分離核酸物質的方法和材料的製作方法

2023-11-10 02:59:07 2

專利名稱：分離核酸物質的方法和材料的製作方法
技術領域：
本發明涉及從多種樣品材料諸如全血、血清、血漿、固體組織、體液、組織、頭髮、指甲材料、口腔細胞、培養細胞、陰道拭子、細菌、真菌和植物組織中分離核酸物質。更具體地，本發明涉及允許在溫和的溫度和PH條件下有效和迅速分離核酸物質的方法和材料。
背景技術：
經常需要從各種生物樣品和其他流體諸如細胞溶解液、合成反應混合物、PCR反應混合物等等中分離合成和天然存在的核酸物質諸如DNA、RNA、寡核苷酸等等。這種分離可為各種分析過程、合成過程和研究活動中非常重要的步驟。任何這樣的方法都應為可靠的、有效的、容易實施的並且不破壞核酸物質。在很多例子中，帶正電荷的聚合物諸如基於聚賴氨酸和聚乙烯亞胺的材料已經用於基因傳遞和多種核酸純化方法，因為這些類型的分子可有效捕獲和保留帶負電荷的核酸物質。在這樣的方法中，帶電荷的聚合物通常被固定在固體表面上，諸如磁性顆粒、聚苯乙烯顆粒或類似物。通常在小於8的pH下，帶電荷的聚合物隨後與包含核酸物質的樣品接觸。這使核酸物質結合至帶正電荷的聚合物。雜質諸如蛋白質和碳水化合物不結合併能從樣品上洗掉。在高PH條件下，所結合的核酸物質隨後從聚合物釋放，以便實現純化。然而，在很多例子中，核酸物質非常強地結合至聚合物，由此要求使用高PH和高溫度條件，以便從聚合物釋放所結合的核酸。然而，核酸物質可通過這樣的高溫度和鹼性反應條件被永久變性。因此，需要允許在相對溫和的PH和溫度條件下分離和純化核酸物質的方法和材料。如將在下文中詳細解釋的，本發明允許在室溫和在溫和的鹼性條件下結合、分離和釋放核酸物質。本發明的這些和其他優點根據隨後的討論和描述將是顯而易見的。

發明內容
所公開的是從生物樣品或其他流體混合物分離核酸物質的方法。根據該方法，其中具有核酸物質的樣品在包括完整細胞的例子中首先用裂解緩衝劑進行裂解以釋放核酸物質；在不包括完整細胞的樣品中，該步驟可被省略。隨後，流體與帶正電荷的聚合物諸如聚賴氨酸、聚乙烯亞胺或其他單獨或結合使用的這樣的多胺接觸。未結合的雜質用清洗緩衝劑清洗掉。帶正電荷的聚合物結合核酸物質於其；並且在本發明的第二步驟中，具有結合於其的核酸物質的聚合物與包括鹼性材料和二醇的溶液的釋放劑接觸。溶液具有不超過12的PH，並且溶液有效地使核酸物質從聚合物釋放。釋放溶液可進一步包括緩衝劑，並且在具體的例子中，溶液具有不超過11的pH。鹼性材料可包括I族金屬氫氧化物，諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀，並且在一些例子中，鹼性材料的濃度可不超過50mM。在一些例子中，二醇為聚合的二醇，諸如聚乙二醇，並且可具有200-2000範圍內的分子量。在具體的例子中，將聚合物與釋放劑接觸的步驟在不超過40°C的溫度下進行。在一些例子中，帶正電荷的聚合物為羧化多胺。帶正電荷的聚合物可包括所有或部分配置為珠粒、片材、載玻片、管、移液管、拭子、磁性顆粒等等的基體。本發明的方法可在自動系統中或在手動基礎上實施。進一步公開的是製備部分帶正電荷的聚乙烯亞胺聚合物的方法。根據該方法，聚乙烯亞胺聚合物與酸化試劑諸如羧化試劑或磺化試劑反應，以便產生酸化聚乙烯亞胺，並且酸化聚乙烯亞胺隨後與第二體積的聚乙烯亞胺反應，以便將至少一些酸化聚乙烯亞胺結合至第二體積的聚乙烯亞胺。在具體的例子中，酸化試劑為羧化試劑，其可為氯醋酸鈉。進一步公開的是實施本發明的方法的系統以及實施本發明方法的部件的試劑盒。發明詳述 根據本發明，已經被結合至分離反應劑諸如帶正電荷的聚合物的核酸物質通過將它們與包括鹼性材料和二醇(glycol)的釋放反應劑接觸從那裡釋放。釋放溶液具有不超過12的，並且在一些例子中不超過11的pH。該溶液在相對低的溫度諸如不超過50°C的溫度下有效釋放核酸物質。在具體的例子中，核酸物質的釋放在室溫下發生，室溫通常理解為不超過40°C的溫度。通常，釋放在10分鐘內完成，並且在具體的例子中不超過5分鐘。這些溫和的條件避免對核酸物質的損害，或將對核酸物質的損害極大地最小化。在具體的例子中，釋放劑中的鹼性材料為I族金屬氫氧化物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀或類似物。二醇材料可包括乙二醇；然而，在一些具體的例子中，已經發現聚合的二醇材料諸如聚乙二醇聚合物在本發明的實踐中非常有效。在具體的例子中，鹼性材料的濃度小於50mM，並且基於重量，二醇成分的濃度處於1-40%的範圍內。在具體的例子中，聚乙二醇聚合物的分子量可在從200至2000的範圍內。在本發明的實踐中具有實用性的一種具體的反應劑包括大約8mM的氫氧化鈉水性溶液，其包含以重量計大約30%的聚乙二醇(PEG600)。其他類似的組合物對本領域技術人員將是顯而易見的。已經發現該類型組合物通常具有不超過12的pH，並且通常不超過11的PH，並且已經顯示這些組合物在4或5分鐘內，在不超過50°C並且通常不超過40°C (室溫)的溫度下從帶正電荷的聚合物諸如羧化聚乙烯亞胺(PEI)有效釋放核酸物質。這些溫和的PH和溫度條件將對核酸物質的損害最小化。應當理解釋放反應劑可進一步包括成分，諸如起維持適當PH水平作用的緩衝劑、表面活性劑、以及輔助成分諸如粘度控制試劑
坐坐寸寸o用於本發明的帶正電荷的聚合物可包括塊狀聚合的材料，或它們可包括在基底諸如珠粒、顆粒、帶狀材料、載玻片、管或移液管上的塗層。基底也可包括吸水材料諸如拭子、海綿或類似物。在一些例子中，帶正電荷的聚合的材料可通過衍生、移植或另外地改性塊聚合體而製備。在一些情況下，帶正電荷的聚合物被包被在磁性顆粒或磁性敏感顆粒上，以便於通過磁性方法收集顆粒。進行了一系列說明本發明原理的實驗。在第一個實驗中，DNA樣品被吸附至PEI改性的磁性顆粒上，該類型的顆粒在本領域中已知用於分離核酸物質。在這點上，PEI改性的磁性顆粒首先與200ng經純化的小鼠基因組DNA樣品在30微升的緩衝劑溶液中溫育，該緩衝劑溶液包括具有pH 7. 5的50mM Tris-HCl並進一步包含1%的Triton X-IOO0溫育在室溫下進行2分鐘。一系列包含樣品的管被放置在磁分離器中，並且上清液用移液管仔細清除，留下顆粒。結合的DNA從顆粒釋放。在第一個例子中，利用包括10微升20mM NaOH的現有技術反應劑溶液進行釋放。在第二個例子中，根據本發明，釋放反應劑包括8mM NaOH和30%PEG 600的混合物。在任一個例子中，溫育在室溫下進行4分鐘。所得溶液用10微升IOOmM Tris-HCl pH 8.0中和。每個樣品的一部分隨後經瓊脂糖凝膠電泳進行分析。電泳分析說明本發明的8mM NaOH/PEG溶液在室溫條件下從PEI聚合物有效釋放DNA，而現有技術高PH溶液不能。在第二個實驗系列中，冷凍的人外周血首先在75微升裂解緩衝劑中裂解，該裂解緩衝劑由50mM Tris-HCl pH 7. 5緩衝劑組成，該緩衝劑包含IOOmM KCl,1% Triton X-100和0. 5% SDS0裂解在室溫下進行2分鐘。PEI改性的磁性顆粒(10微升，I. 6%v/v)加入溶胞產物中，以結合釋放的DNA。結合的DNA通過將管放入磁分離器2分鐘來收集。上清液中的細胞碎片被清除，並且具有結合於其的DNA的磁性顆粒在60°C下與200微升包含20mMTris-HCl pH 8.0,0. 5%SDS和200微克蛋白酶K的清洗緩衝劑溫育10分鐘。磁性顆粒隨後用相同的不包括蛋白酶K的緩衝劑溶液進行清洗。在此之後，顆粒用200微升包含IOmM Tris pH 8.0的溶液進行清洗。DNA隨後在室溫下，在16微升包含8mM NaOH和30%PEG 600的本發明的釋放溶液中釋放4分鐘。釋放的DNA隨後用4微升IOOmM Tris-HCl pH 8. 0的緩衝劑中和。利用包括現有技術不含二醇的20mM NaOH溶液的釋放劑進行比較。如在實驗I中，所得物質通過凝膠電泳進行分析，並且該實驗證明本發明的溶液在釋放結合的DNA中是非常有效的，而現有技術溶液不是。進行進一步的實驗系列，證明本發明的組合物對於釋放結合的RNA的有效性。在該實驗中，大約4X IO6個293細胞通過離心分離快速從10釐米組織培養皿收穫。丟棄上清液液體，並且細胞沉澱在使用前被保存在_80°C。為了分離RNA，400微升的裂解緩衝劑(25mM檸檬酸鈉、4M異硫氰酸胍、5mM EDTA、2%TX_100)加入冷凍的細胞沉澱。在混合後，20微升的PEI磁性珠粒加入裂解緩衝劑並混合。包含該混合物的樣品管被放置在磁架上，以便形成磁性珠粒的沉澱。丟棄上清液液體，並且珠粒用400微升的清洗緩衝劑(2mM檸檬酸鈉，pH 6.0)清洗一次，並且隨後在37°C下與100微升的DNase I溶液(40mM Tris pH 7.5、8mM MgCl2、5mM DTT和50個單位的DNase I)溫育15分鐘。隨後，在DNase I處理後，珠粒用清洗緩衝劑清洗兩次。結合的RNA隨後用60微升的包括0. IM Bis-Tris pH 9. 5和30%PEG600的釋放緩衝劑從珠粒釋放。10微升的釋放的RNA利用從Takara Bio Inc獲得的M-MLV逆轉錄酶用於cDNA合成。來自50微升反應物的2微升合成的cDNA利用人類￠-肌動蛋白cDNA的引物用於PCR。如此製備的cDNA通過凝膠電泳與對照樣品比較進行分析。該分析證實了本發明的釋放劑在從磁性顆粒釋放RNA中是非常有效的。在第四個實驗中，根據本發明的另一方面製備新型帶正電荷的PEI材料。在該方法的第一步驟中，氯醋酸鈉羧化試劑用於羧化PEI材料(MW 200,000)的樣品。該方法通過由 Miroslav Macka et al. 「New isoelectric buffers for capillary electrophoresis:N-carboxymethylated polyethyleneimine as a macromolecular isoelectricbuffer, 」 Analyst，2001，126，421-425描述的方法進行。此後，IOOmg如此製備的羧化PEI溶解在I微升乙醇中，並且在10-50微升範圍內各種體積的羧化PEI加入50mM包含碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的MES緩衝劑-pH 6. I-中100微升PEI磁性顆粒。如此製備的磁性顆粒在室溫下振蕩2小時。此後，樣品被放置在磁分離器中，並且任何未結合的羧化PEI被清除。如此產生的磁性顆粒用50mM MES清洗兩次，並被保存在100微升50mM MES加0. l%Triton X-100中。應當理解到該方法可用於製備其他類型的帶正電荷的(酸化的)聚合物。例如，PEI能與磺化反應劑反應，以便產生磺化PEI，其隨後與一定量的未磺化PEI結
入
口 o在隨後的實驗中，如此製備的羧化PEI磁性顆粒用於捕獲DNA。在這點上，在大體類似於參考實施例I描述的方法中，用200-500納克經純化的小鼠基因組DNA測試各種羧化PEI磁性顆粒的結合能力。在這點上，在室溫條件下，在將DNA與羧化PEI磁性顆粒在30微升包含50mM的Tris-HCl pH 7. 5和1% Triton X-100的緩衝劑中溫育後2分鐘，收集上清液。結合的DNA在室溫條件利用根據本發明的包括8mM NaOH和30% PEG 600的反應劑進行釋放。結合和未結合DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上利用溴化乙錠染色可視化。發現羧化 PEI磁性顆粒材料在上清液中沒有留下DNA，證明該新型羧化材料作為分離核酸物質的帶正電荷的聚合物的有效性。在隨後的實驗中，評價各種釋放溶液從本發明的羧化PEI材料和從現有技術的非羧化PEI釋放DNA的它們的效力。發現如果聚合物不被羧化，則釋放在某種程度上更難。具體地，對於非羧化PEI聚合物，發現需要氫氧化鈉和PEG 600 (pH 11-12)的組合物提供結合DNA的大於90%的回收率，而更溫和的(較低pH)釋放劑，諸如IOOmM Bis-Tris pH 9. 0溶液，不是同樣有效。在那些使用羧化PEI聚合物的例子中，發現包括IOOmM Bis-Tris pH9. 0溶液的釋放劑可以在室溫下有效產生大約90%的DNA的釋放。在進一步的實驗中，RNA利用羧化PEI聚合物分離。在這點上，RNA從Cos7細胞中提取。500納克提取的RNA隨後在室溫下與羧化PEI磁性顆粒溫育2分鐘。在一個例子中，隨後利用Bis-Tris pH 9.0緩衝劑釋放結合的RNA，並且在另一個例子中，利用相同Bis-Tris緩衝劑和聚乙二醇。釋放在42°C進行3分鐘。如此釋放的RNA用對於猴親環蛋白A特異的引物進行定量SYBR綠色PCR。發現添加PEG至緩衝劑顯著改善了 RNA回收率。前面的內容說明了本發明的一些實施方式。其他實施方式及其改進鑑於本文提出的教導對於本領域技術人員將是顯而易見的。例如，本發明的釋放劑可利用不是所描述的氫氧化鈉的鹼性材料進行製備。同樣地，其他包括聚合的和低聚的二醇以及單體二醇的二醇材料可用於本發明的實踐中。同樣，應當理解本發明可以以自動以及手動模式實施。並且，根據本發明，可製備實施該方法的試劑盒。所有這樣的改進和變形都處於本發明的範圍內。包括所有等價物的所附權利要求限定本發明。
權利要求
1.從流體分離核酸物質的方法，所述方法包括以下步驟 使其中具有核酸物質的流體與帶正電荷的聚合物接觸，從而所述核酸物質結合至所述帶正電荷的聚合物；和 使具有結合於其的所述核酸物質的所述聚合物與釋放劑接觸，所述釋放劑包括鹼性材料和二醇的溶液，所述溶液具有不超過12的pH，從而所述劑使所述核酸物質從所述聚合物釋放。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述劑具有不超過11的pH。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述劑包括緩衝劑。
4.根據權利要求I所述的方法，其中所述鹼性材料為I族金屬氫氧化物。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述鹼性材料以不超過50mM的濃度存在。
6.根據權利要求I所述的方法，其中所述二醇為聚合的二醇。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述聚合的二醇為聚乙二醇。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述聚乙二醇具有200-2000範圍內的分子量。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述使所述聚合物與所述釋放劑接觸的步驟在不超過40°C的溫度下進行。
10.根據權利要求I所述的方法，其中所述使所述流體與所述聚合物接觸的步驟進行不超過10分鐘。
11.根據權利要求I所述的方法，其中所述帶正電荷的聚合物包括選自多胺的一種。
12.根據權利要求I所述的方法，其中所述帶正電荷的聚合物為羧化多胺。
13.根據權利要求I所述的方法，其中所述帶正電荷的聚合物是包括以下的一種或多種的一部分基體珠粒、片材、載玻片、管、移液管、拭子和磁性顆粒。
14.製備部分帶正電荷的聚乙烯亞胺聚合物的方法，所述方法包括以下步驟 提供第一體積的聚乙烯亞胺聚合物； 使所述第一體積的聚乙烯亞胺聚合物與酸化試劑反應，以便產生酸化聚乙烯亞胺； 提供第二體積的聚乙烯亞胺聚合物；和 使所述第二體積的聚乙烯亞胺與所述酸化聚乙烯亞胺反應，以便將至少一些所述羧化聚乙烯亞胺連接至所述第二體積的聚乙烯亞胺。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述酸化試劑為羧化試劑或磺化試劑。
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述酸化試劑為氯醋酸鈉。
17.根據權利要求14所述的方法，其中所述第一體積的聚乙烯亞胺和/或所述第二體積的聚乙烯亞胺具有大約400至200，000的分子量。
18.用於從流體分離核酸物質的系統，所述系統包括 帶正電荷的聚合物，其可用於結合所述核酸物質；和 釋放劑，所述釋放劑包括鹼性材料和二醇的溶液，所述溶液具有不超過12的pH，所述劑可用於使所述核酸物質從所述聚合物釋放。
19.根據權利要求18所述的系統，其中衍生於固體基體材料的所述聚乙烯亞胺包括羧化聚乙烯亞胺聚合物。
20.部分帶正電荷的聚乙烯亞胺聚合物，其包括羧化聚乙烯亞胺聚合物，其已經與非羧化聚乙烯亞胺聚合物反應，以便將所述羧化聚乙烯亞胺聚合物結合至所述非羧化聚乙烯亞胺聚 合物。
全文摘要
核酸物質可通過首先使流體與結合核酸物質的帶正電荷的聚合物接觸被有效地從流體分離。此後，具有結合於其的核酸物質的聚合物與包括鹼性材料和二醇的溶液的釋放劑接觸。該溶液具有不超過12的pH，並起到在相對低溫的條件下從聚合物釋放核酸物質的作用，該溫度通常不超過50℃，並且在具體例子中，不超過40℃。二醇材料可包括單體二醇，諸如乙二醇、丙二醇或類似物，或其可包括聚合的二醇，諸如聚乙二醇。也公開了可用於分離方法中的新型帶正電荷的聚合物。該聚合物包括酸化多胺，諸如已經在偶聯反應中與非酸化聚乙烯亞胺反應的聚乙烯亞胺。酸化聚乙烯亞胺可為羧化和/或磺化聚乙烯亞胺。
文檔編號C12Q1/68GK102753705SQ201080063860
公開日2012年10月24日 申請日期2010年12月13日 優先權日2009年12月14日
發明者B·吳 申請人:B·吳