石油降解菌群與表面活性劑聯合降解水中脫水原油的方法
2023-12-04 15:02:41
石油降解菌群與表面活性劑聯合降解水中脫水原油的方法
【專利摘要】本發明涉及環境生物【技術領域】，旨在提供一種石油降解菌群與表面活性劑聯合降解水中脫水原油的方法。具體步驟如下：(1)取石油汙染土壤樣品，放入裝有石油烴降解菌培養基的三角瓶到前述三角瓶中培養5天；取部分培養液轉移至新的培養基中，加入原油繼續培養5天；重複進行再培養3次後得到石油烴降解菌群；(2)取培養基和石油烴降解菌群，加入脫水原油後加入表面活性劑，恆溫振蕩培養以降解所加入的脫水原油。本發明能以徹底、高效、低成本的方式修復頑固脫水原油對環境的危害；本發明中富集菌群的方法簡便、快捷，僅使用本發明中得到的菌群即可以在35天把10mg原油降解88％，與僅使用菌群降解相比，降解效率加快一倍。
【專利說明】石油降解菌群與表面活性劑聯合降解水中脫水原油的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於環境生物【技術領域】，特別涉及一種微生物與表面活性劑聯合降解脫水 原油的方法。
【背景技術】
[0002] 石油是現代社會的最主要能源之一，被稱作"工業的血液"、"黑色的金子"。原油經 過提煉可以製成各種燃料和化工原料，包括天然氣、汽油、煤油、揮髮油、潤滑油、石蠟和浙 青等。但在原油的加工、使用及運輸過程中不可避免的會造成溢灑及洩漏事故，造成汙染。 石油是由多種烴類、少量非烴化合物組成的複雜混合物。原油難以被降解，長時間存在於環 境中。國內外處理石油汙染有物理方法、化學方法、生物方法三類，其中物理方法包括焚燒 法、隔離法和換土法等，化學方法主要有萃取法、土壤洗滌法以及化學氧化法等。物理方法 及化學方法存在處理成本高、汙染物處理不徹底的問題。
[0003] 微生物降解原油的方法也存在一定的局限性，比如速率低、周期長等。原油汙染物 多屬於疏水性有機汙染物，提高汙染物溶解於水中的含量能夠提高石油烴降解菌的降解效 率。許多石油烴降解菌在降解過程中會產生生物表面活性劑，對疏水汙染物起到增溶、乳 化的作用。但是微生物自身分解表面活性劑效率較低，所以通過外加表面活性劑的形式促 進其降解是一種可行方法。市面上表面活性劑種類龐多，而且大多數表面活性劑對於微生 物都有毒性影響。對於本身降解效率很低的微生物方法來說，過低的表面活性劑濃度甚至 未達到臨界膠束濃度而不能起到促進修復的作用，而過高的表面活性劑濃度又會毒害微生 物。所以，研究不同種類、不同濃度的表面活性劑與微生物聯合的修復效果具有非常重要的 意義。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種微生物與表面活 性劑聯合降解脫水原油的方法。
[0005] 為解決技術問題，本發明的解決方案是：
[0006] 提供一種微生物與表面活性劑聯合降解脫水原油的方法，具體步驟如下：
[0007] (1)石油烴降解菌群的富集：
[0008] a :將 65mg Κ2ΗΡ04、25· 5mg KH2PO4'133. 8mg Na2HPO4 · 12H20、500mg NH4C1、82. 5mg CaCl2、67. 5mg MgSO4 · 7H20、0. 75mg FeCl3 · 6H20 和 IOOOmL 去離子水進行混合，調節 pH 值 為7. 0 ;取配製好的溶液IOOmL加入到IL的三角瓶中，在120°C溫度下滅菌20min，得到裝 有石油烴降解菌培養基的三角瓶；
[0009] b :稱取Ig石油汙染土壤樣品，放入到前述三角瓶中；三角瓶放置在恆溫振蕩箱 中，保持溫度30°C、轉速180r/min，培養5天；
[0010] c :按步驟a中方法獲得第二個有石油烴降解菌篩選培養基的三角瓶，吸取IOmL步 驟b三角瓶中的培養液轉移至該第二個三角瓶中，並加入0. Olg原油，然後將該第二個三角 瓶放置在恆溫振蕩箱中，保持溫度30°C、轉速180r/min，培養5天；
[0011] d :吸取IOmL步驟c中經5天培養後的培養液，並按照步驟c的方法進行再培養； 重複再培養3次後，最終得到的液體為石油烴降解菌群；
[0012] (2)加入表面活性劑對脫水原油進行降解：
[0013] 取上述步驟（1)的步驟a中獲得的石油烴降解菌培養基10mL，取上述步驟（1)的 步驟d中得到的石油烴降解菌群lmL，一併放入到50mL的三角瓶中；然後在該三角瓶中加 入脫水原油〇. Olg ;再加入表面活性劑ImL ;放置在恆溫振蕩箱中，保持在溫度30°C、轉速 180r/min條件下進行培養以降解所加入的脫水原油。
[0014] 本發明步驟（2)中所述表面活性劑是下述任意一種：
[0015] 濃度22. 27mg/L的聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（Tw-80);濃度2500mg/L的十二 烷基硫酸鈉（SDS);濃度1000mg/L的十二烷基苯磺酸鈉（LAS);
[0016] 聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯與十二烷基硫酸鈉混合液（Tw-80+SDS)，其中聚氧 乙烯脫水山梨醇單油酸酯與十二烷基硫酸鈉混合液的摩爾比為1 : 30,聚氧乙烯脫水山梨 醇單油酸酯的濃度為26. 30mg/L ;
[0017] 聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯與十二烷基苯磺酸鈉的混合液（TW-80+LAS)，其中 聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯與十二烷基苯磺酸鈉的混合液的摩爾比為1 : 30,聚氧乙烯 脫水山梨醇單油酸酯的濃度22. 27mg/L。
[0018] 本發明中所述的所述脫水原油為從井中採出後，經過脫水工藝的油。
[0019] 本發明中所述的石油汙染土壤樣品為在油田採油井50mX50mX 20cm範圍內的土 壤。
[0020] 本發明中所述的石油烴降解菌群，保藏於浙江大學紫金港校區農生環組團大樓B 座Peen-Lab實驗室，保藏編號為Pffffl。該菌群已在Genebank提交，其登錄號為SRP045724。
[0021] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0022] (1)本發明中對於油井附近經過脫水工藝的原油的降解有著非常重要的意義，此 種原油因其複雜的化學物質組成和難溶性的物理性質而更難以降解，對水體、土壤這有嚴 重而又持久的危害影響，甚至會通過食物鏈對人體造成危害，本發明中的方法能以徹底、 高效、低成本的方式修復頑固脫水原油對環境的危害；(2)本發明中富集菌群的方法簡便、 快捷，僅使用本發明中得到的菌群即可以在35天把IOmg原油降解88% (附圖2) ; (3)本 發明中石油降解菌群與表面活性劑聯合降解之後與僅使用菌群降解相比，降解效率加快一 倍，效果最好的處理為表面活性劑Tw-80 (濃度22. 27mg/L)、SDS (濃度2500mg/L)、LAS (濃 度 1000mg/L)、Tw-80 與 SDS 混合（比例 1 :30, Tw-80 濃度 26. 30mg/L)、Tw-80 與 LAS 混合 (比例 1 :30, Tw-80 濃度 22. 27mg/L)，最後降解率分別為 97%、88%、98%、88%、98%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1本發明中從汙染土壤中富集石油烴降解菌群的過程示意圖；
[0024] 圖2本發明中石油烴降解菌群降解脫水原油效果示意圖；
[0025] 圖3本發明中石油降解菌群分別與表面活性劑Tw_80(Cl、c2、C 3)聯合降解脫水原 油降解率示意圖（C1 濃度=20. 00mg/L、C2 濃度=22. 27mg/L、C3 濃度=26. 30mg/L);
[0026] 圖4本發明中石油降解菌群分別與表面活性劑Tw_80、SDS、LAS聯合降解脫水原油 降解率示意圖（濃度分別為26.301^/1、25001^/1、100011^/1);
[0027] 圖5石油降解菌群分別與混合表面活性劑（Tw-80+SDS、Tw-80+LAS)聯合降解脫水 原油降解率示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 以下的實施例可以使本專業【技術領域】的技術人員更全面的了解本發明，但不以任 何方式限制本發明。
[0029] 實施例1 :
[0030] 本例用石油烴降解菌群與表面活性劑Tw-80 (C1濃度、C2濃度、C3濃度）聯合降解 脫水原油，具體步驟如下：
[0031] 步驟（1)、富集石油烴降解菌群：
[0032] a :稱取Ig石油汙染土壤樣品，放入到有石油烴降解菌培養基的IL的三角瓶中；
[0033] b :上述石油烴降解菌培養基配方如下：將65mg K2HP04、25.5mg KH2P04、133.8mg Na2HPO4 · 12H20,500mg NH4C1,82. 5mg CaCl2,67. 5mg MgSO4 *7H20,0. 75mgFeCl3 *6H20U000mL 去離子水進行混合，調節pH值為7. 0,取上述配製的溶液IOOmL加入到IL的三角瓶中，在 120°C溫度下滅菌20min。為實驗中所用的有石油烴降解菌培養基的三角瓶；
[0034] c :將上述a中三角瓶放置在恆溫振蕩箱中，溫度保持在30°C、轉速180r/min，培養 5天；
[0035] d :5天後，吸取上述三角瓶中IOmL培養液轉移到上述b中新的有石油烴降解菌篩 選培養基的三角瓶中，並加入〇. Olg原油，然後將所述培養基放置在恆溫振蕩箱中，溫度保 持在30°C、轉速180r/min，培養5天；
[0036] e :按照上述d步驟重複3次，最終三角瓶中的液體為石油烴降解菌群；
[0037] 步驟（2)、加入不同的表面活性劑與石油烴降解菌群結合，對脫水原油進行降解：
[0038] 取上述步驟（l)b中配製的石油烴降解菌培養基10mL，和上述步驟（I)e中得到的 石油烴降解菌群lmL，放入到50mL的三角瓶中；然後在上述三角瓶中加入脫水原油0. Olg ; 再加入表面活性劑Tw-80 (C1濃度、C2濃度、C3濃度）ImL ;放置在恆溫振蕩箱中，溫度保持在 30°C、轉速180r/min條件下進行培養，以降解其中的原油。
[0039] 按上述步驟（2)設置三角瓶，分成三組；三組處理對應加入如下表所設置不同濃 度的不同表面活性劑，除加入的表面活性劑不同，其餘條件均相同：
[0040] 表Ic1濃度Tw-80、C2濃度Tw-80、C 3濃度Tw-80實驗組設計
[0041]
【權利要求】
1. 石油降解菌群與表面活性劑聯合降解水中脫水原油的方法，其特徵在於，具體步驟 如下： (1) 石油烴降解菌群的富集： a:將65mg K2HP04、25.5mg KH2P04、133.8mg Na2HP04.12H20、500mg NH4Cl、82.5mg CaCl2、 67. 5mg MgS04 ? 7H20、0. 75mg FeCl3 ? 6H20 和 lOOOmL 去離子水進行混合，調節 pH 值為 7. 0 ; 取配製好的溶液100mL加入到1L的三角瓶中，在120°C溫度下滅菌20min，得到裝有石油烴 降解菌培養基的三角瓶； b :稱取lg石油汙染土壤樣品，放入到前述三角瓶中；三角瓶放置在恆溫振蕩箱中，保 持溫度30°C、轉速180r/min，培養5天； c :按步驟a中方法獲得第二個有石油烴降解菌篩選培養基的三角瓶，吸取10mL步驟 b三角瓶中的培養液轉移至該第二個三角瓶中，並加入0. Olg原油，然後將該第二個三角瓶 放置在恆溫振蕩箱中，保持溫度30°C、轉速180r/min，培養5天； d :吸取10mL步驟c中經5天培養後的培養液，並按照步驟c的方法進行再培養；重複 再培養3次後，最終得到的液體為石油烴降解菌群； (2) 加入表面活性劑對脫水原油進行降解： 取上述步驟（1)的步驟a中獲得的石油烴降解菌培養基10mL，取上述步驟（1)的步驟 d中得到的石油烴降解菌群lmL，一併放入到50mL的三角瓶中；然後在該三角瓶中加入脫 水原油〇. Olg ;再加入表面活性劑lmL ;放置在恆溫振蕩箱中，保持在溫度30°C、轉速180r/ min條件下進行培養以降解所加入的脫水原油。
2. 根據權利要求1中所述的方法，其特徵在於，步驟⑵中所述表面活性劑是下述任意 一種： 濃度22. 27mg/L的聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯；濃度2500mg/L的十二烷基硫酸鈉； 濃度l〇〇〇mg/L的十二燒基苯磺酸鈉； 聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯與十二烷基硫酸鈉混合液，其中聚氧乙烯脫水山梨醇單 油酸酯與十二烷基硫酸鈉混合液的摩爾比為1 : 30,聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯的濃度 為 26. 30mg/L ; 聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯與十二烷基苯磺酸鈉的混合液，其中聚氧乙烯脫水山梨 醇單油酸酯與十二烷基苯磺酸鈉的混合液的摩爾比為1 : 30,聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸 酯的濃度22. 27mg/L。
3. 根據權利要求1中所述的微生物與表面活性劑聯合降解脫水原油的生物方法，其特 徵在於，所述脫水原油為從油井中採出後，經過脫水工藝的油。
4. 根據權利要求1中所述的微生物與表面活性劑聯合降解脫水原油的生物方法，其特 徵在於，所述石油汙染土壤樣品為在油田採油井50mX 50mX 20cm範圍內的土壤。
【文檔編號】B09C1/10GK104353667SQ201410532922
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優先權日:2014年10月10日
【發明者】趙和平, 孟帆, 溫麗蓮, 賴春宇, 羅一豪, 陳冉 申請人:浙江大學