一種多表位瘧疾疫苗及其編碼基因的製作方法

2023-11-03 18:55:47 1

專利名稱：一種多表位瘧疾疫苗及其編碼基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗及其編碼基因，特別是涉及一種瘧疾疫苗及其編碼基因。
瘧原蟲生活史複雜，歷經了4個不同的時期首先是感染的按蚊在叮咬時將瘧原蟲子孢子注入血液，然後在幾分鐘內子孢子迅速到達肝臟侵入肝細胞，接著在1-2周的時間，瘧原蟲在宿主細胞內大量繁殖，導致感染的肝細胞破裂，釋放出成千上萬的裂殖子，再次侵入紅細胞，一部分形成雌雄配子體，進入有性期。從瘧原蟲的生活周期可以看到，一旦到了裂殖子再次侵入紅細胞的階段，就很難通過疫苗和藥物的手段對紅細胞內的裂殖子進行殺傷，所以目前人們對瘧疾疫苗的設計主要集中在針對瘧疾感染的紅細胞前期和紅細胞內期的抗原，從而構建了紅細胞前期疫苗(MHC)、紅細胞內期疫苗、抗傳播疫苗、多價雜合瘧疾疫苗。
瘧疾疫苗的研製和運用可為瘧疾的綜合治理提供有利的武器，對瘧疾疫苗的研究已經近50年，最早是採用瘧原蟲死疫苗或射線減毒的瘧原蟲活疫苗，這種疫苗能夠保護人類免受瘧疾的侵襲，但用它來預防每年200到500萬的新感染人群顯然是不可行的。近年來，隨著分子生物學及分子免疫學的迅速發展，已通過基因重組或人工合成多肽的方法獲得大量不同種屬瘧原蟲的不同期的特異性抗原，在針對約氏瘧原蟲產生具有保護性的抗體及細胞免疫反應方面也取得了巨大的進展。紅細胞前期疫苗候選抗原主要是瘧原蟲的環子孢子蛋白CSP的運用，惡性瘧原蟲CSP的重複區外含有B細胞表位，這些B細胞表位可以直接激活B細胞，從而防止肝細胞感染或防止原蟲在肝內發育。因為一隻感染蚊的唾液腺常含有幾千個子孢子，而每個子孢子能感染一個肝細胞，所以該類疫苗可以有效降低瘧疾發病率，但保護力卻不能得到完全保證的，因為只要有一個子孢子進入肝細胞，它即可以繁殖進入紅內期。紅細胞內期疫苗的候選抗原有許多，主要包括有裂殖子主要表面抗原MSA1、MSA2及環狀體感染紅細胞表面抗原RESA，MSA1含有至少2個B細胞表位及3個T細胞表位，所以抗MSA1抗體可以抑制裂殖子侵入紅細胞，從而降低原蟲密度。這幾個抗原都含有B細胞及T細胞激活表位，提示它們本身具有克服MHC限制的能力，可能成為理想的疫苗候選抗原。以這三種血液期保護性抗原的免疫活性部分構建的Spf66雜合多價疫苗，是第一個抗惡性瘧原蟲的化學合成疫苗，1988年由patarroyo率先合成，此雜合疫苗的45肽由惡性瘧原蟲子孢子表面抗原重複序列NANP及血液期三個抗原的活性部分pfs35.1、pfs55.1、pfs83.1組成，抗45肽的抗體可以抑制體外活子孢子入侵肝細胞、體外裂殖子入侵RBC、蚊體中卵囊的發育，提示該疫苗對惡性瘧的各期都可能有效。惡性瘧Spf66自誕生起，已經過無數次的動物實驗及不同瘧疾流行地區人群接種實驗，主要臨床結果不完全一致，大多數臨床實驗結果令人鼓舞，證實了Spf66使用安全、有免疫原性，且對惡性瘧原蟲及間日瘧原蟲的攻擊都有較好的保護作用，但保護率差異較大，所以對它的有效性還存在爭議。抗傳播疫苗採用的為瘧原蟲配子體期表達的特異蛋白pfs48/45，此蛋白誘生的特異性抗體能阻止配子受精及合子的發育，所以該類疫苗雖無直接的保護作用，但有降低及阻斷傳播的作用，其缺陷之一是某些抗體可能反而引起傳播增強。瘧疾核酸疫苗的研究最早是在1994年由Hoffman等用含約氏瘧原蟲CSP基因的真核表達載體，肌肉注射小鼠後，產生了抗環子孢子蛋白的特異性抗體和CTL反應，兩種反應的水平均高於減毒子孢子的免疫，用5×105子孢子攻擊感染後的肝期原蟲負荷下降86％，已接受2-3次免疫接種的小鼠，再以102子孢子攻擊，結果顯示對子孢子攻擊小鼠有68％被保護，說明核酸疫苗接種可用於抗瘧疾感染。瘧疾DNA疫苗的首次臨床試驗從1997年開始，採用了瘧原蟲環子孢子蛋白，結果顯示這種單一的DNA疫苗能被較好地耐受、安全且具有免疫原性，但這種疫苗只能對單一階段的瘧原蟲起作用，預防範圍受到較大限制。
本發明的瘧疾疫苗，其活性成分為序列1編碼的蛋白質。
所述疫苗中還可以含有醫用佐劑，例如福氏佐劑。
帶有序列1的質粒，帶有序列1的生物細胞，特別是帶有序列1的真核細胞，尤其是帶有序列1的大腸桿菌均屬於本發明的保護範圍。
SPf66是惡性瘧原蟲紅外期的T細胞表位，CSTE即CSP(368-397)，是惡性瘧原蟲紅內期的B細胞表位，含有廣譜的Th細胞表位CST3(378-397)及Tc細胞表位CSP(368-390)，NKNDD是發現於我國海南的一株惡性瘧的B細胞表位，CTB是霍亂毒素B亞基，無毒性，能與多種HLA-B，HLA-C分子結合，具有很強的免疫原性，能刺激產生黏膜IgA和血清IgG抗體，且是理想的載體蛋白和佐劑，能加強抗原表位的抗原性。本發明創造性地將SPf66、CSTE及NKNDD有機結合，又巧妙地選用CTB作為核酸疫苗的佐劑，以解決瘧疾抗原性弱的問題。將各表位分別進行基因合成，組合後融合在CTB基因的3』端，構成融合基因CTB/SPf66/NKNDD/CSTE，以此融合基因構建了瘧疾亞單位疫苗和DNA疫苗，實驗證明，本發明的疫苗對瘧原蟲的攻擊具有明顯的保護作用，對於瘧疾預防將有巨大意義。
本發明的疫苗具有多階段、多價激發多種免疫反應的特性，免疫了這種多價疫苗的接種者被感染的按蚊叮咬後，入侵的瘧原蟲將被不同時期抗原產生的多重免疫殺傷和滅活，從而顯著降低感染，減輕病症並阻斷傳播。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
實施例2、本發明疫苗對感染瘧原蟲的小鼠的保護性以200隻小鼠為模型，分為實驗組和對照組，實驗組以本發明的疫苗免疫，免疫後誘導了較高水平的體液免疫和細胞免疫。以超量瘧原蟲分別攻擊實驗組和對照組的小鼠，結果實驗組的小鼠免疫保護率達70％，對照組的保護率小於5％，說明用本發明疫苗免疫的小鼠對瘧原蟲具有免疫性。
實施例3、本發明疫苗對感染瘧原蟲的恆河猴的保護性以10隻恆河猴為模型，5隻為實驗組，5隻為對照組，實驗組以本發明的疫苗免疫，免疫後誘導了較高水平的體液免疫和細胞免疫。以超量猴瘧原蟲攻擊實驗組和對照組的恆河猴，結果5隻免疫組的動物全部沒有感染，保護率為100％，而對照組的5隻恆河猴全部感染，且感染持續30天以上。說明用本發明的疫苗可以有效地對付瘧原蟲。
序列表16021702101211676212DNA213artificial sequence214人工序列2202234001acacctcaaa atattactga tttgtgtgca gaataccaca acacacaaat acatacgcta60aatgataaga tattttcgta tacagaatct ctagctggaa aaagagagat ggctatcatt 120acttttaaga atggtgcaac ttttcaagta gaagtaccag gtagtcaaca tatagattca 180caaaaaaaag cgattgaaag gatgaaggat accctgagga ttgcatatct tactgaagct 240aaagtcgaaa agttatgtgt atggaataaa acgcctcatg cgattgccgc aattagtatg 300gcaaatgaat tctaacgcta accctggtga tgaactggaa acccagaacg tgtacgcagc 360cccgaatgcg aatccgtaca gcctgttcca gaaagagaaa atggtgctgc cgaacgccaa 420cccgccggcg aacaagaaga acgcgggtcc caacaagaac gatgataaca agaacgatga 480taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagaac gatgataaca agaacgatga 540taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagggg aaacctaaag acgaattaga 600ttatgaagat attgaaaaga agatcgctaa gatggaaaag gctagcagtg ttttcaacgt 660tgtggtacca tgataa 67權利要求
1.序列1的DNA。
2.帶有序列1的質粒。
3.帶有序列1的生物細胞。
4.根據權利要求3所述的生物細胞，其特徵在於所述生物細胞為真核細胞。
5.根據權利要求4所述的生物細胞，其特徵在於所述生物細胞為大腸桿菌。
6.一種多表位瘧疾疫苗，它的活性成分為序列1編碼的蛋白質。
7.根據權利要求6所述的多表位瘧疾疫苗，其特徵在於所述疫苗中還含有醫用佐劑。
8.根據權利要求7所述的多表位瘧疾疫苗，其特徵在於所述醫用佐劑為福氏佐劑。
全文摘要
本發明為一種多表位瘧疾疫苗及其編碼基因。本發明的目的是提供一種多階段、多價激發多種免疫反應的多表位瘧疾疫苗。本發明的瘧疾疫苗，它的活性成分為序列1編碼的蛋白質，疫苗內還可以含有醫用佐劑，特別是福氏佐劑。本發明的疫苗對瘧原蟲的攻擊具有明顯的保護作用，對於瘧疾預防將有巨大意義。
文檔編號C07H21/00GK1417329SQ0113139
公開日2003年5月14日 申請日期2001年10月31日 優先權日2001年10月31日
發明者馬清鈞, 鍾輝, 曹誠 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所