一種利用激流式生物反應器懸浮培養動物細胞的工藝過程及控制方法

2023-11-02 04:37:12

專利名稱：一種利用激流式生物反應器懸浮培養動物細胞的工藝過程及控制方法
一種利用激流式生物反應器懸浮培養動物細胞的工藝過程及控制方法技術領域
本發明屬於細胞工程技術，涉及動物細胞大規模培養及生產重組蛋白藥物的工藝，具體涉及動物細胞無血清高密度，高表達懸浮培養工藝過程控制方法。
背景技術：
動物細胞大規模培養已成為生物製藥領域最重要的關鍵技術之一，並隨著重組治療性蛋白類藥物的廣泛應用而迅速發展。目前工業化生產動物細胞表達重組蛋白治療藥物的主要方法是通過生物反應器，在體外大規模高密度培養雜交瘤細胞、工程細胞、昆蟲細胞和微生物等，再通過相關的純化手段製備重組蛋白產品。
用於細胞大規模培養的生物反應器有攪拌式生物反應器，氣升式生物反應器，中空纖維生物反應器，固定床式生物反應器，旋轉式生物反應器，一次性生物反應器。[SINGH Vijay. Disposable bioreactor for cell cumture using wave-1nduced agitation[J].Cytotechnology, 1999,30 :149-158. ] [2]SlivacI, Srcek V G, Ra(jo§ evic K, Kmetic I and Kniewald Z 2006Aujeszky』 sdisease virus production in disposable bioreact or[JJ.Biosc1. 31 :363-368.]攪拌式生物反應器的最大優點是能培養各種類型的動物細胞，培養工藝容易放大，產品質量穩定，適合於工業化生產，在生物製品開發中潛力很大。但這種生物反應器也有不足之處，即機械攪拌會產生高剪切力，對細胞造成某種程度上的損傷。氣升式生物反應器能在通氣的同時，利用其獨特的迴路循環裝置使液相達到循環。最常見的為管道或板柱內循環氣升式生物反應器。外循環氣升式反應器，將下降管置於反應器外部，可用於高細胞濃度灌注培養。缺點相對來說較少，主要是高密度培養時混合不夠均勻。中空纖維生物反應器的主要組成部分是一充滿培養液的閉合管道，管道中插入半通透性的中空纖維。中空纖維為培養細胞提供營養物質並運走代謝廢物。但是細胞密度過高會妨礙氧的擴散，使細胞的得氧量不同。同時，此反應器中還存在著營養物質和代謝產物的濃度差，這就導致了細胞生長的不均一性。[李寶香，郭德倫，張瑩三維細胞培養技術及相關儀器的進展和應用]填充床生物反應器中填充了某種材料，作為固定細胞的載體，填料顆粒堆疊成床。培養液可以在床層中流動。它沒有機械攪拌和氣泡，所以剪切力小，適合細胞培養。但該反應器的最大缺點是混合效果差，傳質、傳氧效率低。[動植物細胞培養生物反應器的研究進展王志江，鄭裕國旋轉式生物反應器(RCCS)主要由控制裝置和培養容器兩部分組成。培養容器主要由內外兩個圓筒組成，內、外筒可相對獨立地旋轉。 整個容器由電機驅動沿水平軸旋轉，細胞顆粒在水平軸內建立均質的液體懸浮軌道。由於該系統無推進器、空氣升液器、氣泡或攪拌器，細胞顆粒不與容器壁或任何其它易致傷的物體相碰，故幾乎沒有破壞性的剪切力。普通生物反應器由於通過攪拌保持細胞的懸浮而產生的剪切力破壞了細胞間和細胞與基質問的穩定，使組織和細胞集中於自身的修復，而大大影響其生長和其它的正常生理功能。由於有很好的物質交換功能，細胞在RCCS中能以很高的密度生長，其細胞的培養密度可達到108，故可快速大規模地培養細胞。此外，這種培養能提供本能的分化、高細胞增殖、低的細胞死亡率和增加細胞產物的分泌。[Fang A, Pierson D L. Mishra SK. etal. Growth of Streptomyces hygroscopicusinrotating wall bioreactor under simulated microgravity inhibits rapamycin production[J]. Appl Microbiol Biotecknol. 2000,54 :33.] 一次性生物反應器是最近發展起來的新式反應器， 由預先消毒的、可被FDA認可的、對生物無害的聚乙烯塑料箱組成，箱中部分填充培養液並接種細胞，箱中其餘部分是空氣。使用前箱體用r射線消毒，用後丟棄。特殊的開孔可進行無菌加樣、取樣，而不必把生物反應器置於層流罩中，裝置簡單，易於操作，成本低，低剪切力，無空氣鼓泡減低了氣泡對細胞的損害，可用於培養動物細胞和植物細胞並十分適合生產病毒。此反應器已經成功懸浮培養重組NSO細胞生產單克隆抗體；懸浮培養人293細胞生產腺病毒；用昆蟲sf 9細胞生產棒狀病毒；用微載體Cytodex 3培養人293細胞。[林福玉，陳昭烈等.大規模動物細胞培養的問題及對策.生物技術通報.1999，1:32-35.]
本發明中激流式生物反應器是一種全新概念的生物反應器，激流式生物反應器由控制系統、激流式振蕩器、細胞培養罐、一次性細胞培養袋、滅菌器、取樣器、儲液袋七大部分組成。基於無鼓泡式新型傳氧機制，它通過激流式振蕩器機械搖動產生激流而使培養液反覆衝刷細胞培養袋內表面的氧分子層，進而使氧，二氧化碳等氣體分子層迅速溶解於培養液中，同時帶走排除代謝廢物，以滿足細胞正常生長和代謝的需求。激流式反應器採用具有世界專利的無鼓泡式傳氧技術，可支持懸浮細胞高密度培養。細胞培養用塑料反應袋採用符合生物安全性的專用生物EVA膜，經過24kGy鈷60幅照滅菌，通過內毒素殘留檢測，符合GMP生產條件的要求。培養液在菌塑料反應袋中產生激流式的衝刷，袋子內壁和培養液之間完成氧分的傳遞，從而達到高效的傳氧、傳質和混合的目的。該系統無氣升裝置、鼓泡或攪拌器，使剪切力最小化。一次性培養袋使用後就拋棄，可避免交叉汙染、縮短批間處理周期，無需清洗、消毒、驗證，極大地提高工作效率。
動物細胞大規模培養一般分為分批式(batch)、流加式(Fed-batch)、灌流式 (perfusion)三種操作模式 。當前公開發表的生產工藝佔有主流優勢的是利用反應器進行的懸浮培養，工藝設計是流加或灌流培養[米力，陳志南，動物細胞大規模培養生產蛋白的工藝選擇，中國生物工程雜誌，2003，23 (7) :1.]。無血清培養是當今細胞培養領域的一大趨勢。採用無血清培養可簡化分離純化步驟，避免支原體、病毒汙染造成的危害。[Anna F. Europa, Anshu Garnbhir, Peng-Cheng Fu, We1-Shou Hu. Multiple States with Distinct Cellular Metabolism in Contiuous Culture of mammalian Cells. Biotechnol Bioeng, 2000,67 (I) :25-34.]流加培養工藝是當前動物細胞大規模培養佔有主流優勢的培養工藝。在規模化的蛋白質生產中選擇使用流加工藝(Fed-batch)的公司有，如美國的Genentech, IDEC, Medlmmune, Merck等。流加培養工藝中的關鍵技術是基礎培養液和流加濃縮營養培養液的設計。1996年謝良志博士運用化學計量法，根據動物細胞生長的需求，設計定量添加濃縮的培養液。[Xie L Z, Wang D1. High cell density and high monoclonal antibody production medium design and rational control in a bioreactor. Biorechnol Bioeg,1996,51 :725-729.]

發明內容
本發明的目的是為了應用一種激流式生物反應器，一次性反應袋，無血清懸浮培養動物細胞(細胞包括重組CHO細胞、雜交瘤細胞等)生產重組蛋白的工藝控制方法。我們的優點是該激流式細胞反應器，成本低，操作控制簡單，利於大規模擴大生產。通過細胞反應袋錶面衝刷傳氧，只需通入一定量空氣(O.1 10L/min)和少量氧氣，即可維持培養體系中溶解氧20 80% ;培養過程中只需對pH、溶解氧、溫度進行在線監控；對細胞密度、活率、葡萄糖、穀氨醯胺、氨、乳酸含量，滲透壓進行定時監測，採用自動控制系統進行流加補料。採用連續流加基礎培養液的方法來提高細胞密度並擴大培養體積，再通過降低細胞培養溫度和流加濃縮培養液來維持細胞密度和活率。如流程圖所示，進行每一輪生產時，從一瓶工作細胞庫細胞開始，在無血清培養液中懸浮培養，逐級擴增傳代，在搖瓶擴增細胞後， 接種至50L激流反應器，再接種至300L反應器進行生產。生產期將持續7-21天，細胞密度 (6X IO6 2X 107cells/ml)，加入丁酸鈉等已提高重組蛋白的表達量。培養結束時，收穫液直接純化。
1.細胞培養過程描述
工作細胞庫細胞管從冷凍保存的液氮罐內取出，在約37°C快速融化，無菌條件下將細胞移入含有無血清培養液的T25方瓶中，並逐級擴增到T125方瓶。這個時候以及整個培養過程中的特定間隔，測量細胞密度和計算群體倍增水平(TOL)的樣品都在無菌的條件下取出。T方瓶在37±2°C培養，細胞保持懸浮，密度維持在O. 5X IO6 2X 106cells/ml,當培養體積達到40ml將細胞移入搖瓶中，在37±2°C搖床中培養，(2 5天後)再以適當的細胞密度將細胞接入含有新鮮培養液的150ml搖瓶，(2 5天後)再以適當的細胞密度將細胞接入含有新鮮培養液的3L搖瓶，在適當的細胞密度(2 5天後)細胞接入6L搖瓶。 在適當的細胞生長時期(2 5天後)，6L搖瓶細胞接入帶有氣體(02、C02和N2)控制系統的50L反應器，50L反應器擴增至40L至50L體積，細胞密度維持在4X IO6 8X IO6Cells/ ml，用袋傳袋地方法直接接種300L反應器，溫度控制在37±O. 2°C，通過控制塔用C02和碳酸鈉(鹼)控制PH，用通入空氣恆流來保持反應器內正向壓力，用氧氣通氣量間隔時間來控制溶解氧含量高低。所有氣體通過O. 22 μ m或更小孔徑的膜過濾，葡萄糖要加入培養液中連續流加使糖含量保持在l_2g/L。並不斷擴增培養體積，細胞達到較高密度O. 8 X IO6 2X107cells/ml,降溫30 35°C開始生產期培養，流加濃縮的培養液成分的培養液使細胞保持活率，當細胞群體生長處於衰退期且細胞活率在40 80%時，停止培養。
2.細胞培養擴增的各步工藝參數包括
I)基礎無血清培養液中葡萄糖起始濃度為3 6g/L ;濃縮的表達無血清培養液葡萄糖起始濃度為40 60g/L ;培養過程中葡萄糖濃度控制為I 2g/L ；
2)無血清培養液中穀氨醯胺起始濃度為2 4mM/L ;培養過程中穀氨醯胺下限為 O. 5 1. 5mM/L ；
3)培養過程乳酸的最高上限為5 20mM/L ；
4)凍存管存放在液氮中。T方瓶培養條件37°C 5% C02培養箱。搖瓶培養條件 37°C搖床，轉速100 200rpm。收穫方式無菌放料。收穫時間細胞密度下降且活率在 40 80%時。
3.細胞培養原材料
所有生產原材料都必須按照GMP中規定 的程序，完成接收、鑑定、抽樣、檢驗、測試和籤發。表I列出重組藥物細胞培養中所用原材料，必要的情況下相同材料也可以替代。
表I細胞培養原材料
權利要求
1.一種利用激流式生物反應器動物細胞生產重組蛋白的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1).用激流式生物反應器無血清懸浮培養動物細胞，起始接種細胞密度為O.5X106 4X106cells/ml ;根據細胞密度變化流加基礎培養液進行擴增培養體積，使細胞密度維持在4X IO6 8X 106cellS/ml，當培養體積擴大到反應器最大培養體積的1/2 3/4時，開始將溫度下降到30 35°C並流加濃縮培養液進行表達。
(2).培養過程工藝參數針對不同的細胞株生長代謝需求，通過監測細胞密度及活率，細胞溶液中滲透壓，以及葡萄糖、穀氨醯胺、氨、乳酸含量，來控制流加營養物質的速率。
(3).蛋白降溫表達過程中細胞由對數生長期進入平臺期並維持7 21天，其產物濃度逐漸升高，當細胞群體生長處於衰退期且細胞活率在40 80%時，停止培養。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於，此種方法可以用於重組蛋白的生產，包括單克隆抗體和融合蛋白等。
3.根據權利要求1的方法，其特徵在於，其中，使用的反應器為激流式生物反應器是指由控制塔、搖床、罐體、一次性塑膠袋組成的反應系統；其特徵在於，該反應器系統無氣升、鼓泡或攪拌器裝置，採用搖動的培養方式，使剪切力最小化。使用的反應容器為一次性塑料反應袋，避免罐體清洗、滅菌等工作。
4.根據權利要求1的方法，其特徵在於，所述的細胞包括重組CHO細胞、雜交瘤細胞等適合懸浮培養的動物細胞。
5.根據權利要求1的方法，其特徵在於，其中，培養溫度36 37°C、PH6. 7 7. 4、搖床轉動速度30 60rpm、溶氧濃度(空氣飽和度)為20 80%;所述控制流加營養物質的速率、培養溫度、DO、PH採用細胞反應器控制系統進行在線自動控制。
6.根據權利要求1的方法，其特徵在於，其中，培養過程中定時對細胞密度、活率、滲透壓、葡萄糖、氨、乳酸含量進行監測。
7.根據權利要求1的方法，其特徵在於，其中，所述配製流加用於細胞擴增的基礎培養液和流加用於蛋白表達的濃縮培養液採用商品化培養液乾粉添加一些營養成分和鹽、大豆水解物、生長因子、重組人胰島素，該培養液不包含任何牛源或豬源成分。
8.根據權利要求1的方法，其特徵在於，其中，所述培養反應器中流加基礎培養液後，細胞密度達到4X106 lX107cells/ml，細胞培養體積可擴增到50 300L，甚至更大體積；培養反應器中結合流加濃縮表達培養液後，細胞密度可達到8X IO6 2X 107cells/ml。
全文摘要
本發明公開了一種利用激流式生物反應器無血清培養動物細胞生產重組蛋白類藥物的工藝過程及控制方法。該工藝採用流加基礎培養液來提高細胞密度並擴大細胞培養體積。通過降低培養溫度和流加濃縮的表達培養液來維持細胞密度和活率。從而高效、持續的獲得重組蛋白。工藝控制方法主要針對不同細胞株生長代謝變化，對pH、溶解氧、溫度變化進行在線監測；對細胞密度、活率、培養體系中葡萄糖、穀氨醯胺、氨、乳酸、滲透壓進行定時檢測。該方法特別適合大規模動物細胞懸浮培養。具有操作控制簡單，傳質傳氧效率高，培養周期穩定、批次間結果差異小、生產成本低、容易實現大體積、高密度等優點。
文檔編號C12M1/36GK102994442SQ201110265840
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者張秀芹, 劉鐵成, 張雪亭, 王延濤, 楊威, 李會成 申請人:哈藥集團技術中心