，8，2133-2141(1997)))這種傳統基因轉移載體進行的基因轉移，與本發明的基因轉移方法進行比較。
HVJ脂質體或HVJ病毒的量為50 HAU/μl TE，螢光素酶表達載體pcOriPLuc的量為1.5μg/μl。重組HVJ病毒的凍融次數為2次或15次。其它條件與實施例1中的相同，不同的是用人胚腎細胞系HEK293作為宿主細胞。
結果見圖5。其證實，本發明中將HVJ包膜載體重複凍融15次的方法比用HVJ脂質體進行的傳統基因轉移方法的基因轉移效力高很多。
(實施例6合成寡核苷酸的導入效力)將已用FITC(異硫氰酸螢光素)標記的合成寡核苷酸(20bp)以1mg/ml的濃度與滅活的HVJ病毒混合。將該溶液凍融20次後，使之與BHK-21細胞反應20分鐘。17小時後觀察螢光信號。結果，幾乎在100％的細胞的細胞核中觀察到螢光信號。該結果表明，本發明的方法也可有效用於將合成的核酸導入細胞。
(實施例7GFP基因的導入效力)將GFP(綠色螢光蛋白)基因與滅活的HVJ病毒的混合溶液凍融20次後，將2ng-5μl該混合液注射至大鼠大腦。結果在注射部位觀察到螢光信號。此外，將利用了GFP基因的HVJ包膜載體凍存3個月，然後注射至大鼠大腦。同樣，在注射部位觀察到因GFP基因表達而產生的螢光信號。
以上結果表明，本發明的方法確實能實現基因的體內轉移。此外，還證實HVJ包膜載體的冷凍保存是可能的。
2.基因轉移載體的利用表面活性劑的製備，以及其應用(實施例8利用表面活性劑製備滅活的HVJ包膜載體)利用表面活性劑製備滅活的HVJ包膜載體的方法圖示於圖6。
(1HVJ的培養)
通常可將HVJ種子病毒接種在受精的雞胚中以便進行培養。但也可利用培養的細胞(如猴或人)或持續感染系統(即一種培養液，其中已將一種水解酶如胰蛋白酶添加至培養的組織中)培養HVJ，或通過以克隆化病毒基因組感染培養的細胞，導致持續感染，而培養HVJ。
在本實施例中，HVJ如下培養。
利用SPF(不含特異性病原體的)受精卵培養HVJ種子病毒。將分離並純化的HVJ(Z種)分配至保存細胞的試管中，添加10％DMSO後保存於液氮中。
取剛剛完成受精的雞卵，將其置於培養箱(SHOWA-FURANKI P-03型；能容納約300個受精卵)中，在36.5℃和40％以上溼度的環境下培養10-14天。在暗室中，用檢卵器(其中將來自燈泡的光線引導穿過一個直徑約1.5cm的窗口)證實胚的活力以及氣室和絨毛尿囊膜的位置。用鉛筆標出絨毛尿囊膜上方約5mm處的病毒注入部位(選擇該部位應避開任何厚血管)。將種子病毒(其取自液氮)用多聚蛋白腖溶液(其中將1％多聚蛋白腖與0.2％NaCl混合，用1M NaOH調節至pH7.2，然後經高壓滅菌，保存在4℃)稀釋500倍，並於4℃靜置。雞胚用IsodineTM和乙醇消毒。用錐子(pick)在病毒注射部位製造一個小洞。用1ml的注射針(26號)將0.1ml稀釋的種子病毒液注入絨毛尿囊腔。用Pasteur移液管以Molten石蠟(熔點50-52℃)封閉洞口。將受精卵置於培養箱中，在36.5℃和40％以上溼度的環境下培養3天。然後，將已接種的受精卵於4℃靜置過夜。第二天，用小鑷子打開氣室，將帶有18號針頭的10ml注射器深入絨毛尿囊膜中以吸取尿囊液，將其收集在無菌小瓶中，4℃保存。
(2HVJ的純化)HVJ可通過利用離心進行純化的方法，利用層析柱進行純化的方法，或領域內已知的任何其它方法來純化。
(2.1通過離心進行純化的方法)簡單說，收集含病毒的溶液，低速離心以除去該培養液以及絨毛尿囊液中的組織或細胞碎片。其上清利用蔗糖密度梯度(30-60％w/v)經高速離心(27,500×g，30分鐘)和超速離心(62,800×g，90分鐘)來純化。純化期間儘可能溫和地處理病毒，將病毒4℃保存。
具體在本實施例中，HVJ用如下方法純化。
將約100ml含HVJ的絨毛尿囊液(取自含HVJ的雞胚，收集並保存於4℃)用Komagome型廣口移液管裝入兩個50ml離心管中(見Saeki，Y.和Kaneda，Y用於運送基因、寡核苷酸和蛋白質的蛋白質修飾型脂質體(HVJ-脂質體)。細胞生物學實驗室手冊(第二版)，J.E.Celis編(Academic Press Inc.，San Diego)，第四卷，127-135頁，1998)，於4℃以3000rpm低速離心10分鐘(關閉制動閘(brake))。以此除去雞胚中的組織碎片。
離心後，將上清轉移至4個35ml離心管(高速離心型)，用角度轉子以27,000g離心30分鐘(加速器和制動閘均打開)。除去上清，沉澱中加入BSS(10mM Tris-HCl(pH7.5)，137mM NaCl，5.4mM KCl；高壓滅菌，4℃保存)約5ml/管，4℃靜置過夜。用Komagome型廣口移液管輕輕吹打沉澱並轉移至一個試管中，用角度轉子以27,000g類似地離心30分鐘。除去上清，沉澱中加入約10ml BSS，4℃靜置過夜。用Komagome型廣口移液管輕輕吹打沉澱，4℃以3000rpm低速離心10分鐘(制動閘關閉)，從而除去尚未徹底除去的組織碎片和病毒凝集塊。將上清轉移至新的無菌試管中，4℃保存，作為純化的病毒備用。
將0.9ml BSS加入0.1ml該病毒液中，用分光光度計測定540nm處的吸收值。將病毒滴度轉換為紅細胞凝集活性(HAU)。540nm處的吸收值為1約相當於15,000 HAU。據認為，HAU與融合活性基本成正比。此外，紅細胞凝集活性可利用含雞紅細胞(0.5％)的溶液進行真實地測定(見「動物細胞操作實用手冊」)，REALIZE公司(內田，大石，古沢編)，259-268，1984)。
此外，必要時可利用蔗糖密度梯度純化HVJ。具體是，將病毒懸浮液轉移至已將60％和30％的蔗糖溶液(已高壓滅菌)分層的離心管中，以62,800×g密度梯度離心120分鐘。離心後，回收60％蔗糖溶液中所發現的一條帶。將所回收的病毒懸浮液於4℃對BSS或PBS溶液透析過夜，以除去蔗糖。如果不必立即使用該病毒懸浮液，可加入甘油(已高壓滅菌)和0.5M EDTA(已高壓滅菌)至終濃度分別為10％和2-10mM，溫和凍存於-80℃，並最終凍存於液氮(該凍存可用10mM DMSO代替甘油和0.5M EDTA溶液)中。
(2.2利用層析柱和超過濾進行純化的方法)利用層析柱進行HVJ純化的方法也可取代通過離心進行純化的方法而應用於本發明。
簡單說，利用截留分子量為50,000的超濾膜進行濃縮(約10倍)和通過離子交換層析(0.3M-1M NaCl)進行洗脫均可達到純化的目的。
具體在本實施例中，用以下方法層析純化HVJ。
收集絨毛尿囊液，經濾膜(80μm-10μm)過濾。將0.006-0.008％BPL(終濃度)加至絨毛尿囊液中(4℃，1小時)，以滅活HVJ。將絨毛尿囊液於37℃保溫2小時以滅活BPL。
用500 KMWCO(A/G Technology，Needham，Massachusetts)經切向流超濾法濃縮約10倍。所用緩衝液為50mM NaCl，1mM MgCl2，2％甘露醇，以及20mM Tris(pH7.5)。HAU分析表明，HVJ產量接近100％。故，獲得了極好的結果。
用Q Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech KK，Tokyo)經柱層析純化法(緩衝液20mM Tris HCl(pH7.5)，0.2-1M NaCl)可純化HVJ。產量為40-50％，純度為99％或更高。
用500 KMWCO(A/G Technology)經切向流超濾法濃縮HVJ級分。
(3HVJ的滅活)如果必須滅活HVJ，可如下通過UV光輻射或烷基化試劑處理而實施。
(3.1UV光輻射法)將1ml HVJ懸浮液置於一個直徑30mm的平皿中，接受99或198mJ/cm2的輻射。也可使用γ射線輻射(5-20Gy)，但它不能徹底滅活。
(3.2用烷基化試劑進行處理)使用前，在10mM KH2PO中製備0.01％β-丙醇酸內酯。製備期間將該溶液保持在4℃，操作應快速完成。
將β-丙醇酸內酯加入剛剛完成純化的HVJ懸浮液中至終濃度為0.01％，於冰上靜置60分鐘。然後於37℃將該混合物保溫2小時，再分配至Eppendorf管(10,000 HAU/管)，以15,000rpm離心15分鐘。沉澱物-20℃保存。不用上述滅活法，無需將沉澱物在-20℃保存，可經表面活性劑處理摻入DNA，從而構建一個載體。
(4HVJ包膜載體的構建)將含有200-800μg外源DNA的92μl溶液加入保存的HVJ中，吹打使之充分懸浮。將該溶液於-20℃保存至少3個月。DNA在與HVJ混合前加入硫酸魚精蛋白可將表達效力增強2倍或更多倍。
將所述混合物於冰上靜置1分鐘，加入8μl辛基葡糖苷(10％)。使該試管在冰上振動15秒，冰上靜置45秒。用表面活性劑進行處理的時間優選為1-5分鐘。也可用Triton-X00(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、CHAPS(3-[(3-氯醯氨基丙基)-二甲基氨]-1-丙烷磺酸)(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)、或NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)等表面活性劑代替辛基葡糖苷。Triton-X100，NP-40和CHAPS的終濃度分別優選為0.24-0.80％、0.04-0.12％、和1.2-2.0％。
加入1ml冷BSS，迅速將該溶液以15,000rpm離心15分鐘。在所得沉澱中加入300μl PBS或鹽水等，經渦旋或吹打使沉澱懸浮。可將該懸浮液直接用於基因轉移或可在-20℃保存後用於基因轉移。保存至少2個月後，該HVJ包膜載體維持了同樣的基因轉移效力。
(實施例9HVJ包膜載體中F1蛋白與HN蛋白之比)(1樣品製備)(i)將相當於10,000 HAU的純化HVJ以15,000rpm離心15分鐘，將沉澱懸浮於300μl PBS中，-20℃保存。
(ii)用紫外線(198mJ/cm2)對相當於10,000 HAU的純化HVJ進行輻射，然後以15,000rpm離心15分鐘，使沉澱懸浮於300μl PBS中，-20℃保存。
(iii)用紫外線(198mJ/cm2)對相當於10,000 HAU的純化HVJ進行輻射，然後以15,000rpm離心15分鐘。向沉澱中加入200μl pcLuci DNA(溶液92μl)，通過吹打來懸浮。將懸浮液置於冰上，加入8μl辛基葡糖苷(10％)。用手將試管振動15秒，於冰上靜置45秒。加入1ml冷BSS，迅速以15,000rpm離心15分鐘。此後，使沉澱懸浮於300μl PBS中，-20℃保存。
(2蛋白質電泳)將×5 Laemli樣品緩衝液加入三種樣品(5，10，20μl)中，進行10％SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳後，凝膠用考馬斯亮藍染色。脫色後，將凝膠貼在玻璃紙(cellophane)上，風乾。
(3蛋白質鑑定)將已電泳並染色的樣品插入LAS2000(富士膠捲，東京)(圖7)，測定對應於F1和HN的蛋白質帶的濃度。對每種樣品的三種不同量進行電泳。計算各自的F1/HN密度，並計算每份樣品的平均值和標準差。
(4結果)樣品(i)、(ii)和(iii)的F1/HN保持在約1.7。考慮到F1(51kD)和HN(68kDa)的分子量，分子比應為2.3。這與報導(實驗細胞研究，142，95-101，1985)一致，該報導中，F1/HN值約為2時，F1和HN所重構的脂質體具有最佳融合。在其他研究者所報導的重構類型中，該比例不同於野生型病毒的(病毒學雜誌，67，3312-3318，1993)。其它蛋白組合物在HVJ和HVJ包膜載體之間也基本相同。
(實施例10DNA向HVJ包膜載體中的包裹以及包裹率)(1HVJ包膜載體的電子顯微鏡顯像)(其中的DNA被包膜包裹或未被包膜包裹)如上述，將130μg pSFV-LacZ(14.5kb)包入10,000 HAU的HVJ(已用紫外線滅活)中，並製備HVJ包膜載體。
將已包入的HVJ包膜載體懸浮於300μl PBS中，-20℃保存。10天後，將1μl該懸浮液置於柵格(grid)中，負染後用電子顯微鏡進行觀察。用未包裹DNA的HVJ包膜載體作對照。
(結果)結果見圖8。大多數HVJ包膜載體具有基本相同於HVJ病毒本身所具有的外膜構象。與未包入DNA的HVJ包膜載體相比，在應用了DNA的HVJ包膜載體中可觀察到一種高電子密度結構。另一方面，所述未包裹的HVJ包膜載體具有較高的內部透光率，據此可推論病毒基因組已被破壞或丟失。
(2HVJ包膜載體中的DNA包裹率)將157μg pcLuci(7.4kb)以上述方式包裹至6,700 HAU的HVJ(UV滅活型)中，從而製備HVJ包膜載體。將該HVJ包膜載體懸浮於300μl BSS中，用15個單位的微球菌(Micrococcal)核酸酶、2mM CaCl2、以及20μg/ml RNA酶A於20℃處理30分鐘，對1L PBS透析(4℃，過夜)。將HVJ包膜載體用1％SDS於37℃處理1分鐘，再用500μl苯酚(phenol)和500μl氯仿-異戊醇處理，然後進行乙醇沉澱。將該沉澱物懸浮於100μl BSS中，用分光光度計測定260nm或280nm處的吸光度值。
(結果)產量為85.7％。將其轉化後，可得HVJ包膜載體中DNA摻入效率為3.8％。將279μg pcLuci摻入10,000 HAU的HVJ中時，效率為7.2％。
根據以上結果推斷，當使用辛基葡糖苷時，向10,000 HAU的HVJ中摻入DNA的效率約為6-7％，但根據DNA的使用量不同略有變化。此外，已發現當硫酸魚精蛋白與DNA和HVJ包膜載體同時存在時，導入效率提高，認為這是由於DNA被HVJ包膜載體包裹的效率得到提高。據推斷，使用Triton-X100或NP-40可使效率進一步提高約10-40％。
(實施例11藉助HVJ包膜載體將基因轉移至細胞)(1基因轉移方法)將1,000 HAU裝入Eppendorf管(30μl)中，加入5μl硫酸魚精蛋白(1mg/ml)。更換BHK-21細胞(其於前一天以200,000個細胞/孔的量接種在6個孔中)的培養基，每孔加0.5ml培養基(10％FCS-DMEM)。每孔加上述載體(相當於1,000 HAU)與硫酸魚精蛋白的混合物，前後左右搖晃該平板，使載體與細胞充分混合。將混合物於5％CO2培養箱中37℃保溫10分鐘。
更換培養基，於5％CO2培養箱中37℃保溫過夜(16-24小時)，然後檢查基因表達。如果檢查螢光素酶(pcLuci帶有CMV啟動子的螢光素酶基因)，則細胞用0.5ml細胞裂解緩衝液(Promega)裂解，用螢光素酶分析試劑盒(Promega)測定20μl溶液的活性。如果是綠色螢光蛋白(pCMV-GFPE；Promega)，則在螢光顯微鏡下觀察完整細胞，放大400倍的情況下觀察5-8個視野，計算發出螢光的細胞的比率。
(2有關培養細胞之導入效力的影響條件的研究)用BHK-21細胞作為培養的細胞。
(2.1對HVJ包膜載體的製備中辛基葡糖苷(OG)濃度的研究)對上述(1)的基因轉移方法進行以下改變，並檢查辛基葡糖苷(OG)在以下濃度(即用於製備HVJ包膜載體時的OG終濃度)之時通過HVJ包膜載體對基因轉移的影響(A)辛基葡糖苷濃度1、2、或3％；製備HVJ包膜載體時滅活的HVJ接受OG處理的時間1分鐘、5分鐘、或10分鐘；進行或不進行超聲處理(聲處理)。
(B)辛基葡糖苷濃度0.125-1.25％；用於轉染的載體的體積10μl，100μl。
(C)辛基葡糖苷0.55-0.8％；轉染時間30分鐘，過夜(O/N)。
結果見圖9。
(2.2向細胞內轉移基因的條件，硫酸魚精蛋白(PS)的濃度/處理時間)對上述(1)的基因轉移方法進行以下改變，並檢查硫酸魚精蛋白通過HVJ包膜載體對基因轉移的影響(A)硫酸魚精蛋白濃度0-100μg/ml培養基；轉染時間20、40、或60分鐘。
(B)硫酸魚精蛋白濃度0-40μg/ml培養基；轉染時間5、10、或20分鐘。
結果見圖10。
(2.3包入HVJ包膜載體的DNA的濃度對基因表達水平的影響)對上述(1)的基因轉移方法進行以下改變，並檢查該實驗所用DNA量通過HVJ包膜載體對基因轉移的影響(A)DNA量20-200μg；將HVJ包膜載體於-20℃或-80℃保存5天。
(B)DNA量180-360μg/HVJ10,000 HAU。
結果見圖11。
(2.4用於基因轉移的HVJ滴度對基因表達水平的影響)對上述(1)的基因轉移方法進行以下改變，並檢查基因轉移所用HVJ滴度通過HVJ包膜載體對基因表達量的影響利用滴度為5,000、10,000、或20,000 HAU的HVJ製備HVJ包膜載體，用相當於250、500、1,000、或2,000 HAU的量轉染BHK-21細胞。
結果見圖12。
(2.5HVJ滅活條件對HVJ包膜載體的基因轉移效力的影響)對上述(1)的基因轉移方法進行以下改變，並檢查HVJ滅活方法(UV或β-丙醇酸內酯)對BHK-21細胞中螢光素酶基因表達的影響(A)用於UV輻射的輻射量0-231mJ/cm2。
(B)用於HVJ處理的β-丙醇酸內酯(BPL)的濃度0-0.025％。
結果見圖13。
(實施例12利用HVJ包膜載體將基因轉移至各種細胞)根據本發明實施例11所述，將基因轉移至人舌上的鱗狀細胞癌(SAS)中。結果見圖14。通過基因轉移，用於轉染的硫酸魚精蛋白濃度和保溫時間發生變化，如圖14所示，根據螢光素酶基因的表達來測定基因轉移效力。在用於轉染的條件下，當用200μg/ml硫酸魚精蛋白轉染60分鐘時，基因轉移的效力最大。但通過進一步增加硫酸魚精蛋白的濃度，有望進一步提高基因轉移效力。
用本發明實施例11的方法向人的主動脈內皮細胞(HAEC)中導入基因。結果見圖15。
通過基因轉移，用於轉染的硫酸魚精蛋白濃度和保溫時間發生變化，如圖15所示，根據螢光素酶基因的表達來測定基因轉移效力。在用於轉染的條件下，當用100μg/ml硫酸魚精蛋白轉染60分鐘時，基因轉移的效力最大。但通過進一步增加硫酸魚精蛋白的濃度，有望進一步提高基因轉移效力。
(實施例13利用HVJ包膜載體將基因轉移至各種類型的體內組織中)本實施例描述利用實施例11所述的HVJ包膜載體將基因轉移至各種類型的體內組織中。
(13.1小鼠肝臟)將0.8％辛基葡糖苷與200μg pcLuci(其已懸浮於300μl PBS中)一起在冰上靜置1分鐘，由此製備HVJ包膜載體。所製備的懸浮液取1/10(30μl，相當於l,000 HAU)，用70μl PBS稀釋(總量100μl)，將該稀釋液注射至小鼠(C57BL/6)肝臟的一個小葉中。
通過與200μg pcLuci一起渦旋/擠壓，然後進行蔗糖梯度離心(62000g，90分鐘)，可製備HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂質體。然後通過離心(27000g，30分鐘)使該製劑沉澱，將沉澱懸浮於500μl PBS中。取100μl該樣品注射至小鼠(C57BL/6)肝臟的一個小葉中。
24小時後，分離所注射的肝臟小葉，用螢光素酶分析系統(Promega)分析肝小葉的螢光素酶活性。
結果見圖16A。這些結果清楚表明，本發明的HVJ包膜載體顯示了非常高的基因轉移效力，該效力比傳統HVJ-AVE脂質體的基因轉移效力高出約2倍。
(13.2小鼠子宮)如13.1所述製備HVJ包膜載體。將50μl和100μl樣品用PBS稀釋至500μl，灌注至小鼠的輸卵管，將子宮頸結紮10分鐘。24小時後，分離小鼠子宮，用螢光素酶分析系統(Promega)分析小葉或子宮的螢光素酶活性。結果見圖16B。本發明的HVJ包膜載體能將基因轉移至小鼠子宮中，而利用HVJ-AVE脂質體的方法向子宮組織轉移基因則不顯示可檢測到的轉移水平。
含pcLuci的HVJ包膜載體如13.1所述製備。為了進行LacZ表達，用200μg pEB-CMV-LacZ(13kb)製備含有該質粒的HVJ包膜載體。將含有這些質粒的HVJ包膜載體如上注射至子宮中。結果見圖16C。通過LacZ染色，測得LacZ基因的表達主要見於子宮內膜的腺上皮中。
(13.3大鼠腦部)用與上述含pcLuci之HVJ包膜載體的製備方法類似的方法製備含pEGFP-1(即，已將水母的綠色螢光蛋白基因(約0.7kb)引入攜有巨細胞病毒啟動子的表達載體中的一種載體；可得自Clontech，Palo Alto，CA)的HVJ包膜載體。將30μl該載體(相當於1000 HAU，該製品的1/10)注射至SD(Sprague-Dawley)大鼠的頸動脈或經小腦延髓池注射至髓腔內。基因轉移的3-4天後，將大鼠處死，製備腦組織切片但不固定。在螢光顯微鏡下觀察螢光。如圖16D的結果所示，綠色螢光蛋白(GFP)的腦內表達在注射至頸動脈或經小腦延髓池注射至髓腔內的情況下都可觀察到。另一方面，當利用HVJ-AVE脂質體經大鼠頸動脈進行類似的基因轉移時，未觀察到腦內GFP表達。
(13.4家兔眼部)pCMV-NK4由大阪大學醫學系研究科中村敏一教授等友情贈送，該質粒是將人HGF(肝細胞生長因子)基因的突變體，NK4 cDNA(1.4kb)克隆至pCDNA3(In Vitrogen，San Diego，CA)的HindIII/XbaI位點而構建成的。
用與上述含pcLuci之HVJ包膜載體的製備方法類似的方法製備HVJ包膜載體，不同的是，使用400或800μg pCMV-NK4以及10000 HAU的滅活HVJ。pCMV-NK4是表達能抑制HGF功能的HGF突變體的一種載體。將50μl該載體(1/6的該製品)注射至已用重組VEGF塊處理以誘導血管生成的家兔角膜組織中。7天後，將家兔處死，觀察眼內的血管生成。結果如圖16E所示。pCMV-NK4以劑量依賴的方式抑制由VEGF誘導的血管生成。
(13.5大鼠肺動脈)用與上述含pcLuci之HVJ包膜載體的製備方法類似的方法製備含pSV-LacZ(Promega，Madison，WI)的HVJ包膜載體，其中pSV-LacZ含有在SV40啟動子控制下的LacZ基因。將50μl該載體(1/6的該製品)注射至大鼠氣管。基因轉移的3天後，將大鼠處死，組織用1％戊二醛固定，然後用X-gal顯像動脈中的LacZ表達。結果見圖16F。在將HVJ包膜載體經肺動脈引入的情況下，也觀察到支氣管上皮中有基因表達(資料未顯示)。
(實施例14病毒包膜載體作為藥物運送系統(DDS)的功能)本發明的基因轉移載體還可作為寡核苷酸或誘餌(decoy)核酸治療的有效藥物運送系統。
(14.1螢光寡核苷酸的導入)利用本發明的病毒包膜載體將螢光標記的寡核苷酸導入細胞。
20體寡核苷酸(5』-CCTTgAAGGGATTTCCCTCC-3』)(194μg/92μlBSS)在其5』位置用FITC標記，將其與10,000 HAU的HVJ(已用198mJ/cm2的紫外線滅活)沉澱混合。加入TritonX-100(終濃度0.24％)，將該混合物於冰上靜置1分鐘。加入1μl BSS，將該混合物離心(15,000rpm，15分鐘，4℃)。在沉澱中加入100μl PBS，將該混合物保存在-20℃。1個月後，將該混合物解凍，取10μl與5μg硫酸魚精蛋白混合，與5,000,000 BHK-21細胞(於0.5ml培養基中)一起保溫(10分鐘，60分鐘)。導入後的第二天，在螢光顯微鏡下觀察細胞的螢光。結果，10分鐘後獲得約10％的寡核苷酸導入效率(圖17B)，60分鐘後寡核苷酸已導入80％或更多的細胞(圖17B)。
(14.2用Stat6誘餌核酸治療接觸性皮炎)利用本發明的病毒包膜載體將誘餌核酸導入細胞。
將含有Stat6 DNA結合序列(5』-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT-3』和5』-CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA-5』，(Wang，L.H.等血液95，1249-1257，2000))的雙鏈核酸(250μg/300μl BSS)與30,000 HAU的HVJ(已用99mJ/cm2的紫外線滅活)沉澱混合。
加入TritonX-100(終濃度0.24％)，將該混合物於冰上靜置1分鐘。加入1ml BSS，將該混合物離心(15,000rpm，15分鐘，4℃)。在沉澱中加入300μlPBS，將該混合物保存在-20℃。給小鼠皮下注射該HVJ包膜載體，導致對IgE-誘導型變態反應和遲髮型皮膚反應的抑制。
(實施例15向懸浮細胞中進行基因轉移)用CCRF-CEM、NALM-6、K-562(其類似人白血病細胞)進行基因轉移實驗。
將200μg pCMV-螢光素酶(92μl)與10,000 HAU的滅活HVJ(99mJ/cm2紫外線)沉澱混合。
加入Triton X-100(終濃度0.24％)，將該混合物於冰上靜置1分鐘。加入1ml BSS，將該混合物離心(15,000rpm，15分鐘，4℃)。在沉澱中加入300μlPBS，由此製備HVJ包膜載體。使60μl載體(相當於2,000 HAU)、硫酸魚精蛋白、及4,000,000該懸浮細胞在1.5ml Eppendorf管中混合，離心(10,000-15,000rpm，10分鐘，20℃)。然後，在沉澱中加入培養液，將混合物置於培養皿中。1天後，測定細胞的螢光素酶活性。
所用細胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)當使用HVJ-脂質體或現有脂質體試劑(Gibco BRL的脂質轉染胺試劑(Lipofectamine)，脂質轉染試劑(lipofectin))時顯示極低的導入效率。但如圖18所示，觀察到較高的向這些細胞中轉移基因的效力。
優選的基因轉移條件如下加入600-1,000μg/ml硫酸魚精蛋白，於20℃以10,000rpm或15,000rpm離心10分鐘。未觀察到與HVJ包膜載體相關的顯著細胞毒活性。離心和硫酸魚精蛋白的添加是基因轉移所必需的。
(實施例16向癌組織的基因轉移)將354μg pCMV-螢光素酶(92μl)與34,000 HAU的滅活HVJ(99mJ/cm2紫外線)沉澱混合。加入Triton X-100(終濃度0.24％)，將該混合物於冰上靜置1分鐘。加入1ml BSS，將該混合物離心(10,000rpm-15,000rpm，10分鐘，20℃)。在沉澱中加入300μl PBS，-20℃保存。1天後，將該混合物與500μg/ml或1000μg/ml硫酸魚精蛋白混合。取100μl注射至小鼠黑素瘤B16-F1的腫瘤實體(直徑7-8mm)中。1天後測定螢光素酶活性。如圖19所示，在腫瘤實體中觀察到基因表達。優選硫酸魚精蛋白的濃度為500μg/ml。另一方面，使用較低濃度的硫酸魚精蛋白檢測不到基因表達。
(實施例17皰疹病毒包膜載體的製備)(17.1滅活病毒的製備)單純皰疹病毒1型(HSV-1)(1010空斑形成單位/ml)由大阪大學醫學系研究科細菌學專業的山西教授友情贈送。根據培養的猴細胞(Vero細胞)中病毒空斑的形成來檢查該病毒的滅活條件。當病毒用β-丙醇酸內酯(BPL)0.05％滅活時，空斑以9.1×10-4(空斑/Vero細胞)的頻率出現在Vero細胞中。另一方面，當病毒用200或400mJ/cm2紫外線滅活時，空斑出現頻率分別為4.3×10-4或2.2×10-6(空斑/Vero細胞)。
(17.2利用滅活病毒進行的基因轉移)將100μl HSV-1(109顆粒)用620μl PBS稀釋，用400mJ/cm2紫外線照射該稀釋液。取其10％(72μl)與DNA(pCMV-螢光酶素8.83μg/μl)混合。於冰上加入8μl 3％ TritonX-100(終濃度0.24％)，1、2、3、4、5、或6分鐘後，加入1ml PBS以稀釋該溶液。每種樣品取100μl，導入BHK-21細胞(在6孔板中)。將細胞培養在含10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco極限必需培養基(DME)中。在另一實驗中，每種樣品取100μl與5μg硫酸魚精蛋白混合，然後導入BHK-21中。將樣品於培養箱(37℃，5％CO2)中放置60分鐘後，培養液用10％FCS-DME更換。22小時後測定螢光素酶活性。如圖20所示，用本發明方法製備的皰疹病毒包膜載體具有較高基因轉移效力。經形態學觀察，沒有一種樣品顯示任何細胞毒活性。
皰疹病毒包膜載體用Triton-X100處理5分鐘，於-80℃保存2天，然後解凍，再次加入BHK-21細胞中，測定導入效力。這一次，在導入後60分鐘時加入10％FCS-DME(2.5ml/孔)，培養過夜，然後測定活性。對血清的效應以及載體的量進行研究。
如圖21所示，即使在-80℃保存2天後仍具有較高基因轉移效力。用添加了10％血清的培養基比用無血清培養基的導入效力高。用200μl載體溶液(估計2.8×107個病毒顆粒/孔)比用100μl載體溶液(估計1.4×107個病毒顆粒/孔)的基因轉移活性高。
(17.3利用滅活病毒進行的基因轉移)根據以上內容，本領域技術人員可顯而易見地認識到，本發明利用表面活性劑產生包膜載體的技術不僅可應用於HVJ，還可應用於更大範圍的具有脂質膜的包膜病毒。因此，本領域技術人員顯然可輕易地利用任何其它包膜病毒，按本發明的公開內容，製備用於基因轉移的包膜載體。從而可產生利用了屬於逆轉錄病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、彈狀病毒科、痘病毒科、皰疹病毒科、杆狀病毒科、嗜肝DNA病毒科等的病毒的包膜載體。相應地，可以認為，將目標導入特定器官可利用病毒的組織針對性來實現。例如，利用了皰疹病毒的包膜載體可作為導向神經的載體來應用；利用Epstein-Barr病毒的包膜載體可作為導向淋巴細胞的載體來應用；利用了流感病毒的包膜載體可作為導向呼吸器官的載體來應用。
因此，本發明的具體實施方案在本說明書中作為舉例來描述。但顯然，在不違背本發明的精神和範圍的前提下可作各種修改。具體是，儘管本說明書中的實施例在利用滅活型HVJ的基因轉移載體方面進行了描述，但本領域技術人員顯然可根據本說明書的公開內容，利用不同於HVJ的其它滅活病毒製備本發明的基因轉移載體，也可不通過滅活步驟而利用類似的製備方法來製備本發明的基因轉移載體。因此，本發明僅由所附權利要求書來限定。
工業實用性本發明提供了一種新的基因轉移方法，該方法操作簡單並具有很好的基因轉移效力。據認為這使得能快速篩選基因文庫。本發明還提供了一種進行大量篩選的試劑盒，它包含本發明的病毒包膜載體。此外，本申請提供的病毒包膜載體可耐受較長期的冷凍保存，使得它無需在使用時臨時製備。從而可極大地簡化操作過程，並可實現以大量產生的導入載體為基礎的勻質基因轉移。此外，本發明的基因轉移載體使得基因轉移比任何傳統的基於HVJ製備的載體更有效，並使得可將基因轉移至比傳統方法更大範圍的體內組織中。
本發明還提供了含有本發明基因轉移載體的用於給與藥物的藥物運送系統，藥物篩選系統，以及用於基因治療的載體。
權利要求
1.一種含有病毒包膜的基因轉移載體。
2.權利要求1的基因轉移載體，其中所述病毒衍生自野生型病毒或重組病毒。
3.權利要求1或2的基因轉移載體，其中所述病毒衍生自屬於逆轉錄病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、彈狀病毒科、痘病毒科、皰疹病毒科、杆狀病毒科和嗜肝DNA病毒科的病毒。
4.權利要求3的基因轉移載體，其中所述病毒是HVJ。
5.權利要求1-4中任一項的基因轉移載體，其中所述基因轉移載體利用含以下步驟的方法來製備將所述病毒與一種外源基因混合；和將該混合液冷凍和解凍2次或更多次。
6.權利要求1-4中任一項的基因轉移載體，其中所述載體利用以下方法來製備，所述方法包括將該病毒與一種外源基因在有表面活性劑存在時進行混合的步驟。
7.權利要求5或6的基因轉移載體，其中所述方法進一步包括滅活所述病毒的步驟。
8.權利要求7的基因轉移載體，其中所述表面活性劑選自辛基葡糖苷、Triton-X100、CHAPS和NP-40。
9.權利要求8的基因轉移載體，其中所述表面活性劑是辛基葡糖苷。
10.權利要求1-9中任一項的基因轉移載體，其中所述方法進一步包括將硫酸魚精蛋白添加至所述外源基因的步驟。
11.權利要求1-10中任一項的基因轉移載體，其用於將基因導入動物體內組織中。
12.權利要求11的基因轉移載體，其中所述組織選自肝臟、骨骼肌、子宮、腦、眼、頸動脈、皮膚、血管、肺、心臟、腎臟、脾臟、癌組織、神經、B淋巴細胞、以及呼吸系統的組織。
13.一種用於基因治療的藥用組合物，其包含權利要求1-12的基因轉移載體。
14.一種用於篩選基因文庫的試劑盒，其包含權利要求1-12的基因轉移載體。
15.一種製備基因轉移載體的方法，所述載體包含用於基因轉移的病毒包膜，所述方法包括以下步驟將所述病毒與一種外源基因混合；和將該混合液冷凍和解凍2次或更多次。
16.一種製備基因轉移載體的方法，所述載體括包含用於基因轉移的病毒包膜，所述方法包括以下步驟將所述病毒與一種外源基因在有表面活性劑存在的情況下混合。
17.權利要求15或16的方法，進一步包括滅活所述病毒的步驟。
18.一種將基因導入分離的動物組織中的方法，該方法包括以下步驟製備如權利要求1-12中任一項所述的基因轉移載體，該載體含有所需的外源基因；和通過該基因轉移載體將基因導入分離的動物組織。
19.一種將外源基因導入懸浮細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述懸浮細胞與權利要求1-12中任一項的基因轉移載體在有硫酸魚精蛋白存在的情況下混合；和離心該混合液。
全文摘要
本發明通過將外源基因導入滅活病毒的包膜，經由凍融處理或與表面活性劑混合，來製備基因轉移載體。本發明還提供含有該基因轉移載體的基因治療藥用組合物，含有該基因轉移載體的試劑盒，以及應用該基因轉移載體的基因轉移方法。
文檔編號A61K48/00GK1657103SQ200410100219
公開日2005年8月24日 申請日期2001年2月2日 優先權日2000年2月2日
發明者金田安史 申請人:安增子摩祺株式會社, 金田安史